JP2013541950A - 高い酵素アクセシビリティを有する前処理バイオマス - Google Patents

Abstract

本発明は、５及び６炭糖、リグニン、並びにセルロースのバイオマス組成物に関し、組成物は、加水分解のための２４時間における非常に高い酵素アクセシビリティを有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、エネルギーの生産において加水分解されるバイオマスの使用に関する。

第二世代エタノール法におけるバイオマスの使用は公知である。一般的な方法は、少なくとも水蒸気爆発によりバイオマスを前処理し、酵素の存在下でセルロースを加水分解し、次いで、得られた生成物をエタノールに発酵させる。概念的工程ステップを含む可能な前処理装置の構成は、特許文献１に開示されている。特許文献１は、装置を提供しているが、実施又はバイオマスの処理のための操作の詳細を記載していない。

過去の研究の焦点は、加水分解ステップがより速く進行し得るようにセルロースを加水分解する、より優れた酵素を開発又は選択することであった。しかし、バイオマスが酵素により高度に接触できるような方法でバイオマスを処理することについては、非常にわずかな試験又は研究しか行われなかった。加水分解の前に材料がより高度に接触できるほど、加水分解反応が速くなり、酵素の使用が少なくなることは、公知である。したがって、以前の形態のバイオマス原料より高い酵素アクセシビリティを有するバイオマス原料の必要性がある。

国際特許公開第２００９／１０８７７３号

本明細書において、固体、液体、組成物の液体及び固体中のアラビナン及びキシラン並びにアラビノース及びキシロースのモノマー、ダイマー、オリゴマー及びポリマーの量に基づく量のＣ５糖、組成物の液体及び固体中のグルカンのモノマー、ダイマー、オリゴマー及びポリマーを含むグルカン含量に基づく量のＣ６糖並びにフルフラールを含むバイオマスの組成物であって、少なくとも３０％の２４時間酵素アクセシビリティを有することをさらに特徴とするバイオマスの組成物を記載する。

Ｃ５糖の量とＣ６糖の量との比が０．５０より大きく、フルフラールの量とＣ５糖及びＣ６糖の合計量との比が０より大きく、０．００６０以下であることをさらに開示する。

フルフラールの量とＣ５糖及びＣ６糖の合計量との比が０より大きく、０．００５０以下である、又はより好ましくは０より大きく、０．００４０以下である、又はさらにより好ましくは０より大きく、０．００３０以下である、又は最も好ましくは０より大きく、０．００１６以下であることをさらに開示する。

組成物中の固体の量が組成物の１１〜９９重量％の範囲にある、又はより好ましくは組成物の１４〜９９重量％の範囲にある、又はさらにより好ましくは組成物の１６〜９９重量％の範囲にあり、組成物の１９〜９９重量％、組成物の２１〜９９重量％、組成物の２４〜９９重量％、組成物の２６〜９９重量％、組成物の２９〜９９重量％、組成物の３１〜９９重量％、組成物の３６〜９９重量％、及び組成物の４１〜９９重量％の主として好ましい範囲を有することをさらに開示する。

植物バイオマスは、発酵法の好ましい原料である。以下に示すものは、高度に酵素に接触できる流れを作るための好ましい原料である。

デンプンを別として、植物バイオマス中の３つの主要な成分は、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンであり、これらは、一般的に総称により、リグノセルロースと呼ばれる。総称としての多糖含有バイオマスは、デンプン及びリグノセルロース系バイオマスの両方を含む。したがって、ある種の原料は、植物バイオマス、多糖含有バイオマス、及びリグノセルロース系バイオマスであり得る。

バイオマスが多糖含有バイオマスであり、それがリグノセルロース系である場合、リグノセルロース系内容物の構造が酵素により高度に接触できるようにし、同時に酢酸、フルフラール及びヒドロキシメチルフルフラールなどの有害な阻害性副生成物の濃度を実質的に低く維持することを確実にするために前処理がしばしば用いられる。

本発明による多糖含有バイオマスは、例えば、デンプン並びに精製デンプン、セルロース及びヘミセルロースの形態のポリマー糖を含有する任意の材料を含む。

本発明による加水分解及び混合用の関連する種類のバイオマスは、例えば：デンプン、例えば、デンプン含有穀物及び精製デンプン；わら、例えば、イネ、コムギ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、ナタネ、モロコシの茎、バガス；軟材、例えば、オウシュウアカマツ（Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔｅ）；硬材、例えば、ヤナギ属種、ユーカリ属種；塊茎、例えば、ビート、ジャガイモ；例えば、イネ、コムギ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、ナタネ、モロコシ及びコーンの穀物などの農作物由来のバイオマス；古紙、バイオガス処理からの繊維画分、堆肥、アブラヤシ処理の残留物、都市固体廃棄物又は類似の乾燥物質内容物を有する同様なものを含み得る。

