JP2013151457A - マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】生理的な細胞間伝達作用を介した作用機序によってマトリックスメタロプロテアーゼ−１を阻害することができる、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤を提供する。
【解決手段】ピセアタンノールをマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤の有効成分とする。ピセアタンノールは化学合成品であってもよく、天然物由来のものであってもよい。例えばパッションフルーツの種子にはピセアタンノールが豊富に含まれているので、その抽出物を利用してもよい。このマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤は、紫外線を受ける環境下において、真皮中のコラーゲンの分解を予防又は回復するのに、好ましく適用される。
【選択図】なし

Description

本発明は、ピセアタンノールを有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤に関する。

マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、その一次構造中に互いに相応する配列相同性を有し、活性部位に亜鉛が配位する、一群の金属プロテアーゼであり、ヒトでは２０種類以上が存在する。主に細胞間マトリックスを構成するタンパク質を分解するが、それぞれの基質特異性が異なり、例えば、ＭＭＰ−１では皮膚真皮のマトリックス構成成分であるタイプＩ，ＩＩＩコラーゲン、ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−９では皮膚真皮のマトリックス構成成分であるエラスチンや基底膜成分であるタイプＩＶコラーゲン、ＭＭＰ−３，ＭＭＰ−１０ではプロテオグリカンやタイプＩＶコラーゲン、などとなっている。また、生産細胞から分泌される分泌型と、細胞膜に結合して機能する膜結合型ＭＭＰに分類される。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞間マトリックスの分解にとどまらず、骨形成や創傷治癒、サイトカイン等生理活性ペプチドの活性化など様々な生理現象に関与している。また、炎症、関節リウマチ、癌転移など種々の病態過程に関与している。

このうちマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚への紫外線の照射や加齢によって真皮線維芽細胞からの産生が増加することから、コラーゲン分解が過多となって、肌のはりの減退やしわの増加につながるものと考えられる。一方、関節リウマチの関節組織・軟骨の破壊や、癌の浸潤・転移、結核菌による肺組織の破壊などにも関与していることが報告されており（下記非特許文献１、２）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の脱抑制により症状の悪化につながるものと考えられる。

従って、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の作用を抑制する阻害剤によって、コラーゲン分解のバランスが過多とならないように身体の健常な状態を維持することによって、これらの疾患や症状を予防・改善する効果が期待できる。

マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤については、種々の有効成分のものが報告されており、例えば下記特許文献１には、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＭＭＰ−１阻害剤の発明が開示されている。また、下記特許文献２には、カテキン類、プロシアニジン類、マンゴスチン類等が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の活性を阻害することが記載されている。また、下記特許文献３には、ウーロンチャからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤の発明が開示されている。また、下記特許文献４には、紅茶抽出物中に含まれるエピテアフラガリン、エピテアフラガリン ３−Ｏ−ガレート、テアフラビン ３−Ｏ−ガレート等の茶由来重合カテキンを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ１活性阻害組成物の発明が開示され、それを歯周病改善や予防に用いることが記載されている。

Boire A、外５名、「PAR1 is a matrix metalloprotease-1 receptor that promotes invasion and tumorigenesis of breast cancer cells.」、Cell、Elsevier Inc、2005年2月11日、第120巻、第3号、p.303-13. Elkington P、外１３名、「MMP-1 drives immunopathology in human tuberculosis and transgenic mice.」、J Clin Invest、American Society for Clinical Investigation、2011年5月2日、第121巻、第5号、p.1827-33.

