JP2010110301A - Probe and primer for detecting megasphaera sueciensis and/or megasphaera paucivorans - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出用プローブおよびプライマーに関し、詳細には、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出用のＰＣＲ法プライマーセットに関する。 The present invention relates to a probe and a primer for detection of Megasfera sousiensis and / or Megasfera pausbolance, and more particularly to a PCR method primer set for the detection of Megasfera sousiensis and / or Megasfera pausbolance.
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。製品となったビール中で増殖する菌種としてはラクトバチラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）の乳酸菌の報告例が多いが、１９７０年代以降から、グラム陰性の偏性嫌気性細菌が混濁したビールから分離されている。ペクチネイタス属細菌（Pectinatus）は、ビール混濁能を持つ胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、ペクチネイタス・セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス（Pectinatus frisingensis）、ペクチネイタス・ハイカラエ（Pectinatus haikarae）という菌種が提唱されている（Lee, S. Y. et al. 1978 International Journal of Systematic Bacteriology 28, 582-594、Haikara, A. et al. 1981 Applied and Environmental Microbiology 41, 511-517、Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27、Juvonen, R and Shihko, M. L. 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 4), 695-702）。グラム陰性球菌の偏性嫌気性ビール混濁菌としては、メガスフェラ・セレビシェ（Megasphaera cerevisiae）（Weiss, N. et al. 1979 Brauwissenschaft 32, 189-194）、メガスフェラ・スーシエンシス（Megasphaera sueciensis）、メガスフェラ・パウシボランス（Megasphaera paucivorans）Juvonen, R and Shihko, M. L. 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 4), 695-702）が報告されている。ザイモフィラス・パウシボランス（Zymophilus paucivorans）は、胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、遺伝学的背景がペクチネイタス属と近く、ビール製造に用いられる添加酵母から分離されている（Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27）。これらの細菌がビール中で増殖すると、混濁を起こすのみならず硫化水素や脂肪酸などの不快な香気成分を生産し、ビールの品質を著しく低下させる（Haikara, A. 1985 Monatsschr. fuer Brauwissenschaft 38, 239-243）。従って、これらの細菌を検出し、同定する技術はビール製造における品質管理に非常に重要である。 In the beer industry, contamination of beer with microorganisms poses serious problems. There are many reports of lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus and Pediococcus as the bacterial species that grow in the product beer, but Gram-negative obligate anaerobic bacteria have been turbid since the 1970s Separated from the beer. Pectinatus spp. ( Pectinatus ) is a non-spore-forming obligate anaerobic Gram-negative bacilli with beer turbidity, Pectinatus cerevisiiphilus , Pectinatus frisingensis , Pectinatus haikarae ) has been proposed (Lee, SY et al. 1978 International Journal of Systematic Bacteriology 28, 582-594, Haikara, A. et al. 1981 Applied and Environmental Microbiology 41, 511-517, Schleifer, KH et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27, Juvonen, R and Shihko, ML 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56 (Pt 4), 695-702). The anaerobic beer spoilage microorganisms Gram-negative cocci, Megasphaera cerevisiae (Megasphaera cerevisiae) (Weiss, N. et al. 1979 Brauwissenschaft 32, 189-194), Megasphaera Sushienshisu (Megasphaera sueciensis), Megasphaera Paushiboransu ( Megasphaera paucivorans ) Juvonen, R and Shihko, ML 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56 (Pt 4), 695-702) has been reported. Zaimofirasu-Paushiboransu (Zymophilus paucivorans) are obligate anaerobic gram-negative bacilli asporogenous, genetic background Pekuchineitasu genera and close, it is separated from the added yeast used in beer production (Schleifer, KH et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27). When these bacteria grow in beer, they not only cause turbidity but also produce unpleasant aroma components such as hydrogen sulfide and fatty acids, which significantly reduce the quality of beer (Haikara, A. 1985 Monatsschr. Fuer Brauwissenschaft 38, 239 -243). Therefore, the technology to detect and identify these bacteria is very important for quality control in beer production.
これまでに、メガスフェラ・セレビシェの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を用いた検出用プライマー（特開平１０−３２３１９０号公報）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスのそれぞれに優先的にハイブリダイズするプローブ、及びペクチネイタス属、メガスフェラ属、ザイモフィラス属、セレノモナス属菌に優先的にハイブリダイズするプローブ（特開２００１−１４５４９２号公報）、メガスフェラ・セレビシェの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ（特開２００２−３４５７１号公報）、メガスフェラ・セレビシェの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を明らかにし、その塩基配列を用いた検出用プローブ（特開２００２−１２５６７７号公報）、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域の塩基配列から開発されたＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ用のプローブ（特表２００３−５１００９１号公報）、が報告されている。 So far, a detection primer using the 16S rRNA gene sequence of Megasfera cerevisiae (Japanese Patent Laid-Open No. 10-323190), a probe preferentially hybridizing to each of Pectinatus frisingensis, Pectinatus cerevisiae, and Pectinatus Probes that preferentially hybridize to genera, Megasfera, Zymophilus, and Selenomonas (JP 2001-145492 A), probes for detection using the base sequence of Megasfera cerevisiae 16S rRNA gene (JP 2002-2002) 34571), the base sequence of the 23S rRNA gene of Megasfera cerevisiae has been clarified, and a detection probe using the base sequence (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-125677), Pectinatus cerevisiae Probes for PCR-ELISA developed from the nucleotide sequences of the 23S rRNA gene and 5S rRNA gene of Ilas, Pectinatus frisingensis, Pectinatus sp. DSM20764, Megasfera cerevisiae, and Zymophilus pausbolance (special table 2003-510091) No. Gazette), has been reported.