リグノセルロース系バイオマス原料は、好ましくは通常草（ｇｒａｓｓ）と呼ばれる科からのものである。厳密な名称は、顕花植物のユリ綱（単子葉類）のイネ科又は禾本科として公知の科である。この科の植物は、草、又はそれらを他のイネ科草本と区別するために、イネ科植物（ｔｒｕｅ ｇｒａｓｓ）と通常呼ばれる。竹も含まれる。草の約６００の属及び９，０００〜１０，０００又はそれ以上の種が存在する（世界草種のＫｅｗ指数）。

イネ科は、全世界で生育する主食穀物及び穀物、芝及び禾本科作物並びに竹を含む。イネ科は、一般的に、葉が生ずる稈に沿ったある間隔をおいた節と呼ばれる箇所で塞がれている（固体）稈と呼ばれる中空の茎を有する。草の葉は、通常、互生、対生（１つの面内）又はまれにらせん形であり、平行脈を有する。各葉は、一定の距離にわたり幹を抱く下葉鞘（ｌｏｗｅｒ ｓｈｅａｔｈ）及び通常完全な縁を有する葉身に分化する。多くの草の葉身は、草食動物を阻止する助けとなるシリカフィトリスにより硬化する。一部の草（刀状の葉を持つ草など）では、これにより、葉身の縁がヒト皮膚を切るのに十分に鋭利になる。葉舌と呼ばれる膜状付属体又はふさ毛（ｆｒｉｎｇｅ ｏｆ ｈａｉｒｓ）が葉鞘と葉身の間の接合点にあり、水又は昆虫が葉鞘に侵入するのを防いでいる。

草の葉は、葉身の基部において成長するものであって、伸びた茎の先端からではない。この低い成長点は、草食動物に対応して発達し、草が植物体の重大な損傷を伴うことなく食され、定期的に刈り取られることを可能にする。

イネ科の花は、小穂に特徴的に配列し、各小穂は、１つ又は複数の小筒花を有する（小穂は、穂又は下穂にさらに分類される）。小穂は、頴と呼ばれる、基部の２つ（又は時としてより少ない）の苞葉とそれに続く１つ又は複数の小筒花からなっている。小筒花は、花頴（外部のもの）及び内花頴（内部）と呼ばれる２つの苞葉によって囲まれた花からなっている。花は、通常、両性花（トウモロコシ（雌雄同株）は例外である）であり、受粉は、ほぼ常に風媒である。花被は、拡大し収縮して花頴と内花頴を広げる鱗被と呼ばれる２つの殻に変形する。これらは、変形がく片であると一般的に解釈されている。

イネ科の果実は、種皮が果実壁に融合し、したがって、それから分離しない（トウモロコシ穀粒におけるように）、頴果である。

草には成長習性の３つの一般的な分類があり、束タイプ（叢生とも呼ぶ）、ほふく性及び根茎性である。

草の成功は、一部はそれらの形態及び成長過程に、一部はそれらの生理学的多様性にある。草の大部分は、炭素固定化のＣ３及びＣ４光合成経路を用いて２つの生理学的群に分けられる。Ｃ４草は、暑い気候及び低二酸化炭素大気にそれらを特に順応させる特殊化Ｋｒａｎｚ葉解剖学に関連する光合成経路を有する。

Ｃ３草は、「寒地型牧草」と呼ばれるが、Ｃ４植物は、「暖地型草」とみなされる。草は、一年生又は多年生であり得る。一年生寒地型の例は、コムギ、ライムギ、イチゴツナギ属の各種の草（一年生の牧草（ａｎｎｕａｌ ｍｅａｄｏｗｇｒａｓｓ）、ポアナ（Ｐｏａ ａｎｎｕａ）及びオートムギ）である。多年生寒地型の例は、オーチャードグラス（カモガヤ、ダクチリス・グロメラータ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ））、フェスキュ（フェスク属種）、ナガハグサ及びホソムギ（ロリウム・ペレネ（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ））である。一年生暖地型の例は、コーン、スーダングラス及びパールミレットである。多年生暖地型の例は、ビッグブルーステム、インディアングラス、ギョウギシバ及びスイッチグラスである。

