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JP2009533347A - 抗ＴＮＦα抗体の複合体 - Google Patents

抗ＴＮＦα抗体の複合体 Download PDF

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JP2009533347A JP2009504347A JP2009504347A JP2009533347A JP 2009533347 A JP2009533347 A JP 2009533347A JP 2009504347 A JP2009504347 A JP 2009504347A JP 2009504347 A JP2009504347 A JP 2009504347A JP 2009533347 A JP2009533347 A JP 2009533347A
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メアリー ジェイ． ボサード，
ゲイル スティーブンソン，
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Abstract

抗ＴＮＦ抗体および１つ以上の非ペプチド水溶性ポリマーの複合体を提供する。一般的に、非ペプチド水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）またはその派生物である。特に、複合体を含む組成物、複合体を形成する方法、および組成物を患者に投与する方法も提供する。本発明の１つ以上の実施形態において、加水分解に安定な結合を通じて、水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣を含む複合体を提供する。本発明の別の実施形態において、水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣を含む複合体を提供する。

Description

（発明の分野）
特に、本発明の１つ以上の実施形態は、概して抗ＴＮＦα抗体（例えば、腫瘍壊死因子α、すなわち「ＴＮＦα」に結合する能力を有する抗体）およびポリマーを含む複合体に関する。さらに、本発明は（特に）複合体を含む組成物、複合体を合成する方法、および組成物を投与する方法に関する。
（発明の背景）
代替的に「カヘキシン」または「カケクチン」と称される腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、損傷した白血球、内皮細胞、および特定の組織により放出される１８５アミノ酸長サイトカインである。ＴＮＦαは、２１２アミノ酸長前駆体膜貫通タンパク質の分裂により生体内で形成される。この前駆体膜貫通タンパク質の分裂時に、集合して複合体を形成する可溶性分子が放出される。次にこれらの錯体は、様々な細胞で認められる腫瘍壊死因子レセプタ（ＴＮＦ‐Ｒ）に結合し、それによって、炎症性サイトカインインターロイキン‐６およびインターロイキン‐８の放出、内皮層透過性の増強（その結果、白血球遊走を可能にする）、好中球および好酸球の活性、および滑液および軟骨細胞により生成された組織分解酵素の誘導等の一連の炎症誘発効果をもたらす。
ＴＮＦαレベルの上昇は、多くの病状に関連する。例えば、関節リウマチ患者の関節おいて、高いＴＮＦα濃度が認められる場合が多い。これらの患者において、ＴＮＦαによる組織分解酵素の導入は、関節および骨組織の分解および侵食をもたらす。関節リウマチに加えて、高いＴＮＦα濃度に関連する別の疾患はクローン病である。クローン病の正確な原因は不明であるが、クローン病患者は、消化管の炎症および潰瘍形成を経験する。高いＴＮＦαレベルに関係しているその他の疾患および状態は、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、尋常性乾癬、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、および自己免疫性糖尿病サイトカイン誘導性膵島破壊を含む。
関節リウマチ（および高いＴＮＦαに関連するその他の疾患）の患者を治療するための現行のアプローチは、ＴＮＦαが体内でＴＮＦαレセプタに結合する能力を中和または減少させるステップを含む。そのようなアプローチでは、ＴＮＦα（例えば、抗ＴＮＦα抗体）に結合するモノクローナル抗体を患者に投与することにより、ＴＮＦαがＴＮＦαレセプタに結合する能力を抑制する。市販で入手可能な形態の抗ＴＮＦα抗体を使用することができ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）という名称で市販される。Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．社、Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）およびアダリムマブ（ＨＵＭＨＲＡ（登録商標）という名称で市販される。Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を含む。インフリキシマブは、一般に少なくとも２時間以上、静脈内注射により投与され、一方アダリムマブは、一般に２週間ごとに皮下投与される。インフリキシマブはキメラ抗体であるため、この抗体をヒトに投与することにより、免疫原性反応を引き起こす可能性があるという懸念がある。さらに、アダリムマブは、ＴＮＦに特異的なヒトモノクローナル抗体であるが、成人関節リウマチ患者の約５％は、治療中少なくとも一度アダリムマブに対する低力価抗体を発現し（３つの研究を通じて実証されたように）、アダリムマブの長期免疫原性は不明である。
ＴＮＦαの効果を中和または減少させる別のアプローチは、循環しているＴＮＦαを結合することにより、機能している細胞表面レセプタへの結合に使用できるＴＮＦαの量を削減するステップを含む。このアプローチは、ＴＮＦαレセプタ（またはＴＮＦα様レセプタ）の投与により影響を受ける可能性がある。外因性ＴＮＦαレセプタ（またはＴＮＦα様レセプタ）を過剰投与することにより、循環しているＴＮＦαは、外因性および機能していないレセプタに結合され、その結果、外因性ＴＮＦαレセプタの活性に使用できるなＴＮＦαの量が著しく減少する。このアプローチに基づく市販の医薬製剤は、エタナーセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）という名称で市販されている。Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ｐ７５ ＩＩ型ＴＮＦ可溶性レセプタを含む。現在は市販されていないが、ＰＥＧｓｕｎｅｒｃｅｐｔ（またはＰＥＧ‐ｓＴＮＦ‐ＲＩ）は、ＰＥＧ化バージョンのｐ５５ Ｉ型ＴＮＦレセプタである。エタナーセプトは、希なケースの中枢神経系疾患、例えば、多発性硬化症、脊髄炎および視神経炎、ならびに再生不良性貧血を含む汎血球減少等に関連するとされている。エタナーセプトと同じ問題を起こすかどうかを知るためのＰＥＧｓｕｎｅｒｃｅｐｔを用いた実験は比較的少ない。
そのため、例えば、ＴＮＦαの効果を生体内で減少させることを目的とする治療に関連する免疫原性の問題に取り組む必要がある。本発明は、例えば、水溶性ポリマーを抗ＴＮＦ抗体に結合し、それにより水溶性ポリマーと抗ＴＮＦ抗体との複合体を形成することによって、免疫原性の問題（および／またはその他の問題）に対処することを意図する。本発明は、この実施形態およびその他の実施形態を含み、新規かつ当該技術分野によりまったく提案されていないと考えられる。
（発明の要約）
したがって、直接またはスペーサ部分を通じて、非ペプチド水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体を含む複合体が提供される。一般に、複合体は組成物の一部として提供される。
本発明の１つ以上の実施形態において、加水分解に安定な結合を通じて、水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣を含む複合体を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態において、水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣を含む複合体を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態において、水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣を含む複合体を提供する。ここで、抗ＴＮＦα抗体はアミンにおいて共役結合している。
本発明の１つ以上の実施形態において、線状水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣を含む複合体を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態において、分岐した水溶性ポリマーに共役結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣を含む複合体を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される抗ＴＮＦα抗体は、二量体または三量体でない（したがって、複合体内で対応する抗ＴＮＦα抗体残渣は二量体または三量体でない）。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される抗ＴＮＦα抗体は、一価である（したがって、複合体内で対応する抗ＴＮＦα抗体残渣は一価である）。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される抗ＴＮＦα抗体は、ＣＤＲ移植されない（したがって、複合体内で対応する抗ＴＮＦα抗体残渣はＣＤＲ移植されない）。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される抗ＴＮＦα抗体は、全長抗体である（したがって、複合体内で対応する抗ＴＮＦα抗体残渣は全長抗体である）。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される抗ＴＮＦα抗体は、ガラクトシル化されない（したがって、複合体内で対応する抗ＴＮＦα抗体残渣はガラクトシル化されない）。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される抗ＴＮＦα抗体は、グリコシル化されない（したがって、複合体内で対応する抗ＴＮＦα抗体残渣はグリコシル化されない）。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、
ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、
（ａ）はゼロまたは１であり、
Ｘは存在する場合、１つ以上の原子から成るスペーサ部分であり、
Ｒ１はＨまたは１〜３の炭素原子を含む有機ラジカルであり、
ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、ｎは約３〜約１４００の範囲であり、ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、ｎは約３〜約１４００の範囲であり、ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、
（ｎ）は２〜４０００であり、
（ｇ’）は０、１、２、または３であり、
（ｃ）は１〜１０であり、
各Ｒ２はＨまたは有機ラジカルであり、
各Ｒ３はＨまたは有機ラジカルであり、
（ｊ）は０〜２０であり、
ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、
（ｎ）は２〜４０００であり、
（ｇ’）は０、１、２、または３であり、
（ｃ）は１〜１０であり、
各Ｒ２はＨまたは有機ラジカルであり、
各Ｒ３はＨまたは有機ラジカルであり、
（ｊ）は０〜２０であり、
ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、
ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、
（ａ）はゼロまたは１であり、
Ｘは存在する場合、１つ以上の原子から成るスペーサ部分であり、
Ｒ１は、Ｈまたは１〜３つの炭素原子を含む有機ラジカルであり、
ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、
ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、
（ａ）はゼロまたは１であり、
Ｘは存在する場合、スペーサ部分であり、
ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の構造から成る複合体を提供し、
Figure 2009533347
 式中、
ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、
（ａ）はゼロまたは１であり、
（ｊ）はゼロまたは１から約２０までの整数であり、
（ｂ）はゼロまたは１から約２０までの整数であり、
各Ｒ２は存在する場合、Ｈまたは有機ラジカルであり、
各Ｒ３は存在する場合、Ｈまたは有機ラジカルであり、
ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣である。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）である。水溶性ポリマーの重量平均分子量は、以下の範囲：約６，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトン、および約２０，０００〜約６５，０００ダルトンのうちの１つ以上であってもよい。
本発明の１つ以上の実施形態において、複合体の形成に使用される抗ＴＮＦα抗体は、インフリキシマブまたはアダリムマブである（したがって、複合体とともに認められる対応する抗ＴＮＦα抗体残渣は、インフリキシマブまたはアダリムマブである）。
本発明の１つ以上の実施形態において、それぞれ直接または１つ以上の原子で構成されるスペーサ部分を通じて、ＰＥＧ分子に結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣から成る、複数の複合体を含む組成物を提供する。ここで、組成物中の全複合体のうちの少なくとも５０％は、Ｎ末端モノＰＥＧ化される。
本発明の１つ以上の実施形態において、それぞれ直接または１つ以上の原子で構成されるスペーサ部分を通じて、水溶性ポリマーに結合している抗ＴＮＦα抗体の残渣から成る複数の複合体を含む組成物を提供する。ここで、組成物中の全複合体のうちの少なくとも７５％は、直接または１つ以上の原子で構成されるスペーサ部分を通じて、５つ以下の水溶性ポリマーに結合している抗ＴＮＦ抗体の残渣を有する。
本発明の１つ以上の実施形態において、それぞれ直接または１つ以上の原子で構成されるスペーサ部分を通じて、水溶性ポリマーに結合している抗ＴＮＦ抗体の残渣から成る、複数の複合体を含む組成物を提供する。ここで、組成物中の全複合体のうちの少なくとも７５％は、直接または１つ以上の原子で構成されるスペーサ部分を通じて、３つ以下の水溶性ポリマーに結合している抗ＴＮＦ抗体の残渣を有する。
本発明の１つ以上の実施形態において、抗ＴＮＦ抗体の残渣および水溶性ポリマーの複合体から成る組成物を患者に皮下投与するステップを含む、複合体を送達する方法を提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態について詳細に説明する前に、本発明は、当然のことながら特定のポリマー、合成技術、抗ＴＮＦ抗体等に限定されない。これは、それらが変化する可能性があるためである。
本明細書および対象とする請求項で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白な別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意する。したがって、例えば「ａ ｐｏｌｙｍｅｒ」への言及は、単一のポリマーおよび２つ以上の同一または異なるポリマーを含み、「ａｎ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ」への言及は、単一の任意の賦形剤および２つ以上の同一または異なる任意の賦形剤等を含む。
