JP2010516279A - 表皮ブドウ球菌に対する防御免疫応答を誘導するためのポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、配列番号１に構造的に関連しているアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの使用を特徴とする。配列番号１は完全長表皮ブドウ球菌ポリペプチドのトランケート化誘導体である。天然に存在する該完全長ポリペプチドは本明細書においては完全長ＯＲＦ１３１９ｅと称される。配列番号１のＨｉｓタグ付き誘導体は表皮ブドウ球菌に対する防御免疫応答を生成することが見出された。

Description

本発明は、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫応答を誘導するためのポリペプチドに関する。

本出願の全体において引用されている参考文献は、特許請求されている発明の先行技術であることを自認するものではない。

表皮ブドウ球菌は、特に院内感染および易感染患者において、病原体として現れている（Ｚｉｅｂｕｈｒら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ２８Ｓ：Ｓ１４−Ｓ２０，２００６）。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、主として表皮ブドウ球菌は、診断または治療方法において使用される外来物に関連して最も頻繁に分離される微生物感染菌である（ＨｅｉｌｍａｎｎおよびＰｅｔｅｒｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｉｎ：Ｇｒａｍ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．２０００ならびにＴｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣｒｏｓｓｌｅｙおよびＡｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７）。

核酸配列情報を得、オープンリーディングフレームおよび潜在的ポリペプチドに関する予測を行うために、表皮ブドウ球菌からの核酸が配列決定されている（Ｄｏｕｃｅｔｔｅ−Ｓｔａｍｍら，米国特許第６，３８０，３７０号およびＤｏｕｃｅｔｔｅ−Ｓｔａｍｍら，米国特許第７，０６０，４５８号）。

潜在的抗原をコードする遺伝子を特定するために、提示技術のような技術および感染患者からの血清が使用されうる（Ｍｅｉｎｋｅら，ＷＯ ０２／０５９１４８，Ｍｅｉｎｋｅら，ＷＯ ０４／０８７７４６）。

米国特許第６，３８０，３７０号 米国特許第７，０６０，４５８号 ＷＯ ０２／０５９１４８ ＷＯ ０４／０８７７４６

Ｚｉｅｂｕｈｒら著，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ２８Ｓ：Ｓ１４−Ｓ２０，２００６ ＨｅｉｌｍａｎｎおよびＰｅｔｅｒｓ著，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｉｎ：Ｇｒａｍ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら著，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．２０００ ＣｒｏｓｓｌｅｙおよびＡｒｃｈｅｒ著，Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．１９９７

発明の概括
本発明は、配列番号１に構造的に関連しているアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの使用を特徴とする。配列番号１は完全長表皮ブドウ球菌ポリペプチドのトランケート化誘導体である。天然に存在する該完全長ポリペプチドは本明細書において完全長ＯＲＦ１３１９ｅと称される。配列番号１のＨｉｓタグ付き誘導体は表皮ブドウ球菌に対する防御免疫応答を生成することが判明した。

「防御」免疫または免疫応答に対する言及は表皮ブドウ球菌感染に対する防御の検出可能なレベルを示す。「免疫原」に対する言及は、防御免疫を提供する能力を示す。

したがって、本発明の第１の態様は、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原を記載し、ここで、該ポリペプチドは配列番号３または４のアミノ酸配列を有さない。１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１−９３により提供されるアミノ末端を含有しない。

配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むことに対する言及は、配列番号１に関連した領域が存在し追加的ポリペプチド領域が存在しうることを示す。１つの実施形態においては、追加的領域が存在する場合、該ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１−９３により提供されるアミノ末端を有さない。

参照配列に対するパーセントの同一性（同一％とも称される）は、ポリペプチド配列を該参照配列に対して整列（アライン）させ、対応領域内の同一アミノ酸の数を決定することにより決定される。この数を該参照配列（例えば、配列番号１）内のアミノ酸の総数で割り算し、ついで１００を掛け算し、最も近い整数に丸める。

本発明のもう１つの態様は、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫をもたらすアミノ酸配列と、カルボキシル末端またはアミノ末端において該配列に共有結合した１以上の追加的領域または部分とを含む免疫原を記載する。ここで、各領域または部分は、独立して、以下の特性、すなわち、免疫応答の増強、精製の促進またはポリペプチド安定性の促進の少なくとも１つを有する領域または部分から選ばれる。

「追加的領域または部分」に対する言及は、ＯＲＦ１３１９ｅ領域とは異なる領域または部分を示す。該追加的領域または部分は例えば追加的ポリペプチド領域または非ペプチド領域でありうる。

本発明のもう１つの態様は、患者において表皮ブドウ球菌に対する防御免疫を誘導しうる組成物を記載する。該組成物は、医薬上許容される担体と、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫をもたらす免疫学的に有効な量の免疫原とを含む。

免疫学的に有効な量は、表皮ブドウ球菌感染に対する防御免疫をもたらすのに十分な量である。該量は、表皮ブドウ球菌感染の可能性または重症度を有意に抑制するのに十分なものであるべきである。