特許第４０１８６１１号公報 特開２００３−２５２７４５号公報 特開２００７−３０２６０４号公報 特開２００９−２１９４８４号公報

しかしながら、従来のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤は、その有効成分が酵素を直接阻害するものが多く、この場合、酵素が存在する箇所に相応量が適用されなければならず効率が悪かった。また、投与量を多くすると副作用の問題もあった。そこで本発明者らは、生理的な細胞間伝達作用を介した作用機序によってマトリックスメタロプロテアーゼ−１を阻害しようとする発想に至った。

即ち、本発明の目的は、生理的な細胞間伝達作用を介した作用機序によってマトリックスメタロプロテアーゼ−１を阻害することができる、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、ピセアタンノールが、真皮繊維芽細胞に生理的なシグナルを与える表皮細胞に作用して、真皮繊維芽細胞が生産するマトリックスメタロプロテアーゼ−１を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の構成を有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤を提供する。
［１］ピセアタンノールを有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。
［２］パッションフルーツ種子から得られたピセアタンノール含有組成物からなる前記［１］記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。
［３］皮膚外用剤の形態とされている前記［１］又は［２］記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。
［４］紫外線を受ける環境下において、真皮中のコラーゲンの分解を予防又は回復するために用いられる前記［３］記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤によれば、その有効成分であるピセアタンノールが、真皮繊維芽細胞に生理的なシグナルを与える表皮細胞に作用して、真皮繊維芽細胞が生産するマトリックスメタロプロテアーゼ−１を阻害するので、酵素に直接作用するのとは異なる作用機序で、効率的にマトリックスメタロプロテアーゼ−１の作用を抑制することができる。また、紫外線によるマトリックスメタロプロテアーゼ−１の誘導を抑制する効果に優れているので、紫外線を受ける環境下において、真皮中のコラーゲンの分解を予防又は回復するのに有用である。

試験例１においてＭＭＰ−１活性を測定した結果を示す図表である。

本発明において用いられるピセアタンノール（Piceatannol）は下記化学式で表される。

上記化学式で表されるピセアタンノールは、２個のフェニル基がトランス型のアルケン基で連結した構造のピセアタンノールであるが、上記化学式において、２個のフェニル基がシス型のアルケン基で連結した構造のピセアタンノールを用いることもできる。

ピセアタンノールは化学合成品であってもよく、天然物由来のものであってもよい。例えば、パッションフルーツの種子にはピセアタンノールが豊富に含まれているので、その抽出物を利用することもできる。

パッションフルーツは、パッシフローラ属トケイソウ科の植物であり、別名：クダモノトケイソウ(果物時計草)とよばれ、その実は甘酸っぱく果物として実をそのまま食したり、その果汁をジュースにして飲んだり、ゼリー、ケーキ等の飲食品に配合して、風味付けに用いられたりされている。パッションフルーツの種子は硬く、ジュースなどにする場合には果実から取り除かれ、果実を種ごと飲食した場合であってもその外皮は硬く消化を受けにくいのでそのまま排泄されてしまう。このような背景のなか、パッションフルーツの種子を有効利用するという面でも、ピセアタンノールの起源としては、パッションフルーツの種子であることが好ましい。パッションフルーツの種子抽出物は、パッションフルーツの食経験からも裏付けられるように、安全性には問題がないものである。

パッションフルーツの種子抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば、種子を細断、破砕、又は磨砕等し、種々の溶媒を用いて抽出する方法があげられる。抽出温度は適宜設定することができる。また、上記種子は、抽出効率をよくするため、適宜、酸又はアルカリ分解、酵素分解等の化学的処理を施してから抽出することもできる。

抽出溶媒としては、水、エタノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。これらの中で、含水１，３−ブチレングリコール又は含水エタノールは、後述するポリフェノール関連化合物を含む有効成分を効率よく抽出することができるので好ましい。

パッションフルーツの種子抽出物は、上記の方法で得られた抽出液を、そのまま又は濃縮して液体のまま用いてもよく、更に上記抽出液を凍結乾燥又は噴霧乾燥により粉末化して用いることもできる。抽出物中に含まれる不溶物は、適宜、濾過などで除くことができる。不溶物はさらに粉砕し、微細粒子状にしてもよい。

上記のようにして得られる一次抽出物は、抽出の条件によっても異なるが、通常０．５μｇ〜２０ｍｇ／１００ｍｇ、より典型的には３μｇ〜１０ｍｇ／１００ｍｇの純度でピセアタンノールを含有する。よってその一次抽出物をそのまま用いることもできるが、これをイオン交換、サイズ排除カラムクロマト法、ＨＰＬＣ法、ゲルろ過、膜分離等により、分画、精製して用いることが好ましい。

