JP2013032306A - 新規チオオリゴ糖の合成とそれを用いたセルラーゼの活性測定法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＣＢＨ ＩとＣＢＨ IIの反応特異性を識別できる新たな基質及びそれを用いたＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの活性測定法を提供する。
【解決手段】次の一般式（１）

（式中、Ｇ¹及びＧ²の少なくとも一方はセロビオース残基を示し、残余は単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示し、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ水素原子、単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示す。）
で表されるチオグリコシド化合物。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なチオグリコシド化合物及びこれを用いたセロビオヒドロラーゼＩ及び／又はセロビオヒドロラーゼIIの活性測定法に関する。

セルロースは、オリゴ糖や単糖類を製造するためのバオマス原料として注目されており、このセルロースを分解する酵素がセルラーゼである。セルラーゼとはセルロースに対して何らかの分解活性を示す酵素の総称であり、そのうち、セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨ Ｉ）とセロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ II）はセルラーゼの大部分（両者で８０％以上、この他にエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどが少量含まれる）を占める主要酵素である。従って、セルラーゼの中で最も重要な成分であり、特に結晶性セルロースの酵素分解にはセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨ Ｉ）とセロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ II）の比率（組成比）が大きく影響すると考えられ、そのための最適組成比が検討されてきた（非特許文献１、２、３、４）。

しかし、ＣＢＨ ＩおよびＣＢＨ IIは、その基質特異性が極めて近似していることから、これまで活性測定に用いられてきた化合物（基質）では両者の活性を別々に評価することはほとんど不可能であった。放射化標識したオリゴ糖やパラニトロフェニル基などの発色団を結合したオリゴ糖などを基質とした活性評価から、ＣＢＨ Ｉはセルロースの非還元末端側からセロビオ―ス単位で分解するのに対し、ＣＢＨ IIは逆に還元末端からセロビオース単位で分解するとの推定もなされているが、これらの基質では特異性、定量性が低く、また、汎用性も低いことから十分な解析には至っていない（非特許文献５）。

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このようにＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの反応の特異性を明確に識別できる簡便な基質は存在せず、従って、ＣＢＨ ＩとＣＢＨ IIの反応特性に関する多くの課題、例えばＣＢＨ ＩとＣＢＨ IIの分別活性測定法、セルラーゼ中のＣＢＨ ＩとＣＢＨ IIの含有量の測定等は手つかずの状況にあった。
従って、本発明の課題は、ＣＢＨ ＩとＣＢＨ IIの反応特異性を識別できる新たな基質及びそれを用いたＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの活性測定法を提供することにある。

そこで本発明者は、ＣＢＨ ＩとＣＢＨ IIの新たな基質を見出すべく種々検討したところ、セロビオース残基と単糖又はオリゴ糖とをチオエーテル結合で連結させたチオグリコシド化合物が、その構造によりＣＢＨ Ｉ又はＣＢＨ IIのいずれか一方に高い反応性を有し、これらのチオグリコシド化合物を用いればセルラーゼ中のＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの活性は含有量が分別して測定できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の一般式（１）

（式中、Ｇ¹及びＧ²の少なくとも一方はセロビオース残基を示し、残余は単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示し、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ水素原子、単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示す。）
で表されるチオグリコシド化合物を提供するものである。

また本発明は、上記一般式（１）で表されるチオグリコシド化合物にセルラーゼを作用させることを特徴とするセロビオヒドロラーゼＩ及び／又はセロビオヒドロラーゼIIの活性測定法を提供するものである。
また、本発明は、上記一般式（１）で表されるチオグリコシド化合物にセルラーゼを作用させることを特徴とするセルラーゼ中のセロビオヒドロラーゼＩ及び／又はセロビオヒドロラーゼII含有量の測定法を提供するものである。
また、本発明は、上記一般式（１）で表されるチオグリコシド化合物を含有するセロビオヒドロラーゼＩ及び／又はセロビオヒドロラーゼIIの活性測定試薬を提供するものである。

本発明のチオグリコシド化合物（１）は、ＣＢＨ Ｉ又はＣＢＨ IIのいずれか一方に対する反応性が高い。従って、チオグリコシド化合物（１）を用いれば、セルラーゼ中のＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの分別活性測定及び酵素液中の両者の含有量比が簡便に測定できる。

化合物（１）を用いた時のＣＢＨ Ｉ濃度と反応時間の関係を示す図である。 化合物（１）に対しＣＢＨ Ｉを用いた時の直線相関を示す酵素反応条件を示す図である（１０ｍｇ／２０μＬ）。 化合物（１）に対しＣＢＨ Ｉを用いた時の直線相関を示す酵素反応条件を示す図である（１ｍｇ／２０μＬ）。 化合物（１）を用いた時のＣＢＨ II濃度と反応時間の関係を示す図である。 化合物（１）に対しＣＢＨ IIを用いた時の直線相関を示す酵素反応条件を示す図である（１０ｍｇ／２０μＬ）。 化合物（１）に対しＣＢＨ IIを用いた時の直線相関を示す酵素反応条件を示す図である（１ｍｇ／２０μＬ）。 化合物（１）に対して、ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの混合酵素を用いた時の酵素活性を示す図である。 化合物（２）に対して、ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの混合酵素を用いた時の酵素活性を示す図である。

本発明のチオグリコシド化合物は、前記一般式（１）で表され、セロビオース残基の非還元末端及び／又は還元末端にチオグリコシド結合を介して単糖又はオリゴ糖が結合した化合物である。

一般式（１）中、Ｇ¹及びＧ²の少なくとも一方はセロビオース残基を示し、残余は単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示す。ここで、２糖以上のオリゴ糖残基は、セロビオース以外の２〜４糖のオリゴ糖残基が好ましい。

ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIのいずれか一方に対する高い反応性を考慮すれば、Ｇ¹及びＧ²のいずれか一方がセロビオース残基であり、他方が単糖残基又はセロビオース以外の２〜４糖残基が好ましい。さらにＧ¹及びＧ²のいずれか一方がセロビオース残基であり、他方が単糖残基であるのが、合成のし易さ、セロビオースを作用させた後の遊離成分の定量のし易さ等の点で好ましい。

前記単糖残基としてはグルコース、ガラクトース等の単糖残基が挙げられる。また、２糖以上のオリゴ糖残基としては、Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｘｙｌ−Ｇｌｃ等が挙げられる。これらの糖残基のうち、グルコースまたはガラクトース残基が特に好ましい。

一般式（１）中、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ水素原子、単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示す。このうち、水素原子、単糖残基又はセロビオース以外の２〜４糖残基が好ましく、特に水素原子が好ましい。ここで単糖残基及び２糖以上のオリゴ糖残基としては、前記Ｇ¹及びＧ²で示したものと同じものが挙げられる。

一般式（１）におけるより好ましい態様としては、Ｘ¹及びＸ²が水素原子であり；Ｇ¹及びＧ²の少なくとも一方がセロビオース残基であり、残余が単糖残基又はセロビオース以外の２〜４糖残基であるチオグリコシド化合物である。
また、Ｘ¹及びＸ²が水素原子であり；Ｇ¹及びＧ²のいずれか一方がセロビオース残基であり、他方が単糖残基又はセロビオース以外の２糖残基であるチオグリコシド化合物がさらに好ましい。
さらに、Ｘ¹及びＸ²が水素原子であり；Ｇ¹又はＧ²のいずれか一方がセロビオース残基であり、他方が単糖残基であるチオグリコシド化合物が特に好ましい。