本発明の１つ以上の実施形態の説明および主張において、以下の用語は、下記の定義に従って使用される。
本明細書において「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」および「ポリ（エチレングリコール）」は代替可能であり、任意の非ペプチド水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。一般に、本発明に従って使用するＰＥＧは、以下の構造「‐（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ‐」を含み、（ｎ）は２〜４０００である。本明細書においてＰＥＧは、末端酸素が置換されているかどうかによって、「‐ＣＨ２ＣＨ２‐Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ‐ＣＨ２ＣＨ２‐」および「‐（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ‐」も含む。明細書および請求項全体において「ＰＥＧ」という用語は、様々な末端または「末端封止」基等を有する構造を含むことに留意すべきである。また「ＰＥＧ」という用語は、大部分、つまり５０％を越える‐ＯＣＨ２ＣＨ２‐反復サブユニットを含むポリマーを意味する。特定の形態に関して、ＰＥＧは任意の数の様々な分子量、および「分岐型」、「線状」、「フォーク状」、「多官能性」等の構造または形状であってもよく、それらは以下で詳細に説明される。
「末端封止した」および「末端的に封止した」という用語は、本明細書において同義的に使用され、末端封止部分を有するポリマーの末端または端点を意味する。必ずしもそうではないが、一般に、末端封止部分はヒドロキシまたはＣ１-２０アルコキシ基を含み、より好ましくはＣ１-１０アルコキシ基、およびさらに好ましくはＣ１-５アルコキシ基を含む。そのため、末端封止部分の例は、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、およびベンジルキシ）、およびアリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロ等を含む。末端封止部分は、ポリマーにおける末端モノマーの１つ以上の原子を含んでもよいことに留意する必要がある［例えば、ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ‐およびＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ‐における末端封止部分「メトキシ」］。さらに、前述の末端封止部分はそれぞれ飽和、不飽和、置換、および非置換形態を想定する。さらに、末端封止基はシランであってもよい。また末端封止基は、検出可能な標識を有利に含んでもよい。ポリマーが検出可能な標識を含む末端封止基を有する場合、ポリマーおよび／またはポリマーが結合される部分（例えば、活性剤）の量または位置は、好適な検出器を使用して特定できる。そのような標識は、蛍光体、化学発光体、酵素標識に使用される部分、比色分析（例えば、染色）、金属イオン、放射性部分等を含むが、それらに限定されない。好適な検出器は、光度計、フィルム、分光計等を含む。また末端封止基は、リン脂質を有利に含んでもよい。ポリマーがリン脂質を含む末端封止基を有する場合、ポリマーおよび結果として生じる複合体に対して固有の特性が付与される。典型的なリン脂質は、ホスファチジルコリンと称されるリン脂質類から選択されるものを含むが、それらに限定されない。特定のリン脂質は、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、およびレシチンから成る群から選択されるものを含むが、それらに限定されない。
本明細書に記載されるポリマーに関して「非自然発生的」とは、その全体が自然に見られないポリマーを意味する。しかし本発明の非自然発生的ポリマーは、全体ポリマー構造が自然に見られない限り、自然発生する１つ以上のモノマーまたはモノマー部分を含んでもよい。
「水溶性ポリマー」における「水溶性」という用語は、室温で水に溶解する任意のポリマーである。一般に水溶性ポリマーは、ろ過後に同一の溶液によって伝達される光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を伝達する。重量に基づいて、水溶性ポリマーは、好ましくは少なくとも約３５％（重量で）水溶性、より好ましくは少なくとも約５０％（重量で）水溶性、さらに好ましくは約７０％（重量で）水溶性であり、一層好ましくは約８５％（重量で）水溶性である。しかし最も好ましくは、水溶性ポリマーは約９５％（重量で）水溶性であるか、または完全に水溶性である。
ＰＥＧ等の水溶性ポリマーの文脈において、分子量は、数平均分子量または重量平均分子量で表すことができる。別段の指示がない限り、本明細書における分子量に対するすべての言及は、重量平均分子量を意味する。数平均および重量平均による分子量の測定は、ゲル浸透クロマトグラフィまたはその他の液体クロマトグラフィ技術を使用して行うことができる。その他の分子量値測定方法を使用することもできる。例えば、末端基分析または束一的特性の測定（例えば、凍結点の下降、沸点の上昇、または浸透圧）を使用して数平均分子量を判定するか、または光散乱法、超遠心分離法、または粘度測定を使用して重量平均分子量を判定する。本発明のポリマーは、一般に多分散系であり（例えば、ポリマーの数平均分子量および重量平均分子量は等しくない）、低い多分散値、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらに好ましくは約１．１０未満、一層好ましくは約１．０５未満、および最も好ましくは約１．０３未満を有する。
「活性」または「活性した」という用語は、特定の官能基と併せて使用される場合、別の分子上の求電子物質または求核試薬と容易に反応する反応性官能基を意味する。これは、強い触媒または非常に実用的でない反応条件を反応に要する基（例えば、「非反応性」または「不活性」基）とは対照的である。
本明細書において「官能基」という用語またはその任意の同義語は、その保護形態、および非保護形態を包含することを意味する。
本明細書において「スペーサ部分」、「結合」、および「リンカー」という用語は、ポリマーセグメントおよび抗ＴＮＦ抗体の末端、または抗ＴＮＦ抗体の求電子物質または求核試薬等の相互連結部分の結合に任意で使用される原子または原子の集合という意味で使用される。スペーサ部分は、加水分解に安定であるか、または生理的に加水分解できる結合、あるいは酵素的に分解可能な結合を含んでもよい。文脈上明白な別段の指示がない限り、スペーサ部分は、化合物の任意の２つの要素間に任意で存在する（例えば、抗ＴＮＦ抗体の残渣および水溶性ポリマーを含む提供複合体は、直接またはスペーサ部分を通じて間接的に結合できる）。
「アルキル」は、一般に約１〜１５原子長の範囲の炭化水素鎖を意味する。そのような炭化水素鎖は、必ずしもそうではないが、好ましくは飽和状態であり、また分岐型または直鎖であってもよいが、一般には直鎖が好まれる。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１‐メチルブチル、１‐エチルプロピル、３‐メチルペンチル等を含む。本明細書において、「アルキル」はシクロアルキル、およびシクロアルキレン含有アルキルを含む。
「低アルキル」は、１〜６炭素原子を含むアルキル基を意味し、メチル、エチル、ｎ‐ブチル、ｉ‐ブチル、およびｔ‐ブチルにより例示されるように、直鎖または分岐型であってもよい。
「シクロアルキル」は飽和または不飽和環状炭化水素鎖を意味し、架橋、融合、またはスピロ環状化合物を含み、好ましくは３〜約１２炭素原子、より好ましくは３〜約８炭素原子で構成されている。「シクロアルキレン」は、鎖を環状環系における任意の２つの炭素において鎖を結合することにより、アルキル鎖に挿入されるシクロアルキル基を意味する。
「アルコキシ」は‐Ｏ‐Ｒ基を意味する。ここで、Ｒはアルキルまたは置換アルキル、好ましくはＣ１-６アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ等）である。
例えば、「置換アルキル」等における「置換」という用語は、１つ以上の非干渉置換基で置換された部分（例えば、アルキル基）を意味する。そのような非干渉置換基は、アルキル、例えばシクロプロピル、シクロブチル等のＣ３-８シクロアルキル、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨウ素等のハロ、シアノ、アルコキシ、下位フェニル、置換フェニル等を含むが、それらに限定されない。「置換アリール」は、１つ以上の非干渉基を置換基として有するアリールである。フェニル環上の置換基の場合、置換基は任意の配置（例えば、オルト、メタ、またはパラ）にあってもよい。
「非干渉置換基」は、分子中に存在する場合、一般に分子内に含まれるその他の官能基と反応しない基である。
「アリール」は、１つ以上の芳香環、５または６コア炭素原子のそれぞれを意味する。アリールは、ナフチルに見られるように融合されるか、またはビフェニルに見られるように融合されなくてもよい複数のアリール環を含む。またアリール環は、１つ以上の環状炭化水素、ヘテロアリール、または複素環式環と融合されるか、または融合されなくてもよい。本明細書において「アリール」はヘテロアリールを含む。
「ヘテロアリール」は、１〜４ヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、または窒素、あるいはそれらの組み合わせを含むアリール基である。またヘテロアリール環は、１つ以上の環状炭化水素、複素環式アリール、またはヘテロアリール環と融合されてもよい。
「ヘテロサイクル」または「複素環式」は、不飽和または芳香特性の有無にかかわらず、炭素でない少なくとも１つの環原子を有する５〜１２原子、好ましくは５〜７原子から成る１つ以上の環を意味する。好ましいヘテロ原子は、硫黄、酸素、および窒素を含む。
「置換ヘテロアリール」は、１つ以上の非干渉基を置換基として有するヘテロアリールである。
「置換ヘテロサイクル」は、非干渉置換基から形成された１つ以上の側鎖を有する複素環である。
本明細書において「有機ラジカル」は、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールを含む。
「求電子物質」および「求電子基」は、イオンまたは原子あるいは原子の集合を意味し、イオン性であってもよく、例えば、電子を探索し、求核試薬と反応可能な中心等の求電子中心を有する。
「求核試薬」および「求核基」は、イオンまたは原子あるいは原子の集合を意味し、イオン性であってもよく、例えば、求電子中心を探索する中止、または求電子物質を有する求核中心を有する。
「生理学的に開裂可能な」または「加水分解可能な」または「分解可能な」結合は、生理学的条件下で水と反応する（例えば、加水分解される）結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子を接続する一般型の結合だけでなく、これらの中心原子に結合した置換基に依存する。加水分解に不安定または弱い適切な結合は、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドを含むが、それらに限定されない。
「酵素分解可能な結合」は、１つ以上の酵素により分解されやすい結合を意味する。
「加水分解に安定な」連結または結合は、水中で実質的に安定な、つまり相当な程度の生理学的条件下で長期間加水分解を受けない化学結合、一般に共役結合を意味する。加水分解に安定な結合の例は、炭素‐炭素結合（例えば、脂肪族鎖における）、エーテル、アミド、ウレタン等を含むが、それらに限定されない。一般に、加水分解に安定な結合は、生理学的条件下で約１〜２％／日未満の加水分解率を示すものである。代表的な化学結合の加水分解率は、最も標準的な化学のテキストにおいて見つけることができる。
「薬学的に許容しうる賦形剤」または「担体」は、本発明の組成物に任意で含まれてもよく、患者に著しく有害な毒性効果をもたらさない賦形剤を意味する。「薬学的に有効な量」、「生理学的に有効な量」、および「治療上有効な量」は、本明細書において同義的に使用され、血流または標的組織において望ましいレベルの複合体（または対応する非複合体抗ＴＮＦ抗体）を提供するために必要なポリマー抗ＴＮＦ抗体複合体の量を意味する。精密な量は多くの要素、例えば、特定の抗ＴＮＦ抗体、治療組成物の化合物および物理特性、意図される患者集団、個別の患者の考慮事項等に依存し、当該技術分野に精通する者であれば、本明細書で提供される情報に基づいて容易に決定できる。
「多官能」とは、３つ以上の官能基を有するポリマーを意味する。ポリマーに含まれる官能基は、同一であるかまたは異なってもよい。本発明の多官能ポリマー試薬は、一般に約３〜１００の官能基、３〜５０の官能基、３〜２５の官能基、３〜１５の官能基、３〜１０の官能基、または３、４、５、６、７、８、９、１０の官能基をポリマー骨格内に含む。
本明細書において「抗ＴＮＦα抗体」という用語は、ヒトＴＮＦαとの結合を通じてヒトＴＮＦαの生物活性を中和することにより、結合したヒトＴＮＦαが抗ＴＮＦαレセプタに結合する能力が低下する部分（例えば全長抗体）を意味する。また抗ＴＮＦα抗体は、ポリマー試薬との反応に好適な少なくとも１つの求電子基または求核基を有する。さらに、「抗ＴＮＦα抗体」という用語は、結合前の抗ＴＮＦα抗体、および結合後の抗ＴＮＦα抗体残渣を包含する。以下で詳細に説明されるように、当該技術分野において通常の技術を有する者は、任意の所定の部分が抗ＴＮＦα抗体であるかどうかを判断することができる。典型的な抗ＴＮＦα抗体は、インフリキシマブおよびアダリムマブを含む。
「実質的に同種」という用語は、例えば変異配列等の特定の対象配列を意味し、１つ以上の置換、削除、または追加により参照配列から変化し、その正味の影響は、参照配列と対象配列との間に有害な機能的相違点を生じない。本発明の目的において、９５％を越える相同性、同等の生物学的特性および同等の発現特性を有する配列は、実質的に相同であると考えられる。相同性を特定する目的において、成熟した配列の切断は無視すべきである。相同性、同等の生物活性、および同等の発現特性の低い配列は、実質的に同等であると考えられる。
「フラグメント」という用語は、ＴＮＦαに結合する能力を保持する全長抗ＴＮＦα抗体の任意のフラグメントを意味する。
「患者」という用語は、活性剤（例えば、複合体）の投与により予防または治療できる状態を患う、またはその状態になりやすい生体を意味し、ヒトおよび動物の両方を含む。
「任意の」または「任意で」という用語は、後述される状況が起こる場合と起こらない場合があることを意味し、よってその記載は、状況が起こる場合と起こらない場合を含む。
「実質的に」とは、ほぼすべてまたはほぼ完全にという意味であり、例えば、状態の５０％より大、５１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、および９５％以上のうちの１つ以上を満たす。
ペプチド中のアミノ酸残渣は、以下のように省略される。フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ、ロイシンはＬｅｕまたはＬ、イソロイシンはＩｌｅまたはＩ、メチオニンはＭｅｔまたはＭ、バリンはＶａＩまたはＶ、セリンはＳｅｒまたはＳ、プロリンはＰｒｏまたはＰ、スレオニンはＴｈｒまたはＴ、アラニンはＡｌａまたはＡ、チロシンはＴｙｒまたはＹ、ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ、グルタミンはＧｌｎまたはＱ、アスパラギンはＡｓｎまたはＮ、リジンはＬｙｓまたはＫ、アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ、グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ、システインはＣｙｓまたはＣ、トリプトファンはＴｒｐまたはＷ、アルギニンはＡｒｇまたはＲ、グリシンはＧｌｙまたはＧ。
文脈上明白な別段の指示がない限り、「約」という用語が数値の前につく場合、数値は表示された数値の±１０％を意味することが理解される。
本発明の１つ以上の実施形態に関して、直接またはスペーサ部分を通じて、非ペプチド水溶性ポリマーに共役結合した抗ＴＮＦα抗体を含む複合体を提供する。本発明の複合体は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する。
抗ＴＮＦα抗体
