JP2013517492A - セルモノリス炭素の酵素修飾及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、１μｍ〜１００μｍの平均径ｄ_Aを有するマクロ孔と、０．５〜２ｎｍの平均径ｄ_Iを有するミクロ孔とを備え、該マクロ孔と該ミクロ孔とが相互に連結した、メソ孔のない階層的多孔質ネットワークを有する半黒鉛化炭素モノリスの形で与えられるセル固体材料からなる多孔質電気化学的電極に関するものである。この電極において、マクロ孔は、該マクロ孔の表面を構成する半黒鉛化炭素と直接接触した少なくとも１つの電気活性部分を含む。また、本発明は、かかる電極の製造方法、並びに、当該電極の、バイオセンサーとしての使用又はバイオ燃料電池を製造するための使用に関するものでもある。

Description

本発明は、連続したマクロ孔（このマクロ孔は、電気活性単位を有する）及びミクロ孔を有する階層的多孔性ネットワークを含む半黒鉛化炭素モノリスからなる多孔質電気化学的電極、かかる電極の製造方法、及び、当該電極の、液体媒体中の検体を検出するためのバイオセンサーとしての使用又はバイオ燃料電池を製造するための使用に関する。

バイオセンサーは、生化学的シグナルを定量可能な物理的シグナルに変換する変換器に連結された、「リガンド」としても知られている、固定化された生物学的実体からなる分析ツール又は装置である。国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）によれば、バイオセンサーは、小さくてコンパクトでなければならず、可逆シグナルを有しなければならず、正確な決定（「オンオフ」反応）を与えなければならず、しかも生物材料と変換器との間で実質的な結合を達成しなければならない。

電気化学バイオセンサーは、リガンドが電極上に固定されたバイオセンサーの特定のカテゴリーを構成する。この場合、基質（検体）の添加に対する生化学的反応は、増幅された定量可能な電気信号に変換される。電気化学バイオセンサーは、電流測定、電位差測定、電量測定又は電気伝導度測定に関するものであることができる。電流測定バイオセンサーは、酸化還元反応により定電位で発生した電流を測定する。電位差測定バイオセンサーは、活性電極と参照電極との電位差を測定する。これらのリガンドは、バイオセンサーに大きな特異性を付与することを可能にする生体化合物である。最も一般的に使用されているリガンドは、酵素及び抗体である。しかしながら、全細胞、細胞小器官、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）、抗原又は受容体も使用することができる。

バイオ燃料電池は、カソード及びアノードからなるシステムであり、それらには、異なる性質のバイオ電解触媒が固定されているが、ほとんどの場合、この触媒は、媒体中に存在する基質（媒体中に埋め込まれている）との反応により電流を生じさせ、これにより環境や健康などの様々な分野に低電力装置を供給することが可能になる電気活性酵素である。バイオ燃料電池の例としては、特に、生理液中に自然に存在する酸素・グルコースペアからの化学エネルギーを使用する、例えば糖尿病患者において血中グルコースレベルを監視することを目的とした埋め込み型医療機器を供給するためのバイオ燃料電池が挙げられる。このバイオ燃料電池では、そのアノードにグルコースオキシダーゼが導電性ポリマーＩにより取り付けられ、そのカソードにビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）が導電性ポリマーIIにより取り付けられている。機能時に、アノードにおいて電子が生理液中に存在するグルコースからグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）に移され、続いてＧＯｘから導電性ポリマーＩに移され、そして該導電性ポリマーＩからアノードに移される。カソードにおいて、電子がカソードから導電性ポリマーIIに移され、続いてＢＯＤに移され、そしてこのＢＯＤから生理液中に存在する酸素に移される。

想定される用途（電気化学バイオセンサー又はバイオ燃料電池）にかかわらず、リガンドは、吸着、共有結合、カプセル化などの様々な方法で電極上に固定できる。ここで、任意の固定化法の目的は、電極の表面上にある又は孔内にある生物学的リガンドの最大の活性を保持することである。好適な固定化法の選択は、生物学的リガンドの性質、使用する電極の種類、検出される検体の物理化学的特性及び電気化学系の操作条件に依存する。最も一般的に使用されている２つの方法は、吸着及び共有結合である。ファン・デル・ワールス力に基づくリガンドの物理吸着が最も古くかつ最も簡単な固定化方法である。これには、リガンドのいかなる化学的改質も必要とされず、しかも、該方法は、バイオセンサー又はバイオ燃料電池を再生させることを可能にする。この方法の大きな利点は、その容易さである。しかしながら、バイオセンサーにより実施される測定の間やバイオ燃料電池の操作の間にｐＨ、イオン強度又は温度の変化が生じた場合には、吸着したリガンドが失われる可能性がある。共有結合を使用して電極のマトリックス上への固定化や電極の表面での直接的な固定化を可能にすることができる。これらの方法は、最も一般的には酸化還元メディエーターによるリガンドの官能基と電極表面の反応性基との反応に基づく。実際に、多くのバイオセンサー及びバイオ燃料電池では、酵素の酸化還元中心は、良好な導電性を与えるのには電極の表面から遠すぎるため、酸化還元メディエーターにより電極に連結されていなければならない。該酸化還元メディエーターは、生体分子と電極との間の電子シャトルの役割を果たす。酸化還元メディエーターは、例えば、電気伝導性のリンカーアームからなることができる。例としては、フェロセン基を有する可撓性シロキサンにより酸化還元酵素に結合した電流コレクター（炭素電極）からなるバイオセンターについて記載する米国特許第５,０８９,１１２号が挙げられる。

したがって、このようなバイオセンサーの製造の際に直面する困難さの一つは、これらの酸化還元メディエーターを開発することである。この研究分野における大きな問題の一つは、酸化還元メディエーターなしで済ますために電極の表面に生体分子を何とかして直接結合させることである。

酸化還元メディエーターなしで済ますことができるために、電極材料は、いくつかの必須の基準を兼ね備えなければならない：
・大きな比表面積、特に従来の炭素繊維よりも大きな比表面積の導体材料であること、
・酵素基質の含浸及び核酸によって酸素の結合を可能にするために調節可能な多孔性を有すること、
・生体媒質に溶解した生体分子又は生体部分に対する、生体媒質における合理的な電位範囲内での電気化学反応に生体特異的であること、
・生体適合性があること。

炭素は、電極を製造するのに最適な材料である。実際に、その化学的不活性により、電気化学の分野において広範囲の潜在力を調査することが可能になる。この理由のため、炭素は、電気化学的装置：センサー、アクチュエーター、バッテリー及び蓄電池を製造するために様々な形態で幅広く使用されている。さらに、炭素は、有機分子及び重合体が効果的に吸着する材料であるという特殊性を有する。したがって、高度で効果的でしかも選択的な電気化学的装置を製造するために、その上に酸化還元メディエーター、酵素又は導電性ポリマーを吸着させることが可能である。その上、炭素は、生物学的用途のための装置を理想的に製造するのに役立つ生体適合性材料でもある。炭素は、機械的強度、熱安定性及び大規模で形成できる能力（様々な形のディスク、フィルム、モノリス）という有利な他の特性を有する。

炭素電極は、一般的に、メソ多孔性材料の形態である。しかしながら、この材料の性能レベルは、強度が低すぎる電流、さほど安定ではない又は効果が十分ではない吸着及び材料が厳密にメソ多孔質である場合には物質移行が小さいことによる動力学的限界によりさらに制限される。例えば、バイオ燃料電池の場合には、生じる電力は、特に埋め込まれたバイオセンサーへの電力供給など、生物医療機器には不十分である。

