JP2012527651A - 試料の空間位置の動的決定および動的再配置の装置および方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 自動焦点システムにおいて役に立つ対象試料の空間位置を決定する装置および方法が提供される。この装置および方法は、（ａ）試料によって反射された任意の放射線の放射線検出器上での位置を（ｂ）試料の位置と相関させることによって、一部の実施形態では、試料に焦点が合った状態を維持するため、試料によって検出器に反射された放射線の位置に従って試料の位置、光学装置の位置、または両方を調整することによって機能する。
【選択図】 図５

Description

本願は２００９年５月１９日付で出願された米国特許出願第６１／１７９，４９８号に対して利益を主張するものであり、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、光分析の分野および自動焦点システムに関する。

広視野蛍光顕微鏡のような自動映像化システムは、様々な分野での高感度検出によく使用される。これらのシステムは、ユーザの望む分解能および検出のレベルを達成するため、一般に高数値の絞り値および高倍率光学系を使用する。

既存の自動焦点システムは、典型的に、装填および試料走査を含む種々の操作のための一次焦点合わせを実行し、焦点距離を維持する装置を含む。焦点距離は、典型的には約０．１〜０．２マイクロメートルの精度に維持される。この精度のレベルは、システム光学系と試料面との間の距離の直接測定を必要とする。

従来の位置感応検出器は、フィードバックとして２区分または四分区画フォトダイオードからの差動信号を利用し、その後、焦点を調整するためこれらの信号の相対強度を比較する。しかしながら、これらの差動信号は、対物レンズと試料との間の距離の決定には殆ど役に立たず、ある種の視覚的外形（例えば、領域間に鋭いコントラストを欠く外形）を有するある種の試料への自動焦点の維持に困難さを感じる可能性がある。

従って、既存の自動焦点方法の欠点を被ることなく焦点が合った状態に検査対象を維持することが可能なシステムおよび方法が本技術分野において必要とされている。このようなシステムおよび方法の価値は、このようなシステムおよび方法がこのような焦点を維持することが長期間に亘って可能な場合、さらに強調されることになる。

上記課題に対処する中で、請求項に係る発明は、最初に、少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームを対象試料の少なくとも一部分に照射する工程と、試料から反射された任意の放射線のうちの少なくとも一部を放射線検出器上で収集する工程と、放射線検出器上に収集された反射放射線の位置を対象試料の空間位置（ｓｐａｔｉａｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と相関させる工程とを有する対象試料の空間位置を決定する方法を提供する。

請求項に係る発明は、試料ステージと、少なくとも約５度の入射角で放射ビームを試料ステージに配置された対象に照射することが可能な放射線源と、前記試料ステージに配置された対象物と光学的に連通し、試料ステージに配置された対象物から反射された任意の放射線のうちの少なくとも一部を収集することが可能な放射線検出器と、前記試料ステージに配置された対象物から反射される放射線検出器上の任意の放射線の位置を対象物の空間位置と相関させることが可能な装置とを有する機器をさらに提供する。

さらに、拡大鏡の内部の光学面と対象試料との間の空間関係を特定する工程と、少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームを対象試料の少なくとも一部分に照射する工程と、放射線検出器上で、対象試料から反射された任意の放射線のうちの少なくとも一部を収集する工程と、前記放射線検出器上で収集された反射放射線の位置を拡大鏡の光学面に対する対象試料の空間位置と相関させる工程と、拡大鏡の光学面、試料、または両方の空間位置を変更して、前記拡大鏡の光学面と対象試料との間のプログラムされた空間関係を維持する工程とを有する対象試料上で自動光学焦点を維持する方法を提供する。

本発明は、拡大鏡および試料ステージであって、これらのうち少なくとも１つが傾斜、回転、上昇、下降、またはこれらの何れかの組み合わせを行うことが可能である前記拡大鏡および試料ステージと、少なくとも約５度の入射角で放射ビームを試料ステージに配置された試料に照射することが可能な放射線源と、前記試料ステージに配置された試料と光学的に連通し、試料ステージに配置された試料から反射された何れかの放射線の少なくとも一部分を収集することが可能な放射線検出器と、試料ステージに配置された試料から放射線検出器上に反射された放射線位置を拡大鏡に対する試料の空間位置と相関させることが可能な装置と、を有する自動焦点装置をさらに含む。

本発明の概要は、以下の詳細な説明と共に、添付図面と関連して読まれたときにさらに理解される。本発明を図示する目的のため、図面には、本発明の例示的な実施形態が示される。しかしながら、本発明は、開示された具体的な方法、組成、および装置に限定されない。さらに、図面は、正しい縮尺で表されているとは限らない。
図１は、請求項に係る本発明による例示的な自動焦点ユニットを図示するものである。 図２は、オンにされると、対物レンズと試料との間の距離が十分に維持される新規システムの長期安定性を図示するものである。 図３は、印加力に対して請求項に係る本発明によって作られたシステムの応答を図示し、矢印によって示された位置は、１００ｇ荷重が対象物位置決めステージに載せられ、取り除かれたとき、すなわち、「自動焦点」がスイッチを入れられ（すなわち、アクティブ状態にされ）、対物レンズと試料との間のプリセット距離を維持するためにシステムが対物レンズおよび／または高精度ステージの位置をｚ方向に調整することによって荷重の配置による力シフトを自動的に補償したときの新規システムの動的応答を表すものである。 図４は、請求項に係る本発明による自動焦点システムを含む顕微鏡光路のブロック図を表すものである。 図５は、レーザビームが顕微鏡の対物レンズの軸外に伝搬し、試料面から反射し、対物レンズと試料面との間の距離の変化がレーザビームの偏向を生じさせ、投影されたスポット位置が放射線検出器（例えば、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、又はフォトダイオード装置）によって追跡され、その後、所定の依存性を用いて距離に直接的に変換される、光学的に基礎を置く距離測定のスキームを図示するものである。 図６は、互いに相対的である顕微鏡の対物レンズ位置および試料面の位置のシフトがセンサエリア上で反射されたスポットの変位を生じさせ、スポットの位置の変化が対物レンズと試料との間の距離に正比例し、スポットの位置が自動焦点フィードバック制御ループの中で使用されるセンサ較正の１つの方法を図示するものである。 図７は、画像中で蛍光標識化されたＤＮＡ断片がシリコンエッチングをされたナノチャネルに存在し、自動焦点システムが実験の期間（約３０分間）に亘り画像の焦点を維持する、請求項に係る本発明によって準備された収束画像の実施例を図示するものである。 図８は、試料ステージを較正するステップと、放射線反射器上で試料から反射されたビームの位置を読み取るステップと、アレイ検出器上での試料から反射された１若しくはそれ以上のレーザビームの位置に応答して、試料ステージ、対物レンズ、または両方の空間位置を調整するステップと、請求項に係る本発明のプロセスフロー図を表すものである。 図９は、２スポット追跡プロセスを利用する請求項に係る本発明の例示的な実施形態を表すものである。