本発明のもう１つの態様は、表皮ブドウ球菌感染に対する防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む核酸を記載する。組換え遺伝子は、適切な転写およびプロセシングのための調節要素（これは翻訳および翻訳後要素を含みうる）と共にポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する。該組換え遺伝子は宿主ゲノムから独立して存在することが可能であり、あるいは宿主ゲノムの一部でありうる。

組換え核酸は、その配列および／または形態の点では天然では見出されない核酸である。組換え核酸の具体例には、精製された核酸、天然で見出されるものとは異なる核酸を与える一緒になった２以上の核酸領域、互いに天然で付随している１以上の核酸領域（例えば、上流または下流領域）の非存在が含まれる。

本発明のもう１つの態様は組換え細胞を記載する。該細胞は、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。好ましくは、該細胞をインビトロで増殖させる。

本発明のもう１つの態様は、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫をもたらすポリペプチドの製造方法を記載する。該方法は、該ポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を増殖させ、該ポリペプチドを精製することを含む。

本発明のもう１つの態様は、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫をもたらすポリペプチドであって、宿主において該ポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を増殖させ、該ポリペプチドを精製する段階を含む方法により製造されたポリペプチドを記載する。種々の宿主細胞を使用することが可能である。

本発明のもう１つの態様は、患者における表皮ブドウ球菌に対する防御免疫応答の誘導方法を記載する。該方法は、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫をもたらす免疫学的に有効な量の免疫原を該患者に投与する段階を含む。

個々の用語が互いに矛盾しない限り、「または（もしくは）（あるいは）」は一方または両方の可能性を示す。場合によっては、一方または両方の可能性を強調するために「および／または」のような表現が用いられる。

「含む（含んでなる）」のような非限定的用語に対する言及は追加的な要素または段階を許容する。場合によっては、「１以上」のような表現は、追加的な要素または段階の可能性を強調するために非限定的用語と共に又はそれを伴わずに用いられる。

明示的に示されていない限り、単数表現は単数を示すと限定されるものではない。例えば、「細胞」は複数の細胞を除外するものではない。場合によっては、可能な複数の存在を強調するために、１以上のような表現が用いられる。

本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例（具体例）を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載されている実施例（具体例）は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。該実施例（具体例）は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。

発明の詳細な説明
配列番号１関連ポリペプチドが防御免疫をもたらしうることは、配列番号２を使用する後記実施例において例示されている。配列番号２は配列番号１のＨｉｓタグ誘導体である。Ｈｉｓタグはポリペプチドの精製および特定を促進する。図１は配列番号２を示し、ここで、配列番号１の領域が太字で示されている。

配列番号１は完全長ＯＲＦ１３１９ｅ表皮ブドウ球菌ポリペプチドの誘導体である。配列番号１はＯＲＦ１３１９ｅのアミノ酸９４−５５７（配列番号３）を含有する。アミノ酸１−９３はシグナル配列を含有すると予想された。配列番号３の完全長配列は５５７アミノ酸である。図２Ａおよび２Ｂは配列番号３およびコードする核酸配列を示し、ここで、配列番号１の領域が太字で示されている。

ＯＲＦ１３１９ｅの配列
ＯＲＦ１３１９ｅ関連配列の具体例はＧｅｎ−Ｂａｎｋアクセッション番号Ｑ８ＣＰＱ５およびＱ５ＨＱＣ５において提供される。Ｇｅｎ−Ｂａｎｋアクセッション番号Ｑ５ＨＱＣ５は配列番号３に対応する。Ｇｅｎ−Ｂａｎｋアクセッション番号Ｑ５ＨＱＣ５はＧｉｌｌら，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７（７）：２４２６−２４３８，２００５を参照している。Ｇｅｎ−Ｂａｎｋアクセッション番号Ｑ８ＣＰＱ５（配列番号４）は、アミノ酸４２におけるバリンの代わりにアラニンを有する点で、配列番号３とは異なる。Ｇｅｎ−Ｂａｎｋアクセッション番号Ｑ８ＣＰＱ５はＺｈａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９（６）：１５７７−１５９３，２００３を参照している。

公知ＯＲＦ１３１９ｅ配列と比較した場合の高い度合の配列類似性または連続的なアミノ酸の存在に基づき、他の天然に存在するＯＲＦ１３１９ｅ配列を特定することが可能である。連続的なアミノ酸は特徴的なタグを与える。種々の実施形態において、天然に存在するＯＲＦ１３１９ｅ配列は、配列番号１の場合と同様に少なくとも２０個、少なくとも３０個または少なくとも５０個の連続的なアミノ酸を有する、および／または配列番号１に対して少なくとも８５％の配列類似性もしくは同一性を有する、ブドウ球菌属種、好ましくは表皮ブドウ球菌において見出される配列である。

配列類似性は、当技術分野で公知の種々のアルゴリズムおよび技術により決定されうる。一般に、配列類似性は、配列の１つにおいてギャップ、付加および置換を許容しつつ最大のアミノ酸同一性を得るために２つの配列を整列（アライン）させる技術により決定される。

