JP2013145138A - Ｓｐｆｓ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）を用いたトロポニンの免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中のトロポニン（血液検体中のｃＴｎなど）を高感度で定量ないし検出することのできる手段を提供する。
【解決手段】試料中のトロポニンを対象とする免疫学的測定法であって、ＳＰＦＳ用センサーチップの測定領域に固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体を形成する工程、および形成されたサンドイッチ型免疫複合体に含まれる蛍光体から発せられる蛍光強度をＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）により測定する工程を含むことを特徴とする免疫学的測定法。
【選択図】なし

Description

本発明は、医療、バイオテクノロジー等の分野で利用されるＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）および心筋梗塞等のバイオマーカーとして知られているトロポニンに関する。

急性心筋梗塞は冠動脈の閉塞により心筋が壊死に陥る疾患であるが、この疾患の検査手法としては、胸痛、心電図及び心筋梗塞マーカーを利用することが行われてきている。この心筋梗塞マーカーも大別すると、生化学的指標と免疫学的指標に二分される。生化学的指標には、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やその心筋特異性アイソザイム（ＣＫＭＢ）が用いられているが、測定が簡便ではあるものの、ＣＫは心筋梗塞特異性が低く、ＣＫＭＢもトロポニンＴに比し特異性が低いことから、有用性に限界がある。一方、免疫学的指標には、ミオグロビン、ミオシン軽鎖及びトロポニン等が実用化されている。

トロポニンは筋原線維の細いフィラメントに存在するタンパク質複合体で、トロポニンＴ（分子量３７０００）、トロポニンＩ（分子量２２５００）、トロポニンＣ（分子量１８０００）の３つのザユニットからなる。トロポニンは、心筋疾患により引き起こされる心筋細胞の破壊により心筋細胞から血液中に放出され、血液中ではトロポニンＴ、トロポニンＩおよびトロポニンＣの３つのサブユニットが単独、又は２つ若しくは３つの異なるサブユニットからなる複合体を形成して存在する。

トロポニンのサブユニットのうちトロポニンＩは、正常なヒトの血液中にはほとんど存在せず、心筋疾患に罹患したヒトの血液中に特異的に存在するので、早期に心筋疾患を検出することができるバイオマーカーとして知られていた。たとえば、非特許文献１には、急性心筋梗塞の早期診断における高感度トロポニンＩの有用性が記載されている。また、非特許文献２には、慢性心不全患者における高感度ｃＴｎＩ測定の有用性も記載されている。

また、トロポニンＴも極めて心筋特異性が高く、心筋梗塞発症後早期から長期間にわたって異常値を示すので、従来のマーカーでは検出できなかった微小心筋障害を診断することが可能となった。すなわち、ｃＴｎＴは発症早期（発症後３〜４時間以降）から７〜１０日までの長い期間にわたる心筋梗塞の診断に有用である。欧州心臓病学会と米国心臓病学会の合同作業チームは、心電図変化と臨床症状に基づく急性心筋梗塞の診断基準を、２０００年にｃＴｎＴまたはｃＴｎＩの血中濃度に心電図所見と臨床症状を加味して診断する新しい基準に変更している。２００７年、Circulation（2007; 115: e356-e375）に国立臨床生化学検査アカデミーから，急性冠症候群（ＡＣＳ）と心不全領域におけるバイオマーカーのガイドラインが発表され，ＡＣＳの診断において，トロポニン測定を診断補助に用いることはｃｌａｓｓ Ｉ，エビデンスレベルＡと記載された。さらに、非特許文献３には、老齢者の心血管イベントの発現比率とｃＴｎＴ値との相関が大規模臨床（ｎ＝４２２１）で検証されている。ｃＴｎＴ値は、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ ２０１０で測定され、下限値は３ｐｇ／ｍＬ、カットオフ値は１３．５ｐｇ／ｍＬとされた。その結果、カットオフ値以下であってもｃＴｎＴ値によって心血管イベントの発現比率に差が認められ、低濃度域においてｃＴｎＴ値を測定することの意義が示唆されている。

上記のような用途を有することから、血液検体中のトロポニンの濃度を測定するための様々な方法が提案され、比較検討されているが、方法によって測定値の差が大きく、未だ標準的な測定方法は確立されていない。たとえば、非特許文献４では、捕捉用抗体および標識用抗体として、ｃＴｎＩおよびｃＴｎＴの様々なエピトープを認識する抗体を用いて、検出限界値等の対比を行っている。

高感度でトロポニンを検出または定量するための手段として、以下のような発明も提案されている。
特許文献１には、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に固定される、心筋梗塞マーカーに対する抗体を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲ）用測定チップや、このような測定用チップを用いて心筋梗塞マーカーを測定する方法が記載されている。心筋梗塞マーカーとしては、トロポニンＴ、ミオグロビン等が挙げられている。

特許文献２には、生体試料に由来するトロポニンＩを、トロポニンＣの存在下で、該トロポニンＩの４１〜４９番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識し且つ標識物質で標識された第１抗体（たとえば１９Ｃ７抗体）と接触させて、前記トロポニンＩと、前記トロポニンＣと、前記第１抗体との複合体を形成させ、前記複合体を形成した第１抗体の標識物質を測定することを含む、トロポニンＩを測定する方法などが記載されている。

