JP2010004895A - ヒト化ニワトリ抗体の製造方法 - Google Patents
ヒト化ニワトリ抗体の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010004895A JP2010004895A JP2009236484A JP2009236484A JP2010004895A JP 2010004895 A JP2010004895 A JP 2010004895A JP 2009236484 A JP2009236484 A JP 2009236484A JP 2009236484 A JP2009236484 A JP 2009236484A JP 2010004895 A JP2010004895 A JP 2010004895A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- human
- region
- seq
- derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 94
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 61
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 13
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 abstract description 11
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract description 4
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 abstract description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 51
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 31
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 8
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 4
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 4
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101001090203 Mus musculus Major prion protein Proteins 0.000 description 2
- 101100298534 Mus musculus Prnp gene Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001068592 Bos taurus Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101001095054 Ovis aries Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000389 anti-prion effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】哺乳類動物の抗原に対して反応し、かつ免疫原性の小さい抗体を提供する。
【解決手段】ヒト由来の定常領域と、ニワトリ由来の相補性決定領域とヒト由来の枠組み構造領域とを含む可変領域と、を含むことを特徴とする抗体は、ヒトと系統学的に遠いニワトリ由来の相補性決定領域を含むので、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の抗原に対して広く抗原認識活性を有すると共に、ヒトに対する免疫原性が小さい。従って、本発明の抗体は、医薬品として非常に好適に用いることができる。
【選択図】なし
【解決手段】ヒト由来の定常領域と、ニワトリ由来の相補性決定領域とヒト由来の枠組み構造領域とを含む可変領域と、を含むことを特徴とする抗体は、ヒトと系統学的に遠いニワトリ由来の相補性決定領域を含むので、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の抗原に対して広く抗原認識活性を有すると共に、ヒトに対する免疫原性が小さい。従って、本発明の抗体は、医薬品として非常に好適に用いることができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、抗体、およびその利用に関するものであり、特に、ヒトを対象とする医薬品、例えば治療薬および診断薬に好適に用いることのできる抗体、その製造方法、及びその抗体を含む医薬品に関するものである。
抗体分子は、大きくＶ領域（可変領域、variable region）と定常領域（Ｃ領域、constant region）に分けられる。また、Ｖ領域は、ＣＤＲ（相補性決定領域、complementarity determining region）及びＦＲ（枠組み構造領域、framework region）がモザイク状に配置した構造となっている。このうちＣＤＲは、抗原分子と相補的な立体構造を形成する領域であり、抗体の特異性を決める領域である。また、ＦＲは、ＣＤＲの立体構造を保持することでＣＤＲの抗原への親和性を保持する領域である。
近年、抗体を治療薬または診断薬として用いる、いわゆる抗体医薬品が注目を集めている。
しかし、非ヒト抗体（ヒト以外の生物、つまり異種生物由来の抗体）を治療薬としてヒトに投与する場合、免疫原性が大きな問題となる。つまり、非ヒト抗体をヒトに投与すると、この非ヒト抗体に対してヒトの体内で免疫系が働く。その結果、抗体が不活性化されてしまうという問題を生じる。
そこで、免疫原性を減じるために、非ヒト抗体のヒト化が試みられている。「非ヒト抗体のヒト化」とは、ＣＤＲが非ヒト生物由来であり、それ以外の部分がヒト由来である抗体を作製することを意味する。ヒト化抗体では、非ヒト生物由来の領域が小さいので、ヒト化する前の抗体（親抗体）よりも、免疫原性は低いと考えられている。これまでに、マウス等由来の哺乳類抗体がいくつかヒト化されている（例えば、非特許文献１，２）。
Schlapschy, M., Gruber, H., Gresch, O., Schafer, C., Renner, C., Pfreundschuh, M and Skerra, A. Functional humanization of an anti-CD30 Fab fragment for the immunotherapy of Hodgkin’s lymphoma using an in vitro evolution approach. Protein Eng. Des. Sel., 17:840-860 (2004)
Zhang, W., Freg, J., Li, Y., Guo, N. and Shen, B. Humanization of anti-human TNF-alpha antibody by variable region resurfacing with the aid of molecular modeling. Mol. Immunol., 42:1445-1451 (2005)
しかしながら、哺乳類抗体には以下に述べるような問題があった。
第一に、哺乳類とヒトとは系統学的に近い。そのため、哺乳類からヒト抗原に対する抗体を得ようとすると、免疫寛容のために抗体ができにくい場合がある。
第二に、例えばヒト抗原に対するマウス抗体を得ても、このマウス抗体がヒト抗原のマウスホモログと反応しないことがよくある。これは、抗体を医療の分野で応用するには大きな問題である。なぜなら、医薬用の抗体は、臨床試験でヒトに投与する前に、実験動物（主にマウス）を用いて治療効果を評価しなければならないので、抗体は実験動物（主にマウス）のホモログを認識する必要があるためである。
本発明は、上記従来の課題に鑑みたものであり、その目的は、哺乳類動物の抗原に対して反応し、かつ免疫原性の小さい抗体を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ヒト由来の定常領域と、ニワトリ由来の相補性決定領域とヒト由来の枠組み構造領域とを含む可変領域と、を含む抗体を創製することに成功し、当該ヒト化ニワトリ抗体がヒト化されていないニワトリ抗体と同等の抗原認識活性を有することを見出し、それゆえ、少なくとも抗体を利用した治療薬、および診断薬として有用であるという知見を見出し、本願発明を完成させるに至った。本発明は、かかる新規知見に基づいて完成されたものであり、以下の発明を包含する。
（１）ヒト由来の定常領域と、ニワトリ由来の相補性決定領域とヒト由来の枠組み構造領域とを含む可変領域と、を含む抗体。
（２）上記枠組み構造領域中の補助アミノ酸が最適化された（１）に記載の抗体。
（３）配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、を有する抗体。
（４）配列番号５９〜６４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体。
（５）配列番号６５〜７０のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗体。
（６）ヒト由来の抗体中の相補性決定領域をニワトリ由来の相補性決定領域に置換する相補性決定領域置換工程を含む抗体の製造方法。
（７）さらに、上記ヒト由来の抗体中の枠組み構造領域に含まれる補助アミノ酸を最適化するアミノ酸最適化工程をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のヒト化ニワトリ抗体の製造方法。
（８）上記アミノ酸最適化工程は、上記補助アミノ酸をランダム化するランダム化工程と、上記ランダム化工程によってランダム化されたアミノ酸を含む抗体のうち、抗原認識活性を有する抗体を選択する選択工程とをさらに含むことを特徴とする請求項４に記載のヒト化ニワトリ抗体の製造方法。
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を含む医薬品。
（１）ヒト由来の定常領域と、ニワトリ由来の相補性決定領域とヒト由来の枠組み構造領域とを含む可変領域と、を含む抗体。
（２）上記枠組み構造領域中の補助アミノ酸が最適化された（１）に記載の抗体。
（３）配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、を有する抗体。
（４）配列番号５９〜６４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体。
（５）配列番号６５〜７０のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗体。
（６）ヒト由来の抗体中の相補性決定領域をニワトリ由来の相補性決定領域に置換する相補性決定領域置換工程を含む抗体の製造方法。
