JP2010506857A - 迅速に発光する安定なアクリジニウムエステル - Google Patents

Abstract

迅速に発光し、加水分解に安定な化学発光性アクリジニウムエステルが提供される。化学発光性アクリジニウムエステルは、被験体を検出又は定量するためのアッセイにおける有用な標識である。

Description

本発明は、一般的に、イムノアッセイ等における標識として有用な化学発光性アクリジニウムエステルに関する。化学発光性アクリジニウムエステルは、加水分解に安定であり、迅速に発光する。

化学発光性アクリジニウム化合物は、イムノアッセイ及び核酸アッセイにおいて広く使用されている極めて有用な標識である。最近のレビューであるPringle, M. J., Journal of Clinical Ligand Assay vol. 22, pp. 105-122 (1999)は、この種類の化学発光性化合物の過去と現在の進歩を要約している。

McCapra, F. et al., Tetrahedron Lett. vol. 43, pp. 3167-3172 (1964)及びRahut et al. J. Org. Chem vol. 301, pp. 3587-3592 (1965)による独創的な研究は、アクリジニウム塩のフェニルエステルからの化学発光がアルカリ性過酸化物により誘発され得ることを開示した。これらの初期の研究以来、化学発光性標識としてのそれらの有用性のゆえに、アクリジニウム化合物における関心が増大している。イムノアッセイにおけるアクリジニウムエステル、臭化９−カルボキシフェニル−Ｎ−メチルアクリジニウムの適用が、Simpson, J.S.A. et al., Nature vol. 279, pp. 646-647 (1979)により開示された。このアクリジニウムエステルは、アクリジニウム環とフェノールの間のエステル結合の加水分解のせいで、非常に不安定であり、これにより、エステル結合を加水分解から保護するための特別な防止策をとらない限り、その商業的な有用性が制限される。例えば、米国特許第４，９５０，６１３号においてArnold et al.は、不安定なアクリジニウムエステルの加水分解安定性は、添加剤でいくらか解決することができることを示している。

構造を変えることによりアクリジニウム化合物の加水分解安定性を増大させる種々のストラテジーが記述されている。Law et al., Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, vol. 4, pp. 88-89 (1989)は、フェノール基の両側に２個のメチル基を含有するフェノールが、加水分解にさらに抵抗性であるアクリジニウムエステルを与えることを報告した。アクリジニウムエステル、ＤＭＡＥ−ＮＨＳ［２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシラート］は、２個のメチル基を有さないアクリジニウムエステルと同じ光出力を有することが見出されたが、有意に、加水分解にさらに抵抗性であった。米国特許第４，９１８，１９２号及び第５，１１０，９３２号は、ＤＭＡＥ及びその応用を記述している。Law et al.への米国特許第５，６５６，４２６号には、アクリジニウム環窒素上のメチル基がスルホプロピル基で置き換えられた、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステルと名づけられたＤＭＡＥの親水性バージョンが開示されている。米国特許第６，６６４，０４３Ｂ２号でNatrajan et al.は、フェノールに結合した親水性修飾剤を有するＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体を開示した。

異なる種類の安定な化学発光性アクリジニウム化合物が、Kinkel et al., Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence vol. 4, pp. 136-139 (1989)及びMattingly, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence vol. 6, pp. 107-114 (1991)及び米国特許第５，４６８，６４６号で記述されている。この種類の化合物において、フェノール性エステル結合は、スルホンアミド部分に置き換えられており、これは、光出力を減少させることなく加水分解安定性を付与することが報告されている。ＤＭＡＥ−ＮＨＳの構造及びアクリジニウムスルホンアミドの一般化した構造を、アクリジニウムエステルについて一般的に使用されている番号付けシステムと共に、図１に示す。フェノール及びスルホンアミド部分は、一般に、脱離基とも称される。オキシム等の他の脱離基を含有する化学発光性アクリジニウム化合物もまた、開示されている。Renotte et al. Luminescence 2000, 15, 311-320参照。

アクリジニウム化合物は、水溶液中で、水のアクリジニウム環のＣ−９への付加により形成される付加体との平衡で存在する。この付加体は、一般に、擬似塩基と称される。図２に示される、アクリジニウム−擬似塩基の平衡は、水性媒体のｐＨにより、強く影響される。酸性溶液では、アクリジニウム型が優位であるが、塩基性溶液では、優位な型は、擬似塩基である。アクリジニウム−擬似塩基の平衡は、また、アクリジニウム化合物の構造により影響される。Ｃ−２及び／又はＣ−７に電子供与性基を含有するアクリジニウムエステルは、Ｃ−９の求電子性を減少させ、アクリジニウム型から擬似塩基への遷移が生じるｐＨを上昇させる。アクリジニウムスルホンアミドもまた、アクリジニウムエステルよりも、擬似塩基を形成しにくい。

アクリジニウム化合物からの化学発光は、通常、過酸化水素で誘発される。発光の機構は、過酸化水素のアクリジニウム環のＣ−９への付加と、それに続く脱離基の開裂と同時的な高エネルギーのジオキセタノン中間体の生成を含むと考えられる。ジオキセタノン中間体の急速な分解が、電子的に励起された状態のアクリドンの生成に導くと推測される。発光は、励起状態のアクリドンが基底状態に戻るときに生じる。ジオキセタノン中間体の生成は、最終的に実証されておらず、近年の理論的研究では、脱離基の開裂及び励起状態のアクリジンの生成が同時に起こると仮定している（Rak et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 3002-3008）。

実際のところ、過酸化水素を用いるアクリジニウム化合物及びそれらの複合体からの発光は、通常、水性酸で初期処理して、擬似塩基をアクリジニウム型に完全に変換し、続いて、水性塩基を加えることにより達成される。擬似塩基が過酸化水素と反応できないので、酸処理が必要である。使用すべき酸処理の長さ及び酸の強さは、アクリジニウム化合物の構造に依存する。塩基を添加すると、過酸化水素分子がイオン化して、ヒドロペルオキシドイオンが生成し、これは、次いで、アクリジニウム環のＣ−９に付加して、発光を開始する。便宜上、過酸化水素は、しばしば、水性酸と共に単一試薬として加えられる。典型的には、アクリジニウム化合物又はその複合体からの発光は、数秒間の間に亘って生じる。

アクリジニウム化合物又はその複合体からの発光の動力学又は速度は、いくつかの因子に依存する。過酸化水素の濃度及び塩基の濃度の双方は、発光の期間に影響を与え得る。界面活性剤の存在も、発光の速度及び量子収率に影響を与え得る。さらに、アクリジニウム化合物の構造は、発光の動力学に大きな影響をもたらす。アクリジニウム環上の、アクリジニウム窒素の、及び脱離基上の置換基は、全て発光の動力学に影響を与え得るが、脱離基の種々の構造的特徴の発光に対する効果が、最も広く報告されている。例えば、Adamczyk et al.（Tetrahedron 1999, 55, 10899-10914）は、種々のアクリジニウムスルホンアミドの研究から、発光の動力学は、これらの化合物により発光される全光量に影響を与えることなく、スルホンアミド脱離基の構造を変えることにより変化させることができることを示している。これらの研究者は、それらの研究から、立体的な因子が、スルホンアミド脱離基のｐＫａよりも、発光の速度を変化させる上でより影響が大きいことを結論付けた。アクリジニウムスルホンアミド窒素での立体的な混み具合の増大は、発光を遅くするが、一方、そのような立体障害を緩和すると、発光が促進される。

アクリジニウムフェニルエステルでの同様の研究が、Nelson et al.（Biochemistry 1996, 35, 8429-8438）により報告されている。それらの研究から、著者は、フェノール脱離基のｐＫａが、立体的効果よりも、発光の動力学に、より有意な効果を及ぼすと結論付けている。フェニル環上の電子吸引性基は、発光の速度を加速し、一方、電子供与性基は、速度の抑制をもたらす。Nelsonにより記述されたアクリジニウムエステルは、迅速な発光を示すものの、加水分解を極めて受けやすい。Nelsonが記述した「ハイブリダイゼーション保護アッセイ」は、実際のところ、核酸プローブに接合され、それらの標的にハイブリダイズされていないアクリジニウムエステルは、標識され、ハイブリダイズされたプローブよりも、非常に早く加水分解され得るという事実を活用している。

立体的効果は、また、アクリジニウムフェニルエステルの発光の動力学に重要な役割を果たす。例えば、米国特許第５，６５６，２０７号中でWoodhead et al.は、フェノール上の２'及び６'炭素原子にメチル基を含有するアクリジニウムエステルの発光の動力学は、光誘発試薬を注意深く選択することにより、これら２個の置換基を持たない類似のアクリジニウムエステルと区別することができることを報告している。

２'及び６'炭素にメチル基を含有するアクリジニウムエステルは、これらの置換基を持たないアクリジニウムエステルよりも、より遅く発光する。一方、メチル基の存在は、Law et al.,（Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, vol. 4, pp. 88-89 (1989)）が記したように、アクリジニウムエステルに非常により大きな加水分解安定性を付与する（彼らは、ＤＭＡＥ−ＮＨＳの加水分解安定性を、２’及び６’メチル基を持たない類似のアクリジニウムエステルと比較した）。加水分解安定性は、試薬の安定性に関連しているので、特に、自動化免疫化学機器におけるアクリジニウムエステルの商業的応用に重要である。アッセイ性能における日々の変動が少なく、多くの廃棄物を生じないので、長い保存寿命の試薬が、しばしば好ましい。

タンパク質又は小分子と接合した場合、米国特許第５，６５６，４２６号に記載のＮＳＰ−ＤＭＡＥ等の加水分解に安定なアクリジニウムエステルは、それらの化学発光がアルカリ性過酸化物で誘発されたときに、典型的には、５秒間に亘って発光する。

上記の見地から、加水分解安定性と迅速な発光の双方を示すアクリジニウムエステルがこの分野で必要とされている。したがって、本発明の目的は、加水分解に安定であり、例えば、ＮＳＰ−ＤＭＡＥに匹敵するものであるが、非常により迅速な発光、すなわち、約１〜２秒の発光をも示す、アクリジニウムエステルを提供することである。

本発明は、アクリジニウムエステルからの発光の速度が、驚くことに、それらの加水分解安定性を損なうことなく増大させることができるとの発見に基づいている。本発明のアクリジニウムエステルは、典型的には加水分解に不安定である上記の迅速に発光するアクリジニウムエステルと区別される新規な構造的特徴を有している。したがって、本発明のアクリジニウムエステルは、迅速な発光を示すものの加水分解に極めて感受性である非置換のアクリジニウムフェニルエステルに対して相当の利点を提供する。

本発明の一つの態様において、式Ｉ：

［式中、Ｑは、出現ごとに独立に、結合（すなわち、Ｑは存在しない）又はＯ−、−Ｓ−もしくは−Ｎ（Ｒ^＊）−から選択されるヘテロ原子もしくはヘテロ原子含有基から選択され；ここで、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；ただし、少なくとも１個のＱは、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−でなければならず；かつ、Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である］で示される構造を含む、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物が提供される。

本発明の他の態様において、式ＩＩ：

［式中、Ｒ及びＲ^＊は、独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；かつ、Ｒ_１は、上記のとおりである］で示される構造を含む、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステルが提供される。

本発明のさらに他の態様において、式ＩＩＩ：

［式中、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；かつ、Ｒ_１は、上記のとおりである］で示される構造を含む、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物が提供される。

本発明のさらなる態様において、式ＩＶ：

［式中、
Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；好ましくは、Ｒ_１は、メチル、スルホプロピル又はスルホブチル基であり；
Ｒ_２は、Ｃ１からＣ４のいずれかにおける官能基であり、そしてＲ_３は、Ｃ５からＣ８のいずれかにおける官能基であり、ここで、Ｒ_２及びＲ_３は、独立に、水素か、酸素、窒素、硫黄又はハロゲンから選択される２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
Ｘ及びＹは、出現ごとに独立に、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−から選択され；ここで、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；ただし、ＸもしくはＹのいずれか又は双方は、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−でなければならず；
Ｒ_４及びＲ_５は、独立に、水素か、酸素、窒素、硫黄又はハロゲンから選択される２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
Ｒ_６及びＲ_７は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル、アルキル−アリール、アルコキシ（−ＯＲ）、アルキルチオール（−ＳＲ）及びＮＲ_２基（ここで、窒素上のＲは、同一又は異なることができ、Ｒは、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である）から選択され；
Ｒ_８は、Ｒ_６及びＲ_７と互換性があり、及び基−Ｒ_９−Ｒ_１０であり；
Ｒ_９は、結合又は２０個までのヘテロ原子を含有する、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基を表し；
Ｒ_１０は、下記のもの：

から選択される求電子性又は求核性官能基であり；
ここで、Ｘ^＊は、ハロゲンであり；そしてＲ^＊は、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含有し；
Ａ⁻は、該アクリジニウム核の四級窒素と対を成すために導入される対イオンであり、かつＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハライド、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻及びＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される］で示される、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物が提供される。

本発明は、また、被験体の検出又は定量用のアッセイを提供する。本発明の他の態様において、被験体の検出又は定量用のアッセイは、下記の工程を含む：
（ａ）（ｉ）被験体に特異的な結合性分子；及び（ｉｉ）式Ｉ又は式ＩＩの構造を含む加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステルを含む、複合体を用意する工程；
（ｂ）該被験体に特異的な第二の結合性分子をその上に固定化して有する固体支持体を用意する工程；
（ｃ）複合体、固相及び被験体を含有すると推測される試料を混合して結合錯体を形成する工程；
（ｄ）固体支持体上に捕捉された結合錯体を分離する工程；
（ｅ）化学発光誘発性試薬を加えることにより、工程（ｄ）からの結合錯体の化学発光を誘発する工程；
（ｆ）発光量を照度計で測定する工程；ならびに
（ｇ）反応混合物からの発光量を、公知の被験体濃度に発光量を関連づける標準用量応答曲線と比較することにより、被験体の存在を検出するか、又はその濃度を算出する工程。

本発明の他の態様において、下記の工程を含む、被験体の検出又は定量用のアッセイが提供される：
（ａ）被験体の、式Ｉ又は式ＩＩの構造を含む加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステルとの複合体を用意する工程；
（ｂ）被験体に特異的な結合性分子で固定化した固体支持体を用意する工程；
（ｃ）複合体、固相及び被験体を含有すると推測される試料を混合して結合錯体を形成する工程；
（ｄ）固体支持体上に捕捉された結合錯体を分離する工程；
（ｅ）化学発光誘発性試薬を加えることにより、工程（ｄ）からの結合錯体の化学発光を誘発する工程；
（ｆ）発光量を照度計で測定する工程；ならびに
（ｇ）反応混合物からの発光量を、公知の被験体濃度に発光量を関連づける標準用量応答曲線と比較することにより、被験体の存在を検出するか、又はその濃度を算出する工程。

本発明のこれらの態様及び他の態様は、例示的な実施態様、実施例、及び図面を含む、本発明の下記の詳細な説明を読んだ後、当業者に明白なものとなろう。

アクリジニウムエステルについて一般的に使用されている番号付けシステムと共に、アクリジニウムエステルＤＭＡＥ−ＮＨＳ及びＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳの構造を示す。 アクリジニウム化合物のアクリジニウム型と擬似塩基型との間の平衡を示す。

詳細な説明
本明細書で使用されている全ての用語は、明示的に定義されていない限り、それらの通常の意味を有する。

式Ｉ又は式ＩＩの「構造を含む化学発光性アクリジニウム化合物」とは、化学発光性アクリジニウム化合物が、その構造の一部又は全てとして、式Ｉ又はＩＩの構造を含み、したがって、特定の構造が、場合により、１以上の追加の置換基を、環窒素を包含するアクリジニウム核及びフェニル環の任意の可能な位置に含有する化合物、ならびにそれらの塩を包含することを意味する。置換基は、例えば、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、典型的には１〜５０個の炭素原子及び、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含む。例示的な置換基として、非限定的に、分岐状もしくは直鎖状のＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（非限定的に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ネオ−ペンチル、tert−ペンチル、ヘキシル、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルが挙げられる）；シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ハロアルキル、ベンジル、アルキル−アリール；置換もしくは非置換のアリール又はヘテロアリール基；アシル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシ、カルバミド、シアノ、オキソ、オキサ、ハロゲンなど及びこれらの組み合わせが挙げられ、場合により、１個以上のヘテロ原子（酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせが挙げられる）でのさらなる置換を包含する。

「迅速に発光する」とは、本明細書で特定された条件下に、遊離状態でのアクリジニウムエステルの場合には（すなわち、他の分子と複合化していない）、化学発光反応からの光の全収率の少なくとも９０％が、塩基の添加から２秒以内に生じること、また、アクリジニウムエステル複合体の場合には、化学発光反応からの光の全収率の少なくとも９０％が、塩基の添加から１秒以内に生じることを意味する。

用語「小分子」は、約３，０００未満、好ましくは約２，０００未満、より好ましくは約１，０００ダルトン未満の分子量を有する任意の有機分子をいう。

本発明のアクリジニウム化合物は、フェニル環のメチレン炭素上にヘテロ原子が存在することにより、迅速な発光と加水分解安定性を達成する。一つの実施態様において、加水分解に安定性で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物は、式Ｉ：

［式中、Ｑは、出現ごとに独立に、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−から選択され；ここで、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；ただし、少なくとも１個のＱは、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−でなければならない］で示される構造を含む。好ましい実施態様において、一方又は双方のＱ置換基は、−Ｏ−である。Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である。好ましくは、Ｒ_１は、メチル基又はスルホ−アルキル基（非限定的にスルホプロピル及びスルホブチル基が挙げられる）である。

いずれかの特定の説に縛られることを望むものではないが、少なくとも１対の非結合性電子（すなわち、「孤立電子対」）を有するヘテロ原子、例えば−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−、特に、−Ｏ−が直接に、フェニル環の２’及び６’炭素上のメチレン置換基のいずれか又は双方に結合したときに、ヘテロ原子は、塩基として作用して、アクリジニウムエステルの過酸化物との化学発光反応を触媒する。

他の実施態様において、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物は、式ＩＩ：

［式中、Ｒ及びＲ^＊は、独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；かつ、Ｒ_１は、上記のとおりである］で示される構造を含む。好ましい実施態様において、Ｒは、場合により置換されているＣ_１〜Ｃ_５のアルキル基、好ましくはメチルである。

他の実施態様において、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物は、式ＩＩＩ：

［式中、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含み；かつ、Ｒ_１は、上記のとおりである］で示される構造を含む。

本発明の他の実施態様において、式ＩＶ：

［式中、規定された置換基の各々は、下記のように定義される］で示される構造を有する、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物が提供される。

Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；好ましくは、Ｒ_１は、メチル、スルホプロピル又はスルホブチル基である。

Ｒ_２は、Ｃ１からＣ４のいずれかにおける官能基であり、そしてＲ_３は、Ｃ５からＣ８のいずれかにおける官能基であり、ここでＲ_２及びＲ_３は、独立に、水素か、酸素、窒素、硫黄又はハロゲンから選択される２０個までのヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である。該ヘテロ原子は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基の任意の部分を含むことができ、したがって、例えば、アルコキシ、エーテルもしくはヘテロアリール基におけるように、その基の主鎖の一部を形成し得るか、又はケトン、ハロゲン等の場合のように、そのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基からの側鎖であり得る。具体的には、考慮されるヘテロ原子の置換として、Ｒ_２及び／又はＲ_３が酸素原子を介してアクリジニウム核に結合しているもの（すなわち、Ｒ_２及び／又はＲ_３がアルコキシ置換基である）ならびにＲ_２及び／又はＲ_３がさらに、エーテル又は、例えば一般式−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−のポリエーテルを包含するポリエーテルを含むものが挙げられる。一つの興味深い変形においては、ポリエーテルは、酸素を介してアクリジニウム環に結合しており、したがって、Ｒ_２及び／又はＲ_３は、式−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−のものである。ポリエーテルは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基を包含する任意の基が末端となり得る。好ましい実施態様においては、Ｒ_２及び／又はＲ_３は、式−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_３（ここで、ｎは１〜２０、好ましくは１〜１０の整数である）を有する。

Ｘ及びＹは、独立に、結合（すなわち、その基は存在せず、したがって、Ｒ_４及びＲ_５は、アクリジニウム核に直接結合している）、酸素、硫黄又は窒素から選択される。好ましい実施態様においては、Ｘ及びＹの少なくとも一方は、−Ｏ−である。Ｘ及び／又はＹが窒素原子である場合、窒素原子は、アクリジニウム核ならびにＲ_４及び／又はＲ_５と一緒になって、二級アミンを形成し得るか、あるいは窒素原子は、アクリジニウム核ならびにＲ_４及び／又はＲ_５ならびに基Ｒ^＊と一緒になって、三級アミンを形成し得る（ここで、Ｒ^＊は、本明細書で定義したとおりの基である）。

Ｒ_４及びＲ_５は、独立に、水素か、酸素、窒素、硫黄又はハロゲンから選択される２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である。Ｒ_４及び／又はＲ_５は、例えば、エーテル又は、例えば一般式−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−のポリエーテルを包含するポリエーテル構造を含み得る。Ｘ及び／又はＹが−Ｏ−である、一つの興味深い変形においては、ポリエーテルは、酸素を介してアクリジニウム環に結合しており、Ｘ及び／又はＹと一緒になって、タイプ−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−の基を形成する。ポリエーテルは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基を包含する任意の基が末端となり得る。好ましい実施態様においては、Ｒ_４及び／又はＲ_５は、式−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_３（ここで、ｎは、１〜２０、好ましくは１〜１０の整数である）を有し、Ｘ及び／又はＹと一緒になって、基−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_３を形成する。Ｒ_４及びＲ_５の他の好適な置換基として、非限定的に、場合により任意の数のヘテロ原子、好ましくは酸素原子を含む（存在する場合には、例えば、エーテル又はポリエーテル官能性を含み得る）、Ｃ_１〜Ｃ_１０の分岐状もしくは直鎖状のアルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチルなどが挙げられる。

Ｒ_６及びＲ_７は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル、アルキル−アリール、アルコキシ（−ＯＲ）、アルキルチオール（−ＳＲ）及びＮＲ_２基（ここで、窒素上のＲは、同一又は異なることができ、Ｒは、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である）から選択される。

Ｒ_８は、基−Ｒ_９−Ｒ_１０であり、
Ｒ_９は、結合又は、２０個までのヘテロ原子を含有する、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基を表し、
Ｒ_１０は、下記のもの：

から選択される求電子性又は求核性官能基であり；
ここで、Ｘ^＊は、ハロゲンであり；そしてＲ^＊は、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール、又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含有し；
Ａ⁻は、該アクリジニウム核の四級窒素と対を成すために導入される対イオンであり、かつＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハライド、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻及びＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される。

特に関心がもたれる本発明のアクリジニウムエステルは、下記：

［式中、
Ｒ_１は、−Ｍｅ又はＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ⁻であり；
Ｒは、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲであり、Ａ⁻は、先に記載したとおりである］で示される構造を有する。

本発明の例示的なアクリジニウムエステルとして、非限定的に、下記：

［式中、Ｒ_１、Ｒ、Ｒ_１１及びＡ⁻は、先に記載したと同じである］で示されるものが挙げられる。

本発明のアクリジニウムエステルは、また、下記：

［式中、Ｒは、−Ｍｅ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨＭｅ_２及び（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨ［ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ］_２、ｎ＝１〜５から選択され；Ｒ_１１は、先に記載したとおりである］で示される構造を有する。

本発明の他の例示的なアクリジニウムエステルとして、下記：

［式中、Ｒは、−Ｍｅ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨＭｅ_２及び（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨ［ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ］_２、ｎ＝１〜５から選択され；Ｒ_１１は、先に記載したとおりである］で示されるものが挙げられる。

本発明の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウム化合物は、被験体の測定又は定量用のアッセイにおける標識として有用である。アクリジニウム化合物は、イムノアッセイ及び核酸アッセイにおいて広く使用されている。このようなアッセイで典型的に測定される被験体は、しばしば、ある種の臨床的に関連性の物質であり、マクロ分子、例えばタンパク質、核酸、ウイルス細菌などから、小分子、例えばエタノール、ビタミン、ステロイド、ホルモン、治療薬などまでの広範囲な分子に亘るものであり得る。「サンドイッチ」イムノアッセイは、典型的には、２種の結合性分子、例えば抗体を用いる、マクロ分子被験体とも称する大きな分子の検出を含む。一方の抗体は、固相、例えば粒子、ビーズ、膜、マイクロタイタープレート又は任意の他の固体表面に固定化又は結合される。抗体等の結合性分子の固相への結合方法は、この分野で周知である。例えば、抗体は、グルタルアルデヒド等の架橋性分子を用いることにより、その表面にアミンを含有する粒子に共有結合することができる。結合は、また、非共有結合的であってもよく、固相、例えばポリスチレンビーズ及びマイクロタイタープレートの表面への結合性分子の単なる吸着をも含む。第二の抗体は、しばしば標識と称される化学発光性又は蛍光性分子と共にしばしば共有結合される。抗体及び他の結合性タンパク質等の結合性分子の標識化もまたこの分野で周知であり、一般に、複合化反応と呼ばれており、標識化抗体は、しばしば複合体と呼ばれる。典型的には、標識上のアミン反応性部分は、抗体上のアミンと反応して、アミド結合を形成する。抗体と標識との間のチオエーテル、エステル、カーバメートなどのような他の結合も周知である。アッセイにおいて、２種の抗体は、マクロ分子被験体の異なる領域に結合する。マクロ分子被験体は、例えば、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルス、受容体、又は合成高分子であり得る。結合性分子は、抗体、抗体フラグメント、核酸、ペプチド、結合性タンパク質又は合成結合性高分子であり得る。例えば、葉酸結合性タンパク質（「ＦＢＰ」）は、被験体葉酸塩を結合する。種々の被験体と結合することができる合成結合性分子は、また、Mossbach et al. Biotechnology vol. 14, pp. 163-170 (1995)により開示されている。

固定化抗体と標識化抗体を有する固相を、被験体を含有する試料と混合すると、結合錯体が、被験体と２種の抗体との間で形成される。このタイプのアッセイは、固相が関与するので、しばしば、不均一アッセイと呼ばれる。次いで、結合錯体に関連する化学発光性又は蛍光性シグナルを測定し、被験体の存在又は不存在を推察することができる。通常、結合錯体は、シグナル発生の前に、過剰の標識化抗体等の結合反応成分の残余から分離される。例えば、結合錯体が磁気ビーズに結合している場合には、ビーズに結合している結合錯体をバルク溶液から分離するのに磁石を使用することができる。一連の「標準」、すなわち、既知濃度の被験体を使用することにより、「用量応答」曲線を、その２種の抗体を用いて作製することができる。用量応答曲線は、測定されたシグナルのある量と、被験体の特定量とを相関させる。サンドイッチアッセイにおいて、被験体の濃度が増加するにつれて、シグナルの量も増加する。次いで、未知の試料中の被験体の濃度は、マクロ分子被験体を含有する未知試料により発生するシグナルを用量応答曲線と比較することにより算出することができる。

同様の静脈中で、二つの結合性成分はまた、核酸被験体の異なる領域に結合又はハイブリダイズする核酸であり得る。次いで、核酸被験体の濃度を、同様にして推定できる。

小分子被験体、例えばステロイド、ビタミン、ホルモン、治療薬又は小ペプチド用の他の種類のイムノアッセイは、一般に競合アッセイと称するアッセイフォーマットを使用する。典型的には、競合アッセイにおいて、複合体は、当該被験体及び化学発光性又は蛍光性標識から、二つの分子を共有結合することにより作製される。小分子被験体は、そのまま使用できるか、又はその構造を改変してから、標識に複合化することができる。改変した構造を持つ被験体は、類縁体と呼ばれる。標識を被験体と結合する化学を可能にするために、被験体の構造類縁体を使用することがしばしば必要である。時には、被験体の構造類縁体は、抗体等の結合性分子へのその結合を減少又は増大させるために使用される。このような技術は、この分野で周知である。当該被験体に対する抗体又は結合性タンパク質は、直接又はビオチン−アビチン系等の第二の結合相互作用を介するかのいずれかで、しばしば、固相上に固定化される。

試料中の被験体の濃度は、被験体含有試料及び被験体−標識複合体を、限定量の固相固定化結合性分子に対して競合させることにより、競合アッセイにおいて推定することができる。試料中の被験体濃度が増加するにつれて、固相上の結合性分子に捕捉された被験体−標識複合体の量が減少する。一連の「標準」、すなわち、被験体の既知濃度を使用することにより、固相上の結合性分子に捕捉された被験体−標識複合体からのシグナルが、被験体の濃度と逆に相関する、用量応答曲線を構築することができる。このように一旦用量応答曲線を案出すると、未知の試料中の同じ被験体の濃度は、未知の試料から得られるシグナルを用量応答曲線中のシグナルと比較することにより推定することができる。

小分子被験体に対する競合アッセイの他のフォーマットは、当該被験体又は被験体類縁体が固定化された固相及び化学発光性又は蛍光性標識と複合化された被験体に特異的な抗体又は結合性タンパク質の使用を含む。このフォーマットにおいて、抗体標識複合体は、固相上の被験体又は被験体類縁体との結合性相互作用を介して、固相上に捕捉される。次いで、試料中に存在する当該被験体は、抗体−標識複合体に「競合的に」結合し、したがって、固相を伴う抗体−標識複合体の相互作用を阻害又は置換する。この様式で、固相上に捕捉された抗体−標識複合体から発生するシグナルの量は、試料中の被験体の量と相関される。

アクリジニウムエステルは、特に、自動化免疫化学機器、例えば、加水分解に安定なアクリジニウムエステルＤＭＡＥ及びＮＳＰ−ＤＭＡＥを使用するBayerのADVIA：Centaur（商標）及びACS：180（商標）中で極めて有用な化学発光性標識である。これら双方の機器は、ハイスループットを有し、これは、それらが、毎時、それぞれ２４０及び１８０の試験という多数の免疫アッセイ試験を行うことができることを意味する。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ由来の試薬は、典型的には、化学発光が、０．５％過酸化水素を含有する１００mM硝酸とそれに続く界面活性剤を含有する０．２５N 水酸化ナトリウムの添加により誘発されたときに、５秒間に亘って発光する。迅速に発光し、安定な本発明のアクリジニウムエステルは、ADVIA:Centaur（商標）のような自動化免疫化学機器で使用すると、そのスループットを増大させることができる。「増大したスループット」は、アクリジニウムエステルＤＭＡＥ及びＮＳＰ−ＤＭＡＥを使用するがその他は同一である試験と比較して、所与の時間量で行うことができる試験数を増大させることを意味する。

化学発光性アクリジニウムエステルを用いる自動化免疫化学機器のスループットに影響を与える一つの鍵となる因子は、光測定時間である。ADVIA:Centaur（商標）において、光測定時間は、アクリジニウムエステル試薬により発光された全ての光を集めるためには４秒である。本発明の迅速に発光するアクリジニウムエステルは、化学発光が０．５％過酸化水素を含有する１００mM硝酸と界面活性剤を含有する０．２５N 水酸化ナトリウムを用いて誘発されたときに、光測定時間を４秒から１〜２秒に短縮することを可能にする。

より具体的には、フェノール脱離基のＣ−２’及び／又はＣ−６’のメチレン炭素上に孤立電子対を有する酸素のようなヘテロ原子を配置すると、化学発光が０．５％過酸化水素を含有する１００mM硝酸と界面活性剤を含有する０．２５N 水酸化ナトリウムを用いて誘発されたときに、これらの置換基を持たないアクリジニウムエステルと比較して、対応するアクリジニウムエステルからのより速い速度での発光をもたらす。フェノール上のＣ−２’及び／又はＣ−６’のメチレン炭素は、フェノキシ基が回転するので等価である。アクリジニウムエステルがこれらの炭素の一つに１個の置換基又は官能基を含有するときには、Ｃ−２’メチル基上の置換基と称する。

表１に、本発明の種々のアクリジニウムエステルからの発光をまとめて示す。表１に列挙した種々のアクリジニウム化合物の化学構造を、下に示す。表１に列挙したアクリジニウム化合物は、当業者に周知の有機化学手法を用いて合成された。フェノール上のＣ−２’又はＣ−６’のメチル基上に一切へテロ原子を有していないアクリジニウムエステルＮＳＰ−ＤＭＡＥ及びＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥ（ＵＳ２００５／０２２１３９０Ａ１）を、参照化合物として使用した（表１中のエントリー１と２）。ＮＳＰ−ＤＭＡＥは、アクリジニウム環上に置換基を一切有していないが、ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥは、アクリジニウム環のＣ−２及びＣ−７メチル基上に２個の親水性Ｏ−メトキシヘキサ（エチレン）グリコール部分（ＯＭＨＥＧ）を有している。表１の化合物に関する合成の詳細は、実施例の項で見出すことができる。各々の化合物からの発光は、二つの試薬を添加することにより誘発された。第一の試薬は、１００mM硝酸中に０．５％過酸化水素を含み、第二の試薬は、０．２５N 水酸化ナトリウム中に界面活性剤を含んでいた。光は、光電子増倍管を備えた照度計を検出器として用いて測定した。各化合物からの発光量は、変動する測定時間の関数として測定した。各々の測定時間での発光量は、照度計により、相対光単位（ＲＬＵ）として報告した。ＲＬＵとしての発光量は、最も遅いアクリジニウムエステルについて１０ｓの測定時間で最大であり、全てのアクリジニウムエステルについてこの時点を１００％とした。より短い測定時間での発光は、この数の割合として表し、また、表１中ではパーセントで表示する。これらの測定に関する他の詳細は、実施例の項で見出すことができる。

表１中のデータの検討から、Ｃ−２’及び／又はＣ−６’のメチル基上にエーテル、−ＯＲ置換基を含有するアクリジニウムエステル（ここで、Ｒは、アルキル基であり、さらなるヘテロ原子を有するか有さず、また分岐を有するか有さない）が、加速された発光を示すことを推論することができる。この点は、全ての化合物について、２秒の測定時間で発する光の量を考察することにより、最も明確に実証される。Ｃ−２’及びＣ−６’のメチル基に−ＯＲ置換基を持たないＮＳＰ−ＤＭＡＥ（エントリー１）については、全ての光の４７％が２秒で発光した。同様に、ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥ（エントリー２）については、全ての光の５０％のみが２秒で発光した。著しく対照的に、エントリー３〜８の表１に列挙した全ての他の化合物は、それらの光の＞９０％が、２秒以内に発光し、それらは全て、Ｃ−２’及び／又はＣ−６’のメチレン炭素原子上に、エーテル−ＯＲ基の形態で、ヘテロ原子を含有している。例えば、化合物ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（それぞれ、エントリー３及び４）は、それらの光のそれぞれ９２％及び９６％を２秒で発光する。Ｃ−２’メチレンに結合したさらに長いアルキル鎖を有する、化合物ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥも、２秒でその光の９２％を発光して、迅速な発光を示している（エントリー５、表１）。したがって、エントリー３、４及び５に示されているように、−ＯＲ置換基上のアルキル基Ｒの長さは、速度の加速に影響を及ぼさない。さらに、Ｒでの分岐は、迅速な発光に影響を与えない。例えば、Ｒにさらなる分岐を有している化合物ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ［Ｍｅ］_２）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（エントリー７、表１）も、２秒でその光の９３％を発光して、迅速な発光を示している。化合物ＮＳＰ−２’，６’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２Ｍｅ−ＡＥ（エントリー６、表１）は、Ｃ−２’及びＣ−６’のメチル炭素上に２個のヘテロ原子置換基を有し、Ｃ−２’メチレン炭素原子上に１個のみのヘテロ原子を含有する一置換アクリジニウムエステルよりもさらに迅速な発光を示している。このことは、非常に短い１．０秒の測定時間で各々の化合物について発光する光の量を考慮すると、最も明白である。この化合物は、ほんの１秒後に、その光の９８％を発光する。Ｃ−２’メチレン炭素原子上に１個のヘテロ原子を含有する、全ての他の迅速に発光するアクリジニウムエステル（エントリー３〜６、８）は、１秒で、それらの光の６９〜９０％を発光する。Ｃ−２’メチル炭素上にいずれのヘテロ原子をも持たない２つの化合物、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ及びＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥ（エントリー１及び２）は、１秒後に、それらの光の２２％しか発光しない。表１の結果は、また、アクリジニウム環上の官能基は、Ｃ−２’メチル炭素上の−ＯＲ基の能力が発光加速することを妨げないことを示している。したがって、化合物ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（エントリー８）は、２秒でその光の９４％を発光し、アクリジニウム環上に同じ官能基を有するが、ヘテロ原子を持たない類似の化合物ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥは、同じ時間でその光の５０％しか発光しない。最後に、エントリー９及び１０は、迅速な発光を得るためには、ヘテロ原子−ＯＲ基はＣ−２’メチレン炭素上に直接位置している必要があることを示している。Ｃ−２’メチレン炭素と−ＯＲ基の間にさらなる介在炭素原子を有する、二つの化合物ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ［ＯＭｅ］Ｍｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（エントリー９）及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（エントリー１０）については、発光はより遅い。これら二つの化合物は、２秒後に、それらの光をそれぞれ４９％及び６８％しか発光しない。したがって、−ＯＲ基は有効ではあるが、Ｃ−２’メチレン炭素の官能基−ＣＨ_２ＯＲは、この官能基を含有するアクリジニウムエステルからの発光を加速するには有効ではない。−ＯＲ基は、唯一のものではなく、官能基に孤立電子対を持つ他のヘテロ原子（例えば、チオエーテル（−ＳＲ）及びアミン（−ＮＲ_２））も、Ｃ−２’及び／又はＣ−６’のメチル炭素原子上にこれらの官能基を含有するアクリジニウムエステルからの発光を加速することが期待し得る。上で示したようにＲ基は、発光に影響を与えず、従って、Ｒ基上に位置するさらなる官能基を持つか持たない任意のアルキルもしくはアリール基又はこれらのある種の組み合わせであり得る。

本発明の迅速に発光するアクリジニウムエステルは、また、タンパク質のようなマクロ分子又はステロイドのような小分子に接合されたときに、迅速な発光を示す。表２に、抗ＴＳＨモノクローナル抗体（抗ＴＳＨ Ｍａｂ）のアクリジニウムエステル複合体及びコルチゾール複合体からの発光をまとめて示す。これらの測定は、表１のデータについて先に記載したようにして行ったが、ここでは、５秒で測定した発光を、最も遅いアクリジニウムエステル複合体について最大とし、全ての複合体について１００％と規定した。被験体のＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）及びステロイドコルチゾールは、一般に、免疫化学的手法で測定する。アクリジニウムエステル及び複合体の構造は、表２の下の図に示す。複合体に関する合成詳細は、実施例の項に詳細に記載する。

化学発光は、Magic Lite Analyzer照度計（MLA1, Bayer Diagnostics）で測定した。測定には、種々の化合物の試料を、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ＢＳＡ及び０．０１％アジ化ナトリウムを含有する１０mMリン酸塩ｐＨ８中で調製した。

表２中のデータは、Ｃ−２’メチレン炭素上にヘテロ原子を含有するアクリジニウムエステルが、他の分子に複合化されたときでさえ、迅速な発光を示すことを示している。Ｃ−２’メチル炭素にヘテロ原子を持たないアクリジニウムエステルは、より遅い発光を示す。例えば、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ（エントリー１、表２）及びＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート（エントリー２、表２）に由来する抗ＴＳＨ Ｍａｂ複合体は、１秒でそれらの光のそれぞれ６９％及び５２％を発光する。同様に、アクリジニウム環上のＣ−２及びＣ−７に−ＯＭＨＥＧ部分を含有するが、Ｃ−２’メチル炭素上にヘテロ原子を含有しない、アクリジニウムエステルＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−ＤＭＡＥ−ＡＣの抗ＴＳＨ Ｍａｂ複合体は、１秒でその光の６２％を発光する（エントリー３、表２）。対照的に、Ｃ−２’メチレン炭素上にヘテロ原子を含有する化合物由来の抗ＴＳＨ Ｍａｂ複合体は全て、迅速な発光を示す（エントリー４〜８、表２）。したがって、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（エントリー４）の複合体は、１秒でその光の９４％を発光する。同様に、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨＭｅ_２）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（エントリー５）、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート（エントリー７）及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート（エントリー８）の複合体は、１秒でそれらの光のそれぞれ９４％、９８％及び９０％を発光する。アクリジニウム環上のＯＭＨＥＧ官能基を含有する他に、Ｃ−２’メチレン炭素にヘテロ原子をも含有するＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＡＣ（エントリー６）もまた、１秒で発生するその光の９８％という迅速な発光を示す。

アクリジニウムエステルのコルチゾール複合体は、同様の傾向を示す。Ｃ−２’メチル炭素にヘテロ原子を全く含有しない、複合体ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−コルチゾール（同様の構造及びＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧの合成については、米国特許第６，６６４，０４３Ｂ２号参照）は、１秒でその光の３８％のみを発光する（エントリー９）。対照的に、Ｃ−２’メチレン炭素に酸素を含有する複合体、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−コルチゾール及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−コルチゾール（エントリー１０及び１１）の双方は、１秒でそれらの光のそれぞれ９８％及び９６％を発光する。

迅速な発光を示すことに加えて、本発明のアクリジニウムエステルは、良好な安定性をも示す。「安定性」とは、化合物又は複合体を、水溶液中、典型的には、生理的なｐＨ内である７〜８のｐＨ範囲で保存したときに、ＲＬＵの最小の損失（すなわち、２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満）を意味する。機構の観点からは、フェノール性エステルの加水分解が主な経路であり、それにより、化学発光性アクリジニウムエステルは、非化学発光性になる。安定な複合体は、アクリジニウムエステル試薬の長い保存寿命を保証し、また、アッセイ性能が、所与の期間に亘って大きく変化しないことを保証する。本発明の種々のアクリジニウムエステル複合体の安定性は、表３及び表４に列挙されている。複合体の水溶液は、室温で、ｐＨ７．７の水性緩衝液中で保存され、ＲＬＵは定期的に記録される。最初の時点で測定されたＲＬＵはまた、０日と称し、１００％の値とする。他の時点で測定されたＲＬＵは、この数のパーセントで表す。これらの測定に関する他の詳細は、実施例の項に見出し得る。

表３及び表４から判るように、本発明の迅速に発光するアクリジニウムエステルの抗ＴＳＨ Ｍａｂ及びコルチゾール複合体は、ＲＬＵ変化に極めて安定である。室温で２７日後でさえ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨＭｅ_２）−６’−Ｍｅ−ＡＥの抗ＴＳＨ Ｍａｂ複合体は、その最初の化学発光性の９２％を保持するＮＳＰ−ＤＭＡＥと比べると、それらの最初の化学発光性シグナルのそれぞれ８２％及び９３％を保持する。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ及び迅速に発光するＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥのコルチゾール複合体は、室温で２７日間保存した後に、それらの最初のＲＬＵのそれぞれ１０４％及び９５％の保持を示す。

上記によれば、被験体の検出又は定量用のアッセイは、本発明の一つの実施態様によれば、下記の工程を含む：
（ａ）（ｉ）被験体に特異的な結合性分子；及び（ｉｉ）Ｃ−２’メチル基上にヘテロ原子、好ましくは酸素を有する（本明細書に記載のとおりである）、本発明の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステルのいずれかを含む複合体を用意する工程；
（ｂ）該被験体に特異的な第二の結合性分子をその上に固定化して有する固体支持体を用意する工程；
（ｃ）複合体、固相及び被験体を含有すると推測される試料を混合して結合錯体を形成する工程；
（ｄ）固体支持体上に捕捉された結合錯体を分離する工程；
（ｅ）化学発光誘発性試薬を加えることにより、工程（ｄ）からの結合錯体の化学発光を誘発する工程；
（ｆ）発光量を照度計で測定する工程；ならびに
（ｇ）反応混合物からの発光量を、公知の被験体濃度に発光量を関連づける標準用量応答曲線と比較することにより、被験体の存在を検出するか、又はその濃度を算出する工程
。

他の実施態様においては、下記の工程を含む、被験体の検出又は定量用のアッセイが提供される：
（ａ）被験体の、Ｃ−２’メチル基上にヘテロ原子、好ましくは酸素を有する（本明細書に記載のとおりである）、本発明の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステルのいずれかとの複合体を用意する工程；
（ｂ）被験体に特異的な結合性分子を固定化した固体支持体を用意する工程；
（ｃ）複合体、固相及び被験体を含有すると推測される試料を混合して結合錯体を形成する工程；
（ｄ）固体支持体上に捕捉された結合錯体を分離する工程；
（ｅ）化学発光誘発性試薬を加えることにより、工程（ｄ）からの結合錯体の化学発光を誘発する工程；
（ｆ）発光量を照度計で測定する工程；ならびに
（ｇ）反応混合物からの発光量を、公知の被験体濃度に発光量を関連づける標準用量応答曲線と比較することにより、被験体の存在を検出するか、又はその濃度を算出する工程。

マクロ分子被験体は、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルス及び合成高分子などであり得る。

小分子被験体は、ステロイド、ビタミン、ホルモン、治療薬、及び小ペプチドなどであり得る。

アッセイにおける結合性分子は、抗体、抗体フラグメント、結合性タンパク質、核酸、ペプチド、受容体又は合成結合性分子であり得る。

実施例１
ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＮＨＳ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−グルタラートＮＨＳエステル及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−コルチゾールの合成
ａ）メチル ３，５−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾアートの合成
無水メタノール（６０ml）中の３，５−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾアート（２ｇ、０．０１２mol）の溶液を、氷浴中で冷却し、塩化チオニル（５ml）をこの溶液に滴下した。反応物を氷浴中で１時間撹拌し、次に室温に温め、１６時間撹拌した。次に固体の重炭酸ナトリウムを加えて酸を中性化し、次に混合物をロータリーエバポレーションにより蒸発乾固した。残留物を酢酸エチルと水（各１００ml）に分配した。酢酸エチル層を分離し、ブラインで１回洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。収量＝２．１４６ｇ、白色の粉末。

ｂ）メチル ４−アセトキシ−３，５−ジメチルベンゾアートの合成
ピリジン（２０ml）中のメチル ３，５−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾアート（２．１４６ｇ）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴中で冷却した。無水酢酸（５ml）を滴下し、０℃で３０分後、反応物を室温に温め、２〜３時間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を酢酸エチル（５０ml）に溶解した。この溶液を１N ＨＣｌ、水及びブラインで洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。収量＝２．４ｇ、白色の粉末。

ｃ）メチル ４−アセトキシ−３−ブロモメチル−５−メチルベンゾアートの合成
四塩化炭素（３５ml）中のメチル ４−アセトキシ−３，５−ジメチルベンゾアート（２．４ｇ）の溶液を、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブトリルニトリル、０．１７７ｇ、０．１当量）及びＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド、２．１１７ｇ、１．１当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下で６時間加熱還流した。反応物を室温に冷まし、クロロホルム（３０ml）で希釈した。この溶液を水（４×５０ml）で洗浄し、次に無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。オフホワイトのロウ状の固体を回収した。収量＝４．６３ｇ。粗ブロミドを次の反応でそのまま使用した。

ｄ）メチル ３−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアートの合成
粗メチル ４−アセトキシ−３−ブロモメチル−５−メチルベンゾアート（〜０．５ｇ）の懸濁液を、２−メトキシエタノール５ml中で重炭酸ナトリウム（０．７６５ｇ、〜５当量）と共に９０〜９５℃にて窒素雰囲気下で加熱した。２時間後、ＴＬＣ分析が完全な転換を示した。反応物を室温に冷まし、蒸発乾固した。残留物を酢酸エチル（４０ml）と水（４０ml）に分配した。酢酸エチル層を分離し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次にそれを濾過し、蒸発乾固して、粘性油状物３３８mgを得て、それを２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。精製収量＝８３mg（粘性油状物）。

ｅ）２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン９−カルボキシラートの合成
ピリジン（５ml）中のアクリジン−９−カルボン酸（６６mg、０．６mmol）の懸濁液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（１１５mg、０．６mmol）で処理した。１０分間激しく撹拌した後、ピリジン（１ml）中メチル ３−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアート（７６mg、０．３mmol）の溶液を加え、反応物を窒素雰囲気下、室温で４日間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物をクロロホルム（４０ml）に溶解した。この溶液を、重炭酸層が清澄になるまで重炭酸ナトリウム飽和水溶液で繰り返し洗浄した。次にクロロホルム層を１N ＨＣｌ及びブラインで１回洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（１２８mg）を、１０％酢酸エチル／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。精製収量＝９４mg（７０％）。

ｆ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラート（９４mg、０．２１mmol）、１，３−プロパンスルトン（２．６ｇ、１００当量）及び重炭酸ナトリウム（０．１７ｇ、１０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１４５℃にて窒素雰囲気下で加熱した。２時間後、反応物を室温に冷まし、酢酸エチルとヘキサンの１：１の混合物３０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで数回すすぎ、次に減圧下で乾燥させて、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ メチルエステルを得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ実測値５８１．９。

粗アクリジニウムエステルを、１N ＨＣｌ ４mlに懸濁し、窒素下で還流した。２．５時間後、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、流量１．０ml／分及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの完全な加水分解からの生成物（保持時間＝１３．４分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値５６７．２）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm）及び溶媒の流量２０ml／分で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝７７mg（６４％）、黄色の粉末。

ｇ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＮＨＳの合成
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド、１ml）中のＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（７．１mg、１２．５μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（６．４μl、３当量）及びＴＳＴＵ（Ｏ−Ｎ−スクシンイミジルウランテトラフルオロボラート、５．６mg、１．５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。１５分後、（ｆ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（１４．７分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値６６５．２）。生成物を（ｆ）に記載のように分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。

ｈ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧの合成
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド、２ml）中のＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（４４mg、７７．５μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２０μl、１．５当量）及びＴＳＴＵ（２６mg、１．１当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、（ｆ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、ＮＨＳエステルへの完全な転換を示した。次にこのＤＭＦ溶液を、ＤＭＦ（２ml）中のジアミノ−ＨＥＧ（米国特許第６，６６４，０４３号 Ｂ２、０．１ｇ、５当量）の溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。更に３０分後、（ｆ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝１２．５分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値８３０．５）。生成物を（ｆ）に記載のように分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝５１mg（７０％）。黄色の粘性油状物。

ｉ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート及びそのＮＨＳエステルの合成
メタノール（３ml）中のＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ（３０mg、０．０３２mmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２８μl、５当量）及びグルタル酸無水物（１８mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、（ｆ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物への〜８０％の転換（保持時間＝１３．９分間で溶離）を示した。それぞれジイソプロピルエチルアミン（１４μl）及びグルタル酸無水物（９mg）の追加の２．５当量を加え、反応を更に３０分間続けた。次に反応物をトルエン（５ml）で希釈し、蒸発乾固した。残留物をＤＭＦ（２ml）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２８μl、５当量）及びＴＳＴＵ（４８mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌し、１時間後、（ｆ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝１５分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値１０４２．０）。生成物を（ｆ）に記載のように分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝２１．６mg（６５％）、黄色の油状固体。

ｊ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−コルチゾールの合成
ＤＭＦ（０．５ml）中コルチゾール−３−ＣＭＯ（Sigma、４．６mg、１０．６μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２．２μl、１．２当量）及びＨＡＴＵ（４．８mg、１．２当量）で処理した。５分間撹拌した後、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ（５mg、５．３μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２μl、２当量）と共にＤＭＦ（１ml）中に加えた。反応物を室温で撹拌した。２時間後、（ｆ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝１７．８分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値１２４９．２）。生成物を（ｆ）に記載のように分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝４．８mg（７３％）、黄色の粉末。

下記の反応は、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＮＨＳ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−グルタラート ＮＨＳエステル及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−コルチゾの合成について説明する。

実施例２
ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−グルタラートＮＨＳエステル及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−コルチゾールの合成
ａ）メチル ３−メトキシメチル−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアートの合成
メタノール（１００ml）中の粗メチル ４−アセトキシ−３−ブロモメチル−５−メチルベンゾアート（４．６３ｇ、０．００１５４mol）の懸濁液を、重炭酸ナトリウム（６．４８ｇ、５当量）と混合した。混合物を窒素雰囲気下で還流した。１．５時間後、ＴＬＣ分析は完全な転換を示した。反応物を室温に冷まし、蒸発乾固した。残留物を酢酸エチル（１００ml）と水（１００ml）に分配した。酢酸エチル層を分離し、水で洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（１．５ｇ）を、溶離剤として１０％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。精製収量＝０．８３３ｇ（４０％）。白色のロウ状固体。

ｂ）２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン ９−カルボキシラートの合成
無水ピリジン（１５ml）中のアクリジン−９−カルボン酸（０．４２３ｇ、１．９mmol）の懸濁液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（３６２mg、１．９mmol）で処理した。反応物を窒素雰囲気下で激しく撹拌した。１０〜１５分後、ピリジン（５ml）中のメチル ３−メトキシメチル−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアート（０．２ｇ、０．９５mmol）の溶液を加え、得られた反応物を室温で５日間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物をクロロホルム（５０ml）に溶解した。クロロホルム溶液を、水層が清澄になるまで重炭酸ナトリウム飽和水溶液で繰り返し洗浄した。次にクロロホルム溶液を１N ＨＣｌ及び水で洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、粗生成物０．４１ｇを得て、それを１０％酢酸エチル／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。精製収量＝３００mg（７６％）、黄色の粉末、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値４１４．９。

ｃ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラート（０．１ｇ、０．２４mmol）、１，３−プロパンスルトン（２．９４ｇ、１００当量）及び重炭酸ナトリウム（０．２ｇ、１０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。４５分後、反応物を凝固させた。少量を取り出し、メタノールに溶解し、実施例１（ｆ）に記載したように、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、流量１．０ml／分及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣにより分析した。生成物が、保持時間＝１５．５分間で溶離するのが観察された。反応物を室温に冷まし、１：１の酢酸エチル／ヘキサンの２５〜３０mlを加えた。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで数回すすぎ、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを１N ＨＣｌ ２０mlに懸濁し、窒素下で還流した。１．５時間後、ＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの完全な加水分解からの生成物（保持時間＝１３．０分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値５２４．１）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm）及び２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝６３．６mg（６０％）、黄色の粉末。

ｄ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧの合成
ＤＭＦ（６ml）中のＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ（６４mg、１２１．４μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（３２μl、１．５当量）及びＴＳＴＵ（４０mg、１．１当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、（ｃ）に記載したように、ＨＰＬＣ分析は、ＮＨＳエステル（保持時間＝１４分間で溶離）への完全な転換を示した。次にこのＤＭＦ溶液を、ＤＭＦ（３ml）中のジアミノ−ＨＥＧ（０．１７ｇ、５当量）の溶液に滴下した。反応物を室温で撹拌した。更に１５分間後、（ｃ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝１２．４分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値７８６．１）。生成物を、（ｃ）に記載のように分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝６１mg（６４％）、黄色の粘性油状物。

ｅ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート及びそのＮＨＳエステルの合成
メタノール（３ml）中のＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ（３０mg、３３．４μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１１．６μl、６６．７μmol）及びグルタル酸無水物（７．６mg、６６．７μmol）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、追加のジイソプロピルエチルアミン（１１．６μl）及びグルタル酸無水物（７．６mg）を加え、反応を更に６０分間続けた。（ｃ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝１３．６分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ実測値８９９．０）。次に反応物をトルエン（５ml）で希釈し、蒸発乾固した。残留物をＤＭＦ（２ml）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２９μl、５当量）及びＴＳＴＵ（５７mg、５当量）で処理した。反応物を室温で撹拌し、３０分後、（ｃ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝１４．９分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値９９８．６）。生成物を、（ｃ）に記載のように分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝３３．４mg（１００％）。黄色の油状固体。

ｆ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ−コルチゾールの合成
ＤＭＦ（０．５ml）中のコルチゾール−３−ＣＭＯ（Sigma、４．８mg、１１．０２μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２．１μl、１．１当量）及びＨＡＴＵ（５．０mg、１．２当量）で処理した。５分間撹拌した後、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ−ＨＥＧ（５mg、５．６μmol）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（２μl、２当量）と共にＤＭＦ（１ml）中に加えた。反応物を室温で撹拌した。０．５時間後、（ｃ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝１７．８分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値１２０４．５）。生成物を、（ｃ）に記載のように分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝５．１mg（７６％）、黄色の粉末．

下記の反応は、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−グルタラートＮＨＳエステル及びＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ ＨＥＧ−コルチゾールの合成について説明する。

実施例３
ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
ａ）メチル ３−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアートの合成
無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１０ml）中のメトキシトリ（エチレン）グリコール（Aldrich、０．２９５ｇ、１．８mmol）を、窒素雰囲気下、氷浴中で冷却し、水素化ナトリウム（７２mg、１．８mmol、６０％分散体）で処理した。反応物を０℃で２０分間撹拌し、次にメチル ４−アセトキシ−３−ブロモメチル−５−メチルベンゾアート（０．９mmol、２７０mg）の氷−冷溶液を、ＴＨＦ（３ml）に加えた。反応物を０℃で３０分間撹拌し、その時間までにシリカのＴＬＣ分析は、出発物質の完全な消費を示した。次に反応物をメタノール（５ml）及び酢酸エチル（５ml）でクエンチした。次に反応混合物をロータリーエバポレーションにより蒸発乾固した。残留物をクロロホルム（５０ml）に溶解し、重炭酸ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（０．４４ｇ）を、２％メタノール／クロロホルムを使用する分取ＴＬＣにより精製した。収量＝０．１１８ｇ（４０％）。油状物、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値３６６。Ｍ＋Ｎａ^＋）。

ｂ）アクリジン−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラートの合成
ピリジン（１ml）中のメチル ３−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアート（２０mg、５８．５μmol）の溶液を、アクリジン−９−カルボニルクロリド（２７mg、２当量）で０℃にて処理した。氷浴が融けるにつれて反応物が室温に温まり、窒素雰囲気下で３日間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物をクロロホルム（３０ml）に溶解した。この溶液を、重炭酸ナトリウム飽和水溶液、塩化アンモニウム飽和水溶液及びブラインで洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。生成物を、２０％酢酸エチル／クロロホルムを使用するシリカゲルの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝１１．６mg（３６％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値５４８．９。

ｃ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラート（１１．６mg、２１．２μmol）、１，３−プロパンスルトン（０．５ｇ、２００当量）及び重炭酸ナトリウム（３６mg、２０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。３時間後、反応物を室温に冷まし、少量を取り出し、メタノールに溶解し、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣにより分析した。生成物は、保持時間＝１６．３分間で溶離するのが観察された。反応混合物を、１：１の酢酸エチル／ヘキサンの１０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで２回すすぎ、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを、１N ＨＣｌ ３．５mlに懸濁し、窒素下で還流した。１．５時間後、ＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの完全な加水分解からの生成物（保持時間＝１３．６分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値６５７．９）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm、）及び２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝４．５（３２％）、黄色の粉末。

下記の反応は、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成について説明する。

実施例４
ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ、ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びそのＮＨＳエステルの合成
ａ）２，７−ジメトキシアクリジンメチルエステルの合成
粗２，７−ジメトキシアクリジン−９−カルボン酸（米国特許第５，５２１，１０３号、０．５ｇ）を、塩化チオニル（５ml）に懸濁し、懸濁液を窒素雰囲気下で還流した。１時間後、それを室温に冷まし、ヘキサン（４０ml）を加えた。沈殿した固体を濾過により回収し、ヘキサンですすいだ。次に生成物（〜０．５ｇ）を減圧下で乾燥させた。次にそれを４：１のピリジン／メタノールの氷冷溶液に溶解し、反応物を０℃で１時間撹拌し、次に室温に３６時間温めた。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物をクロロホルム（５０ml）に溶解した。この溶液を、１N ＨＣｌで洗浄し、続いて重炭酸ナトリウム飽和水溶液及びブラインで洗浄した。次にクロロホルム層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。収量＝２３１mg、赤色を帯びた黄色の粉末。

ｂ）２，７−ヒドロキシアクリジンメチルエステルの合成
ジクロロメタン（２０ml）中の２，７−ジメトキシアクリジンメチルエステル（０．２３ｇ）の溶液を、三臭化ホウ素のジクロロメタン溶液（１M、１５ml）で処理した。反応物を室温で４８時間撹拌した。次にそれを氷浴中で冷却し、メタノール（２０ml）をゆっくりと加えた。添加の後、反応物を室温に温め、２４時間撹拌した。次に固体重炭酸ナトリウムを加えて反応物を中和し、懸濁液を蒸発乾固した。残留物を酢酸エチル（５０ml）と水（５０ml）に分配した。酢酸エチル層を分離し、ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次にそれを濾過し、蒸発乾固した。収量＝８０mg、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値２７０．０。

ｃ）２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−アクリジンメチルエステルの合成
無水ＴＨＦ（１０ml）中の２，７−ジヒドロキシアクリジンメチルエステル（８０mg、０．２９６mmol）の溶液を、メトキシオキシヘキサ（エチレン）グリコールモノトシラート（米国特許第２００５／０２２１３９０Ａ１号、０．４ｇ、３当量）及び炭酸セシウム（９６．５mg、３当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下で還流した。４時間後、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣ分析は、生成物（１８．２分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値８２７．０）。反応物を室温に冷まし、蒸発乾固した。残留物をクロロホルム（３０ml）と塩化アンモニウム飽和水溶液に分配した。クロロホルム層を分離し、もう一度塩化アンモニウム溶液で洗浄し、続いてブラインで洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（０．３２ｇ）を、５％メタノール／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝４０mg（１６％）、油状固体。

ｄ）２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−アクリジン−９−カルボン酸の合成
２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−アクリジンメチルエステルの溶液を、２N 水酸化カリウム中で室温にて１６時間撹拌し、その時までにＴＬＣ分析は完全な加水分解を示した。次に反応物を氷浴中で冷却し、濃ＨＣｌで中和した。この溶液を蒸発乾固し、残留物をメタノール（５ml）に溶解し、濾過し、蒸発乾固した。収量＝５７mg（１００％）。

ｅ）２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラートの合成
ピリジン（１ml）中の２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−アクリジン−９−カルボン酸（５４mg、６６．４μmol）の溶液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（３２mg、２．５当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下、室温で１０分間撹拌し、次にピリジン（１ml）中のメチル ３−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアート（２０mg、５８．５μmol）を加えた。反応物を室温で３日間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物をＭｅＣＮ（５ml）に溶解した。Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝２２．６分間で溶離）への〜５０％の転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値１１４０．６）。生成物を、５％メタノール／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝１０mg、５０％転換に基づき収率３６％）。

ｆ）ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）− ４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラート（１０mg、８．８μmol）、１，３−プロパンスルトン（０．２ｇ、２００当量）及び重炭酸ナトリウム（１５mg、２０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。１時間後、反応物を室温に冷まし、１：１の酢酸エチル／ヘキサンの２０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで２回すすぎ、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを１N ＨＣｌ ３．０mlに懸濁し、窒素下で還流した。１．５時間後、（ｅ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの加水分解からの生成物（保持時間＝１６．７分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値１２４９．７）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm）、２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。

ｇ）２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラートの合成
ピリジン（７ml）中の２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−アクリジン−９−カルボン酸（１２０mg、１４６μmol）の溶液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（５６mg、２．０当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下、室温で５分間撹拌し、次にピリジン（３ml）中のメチル ３−メトキシメチル−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアート（６１mg、２当量）を加えた。反応物を室温で５日間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物をトルエン（１０ml）に溶解し、蒸発乾固した。残留物をクロロホルム（５ml）に溶解した。Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝２２．８分間）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値１００５．８）。生成物を、２％メタノール／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝７０mg、６２％、赤色を帯びた黄色の油状固体。

ｈ）ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びそのＮＨＳエステルの合成
２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラート（７０mg）、１，３−プロパンスルトン（１ｇ）及び重炭酸ナトリウム（７５mg）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。２時間後、反応物を追加の１，３−プロパンスルトン０．５ｇ及び重炭酸ナトリウム４４mgで処理し、更に１時間加熱した。次にそれを室温に冷まし、１：１の酢酸エチル／ヘキサンの２０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで２回すずき、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを１N ＨＣｌ ２０mlに懸濁し、窒素下で還流した。１．５時間後、（ｅ）に記載のようにＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの加水分解からの生成物(保持時間＝１６．５分間で溶離)を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値１１１４．３）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm）、２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝２９．５mg（３９％）。

下記反応は、ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２Ｏ［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ］_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ、ＮＳＰ−２，７−（ＯＭＨＥＧ）_２−２’−（ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びそのＮＨＳエステルの合成について説明する。

実施例５
ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
ａ）メチル ４−アセトキシ−３，５−ビス（ブロモメチル）ベンゾアートの合成
四塩化炭素（３０ml）中のメチル ４−アセトキシ−３，５−ジメチルベンゾアート（１．１３ｇ、０．００５１mol）の溶液を、ＡＩＢＮ（２１０mg、０．２５当量）及びＮＢＳ（２．２７ｇ、２．５当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下で６時間還流した。次に反応物を室温に冷まし、クロロホルム（３０ml）希釈した。この溶液を水（４×５０ml）で洗浄した。次にクロロホルム溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固して、粗二臭化物をロウ状の固体として得た。収量＝１．１８ｇ。この物質を精製せずに次の反応で使用した。

ｂ）メチル ３，５−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２−４−ヒドロキシベンゾアートの合成
粗メチル ４−アセトキシ−３，５−ビス（ブロモメチル）ベンゾアート（０．５ｇ）を、エチレングリコールモノメチルエーテル（２０ml）及び重炭酸ナトリウム（０．５５ｇ、５当量）と混合した。混合物を油浴中で９０℃にて３時間加熱し、その時までにＴＬＣ分析は出発物質が全く無いことを示した。反応物を室温に冷まし、ロータリーエバポレーションにより蒸発乾固した。残留物を酢酸エチル（３０〜４０ml）に懸濁し、濾過した。濾液を塩化アンモニウム飽和水溶液で洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（０．１９４ｇ）を、４０％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカゲルの分取ＴＬＣにより精製した。精製収量＝５２mg（粘性油状物）。

ｃ）２’，６’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２−４’−メトキシカルボニルフェニル−アクリジン−９−カルボキシラートの合成
ピリジン（１５ml）中のアクリジン−９−カルボン酸（７１mg、０．３１７mol）の懸濁液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（６０mg、０．３１７mmol）で処理した。反応物を激しく１０分間撹拌し、次にメチル ３，５−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２−４−ヒドロキシベンゾアート（５２mg、０．１５９mmol）の溶液をピリジン（５ml）に加えた。得られた溶液を窒素雰囲気下、室温で４日間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物をクロロホルム（４０ml）に溶解し、次にそれを重炭酸ナトリウム飽和水溶液、塩化アンモニウム飽和水溶液及びブラインで洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（７４mg）を、１％ＭｅＯＨ／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝５１mg（６０％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値５３５．２。

ｄ）ＮＳＰ−２’，６’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２−ＡＥの合成
２’，６’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン ９−カルボキシラート（５０mg、９４μmol）、１，３−プロパンスルトン（２．２８ｇ、２００当量）及び重炭酸ナトリウム（１５８mg、２０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。２〜３時間後、反応物を室温に冷まし、少量を取り出し、メタノールに溶解し、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣにより分析した。生成物は、保持時間＝１５．４分間で溶離するのが観察された。反応混合物を１：１の酢酸エチル／ヘキサンの３０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで２回すすぎ、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを１N ＨＣｌ ２０mlに懸濁し、窒素下で還流した。２時間後、ＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの完全な加水分解からの生成物（保持時間＝１３．０分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値６４３．５）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm）、２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝３０mg（５０％）。黄色の粉末。

下記の反応は、ＮＳＰ−２’，６’−（ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）_２−ＡＥの合成について説明する。

実施例６
ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨＭｅ_２）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びそのＮＨＳエステルの合成
ａ）メチル ３−イソプロピルオキシメチル−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアートの合成
ジクロロメタン（５ml）中の粗メチル ４−アセトキシ−３−ブロモメチル−５−メチルベンゾアート（１２０mg、０．３１４mmol）の溶液を、２−プロパノール（０．１２ml、５当量）で、続いて銀トリフラート（８１mg、１当量）で処理した。反応物を室温で１６時間撹拌し、次に濾過して銀塩を除去した。濾液を蒸発乾固した。生成物であるメチル ３−イソプロピルオキシメチル−４−アセトキシ−５−メチルベンゾアートを、１０％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製して、油状固体７５mgを得て、それをメタノールに溶解し、重炭酸ナトリウム（１１３mg、５当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下で１時間還流し、次に室温に冷まし、蒸発乾固した。残留物を酢酸エチル（１０〜１５ml）に溶解し、濾過した。濾液を蒸発乾固して、粗生成５６mgを得て、それを精製せずにそのまま使用した。

ｂ）２’−（ＣＨ_２ＯＣＨＭｅ_２）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラートの合成
ピリジン（７ml）中のアクリジン−９−カルボン酸（１１２mg、０．５mmol）の懸濁液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（９６．５mg、０．５mmol）で処理した。清澄になるまで懸濁液を窒素雰囲気下で激しく撹拌し、次にメチル ３−イソプロピルオキシメチル−４−ヒドロキシ−５−メチルベンゾアート（５６mg、０．２５mmol）の溶液をピリジン（１ml）に加えた。反応物を室温３日間撹拌した。Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用する、粗反応混合物のＨＰＬＣ分析は、生成物（保持時間＝２５．２分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値４４３．９）。反応混合物を蒸発乾固し、残留物をクロロホルム（３０ml）に溶解した。この溶液を１N ＨＣｌ、重炭酸ナトリウム飽和水溶液及び水で洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（７５mg）を、１０％酢酸エチル／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝３２mg（３０％）、油状固体。

ｃ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨＭｅ_２）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びそのＮＨＳエステルの合成
２’−（ＣＨ_２ＯＣＨＭｅ_２）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン ９−カルボキシラート（３２mg、７２μmol）、１，３−プロパンスルトン（０．８８ｇ、１００当量）及び重炭酸ナトリウム（６１mg、１０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。２時間後、反応物を室温に冷まし、少量を取り出し、メタノールに溶解し、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣにより分析した。生成物は、保持時間＝１７．５分間で溶離するのが観察された（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値５６５．８）。反応混合物を１：１の酢酸エチル／ヘキサンの２０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで２回すすぎ、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを１０％ＨＣｌ １０mlに懸濁し、窒素下で還流した。２時間後、ＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの完全な加水分解からの生成物（保持時間＝１４．４分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値６４３．５）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm）、２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝１９．８mg（５０％）、黄色の粉末。

アクリジニウムエステルをＤＭＦ（２ml）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（９．４μl、１．５当量）及びＴＳＴＵ（１３mg、１．２当量）で処理した。反応物を室温で撹拌した。３０分後、ＨＰＬＣ分析は、ＮＨＳエステル（保持時間＝１６．６分間で溶離）への完全な転換を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ実測値６４９）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm）、２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。収量＝１２mg（５１％）、黄色の粉末。

下記の反応は、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＯＣＨＭｅ_２）−６’−Ｍｅ−ＡＥ及びそのＮＨＳエステルの合成について説明する。

実施例７
ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ［ＯＭｅ］Ｍｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
ａ）メチル ４−ヒドロキシ−３−メチルベンゾアートの合成
４−ヒドロキシ−３−メチル安息香酸（Matrix Scientific、１ｇ）の溶液を、メタノールに溶解し、窒素雰囲気下、氷浴中で冷却した。塩化チオニル（５ml）をゆっくりと加えた。反応物を０℃で１時間撹拌し、次に室温に温め、１６時間撹拌した。次に固体の重炭酸ナトリウムを加えて酸を中和し、混合物を蒸発乾固した。残留物を酢酸エチル（７５ml）と水（１００ml）に分配した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固して生成物１．０ｇを得た。

ｂ）メチル ３−Ｏ−アリル−４−メチルベンゾアートの合成
アセトン（５０ml）中のメチル ４−ヒドロキシ−３−メチル安息香酸（１ｇ、０．００６mol）の溶液を、無水炭酸カリウム（１．６５６ｇ、０．０１２mol）及び臭化アリル（０．７８ml、０．００９mol）で処理した。反応物を窒素雰囲気下で還流した。３時間後、ＴＬＣ分析は完全な転換を示した。反応物を室温に冷まし、蒸発乾固した。残留物を酢酸エチル（５０ml）と水（５０ml）に分配した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。収量＝１．１３８ｇ（明褐色の油状物）。

ｃ）メチル ４−ヒドロキシ−３−アリル−５−メチルベンゾアートの合成
Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（５ml）中のメチル ３−Ｏ−アリル−４−メチル安息香酸（１．１３８ｇ）の溶液を、窒素雰囲気下、油浴中で２００℃にて加熱した。８時間後、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣ分析は、〜８０％の転換を示した。反応物を室温に冷まし、酢酸エチル（７５ml）で希釈した。この溶液を、１０％ＨＣｌ ３００mlで、続いて重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（１．１１ｇ）を、３０％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。生成物を得た黄褐色の粉末として得た。収量＝０．８４３ｇ（７５％）。

ｄ）メチル ４−アセトキシ−３−アリル−５−メチルベンゾアートの合成
ピリジン（５ml）中のメチル ４−ヒドロキシ−３−アリル−５−メチル安息香酸（１５７mg）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴中で冷却し、無水酢酸（１ml）で処理した。反応物を氷浴中で１時間撹拌し、次に室温に４時間温めた。次に溶媒を減圧下で除去し、残留物を無水トルエン（５〜１０ml）に懸濁し、蒸発乾固した。粗生成物を酢酸エチル（３０ml）に溶解し、塩化アンモニウム水溶液で洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固して、褐色の油状物を得た。収量＝０．１７６ｇ（定量）。

ｅ）メチル ４−ヒドロキシ−３−（２−メトキシプロピル）−５−メチルベンゾアートの合成
メタノール（２ml）中のメチル ４−アセトキシ−３−アリル−５−メチル安息香酸（１７５mg、０．７５mmol）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸第二水銀（３２２mg、１当量）で処理した。反応物を氷浴中で１時間撹拌し、その時間までにＴＬＣ分析は出発物質の完全な消費を示した。次に反応物を３N ＮａＯＨ １mlで処理し、２分間激しく撹拌した後、３N ＮａＯＨ中の水素化ホウ素ナトリウム（０．５M、１ml）の溶液を加えた。戻し懸濁液を氷浴中で５分間撹拌し、次に酢酸エチル（２５ml）を加えた。更に５分間撹拌した後、酢酸エチル溶液をデカントし、次に塩化アンモニウム飽和水溶液で２回洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（１４１mg、油状物）を、１５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。精製収量＝８２mg（〜５０％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 実測値２３９。

ｆ）２’−（ＣＨ_２ＣＨ［ＯＭｅ］Ｍｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラートの合成
ピリジン（１０ml）中のアクリジン−９−カルボン酸（１５４mg、０．６８９mmol）の懸濁液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（１３１mg、０．６８９mmol）で処理した。懸濁液を、清澄になるまで窒素雰囲気下で激しく撹拌し、次にメチル ４−ヒドロキシ−３−（２−メトキシプロピル）−５−メチルベンゾアート（８２mg、０．３４５mmol）の溶液をピリジン（２ml）に加えた。反応物を室温で３日間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、残留物をクロロホルム（３０ml）に溶解した。この溶液を１N ＨＣｌ、重炭酸ナトリウム飽和水溶液及び水で洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物（１６７mg）を、１０％酢酸エチル／クロロホルムを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝２９mg（２０％）、油状固体。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値４４３．８。

ｇ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ［ＯＭｅ］Ｍｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
２’−（ＣＨ_２ＣＨ［ＯＭｅ］Ｍｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン ９−カルボキシラート（２９mg、６６μmol）、１，３−プロパンスルトン（０．８０ｇ、１００当量）及び重炭酸ナトリウム（５５mg、１０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。２時間後、反応物を室温に冷まし、少量を取り出し、メタノールに溶解し、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣにより分析した。生成物は、保持時間＝１６．２分間で溶離するのが観察された。反応混合物を１：１の酢酸エチル／ヘキサンの２０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで２回すすぎ、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを、１０％ＨＣｌ １０mlに懸濁し、窒素下で還流した。２時間後、ＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの完全な加水分解からの生成物（保持時間＝１３．７分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値６４３．５）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００mm、）、２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させて黄色の粉末を得た。

下記の反応は、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ［ＯＭｅ］Ｍｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成について説明する。

実施例８
ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
ａ）メチル ４−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−アリル−５−メチルベンゾアートの合成
ジクロロメタン（５ml）中のメチル ４−ヒドロキシ−３−アリル−５−メチルベンゾアート（１５７mg、０．７６２mmol）の溶液を、トリエチルアミン（０．２１ml、２当量）及びtert−ブチルジメチルシリルクロリド（１７２mg、１．５当量）で処理した。反応物を窒素雰囲気下、室温で３日間撹拌し、その時までに、ＴＬＣ分析は、完全な転換を示した。反応物を酢酸エチル（３０ml）で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液及び重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固して、生成物を褐色の油状物として得た。収量＝０．２３９ｇ（９８％）。

ｂ）メチル ４−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルベンゾアートの合成
ジオキサン／水（３：１、１６ml）中のメチル ４−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−アリル−５−メチルベンゾアート（０．２３９ｇ、０．７４２mmol）の溶液を、２，６−ルチジン（１７３μl、１．４８４mmol）、四酸化オスミウム（３．８mg、０．０１４８mmol）で処理し、それを溶液としてアセトン（１ml）に加え、続いて過ヨウ素酸ナトリウム（６３５mg、２．９７mmol）を加えた。反応物を窒素雰囲気下、室温で撹拌した。２時間後、ＴＬＣ分析は生成物の大部分を示した。次に反応物を酢酸エチル（２０ml）及び水（１０ml）で希釈した。酢酸エチル層を分離し、水層をもう一度酢酸エチル（１０ml）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物をブラインで洗浄した。次にそれらを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。褐色の油状物（０．２５５ｇ）を回収した。次に非常に不安定なアルデヒドを、まずそれをメタノール（５ml）に溶解し、氷浴中で冷却した後、水素化ホウ素ナトリウム（５０mg、２当量）を加えることより迅速に還元した。この反応物を氷浴中で撹拌し、１０分後、ＴＬＣ分析がアルコールへの完全な転換を示した。次に反応物をアセトン（２ml）でクエンチし、１０分間撹拌した。次に反応混合物を蒸発乾固し、残留物を酢酸エチル（３０ml）に溶解し、次に塩化アンモニウム飽和水溶液で一度、次に重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄した。次に酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。暗褐色の粘性油状物を回収し、それを２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。生成物を清澄な粘性油状物として得た。収量１３８mg（５８％）。

ｃ）メチル ４−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチル）−５−メチルベンゾアートの合成
ジクロロメタン（３ml）中のメチル ４−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルベンゾアート（４８mg、０．１４８mmol）の溶液を、重炭酸ナトリウム（６０mg、４当量）及びメチル トリフラート（６８μl、４当量）で処理した。反応物を室温で１６時間撹拌し、その時までにＴＬＣ分析は〜５０％の転換を示した。次に反応物を酢酸エチル（２０ml）で希釈し、濾過した。濾液を蒸発乾固した。残留物をＴＨＦ（５ml）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（６０mg、１．５当量）を加えた。反応物を室温で撹拌した。５分後、ＴＬＣ分析は完全な転換を示した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を、酢酸エチル（１ml）に溶解し、２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカの分取ＴＬＣにより精製した。収量＝１３mg（４０％）。

ｄ）２’−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン−９−カルボキシラートの合成
ピリジン（２ml）中のアクリジン−９−カルボン酸（３９mg、１７４μmol）の懸濁液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（３３mg、１７４μmol）で処理した。清澄になるまで、反応物を窒素雰囲気下、室温で１０〜１５分間撹拌し、次にメチル ４−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチル）−５−メチルベンゾアート（１３mg、５８μmol）の溶液を、ピリジン（２ml）に加えた。反応物を室温で３日間撹拌し、次に蒸発乾固した。残留物をクロロホルム（２５ml）に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液及び１０％ＨＣｌで洗浄した。次にそれを無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗収量１１．３mg。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 実測値４２９。この物質を精製せずに次の反応で使用した。

ｅ）ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成
２’−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−４’−メトキシカルボニルフェニル−６’−Ｍｅ−アクリジン ９−カルボキシラート（１１．３mg、２６．３μmol）、１，３−プロパンスルトン（０．６４２ｇ、２００当量）及び重炭酸ナトリウム（４４mg、２０当量）の混合物を、油浴中で１４０〜１５０℃にて加熱した。２時間後、反応物を室温に冷まし、少量を取り出し、メタノールに溶解し、Ｃ１８カラム（４．６×３０mm）、１０％→７０％ＭｅＣＮ／水（各０．０５％ＴＦＡを含有）の３０分間の勾配、１．０ml／分の流量及び検出波長ＵＶ−２６０nmを使用するＨＰＬＣにより分析した。生成物は保持時間＝１５．８分間で溶離するのが観察された。反応混合物を１：１の酢酸エチル／ヘキサンの２０mlで希釈した。混合物を超音波処理するとガム状物が黄色の粉末に分散し、飛粉が静まった後で、溶媒をデカントした。黄色の粉末を酢酸エチル／ヘキサンで２回すすぎ、次に減圧下で乾燥させた。粗アクリジニウムエステルを１０％ＨＣｌ １０mlに懸濁し、窒素下で還流した。２時間後、ＨＰＬＣ分析は、メチルエステルの完全加水分解からの生成物（保持時間＝１４．０分間で溶離）を示した（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ実測値５３７．９）。粗生成物を、Ｃ１８カラム（３０×３００m）及び溶２０ml／分の流量で上記の勾配を使用する分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を回収し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させて、黄色の粉末として得た。

下記の反応は、ＮＳＰ−２’−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ）−６’−Ｍｅ−ＡＥの合成について説明する。

実施例９
アクリジニウムエステルを用いた抗ＴＳＨ Ｍａｂ標識化の一般手順
抗体の原液（５mg／ml、２００μl、１mg、６．６７nmol）を、０．１M リン酸緩衝液ｐＨ８（３００μl）で希釈し、保冷容器中で４℃に冷却した。この冷却溶液に、アクリジニウムＮＨＳエステル１０当量をＤＭＦ溶液（１mg／ml）として加えた。例えばＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳの場合、３９．４μl（６６．７nmol）をタンパク質溶液に加えた。

標識化反応物を、室温で３〜４時間穏やかに撹拌し、次に脱イオン水（１．５ml）で希釈した。次にこれらの希釈した溶液を、２mlのCentricon（商標）フィルター（ＭＷ３０，０００カットオフ）に移し、４５００Ｇで遠心分離して体積を〜０．２mlに減少させた。この工程を更に３回繰り返した。濾過した複合体を、質量スペクトル解析及びＲＬＵ測定のために、最終的に総体積０．５mlの脱イオン水に希釈した。

質量スペクトルをVoyager ＤＥ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計に記録し、非標識抗体を参照として使用した。およそ２μlの複合体溶液を、シナピン酸マトリックス溶液（ＨＰ）２μlと混合し、ＭＡＬＤＩプレートにスポッテングした。完全乾燥の後、質量スペクトルを記録した。非標識抗体と複合体の質量の値の差異から、ＡＥの取り込み程度を測定することができた。概して、これらの標識化条件下では、２〜４ＡＥ標識が抗体に取り込まれた。

実施例１０
光測定のための一般手順
全ての光測定は、Bayer Diagnostics社のＭＬＡ１（商標）又はＭＬＡ２（商標）（ＡＥ安定度測定）のいずれかで実施された。アクリジニウムエステル類からのＲＬＵ測定のために、ＨＰＬＣで精製した化合物のＤＭＦ溶液１mg／mlを、１０mMリン酸塩、１５０mM ＮａＣｌ ｐＨ８（０．０５％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムも含有）に入れて１０^６〜１０^７倍に段階的に希釈した。タンパク質複合体及びＨＰＬＣで精製したコルチゾール複合体を、同様の方法で希釈した。光測定は、試料２５μlを使用し、装置中で、０．１N 硝酸中に０．５％過酸化水素を含有する第一の試薬０．３５０mlを添加し、続けて０．２５N ＮａＯＨ中に界面活性剤を含有する第二の試薬０．３５mlを添加することにより開始した。第一の試薬と第二の試薬の添加の間については、０．１秒という非常に短い遅延時間を使用した。動態測定に関して、アクリジニウムエステル類については測定時間を０．５秒から１０秒まで変化させ、タンパク質複合体及びコルチゾール複合体については０．５秒から５秒まで変化させた。各測定時における発光の量は、計測器によりＲＬＵとして報告され、次にアクリジニウムエステル類については１０秒時に、そして複合体については５秒時に記録されたＲＬＵに１００％の値を割り当てることによって、発光の量をパーセントに変換した。ＡＥ安定度測定については、測定時間５秒を用いた。

Claims (23)

1. 式Ｉ：
   

   

   
   ［式中、Ｑは、出現ごとに独立に、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−から選択され；ここで、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；ただし、少なくとも１個のＱは、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−であり；かつ、Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である］
   で示される構造を含む、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
2. 一方のＱが、−Ｏ−を表し、他方のＱが、結合を表す、請求項１記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
3. Ｒ^＊が、メチルである、請求項２記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
4. 双方の場合のＱが、−Ｏ−を表す、請求項１記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
5. 式ＩＩ：
   

   

   
   ［式中、Ｒ及びＲ^＊は、独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；かつ、Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である］
   で示される構造を含む、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
6. Ｒが、メチルである、請求項５記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
7. 式ＩＩＩ：
   

   

   
   ［式中、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；かつ、Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である」
   で示される構造を含む、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
8. 式ＩＶ：
   

   

   
   ［式中、
   Ｒ_１は、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
   Ｒ_２は、Ｃ１からＣ４のいずれかにおける官能基であり、そしてＲ_３は、Ｃ５からＣ８のいずれかにおける官能基であり；
   Ｒ_２及びＲ_３は、独立に、水素か、酸素、窒素、硫黄又はハロゲンから選択される２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
   Ｘ及びＹは、出現ごとに独立に、結合、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−から選択され；ここで、Ｒ^＊は、出現ごとに独立に、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１〜２０個のヘテロ原子を含有し；ただし、ＸもしくはＹのいずれか又は双方は、−Ｏ−、−Ｓ−又はＮ（Ｒ^＊）−であり；
   Ｒ_４及びＲ_５は、独立に、水素か、酸素、窒素、硫黄又はハロゲンから選択される２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
   Ｒ_６及びＲ_７は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール−アルキル、アルキル−アリール、アルコキシ（−ＯＲ）、アルキルチオール（−ＳＲ）及びＮＲ_２基（ここで、窒素上のＲは、同一又は異なることができ、そして２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基である）から選択され；
   Ｒ_８は、Ｒ_６及びＲ_７と互換性があり、及び基−Ｒ_９−Ｒ_１０であり；
   Ｒ_９は、結合又は２０個までのヘテロ原子を含有する、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基を表し；
   Ｒ_１０は、下記：
   

   

   
   から選択される求電子性又は求核性官能基であり；
   ここで、Ｘ^＊は、ハロゲンであり；そしてＲ^＊は、水素、置換もしくは非置換の、分岐状もしくは直鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキル−アリール又はアリール−アルキル及びこれらの組み合わせから選択され、場合により、酸素、窒素、リン、硫黄、ハロゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含有し；
   Ａ⁻は、該アクリジニウム核の四級窒素と対を成すために導入される対イオンであり、かつＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハライド、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻及びＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される］
   で示される、加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
9. Ｒ_１が、メチル、スルホプロピル又はスルホブチル基である、請求項８の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
10. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ_１は、−Ｍｅ又はＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ⁻であり；
    Ｒは、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲであり；
    Ａ⁻は、該アクリジニウム核の四級窒素と対を成すために導入される対イオンであり、かつＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハライド、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻及びＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
11. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ_１は、−Ｍｅ又はＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ⁻であり；
    Ｒは、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲであり；
    Ａ⁻は、該アクリジニウム核の四級窒素と対を成すために導入される対イオンであり、かつＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハライド、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻及びＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
12. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ_１は、−Ｍｅ又はＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ⁻であり；
    Ｒは、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲであり；
    Ａ⁻は、該アクリジニウム核の四級窒素と対を成すために導入される対イオンであり、かつＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハライド、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻及びＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
13. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ_１は、−Ｍｅ又はＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ⁻であり；
    Ｒは、２０個までのヘテロ原子を含有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリール−アルキル又はアルキル−アリール基であり；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲであり；
    Ａ⁻は、該アクリジニウム核の四級窒素と対を成すために導入される対イオンであり、かつＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、ＦＳＯ_３ ⁻、ＣＦ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_４Ｆ_９ＳＯ_４ ⁻、ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_３ ⁻、ハライド、ＣＦ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＣＯＯ⁻及びＮＯ_３ ⁻からなる群から選択される］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
14. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒは、−Ｍｅ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨＭｅ_２及び−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨ［ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ］_２（ここで、ｎ＝１〜５）から選択され；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲである］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
15. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒは、−Ｍｅ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨＭｅ_２及び−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨ［ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ］_２（ここで、ｎ＝１〜５）から選択され；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲである］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
16. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒは、−Ｍｅ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨＭｅ_２、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ及び−ＣＨ［ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ］_２（ここで、ｎ＝１〜５）から選択され；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲである］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
17. 下記構造：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒは、−Ｍｅ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ、−ＣＨＭｅ_２、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ及び−ＣＨ［ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＭｅ］_２（ここで、ｎ＝１〜５）から選択され；
    Ｒ_１１は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−ＮＨ−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル（ここで、ｎ＝０〜５）、又はＮＨ−Ｒ−ＮＨＲである］
    を有する、請求項８記載の加水分解に安定で、迅速に発光する化学発光性アクリジニウムエステル。
18. 被験体の検出又は定量用のアッセイであって：
    （ａ）（ｉ）被験体に特異的な結合性分子；及び（ｉｉ）請求項１〜１７のいずれか記載の加水分解に安定で、迅速に発光するアクリジニウムエステルを含む、複合体を用意する工程；
    （ｂ）該被験体に特異的な第二の結合性分子をその上に固定化して有する固体支持体を用意する工程；
    （ｃ）複合体、固相及び被験体を含有すると推測される試料を混合して結合錯体を形成する工程；
    （ｄ）固体支持体上に捕捉された結合錯体を分離する工程；
    （ｅ）化学発光誘発性試薬を加えることにより、工程（ｄ）からの結合錯体の化学発光を誘発する工程；
    （ｆ）発光量を照度計で測定する工程；ならびに
    （ｇ）反応混合物からの発光量を、公知の被験体濃度に発光量を関連づける標準用量応答曲線と比較することにより、被験体の存在を検出するか、又はその濃度を算出する工程を含む、アッセイ。
19. 被験体の検出又は定量用のアッセイであって：
    （ａ）請求項１〜１７のいずれか記載の加水分解に安定で、迅速に発光するアクリジニウムエステルと被験体の複合体を用意する工程；
    （ｂ）被験体に特異的な結合性分子を固定化した固体支持体を用意する工程；
    （ｃ）複合体、固相及び被験体を含有すると推測される試料を混合して結合錯体を形成する工程；
    （ｄ）固体支持体上に捕捉された結合錯体を分離する工程；
    （ｅ）化学発光誘発性試薬を加えることにより、工程（ｄ）からの結合錯体の化学発光を誘発する工程；
    （ｆ）発光量を照度計で測定する工程；ならびに
    （ｇ）反応混合物からの発光量を、公知の被験体濃度に発光量を関連づける標準用量応答曲線と比較することにより、被験体の存在を検出するか、又はその濃度を算出する工程含む、アッセイ。
20. 請求項８〜１７のいずれか一項記載のアクリジニウムエステルの、被験体への複合体。
21. 被験体が、ステロイド、ビタミン、ホルモン、治療薬及び小ペプチドから選択される小分子被験体である、請求項２０記載の複合体。
22. 被験体が、タンパク質、核酸、オリゴ糖、抗体、抗体フラグメント、細胞、ウイルス及び合成高分子から選択されるマクロ分子被験体である、請求項２０記載の複合体。
23. 結合性分子が、抗体、抗体フラグメント、結合性タンパク質、核酸、ペプチド、受容体又は合成結合性分子から選択される、請求項１８又は１９記載の結合性分子。

Images