配列類似性は、例えば、ラライン（ｌａｌｉｇｎ）なるプログラム（≪ｓｉｍ≫プログラム用にＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒにより開発されたもの，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７−３５７，１９９１）を利用する局所アライメント手段を用いて決定されうる。オプションおよび環境変数は、ギャップ内の第１残基に関する−ｆ＃ペナルティ（デフォルトで−１４）、ギャップ内の各追加的残基に関する−ｇ＃ペナルティ（デフォルトで−４） −ｓ ｓｔｒ（ＳＭＡＴＲＩＸ）択一的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）スコアリングマトリックスファイルのファイル名である。タンパク質配列の場合には、配列アライメントのためのデフォルト−ｗ＃（ＬＩＮＬＥＮ）出力ライン長（６０）により、ＰＡＭ２５０が使用される。

配列番号１関連ポリペプチド
配列番号１に構造的に関連したポリペプチドには、種々の表皮ブドウ球菌株において存在する対応領域および天然に存在する領域の誘導体を含有するポリペプチドが含まれる。配列番号１関連ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有する。「ポリペプチド」に対する言及は最小または最大のサイズ限界を示すものではない。

配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドは、配列番号１からの約７０個までのアミノ酸改変を含有する。各アミノ酸改変は、独立して、アミノ酸の置換、欠失または付加である。該改変は配列番号１領域内に存在することが可能であり、あるいは配列番号１の領域に付加されることが可能である。種々の実施形態において、配列番号１関連ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９４％または少なくとも９９％同一である；０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸改変だけ配列番号１と異なる；あるいは配列番号１で実質的に構成される。

示されているアミノ酸で「実質的に構成される」に対する言及は、言及されているアミノ酸が存在し、追加的なアミノ酸が存在しうることを示す。追加的なアミノ酸はカルボキシルまたはアミノ末端に位置しうる。種々の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の追加的なアミノ酸が存在する。好ましい追加的なアミノ酸はアミノ末端メチオニンである。

表皮ブドウ球菌に対する防御免疫を誘導しうる誘導体を得るために、配列番号１に改変を施すことが可能である。改変は、例えば、表皮ブドウ球菌に対する防御免疫を誘導する能力を保有する誘導体を得るために、あるいは防御免疫をもたらすことに加えて、特定の目的を達成しうる領域をも有する誘導体を得るために、行うことが可能である。

種々のＯＲＦ１３１９ｅ配列およびアミノ酸の公知特性を考慮して、改変を施すことが可能である。一般に、活性を保有するよう種々のアミノ酸を置換する場合には、類似した特性を有するアミノ酸を置換することが好ましい。アミノ酸の置換の場合に考慮されうる要因には、アミノ酸のサイズ、電荷、極性および疎水性が含まれる。アミノ酸の特性に対する種々のアミノ酸Ｒ基の効果が当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２，Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｃを参照されたい）。

活性を維持するようアミノ酸を置換する際には、置換アミノ酸は、１以上の類似特性（例えば、ほぼ同じ電荷および／またはサイズおよび／または極性および／または疎水性）を有するべきである。例えば、ロイシンからバリンへの、リシンからアルギニンへの、およびグルタミンからアスパラギンへの置換は、ポリペプチドの機能の変化を引き起こさない優れた候補である。

特定の目的を達成するための改変には、該ポリペプチドの産生もしくは効力またはコード化核酸のクローニングを促進するよう意図されたものが含まれる。ポリペプチドの産生は、組換え発現に適した開始コドン（例えば、メチオニンをコードするもの）の使用により促進されうる。該メチオニンは後に細胞プロセシング中に除去されうる。クローニングは、例えば、アミノ酸の付加または変化を伴いうる制限部位の導入により促進されうる。

免疫応答を誘導するポリペプチドの効力はエピトープ増強により増強されうる。エピトープ増強は、ＭＨＣ分子に対するペプチドアフィニティを改善するためのアンカー残基の改変を含む技術およびＴ細胞受容体に対するペプチド−ＭＨＣ複合体のアフィニティを増加させる技術のような種々の技術を用いて行われうる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ １：２０９−２１９，２００１）。

好ましくは、該ポリペプチドは、精製されたポリペプチドである。「精製されたポリペプチド」は、それが天然で付随している１以上の他のポリペプチドを欠く環境中に存在し、および／または存在する全タンパク質の少なくとも約１０％に相当する。種々の実施形態において、精製されたポリペプチドは、サンプルまたは調製物中の全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％に相当する。

１つの実施形態においては、該ポリペプチドは「実質的に精製」されている。実質的に精製されたポリペプチドは、該ポリペプチドが天然で付随している全て又はほとんどの他のポリペプチドを欠く環境中に存在する。例えば、実質的に精製された表皮ブドウ球菌ポリペプチドは、すべて又はほとんどの他の表皮ブドウ球菌ポリペプチドを欠く環境中に存在する。環境は例えばサンプルまたは調製物でありうる。

「精製（された）」または「実質的に精製（された）」に対する言及は、ポリペプチドがいずれかの精製を受けることを要求するものではなく、例えば、精製されていない化学合成ポリペプチドを包含しうる。

ポリペプチドの安定性は、ポリペプチドのカルボキシルまたはアミノ末端を修飾することにより増強されうる。可能な修飾の具体例には、アミノ末端保護基、例えばアセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル；およびカルボキシル末端保護基、例えばアミド、メチルアミドおよびエチルアミドが含まれる。