（７）さらに、上記ヒト由来の抗体中の枠組み構造領域に含まれる補助アミノ酸を最適化するアミノ酸最適化工程をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のヒト化ニワトリ抗体の製造方法。
（８）上記アミノ酸最適化工程は、上記補助アミノ酸をランダム化するランダム化工程と、上記ランダム化工程によってランダム化されたアミノ酸を含む抗体のうち、抗原認識活性を有する抗体を選択する選択工程とをさらに含むことを特徴とする請求項４に記載のヒト化ニワトリ抗体の製造方法。
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体を含む医薬品。
本発明の抗体は、ヒト由来の定常領域と、ニワトリ由来の相補性決定領域とヒト由来の枠組み構造領域とを含む可変領域と、を含む。
つまり、本発明の抗体は、ヒトと系統学的に遠いニワトリ由来の相補性決定領域を含むので、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の抗原に対して広く抗原認識活性を有するという効果を相する。
また、本発明の抗体は、定常領域および可変領域中の枠組み構造領域がヒト由来であるので、その免疫原性が小さいという効果を奏する。
従って、本発明の抗体は、医薬品として非常に好適に用いることができる。
本発明の抗体の製造方法は、ヒト由来の抗体の相補性決定領域をニワトリ由来の相補性決定領域に置換する相補性決定領域置換工程を含む。
本発明の抗体の製造方法によると、免疫原性が小さく、抗原認識活性の高い抗体を容易に製造することができる。
本発明は、医薬品に好適に用いることの出来る抗体、その製造方法、およびその利用に関するものである。そこで、以下では、まず本発明にかかる抗体について説明し、次いで、その製造方法、最後にその利用法について説明する。
＜１．本発明にかかる抗体＞
本発明にかかる抗体は、ヒト由来の定常領域（Ｃ領域）と、ニワトリ由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト由来の枠組み構造領域（ＦＲ）とを含む可変領域（Ｖ領域）と、を含む抗体であればよい。
＜１．本発明にかかる抗体＞
本発明にかかる抗体は、ヒト由来の定常領域（Ｃ領域）と、ニワトリ由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト由来の枠組み構造領域（ＦＲ）とを含む可変領域（Ｖ領域）と、を含む抗体であればよい。
この抗体は、哺乳類と系統学的に遠いニワトリ由来の相補性決定領域を含むので、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の抗原に対して広く抗原認識活性を有するという効果を奏する。この効果について以下に詳しく述べる。
例えば、ヒト抗原が哺乳類間で高度に保存された分子である場合等、免疫寛容によって、哺乳類では抗体が産生されにくい場合がある。
しかし、ニワトリは哺乳類と進化上離れているので、哺乳類間で高度に保存された分子に対しても、抗体を産生しやすい（Song C. S., et al., 1985 J. Immunol. 135, 3354-3359, Matsushita K., et al., J. Vet. Med. Sci. 60 (1998) 777-779, Matsuda H., et al., 1999. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 23,189-194, Nakamura et al., 2000. Cytotechnology 32, 191-198）。
また、哺乳類の抗体、例えばマウス抗体では、ヒト抗原は認識できても、そのヒト抗原のマウスホモログは認識できないという問題が生じることがある（Klohs and Hamby, 1999）。
しかし、ニワトリ抗体は、ヒト抗原もマウスホモログも認識できる可能性が高い。実際、プリオンに対するニワトリ抗体phAb4-3、phAb4-12、およびphAb4-19は、ヒト、マウス、ヒツジ、およびウシのプリオンと反応する（Nakamura N., et al., 2004. Cytotechnology 32, 191-198）。
このように、広く哺乳類のホモログを認識できることは、抗体を治療薬として用いるためには重要である。なぜなら、臨床試験の前には必ず実験動物を用いて治療効果を評価しなければならないので、抗体は実験動物のホモログを認識する必要があるためである。
また、治療薬として抗体を用いる場合、問題になるのが免疫原性である。
免疫原性を減じるためには、抗体のアミノ酸のうち、抗原認識に必要な領域以外が可能な限りヒトのアミノ酸配列になっていることが好ましい。
これまでに、可変領域全体がニワトリ由来で、定常領域がヒト由来である抗体（ニワトリ‐ヒトキメラ抗体）を作製したとの報告はある（Andris-Widhopf, et al., J. Immunol. Methods 242 (2000) 159-181、Nishibori N., et al., Biologocals. (2004) 32, 213-218）。
しかし、ニワトリ抗体を実際にヒトに投与するには、その安全性および有効性を確実なものにするために、ヒト由来の領域がさらに大きい抗体を作製することが求められている。
本発明の抗体は、定常領域に加え、可変領域中の枠組み構造領域もヒト由来になっているので、その免疫原性は非常に小さくなる。このような抗体の作製はこれまでに報告されていない。
なお、本発明の「抗体」は、抗体全長であってもよく、Fab、およびF(ab')2等の部分長であってもよい。
また、本発明の抗体は、ヒト由来である枠組み構造領域中の補助アミノ酸が、最適化されていることが好ましい。
本発明の抗体は、この構成を有することで、さらに抗原認識活性が高くなるという効果を奏する。「補助アミノ酸の最適化」については、次の＜２＞欄で詳しく述べる。
なお、本発明の抗体は、ＣＤＲに合わせて補助アミノ酸が最適化されていればよく、その他のアミノ酸配列は、特に限定されない。つまり、定常領域、およびＦＲ領域の補助アミノ酸以外の部分のアミノ酸配列は、特に限定されるものではない。
＜２．本発明にかかる製造方法＞
本発明にかかる抗体の製造方法は、上記＜１＞欄に記載の本発明の抗体の製造方法の一例である。
＜２．本発明にかかる製造方法＞
本発明にかかる抗体の製造方法は、上記＜１＞欄に記載の本発明の抗体の製造方法の一例である。
本発明にかかる抗体の製造方法は、ヒト由来の抗体の相補性決定領域をニワトリ由来の相補性決定領域に置換する相補性決定領域置換工程を含めばよい。
〔相補性決定領域（ＣＤＲ）置換工程〕
上記相補性決定領域置換工程としては、ヒト由来の抗体中のＣＤＲをニワトリ由来のＣＤＲに置換できればよく、その方法は限定されない。
〔相補性決定領域（ＣＤＲ）置換工程〕
上記相補性決定領域置換工程としては、ヒト由来の抗体中のＣＤＲをニワトリ由来のＣＤＲに置換できればよく、その方法は限定されない。
つまり、公知の遺伝子組換え手技を好適に用いることができる。また、一般的にＣＤＲグラフティング法（CDR grafting）として用いられる方法を利用すればよい。さらに具体的には、重複伸長ＰＣＲ（overlap extension PCR）を用いることもできる。
このようにして製造された抗体は、上記＜１＞欄で述べたように、ニワトリ由来のＣＤＲを有するので、哺乳類抗原を広く認識することができる。また、ヒト由来のＣ領域およびＦＲを有するので、ヒトに対する免疫原性が小さい。そのため、本発明の製造方法によって製造された抗体は特に医薬品に好適に用いることができる。
〔アミノ酸最適化工程〕
また、上記ヒト由来の抗体中の枠組み構造領域中の補助アミノ酸を最適化するアミノ酸最適化工程をさらに含むことが好ましい。
〔アミノ酸最適化工程〕
また、上記ヒト由来の抗体中の枠組み構造領域中の補助アミノ酸を最適化するアミノ酸最適化工程をさらに含むことが好ましい。
この構成によって、本発明の製造方法は、さらに抗原認識活性の高い抗原を製造することができる。この構成および効果について以下に詳しく述べる。
既に述べたように、免疫原性を小さくするためには、抗体中のヒト由来の領域を出来るだけ大きくすることが望ましい。そのために、抗原と相互作用する領域（ＣＤＲ）のみをニワトリ由来とし、他の部分をヒト由来とすることが有効である。
しかし、ヒト抗体のＣＤＲをニワトリのＣＤＲに置換すると（ＣＤＲ置換工程）、元のニワトリ抗体と比較して、その抗原認識活性が低くなったり、失われたりすることがある。これは、ＦＲ中の一部のアミノ酸が、抗原認識に重要な役割を担っているためである。このように抗原認識に寄与するＦＲ中のアミノ酸を、本明細書中では、「補助アミノ酸」とよぶ。
「アミノ酸を最適化する」とは、このように補助アミノ酸を他のアミノ酸に置換することで抗原認識活性を回復させることを意味する。なお、「抗原認識活性を回復させる」とは、本発明の抗体が、そのＣＤＲの由来となるニワトリ抗体の全長とほぼ同等の結合認識活性を有するようにすることを意味する。
これまでに、マウス抗体でいくつかのアミノ酸残基（バーニヤ残基、およびパッケージング残基）が、抗原認識に重要であると予測されている（Foote J., and Winter G., 1992. J. Mol. Biol. 224, 487-499、Paldon E. A., 1991. Mol. Immunol. 28, 489-498）。
「補助アミノ酸」とは、特に、これらのアミノ酸残基、つまりバーニヤ残基および／またはパッケージング残基であることが好ましい。また、バーニヤ残基およびパッケージング残基の他にも、ＣＤＲの抗原認識に関与するアミノ酸残基を広く含むものとする。
また、特に、ＣＤＲ置換工程を経た後の抗体の軽鎖のＮ末端から4, 36、46、47、64、66、68、69、71番目のアミノ酸（L4、L36、L46、L47、L64、L66、L68、L69、L71）、および重鎖のＮ末端から28、29、30、47、48、49、67、73、75、76、78番目のアミノ酸（H28、H29、H30、H47H48、H49、H67、H73、H75、H76、H78）のうちの少なくとも１つが他のアミノ酸、特に好ましくはニワトリ抗体のアミノ酸（ニワトリ型）に置換されることが好ましい。ここで用いたアミノ酸残基の番号はKabat et al. (1991)に従った。
アミノ酸を最適化する方法としては、特に限定されない。例えば一部のアミノ酸を置換した変異体を複数作製し、それらの抗原認識活性を調べ、抗原認識活性が回復していなければ別のアミノ酸を置換して抗原認識活性を調べる、ということを繰り返してもよい。
また、アミノ酸最適化工程は、枠組み構造領域中のアミノ酸をランダム化するランダム化工程と、ランダム化されたアミノ酸を含む抗体のうち、抗原認識活性を有する抗体を選択する選択工程とを含むことが好ましい。
この構成によって、アミノ酸最適化が効率よく、かつ容易に行えるという効果を奏する。
「アミノ酸をランダム化する」とは、補助アミノ酸を他のアミノ酸に置換したあらゆる組み合わせの抗体を作製することである。
アミノ酸をランダム化する方法としては、ファージディスプレイ法が好適に用いられる。
（選択工程）
選択工程は、上記ランダム化工程によってランダム化された抗体から、目的の抗原に結合する抗体を選択する工程である。