一方、各種の生体関連物質を検出または定量するための測定システムの一つとしてＳＰＦＳが知られている（たとえば特許文献３参照）。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。

特開平１１−０２３５７５号公報 特開２０１０−１０７３６３号公報 特開２０１０−１４５２７２号公報

N Engl J Med 2009; 361: 858-867 Therapeutic Research 2010; 31(7): 968-971 JAMA 2010; 304(22): 2494-2502 Pathology 2010; 42(5): 402-408

心筋梗塞等のバイオマーカーとなる血液検体中のトロポニンは極力低濃度で定量ないし検出できることが望ましい。本発明が解決しようとする課題は、試料中のトロポニンを高感度で定量ないし検出することのできる手段を提供することにある。

本発明者は、ＳＰＦＳにおいて、固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体を形成し、当該免疫複合体に含まれる蛍光体から発せられる蛍光強度を測定することにより、試料中にトロポニンが極微量しか含まれない場合であっても定量することができることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］試料中のトロポニンを対象とする免疫学的測定法であって、ＳＰＦＳ用センサーチップの測定領域に固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体を形成する工程、および形成されたサンドイッチ型免疫複合体に含まれる蛍光体から発せられる蛍光強度をＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）により測定する工程を含むことを特徴とする免疫学的測定法。

［２］前記サンドイッチ型免疫複合体を形成する工程が、前記固相化された抗トロポニン抗体と試料中のトロポニンとを反応させて免疫複合体を形成する工程、および形成された免疫複合体と前記蛍光標識化された抗トロポニン抗体とを反応させて前記サンドイッチ型免疫複合体を形成する工程を含む、［１］に記載の免疫学的測定法。

［３］前記固相化された抗トロポニン抗体が１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体であり、前記蛍光標識化された抗トロポニン抗体が、前記固相化された抗トロポニン抗体としての１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体とは異なる、１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体である、［１］または［２］に記載の免疫学的測定法。

［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の免疫学的測定法に用いられる、固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体が測定領域に形成された、ＳＰＦＳ用センサーチップ。

本発明のＳＰＦＳを利用した免疫学的測定法により、従来のＥＬＩＳＡのようなサンドイッチ型免疫複合体を形成する方法と比較して、トロポニンの定量性能ないし検出性能を著しく高めることができる。したがって、本発明により心筋トロポニン（ｃＴｎ）が血液検体中に極微量しか含まれない場合であっても定量することが可能となり、ｃＴｎの心筋梗塞等のバイオマーカーとしての有用性を向上させ、診断に役立つ信頼性の高いデータを得ることが可能となる。

図１は、公知の抗トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）モノクローナル抗体およびそれらのエピトープを示す。 図２は、実施例１−１，１−２，１−３および１−４におけるトロポニンＩの定量限界の結果のプロットである。

本明細書では、トロポニンのうち、心筋に由来し血液検体中に存在するものを特に意図する場合に「心筋トロポニン」（ｃＴｎ）と称することがある。また心筋トロポニン（ｃＴｎ）のサブユニットそれぞれを「心筋トロポニンＴ」（ｃＴｎＴ）、「心筋トロポニンＩ」（ｃＴｎＩ）、「心筋トロポニンＣ」（ｃＴｎＣ）と称することがある。本発明において、「トロポニン」は、すべてのサブユニットによって構成される複合体全体を指すほか、各サブユニットまたはその部分的な複合体を包含する総称として用いることがある。たとえば、「抗トロポニン抗体」は、「トロポニン」のいずれかの部位をエピトープとして認識する抗体であり、「抗トロポニンＩ抗体」、「抗トロポニンＴ抗体」等を包含する。

本明細書において、数値範囲を示す表現「Ｘ〜Ｙ」はＸ以上Ｙ以下を意味する。
以下、本発明についてＳＰＦＳ単独に基づく態様に則しながら説明するが、本発明は、たとえばＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ測定系など、ＳＰＦＳと他の測定系ないしシステムとを組み合わせる態様においても適用することができる。また、本発明のＳＰＦＳに基づく免疫学的測定法に、公知または慣用の手段を適宜組み合わせることができることももちろんである。

− ＳＰＦＳ用測定部材 −
ＳＰＦＳ用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してＳＰＦＳによる蛍光測定を行うための場（測定領域）が形成されているセンサーチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液（アナライトを含む試料、標識リガンド溶液、その他の反応試薬等）を測定領域上に保持することのできる、流路またはウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。

すなわち、本発明は一つの側面において、本発明の免疫学的測定法に用いられる、固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体が測定領域に形成された、ＳＰＦＳ用センサーチップを提供する。

センサーチップは、基本的に、金属薄膜の裏面に励起光を導入するための透明支持体と、当該透明支持体上に形成された、表面プラズモン共鳴を発生させるための金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された、アナライトをセンサー表面に捕捉するための反応層とを含み、さらに必要に応じて、金属薄膜と反応層の間に形成された、蛍光体が金属薄膜に近接しすぎることにより起こる蛍光の金属消光を防止するためのスペーサ層を含んでいてもよい。

