JP2013521771A - 細胞内病原体について試験する方法 - Google Patents
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Abstract
１つより多い細胞内病原体を含有する可能性がある生物学的試料における第１の細胞内病原体が、（ｉ）第２の細胞内病原体の増殖を阻害する作用物質の存在下で、試料を細胞集団と接触させる工程、（ｉｉ）第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で細胞をインキュベートする工程、および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた材料を第１の細胞内病原体について試験する工程を含む方法によって研究される。上記の方法において、上記前記第１の病原体および第１の病原体は、原核生物、真核生物、および／またはウイルスである。
Description
本発明は、生物学的試料において細胞内病原体を研究するための方法に関する。より具体的には、本発明は、１つより多い細胞内病原体を含有する生物学的試料を研究する方法、および第１の細胞内病原体の存在について第２の細胞内病原体の存在下で観察または試験する方法に関する。
同じ生物学的試料、例えば、患者から、もしくは細胞培養物から単離された試料において２つの異なる細胞内病原体を研究すること、または１つの細胞内病原体を他の細胞内病原体の存在下で観察することは興味深いことであり得る。しかしながら、１つのそのような病原体の存在は、他の病原体の観察に干渉する場合が多い。
例えば、細胞内病原体の効果が、一般的な表現型結果をもたらすアッセイ（「表現型アッセイ」）において研究される場合、観察できるものが、必ずしも、特定の病原体に特異的であるとは限らない。例えば、ウイルス学において、細胞培養物において観察されるプラークは、そのようなプラークを引き起こす能力があるさらなる病原体もまた存在する場合には、必ずしも所定のウイルスに起因し得るとは限らない。
しかしながら、一般的な表現型アッセイを用いることが望ましい場合が多い。病原体を観察する他のより特異的な方法は、異なる不利益を被る。より特異的な方法は、実施するのにそれほど直接的または迅速ではない場合が多い。そのような他の方法はまた、さらなる限定を課する特定の試薬を必要とする場合がある。
例えば、免疫学的アッセイは、抗体が入手可能であることを必要とする。免疫学的アプローチの有用性はさらに、試料に存在する可能性がある複数の病原体に対して抗体が交差反応性である場合、さらに限定され得る。いくつかの診断的目的にとって、抗体の関連病原体への幅広い交差反応性が望ましい場合がある。他方、そのような交差反応性は、関連の共存する病原体を免疫学的方法によって独立的に研究することを不可能にする可能性がある。
病原体についてのＰＣＲに基づいた試験はより特異的であり得る。しかしながら、ＰＣＲに基づいた方法は、関心対象となる各病原体についてゲノム配列が知られていることを必要とする。プライマーは、関心対象となる各病原体について設計され、かつ最適化されなければならない。
特異的な抗体またはプライマーの要件は、免疫学的方法およびＰＣＲに基づいた方法の両方の柔軟性、特に、病原体の性質が知られていない場合、病原体を観察するためのそれらの有用性を制限する。これらの特異的な方法の有用性は、急速に進化する病原体、例えば、特定のウイルスの場合、さらに制限される可能性があり、それは、抗体によって認識されるエピトープ、またはＰＣＲプライマーによって認識される配列に変異が起こる可能性があるためである。
生物学的試料において関心対象となる細胞内病原体を、他の細胞内病原体とは独立して研究するためのさらなる改善された方法を提供することが、本発明の目的である。
本発明は、以下の工程を含む、生物学的試料において第１の細胞内病原体について試験するための方法を提供する：
（ｉ）阻害作用物質の存在下で、試料を細胞集団と接触させる工程であって、前記作用物質が第２の細胞内病原体の増殖を阻害する、工程、
（ｉｉ）前記第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で細胞をインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた材料を前記第１の細胞内病原体について試験する工程。
（ｉ）阻害作用物質の存在下で、試料を細胞集団と接触させる工程であって、前記作用物質が第２の細胞内病原体の増殖を阻害する、工程、
（ｉｉ）前記第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で細胞をインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた材料を前記第１の細胞内病原体について試験する工程。
本発明の方法により、生物学的試料は迅速に試験することができる。本発明は、例えば一般的な表現型アッセイにより、単純で直接的な様式で、生物学的試料を細胞内病原体について試験することを可能にする。好ましい方法は、そのようなアッセイにおいて同じ、等価の、または類似した結果をもたらすであろうさらなる細胞内病原体の、試料における（実際の、または疑われる）存在とは独立して、関心対象となる細胞内病原体を研究することを可能にする。
本発明はまた、生物学的試料を以下の状況において細胞内病原体について試験することを可能にする：
− １つもしくは複数の細胞内病原体（例えば、上記および特許請求の範囲で定義された方法の第１の細胞内病原体）の試料における存在が知られていない状況、および／または
− 試料における１つもしくは複数の細胞内病原体（例えば、上記および特許請求の範囲で定義された方法の第１の細胞内病原体）のゲノム配列が知られていない状況、および／または
− 試料における１つまたは複数の細胞内病原体（例えば、上記および特許請求の範囲で定義された方法の第１または第２の細胞内病原体）に対する抗体が入手できない状況、および／または
− 第２の細胞内病原体に対する抗体が用いられない状況、
− 試料における２つ以上の細胞内病原体に対する抗体が交差反応性である状況、および／または
− 試験結果を迅速に得ることが望ましい状況。
− １つもしくは複数の細胞内病原体（例えば、上記および特許請求の範囲で定義された方法の第１の細胞内病原体）の試料における存在が知られていない状況、および／または
− 試料における１つもしくは複数の細胞内病原体（例えば、上記および特許請求の範囲で定義された方法の第１の細胞内病原体）のゲノム配列が知られていない状況、および／または
− 試料における１つまたは複数の細胞内病原体（例えば、上記および特許請求の範囲で定義された方法の第１または第２の細胞内病原体）に対する抗体が入手できない状況、および／または
− 第２の細胞内病原体に対する抗体が用いられない状況、
− 試料における２つ以上の細胞内病原体に対する抗体が交差反応性である状況、および／または
− 試験結果を迅速に得ることが望ましい状況。
本発明の方法は、工程（ｉｉｉ）の試験結果が１２ヶ月以内、または例えば、９ヶ月以内、８ヶ月以内、７ヶ月以内、６ヶ月以内、５ヶ月以内、４ヶ月以内、３ヶ月以内、２ヶ月以内、１ヶ月以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内、１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内、またはそれより早く、得られる実施形態を包含する。
本発明の方法の細胞内病原体
本発明の方法の第１および第２の細胞内病原体は、原核生物（すなわち、細菌（複数可））、真核生物（原生動物（複数可）または真菌（複数可））、および／またはウイルス（複数可）から選択される１つまたは複数の細胞内病原体を包含してもよい。第１の細胞内病原体は、第２の細胞内病原体と異なる。第１および第２の病原体は、それらを異なって阻害することを可能にする、いかなる態様で異なってもよい。例えば、それらは、目、科、属、種、亜種、および／または菌株において異なってもよい。
本発明の方法の第１および第２の細胞内病原体は、原核生物（すなわち、細菌（複数可））、真核生物（原生動物（複数可）または真菌（複数可））、および／またはウイルス（複数可）から選択される１つまたは複数の細胞内病原体を包含してもよい。第１の細胞内病原体は、第２の細胞内病原体と異なる。第１および第２の病原体は、それらを異なって阻害することを可能にする、いかなる態様で異なってもよい。例えば、それらは、目、科、属、種、亜種、および／または菌株において異なってもよい。
第１の細胞内病原体は、原核生物、真核生物、および／またはウイルスであってもよい。好ましくは、第１の細胞内病原体はウイルスである。
第２の細胞内病原体は、原核生物、真核生物、および／またはウイルスであってもよい。好ましくは、第２の細胞内病原体はウイルスである。
本発明は、様々な型のアッセイを包含し、例えば、一実施形態において、第１の細胞内病原体は、原核生物（例えば、下記に列挙された好ましい原核生物のうちの１つまたは複数）、真核生物（例えば、下記に列挙された好ましい真核生物のうちの１つまたは複数）、および／またはウイルス（例えば、下記に列挙された好ましいウイルスのうちの１つまたは複数）を含み、第２の細胞内病原体は原核生物（例えば、下記に列挙された好ましい原核生物のうちの１つまたは複数）を含む。
さらなる実施形態において、第１の細胞内病原体は、原核生物（例えば、下記に列挙された原核生物のうちの１つまたは複数）、真核生物（例えば、下記に列挙された真核生物のうちの１つまたは複数）、および／またはウイルス（例えば、下記に列挙されたウイルスのうちの１つまたは複数）を含み、第２の細胞内病原体は真核生物（例えば、下記に列挙された好ましい真核生物のうちの１つまたは複数）を含む。
さらなる実施形態において、第１の細胞内病原体は、原核生物（例えば、下記に列挙された原核生物のうちの１つまたは複数）、真核生物（例えば、下記に列挙された真核生物のうちの１つまたは複数）、および／またはウイルス（例えば、下記に列挙された好ましいウイルスのうちの１つまたは複数、例えば、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、および／または例えば、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、および／またはノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ））を含み、第２の細胞内病原体はウイルス（例えば、下記に列挙された好ましいウイルスのうちの１つまたは複数、例えば、インフルエンザウイルス、および／または例えば、ライノウイルス、ロタウイルス、エンテロウイルス、ヒト免疫不全ウイルスもしくはサル免疫不全ウイルス、および／またはノロウイルス、および／または例えば、パラインフルエンザウイルス）を含む。
本発明によれば、原核生物には、バルトネラ属、ボルデテラ属、ブルセラ属、クラミジア目、クラミジア科（Ｃｈｌａｍｉｄｉａｃａｅ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、エールリヒア属、エシェリキア属、フランシセラ属、レジオネラ属、リステリア属、ミコバクテリウム属、ミコバクテリウム属、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、サルモネラ属、赤痢菌属、連鎖球菌属、エルジニア属から選択される細胞内病原体を挙げることができる。
特に、原核生物には、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｇｒａｈａｍｉｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｅｃｏｒｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｃａｖｉａｅ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、リケッチア属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓから選択される細胞内病原体を挙げることができる。
