JP2013094071A - TRANSGENIC MOUSE EXPRESSING HUMAN TGFβ1 - Google Patents
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Abstract
【課題】 肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供すること。
【解決手段】 マウス・サーファクタント・プロテインC（SP-C）のプロモーター領域と、その下流に配置されて発現を制御されるヒト形質転換因子β１（hTGFβ1）の全遺伝子領域とを含むことを特徴とするトランスジェニックマウスによって達成される。このとき、トランスジェニックマウスは、生後10週齢から自然的に肺線維症を発症し、生後16週〜18週から死亡し始めることが好ましい。
【選択図】 図５PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a TG mouse that expresses TGFβ1 specifically in the lung and spontaneously develops pulmonary fibrosis.
The present invention comprises a promoter region of mouse surfactant protein C (SP-C) and a whole gene region of human transforming factor β1 (hTGFβ1), which is arranged downstream thereof and whose expression is controlled. Achieved by transgenic mice. At this time, it is preferable that the transgenic mouse spontaneously develops pulmonary fibrosis from 10 weeks of age and begins to die from 16 to 18 weeks of age.
[Selection] Figure 5
Description
本発明は、ヒトTGFβ1（transforming growth factor β1；形質転換（トランスフォーミング）成長（増殖）因子ベータ1；以下、「hTGFβ1」という）を発現するトランスジェニック（TG）マウスに関する。 The present invention relates to a transgenic (TG) mouse that expresses human TGFβ1 (transforming growth factor β1; transforming growth factor β1; hereinafter referred to as “hTGFβ1”).
肺線維症（pulmonary fibrosis; PF）は、突発性間質性肺炎（IIP）としてグループ化される突発性疾患の末期形態である。突発性肺線維症（IPF）は、最も通常の形態であり、平均的な余命が２〜３年程度の進行性疾患である。世界には、約500万人のIPF患者がいると推定されている。IPF患者の生存期間を延ばす有効な治療法については、現在まで知られていない。この疾患の病因については不明である。初期には、慢性的な炎症によってIPFが起こるのではないかと仮定されていたが、炎症だけでは繊維化の進行を説明できていない。炎症は、この疾患の初期には重要な働きを示すが、繊維化は異常な上皮及び間葉組織の反応によって起こる慢性的な上皮損傷によって進行する。
また、IPF以外にも、TGFβ1の関与する繊維化および形態変化は、気管支喘息、COPD、肺癌などにも認められることが分かっている。
Pulmonary fibrosis (PF) is a terminal form of idiopathic disease grouped as idiopathic interstitial pneumonia (IIP). Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is the most common form and is a progressive disease with an average life expectancy of around 2 to 3 years. There are an estimated 5 million people with IPF in the world. To date, no effective treatment has been known to prolong the survival of patients with IPF. The etiology of this disease is unknown. Initially, it was hypothesized that chronic inflammation might cause IPF, but inflammation alone cannot explain the progression of fibrosis. Although inflammation plays an important role early in the disease, fibrosis proceeds with chronic epithelial damage caused by abnormal epithelial and mesenchymal tissue reactions.
In addition to IPF, it has been found that fibrosis and morphological changes involving TGFβ1 are also observed in bronchial asthma, COPD, lung cancer, and the like.
形質転換成長因子β1(TGFβ1)、結合組織成長因子（connective tissue growth factor(CTGF)）、血小板成長因子（platelet-derived growth factor (PDGF)）、炎症性サイトカイン、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2／単球走化性タンパク質１（CCL2）、酸化剤、凝固因子を含む多くの因子は、繊維化の病因であると考えられている。マクロファージ、T細胞、好酸球、好中球、好塩基球を含む多くの細胞はTGFβ1を産生し、細胞内において、関連タンパク質（latency-associated protein (LAP)）に結合した非活性な形で保存される。活性型TGFβ1は、繊維化の過程において共通して増加するカテプシン、プラスミン、カルパイン、トロンボスパンジン、インテグリン−αvβ6、メタロプロテイナーゼなどによってLAPから切り離されることによって放出される。アデノウイルスを介した遺伝子導入や、遺伝子組み換えによって、肺内に活性型TGFβ1濃度が上昇すると、単核球浸潤に伴う肺線維化が誘導されることに鑑みると、肺線維症にはTGFβ1が重要な役割を担っていると考えられる。従来より、重篤な肺線維症患者の肺から得られた気管支肺胞洗浄液（BALF）には、活性型及び潜在型TGFβ1が高濃度に観察されている。 Transforming growth factor β1 (TGFβ1), connective tissue growth factor (CTGF), platelet-derived growth factor (PDGF), inflammatory cytokine, chemokine (CC motif) ligand 2 / single Many factors, including ball chemotactic protein 1 (CCL2), oxidants, and coagulation factors are thought to be the etiology of fibrosis. Many cells, including macrophages, T cells, eosinophils, neutrophils, and basophils, produce TGFβ1, in an inactive form bound to the associated protein (latency-associated protein (LAP)). Saved. Active TGFβ1 is released by being cleaved from LAP by cathepsin, plasmin, calpain, thrombospandin, integrin-αvβ6, metalloproteinase, etc. that increase in common during the fibrosis. TGFβ1 is important for pulmonary fibrosis in view of the fact that increased levels of active TGFβ1 in the lung by adenovirus-mediated gene transfer and genetic recombination induce lung fibrosis associated with mononuclear cell infiltration It is thought that he plays a role. Conventionally, active and latent TGFβ1 have been observed in high concentrations in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) obtained from the lungs of patients with severe pulmonary fibrosis.
肺線維症のモデルマウスとして、肺特異的にTGFβ1を発現するマウスが望まれているが、現在までのところ、そのようなTGマウスは得られていなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供することである。
As a model mouse for pulmonary fibrosis, a mouse that expresses TGFβ1 specifically in the lung is desired, but until now, such a TG mouse has not been obtained.
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a TG mouse that expresses TGFβ1 in a lung-specific manner and spontaneously develops pulmonary fibrosis.
上記目的を達成するための発明に係るトランスジェニックマウスは、マウス・サーファクタント・プロテインC（SP-C）のプロモーター領域と、その下流に配置されて発現を制御されるヒト形質転換因子β１（hTGFβ1）の全遺伝子領域とを含むことを特徴とする。このとき、このトランスジェニックマウスは、生後10週齢から自然的に肺線維症を発症し、生後16週〜18週で死亡し始めることが好ましい。
上記トランスジェニックマウスの系統は、C57BL/6Jであることが好ましい。
また、上記トランスジェニックマウスの作成方法は、(1)ヒトTGFβ1遺伝子を含むBACにおいて、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン部分に選択用カセットを組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子を得る選択用遺伝子組換え工程、(2)前記選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子の5'-側及び3'-側に、マウスSP-Cプロモータの下流の配列に相同的な配列を導入して、修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントとする修飾工程、(3) 5'-側及び3'-側にフランキング配列を有するマウスSP-C全コード配列を含むBACにおいて、前記修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントを、前記マウスSP-Cプロモータ領域の下流側に転移させて、SP-C・選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントとする工程、(4)前記選択用カセットを取り除いて、SP-C-TGFβ1 BACトランスジェニック構築物を得る工程、(5)前記SP-C-TGFβ1 BACトランスジェニック構築物からSP-C-TGFβ1遺伝子を精製し、マウス胚にマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを得る工程を備えることを特徴とする。
上記発明において、選択用遺伝子は、ストレプトマイシン感受性の野生型リボソーマルS12タンパクコード遺伝子（rpsl）であることが好ましい。
The transgenic mouse according to the invention for achieving the above object comprises a mouse surfactant protein C (SP-C) promoter region and a human transforming factor β1 (hTGFβ1) that is arranged downstream of the promoter region and whose expression is controlled. And the entire gene region. At this time, it is preferable that the transgenic mouse spontaneously develops pulmonary fibrosis from the age of 10 weeks and begins to die from 16 to 18 weeks of age.
The transgenic mouse strain is preferably C57BL / 6J.
In addition, the method for producing the transgenic mouse includes (1) a selection genetic recombination step in which a selection cassette is incorporated into an intron portion of a human TGFβ1 gene in a BAC containing a human TGFβ1 gene to obtain a selection-targeted human TGFβ1 gene. , (2) Modification to the modified hTGFβ1 gene fragment by introducing a sequence homologous to the downstream sequence of the mouse SP-C promoter on the 5′-side and 3′-side of the selection-introduced human TGFβ1 gene Step (3) In a BAC containing the entire mouse SP-C coding sequence having flanking sequences on the 5′-side and 3′-side, the modified hTGFβ1 gene fragment is placed downstream of the mouse SP-C promoter region. Transferring to SP-C / selection hTGFβ1 gene fragment, (4) removing the selection cassette to obtain an SP-C-TGFβ1 BAC transgenic construct, (5) the SP-C-TGFβ1 BAC transformer Purification of the SP-C-TGFβ1 gene from Enikku construct was microinjected into mouse embryo, characterized in that it comprises the step of obtaining a transgenic mouse.
In the above invention, the selection gene is preferably a streptomycin-sensitive wild-type ribosomal S12 protein coding gene (rpsl).
本発明によれば、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供できる。このTGマウスを用いることにより、呼吸器関連疾患（肺線維症、気管支喘息、肺ガン、COPDなどを含む）に関する研究を飛躍的に発展させられる。 According to the present invention, a TG mouse that expresses TGFβ1 specifically in the lung and spontaneously develops pulmonary fibrosis can be provided. By using these TG mice, research on respiratory-related diseases (including pulmonary fibrosis, bronchial asthma, lung cancer, COPD, etc.) can be greatly developed.