本発明は、添付図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解することができる。本発明は、本明細書において記載されおよび／または明らかにされた具体的な装置、方法、用途、条件またはパラメータに限定されないことと、本明細書で用いられる用語が単なる一実施例として特定の実施形態を説明することを目的とし、請求項に係る本発明の限定であることが意図されていないこととが理解されるべきである。

特許請求の範囲を含む明細書において使用されているように、単数形「ａ」，「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形を含み、特定の数値への言及は、特に断らない限り、少なくともこの特定の数値を含む。本明細書において使用されるような用語「複数」は、２若しくはそれ以上を意味する。値の範囲が表現されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または、別の特定の値までを含む。同様に、値が近似として表現されるとき、先行詞「約」の使用によって、この特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。すべての範囲は、両端を含み、結合可能である。

本明細書では、明瞭さのため、別個の実施形態との関連で記載された本発明のある種の特徴は、単一の実施形態の中にコンビネーションで提供されてもよいことが認識されるべきである。逆に、簡潔さのため、単一の実施形態との関連で記載された本発明の種々の特徴は、同様に別々に提供されてもよく、または何らかのサブコンビネーションで提供されてもよい。さらに、範囲で記載された値への言及は、この範囲内のあらゆる値を含む。

本明細書で使用されているように、用語「空間位置」は、対象物の物理的位置と、対象物の角度、傾斜、または他の特性とを指す。例えば、レンズに対する対象の空間位置は、対象と平面との間の距離と、レンズに対する対象物の傾斜とに関係する。

本明細書で使用されているように、用語「放射線検出器」は、電磁放射線を検出することが可能な装置を指す。このような装置は、レーザ放射線、光子、マイクロ波、可視光、またはこれらの何らかの組み合わせを適当に検出することが可能である。電荷結合デバイス（ＣＣＤｓ）、相補型金属酸化物半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＣＭＯＳ）、フォトダイオード、光子カウンタ、フォトマルチプライヤチューブなどは、すべてが適切な放射線検出器である。

一部の実施形態では、放射線検出器は、放射線の２個以上の個別のスポット（ビーム）の位置を検出することが可能であり、検出器は、放射線の３個または４個の個別のスポット（ビーム）が検出器に衝突することができる位置を検出できることがある。放射線検出器は、検出器に衝突する放射線のＸ−Ｙ位置（例えば、図５）を適切に決定することが可能である。一部の実施形態では、検出器は、検出器に衝突した１個以上のスポット（すなわち、反射された放射ビーム）の強度を分解することが可能である。

一実施形態では、本発明は、対象試料の空間位置を決定する方法を提供する。これらの方法は、少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームを対象試料の少なくとも一部分に照射する工程を適当に含む。零でない入射角が通常は使用される。１０、２０、３０、４０、５０、６０、またはこれより大きい角度の入射角も同様に適している。最適入射角は、ユーザの要求と、分析される対象の特性とに依存することになる。

これらの方法は、放射線検出器上で、試料から任意の反射された放射線のうちの少なくとも一部を収集する工程と、放射線検出器上に収集された反射放射線の位置を対象試料の空間位置と相関させる工程とをさらに含む。集束は、例えば、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、フォトダイオード、または他の放射線検出器装置によって達成されることがある。検出器は、放射線検出素子の２次元アレイを適当に含むが、検出器は、検出器素子の１次元集合を有することができる。１つの例示的なシステムが図９に表され、同図は、本明細書におけるさらなる細部にさらに説明される。

放射ビームは、適当には、平行ビームである。レーザビームは、特に適した放射線の形式であると考えられるが、マイクロ波放射線および可視光もまた請求項に係る本発明で使用することができる。放射線の波長は、本明細書のどこか他の位置に記載されているように変更することができ、波長は、ビームが試料の外観検査を実質的に妨害しないように選択することができる。

放射線検出器上に収集された反射放射線の位置を対象試料の位置と相関させる工程は、幾つかの方法で達成することができる。一実施形態では、相関させる工程は、（ａ）検出器に収集された反射放射線の位置を、（ｂ）対象試料が既知の（またはプリセットされた）空間位置にあるときに対象試料から反射された放射線が照射することが分かっている放射線検出器上の位置と比較することを含む。

この相関は、例えば、対象試料を取得し、種々の姿勢または位置で試料に照射し、（放射線検出器上で）各姿勢に対して試料によって反射された放射線を収集する工程によって適当に達成される。このように、ユーザは、様々な空間位置において対象試料から反射された放射線が衝突する放射線検出器上の位置のライブラリ（「マップ」とみなすこともできる）を作成することができる。ユーザは、すべての起こり得る姿勢および位置の部分集合だけに対してデータを集めて、この部分集合データに基づいて、ライブラリデータセットを完成するために、予測アルゴリズムを使用することができる。

一つの非限定的な実施例として、顕微鏡対物レンズから２５ｍｍに置かれた平坦な試料にレーザを照射することは、反射されたレーザ放射線が放射線検出器の中心でこの放射線検出器の衝突することが分かる。ユーザは、その後、顕微鏡対物レンズから１５ｍｍに置かれた同じ試料にレーザを照射することは、反射されたレーザ放射線が検出器の左上の四分区画でこの検出器に衝突することも分かる。従って、ユーザがその後に試料を対象ステージに置き、試料に照射し、反射されたレーザビームが光検出器の中心でこの光検出器に衝突することが分かる場合、ユーザは、試料が顕微鏡対物レンズから約２５ｍｍ離れていることが分かることになる。