イネ科の１つの分類では、１２の亜科が認められる。これらは、１）アノモクロア亜種（Ａｎｏｍｏｃｈｌｏｏｉｄｅａｅ）：２つの属（アノモクロア、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｈａｅｔａ）を含む広葉草の小系統、２）ファロア亜科（Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ）：ファルス（Ｐｈａｒｕｓ）及びレプタスピス（Ｌｅｐｔａｓｐｉｓ）を含む３つの属を含む草の小系統、３）プエリア亜科（Ｐｕｅｌｉｏｉｄｅａｅ）：アフリカ属プエリア（Ｐｕｅｌｉａ）を含む小系統、４）コムギ、オオムギ、オートムギ、ブロムグラス（Ｂｒｏｎｎｕｓ）及びヨシ（ノガリヤス属）を含むイチゴツナギ亜科（Ｐｏｏｉｄｅａｅ）、５）タケを含むタケ亜科（Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ）、６）イネ及び野生イネを含むエールハルタ亜科（Ｅｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ）、７）ダンチク及びアシを含むダンチク亜科（Ａｒｕｎｄｉｎｏｉｄｅａｅ）、８）ラッパグサ亜科（Ｃｅｎｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅａｅ）：時としてキビ亜科（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ）に含まれる１１の属の小亜科、９）カゼクサ（スズメガヤ属、テフを含む約３５０種）、ドロップシード（ネズミノオ属、約１６０種）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．）及びムーリーグラス（ネズミガヤ属、約１７５種）を含むヒゲシバ亜科（Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｄｅａｅ）、１０）パニックグラス、トウモロコシ、モロコシ、サトウキビ、大部分のキビ、フォニオ及びブルーステムグラスを含むキビ亜科、１１）ミクライロア亜科（Ｍｉｃｒａｉｒｏｉｄｅａｅ）、１２）パンパスグラスを含むダンソニオダ亜科（Ｄａｎｔｈｏｎｉｏｄｉｅａｅ）であり、約５００種の草の属であるイチゴツナギ属については、両半球の温帯地域に固有のものである。

それらの可食種子のために生育させる農業用草本は、穀草類と呼ばれる。３種の一般的な穀草は、イネ、コムギ及びトウモロコシ（コーン）である。すべての作物のうち、７０％が草である。サトウキビは、砂糖の生産の主要な供給源である。草は、建設に用いられる。竹製の足場は、鋼鉄製足場を破壊するような台風の強風に耐えることができる。より大きい竹及びダンチク（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）は、材木と同様な方法で用いることができる頑丈な稈を有し、草の根は、芝土家屋の芝土を安定化する。アシは、木管楽器のリードを作るために用いられ、竹は、数えきれない器具に用いられている。

したがって、好ましいリグノセルロース系バイオマスは、草からなる群から選択される。代わりになるべきものとして述べると、好ましいリグノセルロース系バイオマスは、イネ又は禾本科に属する植物からなる群から選択される。

多糖含有バイオマスがリグノセルロース系である場合、前処理の前に、材料を、バイオマスの２０％（重量／重量）が好ましくは２６〜７０ｍｍの範囲にある断片に切断することができる。前処理材料は、好ましくは工程に入る前に２０％を超える乾燥物質含量を有する。前処理工程は、炭水化物をバイオマスから遊離させることのほかに、バイオマスを滅菌し、部分的に溶解し、同時にリグニン画分から塩化カリウムを洗い落とす。

バイオマスは、バイオマスの加水分解により得ることができる水溶性種に加水分解できるいくつかの化合物を含有する。例えば、セルロースは、グルコース、セロビオース及びより高分子量のグルコースポリマーに加水分解することができ、ダイマー及びオリゴマーを含む。セルロースは、炭水化物分解性（ｃａｒｂｏｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ）セルラーゼによりグルコースに加水分解される。セルロース分解系の一般的な理解では、セルラーゼを次の３つのクラスに分ける：エキソ−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）（ＥＣ３．２．１．９１）（これは、セルロース鎖の末端からセロビオース単位を切断する）、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ（ＥＧ）（ＥＣ３．２．１．４）（これは、セルロース鎖における内部β−１，４−グルコシド結合をランダムに加水分解する）、１，４−β−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）（これは、セロビオースをグルコースに加水分解し、またセロオリゴ糖からグルコース単位を切断する）。したがって、バイオマスがセルロースを含有する場合、グルコースは、バイオマスの加水分解から得ることができる水溶性加水分解種である。

同様な分析により、ヘミセルロースの加水分解生成物は、バイオマスの加水分解から得ることができる水溶性種である（もちろん、バイオマスがヘミセルロースを含有すると仮定する）。ヘミセルロースは、キシラン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン及びキシログルカンを含む。ヘミセルロース中の種々の糖がヘミセルラーゼにより遊離される。ヘミセルロース分解系は、ヘミセルロースの不均質な性質のため、セルロース分解系より複雑である。この系は、とりわけ、エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）（これは、キシラン鎖の内部結合を加水分解する）、１，４−β−Ｄ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）（これは、非還元性末端からキシロオリゴ糖を攻撃し、キシロースを遊離させる）、エンド−１，４−β−Ｄ−マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）（これは、内部結合を切断する）、１，４−β−Ｄ−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）（これはマンノオリゴ糖をマンノースに切断する）を含む。側基は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）、α−Ｄ−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．１３９）、シンナモイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．−）、アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．６）及びフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などのいくつかの酵素により除去される。