前述のとおり、一般に複合体は、直接またはスペーサ部分を通じて、非ペプチド水溶性ポリマーに共役結合した抗ＴＮＦα抗体を含む。本明細書において「抗ＴＮＦα抗体」という用語は、複合前の抗ＴＮＦα抗体、および非ペプチド水溶性ポリマーと結合した後の抗ＴＮＦα抗体を意味する。しかし、元の抗ＴＮＦα抗体が非ペプチド水溶性ポリマーに結合されると、スペーサ部分を通じて任意でポリマーに結合に関連する１つ以上の共役結合が存在するため、抗ＴＮＦα抗体がわずかに改変することが理解される。多くの場合、別の分子に結合した抗ＴＮＦα抗体がわずかに改変した形態は、抗ＴＮＦα抗体の「残渣」と称される。複合体における抗ＴＮＦα抗体は、抗ＴＮＦα抗体活性を提供する任意のペプチドであってもよい。
抗ＴＮＦα抗体は、抗体を形成する従来技術に由来してもよい。
任意の所定の抗体が本明細書に記載される複合体での使用に適した抗ＴＮＦα抗体となることが提案される場合、その部分が抗ＴＮＦα抗体活性を有するかどうかを判断することが可能である。例えば、提案された抗体を含む組成物をカラムに吸着させ、そのカラムを通じて標識ヒトＴＮＦαを通過させることができる。カラム上に保持される標識をその後検出した場合（提案された抗体に結合されている結果として）は、提案された抗体が本明細書における抗ＴＮＦα抗体としての使用に適していることを示す。
水溶性ポリマー
前述のとおり、各複合体は水溶性ポリマーに結合した抗ＴＮＦα抗体を含む。水溶性ポリマーに関して、水溶性ポリマーは非ペプチド性、非毒性であり、自然発生せず、生体適合性がある。生体適合性に関して、生体組織とともに物質を単体で、または別の物質（例えば、抗ＴＮＦ抗体等の活性剤）と併せて使用すること（例えば、患者への投与）に関連する有益な効果が、臨床医、例えば医師により評価されるように任意の悪影響に勝る場合、物質は生体適合性があると考えられる。非免疫原性に関して、生体内物質の意図的使用により望ましい免疫反応（例えば、抗体の形成）が生成されない場合、または免疫反応が生じる場合、物質は免疫原性であると考えられ、そのような反応は、臨床医により評価されるように、臨床的に有意または重要であると考えられない。非ペプチド水溶性ポリマーは、生体適合性および非免疫原性であることが好ましい。
さらにポリマーは、一般に２〜約３００の末端を有するという特徴がある。そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールのコポリマー、およびプロピレングリコール等のポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチラートポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリビニルピロリドン、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α‐ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ‐アクリロイルモルホリン）、および前述のうちのいずれかの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
ポリマーは特定の構造に限定されず、線状（例えば、アルコキシＰＥＧまたは二官能価ＰＥＧ）、分岐型またはマルチアーム（例えば、フォーク状ＰＥＧまたはポリオールコアに結合したＰＥＧ）、樹状、または分解可能な結合であってもよい。さらに、ポリマーの内部構造は、任意の多くの異なるパターンで組織することができ、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーから成る群から選択できる。
一般に、活性ＰＥＧおよびその他の活性水溶性ポリマー（例えば、ポリマー試薬）は、抗ＴＮＦ抗体上の望ましい部位への結合に適した活性化基で活性される。そのためポリマー試薬は、抗ＴＮＦ抗体と反応するための反応基を有する。これらのポリマーを尾活性部分と複合するための代表的なポリマー試薬および方法は、当該技術分野において知られており、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ” ｉｎ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｌｅｎｕｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、およびＺａｌｉｐｓｋｙ（１９９５）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：１５７‐１８２において詳しく記載されている。
一般に、複合体における水溶性ポリマーの重量平均分子量は、約１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンである。しかし典型的な範囲は、５，０００ダルトンより大〜約１００，０００ダルトンの範囲、約６，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、１０，０００ダルトンより大〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約５３，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約２９，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約３５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、および約４０，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を含む。任意の所定の水溶性ポリマーの場合、１つ以上のこれらの範囲にある分子量を有するＰＥＧが好ましい。
水溶性ポリマーの典型的な重量平均分子量は、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、および約７５，０００ダルトンを含む。前記のいずれかの総分子量を有する分岐型の水溶性ポリマー（例えば、２つの２０，０００ダルトンポリマーから成る分岐型４０，０００ダルトン水溶性ポリマー）を使用することもできる。１つ以上の実施形態において、複合体は、重量平均分子量が約６，０００ダルトン未満であるＰＥＧと直接または間接的に結合した任意のＰＥＧ部分を有しない。
ポリマーとして使用される場合、ＰＥＧは、一般に多くの（ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマー［またはＰＥＧがどのように定義されるかによって（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）］を含む。本明細書全体で使用されるように、反復単位の数は、「（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」における下付き文字「ｎ」により識別される。したがって（ｎ）の値は、典型的に以下の範囲のうちに１つ以上にある、つまり２〜約３４００、約１００〜約２３００、約１００〜約２２７０、約１３６〜約２０５０、約２２５〜約１９３０、約４５０〜約１９３０、約１２００〜約１９３０、約５６８〜約２７２７、約６６０〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約９０９〜約２７３０、および約１２００〜約１９００ということである。分子量が知られている任意の所定のポリマーの場合、ポリマーの総重量平均分子量を反復するモノマーの分子量で割ることにより、反復単位（例えば、「ｎ」）の数を特定できる。
本発明での使用に特に好適なポリマーの１つは、末端封止ポリマー、つまり少なくとも一端が比較的不活性の基、例えば低Ｃ１-６アルコキシ基で封止されたポリマーであるが、ヒドロキシル基を使用することもできる。ポリマーがＰＥＧである場合、例えば、線形のＰＥＧであるメトキシ‐ＰＥＧ（一般にｍＰＥＧと称される）を使用することが好ましい。ここで、ポリマーの一端は、メトキシ（‐ＯＣＨ３）基であるが、別の一端は、ヒドロキシルまたは任意で化学修飾したその他の官能基である。
本発明の１つ以上の実施形態で有効な一形態において、遊離または非結合ＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基で終結する線状ポリマーであり、
Figure 2009533347
 式中、（ｎ）は一般にゼロから約４，０００の範囲である。
上記のポリマー、アルファ‐、オメガ‐ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、ＨＯ‐ＰＥＧ‐ＯＨのように簡潔に表記できる。記号‐ＰＥＧ‐は、以下の構造単位を表し得ることが理解される。
Figure 2009533347
 式中、（ｎ）は上記定義のとおりである。
本発明の１つ以上の実施形態で有効な別種のＰＥＧは、メトキシ‐ＰＥＧ‐ＯＨ、または簡潔にｍＰＥＧである。ここで、一端は比較的不活性なメトキシ基であり、別の一端はヒドロキシル基である。ｍＰＥＧの構造を以下に示す。
Figure 2009533347
 式中、（ｎ）は上記のとおりである。
米国特許番号５，９３２，４６２に記載されるようなマルチアームまたは分岐ＰＥＧ分子をＰＥＧポリマーとして使用することもできる。例えば、ＰＥＧは以下の構造を有してもよく、
Figure 2009533347
 式中、
ｐｏｌｙａおよびｐｏｌｙｂは、メトキシポリ（エチレングリコール）等の（同一または異なる）ＰＥＧ骨格であり、
Ｒ”は、Ｈ、メチル、またはＰＥＧ骨格等の非反応性部分であり、
ＰおよびＱは非反応性結合である。好適な実施形態において、分岐型ＰＥＧポリマーは、メトキシポリ（エチレングリコール）二基置換リジンである。使用される特定の抗ＴＮＦ抗体に応じて、二基置換リジンの反応性エステル官能基をさらに修飾し、抗ＴＮＦ抗体内における標的基との反応に適した官能基を形成してもよい。
さらに、ＰＥＧはフォーク状ＰＥＧを含むことができる。フォーク状ＰＥＧの例は、以下の構造により表される。
Figure 2009533347
 式中、Ｘは１つ以上の原子のスペーサ部分であり、各Ｚは、定義された長さの原子鎖によりＣＨと連結された活性末端基である。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５３３３は、本発明の１つ以上の実施形態において使用可能な様々なフォーク状ＰＥＧ構造を開示する。Ｚ官能基を分岐している炭素原子に結合する原子鎖は、連結基として機能し、例えばアルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。
ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧの長さに沿って共役結合しているカルボキシル等の反応基を有するペンダントＰＥＧ分子を含んでもよい。ペンダント反応基は、直接またはアルキレン基等のスペーサ部分を通じてＰＥＧに結合できる。
上記形態のＰＥＧに加えて、上記ポリマーのいずれかを含むポリマーにおいて、１つ以上の弱いまたは分解可能な結合を用いてポリマーを調製することもできる。例えば、加水分解の影響を受けやすいポリマーにおいて、エステル結合を用いてＰＥＧを調製することができる。以下に示すように、この加水分解の結果、ポリマーは低分子量のフラグメントに開裂する。
Figure 2009533347
 ポリマー骨格内の分解可能な結合として有効なその他の加水分解で分解可能な結合は、炭酸結合、例えばアミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合（例えば、Ｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３８（１）：５８２‐３を参照）、例えばアルコールがリン酸基と反応して形成されるリン酸エステル結合、一般にヒドラジドとアルデヒドとの反応により形成されるヒドラゾン結合、一般にアルデヒドとアルコールとの反応により形成されるアセタール結合、例えば、ギ酸とアルコールとの反応により形成されるオルトエステル結合、例えばＰＥＧ等のポリマーの末端におけるアミン基、および別のＰＥＧ鎖のカルボキシル基により形成されるアミド結合、例えば末端イソシアネート基とＰＥＧアルコールとの反応から形成されるウレタン結合、例えばＰＥＧ等のポリマーの末端におけるアミン基、およびペプチドのカルボキシル基により形成されるペプチド結合、および例えばポリマーの末端におけるリンアミダイト基、およびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基により形成されるオリゴヌクレオチド結合を含む。
複合体のそのような任意の特徴、例えば、１つ以上の分解可能な結合をポリマー鎖に導入することは、投与時に複合体の最終的な望ましい薬理的特性にさらなる制御を提供する。例えば、大規模かつ比較的不活性の複合体（例えば、そこに結合した１つ以上の高分子量ＰＥＧ鎖、例えば、約１０，０００を越える分子量を有する１つ以上のＰＥＧ鎖を持ち、ここで複合体は基本的に生物活性を有しない）を投与してもよい。この複合体は加水分解され、元のＰＥＧ鎖の一部を有する生物活性複合体を生成する。このように、複合体の特性を有効に調整し、時間とともに複合体の生物活性のバランスをとる。
複合体に関連する水溶性ポリマーは、「開裂可能」であってもよい。つまり、水溶性ポリマーは（加水分解、酵素過程、またはその他のいずれかを通じて）開裂し、それにより非複合体抗ＴＮＦ抗体を生じる。一部の場合において、開裂可能ポリマーは、水溶性ポリマーの任意の断片を残すことなく、生体内で抗ＴＮＦ抗体から離れる。その他の場合において、開裂可能なポリマーは、水溶性ポリマーから比較的小さい断片（例えば、コハク酸タグ）を残して生体内で抗ＴＮＦ抗体から離れる。典型的な開裂可能ポリマーは、炭酸結合を介して抗ＴＮＦ抗体に結合するポリマーを含む。
当該技術分野において通常の技術を有する者は、非ペプチド水溶性ポリマーに関する前述の記載は、決して包括的ではなく単なる例示であり、上記の性質を有するすべてのポリマー材料が考慮されることを認識する。本明細書において「ポリマー試薬」という用語は、一般に分子全体を意味し、水溶性ポリマーセグメントおよび官能基を含んでもよい。
前述のとおり、本発明の複合体は抗ＴＮＦα抗体に共役結合した水溶性ポリマーを含む。一般に、任意の所定の複合体の場合、抗ＴＮＦ抗体活性を有する１つ以上の分子に共役結合した１つまたは３つの水溶性ポリマーである。しかし一部の場合、複合体は抗ＴＮＦα抗体に個別に結合した１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の水溶性ポリマーを有してもよい。
抗ＴＮＦα抗体およびポリマー内の特定の結合は、多くの要素に依存する。そのような要素は、例えば、採用される特定の結合化学、特定の抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦα抗体において（ポリマーに結合するため、または好適な結合部位への変換に）使用可能な官能基、抗ＴＮＦα抗体における追加反応官能基の存在等を含む。
一般に、加水分解に安定な結合、例えばアミド、ウレタン（カルバメートとしても知られる）、アミン、チオエーテル（硫化物としても知られる）、または尿素（カルバミドとしても知られる）結合は、抗ＴＮＦα抗体を連結するための結合として採用される。ここでも、好適な加水分解に安定な結合はアミドである。１つのアプローチにおいて、活性エステルを含む水溶性ポリマーは、抗ＴＮＦα抗体上のアミン基と反応させることができ、それによりアミド結合を生じる。
抗ＴＮＦα抗体をポリマーに連結する加水分解に安定な結合を有する複合体の場合、その複合体は、一般に測定可能な程度の生物活性を有する。例えば、そのような複合体は、一般に非複合体抗ＴＮＦα抗体のそれと比較して、以下のパーセンテージ：少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約１００％、および１０５％より大（当該技術分野においてよく知られているモデル等の好適なモデルで測定した場合）のうちの１つ以上を満たす生物活性を有することを特徴とする。好ましくは、加水分解に安定な結合（例えば、アミド結合）を有する複合体は、非修飾親抗ＴＮＦα抗体の生物活性を少なくともある程度有する。
抗ＴＮＦα抗体上のアミノ基は、抗ＴＮＦα抗体と水溶性ポリマーとの間の結合点を提供する。リジン残渣は、それぞれ複合体に使用可能であってもよいε‐アミノ酸を有する。さらに、抗ＴＮＦα抗体のＮ末端アミンも結合点として機能する。