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
＜試験材料と試験方法＞
１．試薬
ダルベッコMEM(DMEM)、脂肪酸フリーBSA(BSA)及びL-グルタミンは、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich (St Louis, MO)）から購入した。ウシ胎児血清(FBS)は、バイオ・ホイタッカー（Bio Whittaker (Walkersville, MD)）、ペニシリンとストレプトマイシンは、ナカライテスクのものを用いた。非必須アミノ酸、トリゾール（TRIZOL）試薬、スーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム（Superscript preamplification system）、リポフェクチン2000、オプティ-MEM（Opti-MEM）は、インビトロージェン（Invitrogen (Carlsbad, CA)）から購入した。ブレオマイシン（Bleomycin (BLM)）は、日本化薬から購入した。TGFβ1、PDGF、CTGF、TF、MCP-1、Smad3のsiRNAは、ハヤシ化成から購入した。その他の試薬については、試薬級または高度精製のものを一般的な市販品として購入した。
Next, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. However, the technical scope of the present invention is not limited by these embodiments, and various forms can be made without changing the gist of the invention. Can be implemented. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.
<Test materials and test methods>
1. Reagents Dulbecco MEM (DMEM), fatty acid free BSA (BSA) and L-glutamine were purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Fetal bovine serum (FBS) was Bio Whittaker (Walkersville, MD), and penicillin and streptomycin were from Nacalai Tesque. Non-essential amino acids, TRIZOL reagents, Superscript preamplification system, Lipofectin 2000, Opti-MEM are from Invitrogen (Carlsbad, CA) Purchased. Bleomycin (BLM) was purchased from Nippon Kayaku. TGFβ1, PDGF, CTGF, TF, MCP-1 and Smad3 siRNA were purchased from Hayashi Kasei. As for other reagents, reagent grade or highly purified ones were purchased as general commercial products.
２．siRNAデザイン
標的配列に対するsiRNA及び混合siRNAは、エンハンスト・siDirectプログラム（株式会社RNAi）を用いてデザインした。塩基配列として、オフターゲット作用を起こす可能性が低いものを選択した。
2. siRNA design siRNA and mixed siRNA for the target sequence were designed using the enhanced siDirect program (RNAi Inc.). A nucleotide sequence having a low possibility of causing off-target action was selected.
３．野生型マウスを用いたインビボ（in vivo）試験
野生型マウスを用いた肺線維症モデルにおいて、潜在的に原因となりうる因子の経時的な変化を追うために、100 mg/kg BLMを経皮投与したマウスを投与後0, 3, 7, 14 及び 21日目に絶命させた。BALF中のTGFβ1, CTGF, PDGF, MCP-1及びTFタンパク質の濃度をEIAによって測定し、肺組織中の各mRNA量を各時点において定量的PCRによって測定した。BALF中の全タンパク質とコラーゲン濃度を各時点で測定し、21日目の肺内ヒドロキシプロリン濃度を測定した。
肺繊維化におけるsiRNAの効果を評価するために、20g〜22gのメス9〜11週齢のC57BL/6野生型（WT）マウスを用いた。マウスは、日本SLC（浜松市）から購入し、三重大学動物施設にて飼育した。本試験は、三重大学動物実験委員会によって承認された。滅菌生理食塩水にブレオマイシン(BLM)を溶解し、無作為抽出されたマウスに対して、浸透圧式ミニポンプ（model 2001; Alzet Corporation, Palo Alto, CA）を用いて、100 mg/kgを持続的に筋肉内投与することで肺障害を起こした。対照群には、BLMを含まない生理食塩水を投与した(20)。試験開始から、いずれの動物にも死亡例は認められなかった。21日後に、全ての試験動物を腹腔内へのペントバルビタールの過剰投与によって絶命させ、気管支肺胞洗浄液(BALF)、血液、及び臓器を摘出した。肺繊維化の程度は、アッシュクラフト・スコア（Ashcroft score）、CT所見、及び組織中のコラーゲン及び／又はヒドロキシプロリンの量によって評価した。
3. In vivo test using wild-type mice In a pulmonary fibrosis model using wild-type mice, 100 mg / kg BLM was administered transdermally to track changes over time in potentially causative factors. The mice were killed on days 0, 3, 7, 14 and 21 after administration. The concentrations of TGFβ1, CTGF, PDGF, MCP-1 and TF protein in BALF were measured by EIA, and the amount of each mRNA in lung tissue was measured by quantitative PCR at each time point. The total protein and collagen concentrations in BALF were measured at each time point, and the lung hydroxyproline concentration on day 21 was measured.
To evaluate the effect of siRNA on lung fibrosis, 20-22 g female 9-11 week old C57BL / 6 wild type (WT) mice were used. Mice were purchased from Japan SLC (Hamamatsu City) and raised at Mie University Animal Facility. This study was approved by the Mie University Animal Experiment Committee. 100 mg / kg continuously in osmotic minipumps (model 2001; Alzet Corporation, Palo Alto, Calif.) For mice randomly extracted from bleomycin (BLM) in sterile saline Intramuscular administration caused lung injury. The control group received saline without BLM (20). There were no deaths in any animal since the start of the study. After 21 days, all test animals were killed by pentobarbital overdose intraperitoneally and bronchoalveolar lavage fluid (BALF), blood, and organs were removed. The degree of pulmonary fibrosis was assessed by the Ashcraft score, CT findings, and the amount of collagen and / or hydroxyproline in the tissue.
TGFβ1、CTGF、PDGF、CCL2または組織因子（TF）のsiRNAを気管支内に投与したときの抗繊維化効果を評価するために、BLM投与後3,7及び14日目にマウス特異的siRNA（5 mg/kg）を投与した。用量依存的試験のために、5, 0.5, 及び0.05 mg/kg のマウス特異的TGFβ1 siRNAを投与した。コントロール群には、気管支内に混合siRNA（5mg/kg）または基材を投与した。治療について最適な疾患ステージを評価するために、疾患の急性期（3及び7日目）、慢性期（12及び16日目）、または両期（3,7及び14日目）に 5 mg/kg のTGFβ1 siRNAを投与した。TGFβ1 siRNA の単回投与の効果は、BLM投与後14日目のみに投与することで評価した。ヒトとマウスに共通な配列を持つTGFβ1とSmad3のsiRNA/DNAキメラの抑制効果を評価するために、BLM投与3,7及び14日目に各キメラを気管内投与した。
肺線維症に対するSmad3の抑制効果を評価するため、BLM投与によって肺線維症を起こさせたマウスに、マウス特異的Smad3 siRNA、混合siRNA、または基剤のみ（各5mg/kg）を投与し、肺線維症の程度を各投与処理から21日目に調べた。
To evaluate the anti-fibrotic effect of intra-bronchial administration of TGFβ1, CTGF, PDGF, CCL2 or tissue factor (TF) siRNA, mouse-specific siRNAs (5, 7 and 14 days after BLM administration) mg / kg). For dose-dependent studies, 5, 0.5, and 0.05 mg / kg of mouse specific TGFβ1 siRNA were administered. Control groups received mixed siRNA (5 mg / kg) or substrate intrabronchially. 5 mg / day in the acute phase (days 3 and 7), chronic phase (days 12 and 16), or both phases (days 3, 7 and 14) to assess the optimal disease stage for treatment kg of TGFβ1 siRNA was administered. The effect of a single dose of TGFβ1 siRNA was evaluated by administering only 14 days after BLM administration. In order to evaluate the inhibitory effect of siRNA / DNA chimeras of TGFβ1 and Smad3 having sequences common to humans and mice, each chimera was administered intratracheally on days 3, 7 and 14 of BLM administration.
In order to evaluate the inhibitory effect of Smad3 on pulmonary fibrosis, mice specific to pulmonary fibrosis caused by BLM administration were administered mouse-specific Smad3 siRNA, mixed siRNA, or base alone (5 mg / kg each), and lungs The extent of fibrosis was examined on day 21 after each treatment treatment.
４．肺内滴下によるマウスへの処理
マウスへの肺内投与の詳細は、既報（非特許文献１）に従って行った。簡単に説明すると、マウスの腹腔内にペントバルビタールナトリウム（75 mg/kg）を投与して睡眠状態とし、45°に傾けた処理台上に上歯を引っ掛けて吊した。舌をパッドしたピンセットを用いて引っ張り、その後から挿入した喉頭鏡を通して気管支を視認した。を気管支内微小噴霧器(Penn-Century, Philadelphia, PA)を用いて、肺内に75μLの試験液を投与し、機器を取り除いた。その後、マウスが完全に回復するまで監視した。この方法によって、経気管支的に投与された試験液が拡散することを75μLまたは50μLのエバンス・ブルーによって確認した。
4). Treatment to mice by intrapulmonary instillation Details of intrapulmonary administration to mice were performed according to a previous report (Non-patent Document 1). Briefly, pentobarbital sodium (75 mg / kg) was administered into the abdominal cavity of the mouse to make it sleep, and the upper teeth were hooked and hung on a treatment table inclined at 45 °. The bronchus was visually confirmed through the laryngoscope inserted after pulling with the tweezers which pad the tongue. Using an intrabronchial microsprayer (Penn-Century, Philadelphia, PA), 75 μL of the test solution was administered into the lung, and the device was removed. Thereafter, the mice were monitored until full recovery. By this method, it was confirmed with 75 μL or 50 μL of Evans Blue that the test solution administered transbronchially diffused.