バイオセンサー又はバイオ燃料電池の電流密度を増加させることは、それぞれ、十分な検出限界又は２μＷを超える電力を達成することができるために必須の工程である。これを行うためには、電極の比表面積を増大させると同時に十分な物質移行を維持することが必要である。

米国特許出願公開第２００７／００６２８２１号には、孔が酸化還元酵素で官能化された導電性多孔質炭素材料が記載されている。この場合に使用される材料は、「金属フォーム」と呼ばれる多孔質金属構造（例えばＮｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｎｉ／Ｃｒから選択される金属及び金属合金）からなり、その表面は、炭素粉末（特にＫｅｔｊｅｎｂｌａｃｋ）、カーボンナノチューブ又はフラーレンなどの炭素材料で少なくとも部分的に覆われている。このタイプの基材において、酵素の固定化は、酸化還元メディエーターを使用することなく実施できる。しかしながら、この装置の骨格を製造するために使用される金属及びそれを覆うカーボンナノチューブは、生体適合性ではない。さらに、当該装置の生産性は４ｍＡ／ｃｍ²しかなく、これは依然として満足のいくものではない。

多孔質炭素モノリスの形態の材料は、それらの大きな比表面積、大きな細孔容積、周囲の化学反応に対する非応答性、優れた機械的性質及び最後に生体適合性のため、水及び空気の浄化、吸着、不均一相触媒作用、バイオセンサー又はバイオ燃料電池として使用できる電極の製造及びエネルギー貯蔵などの多数の用途に好適な材料となる。

これらの材料は、高い比表面積及び階層構造、すなわち、概して二重孔隙を有するセル構造を備える。これらは、特に、平均孔径が約２〜１０ｎｍの範囲にあるメソ多孔性構造を示す。

これらは、２つの主要な方法に従って製造できる。

第１の主要方法は、軟質の鋳型を使用するものであり、軟質鋳型方法、すなわち、熱重合性重合体（一般には炭素先駆物質）と、不活性雰囲気下において３５０℃での炭化及び熱分解後に多孔質炭素材料を直接得るためのモデリング剤として使用される、ＢＡＳＦ社がＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１２３又はＦ１２７という商品名で販売する製品などの所定の非イオン性重合体型ブロック共重合体との有機／有機相互作用を使用する方法に相当する（Ｍｅｎｇ Ｙ．外，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００５，４４，２）。

第２の主要方法は、硬質の鋳型を使用するものであり、硬質鋳型方法又は外部鋳型方法、すなわち、メソ多孔性固体鋳型に、得ることが望まれる最終材料の先駆物質（例えば炭素先駆物質）の溶液を含浸させてから、該鋳型を非酸化性雰囲気下で炭化させる方法に相当する。

以下で説明する発明は、硬質鋳型方法の群に属する方法に従って製造された材料を使用するものである。

米国特許第５０８９１１２号明細書 米国特許出願公開第２００７／００６２８２１号明細書

Ｍｅｎｇ Ｙ．外，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００５，４４，２

本発明者は、メソ多孔性のない多孔性ネットワークを有すると同時に大きな比表面積を有するセル炭素モノリスを電極として使用すると、酸化還元メディエーターを使用しないことが可能になり、それによって、特に電流密度の点で効果的なバイオセンサー及びバイオ燃料電池を、電気活性部分と電極との間に電子を通すための酸化還元メディエーターを使用することを必要とせずに製造することが可能になることを発見した。本願を例示する実施例で実証するとおり、本発明に従って使用できる炭素モノリスから得られる電気化学的電極は、電気活性部分がモノリスの構成半黒鉛化炭素と直接接触した状態にある場合の方が、酸化還元メディエーターを使用して電気活性部分とモノリスの構成半黒鉛化炭素との間の接点を形成する場合よりもさらに効果的である。

したがって、本発明の主題は、１μｍ〜１００μｍの平均径ｄ_Aを有するマクロ孔と、０．５〜２ｎｍの平均径ｄ_Iを有するミクロ孔とを備え、該マクロ孔と該ミクロ孔とが相互に連結した、メソ孔のない階層的多孔質ネットワークを有する半黒鉛化炭素モノリスとして与えられる固体セル材料からなり、しかも、該マクロ孔が、該マクロ孔の表面を構成する半黒鉛化炭素と直接接触した少なくとも１つの電気活性部分を含むことを特徴とする多孔質電気化学的電極である。

図１ａは、本願の方法の３つの工程のそれぞれの終了時に得られた、ＭＳｉ型のモノリスに相当するモノリスの顕微鏡写真図を示す。 図１ｂは、本願の方法の３つの工程のそれぞれの終了時に得られた、ＭＳｉＳｃｒｏｓｓ型のモノリスに相当するモノリスの顕微鏡写真図を示す。 図１ｃは、本願の方法の３つの工程のそれぞれの終了時に得られた、ＭＳ８０ＨＦ型の炭素モノリスに相当するモノリスの顕微鏡写真図を示す。 図１ｄは、ＭＳｉ型のモノリス及びＭＳ８０ＨＦ型の炭素モノリスの巨視的多孔性ネットワークの顕微鏡ＳＥＭ図を示す。 図２は、実施例で合成された炭素モノリスのそれぞれについて実施された水銀圧入測定法の結果を示す。 ａ）は、Ｍｓｉシリカ鋳型で得られたＦＩＴＲスペクトルを示す。ｂ）は、フェノール／ホルムアルデヒド樹脂の溶液の含浸及び架橋後のシリカマトリックス：ＭＳｉＳｃｒｏｓｓのＦＩＴＲスペクトルを示す。ｃ）は、フッ化水素酸による処理を受けているが、炭化されていないＭＳｉＳｃｒｏｓｓ型のシリカマトリックスのＦＩＴＲスペクトルを示す。ｄ）は、ガラス製試料管内での１ｍｌのＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１０１フェノール／ホルムアルデヒド樹脂の熱処理による単純な架橋により得られた架橋フェノール／ホルムアルデヒド樹脂マトリックスのＦＩＴＲスペクトルを示す。ｅ）は、炭素モノリスＭＳｃａｒｂのＦＩＴＲスペクトルを示す。 図４ａは、ＳＡＸＳによって評価されるメゾスコピックスケールでの多孔率を示す図である。 図４ｂは、ＭＳ８０ＨＦ型の炭素モノリスのＸＲＤ回折スペクトルを示す図である。 図５は、炭素モノリスＭＳ８０ＨＦについて実施された機械的圧縮試験の結果を示す図である。 図６は、ＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂ、ＢＯＤ−Ｍｅｄｉａｔｏｒ−ＭＳ４０ｃａｒｂ及びＢＯＤ−ＧＣ酵素センサーを用いて得られた結果を示す図である。 図７は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中における１０００ｒｐｍの回転速度でのＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂバイオセンサーの０Ｖでの触媒電流密度の変化を示す図である。

用語「モノリス」とは、少なくとも１ｍｍの平均寸法を有する固体を意味するものとする。

用語「メソ孔」とは、平均直径が約２〜５０ｎｍの範囲にある任意の孔を意味するものとする。

用語「電気活性部分」とは、電子交換が生じることのできる任意の分子、すなわち、１個以上の電子を供与する又は受容することのできる任意の分子を意味するものとする。

本発明によれば、電気活性部分を修飾するために使用する「直接接触した（状態）」という表現は、該部分が、半黒鉛化炭素モノリスのマクロ孔の表面に、酸化還元メディエーターを使用することなく、すなわち、該電気活性部分をマクロ孔の表面に結合させるための電気伝導性のリンカーアームを使用する必要なく、固定化されていることを意味する。

このような炭素モノリスを電極材料として使用することにより、本発明の電気化学的電極は次の利点を有する：
・大きな比表面積、特に従来の炭素繊維よりも大きな比表面積を有する；
・固定化することが望まれる電気活性部分と対応する検体との性質に従って孔径を調節することが可能である；
・液体媒体、例えば生理液中に溶解された生体分子又は部分に対して生体特異的である；
・電気活性部分は、いかなる導電性リンカーアームも使用することなく、すなわち酸化還元メディエーターを使用することなく、マクロ孔の表面に固定化される；
・モノリスのマクロ孔内に固定化された電気活性部分がそれらの生物学的活性の全てを保持する；
・マクロ孔が電極内において電解質の迅速な含浸を可能にし、関連する含浸速度は、フィックの拡散法則によっては制限されない；
・良好な機械的性質。

本発明の好ましい実施形態によれば、半黒鉛化炭素モノリスのマクロ孔の壁は、０．５〜４０μｍ、好ましくは２〜２５μｍの厚みを有する.