代替的に、ユーザが試料にレーザを当て、反射された放射線が検出器の左上の四分区画でこの検出器に衝突することが分かる場合、試料は、顕微鏡対物レンズから約１５ｍｍ離れていることが分かることになる。ユーザは、その後、試料を適切な焦点で維持するために、手動で、またはコントローラを用いて、試料、顕微鏡対物レンズ、または両方の姿勢を変更することができる。上記実施例では、試料から対物レンズまでの最適焦点距離が１３．５ｍｍである場合、ユーザ（またはシステムコントローラ）は、その後、試料が対物レンズから１３．５ｍｍに位置合わせされるように、試料位置を調整することが可能である。

図６は、請求項に係る本発明による１つの例示的なプロセスを図示する。同図は、反射された放射線が衝突するレーザセンサ上の位置（同図のｘ軸に示される）と顕微鏡の対物レンズのシフト（同図のｙ軸に示される）との間の相関を表す。非限定的な図６によって示されるように、検出器上でのスポットの位置は、対物レンズの内部の平面と試料との間の距離の線形関数である。

請求項に係る方法を使用して、ユーザは、１若しくはそれ以上の空間位置にある対象試料から反射された放射線に対応する放射線検出器上でのスポット位置のライブラリ（またはマップ）を開発することができる。ユーザは、従って、広い範囲の空間位置（例えば、顕微鏡対物レンズからの距離、顕微鏡対物レンズに対する試料の傾斜など）の中の個々の空間位置にある試料に照射することにより、このようなライブラリまたはマップを構築することができる。能動的な実験中に、ユーザは、その後、対象の空間位置を推定するために、対象から反射され、次に、放射線検出器に衝突する放射線の位置をライブラリまたはマップ内のデータと比較することができる。ユーザは、その後、対象の姿勢を返すために、対象の空間位置を調整するさらなるステップを利用することができる。

図５は、請求項に係る本発明の非限定的な実施形態を表す。同図において、試料がシステムの対物レンズから異なる距離にある個々の位置ｄ_１、ｄ_２、およびｄ_３に進められるとき、ビームは、（同図の上端に位置している）試料から反射する。

これらの３つの位置のうちの個々の位置で、ビームは、試料から反射し、それぞれ、位置（Ｘ_１，Ｙ_１）、（Ｘ_２，Ｙ_２）、および（Ｘ_３，Ｙ_３）で検出器に衝突する。これらの３つの検出器位置を表形式化し、これらを対応する試料位置（ｄ_１、ｄ_２、およびｄ_３）に相関させることにより、ユーザは、データのライブラリまたはテーブル、すなわち、試料位置を放射ビームが各位置で反射される検出器上の（複数の）位置と相関させるマップを構築することが可能である。このライブラリを使用することによって、ユーザは、その後、ビームが引き続く試料から反射する位置に基づいて、試料の位置を決定し、これに応じて焦点を調整することが可能である。

図５における実施形態の動作は、以下の通りである。試料位置ｄ_１（検出器反射位置Ｘ_１およびＸ_２）は、対物レンズより１０ｍｍ上の位置に対応する。入射ビームを位置Ｘ_１およびＹ_１に反射するレーザ分析試料は、その後、対物レンズより１０ｍｍ上にあることが分かることになる。図５は、本明細書の他の位置に記載されているように単一ビームを表すが、システムは、複数のビームを使用してもよい。

一部の実施形態では、放射ビームは、対象試料の外観検査を妨害しない波長を有する。この構成は、対象の空間位置の決定を可能にさせ、その間に同時に対象を観測するので、特に役に立つ。

本発明は、図９に図示されるように、複数の放射ビームを少なくとも試料の一部分に照射する工程をさらに含む。この工程は、２、３、または４以上の平行放射ビームを試料に照射する工程をさらに含むことができ、これは、今度は、対象の空間位置に関してユーザへのさらなる情報を生じる。放射線は、導波管を介して、光ファイバを介して、または他の類似した手段を用いて届けることができる。（本明細書により詳細にさらに記載された）１つの非限定的な実施例として、複数のビームを対象に照射する工程は、変位、傾斜、または試料の空間位置に関する他の情報に関する情報をユーザに供給する。

これらの方法は、対象試料が特定の空間位置にあるときに、約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームが照射された対象試料から反射された放射線が照射することが分かっている放射線検出器上の位置を関係付けるデータセット（またはマップ）の構築をさらに含むことができる。データは、試料の２若しくはそれ以上の空間位置に対して、この構築を実行することがある。ユーザは、その後、試料の空間位置を推定するために放射線検出器上に収集された反射された放射線の位置をデータセットと比較することができる。

非限定的な実施例として、ユーザは、顕微鏡対物レンズから２５ｍｍ離れ、かつ、この対物レンズからの垂直線から４５°傾斜している試料にレーザを当てることが、結果として、反射された放射線が放射線検出器の右下の四分区画でこの検出器に衝突することになる、と決定することができる。ユーザは、顕微鏡対物レンズから３５ｍｍ離れ、かつ、この対物レンズからの垂直線から５５°傾斜している試料にレーザを照射することが、結果として、反射された放射線が放射線検出器の右上の四分区画でこの検出器に衝突することになる、とさらに決定することができる。この情報に基づいて、右上の四分区画で検出器に衝突するため入射放射線を反射する後で分析される試料は、おそらく顕微鏡対物レンズから３５ｍｍ離れ、かつ、垂直線から対物レンズへ５５°回転させられる。ユーザは、その後、試料を適切な焦点に維持するように、対物レンズ、試料、または両方の位置または姿勢を調整するためにこの情報を利用することができる。

本明細書における幾つかの実施形態は、検出器によって受信された信号に応答して試料を動かすことを記載するが、新規システムの対物レンズまたは他の映像化機器が同様に検出器によって収集された情報に応答して移動させることができることが理解されるべきである。

一部の実施形態では、これらの方法は、光分析装置の内部の平面と対象試料との間の空間関係を特定する工程を含むことができる。これは、例えば、試料を焦点が合った状態に維持するために、試料と顕微鏡対物レンズとの間の最適距離を特定するために行うことができる。他の実施形態では、光分析装置と試料との間の関係は、試料と分析装置との間の最小限のクリアランスを維持するような他の理由のために選ばれる。