抗ＴＮＦα抗体の使用可能なアミンとの共役結合形成に有効な好適なポリマー試薬には多くの例がある。以下の表１において、特定の例が対応する複合体とともに提供される。表において、変数（ｎ）は、反復するモノマー単位の数を表し、「‐ＮＨ‐ＡＴＡ」は、ポリマー試薬との複合体後の抗ＴＮＦα抗体残渣を表す。表１に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は、「ＣＨ３」基で終結するが、その他の基（例えば、Ｈおよびベンジル）は置換することができる。
Figure 2009533347
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 抗ＴＮＦα抗体のアミノ基に対するポリマー試薬の複合体は、様々な技術により達成できる。１つのアプローチにおいて、抗ＴＮＦα抗体は、スクシニミジル派生物（またはその他の活性エステル基で官能化されたポリマー試薬に複合体できる。ここで、これらの代替エステル基含有ポリマー試薬に関して記載されるアプローチに類似するアプローチを使用できる）。このアプローチにおいて、スクシニミジル派生物を含むポリマーは、ｐＨ７〜９．０の水媒体中の抗ＴＮＦα抗体に結合できるが、異なる反応条件（例えば、６〜７の低ｐＨまたは異なる温度および／または１５℃未満）により、ポリマーが抗ＴＮＦα抗体上の異なる位置に結合される可能性がある。さらに、活性カルボン酸基を含有する抗ＴＮＦα抗体を用いたアミン終結非ペプチド水溶性ポリマーの反応により、アミド結合が形成される可能性がある。
抗ＴＮＦα抗体のポリマー試薬との複合体に有効な別の一般的アプローチは、還元的アミノ化を使用し、ケトン、アルデヒド、またはその水和物（例えば、ケトン水和物、アルデヒド水和物）で官能化されたポリマー試薬を用いて抗ＴＮＦα抗体の１級アミンを複合体することである。このアプローチにおいて、抗ＴＮＦα抗体からの１級アミンは、アルデヒドまたはケトンのカルボニル基（または対応するヒドロキシル含有基または水和アルデヒドまたはケトン）と反応し、それによりシッフ基を形成する。次にシッフ基は、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を使用することにより、安定した複合体に還元的に変換できる。特にケトンまたはα‐メチル分岐アルデヒドおよび／または特定の反応条件下（例えば、還元ｐＨ）で官能化したポリマーとの選択的反応が可能である（例えば、Ｎ末端において可能である）。
カルボキシル基は、抗ＴＮＦα抗体上の結合点として機能可能な別の官能基を表す。構造的に、複合体は以下を含み、
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 式中、ＡＴＡおよび隣接するカルボニル基は、カルボキシル含有抗ＴＮＦα抗体に対応し、Ｘは結合であって、好ましくはＯ、Ｎ（Ｈ）、およびＳから選択されたヘテロ原子であり、ＰＯＬＹは、ＰＥＧ等の末端封止部分で任意に終結する水溶性ポリマーである。
Ｃ（Ｏ）‐Ｘ結合は、末端官能基を含むポリマー派生物とカルボキシル含有抗ＴＮＦα抗体との反応から生じる。上述のように、特定の結合は、利用される官能基の種類に依存する。ポリマーがヒドロキシル基で末端官能化または「活性」される場合、結果として生じる結合はカルボン酸エステルとなり、ＸはＯとなる。ポリマー骨格がチオール基で官能化される場合、結果として生じる結合はチオエステルとなり、ＸはＳとなる。特定のマルチアーム、分岐型、またはフォーク状ポリマーが採用される場合、Ｃ（Ｏ）Ｘ部分、および特にＸ部分は、比較的複雑であってもよく、長い結合構造を含んでもよい。
ヒドラジド部分を含む水溶性派生物もカルボニルにおける複合体に有効である。抗ＴＮＦα抗体部分がカルボニル部分を含まない範囲で、任意のカルボン酸（例えば、Ｃ末端カルボン酸）を還元することにより、および／またはグリコシル化またはグリケート化された（ここで添加された糖はカルボニル部分を有する）抗ＴＮＦα抗体を提供することにより、カルボニル部分を導入することができる。ヒドラジド部分を含む水溶性派生物の特定な例は、以下の表２において対応する複合体とともに提供される。さらに、活性エステルを含む水溶性ポリマー派生物をヒドラジン（ＮＨ２-ＮＨ２）、またはｔｅｒｔ‐ブチルカルバジン酸［ＮＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３］と反応させることにより、活性エステル（例えば、スクシニミジル基）を含有する任意の水溶性派生物を変換し、ヒドラジド部分を含むようにすることができる。表において、変数（ｎ）は反復するモノマー単位の数を表し、「＝Ｃ‐ＡＴＡ」はポリマー試薬との結合後の抗ＴＮＦα抗体の残渣を表す。任意で、ヒドラゾン結合は、好適な還元剤を使用して還元できる。表２に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は「ＣＨ３基」で終結するが、その他の基（例えば、Ｈおよびベンジル）は置換できる。
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 抗ＴＮＦα抗体に含まれるチオール基は、水溶性ポリマーの有効な結合部位として機能できる。特にシステイン残渣は、抗ＴＮＦα抗体がシステインを含む場合、チオール基を提供する。そのようなシステイン残渣におけるチオール基は、次に、チオール基、例えばＮ‐マレイミジルポリマーまたはその他の派生物との反応に特異的な活性ＰＥＧと反応させることができる。米国特許番号第５，７３９，２０８号、および国際特許公開番号ＷＯ ０１／６２８２７に記載されている。
以下の表３において、特定の例が対応する複合体とともに提供される。表において、変数（ｎ）は反復するモノマー単位を表し、「‐Ｓ‐ＡＴＡ」は水溶性ポリマーとの結合後の抗ＴＮＦα抗体残渣を表す。表３に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は「ＣＨ３」基で終結するが、その他の基（例えばＨおよびベンジル）は置換できる。
Figure 2009533347
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 １つ以上のマレイミド官能基を含む水溶性ポリマーから形成された複合体に関して、（マレイミドが抗ＴＮＦ抗体上でアミンまたはチオール基と反応するかどうかにかかわらず）、水溶性ポリマーの対応するマレイン酸形態は、抗ＴＮＦα抗体と反応することも可能である。特定の条件下で（例えば、ｐＨ約７〜９および水の存在下で）、マレイミド環が「開き」、対応するマレイン酸を形成する。次にマレイン酸は、抗ＴＮＦα抗体のアミンまたはチオール基と反応できる。典型的なマレイン酸ベースの反応は、以下に概略的に示される。ＰＯＬＹは水溶性ポリマーを表し、ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体を表す。
Figure 2009533347
 本発明に従う代表的な複合体は、以下の構造を有してもよい。
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 ここでＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、Ｌは任意のリンカーであり、ＺはＯ、ＮＨ、およびＳから成る群から選択されたヘテロ原子であり、ＹはＣ２-１０アルキル、Ｃ２-１０置換アルキル、アリール、および置換アリールから成る群から選択され、ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体である。抗ＴＮＦα抗体と反応可能であり、この種の複合体をもたらすポリマー試薬は、米国特許出願公開番号２００５／００１４９０３に記載されている。
複合体は、多くの方法において、チオール特異的ポリマー試薬を使用して形成することができ、本発明はこの点に限定されない。例えば、抗ＴＮＦα抗体（任意で適切なバッファ（所望に応じて、アミン含有バッファを含む）中）をｐＨ約７〜８の水媒体に配置し、チオール特異的ポリマー試薬はモル過剰で添加する。反応は、約０．５〜２時間行われてもよいが、ＰＥＧ化産生が比較的低いと判断される場合、２時間を越える反応時間（例えば、５時間、１０時間、１２時間、および２４時間）が有効である可能性がある。このアプローチで使用できる典型的なポリマー試薬は、マレイミド、スルホン（例えば、ビニルスルホン）、およびチオール（例えば、オルトピリジニルまたは「ＯＰＳＳ」等の官能化されたチオール）から成る群から選択される反応基を含有するポリマー試薬である。
ポリマー試薬に関して、本明細書およびその他に記載のポリマー試薬は、商業的供給源から購入できる（例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）。さらに、ポリマー試薬を調製する方法は文献に記載されている。
抗ＴＮＦα抗体と非ペプチド水溶性ポリマーとの結合は直接であってもよく、その場合、抗ＴＮＦα抗体とポリマーとの間に干渉する原子は位置しない。または間接的であってもよく、その場合、１つ以上の原子が抗ＴＮＦα抗体とポリマーとの間に位置する。間接的結合に関して、「スペーサ部分」は、抗ＴＮＦα抗体の残渣と水溶性ポリマーとの間のリンカーとして機能する。スペーサ部分を構成する１つ以上の原子は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。スペーサ部分は、アミド、２級アミン、カルバメート、チオエーテル、および／またはジスルフィド基を含んでもよい。特定のスペーサ部分の非限定例は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［ＣＨ２］ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、二価シクロアルキル基、−Ｏ−、−Ｓ−、アミノ酸、−Ｎ（Ｒ６）−、および前述のいずれかのうちの２つ以上の組み合わせから成る群から選択されるものを含む。ここで、Ｒ６はＨ、またはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、および置換アリールから成る群から選択される有機ラジカルであり、（ｈ）はゼロ〜６であり、（ｊ）はゼロから２０である。その他の特異的なスペーサ部分は、以下の構造：−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１-６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１-６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１-６−ＮＨ−Ｃ−（Ｏ）−を有し、ここで各メチレンに続く下付きの値は、例えば（ＣＨ２）１-６等の構造に含まれるメチレンの数を示し、該構造が１、２、３、４、５または６のメチレンを含んでもよいことを意味する。さらに、上記スペーサ部分のいずれかは、１〜２０のエチレンオキシドモノマー単位［例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１-２０］を含むエチレンオキシドオリゴマー鎖を含む。つまり、エチレンオキシドオリゴマー鎖は、スペーサ部分の前後、および任意で２つ以上の原子から成るスペーサ部分の任意の２つの原子間で生じる可能性がある。また、オリゴマーがポリマーセグメントに隣接し、単にポリマーセグメントの延長を表す場合、オリゴマー鎖はスペーサ部分の一部として考慮されない。
組成物
複合体は一般に、組成物の一部である。一般に、組成物は複数の複合体を含み、必ずしもそうではないが、各複合体は同一の抗ＴＮＦα抗体で構成されることが好ましい（例えば、全体組成物において、１種類の抗ＴＮＦα抗体のみが検出される）。さらに、組成物は複数の複合体を含むことができる。ここで任意の所定の複合体は、２つ以上の異なる抗ＴＮＦα抗体から成る群から選択される部分で構成される（例えば、全体組成物において、２つ以上の異なる抗ＴＮＦα抗体が検出される）。しかし、最も好ましくは、組成物における実質的にすべての複合体（例えば、組成物における複数複合体の８５％以上）が、それぞれ同一の抗ＴＮＦα抗体で構成される。
組成物は、単一の複合体種（例えば、組成物における実質的にすべての複合体に関して単一ポリマーが同じ位置で結合するモノＰＥＧ化複合体）または複合体種の混合（例えば、ポリマーの結合が異なる部位で起こるモノＰＥＧ化複合体の混合および／またはモノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、およびトリＰＥＧ化複合体の混合）を含むことができる。また組成物は、抗ＴＮＦα抗体活性を有する任意の所定の部分と結合した４、５、６、７、８、またはそれ以上のポリマーを有するその他の複合体を含んでもよい。さらに本発明は、組成物が、それぞれ１つの抗ＴＮＦα抗体に共役結合した１つの水溶性ポリマーを含む複数の複合体、および１つの抗ＴＮＦα抗体に共役結合した２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の水溶性ポリマーを含む。
組成物における複合体に関して、組成物は以下の特徴のうちの１つ以上を満たす。組成物における複合体の少なくとも約８５％は、抗ＴＮＦα抗体に結合した１〜４つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約８５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜４つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約８５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜３つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約８５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜２つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約８５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜５つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９５％は、抗ＴＮＦα抗体に結合した１〜４つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜３つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜２つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９５％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９９％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜５つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９９％は、抗ＴＮＦα抗体に結合した１〜４つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９９％は、抗ＴＮＦα抗体部分に結合した１〜３つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９９％は、抗ＴＮＦα抗体に結合した１〜２つのポリマーを有する。組成物における複合体の少なくとも約９９％は、抗ＴＮＦα抗体に結合した１つのポリマーを有する。
１つ以上の実施形態において、複合体含有組成物はアルブミンをまったく含まないか、または実質的に含まないことが好ましい。また組成物は、抗ＴＮＦα抗体を持たないタンパク質をまったく含まないか、または実質的に含まないことが好ましい。したがって、組成物は８５％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％アルブミンを含まないことが好ましい。さらに組成物は、抗ＴＮＦα抗体を持たない任意のタンパク質を８５％、より好ましくは９５％、最も好ましくは９９％含まないことが好ましい。アルブミンが組成物に存在する限りにおいて、本発明の典型的な組成物は、抗ＴＮＦα抗体の残渣をアルブミンに結合するポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む複合体を実質的に含まない。
任意の所定の部分に対して望ましい数のポリマーを制御することは、適切なポリマー試薬、抗ＴＮＦα抗体部分に対するポリマー試薬の割合、温度、ｐＨ状態、および複合反応のその他の側面を選択することによって達成できる。さらに望ましくない複合体（例えば、４つ以上の結合したポリマーを有する複合体）の削減または排除は、精製手段によって達成できる。