選択工程は、上記ランダム化工程によってランダム化された抗体から、目的の抗原に結合する抗体を選択する工程である。
なお、「抗体を選択する」とは、抗体そのもの、抗体の遺伝子、この遺伝子を含むベクター、並びに、抗体を発現するファージ、菌類、および細胞等、抗体の配列情報を有するものを選択することを意味する。
選択方法としては特に限定されず、公知の方法を好適に利用することができる。例えば、バイオパニングと呼ばれる方法を用いてもよい。
例えばファージライブラリを用いてランダム化を行った場合には、バイオパニングとして次のような操作を行えば、目的の抗原に反応する抗体を発現するファージを濃縮することができる。固定化した抗原に、抗体ファージライブラリを反応させる。次に、結合しなかったファージを洗浄により除去した後に、結合したファージを溶出させる。この溶出させたファージを大腸菌に感染させて増殖させる。以上の操作を数回行うことで抗原に特異的なファージを濃縮することができる。
抗原は、イムノチューブなどのプラスチック表面に抗原を直接吸着させてもよい。また、抗原をビオチン化し、固定化されたストレプトアビジンを介して固定化することで抗原の性質に関係なく、またその構造に影響を与えずに固定することができる。
また、このようにして選択された抗体の抗原認識活性を、さらに詳しく解析し、目的の認識活性を有する抗体を選択してもよい。この場合、解析方法としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、表面プラズモン共鳴等を用いることができる。
＜３．本発明にかかる利用＞
以上に述べたように、本発明の抗体は、医薬品として非常に適した性質を備えている。「医薬品」とは、治療を目的としてヒトに投与する治療薬、および病気、障害等を診断する診断薬等を含む。
＜３．本発明にかかる利用＞
以上に述べたように、本発明の抗体は、医薬品として非常に適した性質を備えている。「医薬品」とは、治療を目的としてヒトに投与する治療薬、および病気、障害等を診断する診断薬等を含む。
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
また、特に明記しない場合は、一般的に用いられる公知の手技を用いたものとする。また、試薬および機器は添付のプロトコールに従って使用した。
なお、以下で作製した抗体のＨ鎖は、すべてＣ末端に、６つのHis（ヒスチジン）タグ
が付いていてもよい。
（１）ＣＤＲ置換工程
（１−１）ファージミドベクターpHPDSの構築
ファージミドベクターpHPDSの構造を図１に示す。pHPDSは、バックボーンとしてpBluescriptを有するベクターであり、図１に示すように、Plac（lacプロモータ）の下流に、２つのgIII leader（M13 geneIII リーダー配列）と、６xHis（６つのヒスチジン繰り返し配列）と、Amber（アンバーストップコドン（TAG））と、gIII（249-406）（M13 geneIIIタンパク質の249-406残基をコードする遺伝子）とを、この順に含んでいる。また、抗生物質耐性遺伝子として、Amp（アンピシリン耐性遺伝子）を含んでいる。
が付いていてもよい。
（１）ＣＤＲ置換工程
（１−１）ファージミドベクターpHPDSの構築
ファージミドベクターpHPDSの構造を図１に示す。pHPDSは、バックボーンとしてpBluescriptを有するベクターであり、図１に示すように、Plac（lacプロモータ）の下流に、２つのgIII leader（M13 geneIII リーダー配列）と、６xHis（６つのヒスチジン繰り返し配列）と、Amber（アンバーストップコドン（TAG））と、gIII（249-406）（M13 geneIIIタンパク質の249-406残基をコードする遺伝子）とを、この順に含んでいる。また、抗生物質耐性遺伝子として、Amp（アンピシリン耐性遺伝子）を含んでいる。
pHPDSの２つのgIII leaderの間にはNheI部位およびBamHI部位があり、これら制限部位間にVLCL（軽鎖遺伝子）が挿入されるようになっている。また、下流側のgIII leaderと６xHisとの間には、SacII部位およびHindIII部位があり、これら制限部位間にVHCH1（重鎖遺伝子）が挿入されるようになっている。
pHPDSの作製方法は以下の通りである。
gIII leaderおよびgIII（249-406）を、pPDS（Yamanaka et al., 1996. J. Immunol. 157, 1156-1162）を鋳型としたPCRによって増幅し、pBluescriptに挿入した。また、NheI部位、SacII部位、および６xHisを部位特異的変異誘発法（site-direct mutation）によって導入することで、pHPDSを作製した。
（１−２）ヒト鋳型遺伝子の調製
実施例で用いたヒトの抗体遺伝子（ヒト鋳型遺伝子）は、以下のようにして調製した。
（１−２）ヒト鋳型遺伝子の調製
実施例で用いたヒトの抗体遺伝子（ヒト鋳型遺伝子）は、以下のようにして調製した。
まず、ヒト抹梢血リンパ球から総ＲＮＡを調製した。このヒト抹梢血リンパ球は、健康な提供者から採取し、ＩＳＯＧＥＮ‐ＬＳでヘパリン処理した血液（ニッポンジーン社）から分離した。この総ＲＮＡを鋳型としoligo-(dT)12-18プライマー（Rche Diagnostic社）およびSuperscript II Synthesis cDNA Kit (GIBCO BRL社)を用いたＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡを合成した。
すべてのヒト鋳型遺伝子は、このｃＤＮＡから、KOD Plus DNA ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲによって増幅した。
本実施例では、ニワトリＦＲと相同性の高いヒトＦＲを用いた方が、抗体の抗原認識活性が高くなると考え、phAb4-31（ニワトリ抗体）のアミノ酸配列と、VBASE（ヒト抗体遺伝子のデータベース）のヒトの可変部の配列とを比較し、最も相同性の高い遺伝子をＰＣＲの鋳型に用いた。
phAb4-31の重鎖ＦＲ残基は、ヒトのVH3-23（DP-47）およびJH4遺伝子に対して70％の相同性を示した。また、phAb4-31の軽鎖ＦＲ残基はヒトのVL3m（3m.102D1）及びJL2遺伝子 配列に72％の相同性を示した。
ニワトリＦＲと最も相同性の高いヒトＦＲ（Ｈ鎖ＦＲはVH3-23、Ｌ鎖ＦＲはVL3m）を含むＶ領域が増幅するようにプライマーを設定した。以下に、ヒト抗体遺伝子の増幅に用いたプライマーセットを示す。
（Ｈ鎖Ｖ領域増幅用プライマー）
VH3F：5'-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA-3'（配列番号１）
VH3R：5'-TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCRGCTCT-3'（配列番号２）
（Ｈ鎖Ｃ領域増幅用プライマー）
JH4F：5'-TTGGATCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT-3'（配列番号３）
CH1R：5'-ATATATAAGCTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号４）
（Ｌ鎖Ｖ領域増幅用プライマー）
VL3F：5'-TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCA-3'（配列番号５）
VL3mR：5'-ACAGTAATAGTCAGCCTCATCTTCTGCCTGGAC-3'（配列番号６）
（Ｌ鎖Ｃ領域増幅用プライマー）
JLF：5'-TTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGT-3'（配列番号７）
CLR：5'-AAGGATCCTTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号８）
なお、Ｖ領域とはＦＲおよびＣＤＲであり、Ｃ領域とは、ここでは結合領域（Ｊ領域、junction region）を含む定常領域を意味する。
（Ｈ鎖Ｖ領域増幅用プライマー）
VH3F：5'-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA-3'（配列番号１）
VH3R：5'-TCTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCRGCTCT-3'（配列番号２）
（Ｈ鎖Ｃ領域増幅用プライマー）
JH4F：5'-TTGGATCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT-3'（配列番号３）
CH1R：5'-ATATATAAGCTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号４）
（Ｌ鎖Ｖ領域増幅用プライマー）
VL3F：5'-TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCA-3'（配列番号５）
VL3mR：5'-ACAGTAATAGTCAGCCTCATCTTCTGCCTGGAC-3'（配列番号６）
（Ｌ鎖Ｃ領域増幅用プライマー）
JLF：5'-TTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGT-3'（配列番号７）
CLR：5'-AAGGATCCTTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号８）
なお、Ｖ領域とはＦＲおよびＣＤＲであり、Ｃ領域とは、ここでは結合領域（Ｊ領域、junction region）を含む定常領域を意味する。
また、VH3FおよびVL3Fは、上記配列に加えて、5'末端側に制限部位（例えばGAATTC）を有していてもよい。また、制限部位の5'末端側にさらに配列（例えばTT）を有していてもよい。
こうして得られたＰＣＲ産物をpBluescriptに挿入し、配列を決定した。
（１−３）ヒト抗体ＣＤＲのニワトリ抗体（B4）ＣＤＲへの置換
上記（１−２）欄で得られたヒト抗体遺伝子のＣＤＲをニワトリ抗体B4のＣＤＲに置換した抗体（huB4）を重複伸長ＰＣＲによって作製した。B4は、抗ＤＮＰ（ハプテン）抗体であり、本実施例ではｓｃＦｖ（一本鎖抗体）を用いた。
（１−３）ヒト抗体ＣＤＲのニワトリ抗体（B4）ＣＤＲへの置換
上記（１−２）欄で得られたヒト抗体遺伝子のＣＤＲをニワトリ抗体B4のＣＤＲに置換した抗体（huB4）を重複伸長ＰＣＲによって作製した。B4は、抗ＤＮＰ（ハプテン）抗体であり、本実施例ではｓｃＦｖ（一本鎖抗体）を用いた。
図２に、huB4作製時の重複伸長ＰＣＲの概略を示す。図２（ａ）、（ｂ）に、それぞれヒト抗体Ｌ鎖・Ｈ鎖、およびB4Ｈ鎖の構造と、その増幅に用いたプライマーとを示し、図２（ｃ）にはＣＤＲ置換工程によって得られた抗体の構造を示す。図２中、矢印はプライマーを設定した位置を示し、矢印に付加した番号は、下記のプライマーの番号を示す。
以下に、各領域の増幅に用いたプライマーセットについて、図２中に示すプライマーの番号、プライマー名、および配列を順に記す。
