JP2012519484A - マイクロｒｎａ応答要素を含む弱毒化生インフルエンザウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、一以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）応答要素（ＭＲＥ）をインフルエンザウイルスゲノム内に含む新規な弱毒化生インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）ワクチンに関する。本発明に有用なＭＲＥは、ワクチン接種を必要とする動物のインフルエンザ標的細胞では高度に発現するが、大規模なワクチン作出に用いる種（例えば、発育鶏卵）や細胞株では発現しないか又は発現が非常に低レベルである如何なるｍｉＲＮＡにも由来することができる。これによって、効率的なワクチン作出が可能となるが、ワクチンウイルスは同族ｍｉＲＮＡを発現するワクチン接種した動物のインフルエンザ標的細胞において弱毒化の影響を受けやすくなる。

Description

政府支援の研究又は開発
本発明は、若手研究者プログラム（Young Investigator Program）（ＹＩＰ）の一環として陸軍研究事務所（ＡＲＯ）の助成（Award#54677LSYIP）を受けた研究の過程で一部なされたものである。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の技術分野
本発明は、一般にはインフルエンザウイルス感染症の予防に関し、詳細には、季節性インフルエンザウイルス株及び大流行の可能性があるインフルエンザウイルス株による感染症の予防に関する。より詳細には、一以上のマイクロＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）を含む新規の弱毒化生インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）ワクチンを本明細書に開示する。

発明の背景
ヒトにおけるインフルエンザウイルス感染症は、重症度の範囲が無症状感染から死に至る可能性のある原発性ウイルス肺炎までに及ぶ呼吸器疾患である。インフルエンザ関連の合併症としては、特に、ライエ症候群や心筋炎、心膜炎、筋炎、脳症、横断性脊髄炎が挙げられる。インフルエンザウイルスはしつこく、束縛がないので、毎年の流行がもたらされると共に、壊滅的な人命の損失を引き起こす可能性のある散発的な大流行がもたらされる。Palese et al., Nature Medicine 8(9):927 (2002)。季節性インフルエンザは、米国では死亡原因の第７位であり、１〜４歳の子供の死亡原因の第１位である。６５歳以上の死者の９０％は肺炎を伴うインフルエンザウイルス感染症によるものである。米国では毎年、約３６，０００人が死亡し、１１４，０００人が入院し、１０億ドルを超える直接の経済的損害を被る。

３種類のインフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ及びＣ）はその内部抗原の抗原反応性によって区別することができる。インフルエンザＡ、Ｂ及びＣは、オルトミクソウイルス科に属し、感染細胞の核で複製する分割型マイナス鎖ＲＮＡゲノムを有し、１０種のポリペプチド、即ち、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、血球凝集素（ＨＡ、これは酵素切断後、サブユニットＨＡ１及びＨＡ２の結合によって構成される）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）、及び非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２、核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）とも称する）をコードする８種のマイナスセンスＲＮＡ（ｎｓＲＮＡ）遺伝子セグメントから成る。Krug et al., In The Influenza Viruses, R.M. Krug, ed., Plenum Press, New York, 1989, pp. 89-152。ウイルスエンベロープに埋め込まれたＨＡ及びＮＡタンパク質は、インフルエンザウイルスの主要な抗原決定基である（Air et al., Structure, Function, and Genetics, 1989, 6:341-356; Wharton et al., In The Influenza Viruses, R. M. Krug, ed., Plenum Press, New York, 1989, pp. 153-174）。インフルエンザウイルスのセグメントゲノムの可能な再集合（抗原シフト）及びゲノム多型の蓄積（抗原ドリフト）に起因して新しいＨＡ及びＮＡ変異体が常に産生するが、これに対して、新たに感染した生物は既往免疫応答を有しない。このように数多くの循環している株から新しい抗原変異体が常に産生することによって、新たな高病原性株（例えば、トリやブタ種からヒトへ直接伝染するＨ５Ｎ１及びＨ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス等）の出現の危険性が高まり、毎年のワクチン接種や多くの株又は全ての株に対して有効な抗ウイルス剤の開発が必要となる。Palese, Nature Medicine 10(12 Suppl):S82 (2004); Garcia-Sastre and Biron, Science 312(5775):879 (2006); Li et al., Nature 2004, 430:209; Kuiken et al., Science 2004, 306:241。こうして、世界保健機関は最新の株をモニターし、毎年のワクチンの組成を常に更新しなければならない。安全で有効なワクチンを作出するためには、選択したワクチン株が流行している株に密接に関係しており、それによって、確実にワクチン接種集団における抗体が抗原的に類似したウイルスを中和できるようにすることが重要である。

３種類のインフルエンザウイルスの内、インフルエンザＡ及びＢウイルスはヒトにおいて高い罹患率や死亡率の原因となる。Fields et al., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2007。従って、インフルエンザウイルス感染に対抗するのに用いる毎年のワクチンには２種のインフルエンザＡ株と単一のインフルエンザＢ株との組み合わせが含まれる。Palese, Nature Medicine 10(12 Suppl):S82 (2004)。

このようなウイルス株の増殖は通常、発育鶏卵で行われるが、そこではウイルスは非常に高い力価まで増殖される。卵内で産生したウイルス粒子を次いで精製し、ワクチン製剤用ストックとして用いる。最近、大規模なインフルエンザワクチン作出用の哺乳動物細胞培養システムも確立されている。例えば、Genzel and Reichl, Expert Review of Vaccines, 2009, 8(12):1681 -1692.を参照。現在、３種の異なる哺乳動物細胞株（メイディン・ダービー・イヌ腎臓［ＭＤＣＫ］細胞、ベロ細胞及びＰＥＲ．Ｃ６細胞）で作出したワクチンが治験中である。

近年開発されたリーバースジェネティックスシステムによってインフルエンザウイルスゲノムの操作が可能になった（Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11354; Neumann and Kawaoka, Adv. Virus Res. 1999, 53:265; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; 米国特許公開第２００４００２９２５１号）。例えば、ｐｏｌＩプロモーター由来の８種のインフルエンザｖＲＮＡとｐｏｌＩＩプロモーター由来の全ｍＲＮＡのプラスミド駆動発現によって感染性インフルエンザＡウイルスの生成がもたらされることが示された（Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6108; Hoffmann et al., Vaccine 2002, 20:3165; 米国特許第６，９５１，７５４号）。

米国及びヨーロッパで公衆衛生当局から現在使用が認可されているインフルエンザワクチンは、不活化インフルエンザワクチンと米国の弱毒化生ＦＬＵＭＩＳＴワクチンである。

不活化ワクチンは、細胞培養又は発育鶏卵で増殖したウイルスを化学的に不活化することによって作出する。化学的不活化は通常、洗浄剤介在の断片化に続けて行う。通常の不活化／断片化処理では、ホルマリン＋トリトンやホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エーテル、エーテル＋ツイーン８０、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）＋トリトンＮ１０１、デオキシコール酸ナトリウム、リン酸トリ（ｎ−ブチル）等の剤を用いる。Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapters 23, 24, 27, pp. 317-332 and 358-372。卵内で産生したウイルスの場合、不活化は尿膜液の清澄化の後又は清澄化の前に行うことができる。不活化によってワクチンの安全性は劇的に高まるが、ワクチンの効力は低下する。また、複製活性の損失を確実にするためのワクチン試験は時間が掛かると共に労働集約的であり、これによってワクチンの費用が増加し、急速に蔓延する季節性感染や大流行時にワクチンの有用性が低下する。

現在のワクチン戦略は、温度感受性変異体の開発やＮＳ１タンパク質等の病原性因子の除去による弱毒化生インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）株に着目している。Talon, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:4309-4314 (2000); Nichol, Vaccine, 19:4373-4377 (2001); Palese et al., J. Infect. Dis., 1997, 176 Suppl l :S45-9。例えば、ＦＬＵＭＩＳＴ（生インフルエンザウイルスワクチン、鼻腔内）には、（ａ）低温に適応し（即ち、２５℃（多くの野生型インフルエンザウイルスの複製を制限する温度）で効率的に複製する）、（ｂ）温度感受性であり（即ち、Ｂ型株は３７℃、Ａ型株は３９℃で複製が制限される（多くの野生型インフルエンザウイルスはこのような温度で効率的に増殖する））、（ｃ）弱毒化された（ヒトインフルエンザ感染のフェレットモデルで古典的なインフルエンザ様疾病を引き起こさない）インフルエンザウイルス株が含まれる。

伝統的な不活化ワクチンに比べて、ＬＡＩＶワクチンは粘膜（例えば、鼻腔内）投与に良く適しており、局所的な粘膜の細胞介在による体液性免疫を誘導することによってより強い免疫応答が生じる。Treanor et al., New England J. Med. 354(13): 1343 (2006)。それでも、現在のＬＡＩＶワクチンは弱毒化され過ぎており、高齢者（即ち、インフルエンザ感染によって毎年米国で死亡する２０，０００〜４０，０００人のグループ）において強い免疫応答を刺激することができない。最も重要なのは、現在のＬＡＩＶワクチンは、適切な卵発生に必要な次善の温度での増殖に適応させたため、発育鶏卵において複製障害を被っており、これによってその後のワクチン作出の規模が制限されることである。高病原性の流行株が出現する場合には、世界的規模でのワクチン作出におけるこのような障害を克服する必要がある。Li et al., Nature 430(6996):209 (2004) and Krug, Science 311(5767):1562 (2006)。

従って、当該技術分野においては、防御免疫を生じさせる上で安全、効率的であり、鶏卵及び／又は細胞培養において迅速で大規模な作出に適した新しいインフルエンザワクチンに対する要求が大きい。特に、当該技術分野においては、新しくより効率的なＬＡＩＶワクチンに対する要求が大きい。

発明の概要
本発明は、一以上の種特異的及び／又は組織／細胞特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）応答要素（ＭＲＥ）を含む新規の弱毒化生インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）ワクチンを提供することによって当該技術分野における上述の要求や他の要求に対処するものである。本発明のＬＡＩＶワクチンに有用な組織／細胞特異的ＭＲＥ及び種特異的ＭＲＥは、ワクチン接種対象の動物においてインフルエンザウイルスの標的となる特定の細胞型や組織型（例えば、上皮細胞や分泌細胞［クララ］、繊毛細胞、頂端細胞、杯細胞［粘膜］、造血細胞［例えば、樹状細胞やマクロファージ、リンパ球］、気管支細胞、インフルエンザウイルスの標的となる肺や上気道の他の細胞）で高レベルで発現するｍｉＲＮＡ、及び／又はワクチン接種対象の選択種（例えば、ヒトやマウス、イヌ、ニワトリ）では高レベルで発現するが、大規模なワクチン作出に用いる細胞株や種（例えば、発育鶏卵［ニワトリ］）では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡと結合し、それによって転写後に阻害される。インフルエンザゲノムのコード領域へのＭＲＥ挿入は、エスケープ変異体の出現を防止してワクチンの安全性を高めるために好ましいが、本発明は、インフルエンザゲノムの他の部分、及び人工的に作出したインフルエンザウイルスの３’ＵＴＲへのＭＲＥの組み込みも包含する。本発明のＭＲＥを利用した弱毒化生ワクチン戦略によって、新たに出現する季節性及び流行性インフルエンザ株に対する大量のワクチンを迅速に作出するのに必要な汎用性、安全性及び有効性がもたらされる。

本発明は、そのより一般的な一様相において、組換え作出に適した如何なるウイルスにも適用することができる。本発明によると、ウイルスゲノムに種特異的ＭＲＥ及び／又は組織／細胞特異的ＭＲＥを挿入することによって、弱毒化生ワクチンとして用いることができると共に、このようなウイルスの標的とならない組織／細胞由来の他の種や細胞株で効率的に増殖することができる組換えウイルスの作出が可能となる。

具体的には、本発明は、その第１の様相において、一以上のＭＲＥ配列を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物を提供する。好ましい一実施形態においては、インフルエンザウイルスは二以上のＭＲＥ配列を含む。このような二以上のＭＲＥは、同一の配列を有する場合もあり、同一のＭＲＥシード配列（即ち、ｍｉＲＮＡ配列の５’位置１〜７又は２〜８）を維持しながら幾つかのヌクレオチド位置が異なる場合もあり、二以上の異なるｍｉＲＮＡに対応する場合もある。

好ましい一実施形態においては、このような一以上のＭＲＥ配列を一以上のインフルエンザウイルス遺伝子のコード領域内に挿入する。このような一以上のＭＲＥは、アミノ酸変化の数が最小限に維持されてウイルスタンパク質機能が保存される限り、リーディングフレームに関わらず挿入することができる。ＭＲＥは、如何なるインフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＨＡやＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＥＰ）のコード領域にも挿入することができる。異なるインフルエンザ株間で保存されているインフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＰＢ１やＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＥＰ）のコード領域にＭＲＥを挿入することが好ましい。

他の具体的な実施形態においては、人工的に作出したインフルエンザウイルスの３’ＵＴＲへＭＲＥ配列を挿入する。

具体的な一実施形態においては、インフルエンザウイルスゲノムに挿入されるＭＲＥは、種特異的及び／又は組織／細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡに対応する。一実施形態においては、インフルエンザウイルスゲノムに挿入されるＭＲＥは、哺乳動物細胞では高度に発現するが、発育鶏卵内でインフルエンザウイルス増殖が生じる領域では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応する。具体的な一実施形態においては、ＭＲＥは、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−９２及びｍｉＲ−９３から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応する。例えば、このようなＭＲＥは、配列５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ−３’（配列番号１）を有するｍｉＲ−１６、配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’(配列番号２）を有するｍｉＲ−１７、配列５’−ＵＧＵＧＣＡＡＡＵＣＵＡＵＧＣＡＡＡＡＣＵＧＡ−３’（配列番号３）を有するｍｉＲ−１９、配列５’−ＣＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＵＣＧＧＵＣＵＧＡ−３’（配列番号４）を有するｍｉＲ−２５、配列５’−ＵＧＧＣＡＧＵＧＵＣＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧＵ−３’（配列番号５）を有するｍｉＲ−３４、配列５’−ＵＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧ−３’（配列番号６）を有するｍｉＲ−９２、及び配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＧＵＵＣＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’（配列番号７）を有するｍｉＲ−９３から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応することができる。

他の実施形態においては、インフルエンザウイルスゲノムに挿入されるＭＲＥは、ワクチン接種対象の動物においてインフルエンザウイルスの標的となる組織では高度に発現するが、インフルエンザウイルスの増殖や大規模な作出に用いる細胞株では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応する。具体的な一実施形態においては、ＭＲＥは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９７７、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１２５９及びｍｉＲ−１９７８から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応する。例えば、このようなＭＲＥは、配列５’−ＵＧＵＡＧＵＧＵＵＵＣＣＵＡＣＵＵＵＡＵＧＧＡ−３’（配列番号１４１）を有するｍｉＲ−１４２、配列５’−ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＵ−３’（配列番号１４２）を有するｍｉＲ−２２２、配列５’−ＵＣＵＧＧＵＣＣＧＵＧＵＣＵＵＣＡＣＵＣＣＣ−３’（配列番号１４３）を有するｍｉＲ−１４９、配列５’−ＧＡＵＵＡＧＧＧＵＧＣＵＵＡＧＣＵＧＵＵＡＡ−３’（配列番号１４４）を有するｍｉＲ−１９７７、配列５’−ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ−３’（配列番号１４５）を有するｍｉＲ−１８１ｂ−２、配列５’−ＡＵＡＵＡＵＧＡＵＧＡＣＵＵＡＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１４６）を有するｍｉＲ−１２５９、及び配列５’−ＧＧＵＵＵＧＧＵＣＣＵＡＧＣＣＵＵＵＣＵＡ−３’（配列番号１４７）を有するｍｉＲ−１９７８から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応することができる。

本発明の組換え弱毒インフルエンザウイルスは、その具体的な一実施形態において、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２から成る群から選択されるインフルエンザサブタイプに由来する。本発明の組換え弱毒インフルエンザウイルスは、その一実施形態において、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／５９、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３０８／７８、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４、Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／６１６／１９９５、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１６／６８、Ａ／ＵＳＳＲ／０３９／６８、Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／Ｃ５／８５、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／４７／５７、及びＡ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０から成る群から選択される分離株に由来する。