例えば、ポリマー‐抗ＴＮＦα抗体の複合体を精製し、異なる複合体種を取得／分離できる。具体的には、生成物の混合物を精製し、１、２、３、４、５、またはそれ以上のＰＥＧ／抗ＴＮＦ抗体、一般に１、２、または３つのＰＥＧ／抗ＴＮＦα抗体の平均を取得できる。最終複合反応混合物を精製する方法は、多くの要素、例えば採用されるポリマー試薬の分子量、特定の抗ＴＮＦα抗体、望ましい投与計画、および個別の複合体の残留活性および生体内特性に依存する。
所望に応じて、異なる分子量を有する複合体は、ゲルろ過クロマトグラフィおよび／またはイオン交換クロマトグラフィを使用して分離できる。つまり、ゲルろ過クロマトグラフィを使用し、抗ＴＮＦα抗体に対する異なるポリマーの割合（例えば、１‐ｍｅｒ、２‐ｍｅｒ、３‐ｍｅｒ等。ここで「１‐ｍｅｒ」は抗ＴＮＦα抗体に対して１ポリマーを示し、「２‐ｍｅｒ」は抗ＴＮＦα抗体部分に対して２ポリマーを示す）を異なる分子量に基づいて分割する（その差は、基本的に水溶性ポリマー部分の平均分子量に対応する）。例えば、３５，０００ダルトンタンパク質が、約２０，０００ダルトンの分子量を有するポリマー試薬にランダムに複合体される典型的な反応において、結果として生じる反応混合物は、非修飾タンパク質（約３５，０００ダルトンの分子量を有する）、モノＰＥＧ化タンパク質（約５５，０００ダルトンの分子量を有する）、ジＰＥＧ化タンパク質（約７５，０００ダルトンの分子量を有する）等を含んでもよい。
このアプローチを使用して、ＰＥＧ、および異なる分子量を有するその他のポリマー‐抗ＴＮＦα抗体部分の複合体を分離できるが、このアプローチは、一般に抗ＴＮＦα抗体部分内で異なるポリマー結合部位を有する位置イソフォームの分離には効果がない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィを使用し、ＰＥＧ１‐ｍｅｒ、２‐ｍｅｒ、３‐ｍｅｒ等から互いに分離できるが、回収された複合体組成物はそれぞれ、抗ＴＮＦα抗体内で異なる反応基（例えば、リジン残渣）に結合したＰＥＧを含んでもよい。
この種の分離を実行するために好適なゲルろ過カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘTMおよびＳｅｐｈａｄｅｘTMカラムを含む。特定カラムの選択は、望ましい分別範囲に基づく。溶出は、一般に好適なバッファ、例えば、リン酸、酢酸等を使用して行われる。捕集したフラグメントは、多くの異なる方法、例えば（ｉ）タンパク質含量に２８０ｎｍにおける吸収度、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用する染色ベースのタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量のヨウ素試験（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０７：６０‐６３）、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＡＧＥ）およびそれに続くヨウ化バリウムを用いた染色、および（ｖ）高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析してもよい。
位置イソフォームの分離は、好適なカラム（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社またはＶｙｄａｃ社等から商業的に入手可能なＣ１８カラムまたはＣ３カラム）を用いた逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ‐ＨＰＬＣ）を使用する逆相クロマトグラフィにより行われるか、または例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅTMイオン交換カラム等のイオン交換カラムを使用するイオン交換クロマトグラフィにより行われる。いずれかのアプローチを使用し、同一の分子量を有するポリマー活性剤異性体（例えば、位置イソフォーム）を分離できる。
組成物は、抗ＴＮＦα抗体活性を持たないタンパク質を実質的に含まないことが好ましい。さらに組成物は、すべてのその他の非共役結合した水溶性ポリマーを実質的に含まないことが好ましい。しかし一部の状況において、組成物はポリマー‐抗ＴＮＦα抗体複合体および非複合体抗ＴＮＦα抗体の混合物を含んでもよい。
任意で、本発明の組成物は、薬学的に許容しうる賦形剤を含む。所望に応じて、薬学的に許容しうる賦形剤を複合体に添加し、組成物を形成することができる。
典型的な賦形剤は、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、バッファ、酸、塩基、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されるものを含むが、それらに限定されない。
糖等の炭水化物、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマー等の誘導体化糖は、賦形剤として存在してもよい。特定の炭水化物賦形剤は、例えば、フラクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ‐マンノース、ソルボース等の単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、スターチ等の多糖類、およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシル、ソルビトール、ミオイノシトール等のアルジトールを含む。
また賦形剤は、無機塩、またはクエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫化ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせ等のバッファを含んでもよい。
また組成物は、微生物の増殖を予防または阻止する抗菌剤を含んでもよい。本発明の１つ以上の実施形態に好適な抗菌剤の例は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
抗酸化剤も同様に組成物に存在してもよい。抗酸化剤を使用して酸化を防ぐことにより、複合体または製剤のその他の構成要素の劣化を防止する。本発明の１つ以上の実施形態での使用に適した抗酸化剤は、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせを含む。
界面活性剤は、賦形剤として存在してもよい。典型的な界面活性剤は、「Ｔｗｅｅｎ ２０」および「Ｔｗｅｅｎ ８０」等のポリソルベート、Ｆ６８およびＦ８８等のプルロニック（どちらもＢＡＳＦ社、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから入手可能）、ソルビタンエステル、レシチンおよびその他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（好ましくはリポソーム形態でない）等のリン脂質を含む脂質、脂肪酸および脂肪エステル、コレステロール等のステロイド、およびＥＤＴＡ、亜鉛等のキレート剤、およびその他の好適なカチオンを含む。
酸または塩基は、組成物において賦形剤として存在してもよい。使用できる酸の例は、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組み合わせから成る群から選択された酸を含むが、それらに限定されない。安定した塩基の例は、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、カリウムフマレート、およびそれらの組み合わせから成る群から選択された塩基を含むが、それらに限定されない。
組成物における複合体（例えば、活性剤とポリマー試薬との間に形成される複合体）の量は、多くの要素により変わるが、組成物用量容器（例えば、バイアル）に保存される場合は、最適に治療上有効な量となる。さらに、医薬組成物はシリンジに格納できる。治療上有効な用量は、増加量の複合体を反復投与することにより実験的に決定し、どの量が臨床的に望ましい評価項目を生成するかを判断する。
組成物における任意の個別賦形剤の量は、賦形剤の活性、および組成物の特定のニーズによって変化する。一般に、任意の個別賦形剤の最適量は、様々な量（少量から多量まで）の賦形剤を含む組成物を調製し、安定性およびその他のパラメータを試験した後、著しい副作用なく最適性能が得られる範囲を特定することにより、日常の実験を通じて決定される。
しかし、一般に賦形剤は組成物において約１％〜約９９重量％、好ましくは約５％〜約９８重量％、より好ましくは約１５〜約９５重量％の賦形剤として存在し、その濃度は３０重量％未満が最も好ましい。
これら前記の医薬品賦形剤およびその他の賦形剤は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）、およびＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００に記載されている。
組成物は、全種類の製剤、特に注射に適した製剤、例えば、再構成できる粉末または親液性物質、および液体を包含する。注射前に固体組成物を再構成するための好適な希釈剤の例は、注射用の静菌性水、水中５％のデキストロース、リン酸緩衝化した生理食塩水、リンガー溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、およびそれらの組み合わせを含む。液体医薬組成物に関して、液体および懸濁液が考えられる。
本発明の１つ以上の実施形態の組成物は、必ずしもそうでないが、一般に注射により投与されるため、投与の直前は、一般に溶液または懸濁液である。医薬製剤は、その他の形態、例えばシロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末等の形態であってもよい。その他の投与モードは、肺、肛門、経皮、経粘膜的、経口、髄腔内、皮下、動脈内等を含む。
本発明は、本明細書で提供されるように、複合体を用いた治療に応答する状態を患う患者に複合体を投与する方法も提供する。該方法は、一般に注射により、治療上有効量の複合体（好ましくは、医薬組成物の一部として提供される）を患者に投与するステップを含む。前述のように、静脈注射によって非経口的に複合体を投与することができる。また複合体は、筋肉内または皮下注射によって有利に投与できる。非経口投与の好適な製剤型は、特に注射準備のできた溶液、使用前に溶媒と組み合わせる乾燥粉末、注射準備のできた懸濁液、使用前に媒体と組み合わせる乾燥不溶性組成物、および投与前に希釈する乳液および原液を含む。
この投与方法を使用し、複合体の投与により治療または予防できる任意の状態を治療してもよい。当該技術分野において通常の技術を有する者は、特異的な複合体が有効に治療できる条件を理解する。例えば、複合体を単独またはその他の薬物療法と組み合わせて使用し、関節炎、クローン病、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、尋常性乾癬、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、および自己免疫糖尿病におけるサイトカイン誘導性膵島破壊を患う患者を治療できる。複合体は、別の活性剤の投与前、投与時、または投与後に患者に対して有利に投与できる。
投与される実用量は、対象の年齢、体重、および全体的状態、および治療する状態の重篤度、医療専門家の判断、および投与される複合体に基づく。治療上有効な量は、当該技術分野に精通する者に既知であり、および／または付属の参照テキストおよび文献に記載されている。一般に、治療上有効な量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり、好ましくは０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日の用量、さらに好ましくは、０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量である。例えば、関節炎の症状が軽減する、および／または完全に除去されるまで所定の用量を定期的に投与できる。
任意の所定の複合体の単位用量（ここでもまた、好ましくは医薬製剤の一部として提供される）は、医師の判断、患者のニーズ等に応じて、様々な投与スケジュールで投与できる。特定の投与スケジュールは、当該技術分野において通常の技術を有する者に知られるか、または通常の方法を使用して実験的に決定できる。典型的な投与スケジュールは、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。臨床上の評価項目が達成されると、組成物の投与は中止する。
当然のことながら、本発明はその特定の好適な実施形態と併せて記載されているが、前述の説明および以下の実施例は、例示を目的とし、本発明の範囲を制限しない。本発明の範囲内におけるその他の側面、利点、および修正は、本発明が関連する技術分野に精通する者に明らかとなる。
本明細書において参照されるすべての記事、書籍、特許、およびその他の発行物は、それら全体を参照することにより、ここに組み込まれる。
実験
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野に含まれる有機合成、生化学、タンパク質精製等の従来技術を採用する。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、上述のＪ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）を参照する。
以下の実施例において、使用される数字（例えば、量、温度等）に関して正確性を保証する努力がなされているが、一部の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別段の指示がない限り、温度は摂氏℃であり、圧力は海水位における大気圧またはその近くである。以下の実施例はそれぞれ、当該技術分野において通常の技術を有する者が本明細書に記載の１つ以上の実施形態を実施するために有益であると考えられる。
インフリキシマブを凍結乾燥粉末として、医薬品流通業者から商業的に購入し、使用する直前に滅菌水を用いて再構成して、再構成したストックインフリキシマブ液を１０ｍｇ／ｍＬ濃度で生成した後、４℃で保存した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析
一部の場合において、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎシステム（ＳｕｒｅＬｏｃｋ ＩＩ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、硫酸ドデシルナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気永動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）によって試料を分析した。サンプルをサンプルバッファと混合した。次に、調製したサンプルをゲルに載せ、約３０分間実行した。
陰イオン交換クロマトグラフィ
一部の場合において、Ｈｉｔｒａｐ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ陰イオン交換カラム（５ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＡＫＴＡｐｒｉｍｅシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに使用し、調製した複合体を精製した。調製した複合体溶液それぞれに対して、５０ｍＭ ＭＥＳバッファ、ｐＨ５．４（バッファＡ）において事前に均衡されるカラムに複合体を載置し、次に９カラム量のバッファＡで洗浄して任意の未反応ＰＥＧ試薬を除去する。続いて、バッファＡの勾配を０〜１００％バッファＢ（０．５Ｍ ＮａＣｌバッファを含む５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．４）を用いて上昇させた。溶離剤をＵＶ検出器により２８０ｎｍで監視した。任意の高いｍｅｒ（例えば、１１‐ｍｅｒ、１０‐ｍｅｒ等）が最初に溶離し、１‐ｍｅｒまで徐々に小さい複合体（例えば、５‐ｍｅｒおよび４‐ｍｅｒ等）が続き、最後に非複合体インフリキシマブ種が溶離する。フラグメントをプールすることができ、個別の複合体の精製をＳＥＣ‐ＨＰＬＣ、主にＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより判断した。
ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ分析
一部の場合において、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ）分析をＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で実施した。ＧＦ‐４５０ Ｚｏｒｂａｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、およびリン酸緩衝化した生理食塩水９０％およびｐＨ７．２のエタノール１０％を含む移動相を使用してサンプルを分析した。カラムの流量は０．５ｍｌ／分であってもよい。溶離したタンパク質およびＰＥＧ‐タンパク質複合体は、ＵＶを使用して２８０ｎｍで検出できる。
実施例１
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ‐ＳＰＡ、３０ｋＤａを大気温度に温めた。（測定アリコートのストックインフリキシマブ液におけるインフリキシマブ量に対して）１０倍過剰の温めたｍＰＥＧ‐ＳＰＡを２ｍＭ ＨＣＬ（＜１０％反応量）のバッファに溶解し、ストックインフリキシマブ液アリコートに添加して十分に混合する。ｍＰＥＧ‐ＳＰＡの添加後、反応混合物のｐＨを特定し、従来の技術を使用してｐＨ７．２〜７．５に調整した。アミド結合を介してｍＰＥＧ‐ＳＰＡをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を５時間室温で撹拌した後、暗冷室において３〜８℃で一晩撹拌することにより、複合体溶液を生じる。グリシンで反応を停止させた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、主に１‐ｍｅｒ、２‐ｍｅｒ、３‐ｍｅｒおよび一部４‐ｍｅｒで構成される約４５％ＰＥＧ化を生じた。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ＳＰＡを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例２
実施例１を繰り返し、実施例２ｂの対照とした。
実施例２ｂ
Figure 2009533347
 複合反応の前に、滅菌水中０．１６４ｍｇのインフリキシマブを取得し、ｐＨを試験して８．０に調整した。インフリキシマブにおいて最も反応性のあるアミノ基を可逆的に保護するため、この液体をインフリキシマブのモルに対して１０倍モル過剰のジメチル無水マレイン酸、「ＤＭＭＡｎ」と組み合わせることにより（Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９９，２９０，３６８-７２）、ＤＭＭＡｎ処理したインフリキシマブ液を形成した。保護反応は、３０分３７℃で行うことができた。必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨ８．０とした。
アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ−ＳＰＡ、３０ｋＤａを大気温度に温めた。ｍＰＥＧ‐ＳＰＡ、３０ｋＤａ（１．４ｍｇ）を１１．６μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、ｍＰＥＧ‐ＳＰＡ溶液を形成した。インフリキシマブに対して１０倍モル過剰のｍＰＥＧ‐ＳＰＡが得られるまで、ｍＰＥＧ‐ＳＰＡ溶液をＤＭＭＡｎ処理したインフリキシマブ液（ｐＨ８．０、室温）に添加した。アミド結合を介してｍＰＥＧ‐ＳＰＡをインフリキシマブに結合可能にするため、反応液を２時間室温で撹拌した後、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生じた。グリシンを添加することにより反応を停止させた。その後、保護リジンアミノ基を脱保護するため、反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ６．０に調整し、３７℃で３０分間培養した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、約２０％モノＰＥＧ化を生じた。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ＳＰＡを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例３ａ
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、６０ｋＤａを大気温度に温めた。分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（０．３２６ｍｇ）を３２．６μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を形成した。インフリキシマブに対して１０倍モル過剰の分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドが得られるまで、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を事前に調製したインフリキシマブ反応混合物１６４μｇに添加した。必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨ８．０とした。アミド結合を介して分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドをインフリキシマブに連結可能にするため、反応液を２時間室温で撹拌した後、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生じた。グリシンを添加することにより反応を停止し、ｐＨを６．０に下げた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、約４０％の天然型をＰＥＧに複合した。反応は、主に１‐ｍｅｒおよび一部２‐ｍｅｒ、および３‐ｍｅｒを生成した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例３ｂ
Figure 2009533347
 複合反応の前に、滅菌水中０．１６４ｍｇのインフリキシマブを取得し、ｐＨを試験して８．０に調整した。インフリキシマブにおいて最も反応性のあるアミノ基を可逆的に保護するため、この液体をインフリキシマブのモルに対して１０倍モル過剰のジメチル無水マレイン酸、「ＤＭＭＡｎ」と組み合わせることにより（Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９９，２９０，３６８-７２）、ＤＭＭＡｎ処理したインフリキシマブ液を形成した。保護反応は、３０分間３７℃で行うことができた。必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨ８．０とした。
アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、６０ｋＤａを大気温度に温めた。分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、６０ｋＤａ（０．３２６ｍｇ）を３２．６μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を形成した。インフリキシマブに対して１０倍モル過剰の分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドが得られるまで、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液をＤＭＭＡｎ処理したインフリキシマブ溶液（ｐＨ８．０、室温）に添加した。アミド結合を介して分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドをインフリキシマブに連結可能にするため、反応液を２時間室温で撹拌した後、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生じた。グリシンを添加することにより反応を停止させた。その後、保護リジンアミノ基を脱保護するため、反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ６．０に調整し、３７℃で３０分間培養した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、約２０％の天然インフリキシマブをＰＥＧに複合した。反応は、主に１‐ｍｅｒおよび一部２‐ｍｅｒを生成した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例４ａ（非還元）
Figure 2009533347
 この反応は、実施例４ｂの対照として使用する。インフリキシマブを還元しないことにより、システイン残渣の側鎖に関連する任意の遊離チオール基が存在するかどうかを識別することができた。
複合反応の前に、滅菌水中０．１６４ｍｇのインフリキシマブを取得した。インフリキシマブに対して１０倍モル過剰のｍＰＥＧ‐ＭＡＬが得られるまで、これにｍＰＥＧ‐ＭＡＬ、３０ｋＤａを添加した（アルゴン下、−２０℃で事前に保存、大気温度に温めた。そのうちの０．３２８ｍｇを０．１ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解した）。複合を可能にするため、混合物を室温で３時間撹拌した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、１０％未満の１‐ｍｅｒ複合体を検出した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ＭＡＬを用いて、その他の複合体を調製した。
実施例４ｂ
Figure 2009533347
 ほとんどの場合において、抗体を還元することにより、ＰＥＧ化後に同様の構造に戻ることができないフラグメントが生成される。任意のイベントにおいて、この反応を行い、還元後の遊離システイン残渣の数に還元する前に、遊離システイン残渣の数を比較する。
複合反応の前に、滅菌水中０．１６４ｍｇのインフリキシマブを取得した。これに１．６８ｍｇのＤＴＴ（インフリキシマブのモルに対して１０倍過剰）を添加し、室温で１時間の還元を可能にした。次に、ＤｅＳａｌｔ媒体を介してＤＴＴを除去し、３０Ｋ Ｍｗカットオフ膜を用いて約１ｍＬまでストック溶液を濃縮して、還元ストックインフリキシマブ液を形成する。
アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ‐ＭＡＬ、３０ｋＤａを大気温度に温めた。温めたｍＰＥＧ‐ＭＡＬ（０．３２８ｍｇ）を０．１ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ溶液を形成した。還元ストックインフリキシマブ液にｍＰＥＧ‐ＭＡＬ液を添加し、１０倍モル過剰のｍＰＥＧ‐ＭＡＬを生じた。混合物を室温で３時間撹拌した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、１‐ｍｅｒ（約２０％）および２‐ｍｅｒ（約５％）を検出した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ＭＡＬを使用して、その他の複合体を調製できる。
実施例５
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ‐ＳＭＢ、３０ｋＤａを大気温度に温めた。温めたｍＰＥＧ‐ＳＭＢ（６．５６ｍｇ）を０．２ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、ｍＰＥＧ‐ＳＭＢ溶液を形成した。インフリキシマブに対して２００モル過剰のｍＰＥＧ‐ＳＭＢが得られるまで、０．１６４ｍｇのインフリキシマブを含むストックインフリキシマブ液アリコートにｍＰＥＧ‐ＳＭＢ溶液を添加した。ｍＰＥＧ‐ＳＭＢの添加後、反応混合物のｐＨを試験し、確実にｐＨ７．２〜７．５とした。アミド結合を介してｍＰＥＧ‐ＳＭＢをインフリキシマブに連結可能にするため、反応溶液を３時間室温で撹拌した。反応溶液を一晩（１６時間）６℃で撹拌することによって結合を継続することができ、それにより複合体溶液を生じた。グリシンで反応を停止させた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、１‐ｍｅｒ（約４０％）および２‐ｍｅｒ、３‐ｍｅｒおよび４‐ｍｅｒ（合計約２０％）を検出した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ＳＭＢを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例６
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒド、３０ｋＤａを大気温度に温めた。ｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒド（６．５６ｍｇ）を０．２ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、ｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒド溶液を形成した。インフリキシマブに対して２００モル過剰のｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒドが得られるまで、事前に調製したインフリキシマブ反応混合液（０．１６４ｍｇストックインフリキシマブ液、従来の方法によりｐＨを６．０に調整）にｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒド溶液を添加した。ｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒドの添加後、必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨを約６．０とした。分岐型ｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒド（必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨを約６．０とした）に対して５倍モル過剰で還元剤ＮａＣＮＢＥｂを添加した。次に、溶液を２時間室温で撹拌した後、一晩４℃で撹拌して、アミン結合により確実に結合させる。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、１‐ｍｅｒ（約４０％）および２‐ｍｅｒおよび３‐ｍｅｒ（合計約１０％）を検出した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、１‐ｍｅｒ（約４０％）および２‐ｍｅｒおよび３‐ｍｅｒ（合計約１０％）を検出した。Ｎ末端ＰＥＧ化により、複合体がＴＮＦαを検出する能力が低下しうることに注意する。結果として生じる複合体に関する結合活性試験は特に保証される。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ブチルアルデヒドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例７
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ‐ＰＩＰ、２０ｋＤａを大気温度に温めた。ｍＰＥＧ‐ＰＩＰ（４．４ｍｇ）を０．２ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、ｍＰＥＧ‐ＰＩＰ溶液を形成した。インフリキシマブに対して２００倍モル過剰のｍＰＥＧ‐ＰＩＰが得られるまで、事前に調製したインフリキシマブ反応混合液（０．１６４ｍｇストックインフリキシマブ液、従来の方法によりｐＨを６．０に調整）にｍＰＥＧ‐ＰＩＰ溶液を添加した。ｍＰＥＧ‐ＰＩＰの添加後、必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨを約６．０とした。ｍＰＥＧ‐ＰＩＰ（必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨを約６．０とした）に対して５倍モル過剰で還元剤ＮａＣＮＢＨ３を添加した。次に、溶液を２時間室温で撹拌した後、一晩４℃で撹拌して、アミン結合により確実に結合させた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、約１０％の１‐ｍｅｒ複合体を検出した。