ただし、以下のプライマーのうち、1-1（HuB4VH-FR1F）は、5'端側にさらに制限部位（例えばCCGCGG）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えばATATAT）を有してもよい。また1-10（CH1R）は、5'端側にさらに制限部位（例えばAAGCTT）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えばATATAT）を有してもよい。また2-2は、5'端側にさらに制限部位（例えばGCTAGC）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えばCTACTA）を有してもよい。また2-8は、5'端側にさらに制限部位（例えばGGATCC）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えばAA）を有してもよい。
（ヒトＨ鎖FR1増幅用プライマー）
1-1. HuB4VH-FR1F：5'-AGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGG-3'（配列番号９）
1-2. HuB4VH-FR1R：5'-GTAACTGCTGAAGTCGAATCCAGAGGCTGCAC-3'（配列番号１０）
（ヒトＨ鎖FR3増幅用プライマー）
1-5. HuVH-FR3F：5'-CGTTTCACCATCTCCAGAGACAAT-3'（配列番号１１）
1-6. HuVH-FR3R：5'-TTTGGCGCAGTAATACACAGCCGT-3'（配列番号１２）
（ヒトＨ鎖FR4およびCH1増幅用プライマー）
1-9. HuVH-FR4F：5'-TGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACC-3'（配列番号１３）
1-10. CH1R：5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号１４）
（ヒトＬ鎖FR1増幅用プライマー）
2-1. HuVL-FR1F：5'-TATGAGCTGACTCAGCCACCCTCA-3'（配列番号１５）
2-2. HuB4VL-FR1R：5'-ATAGTAGCTTCCACCACCTCCAGAGCAGGTGATCCTGGCCGT-3'（配列番号１６）
（ヒトＬ鎖FR2増幅用プライマー）
2-3. HuB4VL-FR2F：5'-GGTGGTGGAAGCTACTATGGTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC-3'（配列番号１７）
2-4. HuB4VL-FR2R：5'-CCTCTTGTCGTTGTAATATATCACCAGCACAGGGGCCTG-3'（配列番号１８）
（ヒトＬ鎖FR3増幅用プライマー）
2-5. HuB4VL-FR3F：5'-ATATATTACAACGACAAGAGGCCTTCAGGAATCCCTGAG-3'（配列番号１９）
2-6. HuB4VL-FR3R：5'-GATGTTGTTGTTGTCTCTACTACCACAGTAATAGTCAGCCTCATC-3'（配列番号２０）
（ヒトＬ鎖FR4およびCL増幅用プライマー）
2-7. HuB4VL-FR4F：5'-AGAGACAACAACAACATCGGTATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG-3'（配列番号２１）
2-8. CLR：5'-TTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号２２）
（B4のVHFR2およびVHCDR2増幅用プライマー）
1-3. HuB4VH-FR2F：5'-GGATTCGACTTCAGCAGTTACACC-3'（配列番号２３）
1-4. HuB4VH-FR2R：5'-GTCTCTGGAGATGGTGAAACGGCCATCCACCGC-3'（配列番号２４）
（B4のHCDR3増幅用プライマー）
1-7. HuB4VH-CDR3F：5'-GCTGTGTATTACTGCGCCAAAAGTGCTGAT-3'（配列番号２５）
1-8. HuB4VH-CDR3R：5'-GACCAGGGTCCCCTGGCCCCATGCGTCGAT-3'（配列番号２６）
以上のプライマーセットで各々の領域を増幅し、得られたＰＣＲ産物を鋳型として重複伸長ＰＣＲを行った。
（ヒトＨ鎖FR1増幅用プライマー）
1-1. HuB4VH-FR1F：5'-AGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGG-3'（配列番号９）
1-2. HuB4VH-FR1R：5'-GTAACTGCTGAAGTCGAATCCAGAGGCTGCAC-3'（配列番号１０）
（ヒトＨ鎖FR3増幅用プライマー）
1-5. HuVH-FR3F：5'-CGTTTCACCATCTCCAGAGACAAT-3'（配列番号１１）
1-6. HuVH-FR3R：5'-TTTGGCGCAGTAATACACAGCCGT-3'（配列番号１２）
（ヒトＨ鎖FR4およびCH1増幅用プライマー）
1-9. HuVH-FR4F：5'-TGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACC-3'（配列番号１３）
1-10. CH1R：5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号１４）
（ヒトＬ鎖FR1増幅用プライマー）
2-1. HuVL-FR1F：5'-TATGAGCTGACTCAGCCACCCTCA-3'（配列番号１５）
2-2. HuB4VL-FR1R：5'-ATAGTAGCTTCCACCACCTCCAGAGCAGGTGATCCTGGCCGT-3'（配列番号１６）
（ヒトＬ鎖FR2増幅用プライマー）
2-3. HuB4VL-FR2F：5'-GGTGGTGGAAGCTACTATGGTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC-3'（配列番号１７）
2-4. HuB4VL-FR2R：5'-CCTCTTGTCGTTGTAATATATCACCAGCACAGGGGCCTG-3'（配列番号１８）
（ヒトＬ鎖FR3増幅用プライマー）
2-5. HuB4VL-FR3F：5'-ATATATTACAACGACAAGAGGCCTTCAGGAATCCCTGAG-3'（配列番号１９）
2-6. HuB4VL-FR3R：5'-GATGTTGTTGTTGTCTCTACTACCACAGTAATAGTCAGCCTCATC-3'（配列番号２０）
（ヒトＬ鎖FR4およびCL増幅用プライマー）
2-7. HuB4VL-FR4F：5'-AGAGACAACAACAACATCGGTATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG-3'（配列番号２１）
2-8. CLR：5'-TTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号２２）
（B4のVHFR2およびVHCDR2増幅用プライマー）
1-3. HuB4VH-FR2F：5'-GGATTCGACTTCAGCAGTTACACC-3'（配列番号２３）
1-4. HuB4VH-FR2R：5'-GTCTCTGGAGATGGTGAAACGGCCATCCACCGC-3'（配列番号２４）
（B4のHCDR3増幅用プライマー）
1-7. HuB4VH-CDR3F：5'-GCTGTGTATTACTGCGCCAAAAGTGCTGAT-3'（配列番号２５）
1-8. HuB4VH-CDR3R：5'-GACCAGGGTCCCCTGGCCCCATGCGTCGAT-3'（配列番号２６）
以上のプライマーセットで各々の領域を増幅し、得られたＰＣＲ産物を鋳型として重複伸長ＰＣＲを行った。
Ｌ鎖は2-1から2-8のプライマーですべての領域が合成される。1-3ｌ1-4、1-7、1-8でＨ鎖が増幅される。また、B4とヒトのFR2はほとんど同じなのでこれらを用いてFR1、FR3、FR4と共にＰＣＲで全長を増幅すると、ＣＤＲのみニワトリであるヒト化抗体が作製できる。
図２（ａ）（ｂ）に示すように、ヒト抗体Ｈ鎖のＦＲ領域（FR1、FR3、FR4）およびＣ領域（CH1領域、CH1 region）と、B4Ｈ鎖のFR2、CDR2、およびCDR3とをＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲ産物はその末端に21bpの重複領域をもっているので、これらＰＣＲ産物を鋳型としてプライマー1-1および1-10によるＰＣＲを行うことで、図２（ｃ）に示す抗体huB4（実施例１）のＨ鎖遺伝子を得た。なお、ヒトFR2とB4FR2はほとんど同じ配列である。
また、同様にしてヒト抗体Ｌ鎖のＦＲ領域（FR1、FR2、FR3、FR4）およびＣ領域（CL）とをＰＣＲで増幅し、2-1と2-8とをプライマーとするＰＣＲを行うことで、図２（ｃ）に示すhuB4のＬ鎖遺伝子を得た。
さらに、Ｌ鎖はNheI/BamHI、Ｈ鎖は SacII/HindIIIサイトを用いてpHPDSに導入した。
（１−４）ヒト抗体ＣＤＲのニワトリ抗体（phAb4-31）ＣＤＲへの置換
上記（１−２）欄で得られたヒト抗体遺伝子のＣＤＲを、ニワトリ抗体pHAb4-31のＣＤＲに置換した抗体（hu4.00）を作製した。ニワトリ抗体phAb4-31は、組換えマウスプリオンタンパク質に特異的に結合する抗体である。
（１−４）ヒト抗体ＣＤＲのニワトリ抗体（phAb4-31）ＣＤＲへの置換
上記（１−２）欄で得られたヒト抗体遺伝子のＣＤＲを、ニワトリ抗体pHAb4-31のＣＤＲに置換した抗体（hu4.00）を作製した。ニワトリ抗体phAb4-31は、組換えマウスプリオンタンパク質に特異的に結合する抗体である。
（１−３）で得られたhuB4を鋳型にし、以下に示すプライマーセットを用いて抗体遺伝子断片を作製した。ただし、FR2、CDR2およびCDR3については、phAb4-31を鋳型とした。これらＰＣＲ産物を（１−３）で述べたように重複伸張ＰＣＲにて連結し、Ｌ鎖およびＨ鎖の遺伝子を得た。このＬ鎖およびＨ鎖をNheI/HindIII サイトを用いてpHPDSに導入した。
なお、B4およびphAb4-31はscFV（一本鎖抗体）だが、実施例（huB4、hu4.00、hu4.15, hu4.17, hu4.06, hu4.29, hu4.32 , hu4.44）、コントロールは共にFab型（Ｈ鎖とＬ鎖からなる抗体）である。
（hu4.00のＨ鎖FR1増幅用プライマー）
3-1. Hu-FR1-overlap：5'-GAATGTTCATAACAAGGGAACAAAAGCGGCTC-3'（配列番号２７）
3-2. Hu412VH-FR1R：5'-ATAATCGCTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACA-3'（配列番号２８）
（phAb4-12のFR2およびCDR2増幅用プライマー）
3-3. Hu412VH-FR2F：5'-GGATTCACCTTCAGCGATTATGGC-3'（配列番号２９）