５．経気管支投与後の肺内TGFβ1 siRNAの局在
肺内のTGFβ1 siRNAの局在を確認するために、C57BL/6野生型マウスに浸透圧ミニポンプを用いてBLMを投与し、その後７日目にCy3をラベルしたTGFβ1 siRNA（100μg）を経気管支投与した。３時間後にマウスを絶命し、肺を10%ホルマリンに漬けた後、膨らませて、パラフィンで固定した。肺組織は、パラフィンを除き、生理食塩水−トリス緩衝液にて数回洗浄した。洗浄後、切片を抗プロサーファクタント・タンパク質Ｃポリクローナル抗体（ウサギ血清：Millipore, Bedford, MA）と共に４℃にて１時間反応させ、生理食塩水−トリス緩衝液にて洗浄後、抗ウサギ抗体蛍光標識試薬（Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG）によって処理した。洗浄処理後に、サンプルを蛍光試薬を含むイメージング試薬（DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）を含むSlowFade Goldantifae）によって処理した。蛍光の局在を顕微鏡にて観察した。TGFβ1 siRNAのセンス配列とアンチセンス配列は、それぞれセンス：5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3'（配列番号１）、アンチセンス：5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3'（配列番号２）であった。
5. Localization of intrapulmonary TGFβ1 siRNA after transbronchial administration To confirm the localization of TGFβ1 siRNA in the lung, C57BL / 6 wild-type mice were administered BLM using an osmotic minipump, and then on day 7 Cy3 Labeled TGFβ1 siRNA (100 μg) was transbronchially administered. After 3 hours, the mice were killed and the lungs were immersed in 10% formalin, then inflated and fixed with paraffin. Lung tissue was washed several times with saline-Tris buffer except for paraffin. After washing, the sections were reacted with an anti-prosurfactant protein C polyclonal antibody (rabbit serum: Millipore, Bedford, MA) at 4 ° C. for 1 hour, washed with physiological saline-Tris buffer, and then labeled with anti-rabbit antibody. Treated with reagent (Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG). After the washing treatment, the sample was treated with an imaging reagent containing a fluorescent reagent (SlowFade Goldantifae containing DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole)). The localization of fluorescence was observed with a microscope. The sense sequence and antisense sequence of TGFβ1 siRNA were sense: 5′-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and antisense: 5′-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3 ′ (SEQ ID NO: 2), respectively.
６．BALFと末梢血の回収方法
ヘパリンを含むチューブ内に心臓穿刺によって血液サンプルを集めた後、遠心分離（1000 g, 10 min）して血漿を回収した。BALFサンプルは、既報（非特許文献２）に記載された方法に従って得た。BALF中の全細胞数は、ケモメテック社製（ChemoMetec (Allerod, Denmark)）の細胞計数装置によって計数した。BALFを遠心分離（1000 g, 10 min, 4℃）後に上清を回収し、必要となるまで-80℃にて保存した。分画細胞の計数のために、BALF細胞をサイトスピンを用いて遠心分離し、メイ・グリンヴァルト・ギムザ染料（May-Grunwald-Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany)）にて染色した。血液中の気体は、コーバスb221血液中気体システム（Cobas b221 Blood Gas system (Roche, Basel, Switzerland)）によって解析した。
6). BALF and peripheral blood collection method Blood samples were collected by cardiac puncture in a tube containing heparin, and then centrifuged (1000 g, 10 min) to collect plasma. The BALF sample was obtained according to the method described in the previous report (Non-Patent Document 2). The total number of cells in BALF was counted with a cell counter manufactured by Chemometec (ChemoMetec (Allerod, Denmark)). The supernatant was collected after centrifugation of BALF (1000 g, 10 min, 4 ° C.) and stored at −80 ° C. until needed. For counting of fractionated cells, BALF cells were centrifuged using cytospin and stained with May-Grunwald-Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany). The gas in the blood was analyzed by Cobas b221 Blood Gas system (Roche, Basel, Switzerland).
７．生化学的解析
全タンパク質濃度は、市販のキット（BCATM protein assay kit; Pierce, Rockford, IL, USA）を用いて、使用マニュアルに従って測定した。ヒト及びマウスTGFβ1（R＆D System, Minneapolis, MIN）、INF-αとIFN-β（PBL Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ）、MCP-1（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）、血液凝固活性マーカ、トロンビン・アンチトロンビン複合体（TAT）（Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Canada）及びTF（IMUBIND, Tissue factor, American Diagnostica, Greenwich, CT）の濃度については、市販のEIAキットを用いて、それぞれの使用マニュアルに従って測定した。PDGF濃度は、ポリクローナル抗PDGF抗体（Genzyme Corporation, Cambridge, MA）とビオチン化抗PDGF抗体を用いて測定した。PDGF濃度は、PDGF抗原の標準品を用いて作成した用量カーブに内挿することで求めた。PDGF測定系の日間及び日内変動は、10%以内であった。
7). Biochemical analysis The total protein concentration was measured using a commercially available kit (BCA ™ protein assay kit; Pierce, Rockford, IL, USA) according to the instruction manual. Human and mouse TGFβ1 (R & D System, Minneapolis, MIN), INF-α and IFN-β (PBL Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ), MCP-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.), Blood coagulation activity marker, thrombin・ Regarding the concentrations of antithrombin complex (TAT) (Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Canada) and TF (IMUBIND, Tissue factor, American Diagnostica, Greenwich, CT), use each commercially available EIA kit. Measured according to PDGF concentration was measured using a polyclonal anti-PDGF antibody (Genzyme Corporation, Cambridge, MA) and a biotinylated anti-PDGF antibody. PDGF concentration was determined by interpolating into a dose curve created using a standard PDGF antigen. The daily and daily fluctuation of the PDGF measurement system was within 10%.
８．肺の組織学的検査
マウスを絶命後、肺循環を生理食塩水で洗浄した後、肺と他の臓器を取り出した。左肺はホルマリン（10%中性緩衝液）でかん流し、ガスで膨らませて、ホルマリン中にて24時間固定した後、パラフィンに包埋した。5μm厚さの組織検査用切片を作成後、パラフィンを除き、生理食塩-リン酸緩衝液にて数回洗浄した。組織切片は、ヘマトキシリン／エオジンとマッソン三色染色法にて処理した。ランダムに抽出された切片を盲験観測者によって評価した。肺の組織学的検査は、オリンパスDP70デジタルカメラを装着したオリンパスBX50顕微鏡を用いて行った。全群の各マウスについて、肺組織中の５個の顕微鏡視野をランダムに抽出し、アッシュクラフト繊維化スコア（非特許文献３）に従って５名の盲験観測者が肺繊維化の状態を評価した。
8). Histological examination of the lungs After the mice died, the pulmonary circulation was washed with physiological saline, and then the lungs and other organs were removed. The left lung was perfused with formalin (10% neutral buffer), inflated with gas, fixed in formalin for 24 hours, and then embedded in paraffin. After preparing a 5 μm-thick histological section, paraffin was removed and the tissue section was washed several times with physiological saline-phosphate buffer. Tissue sections were processed by hematoxylin / eosin and Masson trichrome staining. Randomly extracted sections were evaluated by blinded observers. Lung histology was performed using an Olympus BX50 microscope equipped with an Olympus DP70 digital camera. For each mouse in all groups, five microscopic fields in lung tissue were randomly extracted, and five blind observers evaluated the state of lung fibrosis according to the Ashcraft fibrosis score (Non-patent Document 3). .
９．ヒドロキシプロリン測定
肺中のコラーゲン沈澱量とヒドロキシプロリン濃度は、比色分析により測定した。簡単に説明すると、次の通りである。左肺を切除し、ホモジナイズ処理前に乾燥させた。サンプルを6N塩酸中にて20時間、110℃にて加水分解した。96穴プレートに、いずれも3個ずつ（triplicate）の標準品またはサンプル（5μL）を用意し、5μLクエン酸・酢酸緩衝液（238 mM クエン酸、1.2% 氷酢酸、532 mM 酢酸ナトリウム、85 mM 水酸化ナトリウム）、100μLクロラミンＴ溶液（16 mLクエン酸・酢酸緩衝液に0.282 gクロラミンＴを添加した溶液、2 mL n-プロパノール、2 ml 精製水）を加えて、室温にて20分間反応させた。その後、100μL エールリッヒ溶液（9.3 mL n-プロパノールと 3.9 mL 70% 過塩素酸に 2.5 g p-ジメチルアミノベンゾアルデヒドを加えた溶液）を加えて、65℃にて20分間反応させた後、プレートリーダーにて 550 nm の吸光度を測定した。
9. Hydroxyproline measurement The amount of collagen precipitation and hydroxyproline concentration in the lung were measured by colorimetric analysis. Briefly, it is as follows. The left lung was excised and dried before homogenization. The sample was hydrolyzed in 6N hydrochloric acid for 20 hours at 110 ° C. Prepare three triplicate standards or samples (5 μL) in 96-well plates, and use 5 μL citrate / acetate buffer (238 mM citrate, 1.2% glacial acetic acid, 532 mM sodium acetate, 85 mM) Sodium hydroxide) and 100 μL chloramine T solution (16 mL citrate / acetic acid buffer solution with 0.282 g chloramine T added, 2 mL n-propanol, 2 ml purified water) and reacted at room temperature for 20 minutes It was. Then, add 100 μL Ehrlich solution (9.3 mL n-propanol and 3.9 mL 70% perchloric acid to which 2.5 g p-dimethylaminobenzaldehyde is added) and react at 65 ° C for 20 minutes, then plate reader Absorbance was measured at 550 nm.