本発明によれば、真核生物には、バベシア属、クリプトコックス属、クリプトスポリジウム属、アイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、ヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、リーシュマニア属、プラスモディウム属、タイレリア属（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、トキソプラスマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、トリパノソーマ属から選択される細胞内病原体を挙げることができる。
特に、真核生物には、Ｂａｂｅｓｉａ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｉｍｅｒｉａ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉを挙げることができる。
本発明によれば、ウイルスには、以下を挙げることができる：
− ＲＳウイルス（ＲＳＶ）を含む肺炎ウイルス属などの肺炎ウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）；
− 麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属；
− コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルス、およびエンテロウイルスなどのピコルナウイルス科のエンテロウイルス属；
− 哺乳類レオウイルス科、特にオルトレオウイルス（ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）（例えば、哺乳類レオウイルス（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ））および／もしくはロタウイルス；
− トリレオウイルス科、特に、トリレオウイルス（ａｖｉａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ）などのオルトレオウイルス；
− ヒトメタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）（ＨＭＰＶ）などのパラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属；
− 流行性耳下腺炎ウイルスなどのパラミクソウイルス科のルブラウイルス属；
− 風疹ウイルスなどのトガウイルス科；
− ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス科、ヒトコロナウイルス；
− ピコルナウイルス科のライノウイルス属；
− ライノウイルスのＭ株
− ヒトヘルペスウイルス２（ＨＨＶ３）としても知られた水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）；
− ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルスなどのポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）；
− ブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）；
− ブタピコルナウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）；
− ブタ水疱病ウイルス（ｓｗｉｎｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＶＤＶ）；
− テッシェン−タルファン（Ｔｅｓｃｈｅｎ−Ｔａｌｆａｎ）ウイルス；
− イヌパルボウイルス（ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）（ＣＰＶ）もしくはブタパルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）などのパルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、またはボカウイルス属（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、例えば、ヒトボカウイルス（ｈｕｍａｎ ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）；
− オルトミクソウイルス科、特にインフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルス；
− パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラインフルエンザウイルス５型；
− ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス１および２；
− ヒトアデノウイルスおよびサルアデノウイルスを含むアデノウイルスなどのアデノウイルス科；
− トリサーコウイルス（ａｖｉａｎ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）；
− ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などの免疫不全ウイルス（ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）；
− ノロウイルス；および／または
− 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ガンボロ（ｇｕｍｂｏｒｏ）ウイルスとしても知られている）などのビルナウイルス科。
− ＲＳウイルス（ＲＳＶ）を含む肺炎ウイルス属などの肺炎ウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）；
− 麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属；
− コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルス、およびエンテロウイルスなどのピコルナウイルス科のエンテロウイルス属；
− 哺乳類レオウイルス科、特にオルトレオウイルス（ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）（例えば、哺乳類レオウイルス（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ））および／もしくはロタウイルス；
− トリレオウイルス科、特に、トリレオウイルス（ａｖｉａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ）などのオルトレオウイルス；
− ヒトメタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）（ＨＭＰＶ）などのパラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属；
− 流行性耳下腺炎ウイルスなどのパラミクソウイルス科のルブラウイルス属；
− 風疹ウイルスなどのトガウイルス科；
− ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス科、ヒトコロナウイルス；
− ピコルナウイルス科のライノウイルス属；
− ライノウイルスのＭ株
− ヒトヘルペスウイルス２（ＨＨＶ３）としても知られた水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）；
− ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルスなどのポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）；
− ブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）；
− ブタピコルナウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）；
− ブタ水疱病ウイルス（ｓｗｉｎｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＶＤＶ）；
− テッシェン−タルファン（Ｔｅｓｃｈｅｎ−Ｔａｌｆａｎ）ウイルス；
− イヌパルボウイルス（ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）（ＣＰＶ）もしくはブタパルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）などのパルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、またはボカウイルス属（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、例えば、ヒトボカウイルス（ｈｕｍａｎ ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）；
− オルトミクソウイルス科、特にインフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルス；
− パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラインフルエンザウイルス５型；
− ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス１および２；
− ヒトアデノウイルスおよびサルアデノウイルスを含むアデノウイルスなどのアデノウイルス科；
− トリサーコウイルス（ａｖｉａｎ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）；
− ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などの免疫不全ウイルス（ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）；
− ノロウイルス；および／または
− 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ガンボロ（ｇｕｍｂｏｒｏ）ウイルスとしても知られている）などのビルナウイルス科。