3-4. Hu412VH-FR2R：5'-TGAGGGCCTGTTGGTGTTGTCATATATCACCAGCACAGGGGC-3'（配列番号３０）
（hu4.00のＨ鎖FR3増幅用プライマー）
1-5. HuVH-FR3F：5'-CGTTTCACCATCTCCAGAGACAAT-3'（配列番号３１）
1-6. HuVH-FR3R：5'-TTTGGCGCAGTAATACACAGCCGT-3'（配列番号３２）
（phAb4-12のＨ鎖CDR3増幅用プライマー）
3-7. Hu412VH-CDR3F：5'-GCTGTGTATTACTGCGCCAAAACTGCTGGC-3'（配列番号３３）
3-8. Hu412VH-CDR3R：5'-GACCAGGGTTCCCTGGCCCCATGTGTCGAT-3'（配列番号３４）
（hu4.00のＨ鎖FR4およびＣ領域増幅用プライマー）
3-9. HuVH-FR4F：5'-TGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACC-3'（配列番号３５）
1-10.CH1R： 5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号３６）
（hu4.00のＬ鎖FR1増幅用プライマー）
4.1. Full-F：5'-TCCTTTCTATTCTCACTCCGCTAGCTATGAGCT-3'（配列番号３７）
4.2.Hu412VL-FR1R：5'-GTAACTTCCAGCATAGGTGCCACCCCCGGAGCAGGTGATCCTGGCCGT-3'（配列番号３８）
（hu4.00のＬ鎖FR2増幅用プライマー）
4.3. Hu412Vl-FR2F：5'-ACCTATGCTGGAAGTTACTATTATGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC-3'（配列番号３９）
4.4. Hu412Vl-FR2R：5'-TGAGGGCCTGTTGGTGTTGTCATATATCACCAGCACAGGGGC-3'（配列番号４０）
（hu4.00のＬ鎖FR3増幅用プライマー）
4.5. Hu412VL-FR3F：5'-GACAACACCAACAGGCCCTCAGGAATCCCTGAGCGA-3'（配列番号４１）
4.6. Hu412VL-FR3R：5'-AACATCGATGCTGTCTGCACTCCCACAGTAATAGTCAGCCTCATC-3'（配列番号４２）
（hu4.00のＬ鎖FR4およびＣ領域増幅用プライマー）
4.7. Hu412VL-FR4F：5'-GCAGACAGCATCGATGTTGGTATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG-3'（配列番号４３）
4.8. HuCL-overlap：5'-TGAGCCGCTTTTGTTCCCTTGTTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号４４）
このようにして得たhu4.00のアミノ酸配列をＬ鎖は配列番号７１に、Ｈ鎖は配列番号７２に示す。
（２）コントロール抗体遺伝子の作製
ヒト化抗体の評価の対照であるコントロール抗体として、phAb4-31の可変部とヒトの定常部とを連結したニワトリ−ヒトキメラ（chimera）抗体（ch4.12）を作製した。
（hu4.00のＨ鎖FR1増幅用プライマー）
3-1. Hu-FR1-overlap：5'-GAATGTTCATAACAAGGGAACAAAAGCGGCTC-3'（配列番号２７）
3-2. Hu412VH-FR1R：5'-ATAATCGCTGAAGGTGAATCCAGAGGCTGCACA-3'（配列番号２８）
（phAb4-12のFR2およびCDR2増幅用プライマー）
3-3. Hu412VH-FR2F：5'-GGATTCACCTTCAGCGATTATGGC-3'（配列番号２９）
3-4. Hu412VH-FR2R：5'-TGAGGGCCTGTTGGTGTTGTCATATATCACCAGCACAGGGGC-3'（配列番号３０）
（hu4.00のＨ鎖FR3増幅用プライマー）
1-5. HuVH-FR3F：5'-CGTTTCACCATCTCCAGAGACAAT-3'（配列番号３１）
1-6. HuVH-FR3R：5'-TTTGGCGCAGTAATACACAGCCGT-3'（配列番号３２）
（phAb4-12のＨ鎖CDR3増幅用プライマー）
3-7. Hu412VH-CDR3F：5'-GCTGTGTATTACTGCGCCAAAACTGCTGGC-3'（配列番号３３）
3-8. Hu412VH-CDR3R：5'-GACCAGGGTTCCCTGGCCCCATGTGTCGAT-3'（配列番号３４）
（hu4.00のＨ鎖FR4およびＣ領域増幅用プライマー）
3-9. HuVH-FR4F：5'-TGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACC-3'（配列番号３５）
1-10.CH1R： 5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号３６）
（hu4.00のＬ鎖FR1増幅用プライマー）
4.1. Full-F：5'-TCCTTTCTATTCTCACTCCGCTAGCTATGAGCT-3'（配列番号３７）
4.2.Hu412VL-FR1R：5'-GTAACTTCCAGCATAGGTGCCACCCCCGGAGCAGGTGATCCTGGCCGT-3'（配列番号３８）
（hu4.00のＬ鎖FR2増幅用プライマー）
4.3. Hu412Vl-FR2F：5'-ACCTATGCTGGAAGTTACTATTATGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGC-3'（配列番号３９）
4.4. Hu412Vl-FR2R：5'-TGAGGGCCTGTTGGTGTTGTCATATATCACCAGCACAGGGGC-3'（配列番号４０）
（hu4.00のＬ鎖FR3増幅用プライマー）
4.5. Hu412VL-FR3F：5'-GACAACACCAACAGGCCCTCAGGAATCCCTGAGCGA-3'（配列番号４１）
4.6. Hu412VL-FR3R：5'-AACATCGATGCTGTCTGCACTCCCACAGTAATAGTCAGCCTCATC-3'（配列番号４２）
（hu4.00のＬ鎖FR4およびＣ領域増幅用プライマー）
4.7. Hu412VL-FR4F：5'-GCAGACAGCATCGATGTTGGTATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG-3'（配列番号４３）
4.8. HuCL-overlap：5'-TGAGCCGCTTTTGTTCCCTTGTTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号４４）
このようにして得たhu4.00のアミノ酸配列をＬ鎖は配列番号７１に、Ｈ鎖は配列番号７２に示す。
（２）コントロール抗体遺伝子の作製
ヒト化抗体の評価の対照であるコントロール抗体として、phAb4-31の可変部とヒトの定常部とを連結したニワトリ−ヒトキメラ（chimera）抗体（ch4.12）を作製した。
作製方法を図３に基づいて説明すると以下の通りである。
図３は、コントロール抗体の作製方法を示す図である。図３に示すように、Ｖ領域（VL、VH）はニワトリ抗体、Ｃ領域（CL、CH1）はヒト抗体を鋳型とし、VLおよびCL、VHおよびCH1を、重複伸長PCRにて結合させてL鎖遺伝子およびH鎖遺伝子を作製した。さらに、L鎖はNheI/BamHI、H鎖はSacII/HindIII部位を用いてpHPDSに導入し、配列を確認した。
ただし、以下のプライマーのうち、6-1（ChickenVLF）は、5'端側にさらに制限部位（例えばGCTAGC）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えばCTACTA）を有してもよい。また6-3（ChickenVH）は、5'端側にさらに制限部位（例えばCCGCGG）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えば TCCTCC）を有してもよい。
また6-6は、5'端側にさらに制限部位（例えばGGATCC）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えばAA）を有してもよい。また6-8は、5'端側にさらに制限部位（例えばAAGCTT）を有してもよく、この制限部位の5'端側にさらに配列（例えばATATAT）を有してもよい。
（phAb4-31のVL増幅用プライマー）
6-1. ChickenVLF：5'-CTGACTCAGCCGGCCTCGGTGTC-3'（配列番号４５）
6-2. ChickenVLR：5'-TAGGACGGTCAGGGTTGTCCCGGC-3'（配列番号４６）
（phAb4-31のVH増幅用プライマー）
6-3. ChickenVH：5'-CCGTGACGTTGGACGAGTC-3'（配列番号４７）
6-4. ChickenVHR：5'-TGTCGACACGATGACTTCGGTCCCG-3'（配列番号４８）
（ヒトのCL増幅用プライマー）
6-5. ChickenVL-CL overlapF：5'-GGACAACCCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3'（配列番号４９）
6-6. CLR：5'-TTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号５０）
（ヒトのCH増幅用プライマー）
6-7. ChickenVH-CH1-overlapF：5'-CGAAGTCATCGTGTCGACAGCCTCCACCAAGGGCCCATCG-3'（配
列番号５１）
6-8. CH1R：5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号５２）
（１−３）〜（１−５）で得られた抗体の抗原結合活性をＥＬＩＳＡにて調べたところ、図５に示すように、huB4はB4（chB4）と同等の抗原結合能を有していた。しかし、hu4.00は抗原結合能を失っていた。また、ch4.12は、phAb4-31と同等の抗原結合活性を有していた（データ不図示）。なお、huB4のＬ鎖・Ｈ鎖のアミノ酸配列を配列番号５７・５８にそれぞれ示す。
（phAb4-31のVL増幅用プライマー）
6-1. ChickenVLF：5'-CTGACTCAGCCGGCCTCGGTGTC-3'（配列番号４５）
6-2. ChickenVLR：5'-TAGGACGGTCAGGGTTGTCCCGGC-3'（配列番号４６）
（phAb4-31のVH増幅用プライマー）
6-3. ChickenVH：5'-CCGTGACGTTGGACGAGTC-3'（配列番号４７）
6-4. ChickenVHR：5'-TGTCGACACGATGACTTCGGTCCCG-3'（配列番号４８）
（ヒトのCL増幅用プライマー）
6-5. ChickenVL-CL overlapF：5'-GGACAACCCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3'（配列番号４９）