ウイルス含有組成物と共に、本発明は、ＭＲＥ含有インフルエンザウイルスの作出に用いることができる組換え核酸も提供する。従って、本発明は、その別の一実施形態において、一以上のＭＲＥ配列が内部に挿入されたインフルエンザウイルス配列を含む単離核酸分子を提供する。本発明の核酸は、その具体的な一実施形態において、ＭＲＥとその対応するｍｉＲＮＡとの相互作用の平均自由エネルギー（ＭＦＥ）が−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。本発明の核酸は、その他の実施形態において、ＭＲＥとその対応するｍｉＲＮＡとの相互作用の平均自由エネルギー（ＭＦＥ）が−３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。以下に本発明の核酸分子の具体的な非限定的例について更に記載する。

１．ｍｉＲ−９３に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＰのコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＮＰアミノ酸６２〜６９をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＮＰアミノ酸２５８〜２６５をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＡＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１０７）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＣＣＴＴＧＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＴＡ−３’（配列番号１１１）を含むことができる。

２．ｍｉＲ−９２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１のコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＮＳ１アミノ酸１３１〜１３７をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＮＳ１アミノ酸１５０〜１５６をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ−３’（配列番号９７）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＡＴＡ−３’（配列番号１０１）を含むことができる。

３．ｍｉＲ−９２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡのコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸６８〜７４をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸１９５〜２０１をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸５２６〜５３２をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＴ−３’（配列番号８３）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＧＣＣＴＡＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号８７）を含むことができ、第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＡＧＧＴＧＣＡＡＴＡ−３’（配列番号９１）を含むことができる。

４．ｍｉＲ−１９に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡのコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸１５〜２２をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸５６１〜５６８をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸３２７〜３３４をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡ−３’（配列番号４５）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＴＡ−３’（配列番号４９）を含むことができ、第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＧＣＧＵＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＴＴＧＣＧＣ−３’（配列番号５３）を含むことができる。

５．ｍｉＲ−１６に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡのコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸２〜９をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸４３９〜４４５をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号２１）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＧＣＣＧＡＡＣＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号２５）を含むことができる。

６．ｍｉＲ−３４に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＰＡのコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＰＡアミノ酸４２６〜４３３をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＰＡアミノ酸６３４〜６４１をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＰＡアミノ酸７０９〜７１６をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号６９）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＧＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＴＡ−３’（配列番号７３）を含むことができ、第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡ−３’（配列番号７７）を含むことができる。

７．ｍｉＲ−２５に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質Ｍ１のコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＭ１アミノ酸１１１〜１１８をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＭ１アミノ酸１２７〜１３４をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴ−３’（配列番号５９）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号６３）を含むことができる。

８．ｍｉＲ−１７に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＰＢ１のコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含む核酸分子であって、第１のＭＲＥ配列はＰＢ１アミノ酸３７４〜３８１をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＰＢ１アミノ酸４１８〜４２４をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＰＢ１アミノ酸６７７〜６８３をコードするヌクレオチド配列にある核酸分子。例えば、第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＣＴＴＴ−３’（配列番号３１）を含むことができ、第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号３５）を含むことができ、第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号３９）を含むことができる。

９．ｍｉＲ−１４２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＰの人工３’ＵＴＲに挿入されている４種のＭＲＥを含む核酸分子であって、ＭＲＥ配列はウイルス終止コドンとポリＡテール配列との間に存在する核酸分子。例えば、４種の反復ＭＲＥはヌクレオチド配列５’−ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ−３’（配列番号１５９）を含むことができる。

１０．ｍｉＲ−１４２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１の人工３’ＵＴＲに挿入されている４種のＭＲＥを含む核酸分子であって、ＭＲＥ配列はウイルス終止コドンとポリＡテール配列との間ではあるが、複製ＮＳ２／ＮＥＰのＯＲＦの前に存在する核酸分子。例えば、４種の反復ＭＲＥはヌクレオチド配列５’−ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ−３’（配列番号１５９）を含むことができる。

上述の具体例に記載のインフルエンザヌクレオチドとアミノ酸の位置はインフルエンザＡウイルス株であるＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ（Ｈ１Ｎ１）に相当する。具体的には、これらの位置は次のＧｅｎＢａｎｋ登録番号に相当する。

本発明の組換えウイルスは、その具体的な一実施形態において、更なる弱毒化変異を含む。一実施形態においては、このような変異によって温度感受性ウイルス増殖（例えば、ＦＬＵＭＩＳＴに用いる変異）がもたらされる。他の実施形態においては、このような変異は病原性因子の除去（例えば、ＮＳ１タンパク質の除去）である。

本発明の組成物は、その好ましい一実施形態においてワクチン組成物である。このようなワクチン組成物はアジュバントを更に含むことができる。

ワクチン組成物と共に、本発明は、動物においてインフルエンザ感染に対する防御免疫応答を誘導する方法であって、本発明のＭＲＥ含有組換えインフルエンザワクチン組成物を前記動物に投与することを含む方法も提供する。好ましい一実施形態においては、動物はヒトである。他の実施形態においては、動物はトリ（例えば、水鳥やニワトリ）である。更に他の実施形態においては、動物はブタである。具体的な一実施形態においては、ワクチン組成物は粘膜投与する。他の具体的な実施形態においては、ワクチン組成物はアジュバントと共に投与する。

図１（Ａ）上：ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−９３又はｍｉＲ−１２４）の外因性送達に用いる単一イントロン（ｐＲＦＰ）を含む赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）ミニ遺伝子の概略図。図１（Ａ）下：ｐＲＦＰトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞の蛍光顕微鏡法。 図１（Ｂ）：ＨＥＫ−２９３細胞の偽感染又はインフルエンザウイルス感染後のｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１２４及びＵ６ｓｎＲＮＡのノーザンブロット。 図１（Ｃ）：ｍｉＲ−１２４と、ＳＶ４０又はｍｉＲ−１２４標的３’ＵＴＲを含むルシフェラーゼレポーター構築物とをコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞。トランスフェクション６時間後、細胞をインフルエンザウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））に１．０のＭＯＩで感染させ、感染１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。 図１（Ｄ）：インフルエンザウイルスＮＳ１と、ｍｉＲ−１２４と、図１（Ｃ）に記載のＳＶ４０又はｍｉＲ−１２４標的３’ＵＴＲを含むルシフェラーゼレポーター構築物とをコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞。ルシフェラーゼ活性はトランスフェクション２４時間後に測定した。図１（Ｃ）及び（Ｄ）において、ルシフェラーゼ活性はウミシイタケ対照ベクターに対して標準化した。データは３種類の独立したトランスフェクション（各々３回実施）の平均であり、エラーバーは＋／−ＳＤを示す。各グラフ下のウェスタンブロットは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に対するポリクローナル抗体によって測定したインフルエンザマトリックス及びＮＳ１タンパク質の発現を示す。 図２（Ａ）上：１０日齢の発育鶏卵膜及び初代マウス肺組織のノーザンブロット。ｍｉＲ−９３及びＵ６ｓｎＲＮＡ負荷対照用プローブを示す。下のグラフは、ＣＣＤカメラで化学発光を検出して行い、任意単位（ａ．ｕ．）で表した対応するバンド強度の定量化を示す。 図２（Ｂ）：ｍｉＲ−９３応答要素組み込み用インフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）のｍＲＮＡ部位とインフルエンザウイルス株の全体保存の概略図。単一の同義変異を「＊」で示す。 図２（Ｃ）：部位１及び部位２を非応答性親（ＰＲＮＴＬ）部位又はｍｉＲ−９３応答性（９３ＮＰ１／２）部位に形質転換させるためのＲＮＡ塩基置換の概略図（「＊」はアミノ酸置換を示す）。 図２（Ｄ）：ヌクレオカプシド無し（−）、野生型ＮＰ（ＷＴ）又はＰＲＮＴＬ ＮＰ（ＰＲＮＴＬ）のコンテクストにおけるインフルエンザウイルスポリメラーゼを利用したルシフェラーゼレポーターアッセイ。ルシフェラーゼ活性はトランスフェクション２４時間後に測定し、ウミシイタケ対照ベクターに対して標準化した。データは３種類の独立したトランスフェクション（各々３回実施）の平均であり、エラーバーは＋／−ＳＤを示す。 図２（Ｅ）：１０日齢の発育卵のＰＲＮＴＬ及びＭＲＥ含有インフルエンザウイルス感染によるウイルス力価。力価は、感染２日後に尿膜液の血球凝集及びプラークアッセイによって求め、プラーク形成単位／ｍＬ（ｐｆｕ／ｍＬ）で表した。データは２種類の独立した感染の平均である。 図３（Ａ）：インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ａ／ＰＲ／８／３４）ＰＲＮＴＬ、９３ＮＰ２及び９３ＮＰ１／２に感染させ、感染１２時間後、２４時間後及び４８時間後（ｈｐｉ）に回収した野生型（ＷＴ）線維芽細胞及びダイサー−／−マウス線維芽細胞のウェスタンブロット。血球凝集素（ＨＡ）及びアクチンタンパク質のレベルのイムノブロットを示す。 図３（Ｂ）：非刺激のＷＴ及びダイサー−／−線維芽細胞のノーザンブロット。ｍｉＲ−９３及びＵ６ｓｎＲＮＡ用プローブを示す。下のグラフは、対照Ｕ６ｓｎＲＮＡの強度に対するｍｉＲ−９３の測定値を任意単位（ａ．ｕ．）で表した対応するバンド強度の定量化を示す。 図３（Ｃ）：感染５日後（ｄｐｉ）の感染マウス肺のＲＴ−ＰＣＲ解析。ウイルスはＰＲＮＴＬ、９３ＮＰ１、９３ＮＰ２及び９３ＮＰ１／２である。インターフェロン調節因子７（ＩＲＦ７）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターロイキン６（ＩＬ６）及びヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に特異的なプライマーを示す。 図３（Ｄ）：図３（Ｃ）に記載のマウス感染のＩＲＦ１、ＳＴＡＴ１、インターフェロン刺激遺伝子５４（ＩＳＧ５４）及びアクチンタンパク質のレベルを示すウェスタンブロット。 図３（Ｅ）：エクスビボでの複数の継代後又はインビボでの感染５日後に単離したインフルエンザウイルスＮＰクローンの代表的な配列。 図４（Ａ）：ＰＲＮＴＬ又はＭＲＥ含有（９３ＮＰ１／２）Ｈ５Ｎ１キメラウイルスによる鼻腔内チャレンジ後の１０日間経過における生存率を示すグラフ。データは、各接種量の平均とウイルス処理（ｎ＝４／コホート）を示す。 図４（Ｂ）：接種量を１×１０⁴プラーク形成単位（ｐｆｕ）／感染とした時の図４（Ａ）に記載のマウスの最初の重量からの平均重量減少によって表される罹患。 図４（Ｃ）：ワクチン接種及びキメラＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスによる第２の致死的チャレンジ後の生存率を示すグラフ。非チャレンジコホート（ｎ＝２／処理）及びＨ５Ｎ１チャレンジ（ｎ＝７／処理）から得たデータを平均生存率で示す。 図４（Ｄ）：ＰＢＳ又は９３ＮＰ１／２でワクチン接種した後、ＰＲＮＴＬ Ｈ５Ｎ１（１×１０⁶ｐｆｕ／マウス）で再チャレンジしたマウスの最初の重量からの平均重量減少によって表される罹患。データは、図４（Ｃ）に記載のコホートにおける平均重量減少で示す。エラーバーは平均の＋／−ＳＤを示す。 図５：ヒトｍｉＲＮＡ含有転写物のＲＴ−ＰＣＲ。胎児腎臓細胞株（ＨＥＫ−２９３）、肺上皮細胞株（Ａ５４９）、Ｔリンパ球細胞株（ジャーカット）、星状細胞株（Ｕ３７３）及び初代樹状細胞（ＤＣ）に由来する非刺激の全細胞ＲＮＡ。ｍｉＲＮＡの発現はＰＣＲ増幅によって確認。チューブリンはＲＮＡ負荷対照として示す。 図６：野生型（ＷＴ）線維芽細胞及びダイサー−／−マウス線維芽細胞におけるインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（９３ＮＰ１）感染のウェスタンブロット。イムノブロットは血球凝集素（ＨＡ）及びアクチンタンパク質のレベルを示す。 図７：インフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）及びＡ５４９肺上皮細胞由来チューブリン転写物のＲＴ−ＰＣＲ。Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ＰＲＮＴＬ）、（９３ＮＰ２）及び（９３ＮＰ１／２）を用いて低ＭＯＩで感染させ、図示のように継代した。回収時の感染細胞由来の全ＲＮＡを高忠実度ポリメラーゼを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅し、２％アガロースにて分割した。 図８Ａ〜Ｄ：弱毒化生ワクチンとしてのＭＲＥシードインフルエンザＡウイルス。図８（Ａ）：１０ｅ３ＰＦＵのＰＲＮＴＬ又はＭＲＥシード９３ＮＰ１／２Ｈ１Ｎ１ウイルスで鼻腔内にワクチン接種し、感染２１日後（ｄｐｉ）に５×１０ｅ３ＰＦＵのＷＴ Ａ／ＰＲ８／３４でチャレンジしたマウスの最初の体重からの平均重量減少を示すグラフ。データは各コホート（ｎ＝４）の平均を示し、エラーバーは＋／−ＳＤを示す。右のパネルは、正の血球凝集阻害を得るために最低血清希釈によって求めたチャレンジ後の抗体応答、及びＥＬＩＳＡによって測定した免疫グロブリン応答を示す。 図８Ａ〜Ｄ：弱毒化生ワクチンとしてのＭＲＥシードインフルエンザＡウイルス。図８（Ｂ）：図示のＨ５Ｎ１リアソータントウイルスについてのセグメント分布を示す表。 図８Ａ〜Ｄ：弱毒化生ワクチンとしてのＭＲＥシードインフルエンザＡウイルス。図８（Ｃ）：１０日齢の発育卵のＰＲＮＴＬ及びＭＲＥシードＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスリアソータント感染によるウイルス力価を示す棒図表。力価は、感染２日後に尿膜液の血球凝集及びプラークアッセイによって求め、ｐｆｕ／ｍＬで表した。データは４種類の独立した感染の平均である。 図８Ａ〜Ｄ：弱毒化生ワクチンとしてのＭＲＥシードインフルエンザＡウイルス。図８（Ｄ）：図８（Ａ）と同様、Ｈ５Ｎ１リアソータントＰＲＮＴＬ又はＭＲＥシード９３ＮＰ１／２によるワクチン接種。 図９：種特異的弱毒化のための設計戦略。部位１、部位２及び部位３をｍｉＲ−３４標的ＰＡに形質転換させるためのＲＮＡ塩基置換の概略図。ｍｉＲ−３４は哺乳動物特異的ｍｉＲＮＡである。各部位において平均自由エネルギーをｋｃａｌ／ｍｏｌで示す。ウイルスは卵内でレスキューし、図示の時点（ＨＰＩ：感染後時間）でＤＦ１ニワトリ線維芽細胞又はマウス初代肺線維芽細胞の感染に用いた。ＰＡ＿ＰＲＮＴはｍｉＲ−３４の標的とはならない野生型ウイルスであり、ＰＡ＿ｍｉＲ３４はＰＡが図示の３部位で標的となるウイルスである。 図１０（Ａ）：組織培養におけるインフルエンザＡウイルス非翻訳領域（ＵＴＲ）ターゲティングを示す概略図。パッケージング配列（ｖＲＮＡ画像上に一定の縮尺で表示）を破壊することなくｍＲＮＡの３’ＵＴＲを拡大するため、最後の８０〜１２０塩基対を複製して、終止コドン（ＳＴＯＰ）とポリＡテール（ＵＵＵＵＵＵ）との間にスクランブル要素（ｓｃｒｂｌ）又はｍｉＲＮＡ標的要素（ＭＲＥ）が挿入できるようにした。ＮＣＲはウイルスＲＮＡの非コード領域を示す。 図１０（Ｂ）：ｍｉＲＮＡの外因性送達に用いる単一イントロン（ｐＲＦＰ）を含む赤色発光タンパク質ミニ遺伝子の概略図。 図１０（Ｃ）：線維芽細胞（ＭＤＣＫ細胞）由来ｍｉＲ−１４２、トランスフェクト線維芽細胞（ｐＲＦＰ−ｍｉＲ−１４２をトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞）及び初代マウスマクロファージのノーザンブロット。 図１０（Ｄ）：ＭＤＣＫ細胞内ｍｉＲ−１４２のノーザンブロット。 図１０（Ｅ）：偽感染、スクランブル３’ＵＴＲを有するＮＰをコードするウイルス（ＮＰ＿ＵＴＲ）又はｍｉＲ−１４２応答要素をコードするＵＴＲ（ＮＰ＿１４２）からのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ＮＰ、Ｍ１及びアクチンの発現を示すウェスタンブロット。タンパク質抽出物は、ＭＤＣＫ対照細胞又はｍｉＲ−１４２を発現するＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ＿１４２）から感染（ＭＯＩ＝１）１２時間後に回収した。 図１０（Ｆ）：対照ウイルス（ＮＳ１＿ＵＴＲ）又はｍｉＲ−９３標的ＮＳ１ウイルスに図示の時点で感染させた初代肺線維芽細胞又はマクロファージ（Zhu et al., Nature Protocols, 2010, 5(3):550に記載のものに適応されたプロトコルを用いて作出）由来のマトリックス（Ｍ１）、ＮＳ１及びアクチンのウェスタンブロット。用いたウイルスはＮＳ１＿ＵＴＲ及びｍｉＲ−１４２標的ＮＳ１（ＮＳ１＿１４２）である。