したがって、第１および／または第２の細胞内病原体は、バルトネラ属、ボルデテラ属、ブルセラ属、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、エールリヒア属、エシェリキア属、フランシセラ属、レジオネラ属、リステリア属、ミコバクテリウム属、ミコバクテリウム属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、連鎖球菌属、エルジニア属、バベシア属、クリプトコックス属、クリプトスポリジウム属、アイメリア属、ヒストプラスマ属、リーシュマニア属、プラスモディウム属、タイレリア属、トキソプラスマ属、トリパノソーマ属、肺炎ウイルス亜科、肺炎ウイルス属、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属、コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルスおよびエンテロウイルス、哺乳類レオウイルス科、トリレオウイルス科、オルトレオウイルス、ロタウイルス、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、流行性耳下腺炎ウイルス、トガウイルス科、風疹ウイルス、コロナウイルス科、ヒトコロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、ライノウイルスのＭ株、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒト単純ヘルペスウイルス２（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ２）（ＨＨＶ３）、ポリオーマウイルス科、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）、テッシェン−タルファンウイルス（Ｔｅｓｃｈｅｎ−Ｔａｌｆａｎ ｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス属、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ブタパルボウイルス、オルトミクソウイルス科、特に、インフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラインフルエンザウイルス５型、ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス１および２、アデノウイルス科、アデノウイルス、ヒトアデノウイルスおよびサルアデノウイルス、トリサーコウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ノロウイルス、ビルナウイルス科、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ガンボロウイルスとしても知られている）から選択される１つまたは複数の細胞内病原体を含んでもよい。
例えば、第２の細胞内病原体は、好ましくは、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス、エンテロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、またはノロウイルスであってもよく、またはそれを含んでもよい。さらに好ましい実施形態において、第２の細胞内病原体は、例えば、インフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスであってもよい。
本方法は、ウイルスのいかなる特定の型または株にも限定されない。例えば、第２の細胞内病原体がインフルエンザウイルスまたはその株である場合には、ウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスであってもよい。本発明の関連において好ましいＡ型インフルエンザ株には、亜型Ｈ１Ｎ１（例えば、ヒトおよび／またはブタＨ１Ｎ１）、Ｈ１Ｎ２（例えば、ヒトおよび／またはブタＨ１Ｎ２）、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２（例えば、ヒトおよび／またはブタＨ３Ｎ２）、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７の株が挙げられる。本発明の方法におけるウイルスはまた、（特に、Ａ型インフルエンザウイルスの）Ｈ１（例えば、Ｈ１Ｎ１）、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９亜型株などの汎流行性株（すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般的なヒト集団がその株に対して免疫学的にナイーブである、株）であってもよい。したがって、本発明の方法において、Ａ型インフルエンザウイルスは、ＨＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６を有してもよい。本発明を、ＮＡ亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９を有するＡ型インフルエンザウイルスと共に用いてもよい。
ウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでもよい（典型的には、Ａ／ＰＲ／８／３４由来の６つのセグメントであり、ＨＡセグメントおよびＮセグメントはワクチン株由来であり、すなわち、６：２リアソータント）。それはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来、またはワクチン調製のためのリアソータントウイルスを作製するのに有用な任意の他のウイルス株由来の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでもよい。典型的には、ウイルスは、ヒトからヒトへ伝染する能力がある株であってもよく、それゆえ、その株のゲノムは通常、哺乳類（例えば、ヒトまたはブタ）インフルエンザウイルスから生じた少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。それは、トリ、ヒト、またはブタのインフルエンザウイルスから生じたＮＳセグメントを含んでもよい。
ウイルスは弱毒化されていてもよい。ウイルスは温度感受性であってもよい。ウイルスは低温に適応していてもよい。ウイルスは、リアソータント株であってもよく、逆遺伝学技術によって取得された可能性がある［例えば、１〜５］。
本発明の方法は、第１の細胞内病原体の存在または非存在について試験するために用いられてもよい。すなわち、第１の細胞内病原体が、試験される生物学的試料に存在するかどうかが知られてなくてもよい。第１の細胞内病原体が生物学的試料に存在する可能性がある。第１の細胞内病原体が生物学的試料に存在しない可能性が同等にある。
第２の細胞内病原体が生物学的試料に存在してもよいし、存在しなくてもよい。好ましくは、第２の細胞内病原体は、生物学的試料に存在することが知られている。あるいは、第２の細胞内病原体が、試験される生物学的試料に存在するかどうかが知られてなくてもよい。
好ましい実施形態において、第２の細胞内病原体はウイルスであり、第１の細胞内病原体が生物学的試料に存在するかどうかが知られておらず、すなわち、本発明の方法は、ウイルスの存在下で第１の細胞内病原体の存在または非存在について試験するために用いられる。
本発明の方法の生物学的試料はまた、第３の、第４の、第５の、またはさらなる細胞内病原体を含んでもよいし、またはそれらについて試験されてもよい。任意のそのような第３またはさらなる細胞内病原体は、第１または第２の細胞内病原体について上で記載されているようなものであってもよい。好ましい実施形態において、第３の、第４の、第５の、またはさらなる細胞内病原体が生物学的試料に存在しているかどうかが知られていない。好ましい実施形態において、本発明の方法は、例えば、第３の、第４の、第５の、またはさらなる細胞内病原体について、多数の細胞内病原体の存在または非存在について試験するために用いられる。
生物学的試料
本発明は、様々な異なる生物学的試料と共に用いることができる。試料は、例えば、第１および／または第２の細胞内病原体として、関心対象となるウイルスを含有してもよい。そのような試料は、試料がまた第２の細胞内病原体（例えば、第２のウイルス）を含有する一方で、第１の細胞内病原体（例えば、第１のウイルス）の可能性のある存在について試験されてもよい。
本発明は、様々な異なる生物学的試料と共に用いることができる。試料は、例えば、第１および／または第２の細胞内病原体として、関心対象となるウイルスを含有してもよい。そのような試料は、試料がまた第２の細胞内病原体（例えば、第２のウイルス）を含有する一方で、第１の細胞内病原体（例えば、第１のウイルス）の可能性のある存在について試験されてもよい。
本発明を用いて試験される典型的な試料には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
・実験室試料
・患者から採取された臨床的試料であり、例えば、感染の症状を呈した患者から採取され、その患者から、可能性がある新しい病原体、例えば新しいウイルス株について調べるために呼吸器スワブが取られる。病原体は、例えば、上記で列挙されたウイルスのいずれでもよく、例えば、エンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、またはインフルエンザウイルスである。
・マスターシードおよびワーキングシードを含むウイルスシード。そのようなシードロットが用いられ、それらがウイルス成長の基盤を形成する、生物製剤の製造中、試験される。ウイルスは、上記で列挙されたウイルスのいずれでもよく、例えば、エンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、またはインフルエンザウイルスである。
・実験室試料
・患者から採取された臨床的試料であり、例えば、感染の症状を呈した患者から採取され、その患者から、可能性がある新しい病原体、例えば新しいウイルス株について調べるために呼吸器スワブが取られる。病原体は、例えば、上記で列挙されたウイルスのいずれでもよく、例えば、エンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、またはインフルエンザウイルスである。
・マスターシードおよびワーキングシードを含むウイルスシード。そのようなシードロットが用いられ、それらがウイルス成長の基盤を形成する、生物製剤の製造中、試験される。ウイルスは、上記で列挙されたウイルスのいずれでもよく、例えば、エンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、またはインフルエンザウイルスである。
したがって、第２の細胞内病原体（例えば、ウイルス）の存在が望まれる場合があるが、第１の細胞内病原体の存在は望まれない。本発明の方法は、第１の細胞内病原体の非存在を確認するための試験であってもよい。
同様に、第２の病原体（例えば、ウイルス）の存在が知られている場合があるが、第１の細胞内病原体の存在は望まれず、および／または知られていない。
好ましくは、試料は、前記試料から製造する方法内に試験するためというよりむしろ、単にスクリーニングまたは試験することを目的として用いられる。方法は、有利には、他の公知の試験方法と組み合わされてもよい。
生物学的試料はまた、孵化卵、例えば、尿膜腔もしくはニワトリ胚を含む孵化鶏卵であってもよく、またはそれに由来してもよい。
生物学的試料はまた、細胞培養物または組織培養物、例えば、成長細胞培養物もしくは成長組織培養物、または非成長細胞培養物もしくは非成長組織培養物であってもよく、またはそれから取得されるか、由来してもよい。そのような培養物は、哺乳類起源の細胞系であってもよい。哺乳類起源の適切な細胞には、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類（ヒトおよびサルを含む）細胞、およびイヌ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。様々な細胞型が用いられてもよく、例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肝臓細胞、肺細胞などである。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前をもつ細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系においてのような腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系においてのような腎臓細胞である。このように、適切な細胞系には、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ−３８などが挙げられるが、それらに限定されない。
好ましくは、前記生物学的試料は、哺乳類細胞を含むか、またはそれに由来する。