6-6. CLR：5'-TTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号５０）
（ヒトのCH増幅用プライマー）
6-7. ChickenVH-CH1-overlapF：5'-CGAAGTCATCGTGTCGACAGCCTCCACCAAGGGCCCATCG-3'（配
列番号５１）
6-8. CH1R：5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号５２）
（１−３）〜（１−５）で得られた抗体の抗原結合活性をＥＬＩＳＡにて調べたところ、図５に示すように、huB4はB4（chB4）と同等の抗原結合能を有していた。しかし、hu4.00は抗原結合能を失っていた。また、ch4.12は、phAb4-31と同等の抗原結合活性を有していた（データ不図示）。なお、huB4のＬ鎖・Ｈ鎖のアミノ酸配列を配列番号５７・５８にそれぞれ示す。
ＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行なった。ＥＬＩＳＡプレートに抗原であるリコンビナントマウスプリオンプロテイン２．５ug/mlを４℃、一晩の条件で固相化した。２５％ Block Ace （雪印乳業社製）入りＰＢＳで、３７℃・１時間でブロッキングを行なった。洗浄後、ファージ液を加えて３７℃・１時間インキュベートした。さらに洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgl（Southern Biotech社製））を加え、３７℃・１時間インキュベートした。洗浄後、o-フェニレンジアミンを用いて発色し、４９０ｎｍの吸収を測定した。
（３）アミノ酸最適化工程
（３−１）ヒト化Fabライブラリの構築
（１−４）で述べたように、hu4.00は抗原結合能を失っていた。そこで、ch4.12およびhu4.00のアミノ酸配列を比較したのが図６である。図６中、配列番号はKabat et al.(1991)によるもので、ch4.12のアミノ酸番号を示す。コロンは同一の残基、アスタリスクはバーニヤ残基、またはパッケージ残基である。
（３）アミノ酸最適化工程
（３−１）ヒト化Fabライブラリの構築
（１−４）で述べたように、hu4.00は抗原結合能を失っていた。そこで、ch4.12およびhu4.00のアミノ酸配列を比較したのが図６である。図６中、配列番号はKabat et al.(1991)によるもので、ch4.12のアミノ酸番号を示す。コロンは同一の残基、アスタリスクはバーニヤ残基、またはパッケージ残基である。
なお、図６には、VLドメイン（VL domain）およびVHドメイン（VH domain）のみを示す。図６で、ＣＤＲとＦＲとはスペースで区切られており、VL・VH共に、Ｎ末端側から、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4がこの順に並んでいる。
なお、hu4.00のアミノ酸配列を、Ｌ鎖は配列番号７１に、Ｈ鎖は配列番号７２にそれぞれ示す。
この比較結果から、ランダム化のターゲットとなるアミノ酸残基は、hu4.00の軽鎖ではL46、66、69、及び71であり、重鎖ではH47、49、67、75、76、及び7８とした。軽鎖のコドンをランダム化するために、各々の3'末端が互いに相補的な２つのオリゴヌクレオチドとVL90及びVL91を用いた。下線部はランダム化した部分である。
（Ｌ鎖ランダム化用プライマー）
VL90：5'-TGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGWYGGTGATATATGACAACACCAACAGGCCCTCAGGAATCCCTGAGCGATTCTCTGGC-3'（配列番号４５）
VL91：5'-ATCTTCTGCCTGGACTCCACTGATGGTCAACGTGRYTGTABTCCCTGAGKHGGAGCCAGAGAATCGCTCAGGGATTCCTGAGGGCCTGTT-3'（配列番号４６）
VL90及びVL91を３’末端でハイブリダイズさせ、KOD Plus DNA polymerase（TOYOBO社製）によって互いを鋳型として伸張させた。こうして得られた144bpの産物は、VL領域の中央部分L34-82をコードしていた。軽鎖の他の領域（L1-44及びL73からCλの3’末端まで）は、hu4.00を鋳型として用いたＰＣＲによって増幅した。
（Ｌ鎖ランダム化用プライマー）
VL90：5'-TGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGWYGGTGATATATGACAACACCAACAGGCCCTCAGGAATCCCTGAGCGATTCTCTGGC-3'（配列番号４５）
VL91：5'-ATCTTCTGCCTGGACTCCACTGATGGTCAACGTGRYTGTABTCCCTGAGKHGGAGCCAGAGAATCGCTCAGGGATTCCTGAGGGCCTGTT-3'（配列番号４６）
VL90及びVL91を３’末端でハイブリダイズさせ、KOD Plus DNA polymerase（TOYOBO社製）によって互いを鋳型として伸張させた。こうして得られた144bpの産物は、VL領域の中央部分L34-82をコードしていた。軽鎖の他の領域（L1-44及びL73からCλの3’末端まで）は、hu4.00を鋳型として用いたＰＣＲによって増幅した。
重鎖は、２つのヌクレオチドVH99及びVH96を用いて、同様にＰＣＲを行い、重鎖のV領域の中央（H36-86）をコードする165bpの産物を得た。下線部はランダム化した部分である。
（重鎖ランダム化用プライマー）
VH99：5'-TGGGTGCGCCAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTkkGTCrsTCAAATTAGCAGCACTGGTAGTAGCacatggtacgcgccggcagtgaagggccgt-3'（配列番号４７）
VH96：5'-GTCCTCAGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACASCGTGYTCTKGGAATTGTCTCTGGAGATGGTGRMACGGCCCTTCACTGCCGGCGCGTACCATGT-3'（配列番号４８）
ランダム化した位置のヒト型残基、ニワトリ型残基、ランダム化によって置換された後のアミノ酸残基、およびランダム化後に選択したアミノ酸残基を、表１に示す。表１中、選択後のアミノ酸で太字表記したものは、多くのクローンで選択されていたアミノ酸である。
（重鎖ランダム化用プライマー）
VH99：5'-TGGGTGCGCCAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTkkGTCrsTCAAATTAGCAGCACTGGTAGTAGCacatggtacgcgccggcagtgaagggccgt-3'（配列番号４７）
VH96：5'-GTCCTCAGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACASCGTGYTCTKGGAATTGTCTCTGGAGATGGTGRMACGGCCCTTCACTGCCGGCGCGTACCATGT-3'（配列番号４８）
ランダム化した位置のヒト型残基、ニワトリ型残基、ランダム化によって置換された後のアミノ酸残基、およびランダム化後に選択したアミノ酸残基を、表１に示す。表１中、選択後のアミノ酸で太字表記したものは、多くのクローンで選択されていたアミノ酸である。
重鎖の他の領域（第２のgeneIIIリーダー配列及びH1-26、並びにH76からCH1の３’末端まで）は、hu4.00を鋳型としたＰＣＲによって増幅した。プライマーを以下に示す。ただし、7-4については、5'側にさらに制限部位（例えばAAGCTT）を有してもよく、この制限部位の5'側にさらに配列（例えばATATAT）を有してもよい。
（VH1-26増幅用プライマー）
7-1. Hu-VHFR1-overlap：5'-GAATGTTCATAACAAGGGAACAAAAGCGGCTC-3'（配列番号４９）
7-2. RaVH-FR1R：5'-CAGCCCCTTGCCGGGCGCCTGGCGCACCCA-3'（配列番号５０）
（VH76〜CH1増幅用プライマー）
7-3. RaVHFR4F：5'-CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGAC-3'（配列番号５１）
7-4. CH1R：5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号５２）
（VL1-44増幅用プライマー）
7-5. Full-F：5'-TCCTTTCTATTCTCACTCCGCTAGCTATGAGCT-3'（配列番号５３）
7-6. RaVL1R：5'-AGGGGCCTGGCCTGGCTTCT GCTGGTACCA-3'（配列番号５４）
（L73〜CL増幅用プライマー）
7-7. RaF4：5'-TTGACCATCAGTGGAGTCCA GGCAGAAGAT-3'（配列番号５５）
7-8. HuCL-overlap：5'-TGAGCCGCTTTTGTTCCCTTGTTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号５６）
30bpの重複を有するこれら６つの産物は、重複伸長ＰＣＲによって連結され（図４）、pHPDSの NheI/HindIII に挿入され、ヒト化ライブラリを構築するのに用いられた。このライブラリは、E.coli XL1-Blue cells（Strategene社）にエレクトロポレーションによって導入された。形質転換体の数は、約2.8×108個であった。
（VH1-26増幅用プライマー）
7-1. Hu-VHFR1-overlap：5'-GAATGTTCATAACAAGGGAACAAAAGCGGCTC-3'（配列番号４９）
7-2. RaVH-FR1R：5'-CAGCCCCTTGCCGGGCGCCTGGCGCACCCA-3'（配列番号５０）
（VH76〜CH1増幅用プライマー）
7-3. RaVHFR4F：5'-CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGAC-3'（配列番号５１）
7-4. CH1R：5'-CTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'（配列番号５２）
（VL1-44増幅用プライマー）
7-5. Full-F：5'-TCCTTTCTATTCTCACTCCGCTAGCTATGAGCT-3'（配列番号５３）
7-6. RaVL1R：5'-AGGGGCCTGGCCTGGCTTCT GCTGGTACCA-3'（配列番号５４）
（L73〜CL増幅用プライマー）
7-7. RaF4：5'-TTGACCATCAGTGGAGTCCA GGCAGAAGAT-3'（配列番号５５）
7-8. HuCL-overlap：5'-TGAGCCGCTTTTGTTCCCTTGTTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC-3'（配列番号５６）