これらの方法は、光分析装置の内部の平面と対象試料との間のプログラムされた空間関係を維持するように放射線検出器上に収集された反射された放射線の位置に応答して試料の空間位置を変更する工程をさらに含む。このようにして、ユーザは試料上で最適焦点を維持し得る。

非限定的な実施例として、ユーザは、試料と顕微鏡対物レンズとの間の（映像化目的のための）最適距離は２５ｍｍである、と決定することができる。ユーザは、その後、設定点としてこの距離を試料、顕微鏡対物レンズ、または両方の空間位置を制御するコントローラに設定する。試料の分析が進行するとき、レーザ光または他の平行放射線がこの試料から反射され、反射された放射線が放射線検出器に衝突する。コントローラは、その後、放射線が衝突する放射検出器上の位置を種々の既知の空間位置を有する対象試料から反射された放射線が衝突することが分かっている放射線検出器上のデータセット位置と比較する。この比較に基づいて、コントローラは、効果的に、（１）分析中の試料の空間位置を決定し、（２）試料を焦点が合った状態に維持するため必要とされる２５ｍｍの分離距離を維持するように、試料対象物、顕微鏡対物レンズ、または両方の空間位置を変更することが可能である。

このプロセスは、請求項に係る方法のステップ状のプロセスを示す図８に表される。同図に示されるように、ユーザは、ステージが検出器の動作範囲内に入るように（ｚ軸方向に）ステージ位置を調整することができる。ユーザは、その後、（例えば、レーザを用いて）１若しくはそれ以上のビームを試料に照射し、その後、検出器上の反射されたビームスポットのｘ−ｙ位置を読み取ることができる。ビームスポット寸法が範囲外である場合、ユーザは、スポット寸法が動作範囲内に入るように（手動または自動的に）ビーム電力を調整することができる。

ユーザは、その後、移動のためにこのステージを準備することができる。ステージ移動は、その後、試料ステージの移動および姿勢を変化させるＰＩまたはＰＩＤコントローラのようなコントローラによって行うことができる。検出器は、その後、反射されたビームの位置を読み取り、次に、試料を焦点が合った状態に維持するためにステージが所望の位置に到達するようにプロセスが再び開始する。このプロセスは、試料を焦点が合った状態に維持するために（ステージ上の）試料位置を調整するようにリアルタイムで動かされてもよい。

対象試料、または顕微鏡対物レンズの空間位置を変更する工程は、上昇、下降、傾斜、回転などを行う工程を含むことが可能である。このようにして、システムは、観測中および分析中に、リアルタイムで試料（または分析装置）の位置を調整するために働く。これらの方法は、試料から反射された放射線が衝突する放射線検出器内部の位置に主に依存するさらなる利点を有している。このようにして、これらの方法は、必ずしも放射線の強度ではなく、この放射線の衝突の位置に基づいている。

本発明は、機器をさらに含む。開示された機器は、試料ステージと、少なくとも約５度の入射各で放射ビームを試料ステージに配置された対象に照射することが可能な放射線源と、試料ステージに配置された対象と光学的に連通し、試料ステージに配置された対象から反射された放射線のうちの少なくとも一部を収集することが可能な放射線検出器と、放射線検出器上での試料ステージに配置された対象から反射された何れかの放射線の位置を対象の空間位置と相関させることが可能な機器とを適当に含む。

適当な試料ステージは、当業者に公知であり、調整可能な空間位置の市販されている試料ステージを含むことができる。一部の実施形態では、試料ステージは、電動化され、Ｚ軸方向に並進可能である。他の実施形態では、試料ステージは、Ｘ、ＹまたはＺ方向の移動を制御することが可能である。試料ステージは、制御可能的に傾斜させることもできる。

適当な検出器は、例えば、ＣＭＯＳ、ＣＣＤ、フォトダイオード、ＰＭＴなどを含む。

請求項に係る装置の放射線源は、レーザ放射線、可視光放射線、ＩＲ放射線、および、ＵＶ放射線を含む。他の放射線源もまた役に立つが、平行レーザビームは、特に好ましい。

請求項に係る機器は、試料ステージに配置された対象、放射線源、または両方と光学的に連通することが可能な光分析装置をさらに適当に含む。このような装置は、例えば、顕微鏡、ＣＣＤｓなどを含む。

光分析装置、試料ステージ、または両方の空間位置を制御することが可能なコントローラは、請求項に係る機器にさらに適当に含まれる。本明細書のどこか他の位置に記載されているように、コントローラは、試料ステージの空間位置、光分析装置の空間位置、または両方を適当に制御する。コントローラは、放射線照射された試料から反射された放射線によって衝突された放射線検出器上の位置を１若しくはそれ以上の既知の空間位置にある放射線照射された試料から反射された放射線によって衝突された放射線検出器上の位置に対応する放射線検出器上の位置のデータセットと適当に相関させる。

本発明は、対象試料上で自動光学焦点を維持する方法をさらに提供する。これらの方法は、（例えば、プログラミングすることにより）拡大鏡の内部の光学面と対象試料との間の空間関係を特定する工程と、少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームを対象試料の少なくとも一部分に照射する工程と、放射線検出器上で、対象試料から反射された放射線のうちの少なくとも一部を収集する工程と、放射線検出器上で収集された反射された放射線の位置を拡大鏡の光学面と相対的である対象試料の空間位置と相関させる工程と、拡大鏡の光学面と対象試料との間のプログラムされた空間関係を維持するために、拡大鏡の光学面、試料、または両方の空間位置を変更する工程と、を含む。請求項に係る本発明は、一部の実施形態では、約２００ｎｍの焦点範囲を支援することが可能である。請求項に係る本発明は、マイクロメータ範囲内の焦点距離を適当に維持することができる。

本明細書のどこか他の位置に記載されるように、適当に照射する工程は、対象試料にレーザまたは他の放射線を当てる工程を含む。レーザ放射線は、試料の光分析または検査を妨害しない周波数を適当に有し、試料を破壊しないが、試料から反射する放射線がそれにもかかわらず放射線検出器によって検出可能である大きさを有する同様に十分に強力である電力を適当に有する。一部の実施形態では、レーザ出力は、数十、または数百μＷの範囲に入る。特定の用途のための最適レーザ電極は、当業者によって容易に決定され、使用中の放射線（光子）センサと、試料の特性と、他の条件とに依存することがある。