好ましい哺乳類細胞系には以下が挙げられる：メイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［６〜９］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓由来のＶｅｒｏ細胞［１０〜１２］；またはヒト胎児網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［１３］。これらの細胞系は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［１４］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［１５］から、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７による様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ−３４によるＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０により入手可能である。
最初のＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の派生物もまた用いられてもよい。例えば、参考文献６は、懸濁培養における成長に適応したＭＤＣＫ細胞系を開示する（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）。同様に、参考文献１６は、無血清培養における懸濁液中で成長するＭＤＣＫ由来細胞系を開示する（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）。参考文献１７は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）。「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献１８は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に対する高い感受性をもつＭＤＣＫ細胞系を開示する。これらのＭＤＣＫ細胞系のいずれも用いることができる。
試料はまた、トリ胚性幹細胞［１９、２２］およびアヒル（例えば、アヒル網膜）由来または雌鳥由来の細胞系を含む、トリ細胞系［例えば、参考文献１９〜２１］であってもよく、またはそれらから取得可能であってもよい。適切なトリ胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞由来のＥＢｘ細胞系、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４が挙げられる［２３］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）もまた用いることができる、など。
細胞集団
本発明の方法において、試験される生物学的試料を、細胞の集団とインビボまたはインビトロで接触させる。細胞集団は、胚を含む生物体、例えば、哺乳類、齧歯類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒヨコ、または非ヒト霊長類であってもよく、またはそれに含まれてもよい。細胞集団はまた、培養中の細胞でもよい。好ましくは、細胞集団は細胞培養物（培養細胞）である。細胞集団はまた、例えば、孵化卵、例えば、尿膜腔またはニワトリ胚を含む孵化鶏卵であってもよい。
本発明の方法において、試験される生物学的試料を、細胞の集団とインビボまたはインビトロで接触させる。細胞集団は、胚を含む生物体、例えば、哺乳類、齧歯類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒヨコ、または非ヒト霊長類であってもよく、またはそれに含まれてもよい。細胞集団はまた、培養中の細胞でもよい。好ましくは、細胞集団は細胞培養物（培養細胞）である。細胞集団はまた、例えば、孵化卵、例えば、尿膜腔またはニワトリ胚を含む孵化鶏卵であってもよい。
一般的に、細胞集団は、生物学的試料について上で記載されているとおりであってもよい。したがって、細胞集団または培養細胞は、哺乳類起源の細胞系であってもよい。好ましくは、前記細胞集団は、哺乳類細胞を含むか、またはそれらに由来する。本発明の好ましい実施形態において、生物学的試料および細胞集団の両方が、哺乳類細胞を含むか、またはそれらに由来する。
哺乳類起源の適切な細胞は、生物学的試料について上で記載されているとおりである。これらには、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。生物学的試料に関連して上で記載された細胞系のいずれも、例えば、上で記載されたＭＤＣＫ細胞系のいずれも、細胞集団として用いることができる。
生物学的試料について上で記載されているような哺乳類細胞系に代わるものもまた用いてもよく、例えば、本発明の方法の細胞集団は、トリ細胞系であってもよい。
好ましい実施形態において、細胞集団は、本発明の方法の阻害作用物質であるオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを発現する。前記オリゴヌクレオチドは、本明細書において下でより詳細に記載されているように、オリゴマー化合物であってもよい。好ましくは、前記細胞集団における細胞は、阻害作用物質を発現するようにトランスフェクトおよび／または操作される。阻害作用物質の発現は、発現ベクターからであってもよい。細胞、例えば、哺乳類細胞における配列の発現のためのベクターおよび方法は、当技術分野においてよく知られている。阻害作用物質は一過性に発現してもよい。より好ましくは、阻害作用物質は、細胞集団において安定的に発現する。すなわち、阻害作用物質を発現する能力があるヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ配列が、細胞集団へ一過性にトランスフェクトされてもよい、すなわち、細胞集団における阻害作用物質の発現は、発現ベクターの一過性トランスフェクションによってもよい。しかしながら、より好ましくは、阻害作用物質を発現する能力があるヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ配列が、細胞集団へ安定的にトランスフェクトされる、すなわち、細胞集団における阻害作用物質の発現は、安定的なトランスフェクションによる、すなわち、細胞集団における阻害作用物質の発現は、前記細胞集団の細胞のゲノムへ安定的に組み込まれ、および／または細胞集団内で安定的に増殖したコード配列からである。
生物学的試料が細胞を含有する場合には、生物学的試料自体が細胞集団としての役割を果たしてもよい。この場合、本発明の方法の工程（ｉ）は、生物学的試料に阻害作用物質を接触させる工程を含むことになり、または生物学的試料自体が、上記のように阻害作用物質を発現してもよい。
インキュベーション
本発明は、第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で細胞（すなわち、本発明の方法の細胞集団および／または生物学的試料）をインキュベートする工程を含む。前記条件はまた、細胞集団内の細胞の生存、成長、増殖、および／または分裂を可能にしてもよい。インキュベーションはインビボでもインビトロでもよい。第１の細胞内病原体の増殖のための、ならびに／または細胞集団の細胞生存、成長、増殖、および／もしくは分裂を可能にする特定の条件は、普通の実験設計に従って変化する。
本発明は、第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で細胞（すなわち、本発明の方法の細胞集団および／または生物学的試料）をインキュベートする工程を含む。前記条件はまた、細胞集団内の細胞の生存、成長、増殖、および／または分裂を可能にしてもよい。インキュベーションはインビボでもインビトロでもよい。第１の細胞内病原体の増殖のための、ならびに／または細胞集団の細胞生存、成長、増殖、および／もしくは分裂を可能にする特定の条件は、普通の実験設計に従って変化する。
好ましい実施形態において、前記条件は、生物体が第１の細胞内病原体についてのインキュベーターとしての役割を果たす条件であってもよい。
本発明の細胞集団が細胞培養物である場合、本発明の方法のインキュベーション工程は、好ましくは、細胞生存、成長、増殖、および／または分裂を可能にする条件下で細胞培養物をインキュベートする（すなわち、培養する）工程を含む。細胞は、本発明の領域の当業者に知られた普通の条件下で、上記の細胞内病原体のうちの１つまたは複数の増殖を（増殖することが可能な細胞内病原体に特異的な阻害作用物質の非存在下で）援助する能力がある。したがって、細胞をさらに培養する工程は、培養物中の病原体の増殖を可能にする。その後、このように増殖することが可能な病原体、またはそれらが培養中に生じる効果（例えば、細胞集団に対する表現型効果）を観察することができる。本発明の方法によれば、これらの第１の病原体を、第２の病原体より優先的に観察することができ、その第２の病原体もまた試料に存在するが、第２の病原体に特異的である阻害作用物質の存在によって、増殖するのを阻害される。
一般論として、病原体の増殖および／または適切な細胞の成長を可能にする条件は、当技術分野においてよく知られている。適切な細胞の生存、成長、増殖、および／または分裂を可能にする条件は、細胞が商業的供給業者から入手される場合、一般的に、細胞と一緒に提供される。
細胞型および所望のアッセイに応じて、細胞を、懸濁液中、接着培養で、またはマイクロキャリア培養で、成長させてもよい。したがって、本発明と共に用いられる細胞は、懸濁液中での成長に適応してもよい。懸濁培養での成長に適応している１つの適切なＭＤＣＫ細胞系は、（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）ＭＤＣＫ ３３０１６である。
血清の存在下で成長させるよりむしろ、細胞系を、無血清培地および／または無タンパク質培地中で成長させてもよい。ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物がない培地は、本発明の関連において、無血清培地と呼ばれる。無タンパク質とは、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を排除して細胞の分裂増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が生じる培養を意味すると理解されるが、任意で、特定の細胞内病原体（すなわち、本発明の方法の第１の細胞内病原体）の複製を援助するのに必要とされ得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる。そのような培養で成長する細胞は、当然ながら、それ自体、タンパク質を含有する。
いくつかの実施形態において、細胞集団は、３７℃より下（例えば、３０〜３６℃）でインキュベートされてもよい。
観察、試験
本発明によれば、細胞成長を可能にする条件下での細胞のインキュベーションから生じる材料は、第１の細胞内病原体について試験される。
本発明によれば、細胞成長を可能にする条件下での細胞のインキュベーションから生じる材料は、第１の細胞内病原体について試験される。
一般的に、試験は、細胞自体、細胞含有培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌｕｉｄ）、または細胞を含まない培養液（例えば、培養物の上清）に実施されてもよい。そのような試験には、インビトロ試験およびインビボ試験の両方が挙げられる。例えば、以下の試験のうちの１つまたは複数が実施されてもよい：
・透過型電子顕微鏡検査を含む顕微鏡検査
・組織学的試験、例えば、細胞染色、例えば、組織化学的、免疫学的、または免疫化学的染色
・レトロウイルスについての生化学的試験、例えば、ＲＴアッセイ
・異なる細胞型の感染性についての、例えば、細胞変性効果を検出するための試験
・ＰＣＲなどの分子遺伝学的試験
・例えば、成体マウス、授乳期マウス、モルモット、ウサギへの、動物接種試験
・孵化卵の感染 。
・透過型電子顕微鏡検査を含む顕微鏡検査