接触できる前処理バイオマスの組成物は、液体及び固体を含み、そのＣ５、Ｃ６、フルフラール量及び酵素アクセシビリティに基づいて特徴づけることができる。

組成物中の総Ｃ５糖は、組成物の液体及び固体中のアラビノース及びキシロースのモノマー、ダイマー、オリゴマー及びポリマーを含む組成物中のアラビナン及びキシランの合計である。

組成物中の総Ｃ６糖は、液体及び固体中のグルコースのモノマー、ダイマー、オリゴマー及びポリマーを含むグルカンの含量である。

文献において公知のように、一般的な水蒸気爆発バイオマスは、少なくとも５０のフルフラール対［Ｃ５糖＋Ｃ６糖］×１００００の比を有し、Ｃ５糖対Ｃ６糖の比は０．５５より大きい。実験的流れに示されているように、本明細書で述べる方法は、常に存在する０を超えるフルフラール含量を有するが、６０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比を有する水蒸気爆発生成物を製造することができる。したがって、０．４５〜０．５４の範囲のＣ５糖対Ｃ６糖の比、及び０〜６０、又はより好ましくは０〜５０、又はより好ましくは０〜３０のフルフラール対［Ｃ５糖＋Ｃ６糖］×１００００の比を有する組成物が企図される。

水蒸気爆発による組成物は、フルフラールを常に有し、０．４５未満のＣ５糖対Ｃ６糖の比及び４０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又はより好ましくは、０．４５未満のＣ５糖対Ｃ６糖の比及び１５未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又はより好ましくは０．４５未満のＣ５糖対Ｃ６糖の比及び１０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又はより好ましくは０．４０未満のＣ５糖対Ｃ６糖の比及び４０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又はさらにより好ましくは０．４０未満のＣ５糖対Ｃ６糖の比及び９未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、０．３５未満のＣ５糖対Ｃ６糖の比及び１０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又はさらにより好ましくは０．３０未満のＣ５糖対Ｃ６糖の比及び７未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比を有すると特徴づけることができる。

流れの液体部分の組成物は、特有であり、フルフラールを常に有し、４．０を超えるＣ５糖対Ｃ６糖の比及び８０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又はより好ましくは４．０を超えるＣ５糖対Ｃ６糖の比及び６０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又はさらにより好ましくは４．０を超えるＣ５糖対Ｃ６糖の比及び３０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比、又は３．０を超えるＣ５糖対Ｃ６糖の比及び１６０未満のフルフラール対（Ｃ５糖＋Ｃ６糖）×１００００の比の最も広い範囲を有すると述べることができる。

組成物は、その酵素アクセシビリティによってさらに特徴づけられる。水蒸気爆発が通常最終ステップとなる前処理の後、バイオマス組成物を加水分解ステップに送ってセルロースを解重合することにより粘度を低下させる。これは、一般的に酵素の存在下で行う。反応が速いほど、セルロース材料が酵素に、より高度に接触でき、したがって、酵素アクセシビリティという用語である。

加水分解工程において、酵素アクセシビリティは、標準的酵素がセルロース成分をどの程度速やかに加水分解することができるかの尺度である。酵素アクセシビリティは、一定時間に変換されるセルロースの総量のパーセントとして表される。

一般的なバイオマス組成物において、酵素アクセシビリティは、約７２時間で９０％である。これは、利用できる総セルロース材料の９０％を加水分解するのに約７２時間を要したことを意味する。より高い酵素アクセシビリティは、より多くのセルロース材料がより短時間に変換されることを意味する。酵素アクセシビリティは、時間の単位におけるパーセントとしても表すことができる。例えば、２４時間における５０％の酵素アクセシビリティは、利用できるセルロースの５０％が２４時間で変換されたことを意味する。これはまた、２４時間で酵素アクセシビリティが５０％、又は５０％の２４時間酵素アクセシビリティと表すこともできる。

２４時間で少なくとも３０％の酵素アクセシビリティ、２４時間で酵素アクセシビリティが少なくとも３０％、少なくとも３０％の２４時間酵素アクセシビリティという語句はすべて、セルロースの３０％〜１００％が２４時間で変換されたことを意味する。

発明された組成物がどのような原因でそのような高い酵素アクセシビリティを有するのかは不明であるが、弁の直径と相対的な水蒸気爆発の時間の長さがより高いアクセシビリティ数を生じさせると考えられる。