なお、本明細書において、便宜上、センサーチップの金属薄膜、反応層等が形成される側を「上」または「表」、その反対側を「下」または「裏」と称することがある。
反応層が形成されている部位が測定領域に相当する。流路またはウェルの底面全域に反応層を形成して測定領域としてもよいし、底面の一部のみに（必要であれば所望のパターニングで）反応層を形成して測定領域としてもよい。測定領域の面積は、一般的にレーザー光として照射される励起光の照射面積を考慮しながら調整することができる。たとえば、励起光のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、上記アッセイエリアは通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有するものとなるよう設計される。

ＳＰＦＳのシステムを、密閉流路を通じて各種の溶液を送液する「流路型」とする場合、センサーチップの上に、流路を形成するための穴のあいた「フローセル」を積載し、必要に応じてさらにその上に、上記フローセルの穴に対応する位置に送液導入口および送液排出口のあいた「天板」を積載し、これらを密着させて固定するようにして、測定部材を構築する。上記フローセルの穴に対応する位置のセンサーチップ表面が、流路の底面をなし、そこに測定領域が形成される。流路型の場合、たとえばポンプやチューブを含む送液手段を用いて、各種の液体を送液導入口から流路内に送液して送液排出口から排出することができ、必要に応じて往復型、循環型の送液を行うこともできる。送液速度や送液（循環）時間などの条件は、試料の量や試料中のアナライトの濃度、流路ないしウェルのサイズや反応層の態様（固相化リガンドの密度等）、ポンプの性能等を考慮しながら、適宜調整することができる。

一方、ＳＰＦＳのシステムを、上記流路よりも広い空間に各種の溶液を貯留させる「ウェル型」とする場合、センサーチップの上に、ウェルを形成するための貫通孔を有する「ウェル部材」を積載して固定することにより測定部材を構築する。ウェル型の場合、たとえばピペット状の部材を用いて、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。

上記フローセルは、たとえばシート状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製とすることができる。上記天板は、測定領域から発せられる蛍光を測定できるよう透明性を有する材料で作製され、たとえばプレート状のポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製とすることができる。あるいは、フローセルおよび天板を、成形加工やフォトリソグラフィにより所望の形状にしたプラスチック製とすることも可能である。

センサーチップ上にフローセルまたはウェル部材を密着させて固定する手段は特に限定されるものではなく、一般的には物理的に上下から圧力をかけるようにすればよく、必要であれば、透明支持体と同じ光屈折率を有する接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いてもよい。

（透明支持体）
透明支持体は、プリズムまたは平面基板の形態をとることができる。プリズム形状の透明支持体は、センサーチップ作製後にそのままＳＰＦＳ測定装置に装着して用いるようにし、平面基板状の透明支持体は、センサーチップ作製後に、ＳＰＦＳ測定装置が備えるプリズムの水平面上に装着して用いるようにする。透明支持体のサイズは特に限定されるものではなく、ＳＰＦＳ測定装置にあわせて調整することができる。透明支持体が平面基板の形状をとる場合、その厚さは通常０．０１〜１０ｍｍの範囲である。

透明支持体の材料としては、ガラスや、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチックのように、透明な誘電体が挙げられ、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎ_d〕が１．４０〜２．２０の範囲にある物質が好ましい。透明支持体の表面は、金属薄膜を形成する前に、酸またはプラズマによる洗浄処理がなされていることが好ましい。

（金属薄膜）
金属薄膜は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強効果が大きい、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなる（つまり、上記いずれかの金属単独からなるものであっても、複数の金属の合金からなるものであってもよい。）ことが好ましく、特に金からなることが好ましい。

誘電体部材としてガラス製のもの用いる場合には、ガラスと金属薄膜とをより強固に接着するために、たとえばクロム、ニッケルクロム合金またはチタンからなる接着用薄膜を介在させ、ガラス製の誘電体部材／接着用薄膜／金属薄膜の順に積層することが好ましい。

金属薄膜および接着用薄膜を形成する方法としては、たとえば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられるが、薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法が好ましい。

金属薄膜および接着用薄膜の厚さは、金属薄膜の材料に応じて、表面プラズモンが発生し易いように調整することが適切である。一般的には、金属薄膜の厚さは５〜５００ｎｍが好ましく、接着用薄膜の厚さは１〜２０ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金属薄膜の厚さは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましい。また、接着用薄膜の厚さは、たとえばクロムであれば１〜３ｎｍがより好ましい。

（反応層）
反応層は、一般的に、リガンドと、当該リガンドを金属薄膜または必要に応じて設けられるスペーサ層に固定化するための分子（リンカー）とにより構成される。

上記リンカーは、リガンドをセンサー表面に固定化し、アナライトを捕捉してＳＰＦＳによる分析を適切に行うことができるものであれば、その態様は特に限定されるものではなく、１種類の分子からなるものでも、２種類以上の分子からなるもの（複合体）であってもよい。

たとえば、リンカーとしてＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）を用いる態様が挙げられ、この態様では、金属薄膜等の表面に形成されたＳＡＭ−リガンド結合体が反応層をなす。

また、リンカーとしてＳＡＭおよび高分子化合物を併用する態様も挙げられ、この態様では、金属薄膜等の表面に形成されたＳＡＭ−高分子化合物−リガンド結合体が反応層をなす。なお、このような高分子化合物を介してリガンドをセンサー表面に固定化する、換言すれば高分子化合物にリガンドを担持させる態様において、高分子化合物からなる層を「固相化層」と称する場合もある。このような態様は、固相化層中にリガンドを三次元的に配置することで、ＳＡＭの上層にリガンドを二次元的（平面的）に配置する態様に比べ、センサー表面に高密度でリガンドを固定化することができることから、より好ましい態様といえる。