30bpの重複を有するこれら６つの産物は、重複伸長ＰＣＲによって連結され（図４）、pHPDSの NheI/HindIII に挿入され、ヒト化ライブラリを構築するのに用いられた。このライブラリは、E.coli XL1-Blue cells（Strategene社）にエレクトロポレーションによって導入された。形質転換体の数は、約2.8×108個であった。
形質転換後、ライブラリを50μg/mlカルベニシリン、25μl/mlカナマイシン、及び10μl/mlテトラサイクリンを含む２xYT液体培地を用い、37℃で培養し、ヘルパーファージVCSM13を感染させた。この培養液にポリエチレングリコール（PEG）8000（終濃度4% w/w）、およびNaCl（終濃度3% w/w）を加えることで、上清からファージ粒子を沈殿させた。このファージ粒子を1% BSAを含むTBS （50 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl）で再懸濁した。
（３−２）ライブラリからの抗原結合ファージの選択
ELISAプレートを、50 μl の rPrP（組換えプリオンタンパク質） (Prionics社) (１〜４サイクルまでは10 μg/ml、５〜７サイクルまでは1 μg/ml) 4oC オーバーナイトでコーティングした。
（３−２）ライブラリからの抗原結合ファージの選択
ELISAプレートを、50 μl の rPrP（組換えプリオンタンパク質） (Prionics社) (１〜４サイクルまでは10 μg/ml、５〜７サイクルまでは1 μg/ml) 4oC オーバーナイトでコーティングした。
このプレートは、350 μl of TBS containing 3% BSA で、37℃、１時間ブロッキングした。各ウェルにファージ懸濁液（1x1011〜1012cfu）を加え、４℃で一晩静置した。その後、各ウェルをＰＢＳにて洗浄した後、結合したファージを、100 mM glycine-HCl（pH2.2）で溶出し,2M Tris baseで中和した。溶出されたファージは、次のセレクションサイクルで使うために増殖させた。最終的には４８クローンについてＥＬＩＳＡでその抗原結合活性を測定し、さらに塩基配列を決定した。
（３−３）抗体の発現
選択した抗体（Ｆａｂ）、およびキメラ抗体（ch4.12）を、発現ベクターに挿入し、大腸菌内で発現させた。ペリプラズム画分をamicon Ultra-15 (Millipore, USA)によって回収、濃縮した。各種可溶化抗体の濃度は、受容体として抗ヒトIgg鎖抗体（BD Biosciences社）を用い、パーオキシダーゼラベルされた抗ヒトIgλ鎖抗体（Southern Biotech社）を用いたspecific quantitative ELISAで測定した。なお、精製ヒトFab（λ）(BETHYL社)をスタンダードとした。
（３−４）抗原への親和性の測定
それぞれの抗原への親和性は、Biacore 2000 （Biacore AB社）を用いた表面プラズモン共鳴によって測定した。測定に用いたセンサーチップCM5と、N-hydroxysuccinimide、N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride 、およびethanolamine hydrochlorideを含有したAmine coupling kitと、はBiacore AB社から入手した。
（３−３）抗体の発現
選択した抗体（Ｆａｂ）、およびキメラ抗体（ch4.12）を、発現ベクターに挿入し、大腸菌内で発現させた。ペリプラズム画分をamicon Ultra-15 (Millipore, USA)によって回収、濃縮した。各種可溶化抗体の濃度は、受容体として抗ヒトIgg鎖抗体（BD Biosciences社）を用い、パーオキシダーゼラベルされた抗ヒトIgλ鎖抗体（Southern Biotech社）を用いたspecific quantitative ELISAで測定した。なお、精製ヒトFab（λ）(BETHYL社)をスタンダードとした。
（３−４）抗原への親和性の測定
それぞれの抗原への親和性は、Biacore 2000 （Biacore AB社）を用いた表面プラズモン共鳴によって測定した。測定に用いたセンサーチップCM5と、N-hydroxysuccinimide、N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride 、およびethanolamine hydrochlorideを含有したAmine coupling kitと、はBiacore AB社から入手した。
rPrP は、センサーチップに、coupling kit（Biacore AB社）をその使用書の通りに用
いることで固定した。
いることで固定した。
結合アッセイは、濃度を変えた60μlの抗体を用い、20μl/minの流速で行った。
各々の試料について、結合測定後、残った抗体は20μlの10 mM Glycine-HCl（pH 1.5）によって、流速 20 μl/minで洗浄・除去した。各データセットは、BIAevaluation software ver. 3.0 （Biacore AB社）によって解析した。平衡解離定数KDは、kd/kaの値から算出した。結果を表３に示す。
本発明者らは、パッケージング残基、バーニヤ残基、およびH 75・76をランダム化した。これは、H75・76は、CDR-H1とCDR-H2に隣接したループ中に存在し、抗原への接触によって直接または間接的に抗原への結合に影響を与え得るからである。表１に示すように、ランダム化した残基は、L46、L66、L69、L71、H47、H49、H67、H75、H76、H78であった。
ヒト化phAb4-31Fabライブラリから得られたファージから、rPrPに対する結合能を有するクローンをパニング（選抜）した。7回パニングした後、４８クローンが無作為に選ばれ、結合活性をELISAによって解析した。すべてのクローンはrPrPに対する結合能を有していた。選択されたクローンのVL及びVH鎖をコードする塩基配列を決定した。選択されたクローンのランダム化された部位のアミノ酸配列を、同じく表１に示す。ランダム化されたFRで、保存配列が見出された。４８クローンのうち、４６クローンで、H47、 H78のポジションは、それぞれ元のニワトリの残基Phe、Valであった。すべてのクローンで、L46のポジションは、ニワトリ残基のThr または Ser (Thrはニワトリ)であった。48クローンのうちの40は、H75ポジションは、ヒト残基Lysであった。この他のポジション L66、L69、L71、H49、H67、H76では、特によく保存された配列はなかった。しかし、優先的に選択される残基もあった。例えば、L66はTyr、L71はAla、H49はSer、そしてH76はAsnであることが多かった。興味深いことに、L66とL71は、ヒト残基を持ったクローンでは、ヒト鋳型のVL3m （SerとVal）はないものの、ヒトVL3ファミリー（L66はAsnとThr、L71はAla and Thr）で一般的に見られる残基を持っていることが分かった。
よくヒト化された抗体の方が免疫原性が低いと考えられるので、（３−４）で得られたクローンのうち、最もヒト化されていた抗体６つを選択して、その親和性を調べた。
選択した抗体は、hu4.15, hu4.17, hu4.06, hu4.29, hu4.32 , hu4.44 (表２・表３)である。hu4.15 及び hu4.17は、ニワトリの３つの残基（L46, H47、H78）を有していた。他のクローンhu4.06、hu4.29、hu4.32は、さらに１つ のニワトリ残基を有しており、hu4.44は、２つの残基ニワトリ残基をさらに有していた（表２）。
なお、hu4.15, hu4.17, hu4.06, hu4.29, hu4.32 , hu4.44 のＬ鎖のアミノ酸配列を、配列番号５９〜６４にそれぞれ示し、Ｈ鎖のアミノ酸配列を配列番号６５〜７０にそれぞれ示す。
これらのクローンおよびニワトリ抗体（ch4.12）の抗原結合親和性は、表面プラズモン共鳴を利用して、BIAcore instrument によって測定した(表３)。アミノ酸置換は、結合・解離速度定数にわずかに影響を与えた。算出されたヒト化抗体のKDは、15 pMから61 pMの範囲であり、親抗体のそれは 63 pMであった。これらの結果は、アミノ酸を最適化した抗体が、親抗体（phAb4-31）と同等の結合親和性を有していることを示す。
現在、mAbは、有効な治療薬として注目されている。ヒト抗体自体を製造する新たな方法も開発されてきている。現在、ファージディスプレイを利用して、ヒトの抗体ライブラリからmAbを選択すること、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスを用いて産出すること等が検討されている。
しかし、従来用いられている免疫学的な宿主（マウス、ラット、ウサギ）と比較してニワトリは、いくつかの利点を有している。
まず、ニワトリは哺乳類と進化上、つまり遺伝子配列上離れているので、哺乳類間で高度に保存された分子に対しても、抗体を産生しうる。
次に、ヒト抗原に対するニワトリの抗体は、マウスのホモログに対しても反応しうる。実際、抗プリオン抗体であるphAb4-3,phAb4-19は、ヒト、マウス、羊、牛の PrP（プリオンタンパク質）に結合する（Nakamura et al., 2004）。これは、既に述べたように、抗体医薬の開発には重要なことである。
３つ目に、ニワトリのmAbsは、ハイブリド−マ、またはファージディスプレイを利用して産生しやすいことが挙げられる。
最後に、本発明者らが明らかにしたことだが、ニワトリの抗体は、ヒト化しやすく、親抗体と同等の高い親和性及び特異性を示す。
ニワトリのＦＲのアミノ酸残基の多様性はげっ歯類よりもかなり小さい。そのため、我々が今回選択したヒトＦＲ配列を用いて、すべてのニワトリの抗体をヒト化することが可能である。
本発明の抗体は、治療薬および診断薬等の医薬品に好適に用いることができる。
Claims (3)
- ヒト由来の抗体中の相補性決定領域をニワトリ由来の相補性決定領域に置換する相補性決定領域置換工程と、
ヒト由来の抗体の可変部のアミノ酸配列と、ニワトリ抗体の枠組み構造領域のアミノ酸配列とを比較する工程とを含み、
ヒト由来の抗体中の枠組み構造領域のアミノ酸配列として、ニワトリ抗体の枠組み構造領域のアミノ酸配列と最も相同性の高いアミノ酸配列を用いることを特徴とするヒト化ニワトリ抗体の製造方法。 - 上記ヒト由来の抗体中の枠組み構造領域に含まれる補助アミノ酸を最適化するアミノ酸最適化工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のヒト化ニワトリ抗体の製造方法。
- 上記アミノ酸最適化工程は、
上記補助アミノ酸をランダム化するランダム化工程と、