しかし、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを特異的に検出する手段は、まだ報告されていない。
本発明者は、メガスフェラ・スーシエンシスおよびメガスフェラ・パウシボランスの１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子において、種のレベルで保存され、かつメガスフェラ・スーシエンシスおよびメガスフェラ・パウシボランスに特異的な塩基配列を見出した。具体的には、メガスフェラ・スーシエンシスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（塩基配列３）、あるいはメガスフェラ・パウシボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（塩基配列４）のうち、配列番号１の塩基配列が、メガスフェラ・スーシエンシスおよびメガスフェラ・パウシボランスに共通して特異的であることを見出した。本発明者はまた、この特異的な配列に基づいて設計したメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランス検出用ＰＣＲ法プライマーセットによってメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを正確に検出できることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づくものである。 The present inventor has found a base sequence that is conserved at the species level and specific for Megasfera suciensis and Megasfera pausborans in the 16S ribosomal RNA (16SrRNA) gene of Megasfera sousiensis and Megasfera pausbolances. Specifically, among the base sequence of the 16S rRNA gene of Megasfera succinsis (base sequence 3) or the base sequence of the 16S rRNA gene of Megasfera pauce borans (base sequence 4), the base sequence of SEQ ID NO: 1 is It was found to be specific in common with Megasfera Pauciborans. The present inventor has also found that Megasfera succinsis and / or Megasfera pausibolans can be accurately detected by the PCR method primer set for detection of Megasfera succinsis and / or Megasfera paucivorans designed based on this specific sequence. The present invention is based on these findings.
本発明は、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。本発明は、また、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a primer and probe and a primer set that can accurately detect Megasfera susciensis and / or Megasfera pausbolance. Another object of the present invention is to provide a method for detecting Megasfera susciensis and / or Megasfera pauce borans and a method for determining the possibility of turbidity of a beverage.
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）配列番号１の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランス検出用プローブまたはプライマー。
（２）配列番号１の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、または配列番号１の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（３）配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（４）配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列の相補配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドであり、配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（５）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のプライマーを少なくとも１種含んでなる、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（６）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のプライマーと、配列番号３または４の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランス検出用プライマーとからなる、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（７）配列番号３または４の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号３もしくは４の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、または配列番号３もしくは４の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、前記（６）に記載のプライマーセット。
（７’）配列番号３または４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号５〜８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号５〜８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、配列番号３または４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号５〜８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号５〜８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（６）に記載のプローブまたはプライマー。
（７”）配列番号３または４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号５〜８の塩基配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドであり、配列番号３または４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号５〜８の塩基配列の相補配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドである、前記（６）に記載のプローブまたはプライマー。
（８）前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、または前記（５）〜（７）のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A probe or primer for detection of Megasfella succinsis and / or Megasfella paucus borans comprising a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence.
(2) The polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence comprises at least 10 consecutive nucleotides of the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1. Or a polynucleotide comprising at least 10 contiguous nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (one or several mutations are introduced) The probe or primer according to (1) above.
(3) a polynucleotide in which a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to a polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 is a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 2, or a base sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1, and a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2. The probe or primer according to (1) above, which is a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide that is represented by a complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
(4) A polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 is complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2 (one or several mutations may be introduced) ), A polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to a polynucleotide represented by a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1, and the base sequence of SEQ ID NO: 2 (one or several mutations introduced) The probe or primer according to (1) above, which is a polynucleotide comprising
(5) A PCR method primer set for detecting Megasfera susciensis and / or Megasfella pausibolans, comprising at least one primer according to any one of (1) to (4).
(6) A polynucleotide having at least 10 bases that hybridizes with the primer according to any one of (1) to (4) above and the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or a complementary sequence thereof. A PCR method primer set for detecting Megasfera sousiensis and / or Megasfera pousibolans comprising a primer for detecting Megasfera sousiensis and / or Megasfera pousibolance.
(7) At least 10 consecutive polynucleotides of at least 10 bases that hybridize to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or a complementary sequence thereof, and the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 Or a polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 (1 or 1). The primer set according to (6), wherein several mutations may be introduced).
(7 ′) a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 5 to 8, or a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 to 8 that hybridizes to the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4; A polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide represented by a complementary sequence of 8 base sequences, and a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide represented by a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4; The polynucleotide according to (6), which is a polynucleotide represented by a complementary sequence of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8, or a polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8. Probe or primer.
(7 ″) A polynucleotide having at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 has a base sequence of SEQ ID NOS: 5 to 8 (one or several mutations have been introduced) And a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes with a polynucleotide represented by a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NOs: 5 to 8 The probe or primer according to (6) above, which is a polynucleotide comprising (one or several mutations may be introduced).
(8) A target nucleic acid in a sample using the probe or primer according to any one of (1) to (4) or the primer set according to any one of (5) to (7). A method for detecting Megasfera succinsis and / or Megasfera pausbolance, and a method for determining the possibility of turbidity of beverages, comprising the steps of:
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを正確に検出することができる。特に、本発明によるプライマーセットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。 According to the primer and probe and the primer set according to the present invention, Megasfera succinsis and / or Megasfera pausbolance can be accurately detected. In particular, the primer set according to the present invention can be used for a nucleic acid amplification reaction by a PCR method, and a target bacterial species can be detected by the presence or absence of an amplification product. Therefore, according to the primer and probe and the primer set according to the present invention, Megasfera succinsis and / or Megasfera paucus borans can be accurately, quickly and easily identified.