本発明のチオグリコシド化合物（１）は、例えば次の反応式に従って製造することができる。

本発明のチオグリコシド化合物（１）は、例えば次の反応式に従って製造することができる。

（Ｘ^1a、Ｘ^2a、Ｇ^1a及びＧ^2aは、前記のＸ¹、Ｘ²、Ｇ¹及びＧ²の水酸基が保護された糖残基を示す。ただし、Ｘ¹及びＸ²が水素原子の場合は、Ｘ^1a及びＸ^2aは水素原子である。）

すなわち、保護されたアセチルチオオリゴ糖又はアセチルチオ単糖（２）に、単糖又はオリゴ糖（３）を反応させて保護されたチオグリコシド化合物（１ａ）を得、次いで保護基を脱離させることにより、本発明のチオグリコシド化合物（１）が得られる。

水酸基の保護基としては、ベンゾイル基、アセチル基等のアシル基が用いられる。また、化合物（２）と化合物（３）の縮合反応に際しては、化合物（３）の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、メタンスルホニル基等に活性化するのが好ましい。

縮合反応は、トリフルオロメタンスルホニル基等の活性体を用いた場合にはピリジン等の溶媒中、０℃〜室温で撹拌すればよい。

また、保護基の脱離反応は、例えばナトリウムアルコキシド等の塩基の存在下に加水分解反応に付せばよい。

得られたチオグリコシド化合物（１）は、イオン交換樹脂、カラムクロマトグラフィー等により精製するのが好ましい。

本発明のチオグリコシド化合物（１）は、一般式（１）中の硫黄原子のいずれか一方にセロビオース残基を有するため、ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの基質となる。そして、チオグリコシド化合物（１）は、ＣＢＨ ＩとＣＢＨ IIに対する反応性が大きく相違するため、ＣＢＨ Ｉ及び／又はＣＢＨ IIの活性測定、セルラーゼ中のＣＢＨ Ｉ及び／又はＣＢＨ IIの含有量の測定に有用であり、特にＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの分別活性測定、セルラーゼ中のＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの分別含有量の測定に有用である。

チオグリコシド化合物（１）を用いてＣＢＨ Ｉ及び／又はＣＢＨ II活性又はその含有量を測定するには、チオグリコシド化合物（１）にＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIを含有するセルラーゼを作用させ、分解により得られた単糖類又はオリゴ糖類の含有量を定量すればよい。ＣＢＨ Ｉに特異性の高いチオグリコシド化合物（１）を用いた場合には、ＣＢＨ Ｉ活性が選択的に測定できる。一方、ＣＢＨ IIに特異性の高いチオグリコシド化合物（１）を用いた場合にはＣＢＨ II活性が選択的に測定できる。分解により生じた単糖類又はオリゴ糖類の定量は、常法、例えばイオンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより行うことができる。なお、酵素反応は、セルラーゼの種類によって異なるが、セルラーゼが作用する条件、例えばｐＨ５〜９、２０〜６０℃の条件で５分〜２時間行えばよい。

チオグリコシド化合物（１）を含有する試薬は、ＣＢＨ Ｉ及び／又はＣＢＨ II活性測定試薬、特にＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ II分別活性測定試薬として有用である。この試薬には、チオグリコシド化合物（１）の他、緩衝剤、プロトコール等が含まれる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において、ＮＭＲは、Bruker社製AVANCE-500、AV-400を用い、室温にて測定した。CDCl₃を溶媒に用いたとき、内部標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）＝０ｐｐｍを用いた。CD₃ODおよびD₂Oを溶媒に用いたときは、それぞれCH₃OD(3.30 ppm)およびHOD(4.80 ppm)を基準にした。シグナルの同定に際し、次の略号を使用した。s = singlet, d = doublet, t = triplet, m = multiplet, dd = doublet of doublets, br = broad。質量分析装置ESI-FT-MSは、Bruker社製APEX II 70eを用いた。旋光度計は、日本分光社製のＰ−１０２０−ＧＴを用いた。カラムクロマトグラフィーの充填剤として、ナカライテスク（株）silica gel 60（２３０〜４００ｍｅｓｈ）を用いた。TLCはMerck社製silica gel 60 F254を用いた。さらに、溶媒及び試薬は市販の試薬グレードを用いた。

また、次の略号を使う。
アセチル（Ac）
アリール（Ar）
ベンゾイル（Bz）
ベンゾイルクロライド（BzCl）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）
エチル（Et）
酢酸エチル（EtOAc）
ジェミナル（gem）
ノルマルヘキサン（n-hexane）
メチル（Me）
メタノール（MeOH）
フェニル（Ph）
ピリジン（Pyr）
室温（r.t.）
トリフルオロメタンスルホニル（Tf）
以下に実施例の目的化合物を示す。

非還元末端に４−チオグルコースを有するオリゴ糖（1, 3, 4）の合成手順を示す。

非還元末端に４'−チオセロビオースを有するオリゴ糖（2, 5）の合成手順を示す。

実施例１
チオグリコシドを有する化合物（１）〜（５）の合成
（１）化合物（10）の合成
D-ガラクトース ((9), 1.80 g, 10.0 mmol)をピリジン(36 mL)に溶かし、BzCl (4.88 mL, 42.0 mmol) を−40 ℃で７分かけて滴下した。−40 ℃で３０分攪拌した後、１２時間かけて10 ℃まで昇温した。さらに室温で７時間攪拌した後、反応液を氷で冷やした２Ｎ塩酸水で洗い、酢酸エチルで抽出した。減圧濃縮後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トルエン１：１０から１：４）にて精製し、化合物(10)(1.56g, 26.1%, α:β= 77:23)と、化合物(11) (4.87g, 69.4%, α:β= 94:6)を得た。異性体混合物である化合物(10)は、再度カラムクロマトグラフィーで精製しそれぞれのアノマーを単離した。
化合物(10α): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ2.85 (br, 1H, 4-OH), 4.49 (dd, 1H, J_5,6A 6.0 Hz, J_gem 10.8 Hz, H-6A), 4.51 (br d, 1H, H-4), 4.55 (br t, 1H, H-5), 4.78 (dd, 1H, J_5,6B 6.8 Hz, J_gem 10.8 Hz, H-6B), 5.89 (dd, 1H, J_2,3 10.8 Hz, J_3,4 2.8 Hz, H-3), 6.07 (dd, 1H, J_1,2 3.6 Hz, J_2,3 10.8 Hz, H-2), 6.83 (d, 1H, J_1,2 3.6 Hz, H-1), 7.16-7.30, 7.37-7.65, 7.84-7.88, 7.97-8.03, 8.08-8.12 (each m, 20H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ62.5 (C-6), 67.2 (C-2), 67.5 (C-4), 70.5 (C-5), 70.8 (C-3), 90.9 (C-1), 128.2, 128.37, 128.41, 128.5, 128.6, 128.65, 128.72, 128.95, 129.03, 129.2, 129.3, 129.7, 129.8, 129.86, 129.91, 130.2, 133.3, 133.4, 133.6, 133.8 (each Ar), 164.6, 165.5, 166.0, 166.6 (each PhCO); ESI-FT-MS, calcd. for C₃₄H₂₈O₁₀Na⁺ (M + Na)⁺: 619.1580, found: 619.1579; [α]_D +161 (c 1.14, CHCl₃).
化合物(10β): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ2.73 (d, 1H, J_4,4-OH 4.8 Hz, 4-OH), 4.29 (br t, 1H, H-5), 4.42 (br t, 1H, H-4), 4.55 (dd, 1H, J_5,6A 5.8 Hz, J_gem 11.6 Hz, H-6A), 4.78 (dd, 1H, J_5,6B 6.8 Hz, J_gem 11.6 Hz, H-6B), 5.51 (dd, 1H, J_2,3 10.0 Hz, J_3,4 3.2 Hz, H-3), 6.12 (dd, 1H, J_1,2 8.4 Hz, J_2,3 10.0 Hz, H-2), 6.19 (d, 1H, J_1,2 8.4 Hz, H-1), 7.17-7.64, 7.90-8.13 (each m, 20H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ62.3 (C-6), 67.1 (C-4), 68.5 (C-2), 73.4 (C-5), 73.8 (C-3), 93.1 (C-1), 125.3, 128.2, 128.4, 128.5, 128.56, 128.60, 128.9, 129.0, 129.4, 129.7, 129.89, 129.92, 130.2, 133.3, 133.4, 133.6, 133.8 (each Ar), 164.8, 165.3, 165.7, 166.6 (each PhCO); [α]_D +24.1 (c 0.53, CHCl₃).