マクロ孔は、好ましくは約４〜７０μｍの直径を有する。

本発明によれば、ミクロ孔はマクロ孔の壁の厚さで存在する、すなわちこれらをミクロ多孔質にする。ミクロ孔は、好ましくは約０．７〜１．５ｎｍの直径を有する。

本発明に従って使用できる半黒鉛化炭素モノリスの比表面積は、概して、約４００〜９００ｍ²／ｇ、好ましくは約５００〜７００ｍ²／ｇである。

本発明に従って使用できる多孔質半黒鉛化炭素モノリスは、少なくとも次の工程を含む方法に従って製造できる：
（１）シリカのマトリックス又は有機改質シリカからなるセルモノリスの形態の固体シリカ鋳型を製造する工程、ここで、該モノリスは、１μｍ〜１００μｍの平均径ｄ_Aを有するマクロ孔と、２〜５０ｎｍの平均径ｄ_Eを有するメソ孔と、０．５〜２ｎｍの平均径ｄ_Iを有するミクロ孔とを備え、該孔は相互に結合しているものとする；
（２）該固体シリカ鋳型に、少なくとも１種の炭素先駆物質の溶液を真空下で含浸させる工程；
（３）該固体シリカ鋳型内の該先駆物質を重合及び／又は架橋させる工程；
（４）該重合及び／又は架橋先駆物質を含有する該固体シリカ鋳型を炭化する工程、ここで、該工程は、該炭素の半黒鉛化を生じさせるように７００℃以上の温度で実施される；
（５）該半黒鉛化炭素モノリスを、酸又は塩基による処理で該固体シリカ鋳型を除去することにより製造する工程、ここで、該処理は、該炭化工程の前後で区別なく実施される。

本発明の目的上、用語「メソ多孔質ネットワーク」とは、メソ孔、すなわちサイズが２〜５０ｎｍの範囲の孔を有するネットワークを意味するものとする。

第１工程の間におけるシリカ鋳型の製造は、好ましくは、特許出願ＦＲ−Ａ１−２８５２９４７号及びＦＲ−Ａ１−２９１２４００号に記載されるような方法に従って実施される。これらの方法は、概して、
・油性相を界面活性剤の水溶液に導入することによりエマルジョンを製造し、
・該エマルジョンの製造前又は後に、該界面活性剤の溶液に少なくとも１種のシリカ酸化物先駆物質及び／又は少なくとも１種の有機改質シリカ酸化物先駆物質の水溶液を添加し、
・該反応混合物を該先駆物質が凝縮するまで放置し、続いて
・該混合物を乾燥させて所期の固体シリカ鋳型を得ること
からなる。

この場合、シリカ酸化物又は有機改質シリカ酸化物先駆物質は、次式（Ｉ）のシリカテトラアルコキシド：
Ｒ’_n（ＯＲ）_4-nＳｉ （Ｉ）
［式中：
・Ｒは、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基又は次式（II）の有機基を表し：
−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₁ （II）
（ここで、０≦ｍ≦５であり、Ｒ₁は、チオール基、ピロール基、１個以上の任意に置換されたアルキル、アルキルアミノ若しくはアリール置換基を有していてよいアミノ基、アルキル基（好ましくは１〜５個の炭素原子を有する）又はアルキル型の置換基Ｒ₂を有していてよいフェニル基、特にメチル基から選択される。）、
・Ｒ' は、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基又は１個以上の官能基を有していてよいアリール基を表し、
・０≦ｎ＜ｍであり；ｍはケイ素原子の原子価である。）
から選択できる。

特に、式（II）の有機基は、次のものであることができる：
・３−メルカプトプロピル基；
・３−アミノプロピル基；
・Ｎ−（３−プロピル）ピロール基；
・Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピル基；
・３−（２，４−ジニトロフェニルアミノ）プロピル基；
・フェニル若しくはベンジル基；又は
・メチル基。

式（Ｉ）の先駆物質は、好ましくは、テトラメトキシシラン、テトラエトキシオルトシラン（ＴＥＯＳ）、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、Ｎ−（３−トリメトキシシリルプロピル）ピロール、３−（２，４−ジニトロフェニルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン及びメチルトリエトキシシランから選択される。

式（Ｉ）の少なくとも１個の基を有する式（Ｉ）の先駆物質を使用すると、炭素先駆物質の溶液による湿潤が改善されたシリカ鋳型を得ることが可能になる。また、これにより、炭素を生じさせる重合性単量体又はマクロ単量体による孔の含浸を最適化させることも可能である。

水溶液中におけるシリカ酸化物先駆物質及び／又は有機改質シリカ酸化物先駆物質の濃度は、好ましくは、水性相の重量に対して１０重量％を超える。この濃度は、より好ましくは、水性相の重量に対して１７〜３５重量％の範囲にある。

油性相は、好ましくは、少なくとも１２個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルカンから選択される１種以上の化合物からなる。例えば、ドデカン及びヘキサデカンが挙げられる。また、油性相は、低粘度、すなわち４００センチポイズ未満のシリコーンオイルからなることもできる。

エマルジョン中に存在する油性相の量は、シリカ鋳型について得るのが望まれるマクロ孔の直径に従って調節できる。容積基準によるオイル／水の割合が多ければ多いほど、エマルジョン中のオイル液滴の直径は小さく、また、マクロ孔の直径も小さいと解される。

一般に、油性相は、エマルジョンの全容積に対して６０〜９０容積％まで存在する。このオイル量により、マクロ孔の平均径が約１〜１００μｍのシリカ鋳型を得ることが可能になる。

界面活性剤化合物は、特に、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドから選択される陽イオン性界面活性剤とすることができる。界面活性剤化合物が陽イオン性の場合には、反応媒体は、３未満、好ましくは１未満のｐＨにされる。テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドが特に好ましい。

また、界面活性剤化合物は、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム及びスルホコハク酸ジオクチルナトリウム（ＡＯＴ）から選択される陰イオン性界面活性剤とすることもできる。界面活性剤化合物が陰イオン性の場合には、反応媒体は１０を超えるｐＨにされる。

最後に、界面活性剤化合物は、エトキシル化された頭部及びノニルフェノールを含む界面活性剤から選択される非イオン性界面活性剤とすることもできる。このような界面活性剤としては、特に、例えばＢＡＳＦ社がＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｐ１２３及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ１２７という商品名で販売するエチレングリコール及びプロピレングリコールブロック共重合体が挙げられる。界面活性剤化合物が非イオン性の場合には、反応媒体は、１０を超えるｐＨ又は３未満、好ましくは１未満のｐＨにされ、そしてさらに、好ましくは、シリカ酸化物先駆物質の凝縮を改善させるためにフッ化ナトリウムを含有する。