実験の項で示すように、この材料の酵素アクセシビリティは、２４時間までにセルロースの少なくとも３０％が加水分解されたというほどのものである。好ましい組成物は、少なくとも５０％の２４時間酵素アクセシビリティを有し、より好ましい組成物は、少なくとも６１％の２４時間酵素アクセシビリティを有し、別の好ましい組成物は、少なくとも７１％の２４時間酵素アクセシビリティを有し、別の好ましい組成物は、少なくとも７５％の２４時間酵素アクセシビリティを有し、別の好ましい組成物は、少なくとも８１％の２４時間酵素アクセシビリティを有し、別の好ましい組成物は、少なくとも９１％の２４時間酵素アクセシビリティを有し、最も好ましい組成物は、少なくとも９０％の２４時間酵素アクセシビリティを有する。すべての２４時間酵素アクセシビリティの測定は、３０ＦＰＵ／ｇグルカンに相当する酵素量を用いて行う。

組成物は、Ａｎｄｒｉｔｚ Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ Ｆａｌｌｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）から一般的に入手できる装置を用いて以下の方法で作製した。

実験の項で詳述するように、用いたセルロース系バイオマス材料の原料は、実験の表に示したものであった。特に示さない限り、原料は、第１の加圧反応器に連続的に供給した。セルロース系バイオマス原料は、主としてＣ５糖であるヘミセルロースを溶解し加水分解するために示した圧力及び温度の、表示した量の水蒸気の率で水蒸気を加えることにより処理した。溶解ヘミセルロース、Ｃ５糖及び非晶質Ｃ６糖並びに加水分解副生成物を含んでいた液体流を加圧反応器から液体として抜き出した。

反応器中の原料から液として除去されたＣ５糖副生成物の例としては、アルデヒド（ＨＭＦ、フルフラール及びホルムアルデヒド）、モノマーフェノール樹脂（バニリン及びコニフェリルアルデヒド）及び酸（例えば酢酸及びギ酸）などがある。第１の反応器から溶解ヘミセルロースを除去した後、残りの原料を第１の反応器から排出させて、密封又は抽出に供した。原料は、加圧されたままであり、第１の反応器から排出スクリューを経て排液スクリューに、さらにＡｎｄｒｉｔｚ（ＭＳＤ）Ｉｍｐｒｅｓｓａｆｉｎｅｒ（登録商標）に移した。インプレッサファイナー（Ｉｍｐｒｅｓｓａｆｉｎｅｒ）は、原料に加えられた圧力を第１の反応器内の圧力を上回るレベルに、また水蒸気爆発に適するレベルに増加させ、圧力が増加するにつれてより多くの液体も除去した。

水蒸気爆発反応器は、示したように原料を水で浸出させる機能を果たした。原料を示した時間保持した後、原料を水蒸気爆発反応器から１０ｍｍレジューサーを介して排出させた後、大規模収集容器に入れて大気に曝露する前に直径２５ｍｍのブロー弁を介して５ｍの長さを有する１５ｍｍのブロー管路に通した。ブロー弁は、表示した百分率開放した。

排出は、次の通りに行った。すなわち、水蒸気爆発反応器の排出時の原料の圧力は、示した通りであり、水蒸気爆発反応器に取り付けたブロー弁に原料を通すことによって大気圧に劇的に低下させた。ブロー弁にわたる圧力降下は、示した圧力の降下であった。原料の細胞中の水の水蒸気への転換がセルロース系バイオマス原料中の細胞の破砕爆発をもたらした。

水蒸気爆発反応器の排出時の原料の圧力は、示した通りであり、圧力は大気圧に低下した。

実験
これらの実験の目的は、物理化学的処理（「前処理」）により、酵素的加水分解及び発酵によってその後にバイオエタノールに変換され得る材料を生成することであった。該材料（以下では「前処理（済み）」と名づける）は、様々な必要条件を満たさなければならない。したがって、化学的観点からは、それは、出発材料（原料）に基づいて計算される最大可能量の発酵性Ｃ_５及びＣ_６糖を含有しなければならない。物理的観点からは、バイオマスは、解重合されるべきセルロースへの酵素の接触を妨げる複雑なヘミセルロース及びリグニンネットワークを破壊することによって前処理において爆破されなければならない。

前処理の効率は、これらの側面の両方に基づいて評価する。化学的効果に関しては、下に示すデータは、得られた生成物に関する一般的なパラメーター、すなわち、生成物中のＣ_５及びＣ_６糖の量並びに主な分解生成物としてそれにおいて形成したフルフラールの量を示す。

一方、物理的効果は、間接的に、すなわち、「酵素アクセシビリティ」、すなわち、前処理固体中に存在するグルカンが標準的条件下で酵素にどの程度接触できるかを測定することによってのみ評価する。