（２）化合物（13）の合成
化合物(10α)(900 mg, 1.51 mmol)をピリジン(18 mL)に溶かし、Tf₂O (382 μL, 2.27 mmol)を0 ℃にて加えた。0 ℃で３０分攪拌した後さらにTf₂O (254 μL, 1.51 mmol)を追加した。引き続き３０分0 ℃で攪拌した後、n-hexane (30 mL)とEtOAc (30 mL)で希釈し、氷水(100 mL)で洗い、酢酸エチルにて抽出した。減圧濃縮後、得られた残渣は真空(2 mmHg)で１時間乾燥させスラリー状の化合物(12)（953 mg）を得た。これはこれ以上精製をせず次の反応に用いた。クルードの化合物(12)(317.7 mg)と化合物(6)(629 mg, 0.905 mmol)（非特許文献１，２参照）をDMF (6 mL)に溶解し、Et₂NH (600 μL)を−5 ℃で加えた。−5 ℃で12時間攪拌した後、室温でさらに20分間攪拌した。反応液はn-hexane (30 mL)とEtOAc (30 mL)で希釈し、氷水(100 mL)で洗い、酢酸エチルにて抽出した。減圧濃縮後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ノルマルヘキサン１：３から１：１）にて精製し、化合物(13)(87.6mg, 21.6% 10αの回収率換算の収率)と原料(10α)(104mg, 34.7% 回収率) を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ1.55, 1.85, 1.95, 1.97, 1.99, 2.01, 2.08 (each s, 21H, 7CH ₃CO), 3.42-3.46 (m, 1H, H-b5), 3.47 (t, 1H, J_a3,a4 = J_a4,a5 11.2 Hz, H-a4), 3.60 (t, 1H, J_b3,b4 = J_b4,b5 9.2 Hz, H-b4), 3.60-3.65 (m, 1H, H-c5), 3.77 (dd, 1H, J_b5,b6A 6.8 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6A), 4.00 (dd, 1H, J_c5,c6A 2.0 Hz, J_gem 12.4 Hz, H-c6A), 4.29 (dd, 1H, J_b5,b6B 2.0 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6B), 4.35 (dd, 1H, J_c5,c6B 4.4 Hz, J_gem 12.4 Hz, H-c6B), 4.43 (d, 1H, J_c1,c2 8.0 Hz, H-c1), 4.69 (br d, 2H, H-a5 and H-a6A), 4.84 (dd, 1H, J_b1,b2 10.0 Hz, J_b2,b3 9.2 Hz, H-b2), 4.88 (dd, 1H, J_a5,a6B 2.4 Hz, J_gem 11.6 Hz, H-a6B), 4.92 (dd, 1H, J_c1,c2 8.0 Hz, J_c2,c3 9.2 Hz, H-c2), 5.00 (d, 1H, J_b1,b2 10.0 Hz, H-b1), 5.06 (t, 1H, J_c3,c4 = J_c4,c5 9.2 Hz, H-c4), 5.13 (t, 1H, J_c2,c3 = J_c3,c4 9.2 Hz, H-c3), 5.20 (t, 1H, J_b2,b3 = J_b3,b4 9.2 Hz, H-b3), 5.88 (dd, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, J_a2,a3 9.8 Hz, H-a2), 6.18 (dd, 1H, J_a2,a3 9.8 Hz, J_a3,a4 11.2 Hz, H-a3), 6.80 (d, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1), 7.28-7.69, 7.84-7.88, 7.98-8.03, 8.06-8.13 (each m, 20H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ19.9, 20.39, 20.47, 20.49, 20.54, 20.7 (each CH₃CO), 45.8 (C-a4), 61.5 (C-c6), 61.8 (C-b6), 63.4 (C-a6), 67.1 (C-a3), 67.7 (C-c4), 69.8, (C-b2), 71.65 (C-c2), 71.72 (C-a2), 72.0 (C-c5), 72.3 (C-a5), 73.0 (C-c3), 73.4 (C-b3), 76.6 (C-b4), 76.7 (C-b5), 81.2 (C-b1), 90.5 (C-a1), 101.1 (C-c1), 128.45, 128.49, 128.6, 128.9, 129.1, 129.7, 129.78, 129.81, 129.9, 133.3, 133.5, 133.6, 134.2 (each Ar), 164.1, 165.4, 165.6, 166.0 (each PhCO), 168.9, 169.3, 169.5, 169.6, 169.9, 170.2, 170.5 (each CH₃ CO); ESI-FT-MS, calcd. for C₆₀H₆₂O₂₆SNa⁺ (M + Na)⁺: 1253.3148, found: 1253.3146; [α]_D +45.1 (c 0.92, CHCl₃).

（３）化合物（14）の合成
クルードの化合物(12)(317.7 mg) と化合物(7)(368 mg, 0.905 mmol)を用いて、化合物(13)の合成と同様に反応及び精製を行い、化合物(14)(96.6mg, 65.7% (10α)の回収率換算の収率)を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ1.60, 1.83, 1.95, 2.02 (each s, 12H, 4CH ₃CO), 3.50 (t, 1H, J_a3,a4 = J_a4,a5 11.2 Hz, H-a4), 3.50-3.55 (m, 1H, H-b5), 3.85-3.93 (m, 1H, H-b6), 4.62-4.68 (m, 1H, H-a5), 4.75 (dd, 1H, J_a5,a6A 1.8 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-a6A), 4.87 (dd, 1H, J_a5,a6B 4.0 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-a6B), 4.89-4.94 (m, 2H, H-b2 and H-b4), 4.98 (d, 1H, J_b1,b2 10.0 Hz, H-b1), 5.19 (t, 1H, J_b2,b3 = J_b3,b4 9.2 Hz, H-b3), 5.60 (dd, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, J_a2,a3 9.8 Hz, H-a2), 6.17 (dd, 1H, J_a2,a3 9.8 Hz, J_a3,a4 11.2 Hz, H-a3), 6.81 (d, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1), 7.27-7.70, 7.85-7.88, 7.99-8.03, 8.06-8.13 (each m, 20H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ20.0, 20.4, 20.5, 20.6 (each CH₃CO), 46.0 (C-a4), 62.0 (C-b6), 63.4 (C-a6), 67.3 (C-a3), 68.3 (C-b4), 69.6 (C-b2), 71.7 (C-a2), 72.4 (C-a5), 73.6 (C-b3), 75.8 (C-b5), 81.8 (C-b1), 90.5 (C-a1), 128.4, 128.5, 128.6, 128.9, 129.1, 129.7, 129.78, 129.82, 129.9, 133.3, 133.5, 133.6, 134.1 (each Ar), 164.2, 165.4, 165.7, 165.9 (each PhCO), 169.25, 169.32, 170.0, 170.2 (each CH₃ CO); ESI-FT-MS, calcd. for C₄₈H₄₆O₁₈SNa⁺ (M + Na)⁺: 965.2303, found: 965.2304; [α]_D +92.1 (c 1.53, CHCl₃).