発明の詳細な説明
本発明は、細胞のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロセシング機構を利用して種特異的及び／又は組織／細胞特異的にウイルス弱毒化を誘導して有効且つ安全な弱毒化生ウイルスワクチンを作出することができるという予期せぬ発見に基づく。具体的には、本発明は、一以上のインフルエンザウイルス遺伝子のコード領域及び／又は人工３’ＵＴＲ内に挿入された一以上のｍｉＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）を含む新規の弱毒化生インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）ワクチンを提供する。

ｍｉＲＮＡとは、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害又は異質染色質サイレンシングによって標的ｍＲＮＡの発現を調節して全体的なタンパク質産生に影響を及ぼす、小さい１９〜２５塩基対（ｂｐ）の内在性一本鎖ＲＮＡである。Baek et al., Nature 455(7209):64 (2008); Selbach et al., Nature 455(7209):58 (2008); Ambros, 2004, Nature, 431 , 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531 ; and Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28。ｍｉＲＮＡは７ｂｐの「シード」配列（即ち、ｍｉＲＮＡの５’位置１〜７又は２〜８の配列）によって標的ｍＲＮＡを調節する。「シード」に対するｍＲＮＡ配列の相補性は通常、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に存在する。Bartel, Cell 116(2):281 (2004)。

組織制限ｍｉＲＮＡに対応するＭＲＥは、レンチウイルス、ピコルナウイルス及びラブドウイルスの既存の非翻訳領域（ＵＴＲ）に挿入されて組織特異的ウイルス弱毒化を達成している。Brown et al., Nature Medicine 12(5):585 (2006); Barnes et al., Cell Host & Microbe 4(3):239 (2008); and Kelly et al., Nature Medicine 14(11):1278 (2008)。

このような戦略によって特定の組織におけるウイルス弱毒化がもたらされるが、そのインフルエンザワクチン作出に対する適用は、ＭＲＥ挿入（即ち、ＭＲＥが最も有効であり、インフルエンザウイルスゲノムセグメントのＲＮＡ末端に対する如何なる付加や変化も複製欠損やパッケージング欠損をもたらす）に十分な長さの３’ＵＴＲをインフルエンザウイルスが産生しないという事実によって妨げられる。Muramoto et al., J. Virol. 80(5):2318 (2006)。更に、非翻訳配列はタンパク質コード配列に比べて選択圧をあまり受けないため、タンパク質コード配列の進化的保存の程度がより大きいことからも明らかなように、非コード領域へのＭＲＥの挿入によって「エスケープ」変異体が出現する可能性が高くなるが、このような組換えウイルスはワクチン作出において安全ではない。

本発明は、上述の弱毒化戦略のいずれかをインフルエンザＡウイルスワクチン作出に適用するうえでの不足を克服する新規なアプローチを構成する。このアプローチは、一以上の種特異的及び／又は組織／細胞特異的ＭＲＥをインフルエンザウイルスゲノム内の戦略的位置（好ましくは、ウイルスタンパク質コード配列内、又は人工３’ＵＴＲ内［例えば、ウイルスパッケージング配列の複製及び終止コドンとポリＡテールとの間への遺伝的挿入によって作出］）に組み込み、種特異的及び／又は組織／細胞特異的ウイルス弱毒化をもたらすことに基づく。ワクチン接種対象の動物においてインフルエンザウイルスの標的となる細胞や組織では高度に発現するが、大規模なワクチン作出に用いる細胞株や発育鶏卵では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応するＭＲＥを用いることによって、ワクチン作出時に高いウイルス力価を達成しながら、同族ｍｉＲＮＡを発現する細胞でウイルス弱毒化を保持することができる。インフルエンザコード領域内にＭＲＥを挿入することによって、エスケープ変異体の産生が妨げられ、ワクチンの安全性が高まる。

本発明に有用なＭＲＥは、ワクチン接種を必要とする動物（例えば、ヒト）のインフルエンザ標的細胞（例えば、上皮細胞や分泌細胞［クララ］、繊毛細胞、頂端細胞、杯細胞［粘膜］、気管支細胞、造血細胞［例えば、樹状細胞やマクロファージ、リンパ球］、インフルエンザウイルスの標的となる肺や上気道の他の細胞）では高度に発現するが、大規模なワクチン作出に用いる細胞株や種（例えば、発育鶏卵［ニワトリ］）では発現しないか又は発現が非常に低レベルである如何なるｍｉＲＮＡにも由来することができる。

有用なヒトｍｉＲＮＡの例としては、ｍｉＲ−１６やｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９７７、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１２５９、ｍｉＲ−１９７８が挙げられ、例えば、配列５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ−３’（配列番号１）を有するｍｉＲ−１６や、配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’(配列番号２）を有するｍｉＲ−１７、配列５’−ＵＧＵＧＣＡＡＡＵＣＵＡＵＧＣＡＡＡＡＣＵＧＡ−３’(配列番号３）を有するｍｉＲ−１９、配列５’−ＣＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＵＣＧＧＵＣＵＧＡ−３’(配列番号４）を有するｍｉＲ−２５、配列５’−ＵＧＧＣＡＧＵＧＵＣＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧＵ−３’(配列番号５）を有するｍｉＲ−３４、配列５’−ＵＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧ−３’（配列番号６）を有するｍｉＲ−９２、配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＧＵＵＣＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’(配列番号７）を有するｍｉＲ−９３、配列５’−ＵＧＵＡＧＵＧＵＵＵＣＣＵＡＣＵＵＵＡＵＧＧＡ−３’(配列番号１４１）を有するｍｉＲ−１４２、配列５’−ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＵ−３’（配列番号１４２）を有するｍｉＲ−２２２、配列５’−ＵＣＵＧＧＵＣＣＧＵＧＵＣＵＵＣＡＣＵＣＣＣ−３’（配列番号１４３）を有するｍｉＲ−１４９、配列５’−ＧＡＵＵＡＧＧＧＵＧＣＵＵＡＧＣＵＧＵＵＡＡ−３’（配列番号１４４）を有するｍｉＲ−１９７７、配列５’−ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ−３’（配列番号１４５）有するｍｉＲ−１８１ｂ−２、配列５’−ＡＵＡＵＡＵＧＡＵＧＡＣＵＵＡＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１４６）を有するｍｉＲ−１２５９、配列５’−ＧＧＵＵＵＧＧＵＣＣＵＡＧＣＣＵＵＵＣＵＡ−３’（配列番号１４７）を有するｍｉＲ−１９７８が挙げられるが、これらに限定されない。更なる有用なｍｉＲＮＡは、並行配列決定及び２個の種間又は組織／細胞間での相対発現レベルを確認することによって同定することができる。ｍｉＲＮＡ配列の最新データベース（ｍｉＲＢａｓｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／（ｍｉＲＢａｓｅ））及びBurside et al., BMC Genomics 9:185 (2008); Williams et al., BMC Genomics 8:172 (2007); Landgraf et al., Cell 129:1401 (2007)を参照。

好ましい一実施形態においては、少なくとも２種のＭＲＥをインフルエンザゲノムセグメントに挿入する。このような二以上のＭＲＥは、同一の配列を有する場合もあり、同一のＭＲＥシード配列（即ち、ｍｉＲＮＡ配列の５’位置１〜７又は２〜８）を維持しながら幾つかのヌクレオチド位置が異なる場合もあり、二以上の異なるｍｉＲＮＡに対応する場合もあるが、各ｍｉＲＮＡは、ワクチン接種を必要とする動物のインフルエンザ標的細胞では高度に発現するが、大規模なワクチン作出に用いる細胞株や発育鶏卵内のウイルス増殖が生じる領域では発現しないか又は発現が非常に低レベルである。このような二以上のＭＲＥは、アミノ酸変化の数が最小限に維持されてウイルスタンパク質機能が保存される限り、リーディングフレームに関わらず挿入することができる。

本発明においては、ＭＲＥをインフルエンザウイルス遺伝子のタンパク質コード領域内に挿入することが好ましい。（５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）等の非コード領域とは対照的に）コード領域内にＭＲＥを挿入することによって、エスケープ変異体の産生が妨げられ、ワクチンの安全性が高まる。全てのインフルエンザ遺伝子をＭＲＥ挿入に用いることができるが、より保存されたインフルエンザタンパク質のオープンリーディングフレームを用いると、エスケープ変異体が出現しにくくなり、ワクチンの安全性が高まるため好ましい。従って、ＭＲＥ挿入に好ましいインフルエンザ遺伝子はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１及びＮＥＰである。

また、本発明は、インフルエンザゲノムの他の部分へのＭＲＥ挿入も包含する。本発明は、その具体的な一実施形態において、人工３’ＵＴＲへのＭＲＥ挿入を提供するが、これによって、得られるウイルスｍＲＮＡの終止コドンとポリＡテール配列との間にＭＲＥを挿入する。一実施形態においては、終止コドンとポリＡテール配列との間へのこのようなＭＲＥ挿入は、ビリオン内への効率的なウイルス鎖パッケージングに必要な配列を更に追加することを伴う。

本発明のＭＲＥは好ましくは１９〜２５ヌクレオチド長であり、少なくとも対応するｍｉＲＮＡの「シード」配列（即ち、ｍｉＲＮＡ配列の５’位置１〜７又は２〜８）の完全な補体を含む。更なる相補性のいずれかを用いて弱毒化を更に高めることができる。或いは（又は更に）、挿入するＭＲＥの数を増加させて弱毒化を高めることができる。

本発明に係るＭＲＥは、例えば、対象となるｍｉＲＮＡの部分的又は完全に逆位で相補的な配列を用いて設計することができ、これによって、ｍｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基対形成によりＭＲＥを含むヌクレオチドに結合することができる。相補性のあるより短い領域を用いることによって、潜在的な部位の数は増加し、必要なヌクレオチド変更の数は減少する。ＭＲＥの３’末端（シード配列）における相補性は、少なくとも位置１〜７又は２〜８から維持する必要がある。

本発明のＭＲＥ含有弱毒化生ウイルスは、培養細胞中（例えば、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ−２９３細胞［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１５７３］やニワトリ線維芽細胞ＤＦ１［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１２２０３］、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＣＫ）細胞［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−３４、ＣＲＬ−２２８５、ＣＲＬ−２２８６、ＣＲＬ−２９３５又はＣＲＬ−２９３６］、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ）［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−８１、ＣＲＬ−１５８６、ＣＲＬ−１５８７又はＣＲＬ−２７８３］、ヒトＰＥＲ−Ｃ６細胞［Pau et al., Vaccine, 2001, 19(17-19):2716］中）で組換えによって作出することができ、その後（必要に応じて）、発育鶏卵中で増殖させてより高い力価を得ることができる。

実施例の項で後述するように、ＮＰオープンリーディングフレームに挿入されたｍｉＲ−９３に対応する２種のＭＲＥを含む本発明のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１を利用した弱毒インフルエンザウイルスワクチンは、細胞培養で増殖する際には高い安定性を示し（復帰変異体無し）、マウスに投与した際にはそれぞれＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１の致死量からの防御がもたらされる。

総合すれば、本発明の新規なＭＲＥを利用した弱毒化生ワクチン戦略によって、新たに出現するインフルエンザ株に対する大量のワクチンを迅速に作出するのに必要な汎用性、安全性及び有効性がもたらされる。

本発明は、そのより一般的な一様相において、組換え作出に適した如何なるウイルスにも適用することができる。本発明によると、ウイルスゲノムに種特異的ＭＲＥ及び／又は組織／細胞特異的ＭＲＥを挿入することによって、ある種及び／又は組織／細胞においては弱毒化生ワクチンとして用いることができると共に、他の種及び／又は組織／細胞では効率的に増殖することができるウイルスの作出が可能となる。

定義
本明細書において「インフルエンザウイルス」は、インフルエンザ又は流感として知られる疾患を引き起こすウイルス種の病原株を定義するのに用いる。「インフルエンザ」は、インフルエンザウイルスの如何なる株や血清型（ＨＡ（例えば、Ｈ１やＨ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６）とＮＡ（例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８又はＮ９遺伝子）との如何なる組み合わせも含む）をも包含することを意味する。一実施形態においては、インフルエンザとはＨ５Ｎ１インフルエンザ（トリ流感又は流行性インフルエンザ）を意味する。一実施形態においては、インフルエンザとはインフルエンザウイルスの他の株又はサブタイプ（Ｈ１Ｎ１やＨ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２が挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。

インフルエンザウイルス生物学のコンテクストにおいては、「コード領域」とは、成熟ウイルスタンパク質内で示されるアミノ酸をコードするウイルスＲＮＡの領域を意味する。

本明細書において、「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、７ｂｐの「シード」配列（即ち、ｍｉＲＮＡの５’位置１〜７又は２〜８の配列）によって標的ｍＲＮＡの発現を調節する、小さい１９〜２５ｂｐの内在性一本鎖ＲＮＡを意味する。「シード」に対するｍＲＮＡ配列の相補性は通常、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内に存在する。Bartel, Cell 116(2):281 (2004)。ｍｉＲＮＡ調節は全体的なタンパク質産生に適度に影響を及ぼし、細胞トランスクリプトームの「微調整」をもたらす。Baek et al., Nature 455(7209):64 (2008) and Selbach et al., Nature 455(7209):58 (2008)。

「相補性」とは、伝統的なワトソン−クリック相互作用又は他の非伝統的相互作用（例えば、グアニンとウラシルの結合を可能にするウォッブル塩基対形成）によってある核酸が他の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。相補性率は、第２の核酸配列と水素結合を形成し得る核酸分子内の残基の割合（％）を示す。

本発明の核酸分子に関して、ある核酸分子のその相補的配列に対する結合自由エネルギーは、該核酸の関連機能（例えば、ｍｉＲＮＡ活性）が進行可能な程度に十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定については当該技術分野ではよく知られている（例えば、Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J Am. Chem. Soc. 109:3783-3785参照）。「完全に相補的」とは、ある核酸配列の全ての近接残基が第２の核酸配列の同じ数の近接残基と水素結合することを意味する。一実施形態においては、ヒトｍｉＲＮＡは、対応する標的インフルエンザ核酸分子に対して部分的相補性（即ち、１００％未満の相補性）を有する。