比較のために、下に示すデータは、外部で実施された、いくつかの実験で測定された対応パラメーターも含む。

用いた装置
前処理は、１つは回分式で稼働し、他は連続的に稼働する２つの異なる種類の装置で実施する。

回分法に用いる装置は、ボール弁によって閉じることができる管により６００ｄｍ^３膨張容器に接続されている、１０ｄｍ^３の容積を有する断熱反応器である。反応器は、上部のバイオマスの入口と、同じく上部に配置された２つの水蒸気入口を有する。反応器に導入される水蒸気は、コントロールパネルから空気圧式アクチュエータにより調節される。水蒸気の圧力は、手動弁により調節されるが、低く維持された。反応器には蝶型弁を取り付けた通気口も装備されている。後者は、手動で操作されるタップにより調節される。最後に、反応器は、圧縮空気の入口も備えており、これも手動で調節される。他方で、上述の膨張容器は、ブリーザー管により外側に接続され、外側の冷却ジャケットとの接触時間を最大限にすると同時に反応器から入ってくるバイオマスを導くためにその内側表面に位置するバッフルが取り付けられている。処理済みバイオマスは、スライドゲート弁で閉じることができる底部の出口開口部を経て排出される。装置は、３００バールの圧力を発生することができ、前処理後に固体から液相を除去するために用いられる手動プレスも含む。

連続法に用いる装置は、特許文献１に記載されているものと本質的に同じである。現在の変形形態は、２つのボール弁を側面に配置した圧力チャンバーを経てバイオマスを導入するための部分を含む。バイオマスは、その中に水蒸気を導入することにより所要の圧力に維持されている垂直な反応器（反応器１）にこのチャンバーから供給される。処理後、バイオマスは、反応器の底部に配置されているスクリューコンベアにより排出される。この第１のスクリューコンベアは、水による材料の洗浄に起因し得る水蒸気の凝縮によってもたらされる液体を除去するために用いられる、第２の傾斜スクリューコンベアに接続されている。この部分の下流では、バイオマスは、高圧縮比で操作される、Ａｎｄｒｉｔｚ ＡＧから入手した「ＭＳＤインプレッサファイナー」と呼ばれるスクリューコンベアに通される。この装置は、異なる圧力下にあった可能性がある、上流部から下流部を分離するために必要な材料プラグを形成するのに用いられる。さらに、液体のさらなる除去もここで実施することができる。ＭＳＤインプレッサファイナーの下流に位置する部分は、２つのウォームコンベアを含み、その最初のものは、反応器２と呼ばれる。これらのウォームコンベアの末端に取り付けられている自動排出弁は、瞬時の減圧をもたらす「ブローダウン配管」と呼ばれる管に接続されている。バイオマスは、最終的にサイクロンに通され、そこで揮発性成分及び過剰の水蒸気が除去される。

除去された液体は、可能なリサイクルのために、場合によっては加圧下に保持された２つの別個のタンクに収集される。

酵素的加水分解自体は、実験室規模の３．６リットルＩｎｆｏｒｓ発酵槽内で実施した。これらの反応器は、ジャケットが取り付けられ、それらの内部の温度は、それらの内部に取り付けられたセンサーの表示に基づいて調節される。ｐＨは、それぞれ酸及び塩基の添加のための２台の蠕動ポンプを作動させるプローブを用いて測定する。バイオリアクターには、２つのペルトンタービンに接続された回転軸撹拌器が取り付けられている。

用いた材料
実験は、組成が以下の通りである２種の原料バイオマス（１つはセイヨウフイリダンチク（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）からのものであり、他はモロコシ繊維からのものである）を用いて行う。

表１ − 出発材料の組成

バイオマスの組成は、以下の標準的分析法により測定した。

バイオマス中の構造炭水化物及びリグニンの測定
２００８年４月２５日に発行された実験室分析手順書（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（ＬＡＰ）
２００８年４月に改訂された技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１８を参照のこと。
［ＮＲＥＬ＝Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］

バイオマス中の抽出成分の測定
２００５年７月１７日に発行された実験室分析手順書（ＬＡＰ）
２００８年１月の技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１９を参照のこと。

組成の測定用の試料の調製
２００５年９月２８日に発行された実験室分析手順書（ＬＡＰ）
２００８年１月の技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２０を参照のこと。

バイオマス中の総固体及び得られた液体試料中の総溶解固体の測定
２００８年３月３１日に発行された実験室分析手順書（ＬＡＰ）
２００８年３月に改訂された技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２１を参照のこと。

バイオマスの灰分含量の測定
２００５年７月１７日に発行された実験室分析手順書（ＬＡＰ）
２００８年１月の技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２２を参照のこと。

得られた液相中の糖、副生成物及び分解生成物の測定
２００６年１２月８日に発行された実験室分析手順書（ＬＡＰ）
２００８年１月の技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２３を参照のこと。

前処理済みバイオマス中の不溶性固体の測定
２００８年３月２１日に発行された実験室分析手順書（ＬＡＰ）
２００８年３月の技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２７を参照のこと。

