JP2010168288A - Enhancement of immunogenicity of virus vaccine by use of optimized antigen gene - Google Patents
Enhancement of immunogenicity of virus vaccine by use of optimized antigen gene Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010168288A JP2010168288A JP2009010172A JP2009010172A JP2010168288A JP 2010168288 A JP2010168288 A JP 2010168288A JP 2009010172 A JP2009010172 A JP 2009010172A JP 2009010172 A JP2009010172 A JP 2009010172A JP 2010168288 A JP2010168288 A JP 2010168288A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- hiv
- viral vector
- vector
- gag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 39
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 29
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 title description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 75
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 88
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 74
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 62
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 23
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 21
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 claims description 21
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 9
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 7
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 9
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 8
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 8
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 8
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N nevirapine Chemical compound C12=NC=CC=C2C(=O)NC=2C(C)=CC=NC=2N1C1CC1 NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 6
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N CPD000469186 Natural products CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)NC(C(O)CN1C(CC2CCCCC2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 4
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 description 4
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical compound C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229960000884 nelfinavir Drugs 0.000 description 4
- QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N nelfinavir Chemical compound CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)N[C@H]([C@H](O)CN1[C@@H](C[C@@H]2CCCC[C@@H]2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N 0.000 description 4
- 229960000689 nevirapine Drugs 0.000 description 4
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 description 4
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 description 4
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 description 4
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 3
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 3
- 108010042634 F2A4-K-NS peptide Proteins 0.000 description 3
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 3
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 description 3
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N Didanosine Chemical compound O1[C@H](CO)CC[C@@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229960002656 didanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N tenofovir disoproxil fumarate Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.N1=CN=C2N(C[C@@H](C)OCP(=O)(OCOC(=O)OC(C)C)OCOC(=O)OC(C)C)C=NC2=C1N VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000701124 Human adenovirus 35 Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003489 abdominal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004556 tenofovir Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150059019 vif gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150024249 vpr gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026222 vpu Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150090490 vpu gene Proteins 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】 哺乳類細胞において抗原タンパク質の発現量が高いウイルスベクターワクチンを提供すること。
【解決手段】 哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチン。
【選択図】 図３PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a virus vector vaccine having a high expression level of an antigen protein in a mammalian cell.
A viral vector vaccine incorporating an antigen gene that has been synonymously substituted so that the expression level in a mammalian cell is greater than that in the wild type.
[Selection] Figure 3
Description
本発明は、ウイルスベクターワクチンに関する。 The present invention relates to viral vector vaccines.
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)が同定されてから２０年余りが経過しているが、未だに完全なる治療法は確立されていない。 More than 20 years have passed since the identification of human immunodeficiency virus (HIV), but no complete treatment has yet been established.
初の抗HIV薬としてアジドチミジン（AZT）が開発された後、次々に新しい抗HIV薬が開発され、1995年、複数の抗HIV薬を併用するHAART(Highly Active Anti-retrovial Therapy)が開始され、先進国ではエイズによる死亡者は激減した。 After the development of azidothymidine (AZT) as the first anti-HIV drug, new anti-HIV drugs were developed one after another, and in 1995, HAART (Highly Active Anti-retrovial Therapy), which combines multiple anti-HIV drugs, was started. In developed countries, AIDS deaths have fallen dramatically.
しかし、この治療法では、抗HIV薬の投与を中止すると、２〜３週間後にはHIVが再増殖してくる。また、薬剤耐性ウイルスも次々と現れ、これらに対応するために更に新しい抗HIV薬が必要になってくる。さらに、患者は、生涯、薬剤の投与を続けなくてはならず、それにかかる医療費も莫大なものである。 However, with this treatment, when the administration of the anti-HIV drug is discontinued, HIV will regrow after 2-3 weeks. In addition, drug-resistant viruses are appearing one after another, and new anti-HIV drugs are needed to cope with them. In addition, patients must continue to administer drugs throughout their lives, and the medical costs associated with them are enormous.
従って、有効かつ安価な治療法が求められている。 Therefore, there is a need for an effective and inexpensive treatment.
一方で、HIVワクチンの開発が行われてきた。開発されているワクチンはHIVサブユニットペプチドワクチン、DNAワクチン、組換えウィルスベクターワクチン(ワクシニアウィルス、アデノウィルス(Ad)、ラビウィルス、フラビウィルス、センダイウィルスやアデノ随伴ウィルス(AAV)を含む)や細菌ベクターワクチンがある。現在、世界で知られているHIVワクチンの中で、アデノウイルス5型ベクターを利用したワクチンは免疫原性が非常に強いワクチンであるが、アデノウイルス5型に対する中和抗体を持つ患者が多く、このような患者においてはあまり強い免疫誘導能ができないこと、アデノウイルス5型は肝障害性が非常に強いため、大量に投与することができないなどの問題があった（非特許文献１）。そこで、アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換することによって、アデノウイルス5型に対する中和抗体を持つ患者にも有効で、かつ肝障害性が低いワクチンが作製された（特許文献１、非特許文献２）。 On the other hand, HIV vaccine has been developed. Developed vaccines include HIV subunit peptide vaccines, DNA vaccines, recombinant virus vector vaccines (including vaccinia virus, adenovirus (Ad), rabivirus, flavivirus, Sendai virus and adeno-associated virus (AAV)) and bacterial vectors There is a vaccine. Among HIV vaccines currently known in the world, vaccines using adenovirus type 5 vectors are highly immunogenic vaccines, but many patients have neutralizing antibodies against adenovirus type 5, In such patients, there was a problem that the ability to induce immunity was not so strong, and adenovirus type 5 was very strong in liver damage and could not be administered in large quantities (Non-patent Document 1). Therefore, by substituting the adenovirus type 5 fiber with one derived from adenovirus type 35, a vaccine that was effective for patients with neutralizing antibodies against adenovirus type 5 and low in liver damage was prepared ( Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
HIVワクチンに遺伝子導入される抗原遺伝子としては、gag遺伝子、env遺伝子などが使用されている。アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したベクター(Ad5/35ベクター)を用いたHIV-1 Clade Cに対するワクチンが開発されており、ワクチン抗原としては、ヒトIgGのFc断片が結合した野生型gagが使用された(非特許文献３)。また、ワクチン抗原の遺伝子として、哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、同義置換したものを使用したDNAワクチンは、哺乳類細胞において、タンパク質の発現量が野生型と比べて高く、野生型よりも免疫原性が高いことが報告されている（非特許文献４）。 As an antigen gene to be introduced into the HIV vaccine, gag gene, env gene and the like are used. A vaccine against HIV-1 Clade C using a vector in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with one derived from adenovirus type 35 (Ad5 / 35 vector) has been developed, and the vaccine antigen is an Fc fragment of human IgG Wild type gag to which is bound was used (Non-patent Document 3). In addition, DNA vaccines using synonymous substitutions in consideration of the frequency of mammalian codon usage as a vaccine antigen gene have higher protein expression levels in mammalian cells compared to wild type, compared to wild type. High immunogenicity has been reported (Non-patent Document 4).
しかし、抗原遺伝子を同義置換したものをウイルスベクターワクチンに搭載した例は報告されていない。 However, there has been no report of an example in which an antigen gene is synonymously substituted in a viral vector vaccine.
本発明は、哺乳類細胞において抗原タンパク質の発現量が高いウイルスベクターワクチンを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a viral vector vaccine having a high expression level of an antigen protein in mammalian cells.
本発明者らは、哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して同義置換した抗原遺伝子をウイルスベクターに組み込むことにより、哺乳類細胞における抗原タンパク質の発現量を野生型よりも増加させることに成功し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors succeeded in increasing the expression level of the antigen protein in mammalian cells compared to the wild type by incorporating into the viral vector an antigen gene synonymously substituted in consideration of the frequency of mammalian codon usage. The invention has been completed.
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチン。
（２）哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子がヒト化抗原遺伝子である（１）記載のウイルスベクターワクチン。
（３）抗原遺伝子がHIVの抗原遺伝子である（１）又は（２）記載のウイルスベクターワクチン。
（４）HIVがHIV-1である（３）記載のウイルスベクターワクチン。
（５）HIV-1がHIV-1 Clade Cである（４）記載のウイルスベクターワクチン。
（６）HIV-1の抗原遺伝子がHIV-1の構造遺伝子である（４）又は（５）記載のウイルスベクターワクチン。
（７）HIV-1の構造遺伝子がgag遺伝子である（６）記載のウイルスベクターワクチン。
（８）HIV-1の構造遺伝子がgag遺伝子及びenv遺伝子である（６）記載のウイルスベクターワクチン。
（９）ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである（１）〜（８）のいずれかに記載のウイルスベクターワクチン。
（１０）アデノウイルスベクターが複製機能欠損5型アデノウイルスである（９）記載のウイルスベクターワクチン。
（１１）アデノウイルスベクターがアデノウイルス5型と35型のキメラ型ベクターである（９）又は（１０）記載のウイルスベクターワクチン。
（１２）キメラ型ベクターが、アデノウイルス5型のファイバー部分を35型に置換したものである（１１）記載のウイルスベクターワクチン。
（１３）CAGプロモーターを含む（１）〜（１２）のいずれかに記載のウイルスベクターワクチン。
（１４）２個以上の抗原遺伝子が組み込まれている（１）〜（１３）のいずれかに記載のウイルスベクター。
（１５）２個以上の抗原遺伝子の各々がアダプター配列により結合されている（１４）記載のウイルスベクターワクチン。
（１６）アダプター配列がIRES及び／又はF2Aである（１５）記載のウイルスベクターワクチン。
The gist of the present invention is as follows.
(1) A viral vector vaccine incorporating an antigen gene that has been synonymously substituted so that the expression level in mammalian cells is higher than that in the wild type.
(2) The viral vector vaccine according to (1), wherein the antigen gene that has been synonymously substituted so that the expression level in a mammalian cell is greater than that of the wild type is a humanized antigen gene.
(3) The viral vector vaccine according to (1) or (2), wherein the antigen gene is an HIV antigen gene.
(4) The viral vector vaccine according to (3), wherein HIV is HIV-1.
(5) The viral vector vaccine according to (4), wherein HIV-1 is HIV-1 Clade C.
(6) The viral vector vaccine according to (4) or (5), wherein the HIV-1 antigen gene is a HIV-1 structural gene.
(7) The viral vector vaccine according to (6), wherein the structural gene of HIV-1 is the gag gene.
(8) The viral vector vaccine according to (6), wherein the HIV-1 structural genes are gag gene and env gene.
(9) The viral vector vaccine according to any one of (1) to (8), wherein the viral vector is an adenoviral vector.
(10) The viral vector vaccine according to (9), wherein the adenoviral vector is a replication function deficient type 5 adenovirus.
(11) The virus vector vaccine according to (9) or (10), wherein the adenovirus vector is an adenovirus type 5 or type 35 chimeric vector.
(12) The viral vector vaccine according to (11), wherein the chimeric vector is obtained by replacing the fiber part of adenovirus type 5 with type 35.
(13) The viral vector vaccine according to any one of (1) to (12), comprising a CAG promoter.
(14) The viral vector according to any one of (1) to (13), in which two or more antigen genes are incorporated.
(15) The virus vector vaccine according to (14), wherein each of two or more antigen genes is bound by an adapter sequence.
(16) The viral vector vaccine according to (15), wherein the adapter sequence is IRES and / or F2A.
本発明のウイルスベクターワクチンは、野生型の抗原遺伝子を使用したウイルスベクターワクチンよりも哺乳類細胞で抗原タンパク質の発現強度が高く、抗原タンパク質に対する細胞性免疫及び／又は液性免疫反応を増加させることができる。 The viral vector vaccine of the present invention has a higher expression intensity of the antigen protein in mammalian cells than a viral vector vaccine using a wild-type antigen gene, and may increase cellular immunity and / or humoral immune response to the antigen protein. it can.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクターワクチンを提供する。 The present invention provides a viral vector vaccine incorporating an antigen gene that has been synonymously substituted so that the expression level in mammalian cells is greater than that in the wild type.
哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子としては、哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、同義置換した抗原遺伝子（ヒト化抗原遺伝子）などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。 Examples of antigen genes that have been synonymously substituted so that the expression level in mammalian cells is greater than that of the wild type are exemplified by antigen genes that have been synonymously substituted (humanized antigen genes) in consideration of the frequency of mammalian codon usage. However, it is not limited to these.
抗原遺伝子としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、インフルエンザウイルス、HCV、天然痘ウイルス、ヒトパピロ−マウイルス、ＥＢウイルス、白血病ウイルスなどのウイルス由来の抗原タンパク質をコードする遺伝子、結核菌等の細菌由来の抗原をコードする遺伝子などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。 Antigen genes include genes encoding antigen proteins derived from human immunodeficiency virus (HIV), influenza virus, HCV, smallpox virus, human papilloma virus, EB virus, leukemia virus, and bacteria such as Mycobacterium tuberculosis Examples of such genes may include, but are not limited to, genes encoding these antigens.
HIVは、Type-1とType-2に大きく分けられるが、いずれのTypeであってもよい。さらに、HIV-1は、AからKまで10種類のcladeに分類されているが、いずれのcladeであってもよい。 HIV is roughly classified into Type-1 and Type-2, but any type may be used. Furthermore, HIV-1 is classified into 10 types of clades from A to K, but any clade may be used.
HIV-1の抗原遺伝子としては、HIV-1の構造遺伝子（gag遺伝子、env遺伝子及びpol遺伝子）、複製制御遺伝子（rev遺伝子、tat遺伝子、nef遺伝子、vif遺伝子、vpr遺伝子及びvpu遺伝子）を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。 Examples of HIV-1 antigen genes include HIV-1 structural genes (gag gene, env gene and pol gene) and replication control genes (rev gene, tat gene, nef gene, vif gene, vpr gene and vpu gene). However, it is not limited to these.
ウイルスベクターに組み込まれる抗原遺伝子は、抗原遺伝子領域の全部であっても、一部であってもよい。 The antigen gene incorporated into the viral vector may be the whole or a part of the antigen gene region.
HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子の配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知である（Goa, F., et al., J. Virol.70(3), 1651-1667(1996); Ratner, L., et al., Nature 313(6000), 277-284(1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609-617(2003); Kim, F.M., et al., J. Virol.69(3), 1775-1761(1995); Rodenburg, C.M., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 17(2), 161-168(2001); Gao, F., et al., J. Virol. 72(7), 5680-5698(1998); Gao, F. et al., J. Virology 70(10), 7013-7029(1996)）。また、NCBIなどのジーンバンクからも遺伝子情報を入手できる（U51190, K03455, U39362, AF286224, U88822, U51188）。 The sequences of HIV structural genes and replication control genes and the amino acid sequences encoded by them are known (Goa, F., et al., J. Virol. 70 (3), 1651-1667 (1996); Ratner, L , et al., Nature 313 (6000), 277-284 (1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609-617 (2003); Kim, FM, et al., J. Virol. 69 (3), 1775-1761 (1995); Rodenburg, CM, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 17 (2), 161-168 (2001); Gao, F., et al. , J. Virol. 72 (7), 5680-5698 (1998); Gao, F. et al., J. Virology 70 (10), 7013-7029 (1996)). Gene information can also be obtained from gene banks such as NCBI (U51190, K03455, U39362, AF286224, U88822, U51188).
哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子を同義置換することは知られており(Gao F, et al. AIDS Res Hum Retroviruses 2003 Sep;19(9):817-23. Haas J, et al. Curr Biol 1996 Mar 1;6(3):315-24.)、また、そのように同義置換された遺伝子はAIDS Research and Reference Reagent Program,アメリカ国立衛生研究所(NIH), Rochville, MD, USAから入手可能である。 Considering the frequency of mammalian codon usage, synonymous substitution of HIV structural genes and replication control genes is known (Gao F, et al. AIDS Res Hum Retroviruses 2003 Sep; 19 (9): 817- 23.Haas J, et al. Curr Biol 1996 Mar 1; 6 (3): 315-24.), And the synonymously substituted genes are AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health (NIH ), Rochville, MD, USA.
ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター(Ad)、ワクシニアウィルス、ラビウィルス、フラビウィルス、センダイウィルス、アデノ随伴ウィルス(AAV)などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。これらのウイルスベクターのうち、複製機能欠損5型Adベクター（例えば、初期遺伝子E1及び／又はE3が除去されたアデノウイルス5型）は遺伝子導入性や免疫原性が高く、ヒトを使った臨床研究もされているベクターである。しかし、このウィルスは初期の接着分子としてコクサッキーウイルス-アデノウイルスレセプター(CAR)を使用しており、CARの発現が高い肝実質細胞への親和性が高く、肝臓にウィルスが蓄積する。このため、その毒性の高さが問題となっている。後述の実施例では、細胞に対する親和性に関わるファイバー部分のみを35型に置換したキメラ型Ad5/35ベクター(Gene Therapy (2005) 12, 1769-1777、国際公開WO2005/052165号パンフレット)を使用した。このAd5/35ベクターは、細胞への初期接着分子としてCARではなくほとんどのヒト細胞で発現しているCD46レセプターを使用している。この向性によって、Ad5よりも肝毒性が低いことが報告されている。さらに、Ad5/35はAd5と比較してヒトの樹状細胞に遺伝子導入効率が高く、抗体保有率の低いAd35のファイバーを有しているので、ワクチンとして有用性が高いベクターである。 Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors (Ad), vaccinia viruses, rabiviruses, flaviviruses, Sendai viruses, adeno-associated viruses (AAV), and the like. Among these viral vectors, replication-deficient type 5 Ad vectors (for example, adenovirus type 5 from which early genes E1 and / or E3 have been removed) have high gene transferability and immunogenicity, and clinical research using humans It is also a vector. However, this virus uses Coxsackie virus-adenovirus receptor (CAR) as an initial adhesion molecule, has high affinity for hepatocytes with high CAR expression, and the virus accumulates in the liver. For this reason, the high toxicity is a problem. In the examples described below, a chimeric Ad5 / 35 vector (Gene Therapy (2005) 12, 1769-1777, International Publication WO2005 / 052165 pamphlet) in which only the fiber part related to affinity for cells was replaced with type 35 was used. . This Ad5 / 35 vector uses the CD46 receptor expressed in most human cells instead of CAR as an initial adhesion molecule to cells. This tropism has been reported to be less hepatotoxic than Ad5. Furthermore, Ad5 / 35 has a higher gene transfer efficiency in human dendritic cells than Ad5, and has an Ad35 fiber with a low antibody retention rate, so it is a highly useful vector as a vaccine.
抗原遺伝子は、ベクターとなるウイルスのライフサイクルに悪影響を及ぼさない限り、ウイルスベクターのいかなる部位に挿入されてもよい。例えば、アデノウイルス5型又はそのキメラウイルスに組み込む場合、抗原遺伝子はアデノウイルス5型のE1部位に挿入されるとよい。抗原遺伝子をウイルスベクターに組み込むには、例えば、CMVプロモーター、CMViプロモーター、CAGプロモーターなどのプロモーターの下流に、抗原遺伝子、次いでポリA遺伝子を含む発現カセットを用意し、その両端にウイルスベクターと同じ遺伝子を接続し、これを宿主細胞（例えば、HEK293細胞）にトランスフェクトすると、抗原遺伝子が挿入されたウイルスベクターが生成する。また、抗原遺伝子をアデノウイルス5型と35型のキメラウイルスベクター(例えば、Ad5/35ベクター)に組み込むには、例えば、CMVプロモーター、CMViプロモーター、CAGプロモーターなどのプロモーターの下流に、抗原遺伝子、次いでポリA遺伝子を含む発現カセットを用意し、Ad35ファイバーを持つE1/E3欠損Ad5のゲノムを持つプラスミド(pAdHM34)のE1部位に導入し、これを宿主細胞（例えば、HEK293細胞）にトランスフェクトすると、抗原遺伝子が挿入されたウイルスベクターが生成する。発現カセットには、さらに、複製起点、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子（目的の遺伝子が導入されたことを示すマーカー）などが含まれていてもよいが、発現カセットには複製起点、アンピシリン耐性遺伝子は含まれなくてよい。これらの遺伝子はpAdHM34を大腸菌で増やしたり、pAdHM34を持つ大腸菌だけをセレクションするため、pAdHM34に含まれている。 The antigen gene may be inserted at any site in the viral vector as long as it does not adversely affect the life cycle of the virus used as the vector. For example, when incorporating into adenovirus type 5 or a chimeric virus thereof, the antigen gene may be inserted into the E1 site of adenovirus type 5. In order to incorporate an antigen gene into a viral vector, for example, an expression cassette containing an antigen gene and then a poly A gene is prepared downstream of a promoter such as CMV promoter, CMVi promoter, CAG promoter, etc. And is transfected into a host cell (for example, HEK293 cell), a viral vector into which an antigen gene has been inserted is generated. In addition, in order to incorporate the antigen gene into adenovirus type 5 and type 35 chimeric virus vectors (for example, Ad5 / 35 vector), for example, downstream of the promoter such as CMV promoter, CMVi promoter, CAG promoter, etc. When preparing an expression cassette containing the polyA gene, introducing it into the E1 site of a plasmid (pAdHM34) having an E1 / E3-deficient Ad5 genome with Ad35 fiber, and transfecting it into a host cell (for example, HEK293 cell), A viral vector into which the antigen gene has been inserted is generated. The expression cassette may further contain a replication origin, a drug resistance gene such as an ampicillin resistance gene (a marker indicating that the gene of interest has been introduced), and the like, but the expression cassette has an origin of replication and ampicillin resistance. Genes may not be included. These genes are included in pAdHM34 to increase pAdHM34 in E. coli or to select only E. coli with pAdHM34.
ウイルスベクターには、２個以上の抗原遺伝子が挿入されてもよい。２個以上の抗原遺伝子の各々はアダプター配列により結合されるとよい。アダプター配列としては、IRES、F2Aなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。 Two or more antigen genes may be inserted into the viral vector. Each of the two or more antigen genes may be bound by an adapter sequence. Examples of adapter sequences include IRES and F2A, but are not limited thereto.
哺乳類細胞における発現量が野生型よりも増加するような同義置換がなされた抗原遺伝子を組み込んだウイルスベクター（組換えウイスルベクター）はワクチンとして利用することができる。 A viral vector (recombinant virus vector) into which an antigen gene that has been synonymously substituted so that the expression level in a mammalian cell is greater than that in the wild type can be used as a vaccine.
組換えウイスルベクターは、例えば、PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与されるとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、不活化剤、保存剤、アジュバント、乳化剤など）などを添加してもよい。組換えウイスルベクターは、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内などに投与することができ、また、経鼻、経口投与してもよい。 The recombinant viral vector is preferably dissolved in a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc., and sterilized by filtration with a filter or the like as necessary, and then administered to a subject by injection. Moreover, you may add an additive (For example, an inactivation agent, a preservative, an adjuvant, an emulsifier etc.) etc. to this solution. The recombinant virus vector can be administered intravenously, muscle, abdominal cavity, subcutaneous, intradermal, etc., or may be administered nasally or orally.
組換えウイスルベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり109〜1013ウイルス粒子、好ましくは1011〜1012ウイルス粒子の組換えウイルスベクターを、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。 The dose, frequency and frequency of administration of the recombinant viral vector vary depending on the subject's symptoms, age, body weight, administration method, dosage form, etc., for example, usually 10 9 to 10 13 virus particles per adult, preferably The recombinant viral vector of 10 11 to 10 12 viral particles may be administered at least once at a frequency that maintains the desired effect.
HIVの抗原遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターをHIV治療用ワクチンとして利用する場合、さらに、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて用いてもよい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddl)、ラブミジン(3TC)、ネビラピン(NVP)などを挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、インジナビル(IDV)、サキナビル(SQV)、リトナビル(RTV)、ネルフィナビル(NFV)、テノフォビル(PMPA)などを挙げることができる。高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy(HAART)）に用いられているものが好ましい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン(AZT)、ジダノシン(ddl)、ラブミジン(3TC)、ネビラピン(NVP)などを挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、インジナビル(IDV)、サキナビル(SQV)、リトナビル(RTV)、ネルフィナビル(NFV)などを挙げることができる。高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy(HAART)）に用いられているものが好ましい。組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を被験者に投与するとよい。例えば、組換えウイルスベクター投与の１〜３か月程度、好ましくは２か月程度前に、逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤を投与する。逆転写酵素阻害剤及び／又はプロテアーゼ阻害剤の投与量は、「抗HIV治療ガイドライン」（平成15年度厚生労働省科学研究費補助金エイズ対策研究事業HIV感染症の医療体制の整備に関する研究班 2004年3月）の記載に準じるものであるとよい。 When a recombinant viral vector into which an HIV antigen gene is incorporated is used as a vaccine for HIV treatment, it may be further used in combination with a reverse transcriptase inhibitor and / or a protease inhibitor. Examples of reverse transcriptase inhibitors include azidothymidine (AZT), didanosine (ddl), lambidine (3TC), nevirapine (NVP) and the like. Examples of protease inhibitors include indinavir (IDV), saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), nelfinavir (NFV), tenofovir (PMPA) and the like. Those used in Highly Active Anti-retroviral Therapy (HAART) are preferred. Examples of reverse transcriptase inhibitors include azidothymidine (AZT), didanosine (ddl), lambidine (3TC), nevirapine (NVP) and the like. Examples of protease inhibitors include indinavir (IDV), saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), nelfinavir (NFV) and the like. Those used in Highly Active Anti-retroviral Therapy (HAART) are preferred. A reverse transcriptase inhibitor and / or a protease inhibitor may be administered to the subject at least once before, after or simultaneously with the administration of the recombinant viral vector. For example, a reverse transcriptase inhibitor and / or a protease inhibitor is administered about 1 to 3 months, preferably about 2 months before administration of the recombinant virus vector. The dosage of reverse transcriptase inhibitors and / or protease inhibitors is the “Anti-HIV Treatment Guidelines” (FY2003, Ministry of Health, Labor and Welfare's Grant-in-Aid for Scientific Research on HIV / AIDS research project. (March) is recommended.
また、組換えウイルスベクターは、DNAワクチンなどの他のワクチンと組み合せて用いてもよい。例えば、組換えウイルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも１回、他のワクチンを被験者に投与する。HIV治療用の他のワクチンとしては、サブタイプBのHIV株であるHIVIIIBのrev遺伝子とenv遺伝子を含むDNAワクチン（pCAGrev/env, Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5: 609-617）などを挙げることができる。DNAワクチンの投与量は、5〜30 mgが適当であり、10〜20 mgが好ましい。 The recombinant virus vector may be used in combination with other vaccines such as a DNA vaccine. For example, another vaccine is administered to a subject at least once before, after, or concurrently with the administration of the recombinant viral vector. Other vaccines for the treatment of HIV include DNA vaccines (pCAGrev / env, Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5: 609-617). The dosage of the DNA vaccine is suitably 5 to 30 mg, preferably 10 to 20 mg.
本発明のウイルスベクターワクチンは、HIV、インフルエンザウイルス、HCV、天然痘ウイルス、ヒトパピロ−マウイルス、ＥＢウイルス、白血病ウイルスなどのウイルス感染症、子宮頸がん、上咽頭がん、悪性リンパ腫などのがんウイルスの感染から発展するがんなどの治療用、さらには予防用ワクチンとしての有効性が期待できる。 The viral vector vaccine of the present invention includes HIV, influenza virus, HCV, smallpox virus, human papilloma virus, EB virus, leukemia virus and other viral infections, cervical cancer, nasopharyngeal cancer, malignant lymphoma and the like. Expected to be effective as a vaccine for the treatment of cancer that develops from infection with cancer virus, and as a preventive vaccine.
＜要約＞
近年のHIVワクチンの開発はHIV clade Bが主流となっている。しかし，世界の半数以上のHIV感染者は発展途上国に多いclade Cに感染している。そのため、HIV-1 clade Cに対するワクチンの開発が早急に求められている。本研究では，HIV Clade Cに対する最適な免疫誘導能を有するワクチンを開発するため、様々な組換えAd5/35ベクターを作成し、マウスにおいて1)野生型とヒト化HIV clade C gag、2)ヒトサイトメガロウィルス(CMV)エンハンサー下流にCMVプロモーター(CMV-IE)とCMV-IE下流にイントロンAが導入されたプロモーター(CMVi)、CMVエンハンサー下流にβ-actinプロモーターと、さらに下流にβ-actinイントロン(CAG)、3)アダプター配列[リボソーム内部認識部位(IRES)、フリン認識部位と2A自己修飾配列(F2A)]あるいは融合遺伝子の下流遺伝子、これらの免疫誘導能を検討した。
<Summary>
In recent years, HIV clade B has become the mainstream for HIV vaccine development. However, more than half of the world's HIV-infected people are infected with clade C, which is common in developing countries. Therefore, there is an urgent need for the development of a vaccine against HIV-1 clade C. In this study, we developed various recombinant Ad5 / 35 vectors to develop vaccines with optimal immunity-inducing ability against HIV Clade C. In mice, 1) wild type and humanized HIV clade C gag, 2) human A CMV promoter (CMV-IE) downstream of the cytomegalovirus (CMV) enhancer, a promoter with intron A introduced downstream of the CMV-IE (CMVi), a β-actin promoter downstream of the CMV enhancer, and a β-actin intron downstream (CAG), 3) The adapter sequence [ribosome internal recognition site (IRES), furin recognition site and 2A self-modifying sequence (F2A)] or the downstream gene of the fusion gene, and their immunity inducing ability were examined.
その結果、ヒト化gag(gagopt)は野生型gagよりも強くgag特異的な細胞性免疫を誘導した。また、CAGが最も強く細胞性免疫を誘導した。さらに、アダプター配列もしくは融合遺伝子の下流に導入したenvタンパク質の発現強度はDNA plasmidでは、F2Aが最も高かったが、Ad5/35ベクターでは融合遺伝子が高かった。以上より、Ad5/35ベクターを使用する場合においてもヒト化HIV遺伝子は有効であり、HIV clade C遺伝子を使用した場合にも強力な免疫誘導能を示すことが示唆された。 As a result, humanized gag (gagopt) induced gag-specific cellular immunity stronger than wild-type gag. CAG was the strongest inducer of cellular immunity. Furthermore, the expression intensity of the env protein introduced downstream of the adapter sequence or the fusion gene was highest in F2A in the DNA plasmid, but higher in the fusion gene in the Ad5 / 35 vector. From the above, it was suggested that the humanized HIV gene is effective even when the Ad5 / 35 vector is used, and that a strong immunity induction ability is exhibited even when the HIV clade C gene is used.
＜緒言＞
ヒト免疫不全症候群(AIDS)の原因ウィルスであるヒト免疫不全ウィルス(HIV)は、Type-1とType-2に大きく分けられる。世界でのHIV感染者は、圧倒的にType-1 HIV(HIV-1)感染者が多い。HIV-1は、AからKまで10種類のcladeに分類されている。
<Introduction>
Human immunodeficiency virus (HIV), the causative virus of human immunodeficiency syndrome (AIDS), is broadly divided into Type-1 and Type-2. The number of HIV-infected people in the world is predominantly Type-1 HIV (HIV-1) infected. HIV-1 is classified into 10 types of clades from A to K.
世界におけるHIV-1感染者の半数以上がインド，中国，アフリカ南部等の発展途上国に多いclade Cに感染している。しかし、現在のHIV-1ワクチン開発の対象はアメリカやヨーロッパ等の先進国に感染者が多いclade Bである。そのため、clade Cに対するワクチンの開発が早急に求められている。 More than half of the HIV-1 people in the world are infected with clade C, which is common in developing countries such as India, China, and southern Africa. However, the current HIV-1 vaccine development target is clade B, which has many infected people in developed countries such as the United States and Europe. Therefore, the development of a vaccine against clade C is urgently required.
過去20年間に渡り、HIVワクチンの開発が行われてきた。開発されているワクチンはHIVサブユニットペプチドワクチン、DNAワクチン、組換えウィルスベクターワクチン(ワクシニアウィルス、アデノウィルス(Ad)、ラビウィルス、フラビウィルス、センダイウィルスやアデノ随伴ウィルス(AAV)を含む)や細菌ベクターワクチンがある。これらのワクチンの中で、複製機能欠損5型Adベクターは遺伝子導入性や免疫原性が高く、ヒトを使った臨床研究もされているベクターである。しかし、このウィルスは初期の接着分子としてコクサッキーウイルス-アデノウイルスレセプター(CAR)を使用しており、CARの発現が高い肝実質細胞への親和性が高く、肝臓にウィルスが蓄積する。このため、その毒性の高さが問題となっている。本研究では、細胞に対する親和性に関わるファイバー部分のみを35型に置換したキメラ型Ad5/35ベクターを使用した。このAd5/35ベクターは、細胞への初期接着分子としてCARではなくほとんどのヒト細胞で発現しているCD46レセプターを使用している。この向性によって、Ad5よりも肝毒性が低いことが報告されている。さらに、Ad5/35はAd5と比較してヒトの樹状細胞に遺伝子導入効率が高く、抗体保有率の低いAd35のファイバーを有しているので、ワクチンとして有用性が高いベクターである。 Over the last 20 years, HIV vaccines have been developed. Developed vaccines include HIV subunit peptide vaccines, DNA vaccines, recombinant virus vector vaccines (including vaccinia virus, adenovirus (Ad), rabivirus, flavivirus, Sendai virus and adeno-associated virus (AAV)) and bacterial vectors There is a vaccine. Among these vaccines, the replication function deficient type 5 Ad vector has high gene transferability and immunogenicity, and is a vector that has been studied in humans. However, this virus uses Coxsackie virus-adenovirus receptor (CAR) as an initial adhesion molecule, has high affinity for hepatocytes with high CAR expression, and the virus accumulates in the liver. For this reason, the high toxicity is a problem. In this study, we used a chimeric Ad5 / 35 vector in which only the fiber part involved in cell affinity was replaced with type 35. This Ad5 / 35 vector uses the CD46 receptor expressed in most human cells instead of CAR as the initial adhesion molecule to cells. This tropism has been reported to be less hepatotoxic than Ad5. Furthermore, Ad5 / 35 has a higher gene transfer efficiency in human dendritic cells than Ad5, and has an Ad35 fiber with a low antibody retention rate, so it is a highly useful vector as a vaccine.
本研究では、遺伝子導入する抗原遺伝子としてgag遺伝子、env遺伝子使用した。gag遺伝子は、HIVのウィルス構造タンパク質であるgagをコードしている遺伝子である。gagタンパク質は最も変異が少なく、よく保存されている。env遺伝子はウィルスを覆う殻エンベロープタンパク質をコードする遺伝子で、中和抗体誘導能が高い。これらの遺伝子は哺乳類のコドンの使用頻度を考慮して、同義置換したもの(ヒト化)を使用している。これにより、哺乳類細胞において、タンパク質の発現量が野生型と比べて高く、DNAワクチンにおいて野生型よりも免疫原性が高いことが報告されている。これらの遺伝子の発現プロモーターとしてCMV、CMVi、CAGを使用した。CMViとCAGはCMVよりもin vitro,in vivo共に下流の遺伝子の発現レベルが高いことが報告されている。また、この２つの遺伝子を一つのベクターで発現させるためにアダプター配列としてIRESとF2Aを使用した。IRESは最初、ポリオウィルスのnon-coding RNAから分離された。現在、脳心筋炎ウィルス由来のIRESは2つの遺伝子を一つのベクターで発現させるためのアダプター配列として広く遺伝子治療や遺伝子導入研究に使用されている。しかし、IRES下流の遺伝子発現量は上流の遺伝子発現量と比べてin vitro,in vivoで低い。F2Aはフリン認識部位と2A自己修飾配列が結合した配列である。2A自己修飾配列は口蹄疫ウィルス(FMDV)由来のオリゴペプチド配列であり、細胞内で自己分割される。以前、AAVベクターによりモノクローナル抗体の誘導のため、使用したF2Aは2A配列単独あるいはIRESよりも機能性のある完全長の抗体が誘導された。これらの知見は、Ad5/35ベクターを使用した場合における詳細な検討は行われていない。 In this study, the gag gene and the env gene were used as antigen genes for gene transfer. The gag gene is a gene encoding gag which is a viral structural protein of HIV. The gag protein has the least mutation and is well conserved. The env gene encodes a shell envelope protein that covers the virus, and has a high neutralizing antibody-inducing ability. These genes have been synonymously substituted (humanized) in consideration of the frequency of mammalian codon usage. As a result, it has been reported that the expression level of the protein in mammalian cells is higher than that of the wild type, and that the DNA vaccine is more immunogenic than the wild type. CMV, CMVi, and CAG were used as expression promoters for these genes. CMVi and CAG have been reported to have higher downstream gene expression levels than CMV both in vitro and in vivo. In addition, IRES and F2A were used as adapter sequences to express these two genes in one vector. IRES was first isolated from poliovirus non-coding RNA. Currently, IRES derived from encephalomyocarditis virus is widely used in gene therapy and gene transfer studies as an adapter sequence for expressing two genes in one vector. However, the gene expression level downstream of IRES is lower in vitro and in vivo than the upstream gene expression level. F2A is a sequence in which a furin recognition site is bound to a 2A self-modifying sequence. The 2A self-modifying sequence is an oligopeptide sequence derived from foot-and-mouth disease virus (FMDV) and is self-divided within the cell. Previously, the monoclonal antibody was induced by the AAV vector, so that the F2A used was derived from the 2A sequence alone or a full-length antibody that is more functional than IRES. These findings have not been examined in detail when Ad5 / 35 vector is used.
本研究では、HIV-1 clade Cに対する最適な免疫誘導能を有するワクチンを開発するため、Ad5/35ベクターを使用し、マウスにおいて1)野生型gagとgagopt，2)CMV、CMViとCAG、3)IRESとF2A、融合遺伝子下流の遺伝子、これらの免疫原性を検討した。 In this study, Ad5 / 35 vector was used to develop a vaccine with the ability to induce optimal immunity against HIV-1 clade C. In mice, 1) wild-type gag and gagopt, 2) CMV, CMVi and CAG, 3 ) IRES and F2A, genes downstream of the fusion gene, and their immunogenicity were examined.
＜材料と方法＞
DNAプラスミドの構築
野生型HIV-1 clade C (96ZM651.8 )gag遺伝子はvT331( AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health, Rockville, MDより分与)からPCR法により増幅された。ヒト化HIV96ZM651.8 gag遺伝子(gagopt)とHIV96ZM651.8 env遺伝子(envopt)はp96ZM651gag-optと p96ZM651gp160-opt(NIHから分与)からそれぞれPCR法により増幅された。増幅された野生型gag断片はCMVi（Gene 272 (2001) 149-156のpCMVL3-1 (Table 1)、内容はp.150 materials and methodsの2.1. Plasmidsに記載されている。）を持つpHMCMV10(大阪大 水口 裕之先生より分与)に導入された(pCMVi-Nativegag)。増幅されたgagopt断片はCMVを持つpHMCMV6(大阪大 水口 裕之先生より分与)とpHMCMV10、さらにCAGを持つpCA5(大阪大 水口 裕之先生より分与)にそれぞれ導入された(pCMV-gagopt、pCMVi-gagopt、pCAG-gagopt)。gagopt-IRES-envoptを作製するために、gagopt断片とenvopt断片はpIRES(Clontech, CA , USA)に導入された。その後、gagopt-IRES-envoptはpCA5に導入された(pCAG-IRES)。gagop-F2A-envoptを作製するために、F2AはRAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号１０）を基にcDNAオリゴが合成され、gagoptとenvoptがF2Aにより結合された。作製したgagopt-F2A-envoptはCAGを持つpCAGGSに導入された。その後、CAG-gagopt-F2A-envopt断片はpHM5(大阪大 水口 裕之先生より分与)に導入された(pCAG-F2A)。さらに、gagopt-envoptを作製するために、gagopt断片とenvopt断片は直接結合させた。その後、gagopt-envopt断片はpCA5に導入させた(pCAG-fusion)。
<Materials and methods>
Construction of DNA Plasmid Wild-type HIV-1 clade C (96ZM651.8) gag gene was amplified by PCR from vT331 (distributed by AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health, Rockville, MD). Humanized HIV 96ZM651.8 gag gene (gagopt) and HIV 96ZM651.8 env gene (envopt) were amplified by PCR from p96ZM651gag-opt and p96ZM651gp160-opt (distributed from NIH), respectively. The amplified wild-type gag fragment has a pHMCMV10 with CMVi (described in pCMVL3-1 (Table 1) of Gene 272 (2001) 149-156, the contents are described in 2.1. Plasmids of p.150 materials and methods)). Introduced by Dr. Hiroyuki Mizuguchi (Osaka University) (pCMVi-Nativegag). The amplified gagopt fragment was introduced into pHMCMV6 with CMV (distributed by Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Osaka University) and pHMCMV10, and also with pCA5 with CAG (distributed by Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Osaka University) (pCMV-gagopt, pCMVi- gagopt, pCAG-gagopt). To make gagopt-IRES-envopt, gagopt and envopt fragments were introduced into pIRES (Clontech, CA, USA). Then gagopt-IRES-envopt was introduced into pCA5 (pCAG-IRES). In order to prepare gagop-F2A-envopt, cDNA oligo was synthesized from F2A based on RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 10), and gagopt and envopt were bound by F2A. The prepared gagopt-F2A-envopt was introduced into pCAGGS with CAG. Subsequently, the CAG-gagopt-F2A-envopt fragment was introduced into pHM5 (distributed by Prof. Hiroyuki Mizuguchi, Osaka University) (pCAG-F2A). Furthermore, in order to produce gagopt-envopt, the gagopt fragment and the envopt fragment were directly combined. Thereafter, the gagopt-envopt fragment was introduced into pCA5 (pCAG-fusion).
Ad5/35ベクターの作製
pCMV-gagopt、pCMVi-Nativegag、pCMVi-gagopt、pCAG-gagopt、pCAG-IRES、pCAG-fusion、pCAG-F2Aは制限酵素I-CeuIとPI-SceIにより、それぞれの遺伝子発現カセットはベクターから切り出され、Ad35ファイバーを持つE1/E3欠損Ad5のゲノムを持つプラスミド(pAdHM34)(大阪大 水口 裕之先生より分与)のE1部位に導入された。それぞれの遺伝子発現カセットを搭載した組換えプラスミドは遺伝子導入試薬であるSuperfect(QIAGEN社)を使って低継代数のHEK293細胞に遺伝子導入させた。2週間後、細胞を回収し、凍結融解を5回行うことによって、組換えウィルスを抽出した。次に、HEK293細胞を用いて組換えウィルスを大量培養し、 超音波装置を用いてウィルスを抽出した。その後、CsCl法によりウィルスを精製した。精製した組換えウィルスはDT Cueriel et al.法を用いウィルス力価(VP)とTCID50法を用いplaque forming unit(PFU)を測定した。
Production of Ad5 / 35 vector
pCMV-gagopt, pCMVi-Nativegag, pCMVi-gagopt, pCAG-gagopt, pCAG-IRES, pCAG-fusion, and pCAG-F2A are cut out from the vector by restriction enzymes I-CeuI and PI-SceI, It was introduced into the E1 site of a plasmid (pAdHM34) with an Ad35 fiber and an E1 / E3-deficient Ad5 genome (distributed by Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Osaka Univ.). Recombinant plasmids carrying the respective gene expression cassettes were introduced into low-passage HEK293 cells using Superfect (QIAGEN), which is a gene introduction reagent. Two weeks later, the cells were harvested and the recombinant virus was extracted by freezing and thawing 5 times. Next, the recombinant virus was mass-cultured using HEK293 cells, and the virus was extracted using an ultrasonic device. Thereafter, the virus was purified by the CsCl method. The purified recombinant virus was measured for virus titer (VP) using DT Cueriel et al. Method and plaque forming unit (PFU) using TCID 50 method.
Western blot解析
それぞれの遺伝子発現カセットを搭載したプラスミドDNAとAd5/35ベクターのgagあるいはenvタンパク質の発現を確認するため、 HeLa細胞を使用した。プラスミドDNA(2μg)をHeLa細胞に遺伝子導入試薬であるlipofectamineTM 2000(invitrogen社)を用いて遺伝子導入し、組換えAdベクターは5moiで感染させた。48時間後、PBS(−)(0.2％ Potassium Dihydrogenphosphate, 0.11% Disodium Hydrogenphosphate, 0.8% Sodium Chloride, 0.02% Potassium Chloride)で2回洗浄し，細胞を回収した。次に、細胞にExtraction Buffer (10mM Tris-HCl, 0.14M NaCl, 1mM Dithiothreitol, 2mM Phenylmethanesulfonylfluoride, 0.5% Nonidet P-40, 3mM MgCl2)を200μl加え、30分間氷上に静置した。静置後、14000rpm、30分間、4℃で遠心分離し、上清を回収した。この上清に200μlの2×SDS buffer (125mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, and 10% beta-mercaptoethanol)を加え、10分間熱処理し、Western blot用のサンプルとした。このサンプルは8％ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動した。その際、野生型gagのサンプルはプラスミドDNAでは10倍、Adベクターでは50倍ロードし、泳動した。その後、ImmobilonTM Transfer Menbranes(MLLIPORE社)に転写した。このメンブレンをBlocking Buffer(5％ skim milk, PBS-T(PBS(-), 0.05%Tween 20)で4℃、16時間、シェイキングした。一次抗体として、抗p24抗体(ハイブリドーマから作製)、抗p120抗体(ハイブリドーマから作製)あるいは内部コントロールとして抗β-actin抗体(AC-15, SIGMA社)を1時間反応させた。その後、3回PBS-Tで洗浄し、2次抗体として1/1000希釈したHorseradish peroxidase(HRP)標識抗マウスIgG抗体(Cappel社)を１時間反応させた。次に、3回PBS-Tで洗浄し、メンブランにImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(MILLIPRE社)を5分間反応させ、HyperfilmTM(Amersham. Buckinghamshire. UK)に感光した。感光したフィルムはImageJ softwareを用いて解析し、Relative densityを算出した。
Western blot analysis HeLa cells were used to confirm the expression of gag or env protein of plasmid DNA and Ad5 / 35 vector carrying each gene expression cassette. Plasmid DNA (2 μg) was transfected into HeLa cells using lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) as a gene introduction reagent, and the recombinant Ad vector was infected at 5 moi. After 48 hours, the cells were collected by washing twice with PBS (−) (0.2% Potassium Dihydrogenphosphate, 0.11% Disodium Hydrogenphosphate, 0.8% Sodium Chloride, 0.02% Potassium Chloride). Next, 200 μl of Extraction Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.14 M NaCl, 1 mM Dithiothreitol, 2 mM Phenylmethanesulfonylfluoride, 0.5% Nonidet P-40, 3 mM MgCl 2 ) was added to the cells and allowed to stand on ice for 30 minutes. After standing, the mixture was centrifuged at 14000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. Add 200 μl of 2 × SDS buffer (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, and 10% beta-mercaptoethanol) to this supernatant, heat-treat for 10 minutes, and use for Western blot Samples of This sample was run using an 8% polyacrylamide gel. At that time, the wild-type gag sample was loaded 10 times for plasmid DNA and 50 times for Ad vector, and then electrophoresed. Then, it transferred to Immobilon TM Transfer Menbranes (MLLIPORE). This membrane was shaken with Blocking Buffer (5% skim milk, PBS-T (PBS (-), 0.05% Tween 20) for 16 hours at 4 ° C. As primary antibodies, anti-p24 antibody (prepared from hybridoma), anti-p120 Antibody (prepared from hybridoma) or anti-β-actin antibody (AC-15, SIGMA) as an internal control was allowed to react for 1 hour, then washed 3 times with PBS-T and diluted 1/1000 as secondary antibody Horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG antibody (Cappel) was reacted for 1 hour, then washed 3 times with PBS-T, and the membrane was allowed to react with Immobilon ™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPRE) for 5 minutes. The film was exposed to Hyperfilm ™ (Amersham. Buckinghamshire. UK) The exposed film was analyzed using ImageJ software, and the relative density was calculated.
組換えAd5/35ベクターによるマウスへの免疫
ケタラール(三共エール薬品社)/セラクタール(バイエルメディカル. Japan)を用いて，Balb/cマウス(8週齢，♀，5匹/群)に麻酔した。その後、マウスの大腿部に108pfu/mouse相当の組換えAd5/35ベクターを投与した。また、ネガティブコントロールとして，LacZ遺伝子を搭載したAd5/35ベクターも同量投与した。投与後、10日、4週目に眼窩採血し、血液、血清サンプルをそれぞれ得た。
Balb / c mice (8 weeks old, rabbits, 5 mice / group) were anesthetized using immuno-Ketaral (Sankyo Yale Yakuhin Co., Ltd.) / Seractal (Bayer Medical. Japan) with recombinant Ad5 / 35 vector . Thereafter, a recombinant Ad5 / 35 vector corresponding to 10 8 pfu / mouse was administered to the thigh of the mouse. As a negative control, the same amount of Ad5 / 35 vector carrying LacZ gene was administered. Orbital blood sampling was performed on the 10th and 4th week after administration to obtain blood and serum samples, respectively.
テトラマーアッセイ
HIV clade C gag特異的なCD8陽性T細胞の頻度を測定するため、phycoerythrin(PE)標識H-2Kd/Cp24テトラマー(ペプチド:AMQMLKDTI（配列番号１４）)を使った。このテトラマーはNational Institute of Allergy and Infectious Disease MHC Tetramer Core Facility (Yerkes Reglonal Primate Research Center, Atlanta, GA, USA)で作製された。まず、組換えAd5/35ベクター投与後10日目の血液サンプル 100μlに0.1μlのテトラマーと0.25μlのfluorescein isothicyanate(FITC)標識抗マウスCD8a抗体(0.5mg/ml,Ly-2,eBioscience社)を加え30分間、室温で反応させた。次に、OptiLyse B Lysing solution(BECKMAN COULTER社)を100μl加え、10分間静置後、1mlの滅菌水を加え、さらに10分間静置した。その後、staining buffer(3%FCS,0.09% NaN3,PBS)で2回洗浄し、flow cytometry(Becton Dickinson,Franklin Lakes, NJ)を用いて解析した。
Tetramer assay
In order to measure the frequency of CD8 positive T cells specific for HIV clade C gag, phycoerythrin (PE) -labeled H-2K d / Cp24 tetramer (peptide: AMQMLKDTI (SEQ ID NO: 14)) was used. This tetramer was produced at the National Institute of Allergy and Infectious Disease MHC Tetramer Core Facility (Yerkes Reglonal Primate Research Center, Atlanta, GA, USA). First, 0.1 μl of tetramer and 0.25 μl of fluorescein isothicyanate (FITC) -labeled anti-mouse CD8a antibody (0.5 mg / ml, Ly-2, eBioscience) was added to 100 μl of blood sample 10 days after administration of recombinant Ad5 / 35 vector. The mixture was further reacted at room temperature for 30 minutes. Next, 100 μl of OptiLyse B Lysing solution (BECKMAN COULTER) was added and allowed to stand for 10 minutes, then 1 ml of sterilized water was added, and the mixture was further allowed to stand for 10 minutes. Then, it was washed twice with staining buffer (3% FCS, 0.09% NaN 3 , PBS) and analyzed using flow cytometry (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
多機能細胞内サイトカイン染色解析(multi-ICSアッセイ)
HIV clade C gag特異的で多機能的なCD8陽性T細胞数を測定するため，multi-ICSアッセイを行った。組換えAd5/35ベクター投与後10日目の血液サンプル 200μlに2mlの1x Lysing Buffer(BD Bioscience社)を加えて15分間反応させ，赤血球を取り除いた。その後、2回 RPMI培地(10％Fetal calf serum, 5ml Pen Strep(GIBCO社)、RPMI-1640(Wako社))で洗浄し、1mlのRPMI培地に懸濁した。次に、PSSM-8(SHIMADZU BIOTECH:KYOTO JAPAN)のプロトコールに従い作製したHIV96ZM651.8 p24ペプチド(AMQMLKDTI)（配列番号１４） 10μg/mlと1μlのFITC標識抗マウスCD107a抗体(0.5mg/ml,1D4B, SouthernBiotech, Birmingham, USA)を加えて、5%CO2、37℃、1時間培養した。その後、1μlのGolgiStop(1μl/ml,BD BioScience社)を加え，さらに 5%CO2、37℃、5時間培養した。培養後、2回Staining Bufferを用いて洗浄し、0.5μlのallophycocyanin (APC) -Cy7標識抗マウスCD8a抗体(0.2mg/ml, BioLegend, San Diego, CA)を加え、4℃、30分間反応させた。2回staining bufferを用いて洗浄後、250μlのCytofix/cytoperm solution(BD Bioscience社)を加え、4℃、15分間静置し、2回1x Perm/Wash solution(BD Bioscience社)で洗浄した。次に、1μlのPE標識抗マウスインターフェロン(IFN)-γ抗体(0.2mg/ml, XMG1.2, eBioscience社)と1μlのAPC標識抗マウス腫瘍壊死因子(TNF)-α抗体(0.2mg/ml,XMG1.2, eBioscience社)を加え、4℃、30分間反応させた。その後、2回1x Perm/Wash solution(BD Bioscience社)で洗浄し、flow cytometry(Moflo, BECKMAN COULTER社)を用いて解析した。
Multifunctional intracellular cytokine staining analysis (multi-ICS assay)
A multi-ICS assay was performed to measure the number of CD8 + T cells specific to HIV clade C gag and multifunctional. On the 10th day after administration of the recombinant Ad5 / 35 vector, 2 ml of 1x Lysing Buffer (BD Bioscience) was added to 200 μl of blood sample and reacted for 15 minutes to remove erythrocytes. Then, it was washed twice with RPMI medium (10% Fetal calf serum, 5 ml Pen Strep (GIBCO), RPMI-1640 (Wako)) and suspended in 1 ml of RPMI medium. Next, HIV 96ZM651.8 p24 peptide (AMQMLKDTI) (SEQ ID NO: 14) prepared according to the protocol of PSSM-8 (SHIMADZU BIOTECH: KYOTO JAPAN) 10 μg / ml and 1 μl of FITC-labeled anti-mouse CD107a antibody (0.5 mg / ml, 1D4B, SouthernBiotech, Birmingham, USA) was added, and the cells were cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, 1 μl of GolgiStop (1 μl / ml, BD BioScience) was added, and further cultured at 5% CO 2 at 37 ° C. for 5 hours. After incubation, wash twice with Staining Buffer, add 0.5 μl allophycocyanin (APC) -Cy7-labeled anti-mouse CD8a antibody (0.2 mg / ml, BioLegend, San Diego, CA), and react at 4 ° C for 30 minutes. It was. After washing twice with a staining buffer, 250 μl of Cytofix / cytoperm solution (BD Bioscience) was added, left at 4 ° C. for 15 minutes, and washed twice with 1 × Perm / Wash solution (BD Bioscience). Next, 1 μl of PE-labeled anti-mouse interferon (IFN) -γ antibody (0.2 mg / ml, XMG1.2, eBioscience) and 1 μl of APC-labeled anti-mouse tumor necrosis factor (TNF) -α antibody (0.2 mg / ml XMG1.2, eBioscience) was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the cells were washed twice with 1 × Perm / Wash solution (BD Bioscience) and analyzed using flow cytometry (Moflo, BECKMAN COULTER).
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)法によるHIV clade gag特異的抗体の検出
HIV96ZM651.8 p24タンパク質を1μg/mlになるように0.1M biocarbonate buffer(pH9.0)に溶解してよく混合した後、96well ELISA plate( NUNC:TOKYO JAPAN)に100μl/well加えて、4℃、16時間静置した(コーティング)。その後、コーティングしていたタンパク質を除き、Blocking buffer(1% BSA, PBS-T)を用いて37℃、2時間静置した(ブロッキング)。次に、4週目に採血して得た血清をblocking bufferで希釈した(1/100〜1/3200)。Blocking bufferを取り除いた後、希釈した血清を100μl/well移し、37℃、2時間静置した。3回PBS-Tを用いて洗浄し、1/1000希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Cappel社)を100μl/well加えて、37℃、2時間静置した。5回PBS-Tを用いて洗浄後、発色液(0.1M クエン酸 buffer(10mM citric acid, 25mM Na2HPO4, pH5.6), 1.3mg/ml OPD(α-フェニレンジアミノ二塩酸塩:Wako社)、0.1％過酸化水素)100μl/well加えて、遮光し、室温で15分間反応させた(発色)。1M H2SO4を50μl/well加えて、反応を停止させ、Benchmark Plus(Bio-Rad社)で450nmの吸光度を測定した。
Detection of HIV clade gag-specific antibodies by Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
Dissolve HIV 96ZM651.8 p24 protein in 0.1M biocarbonate buffer (pH 9.0) to 1μg / ml, mix well, add 100μl / well to 96well ELISA plate (NUNC: TOKYO JAPAN), and add 4 ° C. And allowed to stand for 16 hours (coating). Thereafter, the coated protein was removed, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours using blocking buffer (1% BSA, PBS-T) (blocking). Next, serum obtained by collecting blood at 4 weeks was diluted with blocking buffer (1/100 to 1/3200). After removing the blocking buffer, the diluted serum was transferred to 100 μl / well and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. After washing with PBS-T three times, 100 μl / well of HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Cappel) diluted 1/1000 was added and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. After washing with PBS-T 5 times, the coloring solution (0.1 M citric acid buffer (10 mM citric acid, 25 mM Na 2 HPO 4 , pH 5.6), 1.3 mg / ml OPD (α-phenylenediamino dihydrochloride: Wako ), 0.1% hydrogen peroxide) 100 μl / well, protected from light, and allowed to react at room temperature for 15 minutes (color development). 1 MH 2 SO 4 was added at 50 μl / well to stop the reaction, and the absorbance at 450 nm was measured with Benchmark Plus (Bio-Rad).
統計解析
すべての値は±standard error(S.E.)として示した。実験データの統計解析はStatView softwareを用いて、t検定を行った。統計解析において、P < 0.05で有意性を認めた。
Statistical analysis All values are shown as ± standard error (SE). Statistical analysis of the experimental data was performed with t-test using StatView software. Statistical analysis showed significance at P <0.05.
＜結果＞
HIV clade C gag遺伝子の発現解析
野生型gag発現カセット及びgagopt発現カセットの概略図は[図1]に示した。これらの発現カセットを搭載したplasmidDNA及びAd5/35ベクターはHeLa細胞にそれぞれ遺伝子導入、感染させ、HIV96ZM651.8 gagタンパク質の発現をwestern blottingによって確認した。各レーンに見られたバンドは抗Cp24モノクローナル抗体によって検出された(図 2)。各バンドをImageJ softwareを用いて解析した。野生型gagとgagopt及びプロモーター間におけるgagopt、それぞれの発現強度を比較するため、Relative densityを算出した[図2(A)(B)]。その結果、野生型gagとgagoptの発現強度を比較すると、plasmidベクターでは36倍、Ad5/35ベクターでは221倍とgagoptの発現強度が高かった。一方、プロモーター間におけるgagoptの発現強度を比較すると、plasmidベクターでは同程度だったが、Ad5/35ベクターでは若干CAGプロモーターが高かった。
<Result>
Expression analysis of HIV clade C gag gene A schematic diagram of the wild type gag expression cassette and the gagopt expression cassette is shown in FIG. The plasmid DNA and Ad5 / 35 vector carrying these expression cassettes were transfected into HeLa cells and infected, respectively, and the expression of HIV 96ZM651.8 gag protein was confirmed by western blotting. The band seen in each lane was detected by anti-Cp24 monoclonal antibody (FIG. 2). Each band was analyzed using ImageJ software. In order to compare the expression intensity of wild-type gag and gagopt, and gagopt between promoters, Relative density was calculated [FIG. 2 (A) (B)]. As a result, when the expression intensity of wild-type gag and gagopt was compared, the expression intensity of gagopt was 36 times higher in the plasmid vector and 221 times higher in the Ad5 / 35 vector. On the other hand, when comparing the expression intensity of gagopt between the promoters, it was similar in the plasmid vector, but the CAG promoter was slightly higher in the Ad5 / 35 vector.
HIV clade C gag特異的な免疫原性の比較
野生型gagとgagopt及びプロモーター間におけるgagoptの免疫原性を比較するために、それぞれのHIV-1 Clade C gag発現カセットを搭載したAd5/35ベクターをマウスに投与し、さらにコントロールとしてLacZ遺伝子を搭載したAd5/35ベクターも投与した。免疫後10日目に、HIV-1 Clade C gag特異的な細胞性免疫反応をテトラマーアッセイとmulti-ICSアッセイにより検出した。テトラマーアッセイの結果、それぞれの投与群におけるgag特異的なCD8陽性リンパ球の頻度は [図3]のようになり、Ad-CMVi-Native gag投与群はcontrol群と同程度だった。統計解析した結果、gagoptは野生型gagよりも有意的に高かった (P < 0.01)。またプロモーター間で比較すると、CAGプロモーターが最も有意的に高かった(versus CMV:P <0.01, versus CMVi:P < 0.05)。
Comparison of immunogenicity specific to HIV clade C gag In order to compare the immunogenicity of gagopt between wild-type gag and gagopt and promoter, Ad5 / 35 vector carrying each HIV-1 Clade C gag expression cassette was used. The mice were administered with an Ad5 / 35 vector carrying the LacZ gene as a control. On the 10th day after immunization, HIV-1 Clade C gag specific cellular immune response was detected by tetramer assay and multi-ICS assay. As a result of the tetramer assay, the frequency of gag-specific CD8 positive lymphocytes in each administration group was as shown in [Fig. 3], and the Ad-CMVi-Native gag administration group was similar to the control group. As a result of statistical analysis, gagopt was significantly higher than wild-type gag (P <0.01). When compared between promoters, the CAG promoter was most significantly higher (versus CMV: P <0.01, versus CMVi: P <0.05).
次に、multi-ICSアッセイの結果、それぞれの投与群におけるIFN-γ分泌(1function)、IFN-γ+TNF-α分泌あるいはIFN-γ+CD107a分泌(2function)、さらに IFN-γ+TNF-α+CD107a分泌(3function)するCD8陽性細胞の頻度は[図 4]のようになり、Ad-CMVi-Native gag投与群はcontrol群と同程度だった。統計解析した結果gagoptは野生型gagよりも1function・2function・3functionすべてにおいて有意的に高かった(P < 0.01)。プロモーター間で比較すると、CAGプロモーターが1function(P < 0.01)及び2function(P < 0.05)において有意的に高かった。しかし、3functionにおいて、有意差はなかった。 Next, as a result of the multi-ICS assay, IFN-γ secretion (1 function), IFN-γ + TNF-α secretion or IFN-γ + CD107a secretion (2 function) in each administration group, and IFN-γ + TNF-α The frequency of CD8 positive cells that secrete + CD107a (3 function) is as shown in [Fig. 4], and the Ad-CMVi-Native gag administration group was similar to the control group. Statistical analysis revealed that gagopt was significantly higher in all 1function, 2function, and 3function than wild-type gag (P <0.01). When compared between promoters, the CAG promoter was significantly higher in 1 function (P <0.01) and 2 function (P <0.05). However, there was no significant difference in 3function.
免疫後4週目に、それぞれのHIV clade C gag特異的な抗体価を測定するため、ELISAを行った。採取した血清は1/100から1/3200まで希釈された。それぞれの免疫群及び希釈率における抗体価は[図5]のようになり、Ad-CMVi-Native gag投与群はcontrol群と同程度だった。統計解析した結果、どの希釈率においても、gagoptは野生型gagよりも有意的に高かった(P < 0.01)。一方、プロモーター間で比較するとCAGはCMVよりもどの希釈率においても有意的に低かったが、CMViとは有意差はなかった。 Four weeks after immunization, ELISA was performed in order to measure each HIV clade C gag specific antibody titer. The collected serum was diluted from 1/100 to 1/3200. The antibody titer in each immunization group and dilution ratio was as shown in [FIG. 5], and the Ad-CMVi-Native gag administration group was similar to the control group. As a result of statistical analysis, gagopt was significantly higher than wild-type gag at any dilution rate (P <0.01). On the other hand, when compared between promoters, CAG was significantly lower than CMV at any dilution ratio, but there was no significant difference from CMVi.
HIV clade C env遺伝子の発現の解析
gagタンパク質とenvタンパク質を1つのプロモーターで同時に発現させるためにアダプター配列として、IRESあるいはF2Aを用い、gagopt-IRES-envopt とgagopt-F2A-envoptを作製した。またこの2つの遺伝子を融合タンパクとして発現させるgagopt-envoptも作製した。それぞれの遺伝子の発現カセットの概略図は[図6]に示した。それぞれの遺伝子発現カセットはDNA plasmidベクター及びAd5/35ベクターに組込んだ。これらの遺伝子カセットを搭載したDNA plasmidとAd5/35ベクターをHeLa細胞に遺伝子導入あるいは感染させ、envタンパク質の発現はwestern blottingによって確認した。各レーンに見られたバンドは抗Cgp120抗体によって検出した[図7]。各レーンのバンドはImageJ softwareを用いて解析した。それぞれのサンプルにおけるenvタンパク質の発現強度を比較するため、Relative densityを算出した[図7(A)(B)]。結果、DNA pladmidではIRES:fusion:F2Aが1:6:12となり、pCAG-F2Aが最も値が高く、pCAG-fusionの2倍、pCAG-IRESの12倍となった。一方、Ad5/35ベクターではIRES:fusion:F2Aが1:1.6:1.1となり、fusion
が最も高かった。
Analysis of HIV clade C env gene expression
gagopt-IRES-envopt and gagopt-F2A-envopt were prepared using IRES or F2A as an adapter sequence to simultaneously express gag protein and env protein with one promoter. We also created gagopt-envopt that expresses these two genes as fusion proteins. A schematic diagram of the expression cassette of each gene is shown in FIG. Each gene expression cassette was incorporated into DNA plasmid vector and Ad5 / 35 vector. DNA plasmid loaded with these gene cassettes and Ad5 / 35 vector were transfected or infected into HeLa cells, and expression of env protein was confirmed by western blotting. The band seen in each lane was detected by anti-Cgp120 antibody [FIG. 7]. Bands in each lane were analyzed using ImageJ software. In order to compare the expression intensity of env protein in each sample, Relative density was calculated [FIGS. 7 (A) (B)]. As a result, in DNA pladmid, IRES: fusion: F2A was 1: 6: 12, and pCAG-F2A had the highest value, twice that of pCAG-fusion and 12 times that of pCAG-IRES. On the other hand, with Ad5 / 35 vector, IRES: fusion: F2A becomes 1: 1.6: 1.1
Was the highest.
＜考察＞
本研究ではHIV-1 Clade Cに対する最適な免疫誘導能を有するワクチンを開発するため、Ad5/35ベクターを使用し，マウスにおいて1)HIV Clade Cの野生型gagとgagopt、2)CMV、CMViとCAG、3)IRESとF2A、融合遺伝子(fusion)の下流に導入した遺伝子の発現強度を検討した。その結果、1)gagoptが野生型gagよりも高い細胞性及び液性免疫を誘導した。2)CAGはHIV Clade C gag特異的な細胞性免疫の量及び質共にCMVとCMViよりも高かったが、液性免疫ではCMVとCMViよりも低かった。3)下流に導入したenvのタンパク質の発現強度を比較すると、DNA plasmidではF2Aが最も強かったが、Ad5/35ベクターでは若干fusionが強かった。
<Discussion>
In this study, Ad5 / 35 vector was used to develop a vaccine with optimal immunity-inducing ability against HIV-1 Clade C. In mice, 1) HIV Clade C wild-type gag and gagopt, 2) CMV, CMVi and CAG, 3) IRES and F2A, the expression intensity of genes introduced downstream of the fusion gene (fusion) was examined. As a result, 1) gagopt induced higher cellular and humoral immunity than wild-type gag. 2) CAG was higher in the amount and quality of HIV Clade C gag-specific cellular immunity than CMV and CMVi, but lower in humoral immunity than CMV and CMVi. 3) Comparing the expression intensity of the env protein introduced downstream, F2A was the strongest in the DNA plasmid, but the fusion was slightly stronger in the Ad5 / 35 vector.
現在、およそ20の防御用のHIVワクチンとおよそ20の治療用HIVワクチンが臨床試験されており、このうちのいくつかは臨床試験第II相に入っている(http://aidsinfo.nih.gov/Vaccines/) 。これらのワクチンの多くは北米やヨーロッパ、日本などの先進国に流行しているHIVのsubtypeである clade Bを対象としている。しかし、世界のおよそ半数以上がインド、中国、アフリカ南部等の発展途上国に流行しているHIVのsubtypeであるClade Cに感染している。そのため、clade Cに対するワクチンの開発が求められている。 Currently, approximately 20 protective HIV vaccines and approximately 20 therapeutic HIV vaccines are in clinical trials, some of which are in Phase II clinical trials (http://aidsinfo.nih.gov / Vaccines /). Many of these vaccines target clade B, an HIV subtype that is prevalent in developed countries such as North America, Europe, and Japan. However, more than half of the world is infected with Clade C, an HIV subtype prevalent in developing countries such as India, China, and southern Africa. Therefore, the development of a vaccine against clade C is required.
本研究では、HIV clade C 野生型gagとgagoptにおけるgagタンパク質の発現強度をHeLa細胞で確認し、gagoptで発現強度が高い結果を得た。これは、微生物におけるコドンの使用頻度とヒトにおけるコドンの使用頻度は異なっており、ヒトのコドン使用頻度を考慮し、同義置換したgagoptはヒト細胞においてgagタンパク質の発現が強化されているためであると考えられる。また、gagoptを使用したDNAワクチンにおいて免疫原性が高いことが報告されている。しかし、Adベクターを用いた野生型gagとgagoptの免疫原性の比較は行われていない。DNA plasmidとウィルスベクターにおけるgagタンパク質のRelative densityの結果を比較すると、ウィルスベクターにおいて値が高かった。これは、DNA plasmidよりもウィルスベクターの遺伝子導入効率が高いことによると考えられる。 In this study, we confirmed the expression intensity of gag protein in HIV clade C wild type gag and gagopt in HeLa cells, and obtained high expression intensity in gagopt. This is because the frequency of codon usage in microorganisms differs from the frequency of codon usage in humans, and considering the frequency of human codon usage, synonymously substituted gagopt has enhanced expression of gag protein in human cells. it is conceivable that. Moreover, it is reported that the DNA vaccine using gagopt has high immunogenicity. However, comparison of the immunogenicity of wild-type gag and gagopt using Ad vector has not been performed. When the results of the relative density of the gag protein in the DNA plasmid and the viral vector were compared, the values were higher in the viral vector. This is considered to be due to the higher gene transfer efficiency of the virus vector than the DNA plasmid.
HIVに対する免疫よるウィルス抑制において、細胞性免疫反応が重要であることが知られている。これは、ウィルス特異的なCD8陽性T細胞反応がウィルスの初期増殖を起こす急性感染時に起こるからである。さらに、HIVのコアタンパク質であるgagに特異的なT細胞反応はHIVの感染者において、ウィルス増殖の抑制に関係していると報告されている。そこで本研究では、それぞれのHIV Clade C gag発現カセットを搭載したAd5/35ベクターをマウスに筋肉内投与し、HIV Clade C gag特異的な細胞性免疫反応の比較を行った。細胞性免疫反応を測定するために、テトラマーアッセイ及びmulti-ICSアッセイを行った。テトラマーアッセイは抗原ペプチド・主要組織適合性抗原(MHC)複合体を四量体化したMHCテトラマーを用いて抗原特異的なT細胞の細胞数や頻度を直接定量する。一方、ICSアッセイは免疫系細胞を抗原ペプチドによって刺激することによって、抗原ペプチド特異的な細胞内のサイトカイン産生能を解析することができる。さらに、多くの標識抗体を用いることによって、抗原特異的な細胞のサイトカイン産生、脱顆粒、増殖能等、多機能的に解析することができる(multi-ICSアッセイ)。HIV長期未発症者は、多くの機能を有するHIV特異的なCD8陽性T細胞を有しており、単独の機能よりも多機能的にCD8陽性T細胞を解析することは重要である。本研究では解析するサイトカインとしてIFN-γとTNF-α、さらに脱顆粒マーカーであるCD107aを用いた。テトラマーアッセイ及びmulti-ICSアッセイの結果、gagoptでgag特異的なCD8陽性T細胞性の量及び質共に野生型gagよりも有意的に高かった。これはgagタンパク質の発現強度が高いものほど、誘導されるgag特異的なCD8陽性T細胞反応が高くなったと考えられる。一方、プロモーター間で比較すると、CAGを使用したものでgag特異的なCD8陽性T細胞性の量及び質共に有意的に高かった。これは、抗原タンパク質を発現する細胞によるのではないかと考えられる。今回、Ad5/35ベクターをマウスの筋肉内に投与した。つまり、抗原タンパク質は筋肉細胞内で発現していると考えられる。以前、CAGは筋肉細胞内においてCMVやCMViよりも遺伝子の発現が強いと報告されている。このように、抗原タンパク質の発現が強いと、誘導される細胞性免疫の量及び質共に上昇するのではないかと考えられる。 It is known that the cellular immune response is important in virus suppression by immunity against HIV. This is because a virus-specific CD8-positive T cell response occurs during acute infections that cause early viral growth. Furthermore, it has been reported that a T cell response specific to gag, the core protein of HIV, is associated with suppression of virus growth in HIV-infected persons. Therefore, in this study, Ad5 / 35 vectors carrying the respective HIV Clade C gag expression cassettes were administered intramuscularly to mice, and the cellular immune responses specific to HIV Clade C gag were compared. Tetramer and multi-ICS assays were performed to measure cellular immune responses. The tetramer assay directly quantifies the number and frequency of antigen-specific T cells using MHC tetramers obtained by tetramerizing an antigen peptide / major histocompatibility antigen (MHC) complex. On the other hand, the ICS assay can analyze the intracellular cytokine production ability specific to an antigen peptide by stimulating immune system cells with the antigen peptide. Furthermore, by using many labeled antibodies, it is possible to analyze multifunctionally such as cytokine production, degranulation and proliferation ability of antigen-specific cells (multi-ICS assay). Those who have not yet developed HIV have HIV-specific CD8-positive T cells with many functions, and it is important to analyze CD8-positive T cells multifunctionally rather than a single function. In this study, IFN-γ and TNF-α were used as cytokines to be analyzed, and CD107a, a degranulation marker, was used. As a result of the tetramer assay and the multi-ICS assay, both the amount and quality of gag-specific and gag-specific CD8 positive T cells were significantly higher than those of wild-type gag. This is probably because the higher the expression intensity of the gag protein, the higher the induced gag-specific CD8-positive T cell response. On the other hand, when comparing between promoters, the amount and quality of gag-specific CD8-positive T cells were significantly higher when CAG was used. This is thought to be due to cells expressing the antigenic protein. This time, Ad5 / 35 vector was administered intramuscularly in mice. That is, it is considered that the antigen protein is expressed in muscle cells. Previously, CAG has been reported to have higher gene expression in muscle cells than CMV and CMVi. Thus, it is considered that when the expression of the antigen protein is strong, both the amount and quality of the induced cellular immunity increase.
免疫後四週目において、gag特異的な抗体価を測定した。抗体価を比較した結果、gagoptは野生型gagよりも抗体価が高かった。これにおいても、gagoptはgagタンパク質の発現が強いことによると考えられる。一方、プロモーター間で比較すると、細胞性免疫反応とは異なり、CAGがCMVとCMViよりも抗体価が低かった。これは、細胞性免疫反応が優位となり、液性免疫反応が低くなってしまったのではないかと考えられる。しかし、CD4T細胞が細胞性免疫に機能するTh1あるいは液性免疫に機能するTh2に分化しているのかを調べる等、更なる検討が必要である。 At the fourth week after immunization, gag-specific antibody titers were measured. As a result of comparing antibody titers, gagopt had a higher antibody titer than wild-type gag. Again, gagopt is thought to be due to the strong expression of gag protein. On the other hand, when compared between promoters, CAG had a lower antibody titer than CMV and CMVi, unlike cellular immune responses. This is thought to be because the cellular immune response was dominant and the humoral immune response was lowered. However, further studies are required, such as examining whether CD4T cells have differentiated into Th1 that functions in cellular immunity or Th2 that functions in humoral immunity.
本研究では、一つのベクターでgagoptだけでなく抗体の誘導能が高いenvoptも発現させる方法として、アダプター配列であるIRES及びF2Aを使用あるいは2つの遺伝子を直接結合させた(fusion)。それぞれ作製した遺伝子発現カセットをもつDNA plasmid及びAd5/35ベクターをHeLa細胞でenvタンパク質の発現強度を比較した。その結果、DNA plasmidにおいてF2Aの使用が最も強く、IRESが最も弱かった。DNA plasmidにおける2つ目の遺伝子の発現強度の違いは、IRESとF2Aにおける発現様式の違いによると考えられる。IRES下流の遺伝子は上流にあるプロモーターによる発現ではなく、IRES配列にリボソームが結合することによって下流の遺伝子が翻訳される。つまり、IRES依存の発現様式をとる。一方、F2Aはプロモーターによって、1番目の遺伝子と2番目の遺伝子はF2Aペプチドで結合した一つのタンパク質として翻訳される。その後、F2Aペプチドは分割され、2つのタンパク質は別々になる。つまりCAP依存の発現様式をとり、2つ目の遺伝子発現はIRES依存よりCAP依存の発現が強いという報告と一致した。しかし、F2Aペプチドの2AペプチドはFMDV由来のペプチドであるので、臨床応用を考えた場合、安全性に問題がある。一方、Ad5/35ベクターにおける、envの発現強度を見ると、fusionが最も強く、F2AとIRESは同程度となり、DNA plasmidの結果と一致しなかった。これは、Ad5/35ベクターではIRES下流、fusion下流の遺伝子の発現が増強されるあるいはF2A下流の遺伝子の発現が低下するなど考えられるが、LacZ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を用いて、更なる検討が必要である。 In this study, as a method of expressing not only gagopt but also envopt with high antibody inducing ability in one vector, adapter sequences IRES and F2A were used, or two genes were directly linked (fusion). The expression intensity of env protein was compared in HeLa cells using DNA plasmids and Ad5 / 35 vectors with gene expression cassettes, respectively. As a result, F2A was the strongest and IRES was the weakest in the DNA plasmid. The difference in the expression intensity of the second gene in DNA plasmid is thought to be due to the difference in the expression pattern between IRES and F2A. The gene downstream of IRES is not expressed by an upstream promoter, but the downstream gene is translated by binding of the ribosome to the IRES sequence. In other words, it takes an IRES-dependent expression pattern. On the other hand, F2A is translated by a promoter, and the first and second genes are translated as a single protein linked by the F2A peptide. The F2A peptide is then split and the two proteins become separate. In other words, the CAP-dependent expression pattern was adopted, and the second gene expression was consistent with the report that CAP-dependent expression was stronger than IRES-dependent expression. However, since the 2A peptide of the F2A peptide is a peptide derived from FMDV, there is a problem in safety when considering clinical application. On the other hand, in the expression intensity of env in Ad5 / 35 vector, fusion was strongest, F2A and IRES were comparable, and did not agree with the DNA plasmid results. This is because Ad5 / 35 vector may enhance the expression of genes downstream of IRES and fusion, or decrease the expression of genes downstream of F2A, but it may be further reduced by using a reporter gene such as LacZ gene or luciferase gene. Need to be considered.
本研究において、Ad5/35ベクターにおいてCAGとgagoptの組み合わせがgag特異的な細胞性免疫の量及び質共に最適であることがわかった。このAd5/35-CAG-gagoptは、新しいHIVワクチンとして臨床への応用のみならず、CAG-gagoptの発現カセットは他のAdベクターへの応用が可能であると考えている。 In this study, it was found that the combination of CAG and gagopt in Ad5 / 35 vector is optimal in both the amount and quality of gag-specific cellular immunity. This Ad5 / 35-CAG-gagopt is considered to be applicable not only to clinical applications as a new HIV vaccine, but also to CAG-gagopt expression cassettes to other Ad vectors.
本発明は、Ad5/35ベクター以外のウイルスベクター、HIV-1のgag遺伝子以外の抗原遺伝子にも応用可能である。 The present invention can also be applied to viral vectors other than Ad5 / 35 vectors and antigen genes other than HIV-1 gag gene.
本発明は、医薬品分野、特にワクチンとして利用可能である。 The present invention can be used in the pharmaceutical field, particularly as a vaccine.
<配列番号１>
野生型HIV96ZM651.8gag遺伝子のDNA配列。
atgggtgcgagagcgtcaatattaagagggggaaaattagataaatgggaaaaaattaggctaaggccagggggaaagaaacgctatatgataaaacacctagtatgggcaagcagggagctggaaagatttgcgcttaaccctggccttttagaaacatcagaaggctgtaaacaaataatgaaacagctacaaccagctcttcagacaggaacggaggaacttagatcattatacaacacagtagcaactctctattgtgtacatgaaggggtagaggtacgagacaccaaggaagccttagacaggatagaggaagaacaaaacaaaattcagcaaaaaatacagcaaaaaacacagcaagcggctgacggaaaggtcagtcaaaattatcctatagtgcagaatctccaagggcaaatggtacaccagaaactatcacctagaactttgaatgcatgggtaaaagtaatagaagaaaaagcttttagcccagaggtaatacccatgtttacagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgttaaatacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagatactatcaatgaggaggctgcagaatgggatagattacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccaaatgagagaaccaaggggaagtgatatagcaggaactactagtaccctccaagaacagatagcatggatgacaagtaatccccctattccagtgggagacatctataaaagatggataattctggggttaaataaaatagtaagaatgtatagccctgtcagcattttggacataaaacaagggccaaaggaaccctttagagactatgtagaccggttcttcaaaactttaagagctgaacaggctacacaagaagtaaaaaattggatgacagacaccttgttggtccaaaatgcaaacccagattgcaagaccattttaaaagcattaggaccaggggctacattagaagaaatgatgacagcatgtcaaggagtgggaggacctagccacaaagcaagagtgttggctgaggcaatgagccaaacaaatagtgtaaacatactgatgcagaaaagcaattttaaaggaaataaaagaatggttaaatgttttaactgtggtaaggaagggcacatagccagaaattgcagggcccctaggaaaaagggctgttggaaatgtggaaaggagggacaccaaatgaaagactgtactgagaggcaggctaattttttagggaaaatttggccttcccacaagggaaggccagggaatttccttcagaacaggccagagccaacagccccaccagcagagagcttcaggttcgaggagacaacccccgctccgaagcaggagtcgaaagacagggaagccttaacttccctcaaatcactctttggcagcgaccccttgtctcaataa
<配列番号２>
野生型HIV96ZM651.8gag遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列。
MGARASILRGGKLDKWEKIRLRPGGKKRYMIKHLVWASRELERFALNPGLLETSEGCKQIMKQLQPALQTGTEELRSLYNTVATLYCVHEGVEVRDTKEALDRIEEEQNKIQQKIQQKTQQAADGKVSQNYPIVQNLQGQMVHQKLSPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTSNPPIPVGDIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIKQGPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLAEAMSQTNSVNILMQKSNFKGNKRMVKCFNCGKEGHIARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQNRPEPTAPPAESFRFEETTPAPKQESKDREALTSLKSLFGSDPLSQ
<配列番号３>
ヒト化HIV96ZM651.8gag遺伝子のDNA配列。
atgggcgcccgcgccagcatcctgcgcggcggcaagctggacaagtgggagaagatccgcctgcgccccggcggcaagaagcgctacatgatcaagcacctggtgtgggccagccgcgagctggagcgcttcgccctgaaccccggcctgctggagaccagcgagggctgcaagcagatcatgaagcagctgcagcccgccctgcagaccggcaccgaggagctgcgcagcctgtacaacaccgtggccaccctgtactgcgtgcacgagggcgtggaggtgcgcgacaccaaggaggccctggaccgcatcgaggaggagcagaacaagatccagcagaagatccagcagaaaacccagcaggccgccgacggcaaggtgagccagaactaccccatcgtgcagaacctgcagggccagatggtgcaccagaagctgagcccccgcaccctgaacgcctgggtgaaggtgatcgaggagaaggccttcagccccgaggtgatccccatgttcaccgccctgagcgagggcgccaccccccaggacctgaacaccatgctgaacaccgtgggcggccaccaggccgccatgcagatgctgaaggacaccatcaacgaggaggccgccgagtgggaccgcctgcaccccgtgcacgccggccccatcgcccccggccagatgcgcgagccccgcggcagcgacatcgccggcaccacaagcaccctgcaggagcagatcgcctggatgaccagcaacccccccatccccgtgggcgacatctacaagcgctggatcatcctgggcctgaacaagatcgtgcgcatgtacagccccgtgagcatcctggacatcaagcagggccccaaggagcccttccgcgactacgtggaccgcttcttcaagaccctgcgcgccgagcaggccacccaggaggtgaagaactggatgaccgacaccctgctggtgcagaacgccaaccccgactgcaagaccatcctgaaggccctgggccccggcgccaccctggaggagatgatgaccgcctgccagggcgtgggcggccccagccacaaggcccgcgtgctggccgaggccatgagccagaccaacagcgtgaacatcctgatgcagaagagcaacttcaagggcaacaagcgcatggtgaagtgcttcaactgcggcaaggagggccacatcgcccgcaactgccgcgccccccgcaagaagggctgctggaagtgcggcaaggagggccaccagatgaaggactgcaccgagcgccaggccaacttcctgggcaagatctggcccagccacaagggccgccccggcaacttcctgcagaaccgccccgagcccaccgccccccccgccgagagcttccgcttcgaggagaccacccccgcccccaagcaggagagcaaggaccgcgaggccctgaccagcctgaagagcctgttcggcagcgaccccctgagccagtaa
<配列番号４>
CMV(CMV-IE)プロモーターのDNA配列。
CGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATT
<配列番号５>
CAGプロモーターのDNA配列。
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGC
この配列中、
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGがCMV-IE enhancer、
GTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCがchicken b-actin promoter、
CCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCがβ-actin intronの配列である。
<配列番号６>
牛成長ホルモンポリAシグナルのDNA配列。
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
<配列番号７>
ウサギβ-グロブリンポリAシグナルのDNA配列。
aattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgccatatgctggctgccatgaacaaaggtggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatgaagatc
<配列番号８>
IRESのDNA配列。
AATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCG
<配列番号９>
F2AのDNA配列。
CGCGCCAAGCGCGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGTCCAACCCCGGCCCC
<配列番号１０>
F2Aのアミノ酸配列。
RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
<配列番号１１>
野生型HIV96ZM651.8gp160遺伝子のDNA配列。
atgagagtgagggagatactgaggaattggcaacgatggtggacatggggcatcttaggcttttggatgttaatgatttgtaatgtgtgggggaacttgtgggtcacagtctattatggggtacctgtgtggaaagaagcaaaaactactctattctgtgcatcagatgctaaatcatatgagaaagaagtgcataatgtctgggctacacatgcctgtgtacccacagaccccaacccacaagaaatagttttgggaaatgtaacagaaaattttaacatgtggaaaaatgacatggtggatcagatgcatgaggatataatcagtttatgggatcaaagcctaaagccatgtgtaaagttgaccccactctgtgtcactttaaattgtacagaggttaatgttaccagaaatgttaataatagcgtggttaataataccacaaatgttaataatagcatgaatggagacatgaaaaattgctctttcaacataaccacagaactaaaagataagaaaaagaatgtgtatgcacttttttataaacttgatatagtatcacttaatgagactgacgactctgagactggcaactctagtaaatattatagattaataaattgtaatacctcagccctaacacaagcctgtccaaaggtctcttttgacccaattcctatacattattgtgctccagctggttatgcgattctaaagtgtaataataagacattcaatgggacaggaccatgccataatgtcagcacagtacaatgtacacatggaattaagccagtggtatcaactcaactactgttaaatggtagcctagcagaagaagggataataattagatctgaaaatctgacaaacaatgtcaaaacaataatagtacatcttaatagatctatagaaattgtgtgtgtaagacccaacaataatacaagacaaagtataagaataggaccaggacaaacattctatgcaacaggagacataataggagacataagacaagcacattgtaacattagtaggactaactggactaagactttacgagaggtaaggaacaaattaagagaacacttccctaataaaaacataacatttaaaccatcctcaggaggggacctagaaattacaacacatagctttaattgtagaggagaatttttctattgcaatacatcgggcctgtttagtataaattatacagaaaataatacagatggtacacccatcacactcccatgcagaataagacaaattataaatatgtggcaggaagtaggacgagcaatgtacgcccctcccattgaaggaaacatagcatgtaaatcagatatcacagggctactattggttcgggatggaggaagcacaaatgatagcacaaataataacacagagatattcagacctgcaggaggagatatgagggacaattggaggagtgaattgtataagtataaagtggtagaaattaagccattgggaatagcacccactgaggcaaaaaggagagtggtggagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctgtgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaataacgctgacggcacaggccagacaagtgttgtctggtatagtgcaacagcaaagcaatttgctgagggctatagaggcgcaacagcatctgttgcaactcacggtctggggcattaagcagctccagacaagagtcctggctatagaaagatacctaaaggatcaacagctcctaggactttggggctgctctggaaaactcatctgcaccactgctgtgccttggaacatcagttggagtaataaatctaaaacagatatttgggataacatgacctggatgcagtgggatagagaaattagtaattacacaaacacaatatacaggttgcttgaggactcgcagagccagcaggagcaaaatgaaaaagatttattagcattggacagttggaacaatctgtggaattggtttgacataacaaaatggctgtggtatataaaaatatttataatgatagtaggaggcttaataggtttgagaataatttttgctgtactctctatagtgaatagagttaggcagggatactcacctttgtcgtttcagacccttatcccgaacccaagggaacccgacaggccaggaagaatcgaagaagaaggtggagagcaagacaaagagagatccgtgcgattagtgagcggattcttagcacttgcctgggacgacctacggagcctgtgcctcttcagctaccaccgattgagagacttcatattggtgacagcgagagcggtggagcttctgagacgcagcagtctcaagggactacagagggggtgggaagcccttaagtatctgggaagtcttgtgcagtattggggtctggagctaaaaaagagtgctattagtctacttgataccatagcaatagcagtagctgaaggaacagataggattatagaattaatacaaggaatttgtagagctatccgcaacgtacctagaagaataagacagggctttgaaacagctttgctataa
<配列番号１２>
野生型HIV96ZM651.8gp160遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列。
MRVREILRNWQRWWTWGILGFWMLMICNVWGNLWVTVYYGVPVWKEAKTTLFCASDAKSYEKEVHNVWATHACVPTDPNPQEIVLGNVTENFNMWKNDMVDQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLNCTEVNVTRNVNNSVVNNTTNVNNSMNGDMKNCSFNITTELKDKKKNVYALFYKLDIVSLNETDDSETGNSSKYYRLINCNTSALTQACPKVSFDPIPIHYCAPAGYAILKCNNKTFNGTGPCHNVSTVQCTHGIKPVVSTQLLLNGSLAEEGIIIRSENLTNNVKTIIVHLNRSIEIVCVRPNNNTRQSIRIGPGQTFYATGDIIGDIRQAHCNISRTNWTKTLREVRNKLREHFPNKNITFKPSSGGDLEITTHSFNCRGEFFYCNTSGLFSINYTENNTDGTPITLPCRIRQIINMWQEVGRAMYAPPIEGNIACKSDITGLLLVRDGGSTNDSTNNNTEIFRPAGGDMRDNWRSELYKYKVVEIKPLGIAPTEAKRRVVEREKRAVGIGAVFLGFLGAAGSTMGAASITLTAQARQVLSGIVQQQSNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGLWGCSGKLICTTAVPWNISWSNKSKTDIWDNMTWMQWDREISNYTNTIYRLLEDSQSQQEQNEKDLLALDSWNNLWNWFDITKWLWYIKIFIMIVGGLIGLRIIFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTLIPNPREPDRPGRIEEEGGEQDKERSVRLVSGFLALAWDDLRSLCLFSYHRLRDFILVTARAVELLRRSSLKGLQRGWEALKYLGSLVQYWGLELKKSAISLLDTIAIAVAEGTDRIIELIQGICRAIRNVPRRIRQGFETALL
<配列番号１３>
ヒト化HIV96ZM651.8gp160遺伝子のDNA配列。
atgcgcgtgcgcgagatcctgcgcaactggcagcgctggtggacctggggcatcctgggcttctggatgctgatgatctgcaacgtgtggggcaacctgtgggtgaccgtgtactacggcgtgcccgtgtggaaggaggccaagaccaccctgttctgcgccagcgacgccaagagctacgagaaggaggtgcacaacgtgtgggccacccacgcctgcgtgcccaccgaccccaacccccaggagatcgtgctgggcaacgtgaccgagaacttcaacatgtggaagaacgacatggtggaccagatgcacgaggacatcatcagcctgtgggaccagagcctgaagccctgcgtgaagctgacccccctgtgcgtgaccctgaactgcaccgaggtgaacgtgacccgcaacgtgaacaacagcgtggtgaacaacaccaccaacgtgaacaacagcatgaacggcgacatgaagaactgcagcttcaacatcaccaccgagctgaaggacaagaagaagaacgtgtacgccctgttctacaagctggacatcgtgagcctgaacgagaccgacgacagcgagaccggcaacagcagcaagtactaccgcctgatcaactgcaacaccagcgccctgacccaggcctgccccaaggtgagcttcgaccccatccccatccactactgcgcccccgccggctacgccatcctgaagtgcaacaacaagaccttcaacggcaccggcccctgccacaacgtgagcaccgtgcagtgcacccacggcatcaagcccgtggtgagcacccagctgctgctgaacggcagcctggccgaggagggcatcatcatccgcagcgagaacctgaccaacaacgtcaagaccatcatcgtgcacctgaaccgcagcatcgagatcgtgtgcgtgcgccccaacaacaacacccgccagagcatccgcatcggccccggccagaccttctacgccaccggcgacatcatcggcgacatccgccaggcccactgcaacatcagccgcaccaactggaccaagaccctgcgcgaggtgcgcaacaagctgcgcgagcacttccccaacaagaacatcaccttcaagcccagcagcggcggcgacctggagatcaccacccacagcttcaactgccgcggcgagttcttctactgcaacaccagcggcctgttcagcatcaactacaccgagaacaacaccgacggcacccccatcaccctgccctgccgcatccgccagatcatcaacatgtggcaggaggtgggccgcgccatgtacgccccccccatcgagggcaacatcgcctgcaagagcgacatcaccggcctgctgctggtgcgcgacggcggcagcaccaacgacagcaccaacaacaacaccgagatcttccgccccgccggcggcgacatgcgcgacaactggcgcagcgagctgtacaagtacaaggtggtggagatcaagcccctgggcatcgcccccaccgaggccaagcgccgcgtggtggagcgcgagaagcgcgccgtgggcatcggcgccgtgttcctgggcttcctgggcgccgccggcagcaccatgggcgccgccagcatcaccctgaccgcccaggcccgccaggtgctgagcggcatcgtgcagcagcagagcaacctgctgcgcgccatcgaggcccagcagcacctgctgcagctgaccgtgtggggcatcaagcagctgcagacccgcgtgctggccatcgagcgctacctgaaggaccagcagctgctgggcctgtggggctgcagcggcaagctgatctgcaccaccgccgtgccctggaacatcagctggagcaacaagagcaagaccgacatctgggacaacatgacctggatgcagtgggaccgcgagatcagcaactacaccaacaccatctaccgcctgctggaggacagccagagccagcaggagcagaacgagaaggacctgctggccctggacagctggaacaacctgtggaactggttcgacatcaccaagtggctgtggtacatcaagatcttcatcatgatcgtgggcggcctgatcggcctgcgcatcatcttcgccgtgctgagcatcgtgaaccgcgtgcgccagggctacagccccctgagcttccagaccctgatccccaacccccgcgagcccgaccgccccggccgcatcgaggaggagggcggcgagcaggacaaggagcgcagcgtgcgcctggtgagcggcttcctggccctggcctgggacgacctgcgcagcctgtgcctgttcagctaccaccgcctgcgcgacttcatcctggtgaccgcccgcgccgtggagctgctgcgccgcagcagcctgaagggcctgcagcgcggctgggaggccctgaagtacctgggcagcctggtgcagtactggggcctggagctgaagaagagcgccatcagcctgctggacaccatcgccatcgccgtggccgagggcaccgaccgcatcatcgagctgatccagggcatctgccgcgccatccgcaacgtgccccgccgcatccgccagggcttcgagaccgccctgctgtaa
<配列番号１４>
p24ペプチドのアミノ酸配列。
AMQMLKDTI
<SEQ ID NO: 1>
The DNA sequence of the wild type HIV 96ZM651.8 gag gene.
<SEQ ID NO: 2>
The amino acid sequence of the protein encoded by the wild type HIV 96ZM651.8 gag gene.
MGARASILRGGKLDKWEKIRLRPGGKKRYMIKHLVWASRELERFALNPGLLETSEGCKQIMKQLQPALQTGTEELRSLYNTVATLYCVHEGVEVRDTKEALDRIEEEQNKIQQKIQQKTQQAADGKVSQNYPIVQNLQGQMVHQKLSPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTSNPPIPVGDIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIKQGPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPSHKARVLAEAMSQTNSVNILMQKSNFKGNKRMVKCFNCGKEGHIARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQNRPEPTAPPAESFRFEETTPAPKQESKDREALTSLKSLFGSDPLSQ
<SEQ ID NO: 3>
DNA sequence of the humanized HIV 96ZM651.8 gag gene.
<SEQ ID NO: 4>
DNA sequence of CMV (CMV-IE) promoter.
<SEQ ID NO: 5>
The DNA sequence of the CAG promoter.
In this array,
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAG the CMV-IE enhancer,
GTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGC the chicken b-actin promoter,
Is the sequence of β-actin intron.
<SEQ ID NO: 6>
Bovine growth hormone poly A signal DNA sequence.
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCTGGTGGGAAGGCATGCATGGTG
<SEQ ID NO: 7>
Rabbit β-globulin poly A signal DNA sequence.
<SEQ ID NO: 8>
IRES DNA sequence.
<SEQ ID NO: 9>
F2A DNA sequence.
CGCGCCAAGCGCGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGTCCAACCCCGGCCCC
<SEQ ID NO: 10>
Amino acid sequence of F2A.
RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
<SEQ ID NO: 11>
The DNA sequence of the wild type HIV 96ZM651.8 gp160 gene.
<SEQ ID NO: 12>
The amino acid sequence of the protein encoded by the wild type HIV 96ZM651.8 gp160 gene.
<SEQ ID NO: 13>
DNA sequence of humanized HIV 96ZM651.8 gp160 gene.
<SEQ ID NO: 14>
Amino acid sequence of p24 peptide.
AMQMLKDTI
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009010172A JP2010168288A (en) | 2009-01-20 | 2009-01-20 | Enhancement of immunogenicity of virus vaccine by use of optimized antigen gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009010172A JP2010168288A (en) | 2009-01-20 | 2009-01-20 | Enhancement of immunogenicity of virus vaccine by use of optimized antigen gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010168288A true JP2010168288A (en) | 2010-08-05 |
Family
ID=42700777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009010172A Pending JP2010168288A (en) | 2009-01-20 | 2009-01-20 | Enhancement of immunogenicity of virus vaccine by use of optimized antigen gene |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2010168288A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014502159A (en) * | 2010-11-30 | 2014-01-30 | エルジー ライフ サイエンシーズ リミテッド | New hybrid promoter and recombinant vector containing the same |
| JP2014504500A (en) * | 2010-12-30 | 2014-02-24 | オカイロス アーゲー | Expression system |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006519585A (en) * | 2002-11-05 | 2006-08-31 | グラクソ グループ リミテッド | HIV vaccine |
| JP2006524181A (en) * | 2002-11-15 | 2006-10-26 | グラクソ グループ リミテッド | vaccine |
-
2009
- 2009-01-20 JP JP2009010172A patent/JP2010168288A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006519585A (en) * | 2002-11-05 | 2006-08-31 | グラクソ グループ リミテッド | HIV vaccine |
| JP2006524181A (en) * | 2002-11-15 | 2006-10-26 | グラクソ グループ リミテッド | vaccine |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6013028625; ＡＩＤＳ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｖｏｌ．１９， Ｎｏ．９, 2003, ｐｐ．８１７-２３ * |
| JPN6013028626; ＤＥＭＬ，Ｌ． ｅｔ ａｌ: 'Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉ' Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７５， Ｎｏ．２２, 2001, ｐ．１０９９１-１００１ * |
| JPN6013028628; 庄司正樹 他: 'ＨＩＶ遺伝子搭載アデノウイルスベクターによる免疫誘導能の比較：ＨＩＶワクチン応用にむけて' 生化学 , 2008, ｐ．３Ｔ２０-９ * |
| JPN6013028629; Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｖｏｌ．７３， Ｎｏ．９, 2005, ｐ．５６６６-５６７４ * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014502159A (en) * | 2010-11-30 | 2014-01-30 | エルジー ライフ サイエンシーズ リミテッド | New hybrid promoter and recombinant vector containing the same |
| US9234211B2 (en) | 2010-11-30 | 2016-01-12 | Lg Life Sciences Ltd. | Hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
| JP2016104017A (en) * | 2010-11-30 | 2016-06-09 | エルジー ライフ サイエンシーズ リミテッドＬｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． | Novel hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
| JP2014504500A (en) * | 2010-12-30 | 2014-02-24 | オカイロス アーゲー | Expression system |
| JP2017079787A (en) * | 2010-12-30 | 2017-05-18 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | Expression systems |
| US11701422B2 (en) | 2010-12-30 | 2023-07-18 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Expression systems |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7551157B2 (en) | HIV Vaccination and Immunotherapy | |
| JP5065024B2 (en) | TC-83 derived alphavirus vectors, particles and methods | |
| US12023377B2 (en) | Vaccine for use in the prophylaxis and/or treatment of a disease | |
| US20220160853A1 (en) | Cancer vaccine compositions and methods for use thereof | |
| JP7319368B2 (en) | Adenovirus and methods for using adenovirus | |
| JP4125128B2 (en) | Recombinant poxvirus for human immunodeficiency virus chimeric protein | |
| Malkevitch et al. | A call for replicating vector prime-protein boost strategies in HIV vaccine design | |
| Mulligan et al. | Excellent safety and tolerability of the human immunodeficiency virus type 1 pGA2/JS2 plasmid DNA priming vector vaccine in HIV type 1 uninfected adults | |
| US20040005711A1 (en) | Genetic immunization against cervical carcinoma | |
| JP2024544566A (en) | Lentiviral vectors for the expression of human papillomavirus (HPV) antigens and their use in the treatment of HPV-induced cancers - Patents.com | |
| JP2010168288A (en) | Enhancement of immunogenicity of virus vaccine by use of optimized antigen gene | |
| Ko et al. | Enhanced induction of intestinal cellular immunity by oral priming with enteric adenovirus 41 vectors | |
| CN101394868B (en) | Strong immune induction by using combination of adenovirus type-5/type-35 vector and vaccinia virus mva vector | |
| JP2003510341A (en) | Cell targeting compositions and methods of using them | |
| WO2005052165A1 (en) | Chimeric type 5/type 11 or type 35 adenovirus vector for preventing infection with antihuman immunodeficiency virus | |
| Malkevitch et al. | Evaluation of combination DNA/replication-competent Ad-SIV recombinant immunization regimens in rhesus macaques | |
| RU2782528C1 (en) | Adenoviruses and methods for adenovirus application | |
| US20240335531A1 (en) | Multi-antigen therapeutic vaccines to treat or prevent chronic hepatitis b virus infection | |
| CN119894530A (en) | Lentiviral vectors for expression of Human Papilloma Virus (HPV) antigens and their use in the treatment of HPV-induced cancers | |
| JP4914956B2 (en) | DNA vaccine | |
| CN118354790A (en) | Lentiviral vector for expressing human papillomavirus (HPV) antigens and its application in treating HPV-induced cancers | |
| HK40048152A (en) | A vaccine for use in the prophylaxis and/or treatment of a disease | |
| Involving | Heterologous Human Immunodeficiency | |
| Gall et al. | Enhanced Induction of Intestinal Cellular | |
| Ertl et al. | A Simian Replication-Defective Adenoviral |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120110 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130618 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20131126 |