また、エマルジョン中に存在する界面活性剤の総量は、シリカ鋳型において得ることが望まれるマクロ孔の直径に従って調節できる。また、この量は、使用する界面活性剤の性質に従って変更することもできる。

一般に、界面活性剤の量は、エマルジョンの総重量に対して、１〜１０重量％、好ましくは３〜６重量％の範囲である。

シリカ酸化物先駆物質及び／又は有機改質シリカ酸化物先駆物質の凝縮工程は、有利には、周囲温度に近い温度で実施される。この工程の持続期間は、反応媒体のｐＨに応じて、数時間（２〜３時間）から数週間（２〜３週間）までの範囲とすることができる。

第１工程の終了時に得られるシリカ鋳型を、好ましくは有機溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、アセトン及びそれらの混合物など）を使用して洗浄し、続いて乾燥（例えばオーブン内の空気で又は凍結乾燥により）させてから、炭素先駆物質又はセラミック先駆物質の溶液の含浸工程を行う。

炭素先駆物質は、好ましくは、フェノール樹脂、レゾルシノール、スチレン、ジビニルベンゼン、例えばスクロース及びその誘導体、馬鈴薯でんぷん、リグニン、リグニン・セルロース混合物などの多糖類及び石油ピッチから選択される。

炭素先駆物質は、工程（３）の間に重合及び／又は架橋される単量体、オリゴマー、予め形成されたマクロ単量体又は重合体の形態で与えられる場合がある。炭素先駆物質として石油ピッチを使用する場合には、工程（３）は、必ずしも実施されるわけではない。

含浸溶液の先駆物質は、好ましくは炭素先駆物質、さらに好ましくはフェノール樹脂、特にフェノール／ホルムアルデヒド樹脂である。

炭素先駆物質の溶液の溶媒は、好ましくは、エタノールなどの低級アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン及びそれらの混合物から選択される有機溶媒である。炭素先駆物質がフェノール樹脂から選択される場合、溶媒は、塩基の存在下で水及び水と上記溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒との混合物からも選択できる。

含浸工程ために使用される溶液中における炭素先駆物質の量は、該方法の終了時に炭素モノリスで得ることが望まれるマクロ孔の直径に従って調節できる。ここで、この量が少なければ少ないほど、マクロ孔の直径は大きく、しかも内部連結部分（マクロ孔の壁）は細かいと解される。一般に、含浸溶液中における炭素先駆物質の量は、該溶液の総重量に対して、５重量％〜９０重量％、さらに好ましくは２０重量％〜７０重量％の範囲である。

炭素先駆物質の重合及び／又は架橋の工程（３）は、当業者に知られている任意の方法で実施できる。

先駆物質が例えばフェノール樹脂などの炭素先駆物質の場合には、熱架橋が実施される。

先駆物質が例えばスチレンやジビニルベンゼンなどの炭素先駆物質の場合には、特にアゾ（ビス）イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ペルオキソ二硫酸カリウム及びペルオキソ二硫酸ナトリウムから選択される架橋剤によって誘導される架橋が実施される。

炭素先駆物質が含浸するシリカ鋳型の炭化工程は、半黒鉛化炭素を得ることを可能にし、かつ、一般には、還元性雰囲気中において、約７００〜１２００℃の範囲の温度で、約３〜１２時間の時間にわたって実施される。

前述のように、シリカ鋳型の除去工程は、炭化工程の前後で区別なく実施でき、事実、これら２つの工程を実施する順序は、実際には、得られるモノリスの多孔性ネットワークにはいかなる影響も及ぼさない。

このシリカ鋳型除去工程は、好ましくは、重合した及び／又は架橋した先駆物質が含浸したシリカ鋳型や炭化により得られた炭素モノリスを、例えばフッ化水素酸溶液などの酸性溶液や、例えば、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム溶液などのｐＨ９を超える塩基性溶液中に浸漬させることによって実施される。この処理の持続期間は、シリカ鋳型が完全に除去された瞬間から重要ではなくなる。この期間は、概して、１２〜２４時間の範囲である。

本発明に従って使用することのできる半黒鉛化炭素モノリスのマクロ孔内に固定化され得る電気活性部分は、電子交換が可能な全ての分子から選択できる。かかる分子としては、酸化還元中心を有する酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドなどの核酸、抗体及び抗原のみならず、ポリピロール、ポリアニリン及びレドックス重合体などの導電性重合体も挙げられる。

本発明の目的上、表現「酸化還元中心を有する酵素」とは、酸化又は還元反応を触媒することのできる任意の酵素を意味するものとする。

本発明の好ましい実施形態によれば、電気活性部分は酸化還元中心を有する酵素であり、 特に次のものを含む酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１）から選択される：
（i）グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ；
（ii）５−α−レダクターゼ、シトクロムｂ５レダクターゼ、葉酸及びジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（又は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ又はＨＭＧＲ）、グルタチオンレダクターゼ、メトヘモグロビンレダクターゼ及びリボヌクレオチドレダクターゼなどのレダクターゼ；
（iii）リポキシゲナーゼなどのモノオキシゲナーゼ並びにケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、ヘムオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０などのジオキシゲナーゼを含むオキシゲナーゼ；
（iv）例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びルシフェラーゼなどのヒドロゲナーゼ及びデヒドロゲナーゼ。

これらの酸化還元酵素は、機能するために、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ヘム及びピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）などの酸化還元補酵素から選択される補因子、或いは金属陽イオンと会合する。

つまり、電気活性部分が酸化還元酵素の場合には、炭素モノリスのマクロ孔は、酸化還元補酵素（該補因子は、酸化還元酵素の一体部分、すなわち酵素蛋白質自体の一部であることや、別々に存在することが可能である）及び金属陽イオンから選択される少なくとも１種の補因子を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、固定化された電気活性部分の量は、電気化学的電極の総重量に対して、約０．０１〜７重量％、より好ましくは約０．０４〜３重量％の範囲である。

電気活性部分は、本発明の電気化学的電極の構成半黒鉛化炭素モノリスのマクロ孔内に、半黒鉛化炭素との静電相互作用（吸着）のみならず、マクロ孔のサイズに関連する立体障害により固定化される。

半黒鉛化炭素と電気活性部分との非常に強い相互作用により、吸着安定性が増す。この安定性は、対応するバイオセンサー及びバイオ燃料電池の安定性のために極めて重要である。この安定性の増大により、従来の炭素材料で得ることのできるよりも極めて長い稼働時間が確保されるからである。

また、本発明の主題は、本発明の上記電気化学的電極の製造方法であって、該方法は、１μｍ〜１００μｍの平均径ｄ_Aを有するマクロ孔と、０．５〜２ｎｍの平均径ｄ_Iを有するミクロ孔とを備え、該マクロ孔と該ミクロ孔とが相互に連結した、メソ孔のない階層的多孔質ネットワークを有する半黒鉛化炭素モノリスに、少なくとも１種の電気活性部分の水溶液又は水分散液を含浸させる工程を含み、ここで、該方法は、該マクロ孔の表面を酸化還元メディエーターで官能化する工程を含まないものとすることを特徴とする方法に関するものでもある。

モノリス含浸工程は、好ましくは真空下で実施される。

特に好ましい一実施形態によれば、含浸工程は、真空下において、周囲温度で約７２時間にわたり実施される。

電気活性部分が酸化還元酵素であり、しかも補因子が酵素の一体部分や金属陽イオンではない酸化還元補酵素である場合には、半黒鉛化炭素モノリスを含浸させるのに使用される水溶液又は水分散液は、少なくとも１種の酸化還元補酵素又は金属陽イオンも含む。