メガスフェラ・スーシエンシス、メガスフェラ・パウシボランスはそれぞれ、ビール、発泡酒、およびワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や環境試料の検査に有用である。 Megasfera Susciensis and Megasfera Paucivorans are causative bacteria that cause turbidity of various beverages such as beer, happoshu, and wine, and the presence or absence of these bacteria can be an indicator of quality control of various beverages. Therefore, the primer set according to the present invention is useful for quality control of various beverages (particularly beer, sparkling wine, and wine) and inspection of environmental samples.
プライマー、プローブ、およびプライマーセット
本発明では、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランス検出用のプライマーやプローブとして用いることができる（以下、「本発明による第一の態様のプライマーまたはプローブ」ということがある）。
Primer, probe, and primer set In the present invention, at least 10 bases (preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably at least 20) hybridize to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1. Base) and at least 10 bases (preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably at least 20 bases) hybridizing to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1. ) Can be used as a primer or probe for detection of Megasfera suciensis and / or Megasfera pauce borans (hereinafter referred to as “primer or probe of the first aspect according to the present invention”). It may be referred to).
本発明では、配列番号３または４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号３または４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランス検出用のプライマーとして用いることができる（以下、「本発明による第二の態様のプライマー」ということがある）。 In the present invention, a polynucleotide of at least 10 bases (preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably at least 20 bases) that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4. And at least 10 bases (preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably at least 20 bases) that hybridize to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4. Nucleotides can be used as primers for detecting Megasfera susciensis and / or Megasfera pausbolances (hereinafter sometimes referred to as "primers of the second embodiment according to the present invention").
本発明による第二の態様のプライマーを、本発明による第一の態様のプライマーと組み合わせてＰＣＲプライマーとして使用する場合には、本発明による第二の態様のプライマーは、配列番号３の１〜２０８番目もしくは２５１〜１５３９番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチド、あるいは配列番号４の１〜２０８番目もしくは２５１〜１５３９番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドであることができ、好ましくは、配列番号３の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、もしくは８９０〜９５２番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチド、あるいは配列番号４の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、もしくは８９０〜９５２番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドである。 When the primer of the second aspect according to the present invention is used as a PCR primer in combination with the primer of the first aspect according to the present invention, the primer of the second aspect according to the present invention is 1 to 208 of SEQ ID NO: 3. Hybridizes to the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of the 1st or 251st to 1539th nucleotides or a complementary sequence thereof, or the polynucleotide represented by the 1st to 208th or 251st to 1539th nucleotide sequences of SEQ ID NO: 4 or a complementary sequence thereof A polynucleotide of at least 10 bases (preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably at least 20 bases), preferably 271 to 476th of SEQ ID NO: 3, 530 to 613 Th, 688-846th, or 890-th Polynucleotide represented by the 52nd base sequence or its complementary sequence, or represented by the 271st to 476th, 530 to 613th, 688 to 846th, or 890 to 952nd base sequences of SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence A polynucleotide of at least 10 bases (preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably at least 20 bases) hybridizing to the polynucleotide to be treated.
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。 In the present specification, “hybridize” means that it hybridizes to a target polynucleotide and does not substantially hybridize to a polynucleotide other than the target polynucleotide. Hybridization can be performed under stringent conditions. Here, “stringent conditions” can be determined depending on the Tm (° C.) of the duplex of the primer sequence and its complementary strand, the necessary salt concentration, etc. Setting stringent conditions is a technique well known to those skilled in the art (see, for example, J. Sambrook, EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), etc.). Stringent conditions include hybridization reactions in appropriate buffers normally used for hybridization at temperatures slightly below the Tm determined by the nucleotide sequence (eg, 0 to about 5 ° C. below the Tm). It is mentioned to carry out. Stringent conditions also include performing washing after the hybridization reaction with a high-concentration low-salt concentration solution. Examples of stringent conditions include 37 ° C. (for about 14 base oligonucleotides), 48 ° C. (for about 17 base oligonucleotides), 55 ° C. in 6 × SSC / 0.05% sodium pyrophosphate solution. Examples include washing conditions at 60 ° C. (for oligonucleotides of about 23 bases) (for oligonucleotides of about 20 bases).
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。 When a polynucleotide prepared based on the base sequence of SEQ ID NO: 1 is used as a PCR method primer, the nucleotide length is preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably at least 20 The base can be preferably 30 bases, more preferably 25 bases, and most preferably 20 bases. The nucleotide length can be, for example, 15 to 25 bases, 15 to 30 bases, 18 to 25 bases, 18 to 30 bases, 20 to 25 bases, or 20 to 30 bases.
配列番号３または４の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。 When a polynucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is used as a PCR method primer, the nucleotide length is preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably It can be at least 20 bases, and can preferably be at most 30 bases, more preferably at most 25 bases, particularly preferably at most 20 bases. The nucleotide length can be, for example, 15 to 25 bases, 15 to 30 bases, 18 to 25 bases, 18 to 30 bases, 20 to 25 bases, or 20 to 30 bases.
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１２〜３０塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。 When a polynucleotide prepared based on the base sequence of SEQ ID NO: 1 is used as a probe, the nucleotide length is at least 12 bases, preferably at least 15 bases, more preferably at least 18 bases, particularly preferably It can be at least 20 bases, and can preferably be at most 30 bases, more preferably at most 25 bases, particularly preferably at most 20 bases. The nucleotide length can be, for example, 12-30 bases, 15-30 bases, 18-25 bases, 18-30 bases, 20-25 bases, or 20-30 bases.