酵素的加水分解中の酵素へのバイオマスのアクセシビリティを測定するために用いた酵素カクテルは、すべての実験において以下の組成を有する。

セルラーゼ複合体は、セルロースのグルコース、セロビオース及びより高い分子量を有するグルコースオリゴマーへの分解を触媒する酵素製剤である。

キシラナーゼ及びヘミセルラーゼ溶液は、ヘミセルロースの単糖又はオリゴ糖の形態のその成分への解重合を主として触媒するが、それらは、より低い程度でいくつかの他の触媒活性も有する。

「酵素複合体」は、種々の炭水化物に作用し、それを用いて調製された溶液全体の活性を改善する酵素溶液である。

酵素カクテルは、以下の活性特性を有する。

各種酵素活性単位は、以下のように定義される。

ろ紙単位（ＦＰＵ）は、ＮＲＥＬの実験室分析手順書に記載されているように測定し、定義する（２００８年１月の技術報告書ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２８参照）。工業規格の使用を伴う、この方法において、セルラーゼ活性は、最初（未希釈）の酵素溶液の１ミリリットル当たりのろ紙単位数（ＦＰＵｓ）として測定する。定量的結果を得るために、酵素製剤は、有意且つ同一である変換に基づいて比較しなければならない。所与の酵素について、１ＦＰＵは、５０℃で６０分に５０ｍｇのＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１ろ紙から２．０ｍｇの還元糖（グルコースとして測定）を遊離させる（変換：４％）のに必要な酵素の量である。それは、国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）によりＦＰＵの値を計算するための途中で捕らえるもの（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）として定義された。

キシラナーゼ活性は、既知の活性を有する標準酵素に関連してＦＸＵにより測定する。下記のように上清液について行われた分光光度定量により得られた結果を基準試料について得られた標準曲線と比較する。

この定量のために、シキラナーゼ試料をレマゾール染色コムギから抽出されたアラビノキシランからなる基質とともにインキュベートする。未変換基質をエタノールで沈殿させる。非沈殿基質中の分解生成物が上清液に与えた青色の強度は、シキラナーゼ活性に比例するが、色プロファイルは、酵素によって異なり得る。

ここで、
・Ｃは、ＦＸＵ／ｍｌ単位で標準曲線から読み取った酵素活性である。
・Ｆは、ｍｌ単位の試料の容積である。
・Ｄは、試料のその後の希釈度（例えば、第２又は第３の希釈度）であり、
・Ｗは、試料のｇ単位の重量である。

１ＦＢＧ単位は、下記のソモギ−ネルソン法により行った標準的手順で１分当たり１モルのグルコースに相当する還元能を有する量のグルコース（又は還元炭水化物）を遊離させる酵素の量である。

標準的反応条件：
・試料は、０．０２〜１０ＦＢＧ／ｍｌの活性に希釈すべきである
・基質：０．５％のベータグルカン
・温度：３０℃
・ｐＨ：５．０
・反応時間：３０分

真菌ベータグルカナーゼは、ベータグルカンと反応して、グルコース又は還元炭水化物を形成する。

ｐＨは、補正の目的のためのＨ_２ＳＯ_４の１Ｍ水溶液及びＮａＯＨの１Ｍ水溶液を用いた自動調整システムを用いて約５の値に維持した。

試験方法の手順
一定量の乾燥バイオマスを最初に調製し、次いで、室温にて水で処理して、その含水量を所要のレベルに調節する。用いる条件下では、水は、遊離形態で存在するのではなく、バイオマスにより吸収されている。

回分法（装置１において実施）
この場合、前処理は、２つの連続的段階からなっている。第１の段階において、反応器に水蒸気入口弁を閉じたまま一定量のバイオマスを装入する。この量は、乾燥物質ベースで計算して、約１．５ｋｇである。次いで、水蒸気を、飽和を保証するために必要な温度及び圧力に達するまで反応器に通す。設定値に達したとき、システムを所定の時間ｔの間静止条件下に保持する。その後、圧力を徐々に開放し、バイオマスを回収する。３００バールの圧力で操作されるプレスでバイオマスを圧縮することにより、形成した固相及び液相を分離する。固相は、同じ反応器内での新たな操作サイクルのために、方法の第２の段階に用いられる。この段階は、圧力を通気口を介して徐々に開放せずに、瞬時に「水蒸気爆発弁」を完全に開くことにより圧力を開放すること以外は、前回のように実施する。したがって、材料がタンク内で膨張し、揮発成分及び過剰な水が排出される。この前処理で得られた材料を次に、以下の条件下で行わせる酵素的加水分解のために実験室規模のバイオリアクター内に通す。
Ｔ＝４５℃
撹拌速度＝３００ｒｐｍ
ｐＨ＝５
乾燥物質含量＝７．５重量％
Ｔ＝２４時間