含浸工程の終了時におけるモノリスの洗浄は、好ましくは蒸留水で実施される。

また、本発明の主題は、上記電気化学的電極の、液体媒体中の検体を検出するための又はバイオ燃料電池を製造するためのバイオセンサーとしての使用でもある。

本発明の電極をバイオセンサーとして使用する場合、検出可能な検体の性質は、当然、半黒鉛化炭素モノリスのマクロ多孔内に固定化される電気活性部分の性質に従って変わってくるであろう。

例えば、固定化される部分がグルコースオキシダーゼの場合には、電気化学的電極は、液体媒体、特に血液などの生体液中におけるグルコースレベルを検出するためのバイオセンサーとして使用できる。

固定化される部分が核酸分子又は蛋白質の場合には、電気化学的電極は、操作がオリゴヌクレオチド−ＤＮＡ及び／又は抗原−抗体生物学的認識に基づくアフィニティーバイオセンサーとして使用できる。このタイプのバイオセンサーは、例えば医療診断におけるツールとして使用できる（癌マーカー）。

バイオ燃料電池は、ヒトの生体媒体中に存在する化学燃料を電力に変換するための電極部での生体触媒反応に基づく燃料電池である。バイオ燃料電池は、例えば、人体に埋め込まれた医療機器、例えば血糖値を測定し送信するためのインプラントに供給するためのエネルギー源として機能することができる。

本発明の電極がバイオ燃料電池を製造するために使用される場合には、該バイオ燃料電池は、例えば、固定化部分がグルコースオキシダーゼである本発明の第１電極（アノード）と、固定化部分がビリルビンオキシダーゼである本発明の第２電極（カソード）とからなることができ、ここで、これら２つの電極は、電気エネルギーが供給される装置を貫通する電気回路を介して互いに連結されている。

上記材料における酵素の固定化は、これらバイオ燃料電池の２つの部分を隔てる膜の存在を回避し、それによって装置を単純化し、該装置を小型化することを可能にする。

本発明の別の主題は、本発明の上記少なくとも１個の電気化学的電極を備えることを特徴とするバイオセンサーである。

最後に、本発明の主題は、電気回路を介して互いに連結した正極及び負極を備えるバイオ燃料電池であって、該２個の電極のうち少なくとも１個が本発明の上記電気化学的電極であることを特徴とするバイオ燃料電池である。

本発明を次の例示的実施形態により例示するが、本発明は、これらに限定されるものではない。

例
次の例で使用した原料を以下にまとめる：
・９８％テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）：Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社；
・９８％テトラエトキシオルトシラン（ＴＥＯＳ）：アルドリッチ社；
・アセトン及びドデカン（９９％）：Ｒｅｃｔａｐｕｒ社；
・テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；４８％フッ化水素酸及び３７％塩酸：Ａｎａｌａｒ Ｎｏｒｍａｐｕｒ社；
・ロディア社がＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１０１という商品名で販売するフェノール／ホルムアルデヒド樹脂；
・天野エンザイム株式会社（日本）が販売するビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）；
・レドックス重合体：ポリアクリルアミドとポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）との共重合体であって、［Ｏｓ（４，４’−ジクロロ−２，２’−ビピリジン）₂Ｃｌ］^+/2+と複合体形成したもの（ＰＡＡ−ＰＶＩ−ｂｉｐｙ）。このＰＡＡ−ＰＶＩ共重合体は、次のとおりに製造できる：４，４’−ジニトロ−２，２’−ビピリジン−Ｎ，Ｎ’−ジオキシドをＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．外，Ｊ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ，１９８５，２２４７−２２５０及びＫｅｎａｕｓｉｓ Ｇ．外，Ａ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，Ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎｓ，１９９６，９２，４１３１−４１３５に記載されたとおりに製造した。続いて、４，４’−ジクロロ−２，２’−ビピリジン（ｄｃｌ−ｂｐｙ）を、Ｍａｅｒｋｅｒ Ｇ．外によって変更された方法に従って４，４’−ジニトロ−２，２’−ビピリジン−Ｎ，Ｎ’−ジオキシドから合成した（上記Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．外及びＭａｅｒｋｅｒ Ｇ．外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５８，８０，２４７５−２４７７）。Ｏｓ（ｄｃｌ−ｂｐｙ）₂Ｃｌ₂を次のとおりに製造した：（ＮＨ₄）₂ＯｓＣｌ₆及び「ｄｃｌ−ｂｐｙ」をエチレングリコールに１：２のモル比で溶解させ、そして１時間にわたってアルゴン雰囲気下で還流させた（収率８５％）。続いて、Ｏｓ（ｄｃｌ−ｂｐｙ）₂Ｃｌ₂を１：７ポリアクリルアミド／ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）（ＰＡＡ−ＰＶＩ）共重合体と複合形成させ、そしてＺａｋｅｅｒｕｄｄｉｎ，Ｓ．Ｍ．外，J．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，３３７，２５３−２５６に記載されたとおりに精製してレドックス重合体ＰＡＡ−ＰＶＩ−ｂｉｐｙを製造した；
・Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社が（ＰＥＧＤＧＥ）-４００という商品名で販売するポリエチレングリコールジグリシジルエーテル。

市販の原料を、さらに精製することなく、製造業者から受け取ったときに使用した。

これらの例で得られた様々なモノリスを様々なサイズスケールで特徴付けた。

メソ多孔性は、Ｊｅｏｌ２０００ＦＸ顕微鏡を使用した透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術により、２００ｋＶの加速電圧で定量的に特徴付けた。試料は、粉末シリカ骨格をＦｏｒｍｖａｒ＆ｃｏｍｍａｔ炭素膜が被覆された銅グリッド上に粉末シリカ骨格を付着させることによって製造した。

マクロ多孔性は、１０ｋＶで作動するＪｅｏｌ ＪＳＭ−８４０Ａ走査顕微鏡を使用した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）技術により定量的に特徴付けた。これらのキャラクタリゼーションを行う前に、試料に金又は炭素を被覆した。

比表面積の測定は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ＡＳＡＰ２０１０という商品名で販売される装置を使用した窒素吸着／脱着技術により実施した；判定は、ＢＥＴ又はＢＪＨ算出法により実施される。

マクロ多孔性は、無機骨格が構成される巨視的無機セルの特性を達成するために、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ（商標）Ａｕｔｏｐｏｒｅ ＩＶという商品名で販売される装置を使用した水銀圧入測定法により定量した。

試料を、１８ｋＷ回転アノードＸ線源（Ｒｉｇａｋｕ−２００）を使用し、モノクロメーターとしてＧｅ結晶（１１１）を用いてＸ線回折（ＸＲＤ）又は小角Ｘ線回折（ＳＡＸＳ）により分析した。散乱放射線を２次元コレクター（Ｍａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ハンブルグ）が販売するイメージングプレートシステム）に集めた。検出器から試料までの間隔は５００ｍｍであった。

熱重量分析は、Ｓｔｅａｒａｍ ＴＡＧ−１７５０という商品名で販売されている熱重量分析器を使用して酸素気流（５ｃｍ³．ｍｉｎ^-1）下で実施した。

フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）分析は、Ｎｉｃｏｌｅｔ ７５０という商品名で販売されている分光計で実施した。