（４）化合物（15）の合成
クルードの化合物(12)(317.7 mg) と化合物 8 (629 mg, 0.905 mmol)を用いて、化合物(13)の合成と同様に反応及び精製を行い、化合物(15)(104mg, 26.4% 10αの回収率換算の収率)を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ1.56, 1.84, 1.970, 1.972, 1.99, 2.05, 2.17 (each s, 31H, 7CH ₃CO), 3.45-3.50 (m, 1H, H- b5), 3.48 (t, 1H, J_a3,a4 = J_a4,a5 11.2 Hz, H-a4), 3.62 (t, 1H, J_b3,b4 = J_b4,b5 9.2 Hz, H-b4), 3.78 (dd, 1H, J_b5,b6A 6.8 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6A), 3.85 (br t, 1H, H-c5), 4.07-4.13 (m, 1H, H-c6AB), 4.27 (dd, 1H, J_b5,b6B 2.0 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6B), 4.41 (d, 1H, J_c1,c2 7.6 Hz, H-c1), 4.67-4.72 (br d, 2H, H-a5 and H-a6A), 4.84 (dd, 1H, J_b1,b2 10.4 Hz, J_b2,b3 9.2 Hz, H-b2), 4.88 (dd, 1H, J_a5,a6B 4.0 Hz, J_gem 12.8 Hz, H-a6B), 4.94 (dd, 1H, J_c2,c3 10.4 Hz, J_c3,c4 3.6 Hz, H-c3), 5.01 (d, 1H, J_b1,b2 10.4 Hz, H-b1), 5.10 (dd, 1H, J_c1,c2 7.6 Hz, J_c2,c3 10.4 Hz, H-c2), 5.22 (t, 1H, J_b2,b3 = J_b3,b4 9.2 Hz, H-b3), 5.34 (dd, 1H, J_c3,c4 3.6 Hz, J_c4,c5 0.8 Hz, H-c4), 5.59 (dd, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, J_a2,a3 10.0 Hz, H-a2), 6.18 (dd, 1H, J_a2,a3 10.0 Hz, J_a3,a4 11.2 Hz, H-a3), 6.81 (d, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1), 7.28-7.70, 7.84-7.88, 7.98-8.03, 8.06-8.13 (each m, 20H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ19.9, 20.4, 20.5, 20.57, 20.64, 20.65, 20.7 (each CH₃CO), 45.8 (C-a4), 60.8 (C-c6), 62.0 (C-b6), 63.4 (C-a6), 66.4 (C-c4), 67.1 (C-a3), 69.1 (C-c2), 69.9 (C-b2), 70.8 (C-c5), 71.0 (C-c3), 71.7 (C-a2), 72.3 (C-a5), 73.7 (C-b3), 76.4 (C-b4), 76.7 (C-b5), 81.2 (C-b1), 90.5 (C-a1), 101.4 (C-c1), 127.9, 128.45, 128.49, 128.6, 128.9, 129.1, 129.7, 129.78, 129.81, 129.9, 133.3, 133.5, 133.6, 134.2 (each Ar), 164.1, 165.4, 165.6, 166.0 (each PhCO), 168.9, 169.5, 169.6, 169.9, 170.0, 170.1, 170.3 (each CH₃ CO); ESI-FT-MS, calcd. for C₆₀H₆₂O₂₆SNa⁺ (M + Na)⁺: 1253.3148, found: 1253.3147; [α]_D +53.7 (c 1.21, CHCl₃).

（４）化合物（１）の合成
化合物(13)(47.3 mg, 0.0384 mmol)をMeOH (2 mL)に溶解し、0.5 M NaOMe／MeOH (200 μL)を加え、室温にて４時間攪拌した。Dowex 50W-X8 (H⁺ form) cation-exchange resinを用いて中和した後、濾過した。ResinをMeOHで洗浄後、濾液と洗液を集め減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール１０：１から１：１）にて精製し、化合物(1)(18.3mg, 91.5%) を得た。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD):δ2.74 (t, 0.45H, J_a3,a4 = J_a4,a5 10.8 Hz, H-a4α), 2.76 (t, 0.55H, J_a3,a4 = J_a4,a5 11.0 Hz, H-a4β), 3.07 (dd, 0.55H, J_a1,a2 7.6 Hz, J_a2,a3 8.4 Hz, H-a2β), 3.13 (t, 1H, J_c1,c2 = J_c2,c3 9.2 Hz, H-c2), 3.20-3.25 (m, 1H, H-b5), 3.23-3.27 (m, 1H, H-b2), 3.25-3.30 (m, 2H, H-b4 and H-c3), 3.28-3.32 (m, 0.45H, H-a2α), 3.31-3.34 (m, 0.55H, H-a3β), 3.35-3.39 (m, 0.55H, H-a5β), 3.44 (t, 1H, J_c3,c4 = J_c4,c5 8.8 Hz, H-c4), 3.51 (brt, 1H, J_c4,c5 8.8 Hz, H-c5), 3.54-3.59 (m, 2H, H-b3 and H-b6A), 3.61 (dd, 0.45H, J_a2,a3 9.6 Hz, J_a3,a4 10.8 Hz, H-a3α), 3.71-3.74 (m, 0.45H, H-a6Aα), 3.74-3.78 (m, 1.45H, H-a5α and H-b6B), 3.75-3.81 (m, 2H, H-c6), 3.78-3.83 (m, 0.55H, H-a6Aβ), 3.85-3.91 (m, 0.55H H-a6Bβ), 3.96 (dd, 0.45H, J_a5,a6Bα 3.4 Hz, J_gem 11.8 Hz, H-a6Bα), 4.30 and 4.32 (d, 0.45H and 0.55H, J_c1,c2 7.8 Hz, H-c1), 4.38 (d, 0.55H, J_a1,a2 7.6 Hz, H-a1β), 4.38 and 4.40 (d, 0.45H and 0.55H, J_b1,b2 9.2 Hz, H-b1), 5.06 (d, 0.45H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1α); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):δ45.5 (C-a4α), 45.8 (C-a4β), 60.1, 60.2, 60.9, 61.2 and 61.3 (C-a6, C-b6 and C-c6), 69.9 (C-b5), 70.6 (C-a3α), 71.6 (C-a5α), 72.1 (C-c3), 73.4 (C-c2), 74.1 (C-a2α), 75.7 (C-c4), 75.8 (C-a2β), 76.4 (C-b4), 76.58 (C-a5β), 76.63 (C-b2), 78.3 (C-b3), 78.5 (C-c5), 79.0 (C-a3β), 83.8 and 83.9 (C-b1), 92.5 (C-a1α), 96.4 (C-a1β), 103.1 (C-c1); ESI-FT-MS, calcd. for C₁₈H₃₂O₁₅SNa⁺ (M + Na)⁺: 543.1360, found: 543.1350; [α]_D +4.3 (c 0.92, MeOH).