・ＳＡＭ
ＳＡＭは、分子の一方の末端に金属薄膜（または必要に応じて設けられるスペーサ層）と結合可能な官能基（シラノール基、チオール基等）を、もう一方の末端に固定化する分子と結合可能な反応性官能基（アミノ基、カルボキシル基、グリシジル基等）を有する化合物により形成することができる。このような化合物はＳＡＭ形成試薬として容易に入手することができる。たとえば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（１０−カルボキシ−１−デカンチオールなど）は、光学的な影響が少ない、つまり透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いＳＡＭを形成することができるため好適である。

・高分子化合物
必要に応じて用いられる固相化層は、反応層を構成する他の分子（典型的にはＳＡＭ）または反応層の下に形成された層（金属薄膜、スペーサ層等）と結合させるための官能基と、リガンドと結合させるための官能基とを有する高分子化合物とにより構成される。

また、ＳＰＦＳで用いられる各種の溶液には通常水性溶媒が用いられることから、固相化層を構成する高分子化合物は、それとの親和性が高い、ヒドロキシル基やカルボキシル基などの親水性基に富んだ（これらの親水性基が上記所定の官能基として機能してもよい）親水性高分子であることが好ましい。上記親水性基は水素結合により水分子を包接するため、非特異的吸着が起こりにくいという利点も有する。一方、そのような親水性基が少ない（疎水性基が多い）、全体的に疎水的な高分子は、センサー表面に局在しやすいため反応効率が低下したり、疎水性相互作用により非特異的吸着が起こりやすくなったりするおそれがある。

固相化層を構成する高分子化合物としては、たとえば、グルコースもしくはその誘導体（たとえばカルボキシメチル化グルコース）、ビニルエステル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、オレフィン、スチレン、クロトン酸エステル、イタコン酸ジエステル、マレイン酸ジエステル、フマル酸ジエステル、アリル化合物、ビニルエーテル、ビニルケトンなどの単量体から誘導される単位を含む、単独重合体または共重合体（ランダム、ブロック、グラフト）を用いることができる。

たとえば、デキストランやセルロースに（これらのグルコース単位中の水酸基を介して）カルボキシメチル基が導入されたカルボキシメチルデキストランやカルボキシメチルセルロース、あるいは元来グルコース単位中にカルボキシル基を有しているアルギン酸などの多糖類は、上記所定の官能基を有するとともに、分岐構造が少なく冷水への溶解度が高いため、固相化層を構成する高分子化合物として好適である。また、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸などの高分子化合物も、固相化層を構成するために用いることが可能である。

固相化層の湿潤状態における厚さは、リガンドに捕捉されたアナライトを標識する蛍光体が増強されたエバネッセント波で効率的に励起され、かつ金属薄膜による消光が起きないようにすることなどを考慮すると、３〜８０ｎｍ程度が好ましい。したがって、高分子化合物としてはそのような厚さを生み出せる分子量を有するものが好ましい。たとえばカルボキシメチルデキストランであれば、分子量が約１０〜１００万の範囲にあるものが好ましい。

高分子化合物に結合させる（すなわち固相化層に担持される）リガンドの密度は、用いる高分子化合物およびリガンドの性状（反応に関係する一分子中の官能基の数等）や、高分子化合物とリガンドとの反応条件（添加量、ｐＨ、ＷＳＣの濃度等）によって調整することができる。

・固相化リガンド
本発明におけるリガンドは、アナライトである試料中のトロポニン（特に血液検体中のｃＴｎ）と特異的に結合し得る物質、すなわち抗トロポニン抗体である。なお、本発明における「抗体」には、完全な免疫グロブリン（狭義の抗体）だけでなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’₂、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等、本技術分野において公知の抗体断片または抗体誘導体が含まれる。

本発明では、抗トロポニン抗体を、アナライトをセンサー表面に捕捉するためにセンサー表面に固定されたリガンド（すなわち「固相化リガンド」、サンドイッチ型イムノアッセイの一次抗体）として用いる。

一方、本発明では、センサー表面に捕捉されたアナライトを蛍光標識化するための、蛍光体と複合体化したリガンド（すなわちを「蛍光標識化リガンド」、サンドイッチ型イムノアッセイの二次抗体）としても、抗トロポニン抗体を用いる。

抗トロポニン抗体としては、ポリクローナル抗体を用いることも可能であるが、心筋トロポニンに対する結合力に優れた固相化リガンドおよび蛍光標識化リガンドの組み合わせを構築できることから、モノクローナル抗体を用いることが好適である。心筋トロポニンに対するモノクローナル抗体は、心筋トロポニンの様々な部位をエピトープとするものが公知である。たとえば、トロポニンＩに対するモノクローナル抗体としては、図１に示すようなものが公知であり、容易に入手することができる。同様に、トロポニンＴに対する各種のモノクローナル抗体も公知であり、容易に入手することができる。