実施例８ａ
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、４０ｋＤａを大気温度に温めた。分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（８．７ｍｇ）を２００μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を形成した。インフリキシマブに対して２００倍モル過剰の分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドが得られるまで、事前に調製したインフリキシマブ反応混合液（０．１６４ｍｇストックインフリキシマブ液、従来の方法によりｐＨを８．０に調整）に分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を添加した。必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨを約８．０とした。アミド結合を介して分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を２時間室温で撹拌し、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生じた。０．１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを６．０に下げ、無水物を放出した。グリシンを添加することにより反応を停止させた。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、約１０％の１‐ｍｅｒ複合体を検出した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、約３０％の１‐ｍｅｒ複合体を検出した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例８ｂ
Figure 2009533347
 複合反応の前に、滅菌水中０．１６４ｍｇのインフリキシマブを取得し、ｐＨを試験して８．０に調整した。インフリキシマブにおいて最も反応性のあるアミノ基を可逆的に保護するため、この液体をインフリキシマブのモルに対して１０倍モル過剰のジメチル無水マレイン酸「ＤＭＭＡｎ」（１３．８ｍｇ）と組み合わせることにより（Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９９，２９０，３６８-７２）、ＤＭＭＡｎ処理したインフリキシマブ液を形成した。保護反応は、３０分間３７℃で行うことができた。必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨ８．０とした。
アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、４０ｋＤａを大気温度に温めた。分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（８．７ｍｇ）を３２．６μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を形成した。インフリキシマブに対して２００倍モル過剰の分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドが得られるまで、ＤＭＭＡｎ処理したインフリキシマブ液（ｐＨ８．０、室温）に分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を添加した。アミド結合を介して分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を２時間室温で撹拌し、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生じた。グリシンを添加することにより反応を停止させた。その後、保護リジンアミノ基を脱保護するため、０．１Ｎ ＨＣｌで反応混合物をｐＨ６．０に調整し、３７℃で３０分間培養した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、約１０％の１‐ｍｅｒを検出した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例９
実施例５の拡大
アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ‐ＳＭＢ、３０ｋＤａを大気温度に温めた。温めたｍＰＥＧ‐ＳＭＢ（６５．６ｍｇ）を２．０ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、ｍＰＥＧ‐ＳＭＢ溶液を形成した。インフリキシマブに対して２００モル過剰のｍＰＥＧ‐ＳＭＢが得られるまで、１．６４ｍｇのインフリキシマブを含むストックインフリキシマブ懸濁液のアリコートにｍＰＥＧ‐ＳＭＢ溶液を添加した。ｍＰＥＧ‐ＳＭＢを添加した後、反応混合液のｐＨを試験し、確実にｐＨ７．２〜７．５とした。アミド結合を介してｍＰＥＧ‐ＳＭＢをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を３時間室温で撹拌した。反応溶液を一晩（１６時間）６℃で撹拌し、複合体溶液を生成することによって、結合の継続が可能となった。グリシンで反応を停止させた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、１‐ｍｅｒ（約４０％）および２‐ｍｅｒおよび３‐ｍｅｒ（合計約２０％）を検出した。
実施例１０
実施例８Ａの拡大
実施例８Ａを再度、より大規模で実行した。その結果および収率は同様であった。
実施例１１
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存したｍＰＥＧ‐ＳＰＡ、５ｋＤａを大気温度に温めた。（ストックインフリキシマブ懸濁液の測定アリコート中のインフリキシマブ量に対して）２０倍過剰の温めたｍＰＥＧ‐ＳＰＡをバッファ（１６４μｌの１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧの２ｍＭ ＨＣｌ溶液）に溶解し、ストックインフリキシマブ液（０．２４６ｍｇインフリキシマブ）アリコートに添加し、十分に混合した。ｍＰＥＧ‐ＳＰＡを添加した後、反応混合液のｐＨを特定し、従来技術を使用して７．２〜７．５に調整した。アミド結合を介してｍＰＥＧ‐ＳＰＡをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を暗所で５時間室温で撹拌した後、冷暗室で一晩３〜８℃で撹拌することにより、複合体溶液を生成した。グリシンで反応を停止させた。
非複合形態と複合形態との分子量変化は比較的差が小さいため、ＰＥＧ化の収率は特定しなかった。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ＳＰＡを使用して、その他の複合体を調製する。
実施例１２
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、６０ｋＤａを大気温度に温めた。分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（０．６５０ｍｇ）を３２．６μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を形成した。インフリキシマブに対して１０倍モル過剰の分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドが得られるまで、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を事前に調製したインフリキシマブ反応混合物１６４μｇに添加した（従来の方法によりｐＨを７．０に上昇）。アミド結合を介して分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を２時間室温で撹拌した後、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生じた。グリシンを添加することにより反応を停止させた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、天然型の約２０％をＰＥＧに複合した。反応は、主に１‐ｍｅｒおよび一部２‐ｍｅｒを生成した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例１３
分岐型ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ、６０ｋＤａを用いたインフリキシマブのＰＥＧ化
（「ｍＰＥＧ２‐ＭＡＬ」）
（２０：１ ポリマー：インフリキシマブ比）
ほとんどの場合において、抗体を還元することにより、ＰＥＧ化の後に同様の構造に戻すことができないフラグメントが生成される。任意のイベントにおいて、この反応を行い、還元後の遊離システイン残渣の数に削減する前に、遊離残渣の数を比較した。
複合反応の前に、滅菌水中０．１６４ｍｇのインフリキシマブを取得した。これに１．６８ｍｇのＤＴＴ（インフリキシマブのモルに対して１０倍過剰）を添加し、室温で１時間の還元を可能にした。次に、ＤｅＳａｌｔ媒体を介してＤＴＴを除去し、３０Ｋ Ｍｗカットオフ膜を用いてストック溶液を約１ｍＬまで濃縮し、還元ストックインフリキシマブ液を形成した。
アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ、６０ｋＤａを大気温度に温めた。温めた分岐型ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ（０．６５２μｇ）を０．１ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ溶液を形成した。還元ストックインフリキシマブ液に、分岐型ｍＰＥＧ‐ＭＡＬ溶液を添加し、２０倍モル過剰のｍＰＥＧ‐ＭＡＬを生じた。混合物を室温で３時間撹拌した。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、１‐ｍｅｒ（約２０％）を形成した。
同様のアプローチを使用して、その他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ‐ＭＡＬを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例１４
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、６０ｋＤａを大気温度に温めた。分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（０．６５０ｍｇ）を３２．６μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を形成した。インフリキシマブに対して２０倍モル過剰の分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドが得られるまで、ストックインフリキシマブ液（１６４μｇのインフリキシマブ）（従来の方法を使用してｐＨを７．０に調整したストックインフリキシマブ液）アリコートに分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を添加した。必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨ７．０とした。溶液を３０分間反応させた後、ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液の第２の添加を調製し、前記と同様の方法で添加した。アミド結合を介して分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を２時間室温で撹拌した後、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生成した。グリシンを添加することにより反応を停止させた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、天然型の３０％をＰＥＧに複合した。反応は、主に１‐ｍｅｒおよび一部２‐ｍｅｒを生成した。
同様のアプローチを使用し、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例１５
Figure 2009533347
 アルゴン下、−２０℃で保存した分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド、６０ｋＤａを大気温度に温めた。分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド（０．３２６ｍｇ）を３２．６μＬの２ｍＭ ＨＣｌに溶解し、分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を形成した。インフリキシマブに対して１０倍モル過剰の分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドが得られるまで、ストックインフリキシマブ液（１６４μｇのインフリキシマブ）（従来の方法を使用してｐＨ７．０に調整したストックインフリキシマブ液）アリコートに分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液を添加した。必要に応じてｐＨを試験し、調整して、確実にｐＨ７．０とした。溶液を３０分間反応させた後、ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミド溶液の第２の添加を調製し、前記と同様の方法で添加した。アミド結合を介して分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドをインフリキシマブに結合可能にするため、反応溶液を２時間室温で撹拌した後、一晩（１６時間）６℃で撹拌することにより、複合体溶液を生成した。グリシンを添加することにより反応を停止させた。
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に従って、天然型の３０％をＰＥＧに複合した。反応は、主に１‐ｍｅｒおよび一部２‐ｍｅｒを生成した。
同様のアプローチを使用して、その他の重量平均分子量を有する分岐型ｍＰＥＧ２‐Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドを用いて、その他の複合体を調製できる。
実施例１６
実施例および前述の説明に従って調製した複合体を、放射性リガンド結合アッセイに基づく活性について試験した。以下の材料を使用した。ヒトＵ９３７細胞；リガンド：０．０２８ｎＭ［１２５Ｉ］ＴＮＦ‐α；担体：１％５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ８．０；培養時間／温度：３時間／４℃；培養バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．４、４℃の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；非特異的リガンド：０．０４μＭ ＴＮＦ‐α；ＫＤ０．０７ｎＭ；ＢＭＡＸ０．２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質；特異的結合６０％；定量方法：放射性リガンド結合；有意性基準：最大誘発または抑制の５０％以上。提示される場合、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＴｏｏｌｂｏｘTM（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を使用し、非線形最小二乗回帰分析によりＩＣ５０値を特定した。阻害定数（Ｋ１）が提示される場合、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆの方程式（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９-３１０８，１９７３）を使用し、観察された試験化合物のＩＣ５０、アッセイに採用される放射性リガンドの濃度、およびリガンドのＫＤの歴史的価値（実験的に取得される）を用いてＫ１値を計算する。提示される場合、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｂｏｘ（登録商標）を使用して競合的結合曲線の勾配を定義するヒル係数（ｎＨ）を計算した。１．０から有意に異なるヒル係数は、結合の変位が単一の結合部位との質量作用の法則に従わないことを意味する場合がある。ＩＣ５０、Ｋ１、および／またはｎＨデータが標準誤差（ＳＥＭ）なく提示される場合、データは十分に定量的でなく、提示される値（ＩＣ５０、Ｋ１、ｎＨ）は注意して解読する必要がある。表４に結果を示す。