１０．滴下されたsiRNAのオフターゲット作用
浸透圧ミニポンプにより生理食塩水を皮下投与された野生型C57BL/6マウスをランダムに次の３群に分類した。生理食塩水の投与から3,7及び14日目に、第１群にはマウスTGFβ1 siRNAを（表１）、第２群にはヒト及びマウスに共通な配列を持つsiRNA/DNAキメラを（TGFβ1-Ch1、表３）、第３群には基剤のみを、それぞれ投与した。マウスは21日目に絶命し、BALFと肺サイトカインをEIAにて測定した。
10. Off-target action of dripped siRNA Wild-type C57BL / 6 mice administered with physiological saline subcutaneously by an osmotic minipump were randomly classified into the following three groups. On days 3, 7 and 14 after the administration of physiological saline, the first group contains mouse TGFβ1 siRNA (Table 1), and the second group contains siRNA / DNA chimeras (TGFβ1 that have sequences common to humans and mice). -Ch1, Table 3), the third group received only the base. The mice died on day 21 and BALF and lung cytokines were measured by EIA.
１１．hTGFβ1-BAC トランスジェニックマウスの作成
マウスSP-Cプロモータによって制御されるヒトTGFβ1遺伝子を持つTGFβ1 BAC トランスジェニックマウスは、C57BL/6Jマウス胚への前核インジェクションによって作成された（日本クレア株式会社）。BACによるトランスジェニック動物作成の初代遺伝子導入と生殖細胞への伝達の確認は、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン１フラグメントを［P32］でラベルしたDNAプローブを使用し、Pstlによって切断した尾部DNAを用いたサザンブロットによって行った。子孫56匹のうち7匹には、コロニーが得られた導入遺伝子を持っていた。
TGマウスの作成方法について、詳細に説明すると次の通りである。NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースを用いてマウスBACエンドデータベースを検索し、RPCI-23メスC57BL/6Jマウスから、SP-C BAC クローンマウス（RP23-216B15）を選択した。BACエンド配列は、このBACクローンが、全3kbのマウスSP-C遺伝子配列に加えて、5'側に59kb、3'側に145kbのゲノムDNAを含むことを示している。NCBIのジーンバンク（GenBank）データベースをブラスト（BLAST）検索し、RPCL-11ヒトBACライブラリーからヒトTGFβ1 BAC（hTGFβ1 BAC）クローン（RP11-638N16）を選択した。BACエンド配列は、このBACクローンが全23kbのhTGFβゲノム配列に加えて、5'側に57kb、3'側に115kbのゲノムDNAを含むことを示している。
11. Generation of hTGFβ1-BAC transgenic mice TGFβ1 BAC transgenic mice having the human TGFβ1 gene controlled by the mouse SP-C promoter were generated by pronuclear injection into C57BL / 6J mouse embryos (Claire Japan, Inc.). The introduction of the primary gene for the production of transgenic animals by BAC and confirmation of transmission to germ cells were performed by using a DNA probe labeled with the [P32] intron 1 fragment of the human TGFβ1 gene and Southern using tail DNA cleaved by Pstl. Performed by blotting. Seven of the 56 offspring had the transgene from which a colony was obtained.
The method for creating a TG mouse will be described in detail as follows. The mouse BAC end database was searched using NCBI (National Center for Biotechnology Information) database, and SP-C BAC clone mice (RP23-216B15) were selected from RPCI-23 female C57BL / 6J mice. The BAC endosequence shows that this BAC clone contains 59 kb genomic DNA on the 5 ′ side and 145 kb on the 3 ′ side in addition to the entire 3 kb mouse SP-C gene sequence. NCBI GeneBank database was blasted (BLAST) to select human TGFβ1 BAC (hTGFβ1 BAC) clone (RP11-638N16) from RPCL-11 human BAC library. The BAC endosequence shows that this BAC clone contains 57 kb genomic DNA on the 5 ′ side and 115 kb on the 3 ′ side in addition to the entire 23 kb hTGFβ genomic sequence.
両BACクローンをバックパック・リソース・センター（BACPAC Resources Center； Children's Hospital Oakland Research Institute (CHORI, Oakland, CA)）から入手した。マウスSP-C遺伝子座にヒトTGFβ1の全長コードエクソンとイントロンを持つキメラSP-C-TGFβ1 BACトランスジェニック構築物（コンストラクト）は、BAC組み換え介在遺伝子工学法（BAC recombination-mediated genetic engineering）によって作成した。hTGFβ1遺伝子は、Red/Etカウンター・セレクションBAC修飾キット（Red/ET Counter Selection BAC Modification Kit (Gene Bridges, Heidelberg, Germany)）を用いて、ヒトBACクローンからマウスSP-C BACクローンに転移した（非特許文献４）。
方法を説明すると次の通りである。ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン近傍の二つの配列によって、rpsl-neo用選択カセットをPCRによって増幅した。PCRに用いたプライマーと、その塩基配列は、それぞれRHODTF forward1（5'-GTA TAC TCT GCC ACG GCT TCC AAG ACG GAG ACC AGC CAG GTG GCC CGT GAG CAA GGG CGA GGA GCT G：配列番号３）及び RHODTF reverse1（5'-GTA TAC ATG GGA GAC TCC TAC AGT CGG CCA CGG AGT CCC TGG CAG TCT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C：配列番号４）であった。増幅したrpsl-neo選択用カセットをRed/ET組み換えによって得られたヒトBACクローンのTGFβ1遺伝子中に組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子とした（選択用遺伝子組換え工程）。
Both BAC clones were obtained from the BACPAC Resources Center (Children's Hospital Oakland Research Institute (CHORI, Oakland, CA)). A chimeric SP-C-TGFβ1 BAC transgenic construct (construct) having the human TGFβ1 full-length coding exon and intron at the mouse SP-C locus was prepared by BAC recombination-mediated genetic engineering. The hTGFβ1 gene was transferred from a human BAC clone to a mouse SP-C BAC clone using the Red / Et Counter Selection BAC Modification Kit (Gene Bridges, Heidelberg, Germany) Patent Document 4).
The method is described as follows. The rpsl-neo selection cassette was amplified by PCR with two sequences near the intron of the human TGFβ1 gene. The primers used for PCR and their nucleotide sequences were RHODTF forward1 (5'-GTA TAC TCT GCC ACG GCT TCC AAG ACG GAG ACC AGC CAG GTG GCC CGT GAG CAA GGG CGA GGA GCT G: SEQ ID NO: 3) and RHODTF reverse1 (5′-GTA TAC ATG GGA GAC TCC TAC AGT CGG CCA CGG AGT CCC TGG CAG TCT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C: SEQ ID NO: 4). The amplified rpsl-neo selection cassette was incorporated into the TGFβ1 gene of the human BAC clone obtained by Red / ET recombination to obtain a selection-introduced human TGFβ1 gene (selection gene recombination step).
hTGFβ1遺伝子の両端部分の配列をホモロジーアームとして用いて、TGFβ1遺伝子をプラスミドpDNR-1r (Clontech, Mountain View, CA)にサブクローニングした。サブクローニングしたhTGFβ1遺伝子フラグメントをマウスSP-C遺伝子の非翻訳領域の40塩基隣において、スタートコドン（5'エンド）とストップコドン（3'エンド）の隣に直接的に配置した（修飾工程）。修飾後のhTGFβ1遺伝子フラグメント（修飾hTGFβ1遺伝子フラグメント）は、キメラSP-C-TGFβ1 BACクローンを構築するために、Red/ET組み換えによってマウスBACクローンのマウスSP-C遺伝子に転移し、SP-C・選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントとした。hTGFβ1遺伝子のイントロン中のrpsl-neoカセットは、rpsLカウンターセレクションによって取り除いた。BAC修飾については、シークエンスを行って配列を確認した。SP-C-TGFβ1 BAC トランスジェニック構築物は、アベらの方法（非特許文献５）を改変した方法によって、マイクロインジェクションによって精製した。BAC トランスジェニック構築物をヌクレオボンド・プラスミド・精製キット（Nucleobond Plasmid Purification kit (MACHEREY-NAGEL, Germany)）を用いて、250mLの大腸菌培養液から精製した。精製に際して、10μgのBACトランスジェニック構築物をPI-Scelエンドヌクレアーゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA）を用いて一晩処理し、pBACe3.6ベクター配列中に一つだけ含まれる切断部位を切断することにより線形化した。線形化したBAC DNAをパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）にかけて分離した後、電気泳動溶出してゲルから抽出した。0.1mM EDTA-トリス緩衝液を用いて透析し、大きさと表品を用いてPFGEによって試料を得た。BAC DNA構築物は、1 ng/μL に調整してマイクロインジェクション用とし、使用時まで4℃にて保管した。 Using the sequences at both ends of the hTGFβ1 gene as homology arms, the TGFβ1 gene was subcloned into the plasmid pDNR-1r (Clontech, Mountain View, CA). The subcloned hTGFβ1 gene fragment was placed directly next to the start codon (5 ′ end) and stop codon (3 ′ end) next to 40 bases in the untranslated region of the mouse SP-C gene (modification step). The modified hTGFβ1 gene fragment (modified hTGFβ1 gene fragment) was transferred to the mouse SP-C gene of the mouse BAC clone by Red / ET recombination to construct a chimeric SP-C-TGFβ1 BAC clone. A hTGFβ1 gene fragment for selection was used. The rpsl-neo cassette in the intron of the hTGFβ1 gene was removed by rpsL counter selection. For BAC modification, the sequence was confirmed by sequencing. The SP-C-TGFβ1 BAC transgenic construct was purified by microinjection by a method modified from the method of Abe et al. (Non-patent Document 5). The BAC transgenic construct was purified from 250 mL of E. coli culture using the Nucleobond Plasmid Purification kit (MACHEREY-NAGEL, Germany). During purification, treat 10 μg of BAC transgenic construct with PI-Scel endonuclease (New England Biolabs, Ipswich, Mass.) Overnight to cleave a single cleavage site in the pBACe3.6 vector sequence. Was linearized. The linearized BAC DNA was separated by pulse field gel electrophoresis (PFGE) and then extracted from the gel by electrophoretic elution. Dialysis was performed using 0.1 mM EDTA-Tris buffer, and a sample was obtained by PFGE using size and surface preparation. The BAC DNA construct was adjusted to 1 ng / μL for microinjection and stored at 4 ° C. until use.