上記ランダム化工程によってランダム化されたアミノ酸を含む抗体のうち、抗原認識活性を有する抗体を選択する選択工程とをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のヒト化ニワトリ抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009236484A JP2010004895A (ja) | 2009-10-13 | 2009-10-13 | ヒト化ニワトリ抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009236484A JP2010004895A (ja) | 2009-10-13 | 2009-10-13 | ヒト化ニワトリ抗体の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005056665A Division JP4452884B2 (ja) | 2005-03-01 | 2005-03-01 | 抗体およびその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010004895A true JP2010004895A (ja) | 2010-01-14 |
Family
ID=41586079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009236484A Pending JP2010004895A (ja) | 2009-10-13 | 2009-10-13 | ヒト化ニワトリ抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2010004895A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180053756A (ko) * | 2015-10-05 | 2018-05-23 | 프레닥스 에이비 | 인간화 항 psa(5a10) 항체 |
| JP2018183166A (ja) * | 2018-07-20 | 2018-11-22 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | ニューレグリンに対して非競合的でアロステリックな抗ヒトｈｅｒ３抗体及びその使用 |
| JP2022535808A (ja) * | 2019-06-04 | 2022-08-10 | ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド | 胸線間質性リンパ球増殖因子に結合可能な抗体およびその使用 |
| JP2023554422A (ja) * | 2020-12-16 | 2023-12-27 | メルス ナムローゼ フェンノートシャップ | がんの治療のための多重特異性抗体 |
| JP2024500308A (ja) * | 2020-12-03 | 2024-01-09 | 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司 | 抗ｔｓｌｐ抗体医薬組成物及びその使用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002510481A (ja) * | 1998-04-02 | 2002-04-09 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 抗体変異体及びその断片 |
-
2009
- 2009-10-13 JP JP2009236484A patent/JP2010004895A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002510481A (ja) * | 1998-04-02 | 2002-04-09 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 抗体変異体及びその断片 |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180053756A (ko) * | 2015-10-05 | 2018-05-23 | 프레닥스 에이비 | 인간화 항 psa(5a10) 항체 |
| JP2018531045A (ja) * | 2015-10-05 | 2018-10-25 | フレダックス・アクチエボラーグ | 抗体ポリペプチド及びそれらの使用 |
| US11332543B2 (en) | 2015-10-05 | 2022-05-17 | Fredax Ab | Antibody polypeptides and uses thereof |
| KR102783861B1 (ko) | 2015-10-05 | 2025-03-21 | 프레닥스 에이비 | 인간화 항 psa(5a10) 항체 |
| US12441808B2 (en) | 2015-10-05 | 2025-10-14 | Fredax Ab | Antibody polypeptides and uses thereof |
| JP2018183166A (ja) * | 2018-07-20 | 2018-11-22 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | ニューレグリンに対して非競合的でアロステリックな抗ヒトｈｅｒ３抗体及びその使用 |
| JP2022535808A (ja) * | 2019-06-04 | 2022-08-10 | ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド | 胸線間質性リンパ球増殖因子に結合可能な抗体およびその使用 |
| JP7628966B2 (ja) | 2019-06-04 | 2025-02-12 | ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド | 胸線間質性リンパ球増殖因子に結合可能な抗体およびその使用 |
| JP2024500308A (ja) * | 2020-12-03 | 2024-01-09 | 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司 | 抗ｔｓｌｐ抗体医薬組成物及びその使用 |
| JP2023554422A (ja) * | 2020-12-16 | 2023-12-27 | メルス ナムローゼ フェンノートシャップ | がんの治療のための多重特異性抗体 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107614529B (zh) | Pd-l1抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| Romao et al. | Identification of useful nanobodies by phage display of immune single domain libraries derived from camelid heavy chain antibodies | |
| KR102662387B1 (ko) | B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 | |
| JP7405831B2 (ja) | ヒトｉｌ－４ｒ結合抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医学的使用 | |
| Pelat et al. | Isolation of a human-like antibody fragment (scFv) that neutralizes ricin biological activity | |
| Finlay et al. | Affinity maturation of a humanized rat antibody for anti-RAGE therapy: comprehensive mutagenesis reveals a high level of mutational plasticity both inside and outside the complementarity-determining regions | |
| US9279017B2 (en) | Preparation of scFv antibody fragments | |
| US20190031770A1 (en) | Intercalated single-chain variable fragments | |
| JP2017221200A (ja) | 二重標的化 | |
| JP2020513791A5 (ja) | ||
| RS61781B1 (sr) | Antitela koja ciljaju antigen za sazrevanje b-ćelija i postupci upotrebe | |
| JP2015524404A (ja) | 高度に保存された標的に対するラクダ科動物由来の配列を含む抗体 | |
| CN101432015A (zh) | 功能性抗体 | |
| CN104583238A (zh) | 用于产生具有物种间、靶标内交叉反应性之抗体分子的方法 | |
| WO2022117040A1 (zh) | 抗人b7-h3抗体及其应用 | |
| JP2024014897A (ja) | 混合結合ドメイン | |
| JP2010004895A (ja) | ヒト化ニワトリ抗体の製造方法 | |
| AU2006329208B2 (en) | Methods for generating and screening fusion protein libraries and uses thereof | |
| JP4452884B2 (ja) | 抗体およびその利用 | |
| JP2016500367A (ja) | デュアルターゲティング | |
| WO2025228316A1 (en) | Anti-n3pglu amyloid beta antibodies and uses thereof | |
| KR20100021657A (ko) | 프로테아제 활성화된 수용체-１ (ｐａｒ１)의 길항제 항체 | |
| CN120882746A (zh) | 结合至nkg2a和pd-l1的药剂及其用途 | |
| HK40106852A (zh) | 犬抗体文库 | |
| Hui | Targeted neurotherapeutics for chronic inflammatory pain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091013 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091208 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100511 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100809 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100824 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20101029 |