・組織学的試験、例えば、細胞染色、例えば、組織化学的、免疫学的、または免疫化学的染色
・レトロウイルスについての生化学的試験、例えば、ＲＴアッセイ
・異なる細胞型の感染性についての、例えば、細胞変性効果を検出するための試験
・ＰＣＲなどの分子遺伝学的試験
・例えば、成体マウス、授乳期マウス、モルモット、ウサギへの、動物接種試験
・孵化卵の感染 。
試験は、表現型効果、例えば、細胞変性効果、例えば、細胞培養におけるプラーク、細胞死、アポトーシスについてであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、試験は、炎症または任意の表現型もしくは生物学的指標、炎症に関連したメディエーターまたは分子についてであってもよい。一般的に、いかなる観察可能な効果も適し得る。
陽性試験結果、例えば、表現型効果または細胞変性効果の存在は、第１の細胞内病原体（すなわち、阻害作用物質の存在によって増殖できない第２の細胞内病原体以外の細胞内病原体）の生物学的試料における存在を示している可能性がある。病原体に起因する可能性がある効果の欠如は、第１の細胞内病原体の非存在、すなわち、用いられる条件下において、前記病原体が増殖した場合、細胞集団において観察可能な効果をもたらすであろう細胞内病原体の非存在を示している。
通常には、本発明は、１つまたは複数の対照培養を伴う。例えば、１つの形の陽性対照において、試料および細胞が、阻害作用物質の非存在下および／または既知の病原体の存在下で培養される。陰性対照の例において、細胞は、１つもしくは複数の病原体、例えば、第２の細胞内病原体および／もしくは第１の細胞内病原体の非存在下で、ならびに／または生物学的試料、もしくは試料と阻害作用物質の両方の非存在下で、培養されてもよい。そのような対照により、すぐに比較することが可能になる。
阻害作用物質
本発明によれば、第１の細胞内病原体について試験するために、第２の細胞内病原体の生存および／または増殖を阻害する１つまたは複数の作用物質の存在下で細胞がインキュベートされる。前記阻害作用物質（複数可）が存在しなかったならば、第２の細胞内病原体は、細胞内で増殖し、表現型効果を引き起こしたであろうし、第１の細胞内病原体と第２の細胞内病原体は容易に区別されない可能性がある。阻害作用物質の機能は、培養条件下で第２の細胞内病原体の増殖を阻害することであり、それにより、第１の細胞内病原体が第２の細胞内病原体に優先して増殖することを可能にする。したがって、本発明により、細胞内病原体は、より容易に区別することができ、関心対象となる細胞内病原体（特許請求の範囲による第１の細胞内病原体、またはさらなる、例えば、第３の細胞内病原体）がより容易に観察することができる。
阻害作用物質
本発明によれば、第１の細胞内病原体について試験するために、第２の細胞内病原体の生存および／または増殖を阻害する１つまたは複数の作用物質の存在下で細胞がインキュベートされる。前記阻害作用物質（複数可）が存在しなかったならば、第２の細胞内病原体は、細胞内で増殖し、表現型効果を引き起こしたであろうし、第１の細胞内病原体と第２の細胞内病原体は容易に区別されない可能性がある。阻害作用物質の機能は、培養条件下で第２の細胞内病原体の増殖を阻害することであり、それにより、第１の細胞内病原体が第２の細胞内病原体に優先して増殖することを可能にする。したがって、本発明により、細胞内病原体は、より容易に区別することができ、関心対象となる細胞内病原体（特許請求の範囲による第１の細胞内病原体、またはさらなる、例えば、第３の細胞内病原体）がより容易に観察することができる。
好ましくは、阻害作用物質は、細胞集団の生存、成長、増殖、および／または分裂を妨げない。細胞へのわずかなマイナスの影響が許容されている可能性があるが、本発明の方法において、細胞生存、成長、増殖、および／または分裂は、阻害作用物質の存在下での培養条件下でなお起こることができる。
阻害作用物質はまた、本方法が試験するように意図されている病原体（例えば、特許請求の範囲による第１の細胞内病原体、または本明細書で第３の、第４の、第５の、もしくはさらなる細胞内病原体と呼ばれ得る１つもしくは複数のさらなる細胞内病原体）の生存、分裂増殖、および／または増殖を妨げない。この場合もやはり、わずかなマイナスの影響が許容されている可能性があるが、方法は、それが試料に存在したとしても、第１の細胞内病原体の増殖および検出を可能にすることが意図される。本発明の方法において、阻害作用物質は、その作用物質が第１および／またはさらなる細胞内病原体の生存および／または増殖を阻害する程度より大きな程度まで、第２の細胞内病原体の生存および／または増殖を阻害する。すなわち、阻害作用物質は、第２の細胞内病原体を特異的に、選択的に、または優先的に阻害する。好ましくは、前記阻害作用物質は、第１（および／またはさらなる）細胞内病原体の生存、分裂増殖、および／または増殖を阻害しないか、または実質的に阻害しない。最も好ましくは、阻害作用物質は、第２の細胞内病原体の生存および／または増殖を完全に阻害する。
したがって、異なる病原体を調査する場合、異なる阻害作用物質を用いることが可能であり得る。阻害作用物質は、特定の病原体を阻害するか、または優先的に阻害することができるが、さらなる１つの病原体、またはさらなる複数の病原体には影響を与えないか、またははるかに小さい影響しか与えない可能性がある。この状況において、阻害作用物質は、本発明の方法の第１の細胞内病原体の存在が試験されることになっている場合、本発明と共に用いるのに適しているが、その作用物質は第２の細胞内病原体の増殖を阻害するため、その作用物質は、前記第２の病原体を探索する場合には、適していないであろう。
前述の段落に従って、本発明はまた、第２の、またはさらなる作用物質が第３の、またはさらなる細胞内病原体の増殖を阻害する、実施形態を含む。
阻害作用物質は、阻害されることになっている細胞内病原体の型に基づいて選択されてもよい。例えば、第２の細胞内病原体がウイルス、例えば、インフルエンザウイルスである場合には、阻害作用物質は、ウイルスの型、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスに基づいて選択されてもよい。そのような実施形態において、いくつかの作用物質は、Ａ型ウイルスおよびＢ型ウイルスの両方に対して作用することができるが、他のものは特異的である。
阻害作用物質は、抗真菌剤であってもよい。阻害作用物質はまた、抗ウイルス剤または抗菌剤であってもよい。阻害作用物質は抗生物質であってもよい。
阻害作用物質は、第２の細胞内病原体の生活環の公知の特性に基づいて選択されてもよい。第２の細胞内病原体は溶解性病原体であってもよく、すなわち、それは細胞の溶解を引き起こしてもよい。第２の細胞内病原体が溶解性である場合、阻害作用物質は、好ましくは、細胞溶解が阻止されるように第２の細胞内病原体の生活環を阻害する。例えば、好ましい実施形態において、阻害作用物質は、第２の細胞内病原体における複製または遺伝子発現を阻害する。好ましくは、阻害作用物質は、第２の細胞内病原体の増殖および／または会合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）が阻止されるように、第２の細胞内病原体の１つまたは複数のＲＮＡ種を標的にする。例えば、第２の細胞内病原体がインフルエンザウイルスである場合、オセルタミビルは、本発明に関して、他の作用物質より有用ではない。オセルタミビルは、インビボでインフルエンザウイルスに対して活性があるが、この活性は細胞外で発揮される。インフルエンザウイルスは溶解性であるため、細胞培養物は、抗ウイルス化合物が方法の条件下でウイルスの生活環に干渉し得る前に、大きな細胞変性効果を受けるであろう。一般的に、（インフルエンザウイルスについてのノイラミニダーゼ阻害剤を含む）細胞外で作用する阻害作用物質は好ましくない。好ましくは、阻害作用物質は、第２の細胞内病原体の細胞内増殖、成長、分裂増殖、複製、遺伝子発現、転写、および／または翻訳を阻害または阻止する。例えば、阻害作用物質は、第２の細胞内病原体の遺伝子発現を阻害してもよい。例えば、阻害作用物質は、第２の細胞内病原体の遺伝子発現を、例えば、ｍＲＮＡ翻訳の阻害により、特にｍＲＮＡの分解により、転写後に阻害してもよい。
本発明と共に用いる好ましい作用物質は、細胞内病原体の増殖、成長、分裂増殖、複製、遺伝子発現、転写、および／または翻訳を少なくとも部分的に阻害または阻止することができる。より好ましくは、前記阻害または阻止は、少なくとも実質的に完全であり、最も好ましくは完全である。
本発明と共に用いる好ましい作用物質は、第２の細胞内病原体の表現型効果もしくは細胞変性効果、例えば、ウイルスの細胞変性効果を少なくとも部分的に阻害もしくは阻止することができ、または血球吸着および／もしくは血球凝集を少なくとも部分的に阻害もしくは阻止することができる。より好ましくは、本発明と共に用いる作用物質は、ウイルスの細胞変性効果、血球吸着、および／または血球凝集を少なくとも実質的に完全に、最も好ましくは完全に、阻害または阻止する。
適切な阻害作用物質には、小さい有機化合物（例えば、分子量＜１０００Ｄａ）、オリゴマー化合物、特に干渉ＲＮＡ分子およびアンチセンス分子が挙げられるが、それらに限定されない。第２の細胞内病原体がウイルスである場合、適切な阻害作用物質には、小分子の抗ウイルス薬、およびエンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）などのペプチド阻害剤が挙げられる。
好ましくは、作用物質は、オリゴマー化合物または部分、例えば、修飾核酸または修飾オリゴヌクレオシドを含む、核酸、オリゴヌクレオチド、核酸誘導体、またはオリゴヌクレオチド誘導体を含む。作用物質は、第２の細胞内病原体のゲノムにおける配列（例えば、遺伝子）の発現を阻害してもよく、すなわち、阻害作用物質は標的配列に対して方向づけられてもよい。
好ましくは、作用物質は、標的配列と相補的塩基対形成をすることができるオリゴマー化合物または部分を含む。好ましくは、作用物質は、標的配列に実質的に相補的である。標的配列は、第２の細胞内病原体のゲノムに存在し、そのゲノムに相補的であり、そのゲノムによってコードされ、および／またはそのゲノムから転写されるヌクレオチド配列であってもよい。好ましくは、オリゴマー化合物は、第２の細胞内病原体のゲノムから転写されるヌクレオチド配列、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、成熟ｍＲＮＡと相補的な塩基対形成をすることができる。第２の細胞内病原体がウイルスである場合には、前記の転写された配列もまた、相補的なＲＮＡまたは相補的なＤＮＡ（ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ）ゲノム、すなわち、プラス鎖またはマイナス鎖のウイルスゲノムに関しての相補的ゲノム配列内にあり得る。前記の転写される配列はまた制御性ＲＮＡ分子であってもよい。
好ましくは、オリゴマー化合物は、標的配列と８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、または１００％相補的である。
オリゴマー化合物を含む作用物質は、一本鎖または二本鎖であってもよい。同様に、オリゴマー化合物は、一本鎖または二本鎖であってもよい。作用物質が二本鎖オリゴマー化合物−すなわち、二重鎖−である場合、前記作用物質の２つの鎖のうちの１つが、第２の細胞内病原体のゲノムに存在し、および／またはそのゲノムから転写される前記ヌクレオチド配列と前記相補的塩基対形成をすることができる。