材料において遊離されるグルコースの量は、上述の方法により測定し、得られた値を用いて、以下の式により収率を計算する。

ここで、
Ｙ_{ｇｌｕｃｏｓｅ．２４ｈ}は、総可溶性量に基づいて計算される２４時間後のグルコースの収率であり、
ｃ_{ｇｌｕｃｏｓｅ．２４ｈ}は、２４時間後の液相中のグルコースの濃度であり、
ＷＩＳは、総重量に基づいて重量％単位で計算される２４時間後の非可溶化固体の量であり、
ρ_{ｌｉｑｕｉｄ}は、液相の密度であり、
Ｗ_{ｇｌｕｃｏｓｅ，０ｈ}は、総重量に基づいて計算される時間ｔ＝０でのグルカンの重量であり、
１.１１１は、グルコースの分子量（１８０ｇ／ｍｏｌ）とグルカンの分子量（１６２ｇ／ｍｏｌ）との差を考慮に入れる係数である。

連続法（装置２で実施）
この場合、材料を最初に所要の供給速度を用いて半連続式で圧力チャンバー内に通す。所要の圧力に到達したとき、バイオマスを反応器１に供給する。そこにおける滞留時間は、それまでの蓄積に依存し、水蒸気は、熱損失を補うために場合によって流入させる。次いで、材料を最初に排出スクリューコンベアに、次いで傾斜スクリューコンベアに通し、そこで過剰液体の第１の部分を除去する。次いで、材料をＭＳＤインプレッサファイナーに通し、そこでそれを圧縮することによってより多くの液体を除去する。その後、バイオマスを上述の材料プラグを経て反応器２中に移す。必要に応じて水蒸気を反応器に通すことにより、この反応器内の所要の温度及び圧力を得ることができる。次に材料を最終スクリューコンベアによりブローダウン配管内に移す。ここで起きる減圧により、圧力がサイクロン内で支配的な値に低下した。このブローダウン配管は、約６メートルの長さと約２５ｍｍ（１インチ）の内径を有する。

この操作を制御する弁は、次のような異なる仕方で開くことができる。すなわち、常時ある程度開いたままにすることができ、又はある時間の間閉じておき次の期間にある程度開いておくことができる。

得られた材料を次に、回分法の場合と同じ酵素的加水分解及び分析にかける。

実験条件及び結果
両方の場合に上述の適切な手順を用いて、連続法は８回、回分法は２回実施する。比較のために、以下の表に、１つの水蒸気爆発反応器のみを含む工場、すなわちＴｒｉｓａｉａに所在するＥＮＥＡ工場で実施された他の２回の実験の対応するデータも含める。

以下の表に示すデータは、実験条件並びにバイオマスの組成及び用いた酵素へのそのアクセシビリティの両方について得られた結果を示す。

表２にすべての実験で得られた結果を示す。実験１〜８は、装置２において連続法により行い、実験９及び１０は、装置１を用いて回分法により行った。実験１１及び１２は、スクリューコンベア及び最終爆発を含めて１つの反応器のみを備えたＥＮＥＡ工場で実施された。

表３に乾燥物質として計算したＣ６及びＣ５糖並びにフルフラールの量に関する前処理の終了時に得られた材料の組成、並びにこれらの成分間の比を示す。

表２−実験条件及び達成された酵素へのアクセシビリティ

表３−水蒸気誘発爆発後のバイオマスの組成

Claims (17)

1. 固体、液体、組成物の液体及び固体中のアラビナン及びキシラン並びにアラビノース及びキシロースのモノマー、ダイマー、オリゴマー及びポリマーの量に基づく量のＣ５糖、組成物の液体及び固体中のグルカンのモノマー、ダイマー、オリゴマー及びポリマーを含むグルカン含量に基づく量のＣ６糖並びにフルフラールを含むバイオマスの組成物であって、少なくとも３０％の２４時間酵素アクセシビリティを有することを特徴とする、組成物。
2. Ｃ５糖の量とＣ６糖の量との比が０．５０より大きく、フルフラールの量とＣ５糖及びＣ６糖の合計量との比が０より大きく、０．００６０以下である、請求項１に記載の組成物。
3. フルフラールの量とＣ５糖及びＣ６糖の合計量との比が０より大きく、０．００５０以下である、請求項１に記載の組成物。
4. フルフラールの量とＣ５糖及びＣ６糖の合計量との比が０より大きく、０．００４０以下である、請求項１に記載の組成物。
5. フルフラールの量とＣ５糖及びＣ６糖の合計量との比が０より大きく、０．００３０以下である、請求項１に記載の組成物。
6. フルフラールの量とＣ５糖及びＣ６糖の合計量との比が０より大きく、０．００１６以下である、請求項１に記載の組成物。
7. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の１１〜９９重量％の範囲にある、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
8. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の１４〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
9. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の１６〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
10. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の１９〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
11. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の２１〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
12. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の２４〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
13. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の２６〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
14. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の２９〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
15. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の３１〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
16. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の３６〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
17. 前記組成物中の前記固体の量が、前記組成物の４１〜９９重量％の範囲にある、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。