本発明では、固相化リガンドとして１種または２種以上の抗トロポニン抗体を用いることができ、また蛍光標識化リガンドとしても１種または２種以上の抗トロポニン抗体を用いることができる。ただし、固相化リガンドと蛍光標識化リガンドがアナライトの同一のエピトープに対して競合的に結合することを避けるため、記固相化された抗トロポニン抗体は１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体であり、前記標識化された抗トロポニン抗体は、前記固相化された抗トロポニン抗体としての１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体とは異なる、１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体であることが好ましい。

固相化リガンド、蛍光標識化リガンドそれぞれに用いる抗トロポニン抗体の組み合わせによって、ＳＰＦＳによる心筋トロポニンの検出（定量）感度が相違する場合があるので、所望の感度を達成できる抗トロポニン抗体の組み合わせを選択して用いることが適切である。たとえば、検出（定量）限界濃度が（０．１ｐｇ／ｍＬ以上）１ｐｇ／ｍＬ未満以下と低い、高感度の抗トロポニン抗体の組み合わせを用いることが望ましい。

・反応層の形成方法
反応層は、反応層の下に形成されている層（金属薄膜、スペーサ層等）に、反応層を構成するＳＡＭ、固相化層を構成する高分子化合物、リガンド等を、公知の手法を用いて順次結合させていくことにより形成することができる。

金属薄膜等の上層にＳＡＭを形成するためには、一般的に、ＳＡＭ構成分子の溶液を金属薄膜等に接触させ、当該分子の一方の末端の官能基（たとえばチオール基）と金属薄膜等（たとえば金）とを反応させるようにする。

続いて、ＳＡＭの上層にリガンドを固定化するためには、一般的に、リガンドの溶液をＳＡＭに接触させ、当該リガンドが有する官能基と前記ＳＡＭ構成分子のもう一方の末端の官能基とを反応させるようにする。たとえば、アミノ基を有するリガンド（本発明においては抗トロポニン抗体）と、カルボキシル基を有するＳＡＭ構成分子とは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）および必要に応じてカルボキシル基を活性化（エステル化）するためのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を添加した前記リガンドの溶液をＳＡＭと接触させることにより、アミノ基とカルボキシル基との反応を介して結合させることができる。

一方、ＳＡＭの上層に直接リガンドを固定化するのではなく、高分子化合物を結合させて固相化層を形成する（その後リガンドを当該固相化層に担持させる）ためには、一般的に、高分子化合物の溶液をＳＡＭに接触させ、当該高分子化合物が有する官能基と前記ＳＡＭ構成分子のもう一方の末端の官能基とを反応させるようにする。たとえば、高分子化合物としてカルボキシメチルデキストランを用いる場合、カルボキシメチルデキストランが有するアルデヒド基（還元性末端）とＳＡＭが有するアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させることにより、これらを結合させることができる。反応条件を調整することにより、ＳＡＭ等に連結する高分子化合物の数を増減させることも可能である。

あるいは、金属薄膜等に吸着しうる官能基を有する高分子化合物（たとえばチオセミカルバジドで修飾された多糖類）を用いることにより、ＳＡＭを介することなく、金属薄膜等に直接高分子化合物を結合させ、これにリガンドを担持させることも可能である。

高分子化合物とリガンドとは、アミンカップリング法、チオールカップリング法、間接的捕捉法（キャプチャー法）等、公知の手法に従って結合させることができる。たとえば、アミンカップリング法を用いる場合は、アミノ基を有するリガンド（本発明においては抗トロポニン抗体）と、カルボキシル基を有する高分子化合物（固相化層）とは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）および必要に応じてカルボキシル基を活性化（エステル化）するためのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を添加した前記リガンドの溶液を高分子化合物と接触させることにより、アミノ基とカルボキシル基との反応を介して結合させることができる。反応条件を調整することにより、直鎖状高分子に結合するリガンドの数を増減させることも可能である。

リガンドを固定化した後、アナライトの非特異的吸着を防止するため、センサー表面は（流路またはウェルの側壁・天板を含めて）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等によりブロッキング処理をしておくことが望ましい。

（スペーサ層）
必要に応じて設けられるスペーサ層は、誘電体により形成することができる。スペーサ層用の誘電体としては、光学的に透明な各種無機物や、天然または合成ポリマーを用いることができる。なかでも、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）が好ましい。

スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強効果の観点からは、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。

このようなスペーサ層は、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応を用いた方法、またはスピンコータによる塗布などによって形成することができる。

− ＳＰＦＳ用測定装置 −
本発明の免疫学的測定法は、一般的なＳＰＦＳ用測定装置を使用して実施することができる。ＳＰＦＳ用測定装置は、基本的に、ＳＦＰＦＳ用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光（好適にはレーザー光）を照射するための光源、励起光をセンサーチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム（透明支持体が平面基板状のセンサーチップを使用する場合）、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズおよびその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光および蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。より具体的な態様は、たとえば特開２０１０−１４５２７２号公報（特許文献３）など、各種の文献を参照することができる。

− 免疫学的測定法 −
本発明の免疫学的測定法は、試料中のトロポニン（特に血液検体中のｃＴｎ）を対象として、その濃度の定量ないしその存在の検出を行うことができる方法であり、下記工程１および２を行うことを含む：
（工程１）固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体を形成する工程、および
（工程２）形成されたサンドイッチ型免疫複合体に含まれる蛍光体から発せられる蛍光強度をＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）により測定する工程。