本発明では、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号１の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）とすることができる。 In the present invention, at least 10 bases that hybridize to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1, and at least 10 bases that hybridize to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1. Each of the polynucleotides comprises a polynucleotide comprising at least 10 contiguous nucleotides of a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1 (one or several mutations may be introduced), and SEQ ID NO: 1 A polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides in the base sequence (one or several mutations may be introduced).
本発明による第一の態様のプライマーおよびプローブの具体例としては、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。 Specific examples of the primer and probe of the first aspect according to the present invention include a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and further a polynucleotide complementary to these polynucleotides.
本発明では、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、第一の態様のプライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。 In the present invention, not only the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but also the polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (hereinafter referred to as “homologous polynucleotide”). May also be used as the primer or probe of the first embodiment. Needless to say, polynucleotides complementary to these polynucleotides can also be used as primers and probes.
本発明では、配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号３の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号３の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）とすることができるが、好ましくは、配列番号３の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号３の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）であり、より好ましくは、配列番号３の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号３の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である。 In the present invention, a polynucleotide having at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3 and at least 10 bases to hybridize to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3 Each of the polynucleotides comprises a polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 3 (one or several mutations may be introduced), and SEQ ID NO: 3 A polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of (1 or several mutations may be introduced), preferably 1 to 208 of SEQ ID NO: 3. Or at least 10 consecutive nucleotides complementary to the nucleotide sequence of positions 251 to 1539 A polynucleotide comprising a leotide (in which one or several mutations may be introduced) and at least 10 contiguous nucleotides of nucleotide sequence 1 to 208 or 251 to 1539 of SEQ ID NO: 3 (Or one or several mutations may be introduced), more preferably, 271 to 476th, 530 to 613th, 688 to 846th, or 890 to 952 of SEQ ID NO: 3. A polynucleotide comprising at least 10 contiguous nucleotides of the complementary sequence of the nucleotide sequence (one or several mutations may be introduced), and the 271-476th, 530-613th of SEQ ID NO: 3 , 688-846, or 890-952, at least 10 consecutive nucleosides It is a polynucleotide comprising a de (which may be 1 or several mutations have been introduced).
本発明では、配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号４の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）とすることができるが、好ましくは、配列番号４の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号４の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）であり、より好ましくは、配列番号４の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）、および配列番号４の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である。 In the present invention, at least 10 bases that hybridize to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 4 and at least 10 bases that hybridize to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 4 Each of the polynucleotides comprises a polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides of the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 4 (one or several mutations may be introduced), and SEQ ID NO: 4 A polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of (1 or several mutations may be introduced), preferably, the 1st to 208th positions of SEQ ID NO: 4 Or at least 10 consecutive nucleotides complementary to the nucleotide sequence of positions 251 to 1539 A polynucleotide comprising a leotide (one or several mutations may be introduced) and at least 10 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence 1 to 208 or 251 to 1539 of SEQ ID NO: 4 (Or one or several mutations may be introduced), more preferably, 271 to 476, 530 to 613, 688 to 846, or 890 to 952 of SEQ ID NO: 4. A polynucleotide comprising at least 10 contiguous nucleotides of the complementary sequence of the nucleotide sequence (one or several mutations may be introduced), and the 271-476th, 530-613th of SEQ ID NO: 4 , 688-846, or 890-952, at least 10 consecutive nucleosides It is a polynucleotide comprising a de (which may be 1 or several mutations have been introduced).
本発明による第二の態様のプライマーの具体例としては、配列番号５〜８のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。 Specific examples of the primer of the second aspect according to the present invention include polynucleotides represented by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8, and further polynucleotides complementary to these polynucleotides.
本発明では、配列番号５〜８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号５〜８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、第二の態様のプライマーとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーとして用いることができることはいうまでもない。 In the present invention, not only the polynucleotides represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8, but also polynucleotides that hybridize to the polynucleotides represented by the complementary sequences of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8 (hereinafter referred to as “homology”). Polynucleotide ") may also be used as the primer of the second embodiment. Needless to say, polynucleotides complementary to these polynucleotides can also be used as primers.
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。 The nucleotide length of the homologous polynucleotide is at least 10 bases.
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。 The homologous polynucleotide of the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2 is, for example, at least 15 (15-20) contiguous sequences of SEQ ID NO: 2, more preferably at least 18 (18-20). A polynucleotide comprising a nucleotide (which may have one or several mutations introduced) (nucleotide length can be up to 25 bases, preferably up to 30 bases), preferably 1 Alternatively, it is a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 into which several mutations may be introduced.
配列番号５〜８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号５〜８の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号５〜８の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。 The homologous polynucleotides of the polynucleotides represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8, for example, are at least 15 (15 to 20) continuous, more preferably at least 18 (18 to 18) of SEQ ID NOs: 5 to 8. 20) a polynucleotide comprising nucleotides (one or several mutations may be introduced) (nucleotide length can be up to 25 bases, preferably up to 30 bases), Preferably, it is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 5 to 8, in which one or several mutations may be introduced.