（５）化合物（3）の合成
化合物(14)(66.2 mg, 0.0702 mmol)を用いて、化合物1の合成と同様に反応及び精製を行い、化合物(3)(23.4 mg, 92.9%)を得た。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD):δ2.70 (t, 0.47H, J_a3,a4 = J_a4,a5 10.8 Hz, H-a4β), 2.73 (t, 0.53H, J_a3,a4 = J_a4,a5 10.4 Hz, H-a4α), 3.01-3.05 (m, 0.47H, H-a6Aβ), 3.07 (dd, 0.47H, J_a1,a2 8.0 Hz, J_a2,a3 8.8 Hz, H-a2β), 3.16-3.19 (m, 0.47H, H-a6Bβ), 3.20-3.24 (m, 2H, H-b2 and H-b4), 3.23-3.29 (m, 1H, H-b5), 3.28-3.33 (m, 0.53H, H-a2α), 3.36-3.41 (m, 0.47H, H-a3β), 3.47-3.50 (m, 0.47H, H-a5β), 3.50-3.56 (m, 1H, H-b6A), 3.55-3.59 (m, 1H, H-b3), 3.59-3.64 (m, 0.53H,, H-a3α), 3.71-3.76 (m, 1H, H-b6B), 3.76-3.81 (m, 0.53H, H-a5α), 3.82-3.86 (m, 0.53H, H-a6Aα), 3.91-3.95 (m, 0.53H, H-a6Bα), 4.36 and 4.38 (d, 0.53H and 0.47H, J_b1,b2 8.0 Hz, H-b1), 4.38 (d, 0.47H, J_a1,a2 8.0 Hz, H-a1β), 5.05 (d, 0.53H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1α); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):δ47.6 and 47.9 (C-a4α and C-a4β), 62.8, 62.9, 63.1 and 63.3 (C-a6α, C-a6β, C-b6α and C-b6β), 71.5, 74.2, 75.9, 79.3, 79.4 and 82.3 (C-b2, C-b4 and C-b5), 72.4 (C-a3α, C-a5β, C-b3) 73.5 (C-a5α), 75.1 (C-a2α), 77.7 (C-a2β), 78.5 (C-a3β), 85.7 and 86.0 (C-b1), 94.3 (C-a1α), 98.2 (C-a1β); ESI-FT-MS, calcd. for C₁₂H₂₂O₁₀SNa⁺ (M + Na)⁺: 381.0831, found: 381.0826; [α]_D +50.8 (c 1.17, MeOH).

（６）化合物（4）の合成
化合物(15)(48.9 mg, 0.0397 mmol)を用いて、化合物(1)の合成と同様に反応及び精製を行い、化合物(4)(20.0 mg, 96.6%)を得た。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD):δ2.86 (t, 0.47H, J_a3,a4 = J_a4,a5 10.8 Hz, H-a4β), 2.88 (t, 0.53H, J_a3,a4 = J_a4,a5 11.0 Hz, H-a4α), 3.19 (dd, 0.47H, J_a1,a2 7.6 Hz, J_a2,a3 8.8 Hz, H-a2β), 3.36-3.43 (m, 2H, H-b2 and H-c3), 3.41-3.45 (m, 0.53H, H-a2α), 3.42 (t, 0.47H, J_a2,a3 = J_a3,a4 8.8 Hz, H-a3β), 3.45-3.52 (m, 1.47H, H-a5β and H-b4), 3.52-3.68 (m, 4H, H-b3, H-b5, H-c2 and H-c5), 3.68-3.76 (m, 1.53H, H-a3α and H-b6A), 3.80 (dd, 1H, J_b5,b6B 7.4 Hz, J_gem 11.4 Hz, H-b6B), 3.77-3.89 (m, 4H, H-a6Aα, H-a6Aβ, H-c4 and H-c6), 3.90-3.95 (m, 0.53H, H-a5α), 3.97-4.04 (m, 0.47H H-a6Bβ), 4.08 (dd, 0.53H, J_a5,a6Bα 3.4 Hz, J_gem 11.8 Hz, H-a6Bα), 4.37 and 4.38 (d, 0.47H and 0.53H, J_c1,c2 7.2 and 7.6 Hz, H-c1), 4.49 (d, 0.47H, J_a1,a2 7.6 Hz, H-a1β), 4.50 and 4.52 (d, 0.47H and 0.53H, J_b1,b2 9.6 Hz, H-b1), 5.17 (d, 0.53H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1α); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):δ45.6 (C-a4α), 45.8 (C-a4β), 60.2, 60.3, 61.0, 61.2, 61.3 (C-a6, C-b6, C-c6), 68.8 (C-c4), 70.6 (C-a3α), 71.0 (C-c2), 71.6 (C-a5α), 72.0 and 72.1 (C-b2 and C-c3), 73.3 (C-a5β), 74.1 (C-a2α), 75.6 (C-b3), 75.8 (C-a2β), 76.6 (C-b4), 78.3 (C-b5), 78.5 (C-c5), 78.9 (C-a3β), 83.8 and 84.0 (C-b1), 92.5 (C-a1α), 96.4 (C-a1β), 103.6 (C-c1); ESI-FT-MS, calcd. for C₁₈H₃₂O₁₅SNa⁺ (M + Na)⁺: 543.1360, found: 543.1357; [α]_D +12.4 (c 1.00, MeOH).

（７）化合物（17α）の合成
クトース１水和物 (16, 7.21 g, 20.0 mmol)にピリジン(144 mL)を加え、BzCl (16.3 mL, 140 mmol)を−40 ℃で激しく攪拌下、１１分かけて滴下した。反応液は−40 ℃で３０分攪拌した後、１２時間かけて＋10 ℃に昇温した。反応液を氷で冷やした２Ｎ塩酸水で洗い、酢酸エチルで抽出した。減圧濃縮後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トルエン１：２０から１：７）にて精製し、化合物(17)(2.44g, 12.6%, α:β = 97:3)、(18) (5.12g, 23.9%, α only)、(19)(4.27g, 18.2%, α only)を得た。異性体混合物である化合物(17)は、再度カラムクロマトグラフィーで精製しそれぞれのアノマーを単離した。