機械的圧縮試験は、Ｉｎｓｔｒｏｎ４４６６という商品名で販売されている装置を使用して実施した。試料を２個の剛性板間で圧縮し、そして様々な圧力で観察された機械的歪みを記録した。圧縮率は０．５ｍｍ／ｓであった。

例１
マクロ多孔性及びミクロ多孔性炭素モノリスの製造
この例では、ミクロ／メソ／マクロ多孔性シリカモノリスから出発するマクロ／ミクロ二重多孔性を示す様々な炭素モノリスを例示する。

（１）第１工程：ミクロ／メソ／マクロ多孔性シリカモノリスの合成（ＭＳｉ）
５ｇのＴＥＯＳを、７ｇのＨＣｌで予め酸性にされた３５％ＴＴＡＢ水溶液１６ｇに添加した。単相親水性媒体（エマルジョンの水性相）が得られるまで加水分解を行った。続いて、この水性相に、３５ｇのドデカン（エマルジョンの油性相）を滴下で撹拌しながら添加した。続いて、このエマルジョンを、周囲温度で１週間、シリカモノリスの状態で凝縮するまで放置した。このようにして合成されたシリカモノリスをＴＨＦ／アセトン（５０／５０：ｖ／ｖ）混合物で洗浄して、そこから油性相を抽出した。その後、このシリカモノリスを周囲温度で１週間にわたり乾燥させ、続いて、６５０℃で６時間（２℃／分の温度上昇速度が適用される）、２００℃で２時間のプラトーの加熱処理を行う。Ｍｓｉと示されるシリカモノリスが得られた。

（２）第２工程：フェノール樹脂によるシリカモノリスの含浸
上で得られたシリカモノリスＭＳｉを、手のこぎりを使用して、各０．５ｇの５個の同一の断片に切断した。
さらに、Ａｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１１０フェノール樹脂の次の４種の溶液を製造した：
・溶液Ｓ２５：ＴＨＦ中２５重量％のＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１１０、
・溶液Ｓ６０：ＴＨＦ中６５重量％のＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１１０、
・溶液Ｓ８０：ＴＨＦ中８０重量％のＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１１０、
・溶液Ｓ９０：ＴＨＦ中９０重量％のＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１１０。
続いて、シリカモノリスの０．５ｇ片をビーカー中の溶液Ｓ２５〜Ｓ９０のそれぞれに浸漬した。これらのビーカーを、泡立ちが消失するまで真空下に置いて、フェノール樹脂溶液によるシリカマトリックスの良好な含浸を確保した。周囲温度で２４時間撹拌後に、これらの溶液のそれぞれをろ過した。
続いて、溶液Ｓ２５〜Ｓ９０が含浸されたシリカモノリス（それぞれ、ＭＳｉＳ２５、ＭＳｉＳ６０、ＭＳｉＳ８０及びＭＳｉＳ９０という）をＴＨＦで迅速に洗浄し、次いで８０℃の温度で２４時間にわたりオーブン内で乾燥させて溶媒の蒸発を促進させ、そしてフェノール樹脂の単量体の架橋を熱により開始させた。その後、モノリスＭＳｉＳ２５〜ＭＳｉＳ９０のそれぞれについて、１５５℃の熱風炉内で５時間、２℃／分の温度上昇、８０℃での第１のプラトーが１２時間生じ、その後１１０℃での第２プラトーが３時間生じる第２加熱処理を行う。続いて、モノリスを、単にオーブンの交換により周囲温度にまで戻す。このようにして、架橋フェノール樹脂（ＭＳｉＳｃｒｏｓｓ型のハイブリッドモノリス）が含浸されたシリカモノリスを得た。これらのモノリスをそれぞれＭＳｉＳ２５ｃｒｏｓｓ、ＭＳｉＳ６０ｃｒｏｓｓ、ＭＳｉＳ８０ｃｒｏｓｓ及びＭＳｉＳ９０ｃｒｏｓｓという。ＭＳｉＳ８０ｃｒｏｓｓモノリスは２回製造した。

（３）第３工程：炭素モノリスの合成
２つの合成方法を実施した。
第１の合成方法に従って、第２工程の終了時に得られた上記モノリスＭＳｉＳ２５ｃｒｏｓｓ、ＭＳｉＳ６０ｃｒｏｓｓ、ＭＳｉＳ８０ｃｒｏｓｓ及びＭＳｉＳ９０ｃｒｏｓｓのそれぞれを１０％フッ化水素酸の連続浴中に浸漬し、次いで脱イオン水で徹底的に洗浄した。このフッ化水素酸による処理により、シリカ鋳型を除去した。その後、この処理により生じたモノリスを８０℃の熱風炉内で一晩乾燥させた。乾燥後、モノリスを窒素流れ下で１時間にわたり９００℃の温度で熱分解すると同時に、４℃／分の温度上昇速度を観察した。このようにして得られた黒鉛化炭素モノリスをそれぞれＭＳ２５ｃａｒｂ、ＭＳ６０ｃａｒｂ、ＭＳ８０ｃａｒｂ及びＭＳ９０ｃａｒｂという。
第２合成方法を他のモノリスＭＳｉＳ８０ｃｒｏｓｓに適用した。この第２方法によれば、フッ化水素酸による処理及び熱分解を実施した順序を単に逆にした。ただし、これら２つの工程は、ＭＳｃａｒｂモノリスを製造するのに使用した手順と同じ態様で実施した。得られた黒鉛化炭素モノリスをＭＳ８０ＨＦという。

（４）キャラクタリゼーション
添付図１は、本願の方法の３つの工程のそれぞれの終了時に得られたモノリスの顕微鏡写真図を示す：図１ａ）はＭＳｉ型のモノリスに相当し、図１ｂ）はＭＳｉＳｃｒｏｓｓ型のモノリスに相当し、図１ｃ）はＭＳ８０ＨＦ型の炭素モノリスに相当する。

鋳型として使用したシリカモノリスの一般的な形状は、ＭＳｉＳｃｒｏｓｓ型のハイブリッドモノリスによる炭素モノリスで正確に再現されることに留意すべきである。また、シリカモノリスとそれに対応する炭素モノリスとの間の約４５％の容積の損失も観察される。この容積損失は、熱分解中にシリカ鋳型を除去することにより生じる材料のある種の沈殿によるものである。

また、添付図１は、ＭＳｉ型のモノリスの（図１ｄ）及びＭＳ８０ＨＦ型の炭素モノリスの巨視的多孔性ネットワークの顕微鏡ＳＥＭ図も示している。これらの図において、白の矢印は、細孔の外部結合部を示し、黒の矢印は、細孔の外部結合部を示す。

シリカモノリスのマクロ多孔性ネットワークの構造は、対応する炭素モノリス内で保持されることが観察されるところ、これは、炭素モノリスが、実際には使用したシリカ鋳型の実質的に正確なレプリカであって、そのネガではないことを示している。

この例で合成された炭素モノリスのそれぞれについて実施された水銀圧入測定法の結果を添付図２に示し、以下の表１にまとめる。

図２では、曲線２ａ）〜２ｅ）は、炭素モノリス（図２ａ：ＭＳ２５ｃａｒｂ；図２ｂ：ＭＳ６０ｃａｒｂ；図２ｃ：ＭＳ８０ｃａｒｂ；図２ｄ：ＭＳ９０ｃａｒｂ及び図２ｅ：ＭＳ８０ＨＦ）についての、孔径（ｎｍ）に応じた示差浸入容積（ｍＬ／ｇ／ｎｍ）を示す。