本発明の１つの実施形態においては、ポリペプチド免疫原は、カルボキシル末端またはアミノ末端において該ポリペプチドに共有結合した１以上の追加的領域または部分を含有する免疫原の一部であり、ここで、各領域または部分は、独立して、以下の特性、すなわち、免疫応答の増強、精製の促進またはポリペプチド安定性の促進の少なくとも１つを有する領域または部分から選ばれる。ポリペプチドの安定性は、例えば、アミノまたはカルボキシル末端に存在しうるポリエチレングリコールのような基を使用して増強されうる。

ポリペプチドの精製は、精製を促進させるための基をカルボキシルまたはアミノ末端に付加することにより促進されうる。精製を促進させるために使用しうる基の具体例には、アフィニティータグを付与するポリペプチドが含まれる。アフィニティータグの具体例には、６ヒスチジンタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオンおよびマルトース結合タンパク質が含まれる。

免疫応答をポリペプチドが引き起こす能力は、免疫応答を一般に増強する基を使用することにより増強されうる。ポリペプチドに対する免疫応答を増強するためにポリペプチドに連結されうる基の具体例には、例えばＩＬ−２のようなサイトカインが含まれる（Ｂｕｃｈａｎら，２０００．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３７：５４５−５５２）。

ポリペプチドの製造
ポリペプチドは、化学合成を伴う技術および該ポリペプチドを産生する細胞からの精製を伴う技術を含む標準的な技術を用いて製造されうる。ポリペプチドの化学合成のための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｃｋｅｒ，１９９０を参照されたい）。組換えポリペプチドの製造および精製のための技術も当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２を参照されたい）。

細胞からのポリペプチドの入手は、該ポリペプチドを製造するための組換え核酸技術を用いることにより促進される。ポリペプチドを製造するための組換え核酸技術は、該ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を細胞内に導入し又は細胞内で産生させ、該ポリペプチドを発現させることを含む。

組換え遺伝子は、ポリペプチドの発現のための調節要素と共に、ポリペプチドをコードする核酸を含有する。組換え遺伝子は細胞ゲノム内に存在することが可能であり、あるいは発現ベクターの一部でありうる。

組換え遺伝子の一部として存在しうる調節要素には、該ポリペプチドをコードする配列に天然で付随している調節要素、および該ポリペプチドをコードする配列に天然では付随していない外因性調節要素が含まれる。組換え遺伝子を特定の宿主内で発現させるためには又は発現レベルを増加させるためには、外因性プロモーターのような外因性調節要素が有用でありうる。一般に、組換え遺伝子内に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。

細胞内での組換え遺伝子の発現は発現ベクターの使用により促進される。好ましくは、組換え遺伝子に加えて発現ベクターも、宿主細胞内での自律複製のための複製起点、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、および高いコピー数の潜在性を含有する。発現ベクターの具体例としては、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドおよびウイルスが挙げられる。

遺伝暗号の縮重のため、特定のポリペプチドをコードするために多数の異なるコード化核酸配列が用いられうる。ほとんど全てのアミノ酸は、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされているため、遺伝暗号の縮重が生じる。アミノ酸は、以下のとおりに、コドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ

配列番号１関連ポリペプチドの組換え核酸発現のための適当な細胞は原核生物および真核生物である。原核生物細胞の具体例には、大腸菌；ブドウ球菌属のメンバー、例えば表皮ブドウ球菌；ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、例えばラクトバシラス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）；ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、例えばバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のメンバー、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；およびシュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のメンバー、例えばシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が含まれる。真核生物細胞の具体例には、哺乳類細胞；昆虫細胞；酵母細胞、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメンバー（例えば、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｓ））、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のメンバー（例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）またはクルイベロミセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ））およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））が含まれる。

組換え遺伝子の産生、細胞内への導入および組換え遺伝子発現のための技術は当技術分野でよく知られている。そのような技術の具体例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９のような参考文献に記載されている。

所望により、特定の宿主内での発現はコドン最適化により増強されうる。コドン最適化は、より好ましいコドンの使用を含む。種々の宿主におけるコドン最適化のための技術が当技術分野でよく知られている。

配列番号１関連ポリペプチドは、翻訳後修飾、例えばＮ−結合グリコシル化、Ｏ−結合グリコシル化またはアセチル化を含有しうる。「ポリペプチド」、またはポリペプチドの「アミノ酸」配列に対する言及は、宿主細胞（例えば、酵母宿主）からの翻訳後修飾の構造を有する１以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを含む。

翻訳後修飾は化学的に、または適当な宿主を使用することにより得られうる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、末端前アミノ酸の性質が、Ｎ末端メチオニンが除去されるかどうかを決定するらしい。さらに、末端前アミノ酸の性質は、Ｎ末端アミノ酸がＮ^α−アセチル化されるかどうかをも決定する（Ｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：８２４２−８２４６，１９８７）。もう1つの例には、分泌リーダー（例えば、シグナルペプチド）の存在により分泌のために標的化されるポリペプチドが含まれ、この場合、該タンパク質はＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化により修飾される（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９１５−９４４，１９８７）。