(17α): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ2.53 (br, 1H, b4-OH), 3.97 (t, 1H, J_a3,a4 = J_a4,a5 8.8 Hz, H-a4), 4.16-4.21 (m, 3H, H-a5, H-a6A, H-b5), 4.38-4.47 (m, 2H, H-a6B and H-b4), 4.90 (dd, 1H, J_a2,a3 10.0 Hz, J_a3,a4 8.8 Hz, H-a3), 4.54 (dd, 1H, J_b5,b6A 8.4 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6A), 4.70 (br, 1H, a3-OH), 4.83 (dd, 1H, J_b5,b6B 3.6 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6B), 4.98 (d, 1H, J_b1,b2 8.0 Hz, H-b1), 5.36 (dd, 1H, J_b2,b3 10.4 Hz, J_b3,b4 3.2 Hz, H-b3), 5.41 (dd, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, J_a2,a3 10.0 Hz, H-a2), 5.92 (dd, 1H, J_b1,b2 8.0 Hz, J_b2,b3 10.4 Hz, H-b2), 6.56 (d, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1), 7.16-7.66, 7.86-8.10 (each m, 30H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ61.8 (C-a6), 63.4 (C-b6), 67.4 (C-b4), 69.2 (C-b2), 70.2 (C-b5), 70.4 (C-a3), 71.1 (C-a2), 73.5 (C-a5), 73.9 (C-b3), 82.0 (C-a4), 90.1 (C-a1), 102.3 (C-b1), 128.35, 128.41, 128.5, 128.6, 128.7, 129.0, 129.2, 129.4, 129.6, 129.7, 129.85, 129.87, 129.93, 130.2, 133.15, 133.22, 133.3, 133.6, 133.7 (each Ar), 164.4, 165.38, 165.41, 165.57, 165.58, 165.59 (each PhCO); ESI-FT-MS, calcd. for C₅₄H₄₆O₁₇Na⁺ (M + Na)⁺: 989.2633, found: 989.2631. [α]_D +49.0 (c 0.55, CHCl₃)

（８）化合物（20）の合成
化合物(17α)(800 mg, 0.827 mmol)をピリジン(16 mL)に溶かし、Tf₂O (209 μL, 1.24 mmol)を0 ℃にて加えた。0 ℃で３０分攪拌した後さらにTf₂O (139 μL, 0.827 mmol)を追加した。引き続き３０分0 ℃で攪拌した後、n-hexane (30 mL)とEtOAc (30 mL)で希釈し、氷水(100 mL)で洗い、酢酸エチルにて抽出した。減圧濃縮後、得られた残渣は真空(2 mmHg)で１時間乾燥させスラリー状のトリフレート体（813 mg）を得た。これはこれ以上精製をせず次の反応に用いた。クルードのトリフレート体 (104 mg)と化合物(7)(73.2 mg, 0.180 mmol)をDMF (1 mL)に溶解し、Et₂NH (100 μL)を−5 ℃で加えた。−5 ℃で12時間攪拌した後、室温でさらに20分間攪拌した。反応液はn-hexane (5 mL)とEtOAc (5 mL)で希釈し、氷水(10 mL)で洗い、酢酸エチルにて抽出した。減圧濃縮後、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トルエン１：１０から１：３）にて精製し、化合物(20)(13.9mg, 25.7% 17αの回収率換算の収率)と原料(17α)(57.0mg, 58.9% 回収率) を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ1.58, 1.946, 1.954, 2.02 (each s, 12H, 4CH ₃CO), 3.60 (t, 1H, J_b3,b4 = J_b4,b5 10.8 Hz, H-b4), 3.73 (ddd, 1H, J_c4,c5 10.0 Hz, J_c5,c6A 5.4 Hz, J_c5,c6B 2.4 Hz, H-c5), 3.87 (dd, 1H, J_a3,a4 10.0 Hz, J_a4,a5 8.8 Hz, H-a4), 3.98 (dd, 1H, J_c5,c6A 5.4 Hz, J_gem 12.6 Hz, H-c6A), 4.06 (dd, 1H, J_c5,c6B 2.4 Hz, J_gem 12.6 Hz, H-c6B), 4.12-4.17 (m, 1H, H-a5), 4.21 (dd, 1H, J_a5,a6A 3.4 Hz, J_gem 12.2 Hz, H-a6A), 4.29 (ddd, 1H, J_b4,b5 10.8 Hz, J_b5,b6A 6.8 Hz, J_b5,b6B 1.6 Hz, H-b5), 4.37 (dd, 1H, J_a5,a6B 1.8 Hz, J_gem 12.2 Hz, H-a6B), 4.42 (t, 1H, J_a2,a3 = J_a3,a4 10.0 Hz, H-a3), 4.48 (dd, 1H, J_b5,b6A 6.8 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6A), 4.89 (dd, 1H, J_c1,c2 10.6 Hz, J_c2,c3 9.0 Hz, H-c2), 4.93 (d, 1H, J_c1,c2 10.6 Hz, H-c1), 4.96 (d, 1H, J_b1,b2 7.6 Hz, H-b1), 4.98 (dd, 1H, J_c3,c4 9.0 Hz, J_c4,c5 10.0 Hz, H-c4), 5.20 (t, 1H, J_c2,c3 = J_c3,c4 9.0 Hz, H-c3), 5.25 (dd, 1H, J_b5,b6B 1.6 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6B), 5.34 (dd, 1H, J_a1,a2 4.0 Hz, J_a2,a3 10.0 Hz, H-a2), 5.52 (dd, 1H, J_b1,b2 7.6 Hz, J_b2,b3 9.4 Hz, H-b2), 5.70 (dd, 1H, J_b2,b3 9.4 Hz, J_b3,b4 10.8 Hz, H-b3), 6.56 (d, 1H, J_a1,a2 4.0 Hz, H-a1), 7.16-7.65, 7.84-7.94, 8.03-8.10 (each m, 30H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ20.0, 20.52, 20.55, 20.59 (each CH₃CO), 46.6 (C-b4), 61.9 (C-a6), 62.0 (C-c6), 64.2 (C-b6), 68.1 (C-c4), 69.9 (C-c2), 70.0 (C-b3), 70.2 (C-a5), 70.3 (C-a3), 71.1 (C-a2), 73.1 (C-b2), 73.6 (C-c3), 75.3 (C-b5), 75.8 (C-c5), 81.3 (C-c1), 82.2 (C-a4), 90.0 (C-a1), 102.0 (C-b1), 128.1, 128.2, 128.3, 128.35, 128.40, 128.5, 128.6, 128.7, 129.0, 129.1, 129.3, 129.6, 129.75, 129.77, 129.86, 129.90, 133.2, 133.3, 133.6, 133.7 (each Ar), 164.4, 165.2, 165.47, 165.51, 165.6, 166.1 (each PhCO), 169.29, 169.32, 170.0, 170.3 (each CH₃ CO); ESI-FT-MS, calcd. for C₆₈H₆₄O₂₅SNa⁺ (M + Na)⁺: 1335.3355, found: 1335.3353; [α]_D +52.9 (c 1.47, CHCl₃).