１２．肺線維症を自然発症するhTGFβ1-BAC TGマウスのsiRNAによる治療
hTGFβ1-BAC TGマウスは、マイクロCTと組織学的な検討によって、10週齢から肺炎症と肺繊維化を発症する。マイクロCTによる肺炎症／肺繊維化を同程度に発症したhTGFβ1-BAC TGマウスをランダムに2つの群に分割した。一方の群には、ヒト特異的TGFβ1 siRNA (5 mg/kg)を連続する３週間に渡って毎週１回投与し、他方の群には、基剤のみを３週間に渡って毎週１回投与した。各マウスは毎週マイクロCTによって検査を行い、試験開始から21日目に絶命させ、BALF、血液及び肺組織のサンプリングを行った。
１３．hTGFβ1-BAC TG マウスにBLMを皮下投与して肺線維症を進展させた後のsiRNAによる生存曲線への影響
hTGFβ1 siRNAの肺内投与治療による延命効果を評価するために、10匹のhTGFβ1-BAC TGマウスをランダムに２群に分類し、浸透圧ミニポンプにより80 mg/kg BLMを皮下投与した後に0,3,7及び14日目に、一方の群（BLM/TGFβ1 siRNA; n=5）には、ヒト特異的TGFβ1 siRNA (No 13)を経気管支投与し、他方の群（BLM/vehicle; n=5）には、基剤のみを投与した。BLMは、hTGFβ1-BAC TGマウスの肺繊維化の進行を速めるために投与した。
12 Treatment of hTGFβ1-BAC TG mice with spontaneous development of pulmonary fibrosis with siRNA
hTGFβ1-BAC TG mice develop pulmonary inflammation and pulmonary fibrosis from 10 weeks of age by micro-CT and histological examination. HTGFβ1-BAC TG mice that developed lung inflammation / pulmonary fibrosis to the same extent by micro CT were randomly divided into two groups. One group receives human-specific TGFβ1 siRNA (5 mg / kg) once a week for 3 consecutive weeks, and the other group receives the vehicle alone once every week for 3 weeks. did. Each mouse was examined weekly by micro-CT, killed on day 21 from the start of the test, and sampled for BALF, blood and lung tissue.
13. Effect of siRNA on survival curve after development of pulmonary fibrosis by subcutaneous administration of BLM to hTGFβ1-BAC TG mice
In order to evaluate the survival effect of pulmonary administration of hTGFβ1 siRNA, 10 hTGFβ1-BAC TG mice were randomly divided into 2 groups and 0,3 after subcutaneous administration of 80 mg / kg BLM with an osmotic minipump. On days 7, 7 and 14, one group (BLM / TGFβ1 siRNA; n = 5) was administered bronchially with human specific TGFβ1 siRNA (No 13) and the other group (BLM / vehicle; n = 5 ) Received only the base. BLM was administered to accelerate the progression of lung fibrosis in hTGFβ1-BAC TG mice.
１４．半定量的PCR
hTGFβ1 TGマウスの各組織におけるhTGFβ1遺伝子の発現量を調べるため、逆転写酵素PCR（RT-PCR）を行った。各組織からトリゾール（TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA)）を用いて、全RNAを抽出した。RT-PCRに使用したプライマーの配列は、次の通りであった。human TGFβ1, forward 5'- AAGACTATCGACATGGAGCTGG-3'（配列番号５）及び、reverse 5'-GTATCGCCAGGAATTGTTGCTG-3'（配列番号６）; human GAPDH, forward 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'（配列番号７）及び reverse 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'（配列番号８）; mouse GAPDH, forward 5'-CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT-3'（配列番号９）及び reverse 5'-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3'（配列番号１０）であった。全PCRは、各増幅反応においてプラトーとなる前の状態で実施した。PCR反応物は、2%アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドを臭化エチジウムで染色した後、紫外光にて観察した。
14 Semi-quantitative PCR
In order to examine the expression level of the hTGFβ1 gene in each tissue of hTGFβ1 TG mice, reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was performed. Total RNA was extracted from each tissue using Trizol (TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA)). The primer sequences used for RT-PCR were as follows. human TGFβ1, forward 5'- AAGACTATCGACATGGAGCTGG-3 '(SEQ ID NO: 5) and reverse 5'-GTATCGCCAGGAATTGTTGCTG-3' (SEQ ID NO: 6); human GAPDH, forward 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3 '(SEQ ID NO: 7) and reverse 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3 '(SEQ ID NO: 8); mouse GAPDH, forward 5'-CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT-3' (SEQ ID NO: 9) and reverse 5'-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 10). All PCR was performed in a state before a plateau in each amplification reaction. The PCR reaction product was electrophoresed using a 2% agarose gel, the band was stained with ethidium bromide, and then observed with ultraviolet light.
１５．定量的リアルタイムRT-PCR
A549細胞及び器官組織から全RNAを抽出し、2μgの全RNAから逆転写反応とオリゴdTプライマーを用いてcDNAを調製した。定量的リアルタイムRT-PCRは、アプライド・バイオシステムズ7500リアル・タイムPCRシステム（Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR System）によって実施した。マウス及びヒト遺伝子（TGFβ1, Tgfβ1, Ctgf, F3 [tissue factor], pdgfa, mcp-1）に特異的なプライマーとプローブは、キアゲン（Qiagen (Valencia, CA)）から購入した。データは、アプライド・バイオシステムズの7500ソフトウエアによって解析し、各遺伝子の発現量はGAPDHの転写量によって標準化した。
１６．マイクロCT（computed tomography）による肺線維症の評価
マウスモデルにおける肺線維症の評価は、マイクロCT（理化学研究所製）を用いて行った。CTデータは、イソフルランの吸入によって呼吸抑制された麻酔下にあるマウスを用いて得られた。データ取得時のパラメータは、スキャンスピード17秒、分解能20〜135μm、管電圧90kV、管電流200μAとした。イメージは、アイ・ビュー・ソフトウエア（i-VIEW software；モリタ製作所）によって解析した。CTデータはゼロアジャストを行い、各マウスから下部肺野の４ヶ所の断面図を採用した。換気可能な領域は、肺線維症の進展に伴って減少することから、肺断面図中の全換気可能領域が占める割合をウインドウズ版WinROOFイメージ解析ソフトウエア（三谷商事）にて解析し、そのデータを野生型マウスのCT画像から得られたデータと比較して、高密度領域の割合として示した。
15. Quantitative real-time RT-PCR
Total RNA was extracted from A549 cells and organ tissues, and cDNA was prepared from 2 μg of total RNA using reverse transcription reaction and oligo dT primer. Quantitative real-time RT-PCR was performed with an Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Primers and probes specific for mouse and human genes (TGFβ1, Tgfβ1, Ctgf, F3 [tissue factor], pdgfa, mcp-1) were purchased from Qiagen (Qiagen (Valencia, Calif.)). Data was analyzed by Applied Biosystems 7500 software, and the expression level of each gene was normalized by the transcription amount of GAPDH.
16. Evaluation of pulmonary fibrosis by micro CT (computed tomography) Evaluation of pulmonary fibrosis in a mouse model was performed using micro CT (manufactured by RIKEN). CT data was obtained using anesthetized mice that were respiratory-suppressed by inhalation of isoflurane. The parameters at the time of data acquisition were a scan speed of 17 seconds, a resolution of 20 to 135 μm, a tube voltage of 90 kV, and a tube current of 200 μA. The image was analyzed by i-VIEW software (Morita Manufacturing Co., Ltd.). CT data was zero-adjusted, and four cross-sectional views of the lower lung field from each mouse were used. Ventilated areas decrease with the development of pulmonary fibrosis, so the percentage of all ventilable areas in the lung cross section is analyzed with the Windows version of WinROOF image analysis software (Mitani Corporation). Is shown as a percentage of the high density region compared to the data obtained from CT images of wild type mice.