標的配列と相補的な塩基対形成をすることができる作用物質の一部または配列は、前記標的配列の前記配列に対してアンチセンスであると言われる。したがって、作用物質は、アンチセンスオリゴマー化合物であってもよい。アンチセンスオリゴマー化合物である阻害作用物質は、遺伝子阻害の任意のアンチセンスに基づいた機構、例えば、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）機構、ＲＩＳＣに基づいた機構によって作用してもよい。本明細書において、ＲＩＳＣに基づいた機構は、ＲＮＡｉ機構を含む、ＲＩＳＣ複合体が関与する機構である。遺伝子阻害のアンチセンスに基づいた機構によって作用する作用物質は、当技術分野においてよく知られており、したがって、当業者は、作用物質の構造を適合させることができる。好ましくは、オリゴマー化合物は、第２の細胞内作用物質の増殖を阻害するＲＮＡｉによって作用する。したがって、阻害作用物質は、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ分子（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ））などの干渉ＲＮＡ分子を含む、干渉オリゴマー化合物であってもよい。
オリゴマー化合物、例えば、オリゴヌクレオチドである作用物質の鎖は、長さが１９〜８０個のモノマー、好ましくは、長さが１９〜７５個、１９〜７０個、１９〜６５個、１９〜６０個、１９〜５５個、１９〜５０個、１９〜４５個、１９〜４０個、１９〜３５個、または１９〜３０個のモノマー、好ましくは、長さが１９〜２９個、１９〜２８個、１９〜２７個、または１９〜２６個、例えば、長さが２０〜２６個、２１〜２６個、２２〜２６個、２３〜２６個、１９〜２５個、２０〜２５個、２１〜２５個、２２〜２５個、２３〜２５個、１９〜２４個、２０〜２４個、２１〜２４個、２２〜２４個、２３〜２４個、１９〜２３個、２０〜２３個、２１〜２３個、２２〜２３個、１９〜２２個、２０〜２２個、２１〜２２個、１９〜２１個、２０〜２１個、または１９〜２０個のヌクレオチドであってもよい。前記モノマーは、好ましくは、核酸と相補的塩基対形成をすることができ、好ましくは、核酸塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、例えば、リボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの誘導体を含む。すなわち、前記モノマーは、好ましくは、標的配列の発現を阻害するアンチセンスに基づいた（例えば、ＲＮＡｉ）機構を支援する様式で標的配列と相補的な塩基対形成をすることができる。作用物質は、ヘアピン構造を、すなわち、内部の相補的塩基対形成により、形成することができる一本鎖であってもよく、例えば、作用物質は短いヘアピンＲＮＡであってもよい。
例えば、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスまたはインフルエンザウイルスの複製を阻害する作用物質は当技術分野において知られている。例えば、コロナウイルスを標的にするｓｉＲＮＡ分子は、参考文献２４において論じられ、言及されている。参考文献２５は、Ａ型インフルエンザウイルスを標的にする約２０個の異なるｓｉＲＮＡ分子を開示する。同じグループからのさらなるｓｉＲＮＡ研究は、参考文献２６および２７に開示されている。参考文献２８において、インフルエンザＢウイルスが標的にされた。インフルエンザウイルスに対して活性のあるさらなる干渉ＲＮＡは、参考文献２９および３０に開示されている。
好ましくは、オリゴマー化合物によって標的にされるウイルスの領域は、ウイルスの異なる亜型および株の間で、例えば、ヒト、ニワトリ、アヒル、ウマ、および／またはブタのインフルエンザの間で、保存されている。インフルエンザ配列は、インフルエンザ配列データベース：ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖから入手できる。好ましくは、オリゴマー化合物は、本発明の方法に用いられる細胞集団における既知の遺伝子と同一性を共有せず、または前記第１の細胞内病原体の増殖を可能にする細胞の能力に干渉しない。例えば、インフルエンザウイルスを標的にするオリゴマー化合物は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ、ＮＰ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２遺伝子のうちの１つまたは複数の発現を阻害してもよい。ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、および／またはＰＢ２遺伝子は、標的配列の選択として好まれ、特に、ＮＰおよび／またはＰＡ遺伝子は好ましい標的である。
インフルエンザウイルス複製に対して活性のあるアンチセンス核酸もまた、当技術分野において知られている。例えば、参考文献３１は、抗ウイルスのモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。
インビボで用いられる阻害作用物質が許容され得る毒性、薬物動態学的プロフィール、半減期などをもたなければならないが、これらの考慮すべき事項は、本発明の方法に関してそれほど重要ではない。例えば、好ましくない全身性の薬学的特性のために、ヒトにおける日常的使用について拒絶されている多数の強力な抗ウイルス（例えば、抗インフルエンザ）化合物があるが、それらを、本発明と共に用いてもよい。同様に、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子に関連している送達の問題は、細胞培養を扱う場合、あまり重要ではない。参考文献２５は、そのｓｉＲＮＡ分子が、ＭＤＣＫ培養で成長するインフルエンザウイルスに対して活性があることを報告しており、参考文献２８もまた、培養細胞に焦点をあてていた。それでも、送達系はなお、インビトロ研究について用いることができる。例えば、インフルエンザウイルス複製を阻害するためのｓｉＲＮＡの培養細胞への送達は、ビロソームを用いる参考文献３２に報告された。参考文献３３はさらに、それらの細胞への送達を促進するためのポリカチオンに基づいた系の使用を報告している。参考文献３４は、ＭＤＣＫ培養における抗インフルエンザｓｉＲＮＡにプラスミド構築物を用いた。参考文献３５において、レンチウイルスベクターが培養ＭＤＣＫ細胞と共に用いられた。
好ましくは、阻害作用物質は、細胞集団に関して上で記載されているように、本発明の方法の細胞集団において、例えば、培養細胞系または遺伝子操作された生物体において、発現する。したがって、阻害作用物質は、細胞集団において発現する一本鎖および／または二本鎖オリゴヌクレオチドを含んでもよい。上記のように、好ましくは、阻害作用物質を発現するヌクレオチド配列が、前記細胞集団において安定的に増殖し、阻害作用物質が前記細胞集団において安定的に発現する。好ましい実施形態において、阻害作用物質は、上記のようにオリゴヌクレオチドとして、例えば、ヘアピン構造を形成する能力がある一本鎖化合物（例えば、短いヘアピンＲＮＡ）として、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する能力がある２本の別個の鎖として、一本鎖の干渉作用物質として、アンチセンス作用物質として、第２の細胞内病原体のゲノムから転写されたヌクレオチド配列と相補的な塩基対形成をすることができる化合物として、アンチセンス、例えば、ＲＮＡｉ機構により細胞内病原体の増殖を阻害する能力がある化合物としてなど、発現する。好ましくは、阻害作用物質はヘアピンＲＮＡである。したがって、細胞集団は、好ましくは、本発明の方法の阻害作用物質をコードし、発現するヌクレオチド配列を含有する。阻害作用物質は、好ましくは、ヘアピンＲＮＡであり、および／またはアンチセンスＲＮＡを含む。
例えば、ｓｉＲＮＡ発現ベクターは参考文献３４に記載されている。
一般
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、追加の何かを含んでもよく、例えば、Ｘ＋Ｙであってもよい。
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、追加の何かを含んでもよく、例えば、Ｘ＋Ｙであってもよい。
語「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、語「実質的に」は、本発明の定義から省略される場合がある。
数値ｘに関連した用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
用語「１または複数」は、「１」、「１より多い」、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６・・・などを包含する。
用語「２以上」は、「２」、「２より多い」、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６・・・などを包含する。
特に明記されない限り、２つ以上の構成要素を混合する工程を含む方法は、混合のいかなる特定の順序も必要としない。したがって、構成要素は、任意の順序で混合することができる。３つの構成要素がある場合、２つの構成要素がお互いに組み合わすことができ、その後、その組み合わせが第３の構成要素と組み合わされてもよいなど。
図面の簡単な説明
図面は存在しない。
図面は存在しない。
本発明の方法の１つの好ましい実施形態において、ＭＤＣＫ細胞培養物由来の生物学的試料は、インフルエンザウイルスを含有する。プラークアッセイにおいて、試料を、感染していない（病原体を含まない）ＭＤＣＫ細胞集団（試験培養物）と接触させる。試験培養物におけるインフルエンザウイルスの増殖は、ＲＮＡｉによって阻害され、そのことにより、試験培養物におけるプラーク形成が観察されて、これをインフルエンザウイルス以外の病原体に帰することができる。
試験培養物は、１％の半固体寒天中のＭＤＣＫ細胞の単層であってもよい。適切なインフルエンザウイルス標的配列、例えば、インフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）または酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）遺伝子に対して方向づけられた適当量のｓｉＲＮＡを、当技術分野において公知の方法により、試験培養物の細胞へ導入する（例えば、１×１０７個のＭＤＣＫ細胞あたり２．５ｎｍｏｌ）。ｓｉＲＮＡ配列は、例えば、参考文献２５および２７に開示されているとおり、すなわち、核タンパク質（ＮＰ）遺伝子に対して方向づけられたセンスオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号１）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ｄＴｄＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣ−３’（配列番号２）；または酸性ポリメラーゼ遺伝子に対して方向づけられたセンスオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＡＡＵＵＧＡＧＧＡＧＵＧＣＣＵＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ｄＴｄＴＣＧＵＵＡＡＣＵＣＣＵＣＡＣＧＧＡＣＵ−３’（配列番号４）であってもよい。７〜１０時間後、適当量の試料（例えば、２倍または１０倍の段階希釈）を試験培養物に加える。試験培養物におけるインフルエンザウイルスの力価もしくは含有量および／またはｓｉＲＮＡによるインフルエンザの阻害を、例えば、試験培養上清の段階希釈物を血球凝集（ＨＡ）アッセイに供することにより、または当技術分野においてよく知られている、ＲＮＡ抽出、逆転写、およびＰＣＲを利用する方法により、モニターしてもよい。適切なインキュベーション時間の後、例えば、２日後、試験培養物を、クリスタルバイオレットで染色することによりプラーク形成について評価する。インフルエンザウイルスがインキュベーション中、増殖しない場合には、染色により可視化されたあらゆるプラークは、インフルエンザウイルス以外の病原体に起因し得る。
上で言及された対照に加えて、ＧＦＰに特異的なｓｉＲＮＡもまた、ＧＦＰ発現ＭＤＣＫ細胞へ導入して、続いて、（例えば、インフルエンザウイルスでの）ウイルス感染させ、または試験される試料を加えてもよい。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによってアッセイしてもよい。