工程１として示したサンドイッチ型免疫複合体を形成する工程は、工程２に移る前にサンドイッチ型免疫複合体を形成することができれば、その態様は特に限定されるものではないが、たとえば下記工程１ａおよび１ｂを含む態様が一般的である：
（工程１ａ）前記固相化された抗トロポニン抗体と試料中のトロポニンとを反応させて複合体を形成する工程、および
（工程１ｂ）形成された免疫複合体と前記蛍光標識化された抗トロポニン抗体とを反応させて前記サンドイッチ型免疫複合体を形成する工程。

なお、必要に応じて、工程１ａおよび工程１ｂの間、または工程１（工程１ｂ）と工程２の間に、流路またはウェルを洗浄液（たとえば界面活性剤溶液）を用いて洗浄するための洗浄工程を設けてもよい。

一方、工程２は、一般的なＳＰＦＳと同様の態様で、金属薄膜に励起光を照射し、金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴によって増強されたエバネッセント波を発生させ、それによってサンドイッチ型免疫複合体に含まれる（蛍光標識化リガンドが有していた）蛍光体から発せられる蛍光の強度（「シグナル」に相当する。）を測定すればよい。また、工程２以前に、または測定領域とは別の領域において、サンドイッチ型免疫複合体が形成されていない状態で工程２と同様に金属薄膜に励起光を照射して、発生する蛍光の強度（「ノイズ」に相当する。）を測定し、前記シグナルの値を当該ノイズの値で補正する（引くまたは除する）ようにすることが好適である。

なお、工程２において蛍光体から発せられる蛍光強度を測定する際には、通常、アナライトも蛍光標識化抗体も含まない水性溶媒（たとえばリン酸緩衝液）で流路ないしウェルを満たした状態にするが、水性溶媒以外の溶媒または空気で満たした状態とすることも可能である。

上記のようにして求められた（好ましくはノイズを用いて補正された）シグナルと、濃度が既知の試料を用いて別途作製された検量線とに基づき、分析された試料中のアナライトの濃度を定量することができる。

このようにして測定される試料中のトロポニン、特に血液検体中のｃＴｎ（ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ等）の濃度は、そのｃＴｎがバイオマーカーとして機能する各種の疾患または症状の診断を行う際の参考データとして用いることができる。

・アナライト、試料（血液検体等）
本発明におけるアナライト（ＳＰＦＳにより定量ないし検出すべき物質）は、試料中に含まれるトロポニン、特に血液検体中に含まれ心筋梗塞等のバイオマーカーとして利用することのできるｃＴｎである。

トロポニンには、トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣがサブユニットとして含まれるが、本発明の免疫学的測定法の用途に応じて、典型的には血液検体中のｃＴｎの心筋梗塞等のバイオマーカーとしての用途に応じて、トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）またはトロポニンＴ（ｃＴｎＴ）のいずれをアナライトとすることが好適である。

本発明では、ＳＰＦＳ分析装置に投入し、センサーチップに設けられた反応層と接触させるための試料として、心筋トロポニンを含有する可能性のある血液検体を分析に供する。血液検体としては、各種のバイオマーカーやその他の生体関連物質を分析する場合と同様のものを用いることができ、必要に応じて抗凝固処理した全血でもよいし、全血を凝固させて沈殿物（血餅）を除去して得られる血清でもよいし、必要に応じてこれらを遠心分離、希釈、試薬との混合等の処理をしたものでもよい（本発明ではそれらすべてを「血液検体」と総称する。）。

なお、試験的な測定や検量線作成用の測定などのために、上記のような血液検体の代わりに、あらかじめ購入等により用意した心筋トロポニンをリン酸緩衝液等に溶解して調製した心筋トロポニン溶液を本発明における試料として用いてもよい。すなわち、本発明の免疫学的測定法は、血液検体中の心筋トロポニンと同様に、上記のような血液検体以外の試料中の心筋トロポニンを対象としてもよい。

・蛍光標識化リガンド
本発明では、センサー表面に捕捉されたアナライトを蛍光標識化するための蛍光標識化リガンドとして、蛍光体と、抗トロポニン抗体との複合体を用いる。前述したように、固相化リガンド、蛍光標識化リガンドそれぞれに用いる抗トロポニン抗体の組み合わせによって、ＳＰＦＳによる心筋トロポニンの検出感度が異なる場合があるので、固相化リガンドとして用いる抗トロポニン抗体に応じて、好適な抗トロポニン抗体を蛍光標識化リガンドの作製のために用いるようにする。

蛍光標識化リガンドは、一般的な免疫測定法でも用いられている蛍光体とリガンドとの複合体（コンジュゲート）と同様にして作製することができ、その態様は特に限定されるものではない。たとえば、市販の蛍光体のキット（たとえばAlexa Fluor タンパク質標識キット、インビトロゲン社）を用いて、添付のプロトコールに従い、蛍光体に導入されている官能基と抗トロポニン抗体が有する官能基とを所定の試薬の存在下に反応させることにより、蛍光体−抗トロポニン抗体複合体を作製することができる。蛍光体とリガンドとを結合させるためには、様々な官能基の組み合わせにおける反応を用いることができるほか、ビオチン化した蛍光体とアビジン化した抗トロポニン抗体とをビオチン−アビジン結合させる手法を用いることも可能である。