１７．上皮・間葉転移（epithelial-mesenchymal transition (EMT)）のインビボ（in vivo）試験
3,7,及び14日目に、生理食塩水（SAL/vehicle）、BLM＋基剤（BLML/vehicle）、またはBLM＋マウス特異的TGFβ1 siRNA（BLM/TGFβ1 siRNA）を投与されたマウス肺組織を脱パラフィン処理し、トリス緩衝液-生理食塩水を用いて数回洗浄した。洗浄処理した後、切片を抗プロサーファクタントCウサギ抗血清（Millipore, Bedford, MA）と共に4℃にて1時間反応させ、トリス緩衝液-生理食塩水にて洗浄した後、抗ウサギIgGに結合させた蛍光色素（Alexa Fluor 594 anti-rabbit IgG）にて処理した。更に洗浄処理した後、切片を抗α平滑筋アクチンA4マウスモノクローナル抗体（DAKO, Glostrup, Denmark）の存在下で4℃、1時間反応させ、トリス緩衝液-生理食塩水で洗浄し、抗マウスIgGに結合させた蛍光色素（Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG）にて処理した。洗浄処理後に、サンプルを蛍光試薬を含むイメージング試薬（DAPIを含むSlowFade Goldantifae）によって処理した。スライドグラスをオリンパスFV1000-D顕微鏡にて観察した。共局在化をウインドウズ版WinROOFイメージ解析ソフトウエア（三谷商事）にて解析した。各群について、肺組織の10個の顕微鏡視野をランダムに抽出し、盲験観察者によってEMTの評価を行った。
17. In vivo test of epithelial-mesenchymal transition (EMT)
On days 3, 7, and 14, pulmonary tissue removed from mice given saline (SAL / vehicle), BLM + vehicle (BLML / vehicle), or BLM + mouse-specific TGFβ1 siRNA (BLM / TGFβ1 siRNA) The mixture was treated with paraffin and washed several times with Tris buffer-saline. After washing, the sections were reacted with anti-prosurfactant C rabbit antiserum (Millipore, Bedford, MA) for 1 hour at 4 ° C, washed with Tris buffer-saline, and then bound to anti-rabbit IgG. And treated with a fluorescent dye (Alexa Fluor 594 anti-rabbit IgG). After further washing treatment, the sections were reacted for 1 hour at 4 ° C. in the presence of anti-α smooth muscle actin A4 mouse monoclonal antibody (DAKO, Glostrup, Denmark), washed with Tris buffer-saline, and anti-mouse IgG. It was treated with a fluorescent dye (Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG) conjugated to the. After the washing treatment, the sample was treated with an imaging reagent containing a fluorescent reagent (SlowFade Goldantifae containing DAPI). The slide glass was observed with an Olympus FV1000-D microscope. Co-localization was analyzed using the Windows version of WinROOF image analysis software (Mitani Corporation). For each group, 10 microscopic fields of lung tissue were randomly extracted and EMT was evaluated by blinded observers.
１８．マイクロRNAプロファイリング
BLMによって肺線維症を誘導し、BLM投与とは異なる日にマウスTGFβ1 siRNAまたは基剤で処理したマウスの肺組織から全RNAをトリゾール（TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA)）によって抽出した。RNAサンプルを3D-Gene miRNAマイクロアレイプラットフォーム（東レ）を用い、マイクロRNAプロファイリングに供した。生理食塩水を投与された無処理マウスのマイクロRNAプロファイリングについても実施した。マイクロRNAプロファイリングデータは、NCBI GEOデータベースに寄託されている（accession No GSE28122）。
１９．細胞株と培養条件
ヒト肺ガン由来肺胞上皮細胞株であるA549は、米国タイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection (Rockville, MD)）から入手し、マウス肺腫瘍細胞株であるLA-4は、大日本住友製薬から入手した。A549細胞は、10% FBS（加熱処理済）、50μg/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、0.1mM 非必須アミノ酸を含むDMEMを用い、加湿環境において5%二酸化炭素、95%空気の環境下で培養した。LA-4細胞は、10% FBS（加熱処理済）を含むF-12 HAM培養液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）にて培養した。コンフルエントとなるまで培養した後、0.02% EDTAを含む0.025% トリプシン溶液（ヘペス緩衝液-生理食塩水（Hepes-buffered saline (50 mM Hepes, 150 mM NaCl at pH 7.4)）にて短時間処理して細胞を回収し、5〜7日毎に継代した。
18. MicroRNA profiling
Pulmonary fibrosis was induced by BLM, and total RNA was extracted by trizol (TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)) From lung tissue of mice treated with mouse TGFβ1 siRNA or vehicle on a different day from BLM administration. RNA samples were subjected to microRNA profiling using 3D-Gene miRNA microarray platform (Toray). MicroRNA profiling of untreated mice receiving saline was also performed. MicroRNA profiling data has been deposited in the NCBI GEO database (accession No GSE28122).
19. Cell lines and culture conditions A549, a human lung cancer-derived alveolar epithelial cell line, was obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD). A mouse lung tumor cell line, LA-4, Obtained from Dainippon Sumitomo Pharma. A549 cells use DMEM containing 10% FBS (heat-treated), 50 μg / mL penicillin, 50 μg / mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 5% carbon dioxide, 95% air in a humid environment In the environment of LA-4 cells were cultured in F-12 HAM medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) containing 10% FBS (heat-treated). After culturing until confluent, treat with 0.025% trypsin solution containing 0.02% EDTA (Hepes-buffered saline (50 mM Hepes, 150 mM NaCl at pH 7.4)) for a short time. Cells were harvested and passaged every 5-7 days.
２０．TGFβ1 siRNAのインビトロ（in vitro）試験における阻害活性の測定
マウスTGFβ1 mRNAに対するsiRNAの活性評価をマウスLA-4細胞を用いて行い、ヒトTGFβ1 mRNAに対するsiRNAの活性評価をA549細胞を用いて行った。コンフルエント細胞を0.1% BSAを含むDMEM中において血清飢餓状態にて12時間培養した後、TGFβ1に対するsiRNA/DNAキメラまたはsiRNAを様々な濃度でリポフェクタミン（Lipofectamine）2000とOpti-MEMを用いて遺伝子導入した。6時間後に、細胞を回収し、TGFβ1 mRNAの発現量を評価した。
２１．siRNAがmRNAの発現を抑制することの確認
5'-RACE法（Rapid amplification of cDNA ends）を実施することによって、インビボ（in vivo）においてsiRNAがTGFβ1 mRNAの発現を抑制することを確認した。マウス肺から得られた2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。5'-full RACE Core Set（タカラバイオ）と5'末端リン酸化プライマー（5'-gATCCCGTTGATTTCCACGT-3'：配列番号１１）を用いて、最初のcDNAを調製した。このcDNA（2μL）を用いて第１回目のPCRを行った。このときのセンスプライーマの配列は、5'-GCAACAATTCCTGGCGTTACC-3'（配列番号１２）であり、アンチセンスプライマーの配列は、 5'-CACATGTTGCTCCACACTTGAT-3'（配列番号１３）であった。PCRの反応条件は、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて1分間を1サイクルとし、25サイクルを行った。次いで、第1回目のPCR産物（2μL）を用いて、第2回目のPCR（nested PCR）を行った。このときのセンスプライマーの配列は、 5'-CGTCACTGGAGTTGTACGGCA-3'（配列番号１４）であり、アンチセンスプライマーの配列は、 5'-TTAATCTCTGCAAGCGCAGC-3'（配列番号１５）であった。PCRの反応条件は、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて1分間を1サイクルとし、35サイクルを行った。PCR産物は、4%アガロースゲルを用いた電気泳動によって解析した。
20. Measurement of Inhibitory Activity in In Vitro Test of TGFβ1 siRNA The activity of siRNA against mouse TGFβ1 mRNA was evaluated using mouse LA-4 cells, and the activity of siRNA against human TGFβ1 mRNA was evaluated using A549 cells. Confluent cells were cultured in DMEM containing 0.1% BSA for 12 hours in serum-starved state, and then transfected with siRNA / DNA chimera or siRNA against TGFβ1 at various concentrations using Lipofectamine 2000 and Opti-MEM. . Six hours later, the cells were collected, and the expression level of TGFβ1 mRNA was evaluated.
21. Confirmation that siRNA suppresses mRNA expression
By performing 5′-RACE method (Rapid amplification of cDNA ends), it was confirmed that siRNA suppresses the expression of TGFβ1 mRNA in vivo. CDNA was synthesized using 2 μg of total RNA obtained from mouse lung. The first cDNA was prepared using 5′-full RACE Core Set (Takara Bio) and 5 ′ terminal phosphorylated primer (5′-gATCCCGTTGATTTCCACGT-3 ′: SEQ ID NO: 11). The first PCR was performed using this cDNA (2 μL). The sequence of the sense primer at this time was 5′-GCAACAATTCCTGGCGTTACC-3 ′ (SEQ ID NO: 12), and the sequence of the antisense primer was 5′-CACATGTTGCTCCACACTTGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 13). PCR reaction conditions were 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute for 25 cycles. Next, a second PCR (nested PCR) was performed using the first PCR product (2 μL). The sequence of the sense primer at this time was 5′-CGTCACTGGAGTTGTACGGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 14), and the sequence of the antisense primer was 5′-TTAATCTCTGCAAGCGCAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 15). PCR reaction conditions were 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute for 35 cycles. PCR products were analyzed by electrophoresis using 4% agarose gel.
２２．統計解析
全データは、平均値±標準誤差（mean ± standard error (s.e.m.)）によって示した。3個またはそれ以上の変数の統計的有意性は、チューキー検定（Tukey's test）を用いた事後解析（post hoc analysis）によって、分散分析を行うことによって評価した。2変数の統計的有意性は、マン・ホイットニーＵ検定（Mann-Whitney U test）によって評価した。生存曲線は、カプラン・メイヤー法（Kaplan-Meier method）によって計算し、有意差は、ログ・ランクテストで計算した。統計的有意差は、危険率5％（p＜0.05）にて評価した。解析には、マッキントッシュ用ソフトウエアのスタットビュー4.1（StatView 4.1）パッケージ(Abacus Concepts, Berkeley, CA)を用いた。
22. Statistical analysis All data were expressed as mean ± standard error (sem). Statistical significance of 3 or more variables was assessed by performing analysis of variance by post hoc analysis using Tukey's test. The statistical significance of the two variables was evaluated by the Mann-Whitney U test. Survival curves were calculated by the Kaplan-Meier method, and significant differences were calculated by the log rank test. Statistical significance was evaluated at a risk rate of 5% (p <0.05). For analysis, StatView 4.1 package (Abacus Concepts, Berkeley, CA) of Macintosh software was used.