アジュバント
アジュバントは、免疫応答の生成において免疫原を補助しうる物質である。アジュバントは、以下のうちの１以上のような種々のメカニズムにより機能しうる：抗原の生物学的または免疫学的半減期の延長、抗原提示細胞への抗原の運搬の改善、抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび提示の改善、ならびに免疫調節性サイトカインの産生の誘導（Ｖｏｇｅｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３０（ｓｕｐｐｌ．３）：Ｓ２６６−２７０，２０００）。１つの実施形態においては、アジュバントが使用される。

免疫応答の生成を補助するために、多種多様なタイプのアジュバントが使用されうる。個々のアジュバントの具体例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムもしくはアルミニウムの他の塩、リン酸カルシウム、ＤＮＡ ＣｐＧモチーフ、モノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素、ムラミルジペプチド、フロインド不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激性複合体、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニン、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＳＣＯＭＳが含まれる（Ｖｏｇｅｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３０（ｓｕｐｐｌ ３）：Ｓ２６６−２７０，２０００，Ｋｌｅｉｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８９：３１１−３２１，２０００；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１１８０−１１８７，２００１，Ｋｅｒｓｔｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：９１５−９２０，２００３，Ｏ’Ｈａｇｅｎ Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１：２７３−２８６，２００１）。

防御免疫を誘導するための患者
「患者」は、表皮ブドウ球菌に感染しうる哺乳動物を意味する。患者は予防的または治療的に治療されうる。予防的治療は、表皮ブドウ球菌感染の可能性または重症度を軽減するのに十分な防御免疫をもたらす。治療的処置、表皮ブドウ球菌感染の重症度を軽減するために行われうる。

予防的治療は、本明細書に記載の免疫原を含有するワクチンを使用して行われうる。そのような治療は、好ましくは、ヒトに対して行われる。ワクチンは、一般集団、または表皮ブドウ球菌感染のリスクの高い者に投与されうる。

表皮ブドウ球菌感染のリスクの高い者には、医療従事者、入院患者、機能低下した免疫系を有する患者、手術を受けた患者、カテーテルまたは血管装置のような外来インプラントを受けた患者、免疫の機能低下を招く療法を受けている患者、外来物が関わる診断方法を受けている患者、および火傷または創傷のリスクの高い職業の者が含まれる。

診断または治療方法において使用される外来物には、留置カテーテルまたは移植高分子装置が含まれる。外来物に関連した表皮ブドウ球菌感染の具体例には、レンサ球菌血症／心内膜炎（例えば、静脈内カテーテル、代用血管、ペースメーカーリード、除細動器系、人工心臓弁および左室補助装置）、腹膜炎（例えば、脳室−腹膜脳脊髄液（ＣＳＦ）シャントおよび連続携行式腹膜透析カテーテル系）、脳室炎（例えば、内部および外部ＣＳＦシャント）および慢性高分子関連症候群（例えば、人工関節（股関節）弛緩、シリコーンプロテーゼでの豊胸術後の線維性被膜拘縮症候群、および白内障手術後の人工眼内レンズの移植の後の遅発性眼内炎）が含まれる（ＨｅｉｌｍａｎｎおよびＰｅｔｅｒｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｉｎ：Ｇｒａｍ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．２０００）。

表皮ブドウ球菌に感染しうる非ヒト患者には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコおよびマウスが含まれる。非ヒト患者の治療は、ペットおよび家畜を防御するのに、および特定の治療の効力を評価するのに有用である。

１つの実施形態においては、患者は、外来物が関わる治療的または医学的方法と組合せて予防的に治療される。追加的な実施形態においては、患者は、該操作の前の約１ヶ月、約２ヶ月または約２〜６ヶ月の時点で免疫化される。

混合（組合せ）ワクチン
配列番号１関連ポリペプチドは、単独で又は他の免疫原と組合せて、免疫応答を誘導するために使用されうる。存在しうる追加的な免疫原には、１以上の追加的な表皮ブドウ球菌免疫原、１以上の他のブドウ球菌生物、例えばスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、スタヒロコッカス・ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ）もしくはスタヒロコッカス・ラグネンシス（Ｓ．ｌｕｇｕｎｅｎｓｉｓ）を標的化する１以上の免疫原、および／または他の感染生物を標的化する１以上の免疫原が含まれる。

１以上の追加的な免疫原の具体例には、ＯＲＦ０６５７ｎ関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ＷＯ ０５／００９３７９）；ＯＲＦ０６５７／ＯＲＦ０１９０ハイブリッドポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ＷＯ ０５／００９３７８）；ｓａｉ−１関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ＷＯ ０５／７９３１５）；ＯＲＦ０５９４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ＷＯ ０５／０８６６６３）；ＯＲＦ０８２６関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ＷＯ ０５／１１５１１３）；ＰＢＰ４関連ポリペプチド（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ＷＯ ０６／０３３９１８）；ＡｈｐＣ関連ポリペプチドおよびＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物（Ｋｅｌｌｙら，ＷＯ ０６／０７８６８０）；スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型および８型莢膜多糖（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：４９１−４９６，２００２）；コラーゲンアドヘシン、フィブリノーゲン結合タンパク質および凝集因子（Ｍａｍｏら，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０：４７−５４，１９９４，Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６４０−２６４９，１９９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４：１５７２−１５８０，２００１）および多糖細胞間アドヘシンならびにそれらの断片（Ｊｏｙｃｅら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８：９０３−９２２，２００３）が含まれる。