材料および方法
ＭＤＣＫ細胞を、当技術分野において周知の方法により、例えば、１０％の熱失活したＦＣＳ、２ｍＭのｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気下で成長させる。
ＭＤＣＫ細胞を、当技術分野において周知の方法により、例えば、１０％の熱失活したＦＣＳ、２ｍＭのｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気下で成長させる。
インフルエンザウイルスストックを、日齢１０日間の孵化鶏卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の尿膜腔中、３７℃で成長させる。尿膜腔液を、ウイルス接種から４８時間後、採取し、−８０℃で保存する。ウイルス力価を、血球凝集アッセイまたはプラークアッセイによって測定する。
ｓｉＲＮＡのためのＲＮＡオリゴヌクレオチドは市販されており、または当技術分野において知られた方法に従って化学合成することができる。二重鎖ｓｉＲＮＡを得るために、等モル量の相補的なオリゴヌクレオチドを混合し、９５℃まで５分間、加熱し、その後、温度を、例えば、３０秒ごとに１℃ずつ、３５℃まで、その後、１分ごとに１℃ずつ、５℃まで、低下させることによって、アニールさせる。ｓｉＲＮＡ二重鎖を、ゲル電気泳動による二重鎖形成の完了について分析する。
第２の病原体、例えば、インフルエンザウイルスの増殖を阻害するｓｉＲＮＡの適合性および効力を、ＭＤＣＫ細胞において別々に評価してもよい。対数期のＭＤＣＫ細胞をトリプシン処理し、洗浄し、無血清培地、例えば、ＲＰＭＩ培地１６４０中、１ｍｌあたり２×１０７個の細胞で再懸濁してもよい。細胞（０．５ｍｌ）をｓｉＲＮＡと混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いることにより、４００Ｖおよび９７５μＦで電気穿孔する。電気穿孔処理された細胞を分割し、ＤＭＥＭ中、８時間、培養する。その後、培地を取り出し、ＤＭＥＭ、０．３％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン中の適切な量のウイルスを各ウェルに加える。室温で１時間のインキュベーション後、０．３％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および４μｇ／ｍｌのトリプシンを含有する２ｍｌのＤＭＥＭ緩衝液を各ウェルに加える。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ下で培養し、上清においてウイルス力価をモニターする。
血球凝集アッセイを、Ｖ底９６ウェルプレートで行う。試料の段階希釈物（例えば、２倍）を、等体積の０．５％（体積／体積）懸濁液の赤血球、例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できるニワトリ赤血球と混合する。１時間の氷上でのインキュベーション後、血球凝集を示す、赤血球の粘着性の均質な層についてウェルを評価する。
プラークアッセイについて、１％の半固体寒天中のＭＤＣＫ細胞の単層へ試料の段階希釈物を加える。２日後、プラークを、クリスタルバイオレットで染色することにより可視化する。
本発明は、例としてのみ記載されており、本発明の範囲および精神内に留まりながら、改変がなされ得ることは理解されているであろう。
参考文献
図面の簡単な説明
図面は存在しない。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
生物学的試料において第１の細胞内病原体について試験するための方法であって、該方法は：
（ｉ）阻害作用物質の存在下で、該試料を細胞の集団と接触させる工程であって、該作用物質が第２の細胞内病原体の増殖を阻害する、工程、
（ｉｉ）該第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で該細胞をインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた材料を該第１の細胞内病原体について試験する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
上記第１の病原体が、原核生物、真核生物、および／またはウイルスを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記第２の病原体が、原核生物、真核生物、および／またはウイルスを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記第２の病原体が、ウイルスを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
上記第１の病原体が、バルトネラ属、ボルデテラ属、ブルセラ属、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属、エールリヒア属、エシェリキア属、フランシセラ属、レジオネラ属、リステリア属、ミコバクテリウム属、ミコバクテリウム属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、連鎖球菌属、エルジニア属、バベシア属、クリプトコックス属、クリプトスポリジウム属、アイメリア属、ヒストプラスマ属、リーシュマニア属、プラスモディウム属、タイレリア属、トキソプラスマ属、トリパノソーマ属、肺炎ウイルス亜科、肺炎ウイルス属、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属、コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルスおよびエンテロウイルス、哺乳類レオウイルス科、トリレオウイルス科、オルトレオウイルス、ロタウイルス、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、流行性耳下腺炎ウイルス、トガウイルス科、風疹ウイルス、コロナウイルス科、ヒトコロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、ライノウイルスのＭ株、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒト単純ヘルペスウイルス２（ＨＨＶ３）、ポリオーマウイルス科、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）、テッシェン−タルファンウイルス、パルボウイルス属、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ブタパルボウイルス、ボカウイルス属、オルトミクソウイルス科、特に、インフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラインフルエンザウイルス５型、ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス１および２、アデノウイルス科、アデノウイルス、ヒトアデノウイルスおよびサルアデノウイルス、トリサーコウイルス、ビルナウイルス科、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ガンボロ（ｇｕｍｂｏｒｏ）ウイルスとしても知られている）から選択される１つまたは複数の病原体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記第２の病原体が、項目５に列挙されているような病原体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記第１の細胞内病原体が、試験される上記生物学的試料に存在するかどうかが知られていない、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記第２の細胞内病原体がウイルスである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
上記生物学的試料および上記細胞集団の一方または両方が、哺乳類細胞を含むか、または哺乳類細胞に由来している、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
上記哺乳類細胞が、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、サル細胞、およびイヌ細胞のうちの１つまたは複数を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記哺乳類細胞が、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肝臓細胞、肺細胞のうちの１つまたは複数を含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
上記哺乳類細胞がＭＤＣＫ細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
上記阻害作用物質がオリゴマー化合物を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記オリゴマー化合物が、上記第２の細胞内病原体のゲノムに存在し、該ゲノムにコードされ、および／または該ゲノムから転写される、ヌクレオチド配列と相補的塩基対形成をすることができる、項目１４に記載の方法。
（項目１５）
上記オリゴマー化合物が、第２の細胞内作用物質の増殖を阻害するＲＮＡｉによって作用する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記オリゴマー化合物を含む上記作用物質が二本鎖である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記阻害作用物質が抗真菌剤である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記阻害作用物質が抗ウイルス剤である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
上記阻害作用物質が抗菌剤である、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
工程（ｉｉｉ）の試験結果が１２ヶ月以内に得られる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
図面は存在しない。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
生物学的試料において第１の細胞内病原体について試験するための方法であって、該方法は：
（ｉ）阻害作用物質の存在下で、該試料を細胞の集団と接触させる工程であって、該作用物質が第２の細胞内病原体の増殖を阻害する、工程、
（ｉｉ）該第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で該細胞をインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた材料を該第１の細胞内病原体について試験する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
上記第１の病原体が、原核生物、真核生物、および／またはウイルスを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記第２の病原体が、原核生物、真核生物、および／またはウイルスを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記第２の病原体が、ウイルスを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