＜試験結果＞
１．肺線維症のマウスモデルにおける繊維形成因子の配列変異
ブレオマイシンによって誘導されたマウス慢性肺線維症モデルを用いて繊維化因子を経時的に評価したところ、慢性期には、主として成長因子（CTGF、PDGF）とTGFβ1誘導転写因子Smad3が増加し、繊維化サイトカイン（CCL2）と凝固活性化物質（トロンビン・アンチトロンビン複合体、組織因子）は、急性期に有意に増加することが分かった。これに対し、TGFβ1は両期に増加したことから、TGFβ1がより一般的なターゲットであることが示唆された（図7、A〜N）。
２．肺細胞へのsiRNAの到達
Cy3標識TGFβ1 siRNA を気管支内投与した後に、siRNAが肺に到達したか否かを評価した。気管支内投与から3時間後に、肺胞および肺間質に蛍光が観察された（図8、A〜H）。
<Test results>
1. Sequence variation of fibrogenic factors in a mouse model of pulmonary fibrosis Fibrosis factors were evaluated over time using a mouse chronic pulmonary fibrosis model induced by bleomycin. In the chronic phase, growth factors (CTGF, PDGF) ) And TGFβ1-induced transcription factor Smad3, and fibrotic cytokines (CCL2) and coagulation activators (thrombin / antithrombin complex, tissue factor) were found to increase significantly in the acute phase. On the other hand, TGFβ1 increased in both phases, suggesting that TGFβ1 is a more general target (FIG. 7, A to N).
2. SiRNA reach to lung cells
After intrabronchial administration of Cy3-labeled TGFβ1 siRNA, it was evaluated whether the siRNA reached the lung. Fluorescence was observed in the alveoli and lung interstitium 3 hours after intrabronchial administration (FIGS. 8, A to H).
３．前繊維化因子に対するsiRNAの効果
肺線維症に対するsiRNA療法の有効性を確認するため、TGFβ1、CTGF、PDGF、CCL2及びTFに対するマウス特異的siRNAをデザインし、肺線維症における有効性を比較した（表1）。BLMの皮下投与開始から3日目（準急性期）、7日目（急性期）、及び14日目（慢性期）にエアロゾルによりsiRNAをそのまま投与した。各因子のタンパク質及びmRNA発現量は、コントロール群に比べて、対応するsiRNAを投与した群では、有意に減少した（図1A、図3A）。TGFβ1とCTGFに対しては、対応するsiRNAは、他の因子の場合よりも強いタンパク質の発現抑制効果が認められた（図1A、図93A,B）。このことから、これらの因子では、siRNAは、より強力にタンパク質の発現を抑制していると考えられる。組織学的及びアッシュクロフト・スコアを用いた定量化による肺繊維化と肺ハイドロプロリン量は、TGFβ1とCCL2 siRNA によって強く抑制されたものの、CTGF、PDGF及びTF siRNA では弱い抑制しか認められなかった（図1B,C）が、これらのsiRNAの多くは肺胞内の全タンパク量を減少させ、炎症性細胞による肺浸潤を抑制した（図9C、D）。次に、TGFβ1 siRNA に注目した試験を行った。これは、TGFβ1の肺での発現は、疾患の急性期及び慢性期のいずれでも維持されていたが、CCL2の肺における発現は、そうではなかったこと、及びCCL2 siRNA はBALFのCCL2タンパク質量を減少できなかったためである（図9C）。
3. Effect of siRNA on prefibrosis factor To confirm the effectiveness of siRNA therapy for pulmonary fibrosis, mouse-specific siRNAs for TGFβ1, CTGF, PDGF, CCL2 and TF were designed and compared for their effectiveness in pulmonary fibrosis ( table 1). On the 3rd day (quasi-acute phase), 7th day (acute phase), and 14th day (chronic phase) from the start of subcutaneous administration of BLM, siRNA was directly administered by aerosol. The protein and mRNA expression levels of each factor were significantly decreased in the group administered with the corresponding siRNA compared to the control group (FIGS. 1A and 3A). For TGFβ1 and CTGF, the corresponding siRNA was found to have a stronger protein expression inhibitory effect than other factors (FIGS. 1A and 93A, B). From these results, it is considered that siRNA suppresses protein expression more strongly in these factors. Lung fibrosis and pulmonary hydroproline levels quantified using histological and ashcroft scores were strongly suppressed by TGFβ1 and CCL2 siRNA, but only weak suppression was observed with CTGF, PDGF, and TF siRNA ( 1B and C), many of these siRNAs reduced total protein in the alveoli and suppressed lung infiltration by inflammatory cells (FIGS. 9C and D). Next, a test focusing on TGFβ1 siRNA was conducted. This is because the expression of TGFβ1 in the lung was maintained in both the acute and chronic phases of the disease, but the expression of CCL2 in the lung was not, and CCL2 siRNA reduced the amount of CCL2 protein in BALF. This is because it could not be reduced (FIG. 9C).
４．TGFβ1 siRNA の用量依存的な抑制効果
肺内にTGFβ1 siRNA を投与すると、0.5 mg/kg 及び 5 mg/kg の用量において用量依存的に、TGFβ1の発現と肺線維症の増悪を有意に効果を示した。TGFβ1の発現を有意に抑制するが、低用量のsiRNAでは、肺線維症を抑制しなかった（図2A,B,C）。混合siRNAはポジティブコントロール群に対して効果をしめさなかったことから、TGFβ1 siRNAが、特異的に効果を示すことが分かった。TGFβ1 mRNA がsiRNA によって抑制されることをインビボ（in vivo）試験において5'-RACE 法によって確認した（図2D）。
５．肺線維症の全ステージにおけるTGFβ1 siRNA の効果
急性期、慢性期、または両期において、TGFβ1 siRNA を投与すると、混合siRNAまたは基剤のみを投与したマウスに比べ、肺におけるTGFβ1の発現および肺線維症を有意に抑制した。更に、慢性期におけるsiRNAの単回投与だけでも、コントロールマウスに比べ、肺内のコラーゲン低下を有意に抑制した（図3A〜D）。
4). DGF-dependent inhibitory effect of TGFβ1 siRNA Intrapulmonary administration of TGFβ1 siRNA showed significant effects on TGFβ1 expression and exacerbation of pulmonary fibrosis at doses of 0.5 mg / kg and 5 mg / kg. It was. Although TGFβ1 expression was significantly suppressed, low-dose siRNA did not suppress pulmonary fibrosis (FIGS. 2A, B, and C). Since mixed siRNA did not show any effect on the positive control group, it was found that TGFβ1 siRNA showed a specific effect. Inhibition of TGFβ1 mRNA by siRNA was confirmed by 5′-RACE method in an in vivo test (FIG. 2D).
5. Effects of TGFβ1 siRNA in all stages of pulmonary fibrosis In the acute, chronic, or both phases, TGFβ1 siRNA administration and TGFβ1 expression in the lung and pulmonary fibrosis compared to mice receiving mixed siRNA or base alone Was significantly suppressed. Furthermore, even a single administration of siRNA in the chronic phase significantly suppressed the decrease in collagen in the lung compared to control mice (FIGS. 3A to 3D).
６．ヒトと齧歯類に共通な塩基配列を持つsiRNA及びsiRNA/DNAキメラの抑制活性
ヒト、マウス、及び／又はラットのsiRNA標的配列（表2）によって、インビボ（in vivo）試験において、上皮から間葉への変化を効果的に抑制した（図10A,B）。また、ヒト及びマウスTGFβ1及びSmad3遺伝子をターゲットとするsiRNA/DNAキメラについても評価をした（表3）。TGFβ1 siRNA/DNAキメラは、ヒト（A549）および齧歯類（LA-4）細胞株のいずれにおいてもTGFβ1の発現を有意に阻害した（図4A,B）。TGFβ1 siRNA/DNAキメラを気管支内投与するとTGFβ1の発現を有意に誘導した（図4C）。TGFβ1及びSmad3 siRNA/DNAキメラは、混合siRNAまたは基剤のみを投与したマウスに比較すると、肺線維症を有意に阻害することが、アッシュクラフト・スコア及び肺内のコラーゲンとヒドロキシプロリンの評価によって確認された（図4D,E）。
6). Inhibitory activity of siRNA and siRNA / DNA chimera having base sequences common to humans and rodents. From human, mouse, and / or rat siRNA target sequences (Table 2), from the epithelium in in vivo tests. The change to the leaf was effectively suppressed (FIGS. 10A and B). We also evaluated siRNA / DNA chimeras targeting human and mouse TGFβ1 and Smad3 genes (Table 3). The TGFβ1 siRNA / DNA chimera significantly inhibited TGFβ1 expression in both human (A549) and rodent (LA-4) cell lines (FIGS. 4A and B). Intrabronchial administration of TGFβ1 siRNA / DNA chimera significantly induced TGFβ1 expression (FIG. 4C). TGFβ1 and Smad3 siRNA / DNA chimeras significantly inhibited pulmonary fibrosis compared to mice receiving mixed siRNA or vehicle alone, as confirmed by Ashcraft score and assessment of collagen and hydroxyproline in the lung (Fig. 4D, E).