これらの結果は、マクロ多孔性ネットワークの容積が、ＭＳｉモノリスに含浸させるために使用されるフェノール／ホルムアルデヒド樹脂の濃度に反比例することを示している（ＭＳ２５ｃａｒｂからＭＳ９０ｃａｒｂになるにつれて浸入容積及び多孔率が減少する）。マクロ孔の直径は、多分散性であり、１０〜１００００ｎｍの範囲である（図２）。

ＮＢ：水銀充満測定は、マクロ孔の範囲内で有効であるにすぎない。図２ｃ及び２ｄにおいて２〜５０ｎｍの直径の範囲内にあるように見える点は、特に、これらの材料の測定の乱れ又は点欠陥であって、どんな状況であってもメソ多孔性ネットワークの存在に相当するものではない。さらに、メソ多孔性ネットワークが存在しないことは、窒素吸着／脱着測定でも確認した（以下の表２及び表２の結論参照）。

一方、モノリスのそれぞれの炭素骨格の最終密度は、該骨格が専ら部分黒鉛化炭素からなるという事実のため、それぞれの場合において実質的に同じである。

ＭＳ８０ｃａｒｂ及びＭＳ８０ＨＦで得られた結果はさほど相違するものではないが、これは、炭化工程（３）の間に使用した２つの合成方法が均等であることを示している。

また、フーリエ変換赤外分光により、第３工程中に実施されたフッ化水素酸による処理でシリカ鋳型を除去することが可能になることも確認した。添付図３は、Ｍｓｉシリカ鋳型で得られたＦＩＴＲスペクトル（図３ａ）、フェノール／ホルムアルデヒド樹脂の溶液の含浸及び架橋後のシリカマトリックス：ＭＳｉＳｃｒｏｓｓ（図３ｂ）、フッ化水素酸による処理を受けているが、炭化されていないＭＳｉＳｃｒｏｓｓ型のシリカマトリックス（図３ｃ）、ガラス製試料管内での１ｍｌのＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１０１フェノール／ホルムアルデヒド樹脂の熱処理による単純な架橋により得られた架橋フェノール／ホルムアルデヒド樹脂マトリックス（図３ｄ）及び炭素モノリスＭＳｃａｒｂ（図３ｅ）のＦＩＴＲスペクトルを示す。この図３において、任意単位で表される透過率は、ｃｍ^-1で表される波長に応じたものである。黒の矢印は、１０７６ｃｍ^-1でのＳｉＯのピーク特性を示す。Ｍｓｉ及びＭＳｉＳｃｒｏｓｓモノリスのスペクトル３ａ）及び３ｂ）は、両方とも１０７６ｃｍ^-1を中心とする強い吸収を示すが、これは、シリカが存在することを意味している。純粋なフェノール／ホルムアルデヒド樹脂マトリックスに相当するスペクトル３ｄ）では、このピークはもちろん存在しない。これはスペクトル３ｃ）及び３ｅ）でも同様である。これらの結果は、フッ化水素酸による処理によってシリカ鋳型が完全に除去されたことを示している。ＭＳｃａｒｂ炭素モノリスのスペクトルは完全に平坦である。芳香環のＳｐ²及びＳｐ³軌道に相当するピークは、それぞれ約１６５０ｃｍ^-1及び１１００ｃｍ^-1に位置する。

得られた炭素モノリスのそれぞれに関する比表面積測定値を以下の表２にまとめる。

これらの結果から、モノリスはミクロ多孔性の性質（７〜１２Å）を有しており、メソ多孔性を示さないと結論付けることができる。

ＳＡＸＳによって評価されるメゾスコピックスケールでの多孔率の検討を添付図４ａに与える。散乱プロファイルを合成された炭素モノリスのそれぞれについて確立した（ＭＳｉ：□、ＭＳｉＳ８０ｃｒｏｓｓ：▼、ＭＳ８０ｃａｒｂ：△及びＭＳ８０ＨＦ：●）。この図において、任意単位で表される強度は、Å^-1で表される波数ベクトル（ｑ）に応じたものである。

純粋なシリカＭＳｉ及び架橋樹脂が含浸されたシリカＭＳｉＳｃｒｏｓｓから形成されたマトリックスは、２つの細孔間の間隔が３２Åの非整列メソ多孔性を有することに留意すべきである（波数ｑ＝０．１９５Å^-1）。さらに、メソ多孔性が存在しないことが他のモノリスで観察される。

ＭＳ８０ＨＦ型の炭素モノリスのＸＲＤ回折スペクトルに相当する図４ｂ（回折角（°）に応じた強度（任意単位））を考慮すると、黒鉛化炭素質化合物のピーク特性にそれぞれ相当する２つのメインピーク（２Ｑ＝２２°及び２Ｑ＝４５°）が認められる（ｄ（００２）＝０．４ｎｍ及びｄ（１００）／ｄ（１０１））。

このように黒鉛化されたＭＳｃａｒｂ及びＭＳ８０ＨＦの炭素モノリスは、約１０Ｓ．ｃｍ^-1の伝導性を示した。

炭素モノリスＭＳ８０ＨＦについて実施された機械的圧縮試験の結果を添付図５に与えており、この図において、応力（ＭＰａ）は、歪み（％）に応じたものである。ギザギザの曲線から、モノリスのマクロ多孔性構造が部分的に破壊したことによる突然の応力低下が明らかになる（マクロ孔の壁の破壊）。この図において、斜めの点線は、それぞれの頂点が、加えられた応力の値にかかわらず、同じ傾きで始まることを示している。この結果は、弾性条件下での挙動を表す。

これらの結果から算出される平均ヤング率は約０．２ＧＰａであるところ、これは、得られた材料の非常に高い強度を反映しており、バイオセンサー又はバイオ燃料電池用の電気活性部分で改質された電極を製造するために使用するのを可能にする。

例２
酵素センサーの製造
この例では、炭素モノリス及びビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）から出発した、酸素（Ｏ₂）を検出するための酵素センサー（ＥＳ）の製造を例示するものである。

この例で使用する炭素モノリスを上記例１で記載したとおり正確に製造したが、ただし、例１の工程（１）で得られるシリカ鋳型の含浸工程のために４０％フェノール樹脂溶液、すなわち溶液Ｓ４０：ＴＨＦ中４０重量％のＡｂｌａｐｈｅｎｅ（商標）ＲＳ１１０を使用した。

溶液Ｓ４０が含浸されたシリカモノリス、すなわちＭＳｉＳ４０モノリスを得た。

続いて、上記例１の工程（３）で説明した第１の合成方法に従って炭素モノリスを合成した。

炭素モノリスＭＳ４０ｃａｒｂが得られた。その多孔性の特徴は次のとおりであった：
*メソ多孔性（窒素吸着／脱着）：
ミクロ孔の表面積：５２３ｍ²．ｇ^-1
ミクロ細孔容積：０．２７ｃｍ³．ｇ^-1
*マクロ多孔性（水銀ポロシメトリー）：
浸入容積：１．７３ｃｍ³．ｇ^-1
多孔率：７４％
嵩密度：０．４３ｇ．ｃｍ³
骨格の密度：１．６４ｇ．ｃｍ³。

続いて、炭素モノリスＭＳ４０ｃａｒｂを次の方法に従ってバイオ電解触媒で官能化させた：
炭素モノリスを導電性炭素ペイントにより直径５ｍｍのガラス状炭素電極（ＧＣ電極，Ｐｉｎｅ，米国）に接着させ、その後１Ｔｏｒｒ酸素プラズマに１５分間さらした。
炭素モノリスで改質された電極を１．７ｍｇ／ｍＬのＢＯＤの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）の溶液中に１時間３０分間にわたり浸漬した。
このようにして本発明の酵素センサーＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂを得た。
比較例１として、５ｍｍの直径のガラス状（ＧＣ）電極（米国ノースカロライナ州ローリーのＰｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を製造し、そして５μＬのＢＯＤ水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）で含浸させた。