Figure 2009533347

Claims (21)

  1. 直接または１つ以上の原子を通じて、全長抗ＴＮＦα抗体の残渣に共有結合している水溶性ポリマーを含むことを特徴とする複合体。
  2. 直接または１つ以上の原子を通じて、抗ＴＮＦα抗体の残渣に共有結合した水溶性ポリマーを含む複合体であって、前記水溶性ポリマーは、直接または１つ以上の原子を通じて、前記抗ＴＮＦα抗体内のシステインに共有結合しないことを特徴とする複合体。
  3. 以下の構造を有する複合体であって、
    Figure 2009533347
     式中、
    ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、
    （ａ）はゼロまたは１であり、
    Ｘは、存在する場合、１つ以上の原子で構成されるスペーサ部分であり、
    Ｒ１は、Ｈまたは１〜３の炭素原子を含む有機ラジカルであり、
    ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣であることを特徴とする複合体。
  4. 以下の構造を有する複合体であって、
    Figure 2009533347
     式中、
    ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、
    （ａ）はゼロまたは１であり、
    （ｊ）はゼロまたは１〜約２０までの整数であり、
    （ｂ）はゼロまたは１〜約１０までの整数であり、
    各Ｒ２は、存在する場合、Ｈまたは有機ラジカルであり、
    各Ｒ３は、存在する場合、Ｈまたは有機ラジカルであり、
    ＡＴＡは抗ＴＮＦα抗体の残渣であることを特徴とする複合体。
  5. 前記抗ＴＮＦα抗体は、抗ＴＮＦα抗体断片の形態であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  6. 前記抗ＴＮＦα抗体は、全長抗ＴＮＦα抗体の形態であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  7. 前記水溶性ポリマーは、分岐していることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  8. 前記水溶性ポリマーは、線状であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  9. 前記抗ＴＮＦα抗体は、二量体または三量体でないことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  10. 前記抗ＴＮＦα抗体は、一価であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  11. 前記抗ＴＮＦα抗体は、ＣＤＲ移植されないことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  12. 前記抗ＴＮＦα抗体は、ガラクトシル化またはグリコシル化されないことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の複合体。
  13. 以下の構造を有し、
    Figure 2009533347
     式中、ｎは約３〜約１４００の範囲であることを特徴とする請求項３に記載の複合体。
  14. 以下の構造を有し、
    Figure 2009533347
     式中、ｎは約３〜約１４００の範囲であることを特徴とする請求項３に記載の複合体。
  15. 前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）であることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の複合体。
  16. 前記ポリ（エチレングリコール）は、メトキシで末端封止されていることを特徴とする請求項１５に記載の複合体。
  17. 前記ポリ（エチレングリコール）は、約６，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１６に記載の複合体。
  18. 前記ポリ（エチレングリコール）は、約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１７に記載の複合体。
  19. 前記ポリ（エチレングリコール）は、約２０，０００ダルトン〜約６５，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１８に記載の複合体。
  20. 前記抗ＴＮＦα抗体は、インフリキシマブまたはアダリムマブのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至４および６〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
  21. 請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の複合体と、薬学的に許容しうる賦形剤と、を含むことを特徴とする組成物。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2648582C (en) 2006-04-07 2016-12-06 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
IL226267B (en) 2010-11-12 2022-09-01 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-2 moiety and a polymer, compositions comprising the same and uses thereof
AU2016335860B2 (en) 2015-10-08 2023-08-10 Nektar Therapeutics Combination of an IL-2Rbeta-selective agonist and a long-acting IL-15 agonist
SI3464318T1 (sl) 2016-06-02 2021-07-30 Abbvie Inc. Agonist glukokortikoidnega receptorja in njegovi imunokonjugati
US10495559B2 (en) * 2017-11-27 2019-12-03 Pixart Imaging Inc. Particle concentration sensing method and portable electronic apparatus applying the particle concentration sensing method
PE20201286A1 (es) 2017-12-01 2020-11-24 Abbvie Inc Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados de este
KR20230159299A (ko) * 2022-05-12 2023-11-21 가톨릭대학교 산학협력단 자가면역질환 치료용 항체의 치료 효과 개선을 위한 폴리프로필렌옥사이드가 포함된 고분자 기반 접합체

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003535591A (ja) * 2000-06-06 2003-12-02 セルテック アール アンド ディ リミテッド ヒト腫瘍壊死因子αに対する特異性を有する抗体分子およびそれらの使用
WO2004081026A2 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5169627A (en) * 1991-10-28 1992-12-08 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Oral pharmaceutical composition containing a polyethylene glycol-immunoglobulin G conjugate for reconstitution of secretory immunity and method of reconstituting secretory immunity
GB9225448D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5695760A (en) 1995-04-24 1997-12-09 Boehringer Inglehiem Pharmaceuticals, Inc. Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20040121415A1 (en) 1996-12-10 2004-06-24 King David John Monovalent antibody fragments
US7122636B1 (en) * 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
AU7266898A (en) 1997-04-30 1998-11-24 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6537549B2 (en) 1999-02-24 2003-03-25 Edward L. Tobinick Cytokine antagonists for the treatment of localized disorders
US6596849B1 (en) 1999-05-28 2003-07-22 Academia Sinica Monoclonal-antibody for analysis and clearance of polyethylene glycol and polyethylene glycol-modified molecules
ES2256082T3 (es) 1999-12-22 2006-07-16 Nektar Therapeutics Al, Corporation Derivados de polimeros hidrosolubles con impedimento esterico.
AU2001238595A1 (en) 2000-02-22 2001-09-03 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US7446174B2 (en) 2001-03-02 2008-11-04 Xencor, Inc. Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders
US7687461B2 (en) 2000-03-02 2010-03-30 Xencor, Inc. Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
ES2538342T3 (es) 2001-10-10 2015-06-19 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de la hormona estimuladora del folículo (FSH)
ES2358505T3 (es) 2002-03-20 2011-05-11 Ucb Pharma, S.A. Métodos para analizar isómeros de disulfuro de anticuerpos.
JP4418745B2 (ja) 2002-05-28 2010-02-24 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 抗体ｐｅｇ位置異性体、それを含む組成物及びその使用
MXPA05007165A (es) 2002-12-31 2005-09-21 Nektar Therapeutics Al Corp Reactivos polimericos que comprnden una cetona o un grupo funcional relacionado.
AU2004204136B2 (en) 2003-01-06 2008-10-09 Nektar Therapeutics Thiol-selective water-soluble polmer derivatives
MXPA05008785A (es) 2003-02-19 2005-10-18 Pharmacia Corp Esteres de polietilen glicol activados.
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
HUE043911T2 (hu) 2003-05-23 2019-09-30 Nektar Therapeutics Két PEG láncot tartalmazó PEG származékok
WO2005002597A1 (en) 2003-07-02 2005-01-13 Polycord, Inc. Method for delivering polymerized therapeutic agent compositions and compositions thereof
CA2559809A1 (en) 2004-03-12 2005-11-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10
CN101001871A (zh) 2004-06-10 2007-07-18 津莫吉尼蒂克斯公司 可溶性ZcytoR14、抗ZcytoR14抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法
US8008453B2 (en) * 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
CA2648582C (en) 2006-04-07 2016-12-06 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
KR102612902B1 (ko) 2016-04-22 2023-12-18 삼성디스플레이 주식회사 투명 전도막 및 이를 포함하는 전자 소자

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003535591A (ja) * 2000-06-06 2003-12-02 セルテック アール アンド ディ リミテッド ヒト腫瘍壊死因子αに対する特異性を有する抗体分子およびそれらの使用
WO2004081026A2 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
US9636412B2 (en) 2017-05-02
EP2004231A2 (en) 2008-12-24
WO2007117685A2 (en) 2007-10-18
US9101670B2 (en) 2015-08-11
US10232042B2 (en) 2019-03-19
US20100021481A1 (en) 2010-01-28
US20170196975A1 (en) 2017-07-13
CA2648582C (en) 2016-12-06
EP2004231A4 (en) 2013-07-10
CA2648582A1 (en) 2007-10-18
WO2007117685A3 (en) 2008-10-02
US20160030587A1 (en) 2016-02-04

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