（９）化合物（21）の合成
クルードのトリフレート体 (407 mg) と化合物(6)(518 mg, 0.745 mmol)を用いて、化合物(20)の合成と同様に反応及び精製を行い、化合物(21)(14.3mg, 7.69% (17α)の回収率換算の収率)を得た。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ1.53, 1.96, 1.97, 1.99, 2.01, 2.05, 2.08 (each s, 21H, 7CH ₃CO), 3.18 (t, 1H, J_b3,b4 = J_b4,b5 11.0 Hz, H-b4), 3.62-3.69 (m, 3H, H-c5, H-c4 and H-d5), 3.83-3.91 (m, 2H, H-a4 and H-d6A), 4.03 (dd, 1H, J_c5,c6A 2.0 Hz, J_gem 12.4 Hz, H-c6A), 4.12-4.16 (m, 1H, H-a5), 4.18-4.22 (m, 1H, H-a6A), 4.28-4.38 (m, 3H, H-a6B, H-b5, H-c6B), 4.40-4.45 (m, 2H, H-a3, H-b6A), 4.47 (d, 1H, J_d1,d2 8.0 Hz, H-d1), 4.52-4.56 (m, 1H, H-d6B), 4.83 (t, 1H, J_c1,c2 = J_c2,c3 9.2 Hz, H-c2), 4.92 (dd, 1H, J_d1,d2 8.0 Hz, J_d2,d3 9.2 Hz, H-d2), 4.94 (d, 1H, J_c1,c2 9.2 Hz, H-c1), 4.97 (d, 1H, J_b1,b2 8.0 Hz, H-b1), 5.05 (t, 1H, J_d3,d4 = J_d4,d5 9.2 Hz, H-d4), 5.14 (t, 1H, J_c2,c3 = J_c3,c4 9.2 Hz, H-c3), 5.17 (t, 1H, J_d2,d3 = J_d3,d4 9.2 Hz, H-d3), 5.25 (dd, 1H, J_b5,b6B 1.6 Hz, J_gem 12.0 Hz, H-b6B), 5.34 (dd, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, J_a2,a3 10.0 Hz, H-a2), 5.52 (dd, 1H, J_b1,b2 8.0 Hz, J_b2,b3 9.4 Hz, H-b2), 5.70 (dd, 1H, J_b2,b3 9.4 Hz, J_b3,b4 11.0 Hz, H-b3), 6.56 (d, 1H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1), 7.15-7.64, 7.85-7.94, 8.02-8.09 (each m, 30H, Ar); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ19.9, 20.46, 20.54, 20.57, 20.65, 20.67, 20.70 (each CH₃CO), 46.5 (C-b4), 61.6 (C-c6), 61.7 (C-a6), 61.9 (C-d6), 64.2 (C-b6), 67.8 (C-d4), 69.9 (C-b3), 70.17, 70.21, 70.28 (C-a3, C-a5 and C-c2), 71.2 (C-a2), 71.6 (C-d2), 72.1 (C-c5), 73.0, 73.1, 73.2 (C-b2, C-c3 and C-d3), 75.2 (C-b5), 76.6 (C-c4 and C-d5), 80.8 (C-c1), 82.2 (C-a4), 90.0 (C-a1), 100.7 (C-d1), 102.0 (C-b1), 128.2, 128.3, 128.36, 128.38, 128.43, 128.47, 128.59, 128.62, 128.7, 128.97, 129.04, 129.2, 129.3, 129.7, 129.75, 129.82, 129.87, 129.92, 133.2, 133.6 (each Ar), 164.4, 165.2, 165.4, 165.5, 165.6, 166.2 (each PhCO), 169.0, 169.3, 169.50, 169.53, 169.9, 170.2, 170.5 (each CH₃ CO); ESI-FT-MS, calcd. for C₈₀H₈₀O₃₃SNa⁺ (M + Na)⁺: 1623.4200, found: 1623.4184; [α]_D +22.9 (c 0.85, CHCl₃).

（１０）化合物（2）の合成
化合物(20)(12.8 mg, 9.75 μmol)をMeOH (1 mL)に溶解し、0.5 M NaOMe／MeOH (100 μL)を加え、室温にて４時間攪拌した。Dowex 50W-X8 (H⁺ form) cation-exchange resinを用いて中和した後、濾過した。ResinをMeOHで洗浄後、濾液と洗液を集め減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール１００：１から１：１）にて精製し、化合物(2)(4.44mg, 87.6%) を得た。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD):δ2.83 and 2.84 (t, 0.47H and 0.53H, J_b3,b4 = J_b4,b5 10.8 Hz, H-b4), 3.18 (dd, 0.53H, J_a1,a2 7.6 Hz, J_a2,a3 8.8 Hz, H-a2β), 3.24-3.29 (m, 2H, H-b2 and H-c2), 3.28-3.35 (m, 2H, H-c3 and H-c5), 3.34-3.40 (m, 2H, H-a5 and H-c4), 3.41 (dd, 0.47H, J_a1,a2 3.6 Hz, J_a2,a3 9.6 Hz, H-a2α), 3.46 (dd, 1H, J_b2,b3 9.2 Hz, J_b3,b4 10.8 Hz, H-b3), 3.50 (t, 0.53H, J_a2,a3 = J_a3,a4 8.8 Hz, H-a3β), 3.50-3.60 (m, 2.47H, H-a3α, H-a6A and H-b5), 3.61-3.66 (m, 1H, H-c6A), 3.75-3.80 (m, 1H, H-a4), 3.79-3.86 (m, 1H, H-c6B), 3.86-3.92 (m, 1H, H-a6B), 3.92-3.98 (m, 1H, H-b6A), 4.02-4.07 (m, 1H, H-b6B), 4.42 (d, 1H, J_b1,b2 8.0 Hz, H-b1), 4.48 (d, 1H, J_c1,c2 9.6 Hz, H-c1), 4.49 (d, 0.53H, J_a1,a2 7.6 Hz, H-a1β), 5.09 (d, 0.47H, J_a1,a2 3.6 Hz, H-a1α); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):δ45.7 (C-b4), 60.5, 60.6, 61.1, 61.2 (C-a6, C-b6, C-c6), 69.7 (C-c3 or C-c5), 71.8 (C-a4), 72.1 (C-a2α), 72.4 (C-b2 or C-c2), 73.6 (C-b3), 74.4 (C-b2 or C-c2), 74.5 (C-a2β), 75.0 (C-a5), 75.1 (C-a3β), 76.8 (C-b5), 77.6 (C-c4), 79.5 (C-a3α), 80.4 (C-c3 or C-c5), 83.7 and 83.8 (C-c1), 92.2 (C-a1α), 96.6 (C-a1β), 102.7 (C-b1); ESI-FT-MS, calcd. for C₁₈H₃₂O₁₅SNa⁺ (M + Na)⁺: 543.1360, found: 543.1357; [α]_D +11.1 (c 0.44, MeOH).

（１１）化合物（5）の合成
化合物(21)(6.50 mg, 4.06 μmol)を用いて、化合物(2)の合成と同様に反応及び精製を行い、化合物(5)(2.35mg, 84.8%)を得た。