例えば、図５に示された実施形態のような一部の実施形態では、照射する工程と収集する工程とは、拡大鏡の光学面を通して実行することができる。レーザ照射は、拡大鏡に対して適当に軸外であるが、レーザ照射は、一部の実施形態では、拡大鏡に対して軸上でもよい。

これらの方法は、（ａ）放射線検出器上に収集された反射された放射線の位置を（ｂ）試料が拡大鏡と相対的である特定の空間位置にあるとき、試料から反射された放射線が照射することが知られている放射線検出器上の位置と比較することによって、放射線検出器上に収集された反射された放射線の位置を拡大鏡と相対的である試料の位置と相関させる工程をさらに含む。この手順は、本明細書のどこか他の位置、例えば、図５および図６にさらに詳細に記載される。

一部の実施では、これらの方法は、対象試料の２若しくはそれ以上の空間位置に対して、対象試料が拡大鏡の光学面と相対的である特定の空間位置にあるとき、少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームが照射された対象試料から反射された放射線が照射することが分かっている放射線検出器上の位置を含むデータセット（または「位置マップ」）の制約を含む。

これは、ユーザが試料のための広範囲の空間位置（すなわち、位置および傾斜／姿勢）に対応する放射線検出器位置の完全なマップまたはリスニングを構築することを可能にさせるので、よって、必要に応じて、上昇、下降、傾斜、回転などを行うことによって試料、分析装置、または両方の位置を調整するために用いる最大利用可能情報をユーザに提供する。

相関させる工程は、放射線検出器上に収集された反射された放射線の位置をライブラリと比較する工程を含むことができる。開示された自動焦点方法は、一部の実施形態では、対象試料の少なくとも一部分に２若しくはそれ以上の平行放射ビームを照射する工程を含み、上述されているように、複数のビームによる試料の照射は、試料の傾斜または他の姿勢特性に関するさらなる情報をユーザに提供する。

本発明は、自動焦点装置をさらに含む。これらの装置は、少なくとも一方が傾斜、回転、上昇、下降、またはこれらのうちの何れかの組み合わせを行うことが可能な拡大鏡および試料ステージと、少なくとも約５度の入射角で放射ビームを試料ステージに配置された試料に照射する放射線源と、試料ステージに配置された試料と光学的に連通し、試料ステージに配置された試料から反射された放射線のうちの少なくとも一部を収集することが可能な放射線検出器と、放射線検出器上での試料ステージに配置された試料から反射された何れかの放射線の位置を拡大鏡と相対的である試料の空間位置を相関させることが可能な装置と、を適当に含む。

代表的な装置のブロック図が図４に示される。代表的な装置のためのプロセスフロー図は、図５に示される。

一部の実施形態では、放射線検出器は、荷電結合装置、または他の光検出装置を含む。適当な拡大鏡は、例えば、顕微鏡などを含む。放射線は、適当にレーザである。

装置は、本明細書のどこか他の位置に記載されているように、拡大鏡の空間位置を制御するコントローラ、試料ステージの空間位置を制御するコントローラ、または両方を適当にさらに含む。一部の実施形態では、コントローラは、試料ステージと拡大鏡との両方の空間位置を変化させる。

コントローラは、一部の実施形態では、組み込みファームウェアを含むことができる。このファームウェアは、誤りのない閉ループフィードバック回路を提供するために適当に適合している。この制御は、およそ２００Ｈｚの更新レートで放射線検出器（センサ）から本質的に誤りのない位置を読み出す能力を適当に有し、この制御は、（ａ）反射されたレーザスポットの自動探索と、（ｂ）起こり得る読み誤りを除去するためにロバストアルゴリズムと、（ｃ）適応低域通過デジタルフィルタと、（ｄ）反射の（例えば、最大３００％までの）差を補償するためにレーザ出力のフィードバック制御と、（ｅ）予測できない状態からの回復とを含むことができる。

ＰＩＤコントローラを使用することができる。このようなコントローラは、読み取り成功の期間に適当に適合し、それによって、（ａ）ＰＩＤ係数が試料間隔および誤差値の変化に応じて自動的に調整され、（ｂ）焦点位置合わせは、サブステップ制御を利用するＺ軸移動のために開発されたアルゴリズムを使って調整される。

アルゴリズムは、対物レンズまたは他の計器の物理的破壊を防止するために移動上限および移動下限の連続的な監視を行うために使用することができる。これは、システムのステージまたは光学系の望ましくない移動を防止する物理的なストップによっても達成することができる。

システムは、このシステムが焦点合わせ範囲内にないときに放射線源（例えば、レーザ）をオフにするために構成することができる。プロセスパラメータは、装置の不揮発性メモリの中にあり、起動後に呼び出すことができる。一部の実施形態では、装置は、放射ビームを複数の放射ビームに分離することが可能なスプリッタを含む。分離は、ミラー、フィルタ、プリズムなどによって適当に達成される。

開示された本発明の利点の一部は、とりわけ、（１）高倍率でサブマイクロメータ精度の範囲内で対象物表面にある焦点位置に焦点を合わせ、かつ、焦点位置を維持する能力と、（２）著しく異なった表面反射特性を有する対象の許容と、（３）リアルタイムで自律的に機能する能力と、（４）ＸＹステージ移動中に対象物に自動的に焦点を合わせるために高精度電動位置決めステージ（例えば、Ｚ方向に移動する能力があるステージ）を動的に制御する能力と、（５）拡大鏡（例えば、蛍光顕微鏡）の光学路の妨害を避けるために自動焦点合わせのため異なる波長を使用する能力と、（６）対象物の視野位置決めの機械的公差および不確実性を適切に許容するため広い動作範囲と、を含む。既存の技術は、請求項に係るこれらの態様を取り扱うことができない。

請求項に係る本発明は、基材に配置された１若しくはそれ以上の構造体の範囲内で進む移動検査対象（例えば、高分子）の分析に特に適している。請求項に係る本発明は、分析中にある位置から別の位置へ移動するか、または移動させることができる動的または進化する検査対象（例えば、生物学的試料）の分析にさらに適している。