本発明においては、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号３の塩基配列（好ましくは、配列番号３の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列、より好ましくは、配列番号３の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列）の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。ここで、配列番号３の塩基配列の相補配列に対合するように選択されたプライマーは、配列番号４の塩基配列にも対合することができる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号３の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号３の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。あるいは、二つのプライマーの一方が配列番号１の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号４の塩基配列（好ましくは、配列番号４の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列、より好ましくは、配列番号４の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列）の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。ここで、配列番号４の塩基配列の相補配列に対合するように選択されたプライマーは、配列番号３の塩基配列にも対合することができる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号４の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号４の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。 In the present invention, based on the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a PCR method primer pair for detecting Megasfera susciensis and / or Megasfera pausbolance can be selected. Specifically, in the PCR method, one of the two primers is paired with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the other primer is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (preferably the 1st to 208th positions of SEQ ID NO: 3 or 251 to 1539th base sequence, more preferably the complementary sequence of 271 to 476th, 530 to 613th, 688 to 846th, or 890 to 952 of SEQ ID NO: 3) The primer can be selected so that the other primer is paired with the extended strand extended by one of the primers. Here, the primer selected to pair with the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 3 can also pair with the base sequence of SEQ ID NO: 4. In the PCR method, one of the two primers is paired with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the other primer is a sequence other than the complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (region outside the sequence of SEQ ID NO: 3). The primer may be selected so that the other primer is paired with the extended strand that has been paired with the first strand and extended with one primer. Alternatively, one of the two primers is paired with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the other primer is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (preferably, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 208 or 251 to 1539th, More preferably, an extended strand that is paired with a complementary sequence of SEQ ID NO: 4 at the 271-476th, 530-613th, 688-846th, or 890-952th base sequence) and extended by one primer The primer can be selected so that the other primer is paired with the other primer. Here, the primer selected to pair with the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 4 can also pair with the base sequence of SEQ ID NO: 3. In the PCR method, one of the two primers is paired with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the other primer is a sequence other than the complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (region outside the sequence of SEQ ID NO: 4). The primer may be selected so that the other primer is paired with the extended strand that has been paired with the first strand and extended with one primer.
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号１の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる When a polynucleotide prepared based on the base sequence of SEQ ID NO: 1 is used as a PCR method primer, at least 15 consecutive base sequences of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence (for example, 15 to 30), Preferably at least 18 (eg 18-24 and 18-30), particularly preferably at least 20 (eg 20-25 and 20-30) nucleotides (one or several mutations) A polynucleotide (which can be up to 30 bases, preferably up to 25 bases) can be used as a primer.
配列番号３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号３の塩基配列（好ましくは、配列番号３の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列、より好ましくは、配列番号３の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる When the polynucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is used as a PCR method primer, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to 208 or 251 to 1539 More preferably, the nucleotide sequence of 271 to 476th, 530 to 613th, 688 to 846th, or 890 to 952 of SEQ ID NO: 3 or a complementary sequence thereof is at least 15 (for example, 15 to 30) ), More preferably at least 18 (eg 18-24 and 18-30), particularly preferably at least 20 (eg 20-25 and 20-30) nucleotides (1 or several). A polynucleotide having a maximum nucleotide length of 30 bases, preferably Can be used up may be 25 bases) as a primer
配列番号４の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号４の塩基配列（好ましくは、配列番号４の１〜２０８番目または２５１〜１５３９番目の塩基配列、より好ましくは、配列番号４の２７１〜４７６番目、５３０〜６１３番目、６８８〜８４６番目、または８９０〜９５２番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる When a polynucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is used as a PCR method primer, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (preferably, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 from 1 to 208 or from 251 to 1539) More preferably, 271 to 476th, 530 to 613th, 688 to 846th, or 890 to 952 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or a complementary sequence thereof at least 15 (for example, 15 to 30) ), More preferably at least 18 (eg 18-24 and 18-30), particularly preferably at least 20 (eg 20-25 and 20-30) nucleotides (1 or several). A polynucleotide having a maximum nucleotide length of 30 bases, preferably Can be used up may be 25 bases) as a primer
本発明においては、また、配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを検出するためのプローブを選択することができる。 In the present invention, based on the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1, a probe for detecting Megasfera succinsis and / or Megasfera pausbolance can be selected.
配列番号１の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号１の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２個（例えば、１２〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプローブとして使用できる。 When a polynucleotide prepared based on the base sequence of SEQ ID NO: 1 is used as a probe, at least 12 (for example, 12 to 30) continuous base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, preferably, At least 15 (eg, 15-30), more preferably at least 18 (eg, 18-24 and 18-30), particularly preferably at least 20 (eg, 20-25 and 20-30). A polynucleotide comprising 30 nucleotides (which may have one or several mutations introduced) (nucleotide length is at most 30 bases, preferably at most 25 bases, more preferably at most 24 bases) Can be used as probes.
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１、配列番号３および配列番号４の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。 Homologous polynucleotides and polynucleotides that hybridize to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or their complementary sequences are each at least 90%, preferably at least 95% identical to the corresponding nucleotide sequence A polynucleotide having The numerical value of identity can be calculated according to an algorithm well known in the art, and is the same using, for example, BLAST (http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html). Sexual values can be calculated.
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１、配列番号３および配列番号４の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。 Homologous polynucleotides, and polynucleotides that hybridize to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and their complementary sequences also have one or several mutations introduced into the corresponding nucleotide sequences, respectively. It can be a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide comprising a modified base sequence and represented by a complementary sequence of the corresponding base sequence.
本願明細書において、「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。 In the present specification, the “mutation” may be the same or different, and can be selected from substitution, deletion, insertion, and addition. Preferably, one base is replaced with another one. From “single base substitution”, “single base deletion” to delete one base, “single base insertion” to insert one base, and “single base addition” to add one base You can choose. Further, the number of mutations can be 1 to 6, 1, 2, 3, or 4, 1 or 2, or 1.