・蛍光体
本発明では、一般的なＳＰＦＳや従来の蛍光測定法で用いられている、公知の各種の蛍光体を用いることができる。なお、「蛍光体」は、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、「蛍光」には、狭義の蛍光のみならず、燐光やその他の発光も含まれる。

ＳＰＦＳに用いられる蛍光体としては蛍光色素が代表的であるが、半導体ナノ粒子など、公知のその他の蛍光体であってもよい。
蛍光色素の具体例としては、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）などの有機蛍光色素が挙げられる。

また、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素（たとえばＡＴＢＴＡ−Ｅｕ³⁺）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）またはＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、蛍光色素として挙げられる。

なお、血液検体に由来する試料を分析に供する場合は、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えるため、Ｃｙ５やＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７など、近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。また、センサーチップの金属薄膜に含まれる金属による吸光の影響も考慮することが好ましい。たとえば、金属薄膜に金が用いられている場合には、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上の蛍光色素が好ましく、金属薄膜に銀が用いられている場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上の蛍光色素が好ましい。

［実施例１−１］５８１（固相）／Ｃ５（標識）
（１）センサーチップの作製
厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体「Ｓ−ＬＡＬ １０」（（株）オハラ、屈折率（ｎ_d）：１．７２）をプラズマ洗浄した後、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ以下、金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。

上記工程により得られた金属薄膜を備えた透明支持体を、１ｍＭに調整した１１−アミノ−１−ウンデカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭを形成した。この透明支持体をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールそれぞれで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。

続いて、上記工程により得られたＳＡＭを備えた透明支持体を、分子量５０万〜１００万のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を１ｍＭとを含む、ｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水（ＭＥＳ）（イオン強度：１０ｍＭ）に１時間浸漬して、ＳＡＭの表面に固相化層としてＣＭＤを固定化し、その後１ＭのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解した。ＣＭＤからなる固相化層の平均膜厚は７０ｎｍであり、密度は１．９ｎｇ／ｍｍ²であった。

続いて、上記工程により得られた固相化層を備えた透明支持体を、ＮＨＳを５０ｍＭと、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ヒトトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体「５８１」溶液（Ｈｙｔｅｓｔ社、２．５μｇ／ｍＬ）に３０分間浸漬することで、ＣＭＤに当該モノクローナル抗体を固定化した。

さらに、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳを３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行なった。
上記のようにして得られたセンサーチップに、長さ１０ｍｍ、幅５ｍｍの穴を有する厚さ０．５ｍｍのＰＤＭＳ製シートを載せ、さらにこのＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した。これらのＰＤＭＳ製シートおよびシリコーンゴム製スペーサの上に、当該ＰＤＭＳ製シートの穴に対応する位置に送液導入用の穴および送液排出用の穴が形成されているＰＭＭＡ製天板を載せた。これらのセンサーチップ、ＰＤＭＳ製シートおよびシリコーンゴム製スペーサ、ならびにＰＭＭＡ製天板の積層体を外周部で圧着し、ビスで固定して、ＳＰＦＳ用測定部材を作製した。

（２）蛍光標識化リガンドの作製
抗ヒトトロポニンＩＩｇＧ１モノクローナル抗体「Ｃ５」溶液（Ｈｙｔｅｓｔ社、２．５μｇ／ｍＬ）と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを用いて、当該キットの所定の手順に従い、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化Ｃ５を作製した。その後、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株））を用いて未反応物を除去し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化Ｃ５を精製し、下記アッセイの実施まで４℃で保存した。

（３）アッセイの実施
前記工程（１）で作製した測定部材の流路に、ヒトトロポニンＩを１００ｐｇ／ｍＬ（＝０．１ｎｇ／ｍＬ）含むＰＢＳ溶液０．１ｍＬを送液し、２５分間循環させた。

続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を送液し、１０分間循環させて流路を洗浄した後、前記工程（２）で作製したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化Ｃ５を２μｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を送液し、５分間循環させた。

再度、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を送液し、１０分間循環させて流路を洗浄した後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で流路を満たした状態にしてから、測定領域の金属薄膜の裏面からレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、測定領域の上部に設置された光電子増倍管（ＰＭＴ）で蛍光量を測定した。この測定値を、トロポニンＩ濃度が１００ｐｇ／ｍＬにおける「シグナル」（Ｓ）とした。

一方、トロポニンＩを１００ｐｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液の代わりにトロポニンＩを全く含まない（０ｐｇ／ｍＬ）ＰＢＳ溶液を送液し、それ以外は上記と同様の手順により、蛍光量を測定した。この測定値を「ノイズ」（Ｎ）とした。

また、送液するトロポニンＩのＰＢＳ溶液の濃度を１００００ｐｇ／ｍＬ、３１６０ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、３１６ｐｇ／ｍＬ、３１．６ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、３．１６ｐｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、０．３１６ｐｇ／ｍＬ、０．１ｐｇ／ｍＬ、０．０３１ｐｇ／ｍＬに変化させ、それ以外は上記と同様の手順により蛍光量を測定し、それらの測定値を各濃度における「シグナル」（Ｓ）とした。

縦軸を「シグナル」−「ノイズ」（Ｓ−Ｎ）の値（単位：ａ．ｕ．）、横軸をトロポニンＩの濃度（単位：ｐｇ／ｍＬ）として、上記各濃度の結果をプロットした（図２、菱形）。このプロットに基づき、上記測定系によるトロポニンＩの定量限界は０．２ｐｇ／ｍＬであると判定した。