請求項に係る本発明は、動的な検査対象の分析に適しているが、本発明は、環境条件が試料焦点の維持に難題を課すことができる動的な環境においても役に立つ。例えば、振動が問題である環境（例えば、都会の環境に位置している研究室）では、本発明は、環境振動に応答して、試料、対物レンズ、または両方の位置をリアルタイムで調整することにより、試料を焦点が合った状態に維持するために使用することができる。

本システムの一実施形態では、赤外線レーザ・ダイオード・ビームは、顕微鏡の対物レンズ（例えば、図５）に対して軸外に伝搬し、大きい入射角で試料面に当てられる。反射されたビームは、同じ対物レンズを通って戻り、荷電結合装置（ＣＣＤ）のような位置感応検出器によって検出される。検出器面上の反射されたスポットの位置は、顕微鏡の対物レンズ（または何らかの他の画像収集器）と試料の反射面との間の距離に比例する。検出器からの読みは、その後、対物レンズのｚステージにフィードバックを与えるためにマイクロコントローラによって適当に使用され、このステージは、次に、図８に示されるように、高精度かつ正確度で適当に焦点距離を維持するために移動される。

一実施例として、ユーザは、試料を焦点に置き、その後、焦点が合っている試料から反射されたビームが検出器に衝突する位置または複数の位置を記録することができる。ユーザは、その後、試料を処理し（例えば、試薬を細胞試料に添加する、細胞試料を加熱するなど）、その後、試料から反射されたビームが試料のため焦点が合っている位置に対応する位置または複数の位置で検出器に衝突し続けるように、処理中に試料（または対物レンズ）を移動または姿勢変更するために電動試料ステージ（または光学対物レンズ）に接続されているコントローラを使用する。本明細書のどこか他の位置で説明されているように、システムは、試料処理または分析中に試料を焦点が合った状態に維持するために周囲振動（例えば、通過する交通によって生じる振動）を補償することが可能である。

一部の実施形態では、マイクロコントローラは、対物レンズによる２次元または３次元移動を実施する。これは、上昇、下降、回転、傾斜、またはＸ−Ｙ平面内の運動を含むことができる。

従来のアプローチと異なって、本発明は、フォトダイオード区分でのスポット強度の変動の検出を利用しない。その代わりに、本発明は、センサの表面全域で１個以上のスポットの実際のＸＹ位置を測定する２次元センサ（例えば、ＣＣＤ装置）を用いる多物体追跡技術を利用する。一部の実施形態では、検出器は、２個、３個、または４個の反射スポットに対して同時に絶対位置決めおよび寸法情報を追跡し、提供し、図９は、２つのビームに対するこのプロセスを表す。

このアプローチは、従来の代替案を上回るある程度の数の利点がある。第一に、請求項に係る本発明は、不純物および物体構造によって引き起こされる反射および散乱の局所的な変動に本質的に感応しないマルチスポット追跡を含む。第二に、本発明で使用される焦点合わせ情報は、対物レンズから試料の反射面までの試料の距離に直接的に関係している。さらに、請求項に係る本発明は、比較的広い直線的な検出範囲を与え、この範囲は、１０ｎｍ未満の正確度で約５０μｍである可能性がある。

本発明は、マルチスポット追跡モードが使用されるとき、位置決めが複数のスポット（すなわち、反射された放射線）からのデータに基づいて変化させられ、次に、位置決め正確度を改善するので、ステージまたは拡大鏡の位置決めにおける正確度の増大をさらに提供する。本発明は、光学センサの要件を適合させるために、ユーザが比較的低いレーザ出力（例えば、ガラス／空気界面から反射されるとき、２００μＷ未満）を使用することを許可する。これは、解析を実行しているときユーザがより少ない電力を消費し、入射放射線によって試料内に引き起こされる何らかの変化を同様に低減することを可能にする。

本発明は、マルチスポット追跡のための単一検出器の使用も可能にさせ、次に、ユーザの機器の要件を簡略化する。さらに、２次元空間における反射された放射線スポットの位置および軌道（例えば、図９）は、対物レンズ面に対する試料の距離および傾斜に関する情報を提供する。本発明は、アナログ信号の除去をさらに可能とし（ＣＣＤマトリクス検出器からの読み取りがデジタルであり、従って、電気的アーティファクトによる影響がより小さい）、その結果として、より頑健性のあるデータが所定の試料から抽出される。最後に、請求項に係る本発明は、試料整列が反射された放射線スポットからの情報を使用することにより手動でまたは自動的に実行することができるので、簡略化された試料位置合わせを提供する。

自動焦点システムは、レーザを含む標準的な高分解能光コンポーネントを適当に含むことができる。レーザは、対物レンズの後焦点面に適当に焦点が合わされ、反射されたビームが非球面レンズによって集められ、センサ表面検出器（例えば、ＣＣＤ）に鋭い焦点を設ける。一部の実施形態では、レーザビームは、空間フィルタ処理され、添付図面に記載されたように、ビーム外形の変動を最小限に抑える。

図１は、請求項に係る本発明によって作られた実際の自動焦点ユニットを表す。図示されるように、このユニットは、レーザビームが試料に入射する角度で光学系を通過し（ビームには「入射」というラベルが付されている）、試料から、この場合にはＣＣＤである光学検出器へ反射される（ビームには「反射後」というラベルが付されている）レーザユニットおよび光学系を含む。反射されたビームがＣＣＤ検出器に衝突する位置の座標を使用して、システムは、これらの座標を試料に対する対物レンズの位置を表現するデータセットに翻訳し、これに応じて、対象物と試料との相対位置を調整することができる。

図２は、試料が長時間に亘って監視されるときに「ドリフト」を阻止する請求項に係る本発明の能力を図示する。同図に示されるように、顕微鏡検査システムは、請求項に係る発明の自動焦点システムがオフにされるとき、長期間（６０分間）に亘って「ドリフト」を提示する。この「ドリフト」は、システムが僅か数分間だけ無人で放置されたとしても、非自動焦点システムの焦点を再び合わせるために実験者を必要とすることがある。図２によって示されるように、システムは、このシステムが無人で放置された場合、初期焦点セッティングから比較的大きいずれを被る可能性がある。これに反して、図２は、請求項に係る発明が、アクティブ状態であるとき、非アクティブ状態のシステムが「ドリフト」を提示する同じ期間（６０分間）に亘って検査対象に安定して焦点が合わされた状態を維持することができることをさらに示す。