本発明による第一の態様のプローブまたはプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号２の塩基配列からなり、かつ配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。 As a preferred embodiment of the probe or primer of the first embodiment according to the present invention, the probe or primer comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 into which one or several mutations may be introduced, and is a complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. A polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide that is represented, or a polynucleotide that is complementary to the polynucleotide.
本発明による第二の態様のプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号８の塩基配列からなり、かつ配列番号３および／または配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。 As a preferred embodiment of the primer of the second embodiment according to the present invention, it consists of the base sequence of SEQ ID NO: 8 into which one or several mutations may be introduced, and the base sequence of SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4 And a polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide represented by or a polynucleotide that is complementary to this polynucleotide.
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットの好ましい態様としては、本発明によるプライマーの好ましい第一の態様と、本発明によるプライマーの好ましい第二の態様とからなる、ＰＣＲ法プライマーセットが挙げられる。 A preferred embodiment of the PCR method primer set according to the present invention includes a PCR method primer set comprising the first preferred embodiment of the primer according to the present invention and the second preferred embodiment of the primer according to the present invention.
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。 In the present invention, “polynucleotide” is used to mean DNA, RNA, and PNA (peptide nucleic acid).
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。 The polynucleotide constituting the primer and the primer set according to the present invention is synthesized by a chemical synthesis of nucleic acid according to a usual method such as the phosphite triester method (Hunkapiller, M. et al., Nature, 310, 105, 1984). Or the total DNA of the strain to be detected is obtained, and a DNA fragment containing the desired nucleotide sequence is appropriately obtained by PCR or the like based on the nucleotide sequence disclosed in this specification. May be.
本発明によるプライマーセットは、単独で使用しても、他のプライマーセットと適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを、より正確に検出することが可能となる。 The primer set according to the present invention may be used alone or in combination with other primer sets as appropriate. By carrying out the combination of the primer sets according to the present invention, it is possible to more accurately detect Megasfera susciensis and / or Megasfera pausbolance.
本発明によるプライマーセットは、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、本発明によるプライマーセットを含んでなる、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出キットが提供される。 The primer set according to the present invention can be provided in the form of a kit. Therefore, according to the present invention, there is provided a detection kit for Megasfera susciensis and / or Megasfera pausbolance comprising the primer set according to the present invention.
本発明によるプライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法等による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。 The kit according to the present invention including the primer set according to the present invention may include reagents (for example, DNA polymerase, purified water) and instruments (for example, reaction tubes) necessary for carrying out a nucleic acid amplification reaction by the PCR method or the like. .
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、各種飲料（例えば、酒類）の品質低下の原因となる偏性嫌気性細菌を正確に識別することができる。メガスフェラ・スーシエンシス、メガスフェラ・パウシボランスは、それぞれ、ビール、発泡酒、およびワインの製造工程あるいは最終製品の品質に影響する能力を持つ細菌種である。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。 When the nucleic acid amplification reaction is performed using the primer set according to the present invention, obligate anaerobic bacteria that cause a reduction in quality of various beverages (for example, alcoholic beverages) can be accurately identified. Megasfera Susciensis and Megasfera Paucivorans are bacterial species with the ability to influence the production process or the final product quality of beer, happoshu and wine, respectively. Therefore, the primer set and kit according to the present invention can be used for quality control of various beverages (for example, alcoholic beverages, particularly beer, sparkling wine, and wine) and for inspection of environmental samples (for example, raw water).
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出方法が提供される。
Detection Method and Judgment Method The primer and probe and primer set according to the present invention can be used for detection of Megasfera succinsis and / or Megasfera pausbolance. That is, according to the present invention, a method for detecting Megasfera susciensis and / or Megasfera pausibolans comprising the steps of contacting a probe or primer or primer set according to the present invention with a sample and detecting a target nucleic acid in the sample. Is provided. More specifically, the method comprises contacting the probe or primer or primer set according to the present invention with a sample, and detecting hybridization of the probe or primer or primer set according to the present invention and the target nucleic acid in the sample. -A method for detecting Susciensis and / or Megasfera pausbolances is provided.
メガスフェラ・スーシエンシス、メガスフェラ・パウシボランスは、それぞれ、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットによりメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスが検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。 Megasfera Susciensis and Megasfera Paucivorans are causative bacteria that cause turbidity in various beverages (for example, alcoholic beverages, particularly beer, sparkling wine, and wine). Thus, the probes and primers and primer sets according to the present invention are not only capable of detecting Megasfera succinsis and / or Megasfera pauce borans, but also the potential for turbidity of various beverages (eg, alcoholic beverages, especially beer, sparkling wine, and wine). It can be used for determination. That is, when Megasfera succinsis and / or Megasfera pausbolances are detected by the probe and primer and primer set according to the present invention, if the turbid bacteria are present in the sample, or the sample is likely to become turbid Can be determined.
従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。 Therefore, according to the present invention, there is provided a method for determining the turbidity of a beverage, which comprises a step of contacting a probe or primer or primer set according to the present invention with a sample and detecting a target nucleic acid in the sample. . More specifically, a beverage comprising a step of contacting a probe or primer or primer set according to the present invention with a sample, and detecting hybridization of the probe or primer or primer set according to the present invention with a target nucleic acid in the sample. A method for determining the possibility of turbidity is provided.
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。 Here, a method for detecting hybridization is well known, and commercially available devices and instruments for the detection can be used. Hybridization can be detected, for example, by detecting the presence or absence of an amplification product using a known nucleic acid amplification method such as a PCR method, or using a known nucleic acid detection method such as a Southern blot method. It can be implemented by detecting the presence or absence.