本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）応答要素」又は「ＭＲＥ」とは、特定のｍｉＲＮＡと結合することができ、その転写後サイレンシングの量が測定可能な（例えば、ｍＲＮＡ量及び／又はタンパク質量の低下によって求める）ｍＲＮＡ内のヌクレオチド配列を意味する。転写後サイレンシングが生じるためには、ＭＲＥ−ｍｉＲＮＡ配列相補性は、少なくとも、ヌクレオチド１〜７又は２〜８から成るｍｉＲＮＡのシード配列とＭＲＥの３’末端を含む必要がある。

本明細書に記載のように、本発明の組換え弱毒ウイルスに有用な種特異的及び／又は組織／細胞特異的ＭＲＥは、ワクチン接種を必要とする動物のインフルエンザ標的細胞では高度に発現するが、大規模なワクチン作出に用いる細胞株や種（例えば、発育鶏卵［ニワトリ］）では発現しないか又は発現が非常に低レベルである如何なるｍｉＲＮＡにも由来することができる。本発明の意味において、「組織／細胞特異的ＭＲＥ及び種特異的ＭＲＥ」は、ワクチン接種対象の動物において関連ウイルスの標的となる特定の細胞型や組織型で高レベルで発現するｍｉＲＮＡ、及び／又はワクチン接種対象の選択種では高レベルで発現するが、大規模なワクチン作出に用いる細胞株や種では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡと結合し、それによって転写後に阻害されるＭＲＥとして定義される。

本明細書において、ｍｉＲＮＡ発現に関して「高度に発現する」及び「高レベルで発現する」とは、標準的なノーザンブロット解析（Pall et al., Nature Protocols 3(6) 1077 (2008)）によって検出可能なｍｉＲＮＡを意味する。このような高度に発現するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡディープ配列決定（Hafner et al., Methods 44(1)3 (2008)）によって測定される、対象となる組織又は細胞に存在する全細胞ｍｉＲＮＡの０．１％以上であることが好ましい。

本明細書において、「発現が非常に低レベルである」とは、標準的なノーザンブロット解析によって検出不能なｍｉＲＮＡを意味する。発現が非常に低レベルであるこのようなｍｉＲＮＡは、ＲＮＡディープ配列決定によって測定される、対象となる組織又は細胞に存在する全細胞ｍｉＲＮＡの０．０１％以下であることが好ましい。

本明細書において、組換え弱毒インフルエンザウイルスに関して用いられる「人工３’ＵＴＲ」及び「人工３’非コード領域（ＮＣＲ）」とは、成熟ＲＮＡ転写物においてコードされるが、如何なるタンパク質情報もコードしない遺伝要素の挿入を意味する。「人工」とは、インフルエンザウイルスがＭＲＥ挿入を可能とする内在性３’ＵＴＲをコードせず、従って、ＭＲＥ挿入のためにこの標的位置を利用する唯一の手段が新規な３’ＵＴＲ／ＮＣＲを作出することであるという事実を意味する。本発明の組換え弱毒インフルエンザウイルスにおける人工３’ＵＴＲ／ＮＣＲは、終止コドンとポリＡテールとの間に遺伝物質を導入することによって作出することができる。また、全てのインフルエンザウイルスセグメントはｖＲＮＡの５’末端内にコードされるパッケージング情報（終止コドンとポリＡテールをコードする遺伝情報と重複する）を有するため、人工３’ＵＴＲは５’ｖＲＮＡ末端の複製も必要とする。この場合、必要な物質（通常、セグメントに応じて８０ｎｔ〜２００ｎｔ）を複製し、ポリＡテール配列を超えて挿入することができる。

本明細書において、「感染性」とは、ウイルスが細胞内で複製し、ウイルス粒子を産生できることを意味する。感染力の評価は、ウイルス（即ち、ウイルス負荷）を検出するか、又は動物において疾患の進行を観察することによって行うことができる。

本明細書において、「個体」又は「被験体」又は「動物」とは、マイナス鎖ＲＮＡウイルス感染、特に、インフルエンザウイルス感染をサポートする脊椎動物（トリ類（例えば、水鳥やニワトリ）や哺乳動物種のメンバー（例えば、イヌやネコ、オオカミ、イタチ、齧歯動物（ラシーヌ（racine）やマウス等）、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ種、霊長類）（後者はヒトを含む）が挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。具体的な一実施形態においては、被験体はフェレットであるが、これはインフルエンザを研究するのに適した動物モデルである。他の実施形態においては、被験体はヒトである。

本明細書において、「免疫原性」とは、ある剤が体液性免疫応答又は細胞性免疫応答（好ましくはその両方）を誘発することができることを意味する。免疫原性実体は抗原性でもある。免疫原性組成物とは、免疫系を有する動物に投与した際に、体液性免疫応答又は細胞性免疫応答、又はその両方を誘発する組成物である。

「ワクチン」とは、レシピエント内で防御免疫を誘発するのに用いることのできる組成物（例えば、アジュバントの存在下又は非存在下での弱毒化生インフルエンザウイルス）を意味する。注目すべき点は、本発明のワクチンが有効であるためには、ある個体においては、強い免疫応答や防御免疫応答を開始させることができず、ある場合には如何なる免疫応答も開始させることができないが、免疫化した集団の一部において免疫を誘発することができることである。このような免疫応答の開始不能は、個体の遺伝的背景に由来するか、又は免疫不全状態（後天性又は先天性）や免疫抑制（例えば、化学療法を用いた治療や免疫抑制剤の使用に起因する）のためである。ワクチンの有効性は動物モデルで確立することができる。

「アジュバント」とは、宿主の他の抗原（例えば、弱毒化生インフルエンザウイルス）に対する免疫応答を該抗原と共に投与した際に増強する化合物又は組成物を意味する。本発明のワクチン組成物に有用なアジュバントとしては、フロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウム等の鉱物ゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル又は炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルバムが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントは薬学的に許容し得るのが好ましい。

本発明の意味において用いられる「共投与」とは、免疫アジュバントと抗原を一組成物にて同時に投与するか、異なる組成物にて同時に投与するか、又は特定の期間内（例えば、２４時間）で逐次的に投与することを意味する。

本明細書において、「防御」とは、被験体における疾患（例えば、流感）の発症や持続の予防又は治療、又は必要に応じてその両方を意味する。

「防御免疫応答」又は「防御免疫」は、例えば、病原体（例えば、インフルエンザウイルス）や感染細胞の負荷を除去又は低下させるか、又は免疫化（ワクチン接種）した被験体における感染の測定可能な軽減をもたらすのに有効な体液性（抗体）免疫又は細胞性免疫、又はその両方を包含する。

本明細書において、「治療有効量／用量」は「免疫原性有効量／用量」と交換可能に用いられ、弱毒化生インフルエンザウイルス又は該ウイルスを含む医薬組成物やワクチンを哺乳動物に投与した際に防御免疫応答をもたらすのに十分な量を意味する。

「薬学的に許容し得る」とは、生理学的に容認することができ、ヒトに投与した際に通常はアレルギー反応や類似の不都合な反応（例えば、胃の不調やめまい等）をもたらさない分子体や組成物を意味する。好ましくは、本明細書で用いる「薬学的に許容し得る」とは、動物（より具体的にはヒト）における使用のために、連邦政府又は州政府の監督官庁によって認可されているか、又は米国薬局方か、他の一般に承認された薬局方に記載されていることを意味する。

本発明の医薬組成物又はワクチン組成物に適用される「担体」とは、化合物（例えば、弱毒化生インフルエンザウイルス）と共に投与する希釈剤、賦形剤又は媒体を意味する。このような薬学的担体としては、水や、ピーナッツ油や大豆油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物又は合成に由来するものを含む油状物等の無菌液体を用いることができる。水又は水溶液、生理食塩水溶液、ブドウ糖水溶液及びグリセロール水溶液を担体として用いることが好ましく、特に注射用液剤に用いることが好ましい。適切な薬学的担体は「Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Edition」に記載されている。

本明細書において、「単離」とは、関連物質（例えば、細胞やウイルス）をその天然環境から取り除くことを意味する。従って、単離した生物学的物質は、細胞成分（即ち、天然物質が自然に生じる細胞の成分（例えば、細胞質成分や膜成分））の一部又はその全てを含まない場合がある。ある物質が細胞抽出物や上清に存在する場合には、該物質は単離されたものと考える。核酸分子の場合、単離核酸としては、ＰＣＲ産物や単離ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡやｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、制限断片が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態においては、単離核酸は、それが存在し得る細胞ゲノムやウイルスゲノムから切除することが好ましく、例えば、この核酸の上流又は下流に位置する他の遺伝子や調節配列に連結したり近接することはない。更に他の実施形態においては、単離核酸は一以上のイントロンを欠いている。単離核酸分子には、プラスミドやコスミド、人工染色体等に挿入された（即ち、キメラ組換え核酸構築物の一部を形成する際に）配列が含まれる。従って、具体的な一実施形態においては、組換え核酸は単離核酸である。単離タンパク質は他のタンパク質又は核酸、又はその両方と細胞内で結合することができ、該タンパク質が膜結合性タンパク質の場合には細胞膜と結合することができる。単離オルガネラ、細胞又は組織は、それが生物内に存在する解剖学的部位から除去する。単離物質は精製してもよいが、その必要はない。

本明細書において、「精製」とは、無関係な物質（即ち、夾雑物）（例えば、単離物質の由来源である天然物質）の存在を抑制又は排除する条件下で単離された物質を意味する。例えば、精製ウイルスは、宿主細胞や培養成分（例えば、組織培養物や卵タンパク質、非特異的病原体等）を実質的に含まないことが好ましい。本明細書において、「実質的に含まない」とは、物質の分析試験のコンテクストにおいて操作上用いられる。夾雑物を実質的に含まない精製物質は少なくとも５０％ピュアであることが好ましく、少なくとも９０％ピュアであることがより好ましく、少なくとも９９％ピュアであることが更に好ましい。純度の評価は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、及び当該技術分野で公知の他の方法によって行うことができる。

精製方法は当該技術分野でよく知られている。ウイルス粒子の精製は、スクロースクッションによる限外濾過、又は超遠心分離（好ましくは、連続遠心分離）によって行うことができる（Furminger, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 24, pp. 324-332 参照）。他の精製方法も可能であり、本明細書で意図されている。精製物質は、それが本来は伴っていた細胞成分や媒体、タンパク質、他の望ましくない成分や不純物（状況に応じて）の約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは約９０％未満含んでもよい。「実質的に純粋」とは、当該技術分野で公知の従来の精製技法を用いて達成することができる最も高い純度を示す。

「約」又は「およそ」とは、ある値の統計的に有意な範囲内であることを意味する。このような範囲は、所定の値又は範囲に対して好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更に好ましくは１０％以内、更に好ましくは５％以内のオーダーとすることができる。「約」又は「およそ」によって包含される許容偏差は研究中の特定の系によって決まるが、当業者には容易に理解され得る。

本発明においては、従来の分子生物学、微生物学及び組換ＤＮＡ技法を、当業者の技能範囲内で利用できる。このような技法は文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & SJ. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, F. M. et al. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994 を参照。このような技法には、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488- 492 (1985), 米国特許第５，０７１，７４３号, Fukuoka et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999); Kim and Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000); Parikh and Guengerich, BioTech. 24: 4 28-431 (1998); Ray and Nickoloff, BioTech. 13: 342-346 (1992); Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang and Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999); Xu and Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999), 米国特許第５，７８９，１６６号及び第５，９３２，４１９号、 Hogrefe, Strategies 14. 3: 74-75 (2001), 米国特許第５，７０２，９３１号、第５，７８０，２７０号及び第６，２４２，２２２号, Angag and Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001), Wang and Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000), Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996), Ogel and McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992), Kirsch and JoIy, Nuc. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998), Rhem and Hancock, J. Bacterid. 178: 3346-3349 (1996), Boles and Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198 (1995), Barrenttino et al., Nuc. Acids. Res. 22: 541-542 (1993), Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237, and Pons et al., Meth. Molec. Biol. 67: 209-218 に記載の部位特異的突然変異誘発が含まれる。

ウイルスゲノムに組み込むマイクロＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）の選択
本発明は、ｍｉＲ−９３の２種の遍在性ＭＲＥを保存インフルエンザヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に組み込んで高度に弱毒化されたインフルエンザウイルスワクチン株を得ることによって例示される。後述するように、ＮＰ遺伝子は、株間での遺伝的ドリフトが殆どなく、エスケープ変異体が出現しにくいことによって特徴付けられる。しかし、他のインフルエンザｍＲＮＡのコード領域又は非コード（例えば、人工３’ＵＴＲ）領域内にＭＲＥを組み込むことができることは理解されよう。全てのインフルエンザ遺伝子をＭＲＥ挿入に用いることができるが、より保存されたインフルエンザタンパク質のＯＲＦを用いると、エスケープ変異体が出現しにくくなり、ワクチンの安全性が高まるため好ましい。従って、ＭＲＥ挿入に好ましいインフルエンザ遺伝子はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１及びＮＥＰである。

有効なＬＡＩＶワクチンを作出するには１種のＭＲＥでも十分であるが、ワクチン接種した動物において効率的な弱毒化を確実にし、エスケープ変異体の可能性を低下させるためには少なくとも２種のＭＲＥを用いることが好ましい。このような二以上のＭＲＥは、同一の配列を有する場合もあり、幾つかのヌクレオチド位置が異なる場合もあり、二以上の異なるｍｉＲＮＡに対応する場合もあるが、各ｍｉＲＮＡは、ワクチン接種対象の動物においてインフルエンザウイルスの標的となる組織／細胞では高度に発現するが、大規模なワクチン作出に用いる種及び／又は組織／細胞（例えば、発育鶏卵内でウイルス増殖が生じる領域［例えば、絨毛尿膜］や適切な細胞株［例えば、ＭＤＣＫ細胞］）では発現しないか又は発現が非常に低レベルである。このような二以上のＭＲＥは、インフルエンザウイルスゲノムの一以上の位置に挿入することができる。

コード領域内へのＭＲＥ配列の組み込みは、ヌクレオチド配列の変化、特に、アミノ酸置換をもたらすヌクレオチド配列の変化を最小限に抑えることを目的として、インフルエンザウイルス遺伝子のコード領域を変化させることによって行うことができる。従って、アミノ酸の元来の同一性は通常保持されるが、アミノ酸置換が必要な場合には、同一の階層的クラスタリング（例えば、非極性（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｉ）や極性（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｎ、Ｅ）、芳香族（Ｆ、Ｙ、Ｗ）、正電荷（Ｋ、Ｒ、Ｈ）、負電荷（Ｄ、Ｅ））に従うことが好ましい。

ヌクレオチドの変更は、当該技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発方法のいずれかを用いて導入することができる。例えば、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488- 492 (1985), 米国特許第５，０７１，７４３号, Fukuoka et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999); Kim and Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000); Parikh and Guengerich, BioTech. 24: 4 28-431 (1998); Ray and Nickoloff, BioTech. 13: 342-346 (1992); Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang and Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999); Xu and Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999), 米国特許第５，７８９，１６６号及び第５，９３２，４１９号, Hogrefe, Strategies 14. 3: 74-75 (2001)、 米国特許第５，７０２，９３１号、第５，７８０，２７０号及び第６，２４２，２２２号, Angag and Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001), Wang and Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000), Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996), Ogel and McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992), Kirsch and JoIy, Nuc. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998), Rhem and Hancock, J. Bacterid. 178: 3346-3349 (1996), Boles and Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198 (1995), Barrenttino et al., Nuc. Acids. Res. 22: 541-542 (1993), Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237, and Pons et al., Meth. Molec. Biol. 67: 209-218.を参照。

効率的に弱毒化を行うためには、ＭＲＥ配列は、少なくともｍｉＲＮＡ「シード」配列（即ち、ｍｉＲＮＡの５’及びＭＲＥの３’ヌクレオチド１〜７又は２〜８）と完全に相補的である必要がある。更なる相補性はウイルスの弱毒化を更に高めるのに役立つ。本発明に係るＭＲＥは、例えば、対象となるｍｉＲＮＡの部分的又は完全に逆位で相補的な配列を用いて設計することができる。相補性のあるより短い領域を用いることによって、潜在的な部位の数は増加し、必要なヌクレオチド変更の数は減少する。