図３は、外部刺激に応答する請求項に係る発明の能力を図示する。同図の左側に示されるように、請求項に係る発明は、システムが印加された力の影響を受けるとき、リアルタイムで検査対象への焦点合わせを自動的に回復する。これに反して、自動焦点がオフにされたシステムの挙動を図示する右側は、自動焦点を伴わないシステムが外力印加に続いて焦点を回復しなかったことを実証する。これは、振動または他の外力（例えば、通過する交通）が検査対象へ適切に焦点が合わされた状態の維持に難題を課す環境におけるシステムの有用性を実証する。

図４は、請求項に係る発明の単一試料の非限定的な実施形態を示す。同図に示されるように、試料は、光源とレーザとの両方によって照射される。レーザは、顕微鏡対物レンズを通過し、対物レンズを通って試料から後方へ反射し、反射されたレーザビームは、多物体ＣＣＤセンサまたは他の光学検出器によって集められる。

ミラー、フィルタ、およびビームスプリッタは、すべてが必要に応じてレーザ（および励起）照射の経路を制御するために（単独で、または互いに組み合わせて）使用できる。好ましくは、１台以上のコントローラは、レーザ光または他の放射線が装置に衝突するＣＣＤまたは他の検出器上の位置を試料と対物レンズとの相対的な位置と相関させ、適切な焦点を維持するために試料、対物レンズ、または両方の位置を調整する。

図示されるように、励起照明装置が、ダイクロイックミラーを通過し、ダイクロイックミラーによって反射された照明を同図の右上に示された試料に照射するために使用される。レーザおよび放射線検出器（ＣＣＤ）は、図示され、本明細書のどこか他の位置に記載されているように、レーザのビームは、試料に衝突し、試料から反射し、反射されたビームがその後にＣＣＤユニットによって検出される。ＣＣＤユニット上の「スポット」の位置は、試料位置と共に変化することになり、ユーザは、ＣＣＤユニットによって収集された情報に従って試料の位置または姿勢を調整することができる。この調整は、コントローラのような自動システムによって達成することができ、コントローラは、次に、リアルタイムで試料位置を調整するために作用する。

本明細書のどこか他の位置に記載されているように、請求項に係る発明は、非限定的な図９に示されるように、自動焦点動作中に２若しくはそれ以上のレーザビームを使用してもよい。第１のレーザビームは、例えば、Ｚ軸だけにおいて試料と対物レンズとの相対的な位置に関する情報を提供することができる。第１のレーザビームとは異なった試料の部分を照射することができる第２のレーザビームは、従って、対物レンズと相対的である試料の傾斜に関するさらなる情報、または対物レンズと相対的である試料のＸＹＺ姿勢に関する情報を提供することができる。コントローラは、その後、光学検出器による個々のレーザビームの収集物から収集された情報を対物レンズと相対的である試料の位置および姿勢と相関させ、これに応じて、試料ステージ、対物レンズ、または両方を調整する。

図９では、対物レンズの光軸から外れて伝搬し、試料から反射する複数のビームが示され、反射ビームは検出器（図９の右下に図示されている）に衝突する。

同図の左側は、検出器と相対的に試料面を垂直にシフトする影響を図示する（新しい試料位置は、図９の左上に点線によって示される）。図９の左側領域に示されるように、試料が上に（すなわち、検出器から離れる方へ）移動するとき、検出器上のスポットは、これらのスポットの（１ａおよび２ａによってそれぞれ示された）原位置から、検出器の中心により接近して位置している（１ｂおよび２ｂによってそれぞれ示された）新位置へシフトする。

図９の右側は、傾斜している試料面がシステムに与える影響を図示する。同図に示されるように、試料面は、この試料面の（図９の右上に水平方向実線によって示された）初期姿勢から（図９の右上に点線によって示された）新しい傾斜姿勢まで傾斜させられる。同図に表されるように、検出器上のスポットは、これらのスポットの（３ａおよび４ａによってそれぞれ示された）原位置から、検出器上の（３ｂおよび４ｂによってそれぞれ示された）新しい異なった位置へシフトし、それによって、ユーザが試料の姿勢変更を明らかにすることを可能にする。

図９によって示されるように、試料の様々な動き（すなわち、シフト対傾斜）は、結果として、様々なスポットシフトを生じる。よって、２重のスポットを追跡することにより、ユーザは、試料シフト（すなわち、１若しくはそれ以上のエクセスに沿った並進）と傾斜とを区別する（明らかにする）ことが可能である。

Claims (33)