７．ヒトTGFβ1トランスジェニック（TG）マウスの作成
従来報告されているTGFβ1トランスジェニック（TG）マウスとは異なり、TGFβ1-BAC TGマウスは、全長のヒトTGFβ1遺伝子の発現量と、潜在型及び活性型TGFβ1タンパク質の濃度をいずれも上昇させ、ヒトの形態に近似していた。こうして、ヒトの状態に近いインビボ（in vivo）モデルとして肺線維症を研究するための良好なTGFβ1 TGマウスを確立した。このマウスは、BACを利用して、サーファクタント・タンパク質C（SP-C）のプロモータの下流にヒトTGFβ1を配置した作成されたものである（図5A〜D）（非特許文献５、６）。このTGマウスは、肺の発達段階においてTGFβ1の過剰発現による胚致死性のものではなかったが、10週齢において肺炎症と肺線維症が増悪する（図5E,F）（非特許文献７）。導入された遺伝子は肺のみで特異的に発現し（図5G）、全TGFβ1及び活性型TGFβ1濃度は肺液中で増加した（図5H）。
7). Generation of human TGFβ1 transgenic (TG) mice Unlike the previously reported TGFβ1 transgenic (TG) mice, TGFβ1-BAC TG mice show the expression level of full-length human TGFβ1 gene and latent and active TGFβ1 proteins. The concentrations of both were increased to approximate human morphology. Thus, good TGFβ1 TG mice were established to study pulmonary fibrosis as an in vivo model that approximates the human condition. This mouse was prepared by placing human TGFβ1 downstream of the surfactant protein C (SP-C) promoter using BAC (FIGS. 5A to 5D) (Non-patent Documents 5 and 6). Although this TG mouse was not embryonic lethal due to overexpression of TGFβ1 at the stage of lung development, lung inflammation and lung fibrosis worsened at 10 weeks of age (FIGS. 5E and F) (Non-patent Document 7) . The introduced gene was specifically expressed only in the lung (FIG. 5G), and the total TGFβ1 and active TGFβ1 concentrations increased in the lung fluid (FIG. 5H).
８．ヒト特異的TGFβ1 siRNAは、自然発症性肺線維症を持つヒトTGFβ1 BAC TGマウスにおいて、放射性及び肺機能パラメータの評価によって、良好な結果を示す
インビトロ（in vitro）試験でヒト特異的siRNAの活性を評価した後、肺炎症／肺線維症を発症するヒトTGFβ1TGマウスを用いて、肺線維症に対するヒト特異的siRNAの効果を評価した（表4）。最も強いインヒビターは、siRNA13であり、0.01nMでも活性を示した（図11A〜D）。マイクロCTによって肺炎症／線維症が認められた10週齢ヒトTGFβ1-BAC TGマウスを用いて、siRNA13の阻害活性を評価した。ブラインドテストによってマウスをランダムに2群に分け、一方の群にはTGFβ1 siRNAを経気管支的に投与し（週1回×3週間）、他方の群には同様のプロトコールで基剤のみを投与した。最終投与から1週間後に動物を絶命させた。肺線維症の変化をCTと組織学的試験によって評価したところ、基剤のみを投与した群に比べ、TGFβ1 siRNA13 を投与した群では、有意に良好な結果が認められた（図6A〜C）。基剤を投与したTGマウスでは、野生型マウス（ネガティブコントロール）に比べて、有意に血中酸素濃度が低下した（図6D）。TGFβ1 siRNA13を投与したTGマウスでは、野生型マウスと同等の血中酸素濃度を維持していた（図6D）。
8). Human-specific TGFβ1 siRNA shows good results in human TGFβ1 BAC TG mice with spontaneous pulmonary fibrosis by evaluating radioactivity and pulmonary function parameters In vitro studies show human-specific siRNA activity After the evaluation, human TGFβ1TG mice that developed pulmonary inflammation / pulmonary fibrosis were used to evaluate the effect of human-specific siRNA on pulmonary fibrosis (Table 4). The strongest inhibitor was siRNA13, which also showed activity at 0.01 nM (FIGS. 11A-D). Inhibitory activity of siRNA13 was evaluated using 10-week-old human TGFβ1-BAC TG mice in which pulmonary inflammation / fibrosis was observed by micro CT. Mice were randomly divided into two groups by blind test, one group received TGFβ1 siRNA transbronchially (once a week x 3 weeks), and the other group received only the base using the same protocol. . Animals were killed one week after the last dose. When changes in pulmonary fibrosis were evaluated by CT and histological examination, significantly better results were observed in the group administered with TGFβ1 siRNA13 than in the group administered only with the base (FIGS. 6A to C). . In the TG mice to which the vehicle was administered, the blood oxygen concentration was significantly reduced compared to the wild-type mice (negative control) (FIG. 6D). In TG mice administered with TGFβ1 siRNA13, the blood oxygen concentration was maintained to be equivalent to that of wild-type mice (FIG. 6D).
９．ヒト特異型TGFβ1 siRNAは、BLM投与されたヒトTGFβ1-BAC TGマウスの生存曲線を向上させる
ヒトTGFβ1-BAC TGマウスは、10週齢から徐々に肺線維症を発症させ、16〜18週齢において死亡する。BLM(80 mg/kg mouse)を皮下投与すると、肺線維症を増悪させ、TGマウスを死亡させる。生存曲線に対する影響を評価するため、ヒトTGFβ1-BAC TGマウスをランダムに2群に分類し、一方の群には、BLM投与から0,3,7及び14日目にヒト特異的TGFβ1 siRNA(No.13)を経気管支投与し、他方の群には、同様のプロトコールで基剤のみを投与した。ヒト特異的TGFβ1 siRNAの肺への投与によって、TGマウスの生存曲線は有意に向上し、肺中のヒドロキシプロリン濃度及びコラーゲン量も好転した（図6,F,G,H）。
１０．TGFβ1 siRNAのオフターゲット作用
TGFβ1 siRNAのオフターゲット作用を確認するため、通常マウスに対して、マウス特異的TGFβ1 siRNAを経気管支投与し、肺中のサイトカインの発現を測定した。通常マウスにTGFβ1 siRNAを経気管支投与したところ、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-βの肺中濃度は、いずれも有意に増加せず、TGFβ1のBALF濃度は、コントロール群に比べ、TGFβ1 siRNAを投与した群では、有意に（完全にではないものの）阻害された（図12）。
9. Human-specific TGFβ1 siRNA improves the survival curve of BLM-administered human TGFβ1-BAC TG mice Human TGFβ1-BAC TG mice gradually develop pulmonary fibrosis from 10 weeks of age, and at 16-18 weeks of age Die. Subcutaneous administration of BLM (80 mg / kg mouse) exacerbates pulmonary fibrosis and kills TG mice. To assess the effects on survival curves, human TGFβ1-BAC TG mice were randomly divided into two groups, one group containing human-specific TGFβ1 siRNA (No. 0, 3, 7 and 14 days after BLM administration). .13) was transbronchially administered, and the other group received the base alone according to the same protocol. Administration of human-specific TGFβ1 siRNA to the lung significantly improved the survival curve of TG mice, and also improved the hydroxyproline concentration and collagen content in the lung (FIG. 6, F, G, H).
10. Off-target action of TGFβ1 siRNA
In order to confirm the off-target action of TGFβ1 siRNA, mouse-specific TGFβ1 siRNA was transbronchially administered to normal mice, and cytokine expression in the lung was measured. When TGFβ1 siRNA was transbronchially administered to normal mice, the IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-α, and IFN-β concentrations in the lung did not increase significantly, and the TGFβ1 BALF concentration was Compared with the control group, the TGFβ1 siRNA-administered group was significantly (but not completely) inhibited (FIG. 12).
１１．Smad3 siRNAのインビボ（in vivo）試験での抑制活性
Smad3を標的としたsiRNAを経気管支投与すると、肺内TGFβ1の発現と肺中コラーゲン沈澱量を僅かに抑制した（図13 A-D）。
１２．TGFβ1 siRNAは、前繊維化miRNAを抑制する
異なるステージにおいてマウス特異的TGFβ1 siRNAを投与したマウス、及び異なるステージにおいてヒト特異的TGFβ1 siRNAを投与した hTGFβ1-BAC TGマウスを用いて、前繊維化miR-21 miRNAの発現パターンを評価した。野生型マウスにBLMを投与した肺線維症モデルマウスを用いた場合には、全てのステージにおいて、TGFβ1 siRNAは、前繊維化miR-21 miRNAの肺での発現を抑制し（図14A、B）、hTGFβ1 siRNA 13は、hTGFβ1-BAC TGマウスの前繊維化miR-21 miRNAの肺での発現を抑制した（図15A、B：GEO data base accession No GSE28122）。
このように本願実施形態によれば、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供できた。このTGマウスを用いることにより、呼吸器関連疾患（肺線維症、気管支喘息、肺ガン、COPDなどを含む）に関する研究を飛躍的に発展させられる。
11. Inhibitory activity of Smad3 siRNA in in vivo tests
Transbronchial administration of siRNA targeting Smad3 slightly suppressed the expression of TGFβ1 in the lung and the amount of collagen precipitation in the lung (FIG. 13 AD).
12 TGFβ1 siRNA represses prefibrotic miRNAs using prefibrotic miR- mice using mice that received mouse-specific TGFβ1 siRNA at different stages and hTGFβ1-BAC TG mice that received human-specific TGFβ1 siRNA at different stages. 21 miRNA expression patterns were evaluated. When pulmonary fibrosis model mice were administered BLM to wild-type mice, TGFβ1 siRNA suppressed the expression of prefibrotic miR-21 miRNA in the lung at all stages (FIGS. 14A and B). HTGFβ1 siRNA 13 suppressed the expression of prefibrotic miR-21 miRNA in hTGFβ1-BAC TG mice in the lung (FIG. 15A, B: GEO data base accession No GSE28122).
Thus, according to the present embodiment, it was possible to provide a TG mouse that expresses TGFβ1 specifically in the lung and spontaneously develops pulmonary fibrosis. By using these TG mice, research on respiratory-related diseases (including pulmonary fibrosis, bronchial asthma, lung cancer, COPD, etc.) can be greatly developed.
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