上記第１の病原体が、バルトネラ属、ボルデテラ属、ブルセラ属、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属、エールリヒア属、エシェリキア属、フランシセラ属、レジオネラ属、リステリア属、ミコバクテリウム属、ミコバクテリウム属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、連鎖球菌属、エルジニア属、バベシア属、クリプトコックス属、クリプトスポリジウム属、アイメリア属、ヒストプラスマ属、リーシュマニア属、プラスモディウム属、タイレリア属、トキソプラスマ属、トリパノソーマ属、肺炎ウイルス亜科、肺炎ウイルス属、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属、コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルスおよびエンテロウイルス、哺乳類レオウイルス科、トリレオウイルス科、オルトレオウイルス、ロタウイルス、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、流行性耳下腺炎ウイルス、トガウイルス科、風疹ウイルス、コロナウイルス科、ヒトコロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、ライノウイルスのＭ株、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒト単純ヘルペスウイルス２（ＨＨＶ３）、ポリオーマウイルス科、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）、テッシェン−タルファンウイルス、パルボウイルス属、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ブタパルボウイルス、ボカウイルス属、オルトミクソウイルス科、特に、インフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラインフルエンザウイルス５型、ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス１および２、アデノウイルス科、アデノウイルス、ヒトアデノウイルスおよびサルアデノウイルス、トリサーコウイルス、ビルナウイルス科、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ガンボロ（ｇｕｍｂｏｒｏ）ウイルスとしても知られている）から選択される１つまたは複数の病原体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記第２の病原体が、項目５に列挙されているような病原体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記第１の細胞内病原体が、試験される上記生物学的試料に存在するかどうかが知られていない、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記第２の細胞内病原体がウイルスである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
上記生物学的試料および上記細胞集団の一方または両方が、哺乳類細胞を含むか、または哺乳類細胞に由来している、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
上記哺乳類細胞が、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、サル細胞、およびイヌ細胞のうちの１つまたは複数を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記哺乳類細胞が、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肝臓細胞、肺細胞のうちの１つまたは複数を含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
上記哺乳類細胞がＭＤＣＫ細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
上記阻害作用物質がオリゴマー化合物を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記オリゴマー化合物が、上記第２の細胞内病原体のゲノムに存在し、該ゲノムにコードされ、および／または該ゲノムから転写される、ヌクレオチド配列と相補的塩基対形成をすることができる、項目１４に記載の方法。
（項目１５）
上記オリゴマー化合物が、第２の細胞内作用物質の増殖を阻害するＲＮＡｉによって作用する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記オリゴマー化合物を含む上記作用物質が二本鎖である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記阻害作用物質が抗真菌剤である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記阻害作用物質が抗ウイルス剤である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
上記阻害作用物質が抗菌剤である、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
工程（ｉｉｉ）の試験結果が１２ヶ月以内に得られる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
Claims (20)
- 生物学的試料において第１の細胞内病原体について試験するための方法であって、該方法は：
（ｉ）阻害作用物質の存在下で、該試料を細胞の集団と接触させる工程であって、該作用物質が第２の細胞内病原体の増殖を阻害する、工程、
（ｉｉ）該第１の細胞内病原体の増殖を可能にする条件下で該細胞をインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた材料を該第１の細胞内病原体について試験する工程、
を包含する、方法。 - 前記第１の病原体が、原核生物、真核生物、および／またはウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第２の病原体が、原核生物、真核生物、および／またはウイルスを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記第２の病原体が、ウイルスを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の病原体が、バルトネラ属、ボルデテラ属、ブルセラ属、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属、エールリヒア属、エシェリキア属、フランシセラ属、レジオネラ属、リステリア属、ミコバクテリウム属、ミコバクテリウム属、リケッチア属、サルモネラ属、赤痢菌属、連鎖球菌属、エルジニア属、バベシア属、クリプトコックス属、クリプトスポリジウム属、アイメリア属、ヒストプラスマ属、リーシュマニア属、プラスモディウム属、タイレリア属、トキソプラスマ属、トリパノソーマ属、肺炎ウイルス亜科、肺炎ウイルス属、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属、コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルスおよびエンテロウイルス、哺乳類レオウイルス科、トリレオウイルス科、オルトレオウイルス、ロタウイルス、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、流行性耳下腺炎ウイルス、トガウイルス科、風疹ウイルス、コロナウイルス科、ヒトコロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、ライノウイルスのＭ株、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒト単純ヘルペスウイルス２（ＨＨＶ３）、ポリオーマウイルス科、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）、テッシェン−タルファンウイルス、パルボウイルス属、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ブタパルボウイルス、ボカウイルス属、オルトミクソウイルス科、特に、インフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラインフルエンザウイルス５型、ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス１および２、アデノウイルス科、アデノウイルス、ヒトアデノウイルスおよびサルアデノウイルス、トリサーコウイルス、ビルナウイルス科、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ガンボロ（ｇｕｍｂｏｒｏ）ウイルスとしても知られている）から選択される１つまたは複数の病原体を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の病原体が、請求項５に列挙されているような病原体を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の細胞内病原体が、試験される前記生物学的試料に存在するかどうかが知られていない、請求項１に記載の方法。
- 前記第２の細胞内病原体がウイルスである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的試料および前記細胞集団の一方または両方が、哺乳類細胞を含むか、または哺乳類細胞に由来している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞が、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞、ヒト細胞、サル細胞、およびイヌ細胞のうちの１つまたは複数を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞が、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肝臓細胞、肺細胞のうちの１つまたは複数を含む、請求項９または１０に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項９に記載の方法。
- 前記阻害作用物質がオリゴマー化合物を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴマー化合物が、前記第２の細胞内病原体のゲノムに存在し、該ゲノムにコードされ、および／または該ゲノムから転写される、ヌクレオチド配列と相補的塩基対形成をすることができる、請求項１４に記載の方法。
- 前記オリゴマー化合物が、第２の細胞内作用物質の増殖を阻害するＲＮＡｉによって作用する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴマー化合物を含む前記作用物質が二本鎖である、請求項１５に記載の方法。
- 前記阻害作用物質が抗真菌剤である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害作用物質が抗ウイルス剤である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害作用物質が抗菌剤である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｉｉｉ）の試験結果が１２ヶ月以内に得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
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