具体的には、例えば、パッションフルーツの種子抽出物の一次抽出物を下記条件でＨＰＬＣにかけたときの保持時間が１９〜２２分に溶出される化合物であり、質量分析装置によるマススペクトル測定によってネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する化合物を基準にして、ＨＰＬＣ等により分画、分取して、これを用いることができる。

［ＨＰＬＣ条件］
・ カラム：Mightysil RP-18 GP250-10 径10mm、長さ250mm（関東化学株式会社製）
・ カラム温度：40℃
・ 溶出条件：流速3ml/min、0％メタノール→30％メタノール（10min）
・ ＵＶ検出：280nm

なお、本発明において「パッションフルーツ種子から得られたピセアタンノール含有組成物」とは、上記パッションフルーツ種子の一次抽出物のみならず、それから更にピセアタンノールを指標にして抽出物を分画、精製等して得られた組成物を含む意味である。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤は、上記に説明したピセアタンノールを、マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害のための有効成分として含有するものである。その有効成分以外の他の成分を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ゼリー状剤等の形態にして、これを経口剤として利用することができる。また、軟膏剤、クリーム剤、ジェル、パック、化粧水、化粧料等の形態にして、これを皮膚外用剤として利用することができる。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤において、上記有効成分の含有量は、各製剤形態とした場合に、その製品が使用される量と有効投与量との関係を勘案して適宜定めればよく、特に制限されるものではないが、通常、固形状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.000001〜99質量％含有させることが好ましく、0.00001〜10質量％含有させることがより好ましい。そして、液状又はゼリー状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.000001〜30質量％含有させることが好ましく、0.00001〜10質量％含有させることがより好ましい。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤の投与形態としては、体の中から作用させるため経口的に摂取してもよく、あるいは皮膚に塗布して用いてもよい。また吸引して呼吸器系に適用してもよく、その投与形態が特に制限されるものではない。特に、後述する実施例で示すように、ピセアタンノールは、皮膚の表皮細胞に作用して、繊維芽細胞に生理的なシグナルを送り、繊維芽細胞が生産するマトリックスメタロプロテアーゼ−１を阻害するので、皮膚外用剤の形態で用いることが好ましい。例えば、肌のはりの衰えを予防したい部位やしわを予防したい部位、又はこれらを改善したい部位などに塗布したりして用いることができる。また、紫外線によるマトリックスメタロプロテアーゼ−１の誘導を抑制する効果に優れているので、紫外線を受ける環境下において、真皮中のコラーゲンの分解を予防又は回復するために用いることが好ましい。例えば、日光による肌の損傷を防ぐために予め皮膚に塗布したり、日光を浴びた後の肌の損傷の回復を促進するために皮膚に塗布したりして用いることができる。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤の投与量としては、特に制限はないが、典型的に皮膚に塗布する場合には、ピセアタンノール換算で単位面積あたり一回およそ0.000013〜10μｇ／ｃｍ^２である。

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜試験例１＞
［正常ヒト表皮細胞の培養上清の調製］
正常ヒト表皮細胞(倉敷紡績株式会社)を、6ウェルプレート（6 well plate）に5x10^４ cell/cm^２の密度で播種し、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地(「HuMedia KG2」倉敷紡績株式会社)（以下、「ＫＧ培地」という。）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で培養した。以下同条件にて培養を行った。播種２４時間後に、培地を、0，0.06、0.13、0.25、0.5、1μｇ／ｍＬの各濃度となるようにピセアタンノール（関東化学株式会社）を添加したＫＧ培地に交換し、さらに２４時間培養後、培地を、Ca²⁺、Mg²⁺未含有ハンクス緩衝液(HBSS(-))に交換して、紫外線照射器（フィリップス社製TL20W/12RS）にてＵＶＢ（中波紫外線）を照射した。また、ＵＶを照射しないＵＶ非照射の試料も同様に調製した。培地を、ピセアタンノール未含有のＫＧ培地に再交換し、４８時間培養した後に培養上清を回収した。以下、このように調製した正常ヒト表皮細胞の培養上清を、「ＫＣ培養上清」とする。