［実施例１−２］８Ｅ１０（固相）／Ｍ４６（標識）
前記センサーチップの作製工程（１）においてＣＭＤに固定化したトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体として「８Ｅ１０」を用い、また前記蛍光標識化リガンドの作製工程（２）におけるトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体として「Ｍ４６」を用い、得られたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化Ｍ４６を前記アッセイの実施工程（３）で用いるように変更した以外は、実施例１−１と同様の操作を行い、「シグナル」および「ノイズ」を測定した。各濃度の結果をプロットし（図２、正方形）、上記測定系によるトロポニンＩの定量限界は２ｐｇ／ｍＬであると判定した。

［実施例１−３］８４（固相）／８Ｅ１０（標識）
前記センサーチップの作製工程（１）においてＣＭＤに固定化したトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体として「８４」を用い、また前記蛍光標識化リガンドの作製工程（２）におけるトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体として「８Ｅ１０」を用い、得られたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化８Ｅ１０を前記アッセイの実施工程（３）で用いるように変更した以外は、実施例１−１と同様の操作を行い、「シグナル」および「ノイズ」を測定した。各濃度の結果をプロットし（図２、三角形）、上記測定系によるトロポニンＩの定量限界は５０ｐｇ／ｍＬであると判定した。

上記以外にも、固定化したトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体（固相抗体）および蛍光標識化リガンドに用いたトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体（標識抗体）の様々な組み合わせについて、実施例１−１と同様の操作により検出限界ないし定量限界を求めた。結果（実施例１−１〜１−３を含む。）を下記表に示す。

［実施例１−４］５８１＋８Ｅ１０（固相）／Ｃ５＋Ｍ１８（標識）
前記センサーチップの作製工程（１）においてＣＭＤに固定化したトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体として「５８１」および「８Ｅ１０」を併用し、また前記蛍光標識化リガンドの作製工程（２）におけるトロポニンＩ ＩｇＧ１モノクローナル抗体として「Ｃ５」および「Ｍ１８」を併用し、得られたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化Ｃ５およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化Ｍ１８を前記アッセイの実施工程（３）で併用するように変更した以外は、実施例１−１と同様の操作を行い、「シグナル」および「ノイズ」を測定した。各濃度の結果をプロットしたところ、実施例１−１と同様のシグモイド曲線が得られ、上記測定系によるトロポニンＩの定量限界は０．４ｐｇ／ｍＬであると判定した。

［実施例２］
前記アッセイの実施工程（３）において、トロポニンＩを１００ｐｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液０．１ｍＬの代わりに、トロポニンＩを１００ｐｇ／ｍＬ含むヒト血清０．１ｍＬを用いるよう変更した以外は、実施例１−１と同様の操作を行い、「シグナル」および「ノイズ」を測定した。各濃度の結果をプロットしたところ、実施例１−１と同様のシグモイド曲線が得られ、同様の定量限界を有すると判定した。

［実施例３］
前記センサーチップの作製工程（１）においてＣＭＤに固定化した抗体としてトロポニンＴ ＩｇＧ１モノクローナル抗体「ＴＴ−５０２」（日本バイオテスト研究所製）を用い、また前記蛍光標識化リガンドの作製工程（２）における抗体としてトロポニンＴ ＩｇＧ１モノクローナル抗体「ａｂ４５９３２」（Ａｂｃａｍ社製）を用い、得られたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識化ａｂ４５９３２を前記アッセイの実施工程（３）で用いるように変更し、さらに、前記アッセイの実施工程（３）において、トロポニンＩを１００ｐｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液０．１ｍＬの代わりに、トロポニンＴを１００ｐｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液０．１ｍＬを用いるよう変更し、それ以外は、実施例１−１と同様の操作を行い、「シグナル」および「ノイズ」を測定した。各濃度の結果をプロットしたところ、実施例１−１と同様のシグモイド曲線が得られ、同様の定量限界を有すると判定した。

Claims (4)

1. 試料中のトロポニンを対象とする免疫学的測定法であって、ＳＰＦＳ用センサーチップの測定領域に固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体を形成する工程、および形成されたサンドイッチ型免疫複合体に含まれる蛍光体から発せられる蛍光強度をＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）により測定する工程を含むことを特徴とする免疫学的測定法。
2. 前記サンドイッチ型免疫複合体を形成する工程が、前記固相化された抗トロポニン抗体と試料中のトロポニンとを反応させて免疫複合体を形成する工程、および形成された免疫複合体と前記蛍光標識化された抗トロポニン抗体とを反応させて前記サンドイッチ型免疫複合体を形成する工程を含む、請求項１に記載の免疫学的測定法。
3. 前記固相化された抗ｃＴｎ抗体が１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体であり、前記蛍光標識化された抗トロポニン抗体が、前記固相化された抗トロポニン抗体としての１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体とは異なる、１種または２種以上の抗トロポニンモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の免疫学的測定法。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の免疫学的測定法に用いられる、固相化された抗トロポニン抗体、トロポニン、および蛍光標識化された抗トロポニン抗体を含むサンドイッチ型免疫複合体が測定領域に形成された、ＳＰＦＳ用センサーチップ。