1. 対象試料の空間位置（ｓｐａｔｉａｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定する方法であって、
   少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームを前記対象試料の少なくとも一部分に照射する工程と、
   前記試料から反射された任意の放射線のうちの少なくとも一部を放射線検出器上で収集する工程と、
   前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置を前記対象試料の空間位置と相関させる工程と
   を有する方法。
2. 請求項１記載の方法において、前記少なくとも１つの放射ビームは、平行放射ビームを含むものである方法。
3. 請求項２記載の方法において、前記平行放射ビームは、レーザを含むものである方法。
4. 請求項１記載の方法において、前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置を前記対象試料の位置と相関させる工程は、（ａ）前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置を（ｂ）前記対象試料が既知の空間位置にあるときに前記対象試料から反射される放射線が照射することが分かっている前記放射線検出器上の位置と比較することを含むものである方法。
5. 請求項１記載の方法において、前記放射ビームは、前記試料の外観検査を実質的に妨害しない波長を含むものである方法。
6. 請求項１記載の方法において、さらに、
   前記試料の少なくとも一部分に２若しくはそれ以上の平行放射ビームを照射する工程を有するものである方法。
7. 請求項１記載の方法において、さらに、
   ２若しくはそれ以上の試料空間位置に対して、前記対象試料が特定の空間位置にあるときに、少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームが照射された前記対象試料から反射される放射線が照射することが分かっている前記放射線検出器上の位置を有するデータセットの構築する工程を有するものである方法。
8. 請求項７記載の方法において、前記相関させる工程は、前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置を前記データセットと比較する工程を含むものである方法。
9. 請求項１記載の方法において、さらに、
   光分析装置の内部の平面と前記対象試料との間の空間関係を特定する工程を含むものである方法。
10. 請求項９記載の方法において、さらに、
    前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置に応答して前記試料の空間位置を変更し、前記光分析装置の内部の平面と前記対象試料との間の特定された空間関係を維持する工程を有するものである方法。
11. 請求項１０記載の方法において、前記対象試料の空間位置を変更する工程は、上昇、下降、傾斜、回転、またはこれらの何れかの組み合わせを実行する工程を含むものである方法。
12. 機器であって、
    試料ステージと、
    少なくとも約５度の入射角で放射ビームを前記試料ステージに配置された対象物に照射することが可能な放射線源と、
    前記試料ステージに配置された対象物と光学的に連通し、前記試料ステージに配置された対象物から反射される放射線のうちの少なくとも一部を収集することが可能な放射線検出器と、
    前記試料ステージに配置された対象物から反射される前記放射線検出器上の任意の放射線の位置を前記対象物の空間位置と相関させることが可能な装置と
    を有する機器。
13. 請求項１２記載の機器において、前記放射線検出器は、電荷結合デバイス、相補型金属酸化物半導体、フォトダイオード、フォトマルチプライヤチューブ、またはこれらの何れかの組み合わせを有するものである機器。
14. 請求項１２記載の機器において、前記放射線源は、レーザを含むものである機器。
15. 請求項１２記載の機器において、さらに、
    前記対象物、前記放射線源、またはその双方と光学的に連通する光分析装置を有するものである機器。
16. 請求項１５記載の機器において、さらに、
    前記光分析装置、前記試料ステージ、または双方の前記空間位置を制御するコントローラを有するものである機器。
17. 請求項１５記載の機器において、前記光分析装置は、顕微鏡を含むものである機器。
18. 対象試料に対する自動光学焦点を維持する方法であって、
    拡大鏡の内部の光学面と対象試料との間のプログラムされた空間関係を特定する工程と、
    少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームを前記対象試料の少なくとも一部分に照射する工程と、
    放射線検出器上で、前記対象試料から反射された任意の放射線のうちの少なくとも一部を収集する工程と、
    前記放射線検出器上で収集された前記反射放射線の位置を前記拡大鏡の光学面に対する前記対象試料の空間位置と相関させる工程と、
    前記拡大鏡の光学面、前記試料、またはその双方の前記空間位置を変更して、前記拡大鏡の光学面と前記対象試料との間の前記プログラムされた空間関係を維持する工程と
    を有する方法。
19. 請求項１８記載の方法において、前記照射する工程は、前記対象試料にレーザを当てる工程を含むものである方法。
20. 請求項１８記載の方法において、前記照射する工程、収集する工程、またはその双方の工程は、前記拡大鏡の光学面を通して実行されるものである方法。
21. 請求項１８記載の方法において、前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置を前記拡大鏡の光学面に対する前記対象試料の位置と相関させる工程は、（ａ）前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置を（ｂ）試料が前記拡大鏡に対して特定の空間位置にあるときに前記試料から反射放射線が照射することが分かっている前記放射線検出器上の位置と比較することを含むものである方法。
22. 請求項１８記載の方法において、前記拡大鏡の光学面、前記対象試料、またはその双方の前記空間位置を変更する工程は、上昇、下降、傾斜、回転、またはこれらの何れかの組み合わせを行う工程を有するものである方法。
23. 請求項１８記載の方法において、前記放射ビームは、前記対象試料の外観検査を妨害しない波長を有するものである方法。
24. 請求項１８記載の方法において、さらに、
    前記対象試料の少なくとも一部分に２若しくはそれ以上の平行放射ビームを照射する工程を有するものである方法。
25. 請求項１８記載の方法において、さらに、
    対象試料の２若しくはそれ以上の試料空間位置に対して、前記対象試料が前記拡大鏡の光学面に対して特定の空間位置にあるときに、少なくとも約５度の入射角で傾斜する少なくとも１つの放射ビームが照射された前記対象試料から反射放射線が照射することが分かっている前記放射線検出器上の位置を含むデータセットを構築する工程を有するものである方法。
26. 請求項２５記載の方法において、前記相関させる工程は、前記放射線検出器上に収集された前記反射放射線の位置をライブラリと比較する工程を有するものである方法。
27. 自動焦点装置であって、
    拡大鏡と、
    試料ステージであって、前記拡大鏡および当該試料ステージのうちの少なくとも１つが傾斜、回転、上昇、下降、またはこれらの何れかの組み合わせを実行することが可能である、前記試料ステージと、
    少なくとも約５度の入射角で放射ビームを前記試料ステージに配置された試料に照射することが可能な放射線源と、
    前記試料ステージに配置された試料と光学的に連通し、前記試料ステージに配置された前記試料から反射された任意の放射線のうちの少なくとも一部を収集することが可能な放射線検出器と、
    前記試料ステージに配置された前記試料から放射線検出器上に反射された任意の放射線の位置を前記拡大鏡に対する前記試料の空間位置と相関させることが可能な装置と
    を有する自動焦点装置。
28. 請求項２７記載の自動焦点装置において、前記放射線検出器は、電荷結合デバイス、相補型金属酸化物半導体、フォトダイオード、フォトマルチプライヤチューブ、またはこれらの何れかの組み合わせを有するものである自動焦点装置。
29. 請求項２７記載の自動焦点装置において、前記拡大鏡は、顕微鏡を含むものである自動焦点装置。
30. 請求項２７記載の自動焦点装置において、前記放射線源は、レーザを含むものである自動焦点装置。
31. 請求項２７記載の自動焦点装置において、さらに、
    前記拡大鏡の空間位置を制御するコントローラを有するものである自動焦点装置。
32. 請求項２７記載の自動焦点装置において、さらに、
    前記試料ステージの空間位置を制御するコントローラを有するものである自動焦点装置。
33. 請求項２７記載の自動焦点装置において、さらに、
    前記放射ビームを複数の放射ビームに分離することが可能なスプリッタを有するものである自動焦点装置。

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