¹H NMR (500 MHz, D₂O):δ2.81 (t, 1H, J_b3,b4 = J_b4,b5 10.9 Hz, H-b4), 3.17 (dd, 0.39H, J_a1,a2 8.0 Hz, J_a2,a3 8.6 Hz, H-a2β), 3.21 (dd, 1H, J_d1,d2 7.9 Hz, J_d2,d3 9.2 Hz, H-d2), 3.25-3.28 (m, 1H, H-b2), 3.24-3.29 (dd, 1H, J_c1,c2 10.0 Hz, J_c2,c3 8.7 Hz, H-c2), 3.31 (dd, 1H, J_d3,d4 9.2 Hz, J_d4,d5 9.8 Hz, H-d4), 3.36-3.40 (m, 1H, H-d5), 3.40 (t, 1H, J_d2,d3 = J_d3,d4 9.2 Hz, H-d3), 3.48 (dd, 0.61H, J_a1,a2 3.8 Hz, J_a2,a3 9.8 Hz, H-a2α), 3.48-3.53 (m, 2H, H-a5 and H-b3), 3.52-3.56 (m, 1.39H, H-a3β and H-a4), 3.56 (dd, 1H, J_c2,c3 8.7 Hz, J_c3,c4 9.1 Hz, H-c3), 3.60-3.65 (m, 2.61H, H-a3α, H-b5 and H-b6A), 3.62-3.69 (m, 3H, H-c5 and H-d6AB), 3.69-3.73 (m, 1H, H-a6A), 3.80-3.83 (m, 1H, H-b6B), 3.84-3.87 (m, 3H, H-a6B, H-c4 and H-c6A), 4.00-4.03 (m, 1H, H-c6B), 4.40 (d, 1H, J_b1,b2 8.0 Hz, H-b1), 4.41 (d, 1H, J_d1,d2 7.9 Hz, H-d1), 4.56 (d, 0.39H, J_a1,a2 8.0 Hz, H-a1β), 4.57 (d, 1H, J_c1,c2 10.0 Hz, H-c1), 5.12 (d, 0.61H, J_a1,a2 3.8 Hz, H-a1α); ¹³C NMR (125 MHz, D₂O):δ46.9 (C-b4), 59.8, 60.0, 61.5, 61.2 (C-a6, C-b6, C-c6, C-d6), 69.4 (C-d4), 69.5 (C-a3α or C-b5 or C-c5), 70.0 (C-c4), 71.2 (C-a2α), 72.2 (C-c2), 72.5 (C-a5 or C-b3), 73.1 (C-d2), 73.8 (C-a2β), 74.2 (C-a3β or C-a4 or C-c3), 74.3 (C-b2), 74.7 (C-a5 or C-b3), 75.4 (C-d3), 75.5 (C-a3β or C-a4 or C-c3), 75.9 (C-d5), 76.4 (C-a3α or C-b5 or C-c5), 78.1 (C-a3α or C-b5 or C-c5), 78.5 (C-a3β or C-a4 or C-c3), 83.6 (C-c1), 91.8 (C-a1α), 95.7 (C-a1β), 102.2 (C-d1), 102.5 (C-b1); ESI-FT-MS, calcd. for C₂₄H₄₂O₂₀SNa⁺ (M + Na)⁺: 705.1888, found: 705.1883; [α]_D +4.0 (c 0.24, MeOH).

試験例
本実験に用いたセルラーゼ、は、セルラーゼ高生産であるＴ．ｒｅｅｓｅｉ ＡＴＣＣ６６５８９株を１０％アビセル、４％硫酸アンモニウムを用いて２Ｌジャーファーメンターにより培養し、遠心分離により得られた培養上清液よりＨＰＬＣにより部分精製したものを用いた。ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIともに不純物を含んだ粗酵素である。

１）ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの分別活性測定法
まず、合成した５種類の化合物（１〜５）を用いて、５０ｍＭ 酢酸バッファー、１００μｇ／ｍＬ基質、１００μｇ／ｍＬ酵素、反応液６００μＬの条件で５０℃、３０分間反応させ、氷上で急冷して反応を停止した。反応生成物である遊離グルコース量を、表１の条件でＤＩＯＮＥＸイオンクロマトグラフィーを用いて測定した。以後、遊離グルコース量の分析にはＤＩＯＮＥＸイオンクロマトグラフィーを用いて行った。その結果、表２のように、化合物（１）ではＣＢＨ IIの活性がＣＢＨ Ｉに比べて約２倍高く、化合物（２）ではＣＢＨ Ｉの活性がＣＢＨ IIに比べて約４倍高い結果を示した。また、化合物（３）に対する活性は両酵素で観察されず、化合物（４）に対しては両酵素ともに低い活性を示した。化合物（５）に対しては、ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIとも高い活性を示した。以上の結果から、化合物（１）、（２）、（４）、（５）は、ＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ IIの基質として利用できることが判明した。

100μg/mLの化合物(1)、5 μg/mL、0.5 μg/mL、0.05μg/mLのCBH IまたはCBH IIを用いて、50℃で0、15、30、45、60、90、120、180分間反応させたときの遊離グルコース量を測定した。その結果、CBH IおよびCBH IIの遊離グルコース量は、5μg/mL、0.5 μg/mL 及び0.05μg/mL の酵素濃度において、0から60分の間で直線相関を示した（表３、４、図１から図４）。
以上の結果から、CBH ＩおよびCBH IIは化合物１および化合物２を用いることにより、個別に活性測定ができることが分かった。

２）粗酵素液中のＣＢＨ ＩおよびＣＢＨ IIの濃度組成比の評価法
各々100 μg/mL濃度の CBH I : CBH II の混合比率を 100 : 0 (A)、75 : 25 (B)、50 : 50 (C)、25 : 75 (D)、0 : 100 (E)に変化させ、化合物(１)および化合物(２)に対して反応させたときの遊離グルコース量を測定した。その結果、遊離グルコース量はCBH IおよびCBH IIの比率と直線相関を示した(表５及び表６、図５および図６)。そこで、この直線相関の得られた近似直線を検量線として用いることで、酵素液中の比率を明らかにできることが分かった。

化合物（１）および（２）を用いることにより、未精製の酵素液（CBH IおよびCBH II以外のセルラーゼが不純物として含まれるような粗酵素液）であっても、CBH IとCBH IIの比率が精度よく測定できることが分かった。本法を用いることにより、どのような粗酵素液またはセルラーゼ製剤であっても、その中に含まれるCBH IとCBH IIの割合を明らかにすることができるとともに、どのような組成比のときに、セルロースの効果的な分解が可能になるかの解析ができ、バイオマスの糖化利用において大きな進展をもたらすことが期待される。

Claims (11)

1. 次の一般式（１）
   

   

   （式中、Ｇ¹及びＧ²の少なくとも一方はセロビオース残基を示し、残余は単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示し、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ水素原子、単糖残基又は２糖以上のオリゴ糖残基を示す。）
   で表されるチオグリコシド化合物。
2. Ｘ¹及びＸ²が、水素原子である請求項１記載のチオグリコシド化合物。
3. Ｇ¹及びＧ²の少なくとも一方がセロビオース残基であり、残余が単糖残基又はセロビオース以外の２〜４糖残基である請求項２記載のチオグリコシド化合物。
4. Ｇ¹及びＧ²のいずれか一方がセロビオース残基であり、他方が単糖残基又はセロビオース以外の２糖残基である請求項２記載のチオグリコシド化合物。
5. Ｇ¹又はＧ²のいずれか一方がセロビオース残基であり、他方が単糖残基である請求項２記載のチオグリコシド化合物。
6. 請求項１〜５のいずれか１項記載のチオグリコシド化合物にセルラーゼを作用させることを特徴とするセロビオヒドロラーゼＩ及び／又はセロビオヒドロラーゼIIの活性測定法。
7. セロビオヒドロラーゼＩ及びセロビオヒドロラーゼIIの分別活性測定法である請求項６記載の測定法。
8. 請求項１〜５のいずれか１項記載のチオグリコシド化合物にセルラーゼを作用させることを特徴とするセルラーゼ中のセロビオヒドロラーゼＩ及び／又はセロビオヒドロラーゼII含有量の測定法。
9. セロビオヒドロラーゼＩ及びセロビオヒドロラーゼIIの含有量の測定法である請求項８記載の測定法。
10. 請求項１〜５のいずれか１項記載のチオグリコシド化合物を含有するセロビオヒドロラーゼＩ及び／又はセロビオヒドロラーゼIIの活性測定試薬。
11. セロビオヒドロラーゼＩ及びセロビオヒドロラーゼIIの分別活性測定試薬である請求項１０記載の試薬。

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