本発明ではない酵素センサー（ＢＯＤ−ＧＣという）を得た。

比較例２では、本発明ではない別のバイオセンサーを、ビリルビンオキシダーゼ及び酸化還元メディエーター、すなわち、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）とポリ（アクリルアミド）との共重合体であって［Ｏｓ（４，４’−ジクロロ−２，２’−ビピリジン）₂Ｃｌ］^+/2+と複合体を形成したもの（ＰＡＡ−ＰＶＩ−ｂｉｐｙ）を含むＭＳ４０ｃａｒｂモノリスから出発して製造した。この場合、ビリルビンオキシダーゼは、モノリスのマクロ孔の外部表面には直接的には吸収されないが、酸化還元メディエーターによりマクロ孔の表面に結合している。この場合、ＭＳ４０ｃａｒｂ炭素モノリスには、５１．６μｇのＰＡＡ−ＰＶＩ−ｂｉｐｙ、１０．０μｇのＢＯＤ及び５．０μｇのＰＥＧＤＧＥ（４００）からなる６６．６μｇの混合物が含浸された。

このようにして、本発明の一部ではない酵素センサー（ＢＯＤ−Ｍｅｄｉａｔｏｒ−ＭＳ４０ｃａｒｂという）を得た。

続いて、これら３種のセンサーについて、液体媒体中でのＯ₂の検出を試験した。測定を、コンピューターに連結されたバイポテンショスタット（ＣＨ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、電気化学的検出器、型式ＣＨＩ８３２）で実施した。２０ｍＭリン酸緩衝液から作製された液体媒体の温度を、サーモスタット制御された浴（米国ペンシルベニア州ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３７．５℃で調節した。

Ｐｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（商標）撹拌装置（米国ノースカロライナ州ローリーのＰｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用して、ＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂ、ＢＯＤ−Ｍｅｄｉａｔｏｒ−ＭＳ４０ｃａｒｂ又はＢＯＤ−ＧＣ酵素センサーが上記緩衝液中で移動するのを維持した。測定を、水浴を用いた電気化学的セルで実施した。

それらの電位を、市販のＡｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＫＣｌ）参照電極（ＢＡＳ）と共に、対電極として白金電極（ＢＡＳ）を使用して測定した。

ＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂ、ＢＯＤ−Ｍｅｄｉａｔｏｒ−ＭＳ４０ｃａｒｂ及びＢＯＤ−ＧＣ酵素センサーを用いて得られた結果を添付図６に与えている。ここで、この図において、電流密度（μＡ）は、電位（ボルト）に応じたものである。

この図において、連続の太線としての曲線は、本発明のＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂセンサーで得られた、Ｏ₂からＨ₂Ｏへの電気的還元を示し、波線としての曲線は、本発明の一部ではないＢＯＤ−Ｍｅｄｉａｔｏｒ−ＭＳ４０ｃａｒｂセンサーで得られたＯ₂からＨ₂Ｏへの電気的還元を示し、そして、連続の細線としての曲線は、本発明の一部ではないＢＯＤ−ＧＣバイオセンサーを使用してなされた記録に相当する。本発明のＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂセンサー、すなわち酵素がマクロ孔の壁の半黒鉛化グラファイトと直接接触した状態にあるものは、本発明の一部ではない、酵素が酸化還元メディエーターによりマクロ孔の壁に結合したＢＯＤ−Ｍｅｄｉａｔｏｒ−ＭＳ４０ｃａｒｂセンサーよりも良好な結果を得ることを可能にすることが注目される。

ＢＯＤ−ＧＣセンサーを使用する場合には、電流はごくわずかであることが注目される。

最後に、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中における１０００ｒｐｍの回転速度でのＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂバイオセンサーの０Ｖでの触媒電流密度の変化を試験し、添付図７に与えている。この図において、電流密度（ｍＡ／ｃｍ²）は、時間（時間）に応じたものである。ＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂバイオセンサーの触媒電流密度は、時間に応じて安定であると認められる。比較として、図７中における挿入図は、本発明の一部ではないＢＯＤ−ＧＣバイオセンサー（細線）と比較した、２５℃（極太線）及び３７℃（太線）でのＢＯＤ−ＭＳ４０ｃａｒｂバイオセンサーの残留電流の変化を示している。

Claims (15)

1. 多孔質電気化学的電極であって、該電極が、１μｍ〜１００μｍの平均径ｄ_Aを有するマクロ孔と、０．５〜２ｎｍの平均径ｄ_Iを有するミクロ孔とを備え、該マクロ孔と該ミクロ孔とが相互に連結した、メソ孔のない階層的多孔質ネットワークを有する半黒鉛化炭素モノリスの形で与えられるセル固体材料からなること、及び、該マクロ孔が、該マクロ孔の表面を構成する半黒鉛化炭素と直接接触した少なくとも１つの電気活性部分を含むことを特徴とする電極。
2. 前記半黒鉛化炭素モノリスのマクロ孔の壁が０．５〜４０μｍの厚みを有することを特徴とする、請求項１に記載の電極。
3. 前記マクロ孔が４〜７０μｍの直径を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の電極。
4. 前記ミクロ孔が０．７〜１．５ｎｍの直径を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の電極。
5. 前記半黒鉛化炭素モノリスの比表面積が４００〜９００ｍ²／ｇであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の電極。
6. 前記電気活性部分が、酸化還元中心を有する酵素、核酸、抗体、抗原及び導電性重合体から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の電極。
7. 前記電気活性部分が酸化還元中心を有する酵素であり、酸化還元酵素から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の電極。
8. 前記炭素モノリスのマクロ孔が酸化還元補酵素及び金属陽イオンから選択される少なくとも１種の補因子を含有することを特徴とする、請求項７に記載の電極。
9. 固定化された電気活性部分の量が、電気化学的電極の総重量に対して０．０１〜７重量％の範囲であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の電極。
10. 請求項１〜９のいずれかに記載の電気化学的電極の製造方法であって、１μｍ〜１００μｍの平均径ｄ_Aを有するマクロ孔と、０．５〜２ｎｍの平均径ｄ_Iを有するミクロ孔とを備え、該マクロ孔と該ミクロ孔とが相互に連結した、メソ孔のない階層的多孔質ネットワークを有する半黒鉛化炭素モノリスに、少なくとも１種の電気活性部分の水溶液又は水分散液を含浸させる工程を含み、ここで、該方法は、該マクロ孔の表面を酸化還元メディエーターで官能化する工程を含まないものとすることを特徴とする方法。
11. 前記含浸工程を真空下で実施することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記電気活性部分が酸化還元酵素であり、しかも補因子が、該酵素の一体部分ではない酸化還元補酵素又は金属陽イオンであり、それによって、前記半黒鉛化炭素モノリスに含浸させるために使用される水溶液又は水分散液が少なくとも１種の酸化還元補酵素又は金属陽イオンも含むことを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 請求項１〜９のいずれかに記載の電気化学的電極の、液体媒体中の検体を検出するためのバイオセンサーとしての使用又はバイオ燃料電池を製造するための使用。
14. 請求項１〜９のいずれかに記載の少なくとも１個の電気化学的電極を備えることを特徴とするバイオセンサー。
15. 電気回路を介して互いに連結した正極及び負極を備えるバイオ燃料電池であって、該２個の電極のうち少なくとも１個が請求項１〜９のいずれかに記載の電気化学的電極であることを特徴とするバイオ燃料電池。

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