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。 A specific embodiment of the detection method according to the present invention includes a detection method including a step of detecting the presence or absence of a nucleic acid amplification product after performing a nucleic acid amplification reaction by a PCR method on a nucleic acid sample.
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの存在を示す、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出方法が提供される。
That is, according to the present invention,
(A) performing a nucleic acid amplification reaction by a PCR method on a nucleic acid in a sample using the PCR method primer set according to the present invention; and (b) detecting the presence or absence of an amplification product, A method of detecting Megasfera succinsis and / or Megasfera pousibolans is provided, the production of which indicates the presence of Megasfera succinsis and / or Megasfera pousibolans.
本発明によれば、また、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
According to the invention,
(A) performing a nucleic acid amplification reaction by a PCR method on a nucleic acid in a sample using the PCR method primer set according to the present invention; and (b) detecting the presence or absence of an amplification product, A method for determining the turbidity of a beverage is provided wherein the production indicates the turbidity.
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。 The sample to be subjected to the nucleic acid amplification step by the PCR method may be extracted after culturing microbial cells in the sample, or may be extracted without culturing. The preparation of a nucleic acid sample such as culturing bacterial cells or extracting nucleic acid will be described later.
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。 In the nucleic acid amplification step by the PCR method, an amplification reaction is performed on the nucleic acid in the sample. Nucleic acid amplification reactions by the PCR method are well known, and those skilled in the art can implement the PCR method by appropriately setting conditions for performing the PCR method and its modification method.
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。 A specific embodiment of the detection method using a probe among the detection methods according to the present invention includes a detection method including a step of detecting the presence or absence of a nucleic acid complex after hybridization of the probe according to the present invention to a nucleic acid sample. .
すなわち、本発明によれば、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの存在を示す、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出方法が提供される。
That is, according to the present invention,
(A ′) contacting the probe of the present invention with the nucleic acid in the sample; and (b ′) detecting the presence or absence of a hybridization complex, wherein the formation of the hybridization complex is Megasfella succinosis And / or a method of detecting Megasfera suiciensis and / or Megasfera pausbolance indicating the presence of Megasfera pausbolance.
本発明によれば、また、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
According to the invention,
(A ′) a step of bringing the probe of the present invention into contact with a nucleic acid in a sample; and (b ′) a step of detecting the presence or absence of a hybridization complex, wherein the formation of the hybridization complex may be turbid. A method for determining the turbidity of a beverage is provided.
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。 In the detection method using a probe, the probe can be labeled and used. Examples of the label include radioactive elements (for example, 32 P and 14 C), fluorescent compounds (for example, FITC), and molecules involved in enzyme reactions (for example, peroxidase, alkaline phosphatase).
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。 The detection of the hybridization complex can be carried out using a known method such as Northern hybridization, Southern hybridization, colony hybridization and the like. Prior to detection of the hybridization complex, unbound probes and other non-hybridized components may be removed.
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの識別に用いることができる。
Nucleic Acid Amplification Reaction by PCR Method The PCR method primer set according to the present invention uses a method of nucleic acid amplification such as PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method, in situ PCR, etc., by Megasfera Susciensis and / or Megasfera Paucibolans. Can be used for identification.
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。 If a nucleic acid amplification product is observed, it means that the target base sequence is present, and represents a positive (+) species of bacteria to be detected by the primer set. On the contrary, when nucleic acid amplification is not observed, it means that the target base sequence is absent and represents a negative bacterial species (-) which is a detection target of the primer set.
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。 In the PCR method, a nucleic acid amplification product can be detected according to a known method such as agarose gel electrophoresis. In the real-time PCR method, nucleic acid amplification products can be detected over time in an apparatus in which a thermal cycler and a spectrofluorometer are integrated using an intercalator or a fluorescently labeled probe.
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
Samples to be detected and their preparation Samples to be detected by the primer set and kit according to the present invention include alcoholic beverages such as beer, sparkling liquor and wine; soft drinks such as ramune and carbonated water; water collected for raw materials, etc. Environmental samples; semi-finished products collected from production processes such as alcoholic beverages and soft drinks.
これらをＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする細菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする細菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。 When these are used as samples in the PCR method, operations such as concentration, separation, and culture of bacteria present in the sample, separation of nucleic acids from cells, and concentration of nucleic acids may be performed as pretreatment. Examples of the method for concentrating and separating the bacteria present in the sample include filtration and centrifugation, and can be selected as appropriate. In addition, the number of bacteria may be increased by further culturing the bacteria concentrated and separated from the sample. For the culture, an agar solid medium or a liquid medium suitable for the growth of the target bacterial strain can be used, and a drug such as cycloheximide may be added to select the target bacterial strain. In order to release nucleic acids from bacterial cells present in beverage samples and environmental samples, or cultured bacterial cells, for example, the bacterial cells are treated with a method using a commercially available kit or an alkaline solution at 100 ° C. It is possible to select a method for releasing nucleic acid from bacterial cells by heating. If it is necessary to further purify the nucleic acid, the nucleic acid may be purified by phenol / chloroform treatment, ethanol precipitation, centrifugation, etc., and finally redissolved in TE buffer or the like to be used as a template DNA for testing ( European Brewery Convention: ANALYTICA-MICROBIOLOGICA-EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg, Rolfs et al: PCR-Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992, Taiji Oshima et al: Protein Nucleic Acid Enzyme, vol. 35, 2523-2541, 1990).
本発明によるメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出は、例えば、以下のように実施することができる。 The detection of Megasfera susciensis and / or Megasfera pauce borans according to the present invention can be performed, for example, as follows.