ＲＮＡ結合によって、シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）で置換し、アデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換することができ、更には良好な平均自由エネルギー（ＭＦＥ）を維持することもできる。Crick, J MoI Biol 19(2):548-555 (1966)。その結果、５’−ＵＣＵ−３’（これはセリン（Ｓ）をコードする）や５’−ＵＵＵ−３’（これはフェニルアラニン（Ｆ）をコードする）等のコドンはいずれも５’−ＡＧＡ−３’とハイブリダイズすることができる。従って、ｍｉＲＮＡの５’−ＡＧＡ−３’配列を標的とするＭＲＥは、Ｓ又はＦをコードするインフルエンザ配列に挿入することができる。この例を表１に更に示す。

例えば、ｍｉＲ−１６配列：５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ−３’（配列番号１）の場合、最小「シード」配列は、５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号８）又は５’−ＡＧＣＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号９）、即ち、相補的なＭＲＥ配列５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号１０）又は５’−ＣＧＴＧＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号１１）を形成する配列と見なすことができる。これらの推定ＭＲＥ配列の各々においてシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）で置換、及び／又はアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換することによって、ＶＬＬ、ＲＡＡ、ＲＶＶ、ＲＡＶ、ＲＶＡ、ＣＡＡ、ＣＶＶ、ＣＡＶ又はＣＶＡをコードする如何なるオープンリーディングフレームも操作してｍｉＲ−１６に応答するようになる。

本明細書に記載の具体例においては、ウイルス配列は、インフルエンザＡウイルス株であるＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ（Ｈ１Ｎ１）に由来する。具体的には、特定のヌクレオチドとアミノ酸の位置は次のＧｅｎＢａｎｋ登録番号に相当する。

各例において、平均自由エネルギー（ＭＦＥ）は、非階層的アミノ酸置換（例えば、ｍｉＲ−９３に関して後述するような置換）によって更に低下させることができる。理想的には、ＭＲＥ／ｍｉＲＮＡ相互作用のＭＦＥは−２０ｋｃａｌ／モル未満、−２５ｋｃａｌ／モル未満、−３０ｋｃａｌ／モル未満、又は−３５ｋｃａｌ／モル未満である。ＭＦＥ計算方法については、Dawson and Yamamoto, J. Theor. Biol., 1999, 201(2): 1 13-140.を参照。

しかし、ＡＣＧやＵＣＧ、ＣＧＵ、ＣＧＡ等のまれなコドントリプレットをもたらすヌクレオチド置換（Larner et al. Gene 345:127-138 (2005)）は、このようなトリプレットがＭＲＥ挿入に用いるウイルス領域に既に存在していない場合には回避すべきであることは理解されよう。

本明細書で例示のように、インフルエンザＮＰの場合には、セグメント５の位置２２５（部位１）及び位置８１８（部位２）は、ｍｉＲ−９３のＭＲＥ配列に対して高い配列類似度を示すことが分かった。従って、部位１の配列５’−ＡＣＡＡＵＡＧＡＧＡＧＡＡＵＧＧＵＧＣＵＣＵＣＵ−３’（配列番号１２）を５’−ＡＣＡＣＵＵＧＡＡＣＧＡＡＵＧＧＵＡＣＵＵＵＣＵ−３（配列番号１３）で置換してインフルエンザ９３ＮＰ１を作出し、部位２の配列５’−ＵＵＵＣＵＡＧＣＡＣＧＧＵＣＵＧＣＡＣＵＣＡＵＡ−３’（配列番号１４）を５’−ＵＵＣＣＵＵＧＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣＵＵＵＵＡ−３’（配列番号１５）で置換してインフルエンザ９３ＮＰ２を作出した。

以下の表２〜９においては、ヌクレオチド配列レベルで改変して（標的インフルエンザのアミノ酸配列には如何なる変更も引き起こさずに）二以上のＭＲＥを組み込むことができるインフルエンザＡコード領域の例を示す。開示したＭＲＥ対又はトリプレットの各々は、ヌクレオチド配列の変更を最小限にし、上の表１に記載のパラメータに従ってアミノ酸置換を制限することによって得られる。

本発明に有用なＭＲＥは、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞（例えば、上皮細胞や分泌細胞［クララ］、繊毛細胞、頂端細胞、杯細胞［粘膜］、造血細胞［例えば、樹状細胞やマクロファージ、リンパ球］、気管支細胞、インフルエンザウイルスの標的となる肺や上気道の他の細胞）では高度に発現するが、ワクチン作出に用いる細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞［例えば、ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−３４］）や発育鶏卵（ニワトリ）内でウイルス増殖が生じる領域では発現しないか又は発現が非常に低レベルである如何なるｍｉＲＮＡにも由来することができる。これによって、インオボ又はインビトロで効率的にワクチンを作出することができるが、ワクチンウイルスは同族ｍｉＲＮＡを発現する哺乳動物（例えば、ヒト）細胞において弱毒化の影響を受けやすくなる。

表１０は、１０日齢の鶏（ニワトリ）卵の尿膜とヒトＡ５４９肺上皮細胞におけるｍｉＲＮＡ発現の相対データを示す。これは、ＲＮＡアダプタを精製細胞ＲＮＡに連結させて生成した３００万超の構築配列（「リード」）のハイスループット並行配列決定に基づく。得られた割合（％）は、ｍｉＲＮＡ特異的リードの総数をｍｉＲＮＡリードの総数で割ったものである。

上述のデータに基づき、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−９２及びｍｉＲ−９３は、哺乳動物に特異的なＭＲＥ含有ＬＡＩＶワクチン作出の有力な候補となる。

更なる有用なｍｉＲＮＡは、並行配列決定及び対象となる２個の種間、組織間又は細胞株間での相対発現レベルを確認することによって同定することができる。ｍｉＲＮＡ配列の最新データベースを参照（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／（ｍｉＲＢａｓｅ））。

本発明の組換えＬＡＩＶは、更なる弱毒化変異（例えば、温度感受性ウイルス増殖をもたらす変異（例えば、ＦＬＵＭＩＳＴに用いる変異）や病原性因子の除去（例えば、ＮＳ１タンパク質の除去））を含むことができる。

組換え弱毒化生インフルエンザウイルスの作出
ＭＲＥ含有組換え構築物を作出した後、本発明のＭＲＥ含有弱毒化生ウイルスは、培養細胞中（例えば、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ−２９３細胞［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１５７３］やニワトリ線維芽細胞ＤＦ１［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１２２０３］、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＣＫ）細胞［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−３４、ＣＲＬ−２２８５、ＣＲＬ−２２８６、ＣＲＬ−２９３５又はＣＲＬ−２９３６］、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ）［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−８１、ＣＲＬ−１５８６、ＣＲＬ−１５８７又はＣＲＬ−２７８３］、ヒトＰＥＲ−Ｃ６細胞（Pau et al., Vaccine, 19(17-19) 2716, (2001)）、ニワトリ線維芽細胞ＤＦ１［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１２２０３］中）で組換えによって作出することができる。細胞株中での作出後、発育鶏卵中で増殖させてより高い力価を得ることができる。

各段階において、ウイルス粒子の精製は、例えば、限外濾過や超遠心分離（好ましくは、連続遠心分離）によって行うことができる（Furminger, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 24, pp. 324-332 参照）。ウイルス力価は、プラークアッセイ、組織培養感染量、卵感染量、血球凝集抑制又は抗体依存蛍光によって求めることができる。Huprikar et al., J Virol Methods, 1980, 1(2): 1 17-120, Rimmelzwaan et al., J Virol Methods. 1998, 74(1): 57-66。

本発明の組換え弱毒インフルエンザウイルスは、種々のインフルエンザの遺伝的背景（例えば、Ｈ５Ｎ１ウイルス（例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４やＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／５９、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３０８／７８）、Ｈ１Ｎ１ウイルス（例えば、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４やＡ／ＮｅｗＹｏｒｋ／６１６／１９９５、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）、Ｈ３Ｎ２ウイルス（例えば、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１６／６８やＡ／ＵＳＳＲ／０３９／６８、Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／Ｃ５／８５）、他のインフルエンザＡウイルス（例えば、低温適応株Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７やＡ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／４７／５７、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０）が挙げられるが、これらに限定されない）に由来することができる。

本発明の組換え弱毒インフルエンザウイルスの培養細胞中での作出は、当業者に公知の如何なる手段によっても行うことができ、例えば、ｐｏｌＩプロモーター由来の８種のインフルエンザｖＲＮＡとｐｏｌＩＩプロモーター由来の全ｍＲＮＡのプラスミド駆動発現によって感染性インフルエンザウイルスの生成をもたらす「プラスミドオンリー」システム（Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6108; Hoffmann et al., Vaccine 2002, 20:3165; 米国特許第６，９５１，７５４号; Quinlivan et al, J. Virol. 79(13):8431 (2005)）等の遺伝子工学方法によって行うことができる。哺乳動物細胞中でのウイルス増殖時の弱毒化を回避するため、ＭＲＥ含有プラスミドをＲＮＡＰｏｌＩによってのみ駆動してＭＲＥを含むｖＲＮＡを逆の（即ち、無効の）配向で作出し、他のプラスミド（ＭＲＥを含まず）をＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーターによってのみ駆動して野生型ｍＲＮＡを作出する。例えば、後述の実施例１１に記載のように、ＮＰオープンリーディングフレームにＭＲＥを含む組換え弱毒インフルエンザウイルスを作出するため、本発明者らは、ＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーターによってのみ駆動するプラスミド（ｐＣＡＧＧｓ ＮＰ）を用いて野生型ＮＰｍＲＮＡを作出し、ＲＮＡｐｏｌＩによってのみ駆動する他のプラスミド（ｐＰｏｌＩＭＲＥコードＮＰ）を用いてＮＰオープンリーディングフレームにＭＲＥを含むｖＲＮＡを作出した。

代替方法においては、対象となるＭＲＥ含有ｖＲＮＡセグメントを過剰発現させた後、細胞を対象となるウイルス株に非常に低い感染多重度（ＭＯＩ）（例えば、ウイルス１個／細胞１００個）で感染させることができる。対象となるウイルスセグメントは過剰発現によって組み込まれる。卵内での接種後、異質ウイルスはプラーク精製することができ、培養細胞中でプラークサイズによって野生型ウイルスと区別することができる。或いは、野生型未改変株のみを標的とする短い妨害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトすることによってレスキュー時に更なる選択圧を加えることができる。これによって、組換え体のみを選択する。

大規模なウイルス作出を達成するため、最初のウイルス作出に用いた上清及び／又は培養細胞を１０日齢の発育鶏卵に注入することができる。或いは、ＭＤＣＫ細胞の操作によるＭＲＥ含有ウイルスの増殖は、（ｉ）レンチウイルス組み込みによる対応するｍｉＲＮＡの安定ノックダウン（Gentner et al., Nature Methods (2009) 63-66）、（ｉｉ）ダイサー又はドローシャに特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼの発現（Miller et al, Nature Biotechnology (2007); 778-85）、又は（ｉｉｉ）ＭＤＣＫ細胞において発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応するＭＲＥを組み込むことによって行うことができる。

本発明の組換え弱毒化生インフルエンザウイルスに存在するＭＲＥに対応するｍｉＲＮＡはワクチン作出に用いる細胞株やニワトリの尿膜には存在しないか又は発現が非常に低レベルであるが、哺乳動物組織（例えば、インフルエンザウイルスの標的となる肺組織や他の組織）には豊富にあるため、このようなワクチンは哺乳動物細胞中では選択的に弱毒化されるが、ニワトリ尿膜や選択された細胞株（例えば、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＣＫ）細胞［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−３４、ＣＲＬ−２２８５、ＣＲＬ−２２８６、ＣＲＬ−２９３５又はＣＲＬ−２９３６］やアフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ）［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−８１、ＣＲＬ−１５８６、ＣＲＬ−１５８７又はＣＲＬ−２７８３］、ヒトＰＥＲ−Ｃ６細胞（Pau et al., Vaccine, 19(17-19) 2716, (2001)）、ニワトリ線維芽細胞ＤＦ１［ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１２２０３］）では非常に高い力価まで増殖することができる。従って、本発明のＭＲＥ含有インフルエンザウイルスワクチンは１×１０⁷プラーク形成単位／ｍＬ（ｐｆｕ／ｍＬ）を超えるウイルス力価を得ることができ、標準的な細胞培養又は高密度細胞発酵技術（Meghrou et al, Vaccine 28(2) 309 (2009)）を用いてワクチン増殖が可能である。

本発明のワクチン組成物
また、本発明は、ＭＲＥ含有弱毒化生インフルエンザウイルスと薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む新規な改良ＬＡＩＶワクチン組成物も提供する。インフルエンザウイルスに起因する病態を予防する方法に該ワクチンを用いることができ、その際、該ワクチンの治療有効量をそれを必要とする被験体に投与することができる。

インフルエンザワクチンの有効性を更に高めるための戦略としては、例えば、アジュバントとの共投与（上述参照）や、サイトカインやリンホカイン、ケモカイン等の免疫賦活分子（例えば、インターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３や顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１、Ｂ７．２等）との共投与が挙げられる。Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. 1998, 68: 122; Lyman, Curr. Opin. Hematol., 5: 192, 1998。アジュバントや免疫賦活分子は全身的に又は局所的に（例えば、タンパク質として直接、又はベクターからの発現によって）送達することができる。Wood and Williams, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 23, pp. 317-323; Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. 1998, 68:122. 参照。

本発明のＬＡＩＶワクチンの治療有効な防御用量は、当該技術分野で公知の種々の投与経路によって投与することができる。インフルエンザ感染は粘膜経由で生じ、粘膜は免疫療法の重要な標的である樹状細胞を有しているため、弱毒化生ワクチンの場合、粘膜投与が特に好ましい。有用な粘膜ワクチン接種戦略の例としては、特に、ウイルスをマイクロカプセル内に封入すること（米国特許第５，０７５，１０９号、５，８２０，８８３号、５，８５３，７６３号）や免疫強化膜状担体を用いること（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９８／０５５８）が挙げられる。具体的な一実施形態においては、本発明のワクチンは、コレラ毒素（ＣＴ）との混合物、又はＣＴとの複合タンパク質やキメラ融合タンパク質（例えば、ＣＴ ＢやＣＴ Ａ／Ｂキメラ）として粘膜投与することができる（Hajishengallis, J Immunol., 154: 4322-32, 1995; Jobling and Holmes, Infect Immun., 60: 4915-24, 1992）。ＣＴ Ｂサブユニットの使用に基づく粘膜ワクチンについては既に説明されている（Lebens and Holmgren, Dev Biol Stand 82: 215-27, 1994）。他の実施形態においては、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）との混合物を粘膜ワクチン接種用に調製することができる。吸入によって投与するワクチンの免疫原性は、赤血球（ｒｂｃ）やｒｂｃゴースト（米国特許第５，６４３，５７７号）を用いるか、又はブルータング抗原（米国特許第５，６９０，９３８号）を用いることによっても高めることができる。

上述のアプローチは将来のワクチン接種戦略の改善に有望であるが、それらを特定の状況で用いるには、ワクチンの有効性を確実にする検証や調査が必要である。

ワクチンの効力を評価するため、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）試験を用いることができる。Schild et al., Bull. World Health Organ. 1975, 52: 43-50 and 223-31 Mostow et al., J. Clin. Microbiol. 1975, 2: 531。十分な免疫応答に必要な用量は標準化されており、ＳＲＤ又は最小限の中和活性に対して１５μｇＨＡ／株／投与である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの例や本明細書のどの箇所における他の例も説明の目的にのみ用いられ、決して本発明や如何なる例示用語の範囲や意味をも限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載の如何なる特定の好ましい実施形態にも限定されない。実際、本明細書を読む際、当業者には本発明の多くの改変や変更が明らかとなるであろうし、このような変更は、本発明の精神や範囲を逸脱することなく行うことができる。従って、本発明は、添付する特許請求の範囲の用語、及びこれらの特許請求の範囲によって与えられる均等の全範囲によってのみ限定されるものである。

実施例１
ウイルス感染
動物の感染はＮＩＨ基準に従って行った。５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスをタコニックファームズ社（ニューヨーク州アルバニー）から購入した。イソフルランの吸入によってマウスを約５分間通常の麻酔下におき、意識を取り戻した際に５０μＬのウイルス（ＰＢＳに再懸濁）をマウスのトラップに置いた。ウイルスの力価は標準的なプラークアッセイによって測定し、病原性の研究は３〜５匹のマウス／接種用量のコホートに対して行った。マウスは毎日計量し、最初の体重の２０％が失われた場合には殺した。１×１０³プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＭＲＥ含有Ｈ５Ｎ１ウイルス又は偽ＰＢＳ感染を用いたワクチン接種研究は鼻腔内で行った（ＰＢＳ、ｎ＝２；ＭＲＥ含有Ｈ５Ｎ１、ｎ＝７）。感染２１日後、マウスを１×１０⁶ＰＲＮＴＬ Ｈ５Ｎ１で再チャレンジ（鼻腔内）し、罹患及び死亡の徴候について毎日モニターした。

実施例２
ウイルスＮＰの継代及び配列決定
ＴＰＣＫトリプシンの存在下、ヒト肺上皮細胞をＰＲＮＴＬ又はＭＲＥ含有Ｈ５Ｎ１に０．０１のＭＯＩで感染させた。感染２４時間後、上清を未処理細胞に移し、次の日に計１０回の継代を繰り返した。感染１０日後、全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、ＮＰのＰＣＲ産物を配列決定目的のためにクローン化した。インビボ研究においては、５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを上述のウイルスで処理した。感染５日後、全ＲＮＡを回収し、配列決定のためにＮＰのクローン化に用いた。記載の配列はコホート当たり２５を超えるコロニーを示す。

実施例３
ｍｉＲＮＡ発現及び標的ルシフェラーゼベクター
ｍｉＲ−１２４を発現する赤色蛍光タンパク質のミニ遺伝子はＥ．マケイエフ（Makeyev）によって作出された。Makeyev et al, Molecular Cell 27(3):435 (2007)。ｐＲＦＰ−ｍｉＲ−９３を作出するため、順方向プライマー５’−ＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧ−３’（配列番号１１２）及び逆方向プライマー５’−ＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＣＴＣＣＴ−３’（配列番号１１３）を用い、提供されたプロトコルにより高忠実度ＰＣＲマスターキット（ロシュ・アプライド・サイエンス、インディアナ州インディアナポリス）を用いたＰＣＲ増幅によって、ｐｒｉ−ｍｉＲ−９３遺伝子座を含む５００ｂｐのゲノム断片をマウスゲノムＤＮＡから単離した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）に製造業者の指示に従ってサブクローン化した後、ＰｍｅＩ−ＳｐｅＩ部位によってｐＲＦＰミニ遺伝子にクローン化した。ｍｉＲ−１２４のＭＲＥ及び対照ＳＶ４０の３’ＵＴＲを含むホタルルシフェラーゼ構築物はＥ．マケイエフから入手した。Makeyev et al, Molecular Cell 27(3):435 (2007)。

実施例４
組織培養及びエクスビボ感染
特に明記しない限り、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ−２９３細胞、ヒト肺上皮Ａ５４９細胞、ヒト星状腫Ｕ３７３細胞、及びマウス線維芽細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＪＭバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（メディアテック社）を添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ、メディアテック社、バージニア州マナッサス）中で増殖させた。ダイサー−／−マウス線維芽細胞はＡ．タラーコフシー（Tarahkovsy）（ロックフェラー大学、ニューヨーク州ニューヨークシティ）から贈られたもので、１５％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（ギブコ、インビトロジェン）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。ジャーカット細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したα最小必須培地で増殖させた。初代ヒト樹状細胞ＲＮＡはＡ．フェルナンデス−セスマ（Fernendez-Sesma）（マウントサイナイ医学校、ニューヨーク州ニューヨークシティ）から提供された。線維芽細胞のエクスビボ感染は完全培地中、トリプシンの非存在下で行い（野生型線維芽細胞の場合にはＭＯＩを１、ダイサー−／−線維芽細胞の場合には５とした）、指示された時点で回収した。

実施例５
ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット
ＲＴ−ＰＣＲ及びイムノブロットは最近記載されたように行った。tenOever et al, Science 315(5816):1274 (2007)。アクチン（カタログ番号８２２６、アブカム社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ポリクローナルＰＲ８（Ａ．ガルシア−サストル（Garcia-Sastre）（マウントサイナイ医学校、ニューヨーク州ニューヨークシティ）より入手）、ＩＲＦ１（ｓｃ−６４０、サンタクルーズバイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルーズ）、ＳＴＡＴ１（ｓｃ−４１７、サンタクルーズバイオテクノロジー社）及びＩＳＧ５４（Ｇ．セン（Sen）（クリーブランドクリニック、オハイオ州クリーブランド）より入手）抗体は全て、１μｇ／μＬの濃度で用い、４℃で一晩インキュベートした。二次マウス及びウサギ抗体（ＧＥヘルスケア、英国、ジャイルズ、チャルフォントストリート）は室温で１時間、１：１０００希釈にて用いた。ｍｉＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲプライマーを表１に示す。

実施例６
ｐＲＦＰ及びルシフェラーゼレポータートランスフェクション
ｐＲＦＰ構築物の蛍光確認のためのトランスフェクションは、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で増殖させたＨＥＫ２９３を用い、更に４μｇの適切なｐＲＦＰベクター及びリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用い、提供されたプロトコルに従って行った。トランスフェクション２４時間後に蛍光を画像化した。続いて行うＷＴインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４感染のため、１００ｎｇの適切なホタルルシフェラーゼ３’ＵＴＲ構築物、１０ｎｇの構成的ホタルウミシイタケ（firefly Renilla）及び７００ｎｇの適切なｐＲＦＰ構築物を含む混合物とリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いてＨＥＫ２９３をトランスフェクトした。トランスフェクション６時間後にＭＯＩ＝１で細胞を感染させ、感染１８時間後に細胞を回収してＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅRレポーターアッセイ（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を行った。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン、アジレントテクノロジーズ、カリフォルニア州ラホーラ）又はｐＤＺ−ＮＳ１（全てのｐＤＺ構築物はＰ．パレセ（Palese）（マウントサイナイ医学校、ニューヨーク州ニューヨークシティ）より入手した）を用いたコトランスフェクションのため、５０ｎｇの適切なホタルルシフェラーゼ３’ＵＴＲ、１０ｎｇの構成的ホタルウミシイタケ、３５０ｎｇの適切なｐＲＦＰ構築物及び３５０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン）又はｐＤＺ−ＮＳ１（後述のベクター）を含む混合物とリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いてＨＥＫ２９３をトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に細胞を回収し、Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅRレポーターアッセイ（プロメガ）を製造業者のプロトコルによって行った。全てのホタルルシフェラーゼの測定値はサンプル当たりのホタルウミシイタケ発現に対する割合で表し、その後３個の複製物について平均値を求めた。

実施例７
統計的解析
統計的解析は両側スチューデントＴ検定（ｎ＝３〜８）を用いて行った。ｐ値＜０．０５を有意と見なした。エラーバーは＋／−標準偏差を反映する。

実施例８
ｍｉＲＮＡノーザンブロット解析
トリゾール試薬（インビトロジェン）用い、供給されたプロトコルによって全ＲＮＡを抽出し、７．５Ｍの尿素及び１×ＴＢＥを含む１５％変性ポリアクリルアミドゲルを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離した。Makeyev et al., Molecular Cell 27(3):435 (2007)。次いで、ＲＮＡをハイボンドＮ＋膜（アマシャム、ＧＥヘルスケアライフサイエンス）に移し（０．５×ＴＢＥ中、３６０ｍＡ、６０分間）、ＵＶ照射（２００，０００マイクロジュール／ｃｍ²）によって該膜に架橋させ、該膜を６×ＳＳＣ、７％ＳＤＳ中、６５℃で一晩ブロックした。ハイブリダイゼーションプローブを表２に示す。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（インビトロジェン）及び［γ³²Ｐ］ＡＴＰ（パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて表２に記載のオリゴヌクレオチドを放射標識し、セファデックスＧ−２５カラム（ＧＥヘルスケア）によって精製した。ブロッキング溶液にプローブを約１０００万カウント／分で添加し、４２℃で一晩インキュベートした。次いで、ブロットを４２℃にて３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４回洗浄し、オートラジオグラムで一晩画像化した。

実施例９
インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ヌクレオカプシドへの
ＭＲＥの組み込み
ｍｉＲ−９３に対して部分相補性を有するインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ヌクレオカプシド内の部位を、Ｂｉｂｉｓｅｒｖ'ｓ ＲＮＡｈｙｂｒｉｄアルゴリズム（ビーレフェルト大学、バイオインフォマティクスサービス、Ｃｅｎｔｒｕｍ ｆｕｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ−ＣｅＢｉＴｅｃ、ドイツ、ビーレフェルト）を用いて同定した。ウイルスＲＮＡ発現用ｐＰｏｌ−Ｉ駆動ＮＰベクターにおけるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅRキット及びプロトコル（ストラタジーン）を用いた３〜５段階の部位特異的突然変異誘発によってほぼ完全な相補性が得られた。

実施例１０
変異ＮＰのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性
ＰＲＮＴＬ１／２部位をｐＰｏｌ−Ｉベクターからインビトロタンパク質発現用ｐＤＺバックボーンにクローン化した。ＲｄＲｐ駆動ルシフェラーゼ発現のために、２５０ｎｇのｐＤＺ−ＮＰ−ＰＲＮＴＬ１／２又はＷＴｐＤＺ−ＮＰを、１００ｎｇのｐＰｏｌ−Ｉベースプラスミド駆動のホタルルシフェラーゼ、１０ｎｇの構成的ホタルウミシイタケ、及び残りのインフルエンザウイルスポリメラーゼセグメント（６２．５ｎｇのＰＢ１、６２．５ｎｇのＰＡ及び２５ｎｇのＰＢ２）と共にＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。Hoffmann et al., Antiviral Research 80(2): 124 (2008)。ホタルルシフェラーゼ活性はＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅRレポーターアッセイ（プロメガ）を用いて測定し、サンプル当たりのホタルウミシイタケ発現に対する割合で表し、３個の複製物について平均値を計算した。

実施例１１
組換えインフルエンザＡウイルスのレスキュー
本明細書に記載のｐＰｏｌ−ＩＮＰ変異体を用いて生ウイルスをレスキューした。リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いてＨＥＫ２９３細胞に、変異ｐＰｏｌ−ＩＮＰ構築物と共に、ＷＴのｐＣＡＧＧＳＮＰと、上述の残りの７個のインフルエンザセグメントに対応する７個のｐＤＺ構築物をトランスフェクトした。Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(21):8203 (2006)。トランスフェクション２４時間後に細胞を回収し、受精鶏卵の絨毛尿膜液に注入した。注入４８時間後に生ウイルスを単離し、血球凝集アッセイ及びプラークアッセイの両方によって定量した。上述の構築物を用い、Ｈ５Ｎ１組換えインフルエンザＡウイルスを同様に作出した。

実施例１２
外因性ｍｉＲＮＡヘアピン発現及び転写後の遺伝子サイレンシング
ｍｉＲＮＡを外因的に発現させるため、そのゲノムコンテクスト内のｍｉＲＮＡヘアピンを赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のイントロンとしてクローン化することによって、その切除後に処理することができ、ＲＦＰ発現との関連が得られた（図１Ａ）。これらの研究においては、ｍｉＲ−９３（即ち、内在性標的がまだ確認されていない高遍在性のｍｉＲＮＡ）とｍｉＲ−１２４（即ち、神経細胞分化の促進に伴う組織特異的ｍｉＲＮＡ）を選択した。Makeyev et al., Molecular Cell 27(3):435 (2007)。

ｐＲＦＰ−ｍｉＲ−９３又はｐＲＦＰ−ｍｉＲ−１２４の発現によって、両方のプレｍｉＲＮＡ産物が出現すると共に、その成熟体が増加した（図１Ｂ）。これらの結果から、インビボインフルエンザウイルス感染時にはｍｉＲＮＡプロセシングは有意に影響を受けないことが示唆された。ｍｉＲＮＡ介在の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）がインフルエンザウイルス感染時に影響を受けるかどうか調べるため、公知のｍｉＲ−１２４標的配列を含むルシフェラーゼレポーターのｍｉＲ−１２４介在ＰＴＧＳをモニターした。Makeyev et al., Molecular Cell 27(3):435 (2007)。ｍｉＲ−１２４は対照ＳＶ４０の３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼ活性を抑制できなかったが、ｍｉＲ−１２４のＭＲＥを含むｍＲＮＡ由来のルシフェラーゼ活性の９０％を阻害した（図１Ｃ）。また、この活性は、インフルエンザウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）の存在下やＮＳ１発現（即ち、宿主防御遮断に関与する非構造的ＲＮＡ結合タンパク質）によっては阻害されなかった（図１Ｃ／Ｄ）。Lu et al., Genes & Development 8(15): 1817 (1994); Talon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(8):4309 (2000); and Jackson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105(11):4381 (2008)。これらのデータから、インフルエンザウイルス感染がｍｉＲＮＡ生合成及びＰＴＧＳを可能とし、それによってＭＲＥ組み込みが弱毒化誘導のツールとして用いることができたことが示唆された。

実施例１３
インフルエンザＮＰコード領域へのｍｉＲＮＡ標的配列の組み込み
インフルエンザウイルスは伝統的に発育鶏卵の絨毛尿膜内で高力価まで増殖する。従って、本発明の目的のために、この膜では発現しないが、マウス肺組織及びヒト肺組織の両方に遍在するｍｉＲＮＡ種を同定した。公的に入手可能なｍｉＲＮＡプロファイルのインシリコスクリーン、及びニワトリ内で発現するｍｉＲＮＡの公表レポートを用い、ｍｉＲ−９３を有力な候補として同定した（図５及びBurnside et al., BMC Genomics 9:185 (2008)）。これらのデータはノーザンブロット解析によって裏付けられた（図２Ａ）。

インフルエンザウイルスにｍｉＲ−９３部位を組み込むため、循環している株間で高い保存性を維持しているウイルスゲノム内の領域を同定した。インフルエンザウイルス転写物は十分な３’ＵＴＲをコードせず、外因性ＲＮＡを伴ってパッケージング欠陥を示すため、ｍｉＲＮＡ標的はＮＰのコード領域に直接組み込んだ。ＮＰのコード領域を選択したのは、このセグメントが１９１８年から今日まで株間での遺伝的ドリフトを殆ど示さず、エスケープ変異体が出現しにくいためである（図２Ｂ）。

ＲＮＡフォールディングアルゴリズムを用いてｍｉＲ−９３様部位の配列スキャニングを行ったが、これによって、タンパク質全体に対する構造的置換を行う必要なく、ｍｉＲ−９３標的部位に形質転換し得る２個のＲＮＡ配列が同定された。効率的で効果的なターゲティングを確実に行うと共に、エスケープ変異体の可能性を低下させるため、セグメント５の位置２２５（部位１）及び位置８１８（部位２）において２種のほぼ完全な相補的ＭＲＥを設計した。部位１では配列５’−ＡＣＡＡＵＡＧＡＧＡＧＡＡＵＧＧＵＧＣＵＣＵＣＵ−３’（配列番号１２）を５’−ＡＣＡＣＵＵＧＡＡＣＧＡＡＵＧＧＵＡＣＵＵＵＣＵ−３（配列番号１３）（本明細書では９３ＮＰ１と称する）又は５’−ＡＣＣＵＵＡＧＡＧＡＧＧＡＵＧＧＵＣＣＵＡＵＣＵ−３’（配列番号１３９）（本明細書ではＰＲＮＴＬ１と称する）に置換した。部位２では配列５’−ＵＵＵＣＵＡＧＣＡＣＧＧＵＣＵＧＣＡＣＵＣＡＵＡ−３’（配列番号１４）を５’−ＵＵＣＣＵＵＧＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣＵＵＵＵＡ−３’（配列番号１５）（本明細書では９３ＮＰ２と称する）又は５’−ＵＵＵＣＵＡＧＣＣＡＧＡＡＣＵＧＣＡＣＵＣＵＵＡ−３’（配列番号１４０）（本明細書ではＰＲＮＴＬ２と称する）に置換した。

部位１及び部位２の算出した平均自由エネルギー（ＭＦＥ）はそれぞれ−２８ｋｃａｌ／モル及び−３７．１ｋｃａｌ／モルであった（図２Ｃ）。ｍｉＲ−９３部位の作出によって３個のアミノ酸置換がもたらされたが、その全てが階層的順序内に留まった。こうして、ＮＰ機能が損なわれたかどうかが初めて確認された。このため、インフルエンザウイルスポリメラーゼ部位をコードするアンチセンスレポーター構築物に、必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）成分ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、及び野生型ＮＰ構築物又は親ＮＰ構築物の一方をトランスフェクトした。Pleschka et al., J. Virol. 70(6):4188 (1996) and Hoffmann et al., Antiviral Research 80(2):124 (2008)。これらのデータから、Ｉ６３Ｌ、Ｓ２６２Ｔ及び／又はＩ２６５ＬをＮＰに組み込んでもタンパク質の機能全体には影響を及ぼさないが、それによってポリメラーゼ活性が約２０％低下した（図２Ｄ）ことが分かった。

ＮＰ機能性の検証後、ヒト胎児腎臓細胞に種々のＭＲＥ含有ＮＰセグメントをトランスフェクトすると共に、ＲＮＡポリメラーゼＩ及びＩＩで双方向に転写した残り７個のインフルエンザウイルスセグメント（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）をコードするプラスミドをトランスフェクトして、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）とｍＲＮＡを同時に作出した。Quinlivan et al., J. Virol. 79(13):8431 (2005) and Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(21):8203 (2006)。トランスフェクション２４時間後に細胞を回収し、１０日齢の発育鶏卵に注入した。全てのインフルエンザウイルス株（ＰＲＮＴＬ、ｍｉＲ−９３ＮＰ１、ｍｉＲ−９３ＮＰ２及びｍｉＲ−９３ＮＰ１／２）を同等の効率でレスキューしたが、インオボでは弱毒化は生じず、力価は１×１０⁷プラーク形成単位／ｍＬ（ｐｆｕ／ｍＬ）を超えることが分かった（図２Ｅ）。

実施例１４
ＭＲＥ含有ＮＰセグメントを含むインフルエンザＡウイルスのエクスビボ及びインビボ弱毒化
ＭＲＥ含有ＮＰセグメントの組み込みがｍｉＲ−９３介在の弱毒化をもたらすかどうか確認するため、野生型及びダイサー−／−マウス線維芽細胞に親Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲＮＴＬ）、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／９３ＮＰ１（９３ＮＰ１）、９３ＮＰ２又は９３ＮＰ１／２を感染させた（図３Ａ及びＳ２）。１．０の感染多重度（ＭＯＩ）において、ＰＲＮＴＬウイルスの場合、野生型線維芽細胞では感染１２時間後（ｈｐｉ）に十分なレベルの血球凝集素（ＨＡ）が産生した。このウイルス転写速度から、単一ＭＲＥの組み込みによる弱毒化の程度が低いことが分かったが、９３ＮＰ１／２の場合、タンパク質産生が完全に失われたことが分かった（図３Ａ）。これらの同じウイルス株がｍｉＲＮＡプロセシングを妨げるダイサーの非存在下で高力価まで複製した（図３Ａ及びＢ）ため、この弱毒化は組み込まれたＭＲＥ部位に起因すると考えられる。これらのデータから、インフルエンザウイルス転写物へのＭＲＥの組み込みによってエクスビボでｍｉＲＮＡ介在の弱毒化が誘導されたことが分かった。

インビボでＭＲＥ含有インフルエンザ株の特徴付けを行うため、マウスに１０⁴ｐｆｕで鼻腔内感染させ、感染５日後（ｄｐｉ）に全肺抽出物を回収した。心葉のＲＴ−ＰＣＲ解析から、ＰＲＮＴＬ含有株に対する免疫応答とＭＲＥ含有株に対する免疫応答には認識可能な差は無いことが分かった。各株に対して、インターフェロン調節因子７（ＩＲＦ７）ｍＲＮＡの強いアップレギュレーションがあり、主要な抗ウイルスサイトカイン（インターフェロンβ（ＩＦＮβ）やインターロイキン６（ＩＬ６）等）が誘導された（図３Ｃ）。また、左葉のタンパク質解析から、ＩＦＮβ調節遺伝子及びＩＦＮγ調節遺伝子の両方（例えば、ＳＴＡＴ１やＩＲＦ１、ＩＦＮ刺激遺伝子５４（ＩＳＧ５４））が強く誘導されることも分かった（図３Ｄ）。更に、インフルエンザウイルスは変異する傾向が強い（tenOever et al, Science 315(5816):1274 (2007)）ため、複数回の感染をヒト肺上皮細胞Ａ５４９（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−１８５）ではエクスビボで、マウスではインビボで行って、それぞれ数回の連続継代後又は感染５日後にＲＮＡを回収した（図３Ｅ及び７）。驚くべきことに、インビボ感染及びエクスビボ感染の両方において復帰変異体が産生しなかったが、これは、ｍｉＲＮＡターゲティングの柔軟性と共に、これに対するＮＰの強固な保存性によってエスケープ変異体の産生が妨げられることを示唆する。

実施例１５
ＭＲＥ含有インフルエンザＡウイルスワクチンによるインビボ防御
エクスビボでのｍｉＲＮＡ介在弱毒化がインビボで実証され、良好なワクチンとして用いることができるかどうか確認するため、病原性研究をマウスで行った。この潜在的なワクチン戦略の汎用性を説明するため、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＭＲＥ含有セグメント５を用いてトリ血球凝集素（Ｈ５）及びノイラミニダーゼ（Ｎ１）を含むキメラ株をＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４から標準的な逆遺伝学によってレスキューした。Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(21):8203 (2006) and Tumpey et al., Science 310(5745):77 (2005)。

本発明者らのＨ５Ｎ１のＭＲＥ含有ウイルス株がインビボで弱毒化されるかどうか解明するため、マウスをＨ５Ｎ１のＰＲＮＴＬ又はＨ５Ｎ１の９３ＮＰ１／２に濃度を上昇させて感染させた。１０⁵のウイルス力価において、ＰＲＮＴＬインフルエンザ株の場合、３匹中３匹が死亡したが、これに対し、ＭＲＥ含有株の場合には、１匹の死亡のみであった（図４Ａ）。また、死亡はＰＲＮＴＬ株の１０⁴及び１０³（ｎ＝８／コホート）の鼻腔内接種による感染の場合に限られ、算出した５０％致死量はＭＲＥ含有株に比べて約３ログ高かった（図４Ａ）。ＭＲＥ含有Ｈ５Ｎ１に対しては、親株と同様に重量減少が生じたが、ｍｉＲ−９３ＮＰ１／２ウイルスはその後中和され、マウスは完全な回復を示した（図４Ｂ）。

これらのデータから、ＭＲＥ含有インフルエンザウイルスのインビボ弱毒化はまだ低レベルの複製を許容するため、適応免疫応答を必要とすることが示唆される。これは、ＭＲＥ含有インフルエンザウイルス株が非常に高レベルの中和抗体を産生し、よって、優れたワクチン候補となり得ることを示す。この仮説を試験するため、感染２１日後にマウスを親Ｈ５Ｎ１株を用い致死量の１０倍（１０⁶ｐｆｕ／マウス）で再チャレンジし、生存について再度モニターした（図４Ｃ）。偽ワクチン接種の場合（即ち、死亡率１００％で、急速な重量減少が観察された（図４Ｃ及び４Ｄ））と比べて、ＭＲＥ含有Ｈ５Ｎ１接種マウスでは罹患の徴候が見られなかったが、これは完全な防御と中和抗体の存在を示す（図４Ｃ及び４Ｄ）。

実施例１６
組換えウイルスの免疫学的評価
ｍｉＲ−９３標的株が強い中和免疫応答を誘導するかどうか確認するため、Ａ／ＰＲ／８／３４Ｈ１Ｎ１のＰＲＮＴＬ及び９３ＮＰ１／２組換え体を用いてマウスにおける研究を行った（図８Ａ）。ＰＲＮＴＬ株の接種によって、９３ＮＰ１／２やＰＢＳ投与の場合と比べて１０％を超える重量減少が生じた。また、ワクチン接種２１日後、これらのマウスに対して致死的チャレンジを行った結果、１００％生存し、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを含む強い中和抗体レパートリーがもたらされた（図８Ａ）。種特異的ｍｉＲＮＡ介在ワクチン開発の利用について詳細に説明するため、ｍｉＲ−９３標的Ｈ５Ｎ１リアソータントウイルスを更に試験した。このために、ＭＲＥシードＮＰセグメント（Perez et al. Nature Biotechnology 27(6) 572 (2009)に記載）及びＡ／ＰＲ／８／３４の野生型セグメント１〜３及び７〜８（登録番号：ＡＦ３８９１１５．１、ＡＦ３８９１１６．１、ＡＦ３８９１１７．１、ＡＦ３８９１２１．１、ＡＦ３８９１２２．１）を用いてＨ５Ｎ１の６：２リアソータントをレスキューし、ＨＡ及びＮＡ遺伝子発現によって抗原的にＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４／Ｈ５Ｎ１として認識されるウイルス（Perez et al. Nature Biotechnology 27(6) 572 (2009)に記載）を作出した（図８Ｂ）。これらのウイルスの遺伝的レスキュー及び増殖によってはインオボでの弱毒化は示されなかった（図８Ｃ）。Ｈ１Ｎ１ワクチン接種の場合とは異なり、Ｈ５Ｎ１のＰＲＮＴＬの投与の場合には、死亡率が５０％となり、平均２０％の体重減少が生じた。これに対し、ＭＲＥシードＨ５Ｎ１の場合には完全な生存を示したが、僅かな体重減少が誘発された（図８Ｄ）。ワクチン接種後、感染２１日後にマウスを致死量のＨ５Ｎ１でチャレンジした。偽ワクチン接種の場合（即ち、死亡率１００％で、急速な重量減少が観察された）と比べて、ＭＲＥシードＨ５Ｎ１接種マウスでは罹患の徴候が見られなかったが、これは完全な防御を示す（図８Ｄ）。また、これらのマウスの血清は野生型Ｈ５Ｎ１ウイルスに対する中和活性に関しても陽性であり、Ｈ１Ｎ１ワクチン接種の場合と同様に、高い力価のＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが得られた（図８Ｄ）。

実施例１７
更なる組換えウイルスの作出
セグメント５（ＮＰをコードする）が哺乳動物特異的ｍｉＲ−９３の標的となり得るという上述の知見について詳細に説明するため、異なる哺乳動物特異的ｍｉＲＮＡを用い、異なるインフルエンザＡセグメントを標的とする第２の種特異的ＭＲＥ標的インフルエンザＡウイルス株を設計した。具体的には、上述の通常の鋳型及びアプローチを用い、３個のほぼ完全なｍｉＲ−３４標的部位をＰＡのオープンリーディングフレーム（セグメント３でコードされる）に組み込んだ。ｍｉＲ−３４標的部位の組み込みは標準的な部位特異的突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985), 米国特許第５，０７１，７４３号に記載）によって行った。部位特異的突然変異誘発のプライマーとしては、次の相補的なセット、即ち、部位１には５−ＧＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡｃＧＴｔＧＣｃＣＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１４８）と５’−ＡＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴｃＧＧｔＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号１４９）、部位２には５’−ＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣａｃＴｇＴＴＡＧＣＡＡＡＧＴ−３’（配列番号１５０）と５’−ＧＡＡＡＧＴＴＣＣＡＴＴＧＧｃＡＡＧＧＴａＴＧｔＡＧＧＡＣＡＣＴ−３’（配列番号１５１）、部位３には５’−ＣＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＴＴＧｔｃａＴＡＧＴＴＧＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１５２）と５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴｇＡＣｔＣＡＴＧＣＡｃＴＧＴＣＡＴＡＧＴＴ−３’（配列番号１５３）を用いた（小文字で書かれた塩基は、ｍｉＲ−３４ＭＲＥを作出する各段階における塩基の変更を表す）。ｍｉＲ−９３の場合と同様に、ｍｉＲ−３４はニワトリ細胞に存在しないため（表１０）、このウイルスをＤＦ１ニワトリ線維芽細胞で増殖した際には、該ウイルスのレスキューによっては弱毒化が示されなかった（図９）。これに対し、この同じウイルスをマウス肺由来細胞中で継代した際には、感染１２時間後及び２４時間後（ｈｐｉ）のいずれにおいても強い弱毒化が示された。

実施例１８
組織／細胞特異的組換えウイルスの作出
ターゲティング戦略（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）対非翻訳領域（ＵＴＲ））の両方について詳細に説明し、ＭＲＥ介在の弱毒化が大規模なインフルエンザ作出用の組織／細胞培養システムに適応し得るかどうか確認するため、ＮＳ１又はＮＰインフルエンザ遺伝子を、スクランブル配列（Ｓｃｒｂ１）又は造血細胞に特有なＭＲＥ（ｍｉＲ−１４２［５’−ＵＧＵＡＧＵＧＵＵＵＣＣＵＡＣＵＵＵＡＵＧＧＡ−３’（配列番号１４１）］、Landgraf et al., Cell 129:1401 (2007)参照）のタンデム反復で標的化した。これを行うために、５’パッケージング配列をウイルスＲＮＡで複製し、この遺伝情報を終止コドンとポリＡテール配列との間に挿入した（図１０Ａ）。人工３’ＵＴＲによってｍｉＲＮＡの標的となるウイルス転写物を操作するため、ウイルスセグメントの通常の構造を操作して、３’ＵＴＲをコードし、複製ＲＮＡパッケージング配列を含むようにした。標準的な部位特異的突然変異誘発によって、特有のＳａｌ１制限部位をｖＲＮＡの終止コドンとポリアデニル化部位との間に導入した。人工ＮＰ３’ＵＴＲ作出用プライマーとしては、５’−ＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧｔｃｇＡｃＴＡＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１５４）の相補的なセットを用いた（小文字の塩基は変更されたヌクレオチドであり、下線部の配列はＳａｌ１部位である）。ウイルスパッケージング配列（先に確立されたＮＰ用の１２０塩基対（Fields et al., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2007)）は生成した時点で挿入した。ＮＰパッケージング配列プライマーとしては、５’−ＣｇＴＣＧＡｃＣＴＣＴＣＧＧＡＣＧＡＡＡＡＧＧ−３（配列番号１５５）及び５’−ＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＴＧ−３’（配列番号１５６）（Ｓａｌ１及びＸｈｏ１リンカー（下線部）を含む）を用いた。ＰＣＲによる産物をＸｈｏ１及びＳａｌ１で切断し、Ｓａｌ１部位内に連結させて３’ＵＴＲを作出した。Ｘｈｏ１及びＳａｌ１連結によって回文構造配列が破壊されるため、終止コドンとポリＵトラクト（ポリＡテールの生成に役立つ）との間に位置する単一の残存Ｓａｌ１部位によって、次にスクランブル配列又は特定のｍｉＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）を連結するための挿入ポイントが得られる（図１０）。上述のものと同じ戦略を用いてＮＳ１を標的化したが、この場合には、複製領域としてｖＲＮＡの５’末端に対するスプライスアクセプター部位で開始する全ＮＳ２（ＮＥＰ）ＯＲＦを用いた（５’−ＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１５７）及び５’−ＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡ−３’（配列番号１５８））。ｍｉＲ−１４２のＭＲＥ挿入オリゴは、インサート５’−ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ−３’（配列番号１５９）の４コピー又はスクランブル非標的配列５’−ＧＡＴＣＧＧＴＡＧＣＴＡＣＧＴＡＧＣＴＡＧＣ−３’（配列番号１６０）の４コピーであった。このターゲティング戦略が細胞培養に適用し得るかどうか試験するため、図１に概略を示し、Perez et al. Nature Biotechnology 27(6) 572 (2009)に記載の同じ戦略を用いて外因性ｍｉＲ−１４２を発現するようにプラスミドを適応させた（図１０Ｂ）。ｍｉＲ−１４２を作出するため、ｍｉＲ−１４２遺伝子座をコードする次の配列：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＴＧＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＣＴＡＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＡＧＡＣＡＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号１６３）を有するヒトゲノム３１８ｂｐ断片をプライマー５’−ＣＣＡＧＴＧＣＴＧＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号１６１）及び５’−ＧＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１６２）を用いて増幅した。このプラスミドは、マクロファージで発現する内在性ｍｉＲ−１４２と比べて、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした際に強い発現を示した（図１０Ｃ）。ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−３４）は、赤色蛍光用細胞選別によって安定なプラスミド発現のために選択した。ベクターのみ又はｍｉＲ−１４２を発現する選別されたＭＤＣＫ細胞を維持し、新しい細胞株として拡張した（図１０Ｄ）。ｍｉＲ−１４２標的ＮＰ（図１０Ｅ）のウイルス複製を、ベクターを発現するＭＤＣＫ細胞とｍｉＲ−１４２を発現するＭＤＣＫ細胞とで比較した際、ｍｉＲ−１４２標的ＮＰウイルス株は、スクランブルＵＴＲ対照カウンターパートとは対照的に、ｍｉＲＮＡ特異的に劇的な弱毒化を示した。これらの結果は、ｍｉＲ−１４２標的ＮＳ１を比較した結果（即ち、ＭＲＥコードウイルスは、ｍｉＲ−１４２を発現する初代マクロファージで選択的に弱毒化された（図１０Ｃ）が、ｍｉＲ−１４２が存在しない初代肺線維芽細胞では弱毒化されなかった（図１０Ｆ））と同様であった。これらの結果から、このＭＲＥを利用した技術を細胞培養に適応させる可能性が示されると共に、インフルエンザウイルスセグメントの人工３’ＵＴＲ又はコード領域に対してＭＲＥターゲティングを行うことができることが分かる。更に、これらの結果から、ＭＤＣＫ細胞や他の細胞培養系は、通常このような細胞では発現しないｍｉＲＮＡを組み込むことによって、ウイルス増殖に用いることができることが分かる。

本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によってその範囲が限定されるものではない。実際、上述の説明により、本明細書に記載の改変に加えて本発明の種々の改変が当業者には明らかとなるであろう。このような改変は添付された特許請求の範囲内に入るものである。

本明細書で引用した全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、その他の資料は、それらが本明細書に物理的に存在するかのように、その全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。

Claims (67)

1. 一以上のマイクロＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）配列を含む組換えインフルエンザウイルスを含む組成物。
2. インフルエンザウイルスは二以上のＭＲＥ配列を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 一以上のＭＲＥ配列は、一以上のインフルエンザウイルス遺伝子のコード領域内に挿入されている、請求項１に記載の組成物。
4. インフルエンザウイルス遺伝子は、ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１及びＮＳ２／ＮＥＰから成る群から選択されるインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、請求項３に記載の組成物。
5. インフルエンザウイルス遺伝子は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１及びＮＳ２／ＮＥＰから成る群から選択されるインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、請求項３に記載の組成物。
6. 一以上のＭＲＥ配列は、人工的に作出されたインフルエンザウイルスの３’ＵＴＲ内に挿入されている、請求項１に記載の組成物。
7. ＭＲＥは、種特異的発現によって特徴付けられるｍｉＲＮＡに対応する、請求項１に記載の組成物。
8. ＭＲＥは、ワクチン接種を必要とする動物のインフルエンザ標的細胞では高度に発現するが、発育鶏卵内でインフルエンザウイルス増殖が生じる領域では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応する、請求項７に記載の組成物。
9. ＭＲＥは、組織特異的発現又は細胞特異的発現によって特徴付けられるｍｉＲＮＡに対応する、請求項１に記載の組成物。
10. ＭＲＥは、ワクチン接種を必要とする動物のインフルエンザ標的細胞では高度に発現するが、ワクチン作出に用いる細胞株では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応する、請求項９に記載の組成物。
11. ワクチン作出に用いる細胞株は、ニワトリ線維芽細胞ＤＦ１、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＣＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ）及びヒトＰＥＲ−Ｃ６細胞から成る群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
12. ＭＲＥは、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９７７、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１２５９及びｍｉＲ−１９７８から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応する、請求項１に記載の組成物。
13. ＭＲＥは、配列５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ−３’（配列番号１）を有するｍｉＲ−１６、配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’(配列番号２）を有するｍｉＲ−１７、配列５’−ＵＧＵＧＣＡＡＡＵＣＵＡＵＧＣＡＡＡＡＣＵＧＡ−３’（配列番号３）を有するｍｉＲ−１９、配列５’−ＣＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＵＣＧＧＵＣＵＧＡ−３’（配列番号４）を有するｍｉＲ−２５、配列５’−ＵＧＧＣＡＧＵＧＵＣＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧＵ−３’（配列番号５）を有するｍｉＲ−３４、配列５’−ＵＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧ−３’（配列番号６）を有するｍｉＲ−９２、配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＧＵＵＣＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’（配列番号７）を有するｍｉＲ−９３、配列５’−ＵＧＵＡＧＵＧＵＵＵＣＣＵＡＣＵＵＵＡＵＧＧＡ−３’（配列番号１４１）を有するｍｉＲ−１４２、配列５’−ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＵ−３’（配列番号１４２）を有するｍｉＲ−２２２、配列５’−ＵＣＵＧＧＵＣＣＧＵＧＵＣＵＵＣＡＣＵＣＣＣ−３’（配列番号１４３）を有するｍｉＲ−１４９、配列５’−ＧＡＵＵＡＧＧＧＵＧＣＵＵＡＧＣＵＧＵＵＡＡ−３’（配列番号１４４）を有するｍｉＲ−１９７７、配列５’−ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ−３’（配列番号１４５）を有するｍｉＲ−１８１ｂ−２、配列５’−ＡＵＡＵＡＵＧＡＵＧＡＣＵＵＡＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１４６）を有するｍｉＲ−１２５９、及び配列５’−ＧＧＵＵＵＧＧＵＣＣＵＡＧＣＣＵＵＵＣＵＡ−３’（配列番号１４７）を有するｍｉＲ−１９７８から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応する、請求項１２に記載の組成物。
14. 組換えインフルエンザウイルスは、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２から成る群から選択されるインフルエンザサブタイプに由来する、請求項１に記載の組成物。
15. 組換えインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／５９、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３０８／７８、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４、Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／６１６／１９９５、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１６／６８、Ａ／ＵＳＳＲ／０３９／６８、Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／Ｃ５／８５、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／４７／５７、及びＡ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０から成る群から選択される分離株に由来する、請求項１に記載の組成物。
16. ワクチン組成物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. アジュバントを更に含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
18. 動物においてインフルエンザ感染に対する防御免疫応答を誘導する方法であって、請求項１６に記載のワクチン組成物を前記動物に投与することを含む方法。
19. 前記動物はヒトである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ワクチン組成物は粘膜投与する、請求項１８に記載の方法。
21. 前記ワクチン組成物はアジュバントと共に投与する、請求項１８に記載の方法。
22. インフルエンザウイルスコード配列と、前記コード配列内に挿入された一以上のマイクロＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）配列とを含む単離核酸分子。
23. インフルエンザウイルスコード配列は、ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１及びＮＳ２／ＮＥＰから成る群から選択されるインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、請求項２２に記載の核酸分子。
24. インフルエンザウイルスコード配列は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１及びＮＳ２／ＮＥＰから成る群から選択されるインフルエンザウイルスタンパク質をコードする、請求項２２に記載の核酸分子。
25. インフルエンザウイルスコード配列と、転写物の終止コドンとポリアデニル化部位との間に挿入された一以上のマイクロＲＮＡ応答要素（ＭＲＥ）配列を含む人工３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む単離核酸分子。
26. ＭＲＥは、種特異的発現によって特徴付けられるｍｉＲＮＡに対応する、請求項２２又は２５に記載の核酸分子。
27. ＭＲＥは、ワクチン接種を必要とする動物のインフルエンザ標的細胞では高度に発現するが、発育鶏卵内でインフルエンザウイルス増殖が生じる領域では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応する、請求項２６に記載の核酸分子。
28. ＭＲＥは、組織特異的発現又は細胞特異的発現によって特徴付けられるｍｉＲＮＡに対応する、請求項２２又は２５に記載の核酸分子。
29. ＭＲＥは、ワクチン接種を必要とする動物のインフルエンザ標的細胞では高度に発現するが、ワクチン作出に用いる細胞株では発現しないか又は発現が非常に低レベルであるｍｉＲＮＡに対応する、請求項２８に記載の核酸分子。
30. ワクチン作出に用いる細胞株は、ニワトリ線維芽細胞ＤＦ１、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＣＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ）及びヒトＰＥＲ−Ｃ６細胞から成る群から選択される、請求項２９に記載の核酸分子。
31. ＭＲＥは、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９７７、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１２５９及びｍｉＲ−１９７８から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応する、請求項２２又は２５に記載の核酸分子。
32. ＭＲＥは、配列５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ−３’（配列番号１）を有するｍｉＲ−１６、配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’(配列番号２）を有するｍｉＲ−１７、配列５’−ＵＧＵＧＣＡＡＡＵＣＵＡＵＧＣＡＡＡＡＣＵＧＡ−３’（配列番号３）を有するｍｉＲ−１９、配列５’−ＣＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＵＣＧＧＵＣＵＧＡ−３’（配列番号４）を有するｍｉＲ−２５、配列５’−ＵＧＧＣＡＧＵＧＵＣＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧＵ−３’（配列番号５）を有するｍｉＲ−３４、配列５’−ＵＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧ−３’（配列番号６）を有するｍｉＲ−９２、及び配列５’−ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＧＵＵＣＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ−３’（配列番号７）を有するｍｉＲ−９３、配列５’−ＵＧＵＡＧＵＧＵＵＵＣＣＵＡＣＵＵＵＡＵＧＧＡ−３’（配列番号１４１）を有するｍｉＲ−１４２、配列５’−ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＵ−３’（配列番号１４２）を有するｍｉＲ−２２２、配列５’−ＵＣＵＧＧＵＣＣＧＵＧＵＣＵＵＣＡＣＵＣＣＣ−３’（配列番号１４３）を有するｍｉＲ−１４９、配列５’−ＧＡＵＵＡＧＧＧＵＧＣＵＵＡＧＣＵＧＵＵＡＡ−３’（配列番号１４４）を有するｍｉＲ−１９７７、配列５’−ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ−３’（配列番号１４５）を有するｍｉＲ−１８１ｂ−２、配列５’−ＡＵＡＵＡＵＧＡＵＧＡＣＵＵＡＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１４６）を有するｍｉＲ−１２５９、及び配列５’−ＧＧＵＵＵＧＧＵＣＣＵＡＧＣＣＵＵＵＣＵＡ−３’（配列番号１４７）を有するｍｉＲ−１９７８から成る群から選択されるｍｉＲＮＡに対応する、請求項３１に記載の核酸分子。
33. 二以上のＭＲＥを含む、請求項２２又は２５に記載の核酸分子。
34. ＭＲＥとその対応するｍｉＲＮＡとの相互作用の平均自由エネルギー（ＭＦＥ）は−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である、請求項２２又は２５に記載の核酸分子。
35. ＭＲＥとその対応するｍｉＲＮＡとの相互作用の平均自由エネルギー（ＭＦＥ）は−３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である、請求項２２又は２５に記載の核酸分子。
36. ｍｉＲ−９３に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＰのコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＮＰアミノ酸６２〜６９をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＮＰアミノ酸２５８〜２６５をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
37. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＣＡＡＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１０７）を含む、請求項３６に記載の核酸分子。
38. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＣＣＴＴＧＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＴＡ−３’（配列番号１１１）を含む、請求項３６に記載の核酸分子。
39. ｍｉＲ−９２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１のコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＮＳ１アミノ酸１３１〜１３７をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＮＳ１アミノ酸１５０〜１５６をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
40. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＴＧＴＡＡＴＡ−３’（配列番号９７）を含む、請求項３９に記載の核酸分子。
41. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＡＴＡ−３’（配列番号１０１）を含む、請求項３９に記載の核酸分子。
42. ｍｉＲ−９２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡのコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸６８〜７４をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸１９５〜２０１をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸５２６〜５３２をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
43. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＴ−３’（配列番号８３）を含む、請求項４２に記載の核酸分子。
44. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＧＣＣＴＡＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号８７）を含む、請求項４２に記載の核酸分子。
45. 第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＡＧＧＴＧＣＡＡＴＡ−３’（配列番号９１）を含む、請求項４２に記載の核酸分子。
46. ｍｉＲ−１９に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡのコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸１５〜２２をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸５６１〜５６８をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸３２７〜３３４をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
47. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡ−３’（配列番号４５）を含む、請求項４６に記載の核酸分子。
48. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＴＡ−３’（配列番号４９）を含む、請求項４６に記載の核酸分子。
49. 第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＧＣＧＵＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＴＴＧＣＧＣ−３’（配列番号５３）を含む、請求項４６に記載の核酸分子。
50. ｍｉＲ−１６に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡのコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸２〜９をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＨＡアミノ酸４３９〜４４５をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
51. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号２１）を含む、請求項５０に記載の核酸分子。
52. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＡＣＧＣＣＧＡＡＣＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号２５）を含む、請求項５０に記載の核酸分子。
53. ｍｉＲ−３４に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＰＡのコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＰＡアミノ酸４２６〜４３３をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＰＡアミノ酸６３４〜６４１をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＰＡアミノ酸７０９〜７１６をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
54. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号６９）を含む、請求項５３に記載の核酸分子。
55. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＧＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＴＡ−３’（配列番号７３）を含む、請求項５３に記載の核酸分子。
56. 第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡ−３’（配列番号７７）を含む、請求項５３に記載の核酸分子。
57. ｍｉＲ−２５に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質Ｍ１のコード配列に挿入されている２種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＭ１アミノ酸１１１〜１１８をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＭ１アミノ酸１２７〜１３４をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
58. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴ−３’（配列番号５９）を含む、請求項５７に記載の核酸分子。
59. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号６３）を含む、請求項５７に記載の核酸分子。
60. ｍｉＲ−１７に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＰＢ１のコード配列に挿入されている３種のＭＲＥを含み、第１のＭＲＥ配列はＰＢ１アミノ酸３７４〜３８１をコードするヌクレオチド配列にあり、第２のＭＲＥ配列はＰＢ１アミノ酸４１８〜４２４をコードするヌクレオチド配列にあり、第３のＭＲＥ配列はＰＢ１アミノ酸６７７〜６８３をコードするヌクレオチド配列にある、請求項２２に記載の核酸分子。
61. 第１のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＣＴＴＴ−３’（配列番号３１）を含む、請求項６０に記載の核酸分子。
62. 第２のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号３５）を含む、請求項６０に記載の核酸分子。
63. 第３のＭＲＥ配列はヌクレオチド配列５’−ＡＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号３９）を含む、請求項６０に記載の核酸分子。
64. ｍｉＲ−１４２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＰの人工３’ＵＴＲに挿入されている４種のＭＲＥを含み、ＭＲＥ配列はウイルス終止コドンとポリＡテール配列との間に存在する、請求項２５に記載の核酸分子。
65. ４種のＭＲＥの各々はヌクレオチド配列５’−ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ−３’（配列番号１５９）を含む、請求項６４に記載の核酸分子。
66. ｍｉＲ−１４２に対応し、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１の人工３’ＵＴＲに挿入されている４種のＭＲＥを含み、ＭＲＥ配列はウイルス終止コドンとポリＡテール配列との間ではあるが、複製ＮＳ２／ＮＥＰのＯＲＦの前に存在する、請求項２５に記載の核酸分子。
67. ４種のＭＲＥの各々はヌクレオチド配列５’−ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ−３’（配列番号１５９）を含む、請求項６６に記載の核酸分子。

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