投与
免疫原は、当技術分野でよく知られた技術と共に本明細書に記載の指針を用いて、製剤化され、患者に投与されうる。医薬投与全般に関する指針は、例えばＶａｃｃｉｎｅｓ，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。

医薬上許容される担体は免疫原の保存および患者への免疫原の投与を促進する。医薬上許容される担体は、バッファー、注射用無菌水、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートのような種々の成分を含有しうる。

免疫原は皮下、筋肉内または粘膜のような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば針または噴射式注射器を使用して行われうる。

適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の化合物を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。該免疫原は複数回投与ワクチン形態で使用されうる。用量は全ポリペプチド１．０μｇ〜１．０ｍｇの範囲からなると予想される。本発明の種々の実施形態においては、該範囲は５．０μｇ〜５００μｇ、０．０１ｍｇ〜１．０ｍｇおよび０．１ｍｇ〜１．０ｍｇである。

投与の時機は、当技術分野でよく知られた要因に左右される。初回投与後、１以上の追加用量を投与して抗体力価を維持または増強することが可能である。投与計画の一例は、第１日、第１ヶ月、第３投与としての第４、６または１２ヶ月の投与、および必要に応じて行う、間隔をあけて投与する追加的な追加投与であろう。

抗体の産生
配列番号１関連ポリペプチドは、該ポリペプチドに又は表皮ブドウ球菌に結合する抗体および抗体フラグメントを産生させるために使用されうる。そのような抗体および抗体フラグメントは、ポリペプチドの精製、表皮ブドウ球菌の特定または表皮ブドウ球菌感染に対する治療的もしくは予防的治療における用途を含む種々の用途を有する。

抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。ヒト抗体を含む抗体の産生および使用のための技術は当技術分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８，Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５，Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：４２５−４４５，２００２，Ｂｅｒｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２４（１）：１４−４０，２００２）。

適切なグリコシル化は抗体機能のために重要でありうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。天然に存在する抗体は、重鎖に結合した少なくとも１つのＮ結合炭水化物を含有する（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２）。他のＮ結合炭水化物およびＯ結合炭水化物が存在することが可能であり、抗体機能のために重要でありうる（前掲）。

効率的な翻訳後修飾を得るために、哺乳類宿主細胞および非哺乳類細胞を含む種々のタイプの宿主細胞が使用されうる。哺乳類宿主細胞の具体例には、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｏ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２および骨髄腫細胞が含まれうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８，１９９７）。非哺乳類細胞は、ヒトグリコシル化を模倣するために修飾されうる（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）はそのような修飾非哺乳類細胞の一例である（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５，２００６）。

核酸ワクチン
配列番号１関連ポリペプチドをコードする核酸は、治療投与に適したベクターを使用して患者に導入されうる。適当なベクターは、許容されない副作用を引き起こすことなく標的細胞内に核酸を運搬しうる。使用されうるベクターの具体例には、プラスミドベクター、およびウイルスに基づくベクターが含まれる（Ｂａｒｏｕｃｈ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０５：２８３−２８９，２００６，Ｅｍｉｎｉら，ＷＯ ０３／０３１５８８）。

細胞発現は、所望のポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットを使用して達成される。該遺伝子発現カセットは、有益な効果を達成するための十分な量の核酸を標的細胞内で産生させプロセシングするための調節要素を含有する。

ウイルスベクターの具体例には、第１および第２世代アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターおよびプラスミドベクターが含まれる（Ｈｉｔｔら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３７−２０６，１９９７，Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，米国特許第６，１５６，５８８号，Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，ＷＯ ９５／３２７３３，Ｂａｒｏｕｃｈ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０５：２８３−２８９，２００６，Ｅｍｉｎｉら，ＷＯ ０３／０３１５８８）。

アデノベクターは、種々のアデノウイルス血清型、例えばヒトまたは動物において見出されるアデノウイルス血清型に基づくものでありうる。動物アデノウイルスの具体例には、ウシ、ブタ、チンパンジー、マウス、イヌおよびトリ（ＣＥＬＯ）が含まれる（Ｅｍｉｎｉら，ＷＯ ０３／０３１５８８，Ｃｏｌｌｏｃａら，ＷＯ ０５／０７１０９３）。ヒトアデノウイルスには、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ群血清型、例えば２型（「Ａｄ２」）、４型（「Ａｄ４」）、５型（「Ａｄ５」）、６型（「Ａｄ６」）、２４型（「Ａｄ２４」）、２６型（「Ａｄ２６」）、３４型（「Ａｄ３４」）および３５型（「Ａｄ３５」）が含まれる。

核酸ワクチンは、種々の技術および投与計画を用いて投与されうる（Ｅｍｉｎｉら，ＷＯ ０３／０３１５８８）。例えば、該ワクチンは、１以上の電気パルスの存在下または非存在下、注射により筋肉内に投与されうる。電気媒介導入は、体液性および細胞性の両方の免疫応答を刺激することにより、遺伝的免疫化を補助しうる。投与計画はプライム・ブーストおよび異種プライム・ブーストアプローチを含む（Ｅｍｉｎｉら，ＷＯ ０３／０３１５８８）。

図１は配列番号２のアミノ酸配列を示す。配列番号２は配列番号１のＨｉｓタグ付き誘導体である。配列番号１の領域が太字で示されている。 図２Ａは配列番号３の完全長ＯＲＦ１３１９ｅ（図２Ａ）およびコードする核酸（図２Ｂ、配列番号５）を示す。図２Ａにおいて、配列番号１の領域が太字で示されている。 図２Ｂは配列番号３の完全長ＯＲＦ１３１９ｅ（図２Ａ）およびコードする核酸（図２Ｂ、配列番号５）を示す。図２Ｂにおいて、配列番号１をコードする領域が太字で示されている。 図３は配列番号４のアミノ酸配列を示す。

実施例
本発明の種々の特徴を更に詳しく例示する実施例を以下に記載する。該実施例は本発明の実施のための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。

防御免疫原の産生、精製および製剤化
以下に記載する実施例においては、配列番号１関連ポリペプチドが防御免疫をもたらしうることを例示するために配列番号２を使用した。配列番号２は配列番号１のＨｉｓタグ付き誘導体である。

ＯＲＦ１３１９ｅのクローニングおよび発現および修飾
ＯＲＦ１３１９ｅ ＤＮＡ配列を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを使用して翻訳し、得られた５５７アミノ酸の配列を分析した。ａａ９４で始まり末端Ｌ残基において終止コドンの前で終わる遺伝子を増幅するために、ＰＣＲプライマーを設計した。これらのＰＣＲプライマーは、精製を助けるために、フォワードプライマー上に位置する追加的なＨＩＳタグをも有していた。

該ベクターによりコードされる終止コドンおよびインサートを介してコードされるアミノ末端Ｈｉｓ残基を含有するｐＥＴＢｌｕｅ−１ベクターから発現されるよう、該タンパク質を設計した。また、メチオニン開始因子の後に該タンパク質にグリシン残基を付加した。得られた増幅された（１４１９ｂｐ）核酸は配列番号２の４７３（開始コドンを含む）アミノ酸の配列をコードしていた。

ＰＣＲ増幅された配列を、ＴＡクローニングを用いて直接的にｐＥＴＢｌｕｅ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に連結した。該ベクターを熱ショックにより大腸菌Ｎｏｖａｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に導入した。コロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬ アンピシリンを含有するＬＢ内で増殖させ、ＤＮＡミニプレップを作製し（Ｑｉａｇｅｎ）、制限消化およびＰＣＲにより挿入完全性を判定した。正しい挿入サイズを有するミニプレップを配列決定した。所望の配列からのＤＮＡの変化を含有しないクローンを選択した。

大腸菌Ｔｕｎｅｒ（商標）（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上で増殖させ、発現試験のために３個のコロニーを選択した。液体ＬＢ（アンピシリン）培養を、Ａ_６００が０．６〜１．０となるまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートし、ついで０．４ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加により誘導し、ついで更に３時間インキュベートした。培養（１．５ｍｌ）を１４０００ｒｐｍ、４℃で、１分間の遠心分離により回収した。細胞を３００μｌの溶解バッファー（Ｂｕｇ Ｂｕｓｔｅｒ；Ｎｏｖａｇｅｎ プロテアーゼインヒビター含有）に再懸濁させ、１５秒間で３回、音波処理した。等容量のローディングバッファー（最終容量２％のβ−メルカプトエタノールで補足されたもの）を加えた後、該サンプルを９０℃で５分間加熱した。抽出物をＮｏｖｅｘ ４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上で泳動し、タンパク質に関してアッセイし（クーマシーブルー染色）、ニトロセルロース上にブロッティンングし、抗ＨＩＳ６抗体（Ｚｙｍｅｄｄ）でプローブした。

配列番号２の精製
凍結された組換え大腸菌細胞ペーストを解凍し、２容量の細胞溶解バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ イミダゾール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０、２５０単位／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＥＭ＃１．１０１６９７．０００２）およびプロテアーゼインヒビター混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、ＥＤＴＡ非含有，Ｒｏｃｈｅ＃１８７３５８０）（５０ｍｌ当たり錠剤１個））に再懸濁させた。ミクロフルイダイザーでライセートを調製した。該ライセートを１０，０００×ｇ、４℃で４５分間の遠心分離により清澄化した。上清を捨て、封入体を含有するペレットを洗浄バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ イミダゾールおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０）で５回洗浄した。洗浄された封入体を８Ｍ グアニジン−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、該溶液を１０，０００×ｇ、４℃で１時間の遠心分離により清澄化した。上清を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ２６／６０カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより流速１ｍｌ／分で分画した。ランニングバッファーは８Ｍ Ｇｄ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡであった。ピークＳＥＣ画分をプールし、８Ｍ 尿素中に透析した。該尿素可溶性産物を滅菌濾過し、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度のアルミニウムヒドロキシホスファートアジュバントに吸着させた。該ミョウバン結合産物を食塩水で十分に洗浄することにより（遠心分離および再懸濁の複数反復）、残留尿素を除去した。

ラット留置カテーテルモデル（複数の免疫化）
配列番号１関連ポリペプチドを使用する能動免疫化が移植装置のブドウ球菌感染を抑制しうるかどうかを評価するために、配列番号２およびラット留置カテーテルモデルを使用した。実施例１に記載されているとおりに、配列番号２を含有するワクチンを得た。

ラット（３〜４週齢）を購入し、第０、１４および２１日に、アルミニウムヒドロキシドホスファート（「ＡＨＰ」）（Ｋｌｅｉｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８９：３１１−３２１，２０００）上の免疫原でＩＰで免疫化し、あるいはアジュバントのみで模擬免疫した。第３５日に、頚静脈内に留置カテーテルを配置するために該動物を手術した。手術後約１０日間、該動物を休ませ、その時点で表皮ブドウ球菌ＲＰ６２Ａの亜致死的検証（ＩＶ）を行った（５〜７×１０^９ ＣＦＵ）。検証の２４時間後に該ラットを犠死させ、該カテーテルを摘出した。

該カテーテル全体をマンニトール塩寒天プレート上で培養することにより、該カテーテル上の細菌の存在を評価した。成長の何らかの兆候が該プレート上で観察された場合には、該カテーテルを培養陽性と評価した（表１）。模擬免疫化動物においては、該カテーテルの＞８０％がコロニー化されている。防御的とみなされる免疫原の場合、該カテーテルの＜５０％が該検証株によりコロニー化されている。

ラット留置カテーテルモデル（単一の免疫化）
ブドウ球菌ワクチン候補に対する能動免疫化が単回投与後に移植装置のブドウ球菌感染を予防しうるかどうかを評価するために、ラット留置カテーテルモデルを使用した。今回は、カニューレ挿入ラット（６週）をＡＨＰ上の単一用量（２０μｇ）の配列番号２（ＩＰまたはＩＭ）またはＡＨＰ上のＢＳＡの模擬ワクチン（２０μｇ，ＩＰ）で免疫化し、第１５日に表皮ブドウ球菌ＲＰ６２Ａ（７．０×１０^９ ＣＦＵ／ラット）でチャレンジした。配列番号２でワクチン接種された動物においては、カテーテルの１００％浄化が観察された（表２）。

抗体依存的応答
留置カテーテルからの細菌の排除が抗体依存的であり、先天免疫系の潜在的刺激の結果ではないことを確認するために、カニューレ挿入ラット（６週）を配列番号２−ＡＨＰもしくはＢＳＡ−ＡＨＰ（２０μｇ，ＩＰ）またはＡＨＰのみ（ＩＰ）で１回免疫化する実験を行った。該ラットの半数ずつを第５日または第１４日に犠死させた。第５日には、能動免疫系が抗体を産生するとは予想され得ず、一方、先天免疫系は潜在的に刺激されうるであろう。第１４日には、能動免疫系が刺激されることが可能であり、特異的抗体が産生されうるであろう。

配列番号２で免疫化された動物からのカテーテルはいずれも、第５日に陰性であり、一方、配列番号２で免疫化された動物からのカテーテルの半数は第１４日に陰性であった（表１３を参照されたい）。

他の実施形態も以下の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書中には幾つかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。

Claims (16)

1. 配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド免疫原であって、該ポリペプチドが表皮ブドウ球菌に対する防御免疫をもたらし、該ポリペプチドが、配列番号３または４により示されるアミノ酸配列を有さない、ポリペプチド免疫原。
2. 該ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のポリペプチド。
3. 該ポリペプチドが実質的に配列番号１からなる、請求項２記載のポリペプチド。
4. 該ポリペプチドが配列番号１またはメチオニン−配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項３記載のポリペプチド。
5. 該ポリペプチドが実質的に精製されている、請求項４記載のポリペプチド。
6. 配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列と、カルボキシル末端またはアミノ末端において該アミノ酸配列に共有結合した１以上の追加的領域または部分とを含んでなる免疫原であって、各領域または部分が、独立して、以下の特性、すなわち、免疫応答の増強、精製の促進またはポリペプチド安定性の促進の少なくとも１つを有する領域または部分から選ばれる、免疫原。
7. 請求項１から６のいずれか１項記載の免疫原の免疫学的に有効な量と医薬上許容される担体とを含んでなる、患者において防御免疫応答を誘導しうる組成物。
8. 該組成物がアジュバントを更に含む、請求項７記載の組成物。
9. 請求項１から４のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含んでなる核酸。
10. 該核酸が発現ベクターである、請求項９記載の核酸。
11. 請求項９記載の核酸を含んでなる組換え細胞。
12. 防御免疫をもたらす表皮ブドウ球菌ポリペプチドの製造方法であって、
    （ａ）請求項１１記載の組換え細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で増殖させ、
    （ｂ）該ポリペプチドを実質的に精製する段階を含んでなる、製造方法。
13. 患者における防御免疫応答の誘導方法であって、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫原の免疫学的に有効な量を該患者に投与する段階を含んでなる方法。
14. 該患者がヒトである、請求項１３記載の方法。
15. 表皮ブドウ球菌感染に対して該患者を予防的に治療する、請求項１３記載の方法。
16. 患者における防御免疫応答の誘導方法であって、請求項１２記載の製造方法により製造されたポリペプチドの免疫学的に有効な量を該患者に投与する段階を含んでなる方法。

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