まず、試料中に存在すると考えられるメガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＰＣＲ法を実施し、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。 First, Megasfera succinsis and / or Megasfera pauce borans which are considered to be present in the sample are enriched in an appropriate medium. Subsequently, DNA is isolated from the colonies formed on the agar medium, and PCR is performed on the DNA using the primer set according to the present invention to amplify a specific gene region of Megasfera suciensis and / or Megasfera pausbolance. To do. The presence of the gene amplification product indicates the presence of the species to be detected. In addition, the presence of the species to be detected indicates that turbid bacteria are present in the sample or that the sample is likely to become turbid.
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
実施例：メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出した。１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２７μlを加えて混和することで中和した後、遠心分離した上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０７ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
Example: Detection of Megasfera suciensis and / or Megasfera pauce borans (a) Genomic DNA extraction method The cells cultured on an agar plate medium are scraped, suspended in 0.1 M sodium hydroxide solution, and incubated in boiling water for 10 minutes. DNA was extracted by heating. After neutralizing the mixture by adding 27 μl of 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0) and mixing, the centrifuged supernatant was used as the genomic DNA solution. The bacterial concentration in this suspension was about 10 7 cfu / ml.
（ｂ）ＰＣＲ用プライマーの合成
ＰＣＲ用プライマーを、ホスホアミダイド法で化学合成した（化学合成はシグマアルドリッチジャパン株式会社に委託）。
［プライマーセット１］
正規鎖側プライマー： GATGGCCTCT ATATATAAGC （配列番号２）
逆鎖側プライマー ： CCGTCAATTC CTTTGAGTTT （配列番号８）
(B) Synthesis of PCR primers PCR primers were chemically synthesized by the phosphoramidide method (chemical synthesis was consigned to Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.).
[Primer set 1]
Regular primer: GATGGCCTCT ATATATAAGC (SEQ ID NO: 2)
Reverse side primer: CCGTCAATTC CTTTGAGTTT (SEQ ID NO: 8)
（ｃ）ＰＣＲ反応溶液の調製およびＰＣＲ反応
ゲノムＤＮＡ溶液１μlに、１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液４μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）、正規鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、逆鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑ）０．２５μlを加え、水で５０μlとし、これをＰＣＲ反応溶液とした。
(C) Preparation of PCR reaction solution and PCR reaction 5 μl of reaction buffer 10 times concentrated in 1 μl of genomic DNA solution (Buffer supplied with TaKaRa exTaq, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), 4 types of deoxyribonucleotide triphosphates (DNTP) 4 μl of mixed solution (Takara Ra exTaq, dNTP mixed solution attached to TaKaRa exTaq), normal strand primer 20 pmol, reverse strand primer 20 pmol, DNA polymerase (Takara Ra exTaq, 0.25 μl) Water was made 50 μl, and this was used as a PCR reaction solution.
（ｄ）ＰＣＲ反応
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを２５サイクル繰り返し反応させた。
(D) PCR reaction The process consisting of heat denaturation (94 ° C., 30 seconds), annealing (50 ° C., 30 seconds), and polymerization reaction (72 ° C., 1 minute) was defined as one cycle, and this was repeated for 25 cycles.
反応溶液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによる染色を行った。電気泳動は２％のアガロースゲルを使用し、ＴＡＥバッファーの中、１００ボルトで３０分間行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分間浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この時、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流して相対比較することにより、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。 In order to see whether the nucleotide sequence was amplified in the reaction solution, agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide were performed. Electrophoresis was performed using a 2% agarose gel in TAE buffer at 100 volts for 30 minutes. Next, the gel was taken out, dyed by immersion in an aqueous solution of ethidium bromide of 0.5 μg / ml for 30 minutes, developed with a transilluminator, and photographed with a polaroid camera. At this time, the length of the detected nucleotide sequence fragment was calculated by flowing together DNA fragments having a known base pair number during electrophoresis and performing relative comparison.
（ｅ）ＰＣＲ用プライマーの特異性評価
ＰＣＲ用プライマーとして開発したプライマーセット１について、各種偏性嫌気性菌標準株を用いてＰＣＲ法で特異性を評価した。その結果、プライマーセット１は、メガスフェラ・スーシエンシスおよびメガスフェラ・パウシボランスの菌株と反応させた場合にのみＤＮＡ増幅が観察された（表１）。
以上により、メガスフェラ・スーシエンシスおよびメガスフェラ・パウシボランスに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とするメガスフェラ・スーシエンシスおよびメガスフェラ・パウシボランスを検出するが、同じメガスフェラ属に属するメガスフェラ・セレビシエを検出せず、よって、菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけで、メガスフェラ・スーシエンシスおよび／またはメガスフェラ・パウシボランスを同定・検出することができる。 Based on the above, the primer set according to the present invention created for Megasfera Susciensis and Megasfera Pousibolans detects Megasfera susiensis and Megasfera pousibolans to be tested, but does not detect Megasfera cerevisiae belonging to the same Megasfera genus. Therefore, it was shown that it can be accurately detected at the bacterial species level. By using the primer according to the present invention, it is possible to identify and detect Megasfera susciensis and / or Megasfera pausbolances simply by confirming the presence or absence of gene amplification.
Claims (8)
配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。 A polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 is represented by the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 2 or the base sequence of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide
A polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the polynucleotide hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 The probe or primer according to claim 1, which is a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide represented by:
配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列（１または数個の変異が導入されていてもよい）からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。 The polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 consists of a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 2 (one or several mutations may be introduced) A polynucleotide;
The polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 1 consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2 (one or several mutations may be introduced) The probe or primer according to claim 1, which is a polynucleotide.
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