［正常ヒト線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生］
正常ヒト線維芽細胞(倉敷紡績株式会社)を、96穴マイクロプレートに6.25x10⁴cells/cm^２の密度で播種し、5%仔牛血清含有ダルベッコ変法MEM(5% FBS-DMEM)を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で培養し、播種２４時間後に、培地を、上記ＫＣ培養上清と交換した。さらに２４時間培養し、正常ヒト線維芽細胞が分泌したＭＭＰ−１を含有する培養上清を回収した。以下、このように調製した正常ヒト線維芽細胞の培養上清を、「ＦＢ培養上清」とする。

［ＭＭＰ−１活性の測定］
ＭＭＰ−１は不活性型酵素として培養上清中に分泌されるため、上記のように調製したＦＢ培養上清は、トリプシン処理によりあらかじめ活性化し、これをＭＭＰ−１酵素液とした。
ＭＭＰ−１活性は、ＭＭＰ−１の基質であるＩ型コラーゲンの分解により測定した。具体的には、上記ＭＭＰ−１酵素液100μLに、基質(フルオロセインイソチオシアネート(FITC)標識I型コラーゲン)を濃度0.25mg/mLに調製してそれを50μL加え、３７℃にて２時間酵素反応した。その後、エタノール沈殿にて分解されていない蛋白質を除去し、上清の蛍光強度(Ex/Em=495/520nm)を測定することにより、分解されたコラーゲンの蛍光強度(Ex/Em=495/520nm)を測定した。酵素活性は１分間に１μｇのコラーゲンを分解する酵素活性を1unit（１ユニット）として定義し、20unit/mL Collagenase type I でコラーゲンを完全分解したときの蛍光強度の測定値を基準にして、ユニット値（unit）を算出した。同時に細胞のタンパク量を、タンパク量測定試薬（「BCA protein Assay Reagent」PIERCE）を用いて定量し、上記酵素活性をタンパク量で除することにより、単位タンパク量あたりのＭＭＰ−１活性（unit/mg protein）を算出した。各々の結果は、Student t検定による有意差検定を行い、試料を添加しないコントロールとの差異を評価した。

［結果］
その結果、図１に示すように、ＵＶ照射時及びＵＶ非照射時、共に、ピセアタンノールの添加によって、ＭＭＰ−１活性が抑制された。特に、ＵＶ照射時において、その抑制の効果が顕著であった。本試験では、ピセアタンノールを線維芽細胞に直接作用させていないことから、ピセアタンノールに刺激された表皮細胞から何らかの成分が分泌され、またはピセアタンノールに刺激された表皮細胞の何らかの成分の分泌が抑制されたこと等により、線維芽細胞が影響を受け、ＭＭＰ−１の産生が抑制されたものと考えられた。

以上から、ピセアタンノールの外用によって表皮層を刺激することで、安全性も確保しつつ、真皮層のコラーゲン分解を抑制して、肌のはりの減退やしわの増加に対する抑制効果を発揮できることが示唆された。

＜調製例１＞
［パッションフルーツ種子抽出物の調製］
パッションフルーツ種子をフリーズドライして粉砕し、８０％含水エタノールで抽出した。遠心後その上清をとりエバポレートで濃縮後、フリーズドライして粉末にした。この粉末を水に溶かして抽出物とした。なお、この抽出物の固形分中のピセアタンノール濃度は９．６質量％であった。

従って、上記マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤の有効成分としては、パッションフルーツ種子由来のものが有用であることが明らかとなった。

Claims (4)

1. ピセアタンノールを有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。
2. パッションフルーツ種子から得られたピセアタンノール含有組成物からなる請求項１記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。
3. 皮膚外用剤の形態とされている請求項１又は２記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。
4. 紫外線を受ける環境下において、真皮中のコラーゲンの分解を予防又は回復するために用いられる請求項３記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤。