JP2009525282A - 血管新生疾患の治療のための組み合わせ療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、患者にＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせを投与することによって、血管新生疾患を有すると診断され、又は血管新生疾患を発症するリスクがあると診断された患者を治療するための方法を特徴とする。本発明は、血管新生疾患の治療又は予防のための、第一のＶＥＧＦアンタゴニスト及び第二のＶＥＧＦアンタゴニストを含有する医薬組成物も特徴とする。

Description

関連出願
本願は、２００６年１月３０日に出願された米国仮出願６０／７６３，２４１号（代理人整理番号ＥＹＥ−０５４Ｐ）の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、眼科及び医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を阻害する因子の組み合わせを使用する、血管新生疾患の治療に関する。

血管新生（新血管新生とも称される。）は、既に存在する血管からの芽の形成及び周囲組織中のへのそれらの侵入を伴う。関連するプロセスである血管形成は、組織全体に既に存在する内皮細胞及び血管芽細胞の分化を伴い、並びに、引き続き、血管を形成するために互いに結合することを伴う。

血管新生は、発達中に広範に起こり、傷害又は外傷後に、組織への血流を復活させるために、創傷治癒の間に、健康な身体中にも起こる。しかしながら、血管新生は、癌及び腫瘍形成にも関与していると考えられている。実際、腫瘍組織中の血管の量は、乳癌（Ｗｅｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｊ． Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１８７５−１８８７）、前立腺癌（Ｗｅｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ４３：４０１−４０９）、脳腫瘍（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４４：８２−８６）及び黒色腫（Ｆｏｓｓ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２９００−２９０３）において、予後の不良を強く示唆する指標である。最近、血管新生は、リウマチ学、皮膚科学、心臓学及び眼科学など、医学の多くの分野において、他の病状にも関与していると推測されている。特に、望ましくない、又は病理学的な組織特異的血管新生は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症及び乾癬など、ある種の特定の病状と関連している（例えば、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１６：５７；及びＦｏｌｋｍａｎ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １：２７参照）。さらに、血管の透過性の変化は、正常な生理的プロセス及び病的な生理的プロセスの両者で役割を果たしていると考えられている（Ｃｕｌｌｉｎａｎ−Ｂｏｖｅ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３３：８２９；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：３０３）。これらの疾病のそれぞれにおける血管新生プロセスは、発達時の血管新生及び腫瘍の血管新生と多くの特徴を共有していると思われるが、それぞれは、周囲細胞の影響によって付与される特有の側面も有し得る。

幾つかの眼疾患は、血管新生の変化を伴う。例えば、成人の失明の第三位の原因である糖尿病性網膜症（米国において、失明のほぼ７％を占める。）は、大規模な血管新生現象を伴う。非増殖性網膜症には、網膜内の周皮細胞の選択的喪失が伴い、それらの喪失は、付随する毛細血管の拡張及びその結果生じる血流の増加をもたらす。拡張された毛細血管中では、内皮細胞は増殖し、嚢状突出部を形成し、嚢状突出部は毛細血管瘤になり、隣接する毛細血管が封鎖された状態となって、これらの毛細血管瘤を取り囲む網膜の領域は灌流されないようになる。最終的には、毛細血管瘤の隣接領域の間に短絡血管が出現し、毛細血管瘤及び灌流されない網膜の領域を伴う初期の糖尿病性網膜症の臨床像が見られる。毛細血管瘤が漏出し、毛細血管が出血し得、浸出及び出血を引き起こす。背景となる糖尿病性網膜症の初期段階が一旦確立されたら、何年にもわたって症状が進行し、症例の約５％で、増殖性の糖尿病性網膜症及び失明へと発展する。増殖性の糖尿病性網膜症は、網膜の幾つかの領域がそれらの毛細血管を失い続け、非灌流状態となった時に起こり、円板及び網膜上のその他の場所に新しい血管の出現をもたらす。これらの新しい血管は硝子体中に増殖し、容易に出血して、前網膜性の出血を引き起こす。進行した増殖性の糖尿病性網膜症においては、大規模な硝子体出血が、硝子体腔の大部分を満たし得る。さらに、新しい血管には、牽引性網膜剥離をもたらし得る繊維性組織の増殖が伴う。

糖尿病性網膜症は、概ね、真正糖尿病の継続を伴い、従って、集団が高齢化し、糖尿病患者がより長く生きるにつれて、糖尿病性網膜症の発生率が増加する。現在、非増殖性及び増殖性の両糖尿病性網膜症において、レーザー治療が使用されている。黄斑領域周囲の漏出性毛細血管瘤の局所的レーザー治療は、臨床的に重要な黄斑浮腫を有する患者の５０％において、視力喪失を抑制する。増殖性の糖尿病性網膜症では、網膜全体にわたる光凝固が、（黄斑領域を除く）網膜全体に分散した数千の小さな火傷をもたらし、この治療は、失明の割合を６０％減少させる。黄斑浮腫及び増殖性の糖尿病性網膜症の初期治療は、患者の９５％に、５年間にわたって失明を予防するのに対して、後期治療は僅か５０％に失明を予防するに過ぎない。従って、初期診断と治療が不可欠である。

新血管新生を伴う別の眼疾患は、６５歳を超えるアメリカ人の１０人の約１人が罹患している疾病である加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）である。ＡＭＤは、網膜の中心領域である黄斑の一連の病的変化によって特徴付けられ、これは、減少した視覚の鋭敏さを伴い、特に、中心の視覚に影響を与える。ＡＭＤは、感覚性網膜の直下に位置する網膜色素上皮と呼ばれる細胞の単一層を含む。これらの細胞は、本細胞と接触している網膜の部分（例えば、視覚色素を含有する光受容体細胞）に栄養を補給し、支持する。網膜色素上皮は、ＡＭＤにおいて肥厚する基底膜複合体であるブルッフ膜上に横たわっている。新しい血管は、その下に位置する脈絡膜（豊富な血管床を含有する。）から、ブルッフ膜を貫通し得る。次いで、これらの血管は、網膜色素上皮と感覚性網膜の間にある網膜色素上皮の下で、及び／又は感覚性網膜内で、液体を漏出し、又は出血し得る。続いて生じる繊維性の瘢痕が、光受容体細胞の栄養補給を破壊し、それらの死を引き起こして、中心の視覚の鋭敏さを失わせる。加齢性黄斑症のこのタイプは、漏出性血管及び網膜下の浮腫又は血液のために、「湿潤」型と呼ばれる。湿潤型は、加齢性黄斑症の症例の１０％を占めるに過ぎないが、高齢者の黄斑変性に由来する法的失明の症例の９０％をもたらす。加齢性黄斑症の「乾燥」型は、上に横たわる光受容体細胞の喪失とともに、網膜色素上皮の萎縮を伴う。乾燥型は、視力を低下させるが、通常、２０／５０ないし２０／１００のレベルまで低下させるに過ぎない。

湿潤ＡＭＤの研究は、血管内皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）は、眼内に異常な血管増殖（血管新生）及び血管漏出の両者を引き起こす主な因子の１つである。具体的には、前臨床研究は，ａ）ヒトを含む複数の動物種及びモデルにおいて、増殖している漏出性血管周囲でＶＥＧＦのレベルが上昇していること、ｂ）ＶＥＧＦを封鎖することによって、霊長類及びその他の種にこれらの異常な血管の阻害がもたらされること、並びにｃ）ＶＥＧＦ単独で、湿潤ＡＭＤの特徴である異常な血管増殖及びＤＭＥの特徴である血管漏出を引き起こすのに十分であることを示している。Ａ．Ｐ． Ａｄａｍｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｒｅｔｉｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｒｉｓ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ， １１４（１）Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．６６−７１（１９９６）；Ａ． Ｋｖａｎｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｂｆｏｖｅａｌ ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．３７ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９２９−３４（１９９６）；Ｇ． Ｌｕｔｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａ ａｎｄ ｃｈｏｒｏｉｄ．１１４ Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９７１−７７（１９９６）；Ｍ．Ｊ． Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ ｉｎ ａｎ ａｄｕｌｔ ｐｒｉｍａｔｅ， １０３（１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １８２０−２８（１９９６）；ＭＪ．Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ， Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｉｒｉｓ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ．１１４（８）Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９６４−７０（１９９６）を参照されたい。

専門家による査読を経た数多くの研究が、湿潤ＡＭＤに罹患したヒトの眼内にＶＥＧＦの高い濃度を見出した。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって公表された研究では、ＶＥＧＦの硝子体レベルは、血管新生疾患を有する患者中で極めて高いが、非血管新生疾患のために手術の同じ種類を施した患者では無視できる程度であることが示された。Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ３３１ Ｎｅｗ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．１４８０−８７（１９９４）を参照されたい。別の研究では、活性なＤＭＥを有する患者中で、眼のＶＥＧＦレベルが上昇していることが示された。Ｓ．Ａ．Ｖｉｎｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｎｄ ｎｏｎ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．１２（１）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．９９−１０９（１９９７）を参照されたい。

ＡＭＤには、物体がより大きく若しくはより小さく見え、又は中心線が歪んで、折れ曲がって若しくは中心セグメントが喪失して見える中心の視覚の歪みを伴う。ＡＭＤの湿潤型では、感覚性網膜の小さな剥離が、黄斑領域中に認められ得るが、網膜下の新血管膜の確定的診断には、フルオレセイン血管造影が必要である。乾燥型では、ドルーゼンが、黄斑領域中の色素化パターンを妨害し得る。ドルーゼンは、細胞中に突出している、網膜色素上皮の基底膜の異常成長であり、細胞を前方に膨らませる。加齢性黄斑症におけるリスク因子としてのそれらの役割は明瞭でない。加齢性黄斑症の乾燥型に対しては、現在、治療は存在しない。加齢性黄斑症の湿潤型では、レーザー治療が使用され、まず、新血管膜を完全に消滅させ、１８ヶ月の時点で、患者の約５０％に、さらなる視覚の喪失を予防する。しかしながら、６０ヶ月までに、著しい利益を有する患者は２０％に過ぎない。

塩基性及び酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、形質転換成長因子α及びβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンギオゲニン、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インターロイキンー８（ＩＬ−８）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）など、血管新生の複数の分子媒介物質が同定されている。血管新生への関与が推定されている他の刺激物質には、アンギオポエチン−１、Ｄｅｌ−Ｉ、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）が含まれる。さらに、血管新生の調節は、アンギオアレスチン、アンギオスタチン（プラスミノーゲン断片）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）、フィブロネクチン断片、グロ−β、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖断片、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、インターフェロンα／β／γ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノーゲン断片）、メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤性リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、バスキュロスタチン及びバソスタチン（カルレティキュリン断片）など、身体によって産生される、血管新生の多数の負の制御因子によってさらに媒介される。

これらの血管新生制御因子のうち、ＶＥＧＦが、腫瘍増殖を伴う異常な血管新生の正の制御因子として、中心的役割を果たしているようである（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ， ｅｄｓ．）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， Ｂａｓｅｌ， ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０３−６０６）に概説されている。）。さらに、最近、シグナル伝達分子のＰＤＧＦファミリーのＰＤＧＦ−Ｂメンバーは、血管周囲細胞（壁細胞と称される場合がある。）、例えば、血管平滑筋、メサンギウム細胞及び周皮細胞の形成、増殖及び適切な機能において役割を果たしているように見受けられるので、その役割が調査されてきた。

ＶＥＧＦは、ヒトでは、認められた４つの主要なイソフォームとして主に存在することが知られている、ジスルフィドによって結合されたホモ二量体である。単量体サブユニット当りに存在するアミノ酸の数によって特定される各イソフォームは、選択的ＲＮＡスプライシング現象の結果として生じる。ヒトでは、４つの主要なイソフォームは、ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１８９及びＶＥＧＦ_２０６である。

ＶＥＧＦは、血管新生の複雑なプロセスに関与する数個の成長因子の１つであり、血管内皮細胞に対して極めて高い特異性を有する。ＶＥＧＦは、インビトロでは、強力な内皮細胞有糸分裂促進物質であり、インビボでは、血管新生及び血管の透過性を誘導する。最近のデータは、ＶＥＧＦ_１６５が、主な血管新生増殖因子であり、ＡＭＤの新血管形態の発病に寄与していることを示唆している（Ｋｌｉｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７；Ｋｖａｎｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００２；Ｌｉｐ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。ＶＥＧＦは、ＤＭＥの発病及び血液網膜障壁の破壊においても重要な役割を果たし得る。従って、ＶＥＧＦ_１６５を特異的に標的化することは、臨床的な観点から有利であり得る。

Ｍａｃｕｇｅｎは、一旦、ＶＥＧＦ_１６５に結合すると、ＫＤＲ及びＦｌｔ−１細胞受容体の両者へのＶＥＧＦ_１６５の結合を阻害する、ヒトＶＥＧＦ_１６５に対する特異的な高親和性リガンドである。その結果、この阻害は、ＶＥＧＦ_１６５の下流効果（すなわち、血管新生及び増加した血管透過性）を拮抗させる。

Ｍａｃｕｇｅｎを用いて行われた前臨床インビトロ及び動物研究に基づいて、イソフォーム１６５及び１２１という２つのＶＥＧＦイソフォームが、有意なレベルで眼内に存在することが明らかとなっている。これらの検査において、イソフォーム１６５の動物対応物とのＭａｃｕｇｅｎの結合は、網膜内の異常な血管増殖を阻害する上で極めて効果的であることが見出された。同時に、Ｍａｃｕｇｅｎは、有意な程度では、イソフォーム１２１の動物対応物と結合しなかった。全てのイソフォームを封鎖するＶＥＧＦ阻害剤との直接的な比較を行う動物研究において、Ｍａｃｕｇｅｎは、網膜の正常な血管に対して影響を与えなかったのに対して、汎ＶＥＧＦイソフォーム阻害剤は、それらの増殖及び生存を変化させた。

さらに、ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦの炎症促進性イソフォームとして同定されている（Ｕｓｕｉ ｅｔ ａｌ．， “ＶＥＧＦ_{１６４（１６５）}ａｓ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｓｏｆｏｒｍ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＶＥＧＦＲｌ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２”， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｆｅｂ．２００４， Ｖｏｌ．４５， Ｎｏ．２）。従って、ＶＥＧＦ_１６５を優先的に結合するＭａｃｕｇｅｎの能力は、黄斑変性など、ＶＥＧＦと関連する新血管病変の病理の原因となるＶＥＧＦの特異的イソフォームを標的とし、ＶＥＧＦ_１６５に関連する一切の炎症性応答を制限する。

発達、創傷治癒及び腫瘍形成を伴う血管新生又は新血管新生について多くのことが学ばれてきたが、血管新生のこれらの形態と眼の血管新生の間に差が存在するかどうかは、なお決定を要する。重要なことに、例えば、心臓内の側副血管形成を伴う血管新生は、生物にとって有益であり、生物に適応可能であり得るのに対して、例えば、ＡＭＤを伴う病的な眼の新血管新生は、利点が知られておらず、しばしば、失明をもたらす（概説について、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８４：３０１−１０を参照）。従って、新血管新生を伴う分子現象の理解が進歩しているが、ＡＭＤ及び糖尿病性網膜症とともに発生する脈絡膜新血管新生などの眼の血管新生疾病及び疾患を含む、血管新生疾病及び疾患を治療するためのさらなる方法を開発するために、この理解を使用する必要性が存在している。

発明の要旨
本発明に従って、血管新生疾患に対して改善された治療を提供する、第一及び第二の抗ＶＥＧＦ因子の組み合わせ療法が開示されている。眼の血管新生疾患を治療することに向けられた一実施形態において、第一の抗ＶＥＧＦ因子は、病変領域を乾燥させるための短期的療法を提供し、視覚の鋭敏さを改善させるのに対して、第二の抗ＶＥＧＦ因子は、視覚を保持し、疾病の進行を阻害するための長期的療法として投与される。一実施形態によれば、第一の抗ＶＥＧＦ因子は汎ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤であり、第二の抗ＶＥＧＦ因子は、ＶＥＧＦ_１６５イソフォームを選択的に阻害する。一実施形態によれば、第一の抗ＶＥＧＦ因子は抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片であり、第二の抗ＶＥＧＦ因子は、抗ＶＥＧＦアプタマーである。

従って、本発明は、血管新生疾患を有すると診断され、又は血管新生疾患を発症するリスクがあると診断された患者を治療するための方法を特徴とする。本方法は、全てのＶＥＧＦイソフォームを封鎖する第一の抗ＶＥＧＦ因子及びＶＥＧＦ_１６５に対して選択的である第二の抗ＶＥＧＦ因子を患者に投与することを含む。

特定の実施形態において、第一のＶＥＧＦアンタゴニストは、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ^ＴＭ（ｒｈｕＦａｂＶ２又はラニビズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＵＳＡ）又はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＵＳＡ）などの抗体又はその断片であり、第二のＶＥＧＦアンタゴニストは、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム、（ＯＳＩ）Ｅｙｅｔｅｃｈ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）などのアプタマーである。

一実施形態において、本発明の方法は、眼の血管新生疾患を抑制又は治療するための手段を提供する。幾つかの実施形態において、本発明の方法によって治療又は抑制するのに適した眼の血管新生疾患には、増殖性網膜症、光彩新血管新生、眼内新血管新生、加齢性黄斑変性、角膜新血管新生、網膜の新血管新生、脈絡膜の新血管新生、糖尿病性網膜虚血又は増殖性糖尿病性網膜症が含まれる。

加齢性黄斑変性を治療することに向けられた一実施形態において、浮腫及び進行した疾病が存在するときに、第一の非選択的ＶＥＧＦ阻害剤が投与される。第二の選択的ＶＥＧＦ阻害剤は、長期的治療の一環として、好ましい応答を保持するために、疾病が応答した場合に投与される。

本発明に従って血管新生疾患を治療するための方法は、全てのＶＥＧＦイソフォームを阻害するのに有効な量で第一の抗ＶＥＧＦ因子を投与すること、及びＶＥＧＦ_１６５を選択的に阻害するのに有効な量で第二の抗ＶＥＧＦ因子を投与することを含む。第一の汎ＶＥＧＦ阻害剤は、約３から３６週の治療期間にわたって、約３から６週ごとに投与され、選択的ＶＥＧＦ阻害剤は、必要とされる限り、約３から１２週ごとに投与される。

本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び医薬として許容される担体の両方を含む医薬組成物も提供する。本態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、何れも、患者内の血管新生疾患を抑制するのに十分な量で存在する。この態様によれば、第二のＶＥＧＦアンタゴニストは、約１ヶ月から１年の期間にわたって、ＶＥＧＦアンタゴニストを投与するための徐放製剤であり得る。

本発明の医薬組成物は、ＷＯ２００３／０９２６６５（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に開示されているものなどの小球体又はヒドロゲル製剤を含む医薬として許容される担体を含み得る。

本発明は、両ＶＥＧＦアンタゴニストを含む医薬パックも提供する。本態様の別の実施形態において、医薬パックは、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストであるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。

別の実施形態において、医薬パックの第一及び第二のＶＥＧＦアンタゴニストは、別個に、及び個別の投薬量で製剤化され得る。さらに別の実施形態において、医薬パックの第一及び第二のＶＥＧＦアンタゴニストは、一緒に製剤化される。

発明の詳細な説明
本明細書に挙げられている全ての公報、特許及び特許出願は、参照により、本明細書中に組み込まれる。

定義
本明細書において使用される、以下の用語及び語句は、以下の意味を有するものとする。別段の定義がなければ、本明細書に使用されている全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。

「アンタゴニスト」とは、標的分子の活性又は産生を部分的に又は完全に阻害する因子を意味する。特に、本明細書において選択的に適用される「アンタゴニスト」という用語は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ遺伝子発現、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル又はタンパク質活性のレベルを減少させることが可能な因子を意味する。アンタゴニストの典型的な形態には、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド（環状ペプチドなど）、抗体又は抗体断片、ペプチド模倣物、核酸分子、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマー、ＲＮＡｉ分子及び小有機分子が含まれる。ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲリガンド／受容体標的のアンタゴニスト阻害の典型的な非限定的機序には、アンチセンス、（例えば、リガンド遺伝子／核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物を用いた）リガンド合成及び／又は安定性の抑制、（例えば、抗リガンドアプタマー、抗体又は可溶性の、囮同族受容体を用いた）リガンドの、その同族受容体への結合の遮断、（例えば、リガンド受容体遺伝子／核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物を用いた）受容体合成及び／又は安定性の抑制、（例えば、受容体抗体を用いた）受容体の、その同族受容体への結合の遮断、並びに（例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害剤を用いた）受容体の同族リガンドによる受容体の活性化の遮断が含まれる。さらに、アンタゴニストは、標的分子を直接又は間接に阻害し得る。

本明細書において使用される「抗体」という用語には、あらゆるイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の完全な抗体が含まれるものとし、脊椎動物（例えば、哺乳動物）のタンパク質、炭水化物などを認識し、これらと特異的に反応する完全な抗体の断片が含まれる。抗体は、慣用技術を用いて断片化することが可能であり、断片は、完全な抗体について上述されているものと同じ様式で利用性についてスクリーニングされ得る。従って、本用語には、ある種のタンパク質と選択的に反応することができる、抗体分子のタンパク分解によって切断された部分又は組み換え的に調製された部分のセグメントが含まれる。このようなタンパク質分解及び／又は組み換え断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ並びにペプチドリンカーによって連結されたＶ［Ｌ］及び／又はＶ［Ｈ］ドメインを含有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖは、２つ又はそれ以上の結合部位を有する抗体を形成するために、共有的に又は非共有的に連結され得る。本発明には、ポリクローナル、モノクローナル抗体又は抗体の他の精製された調製物及び組み換え抗体が含まれる。

本明細書において「核酸リガンド」という用語と互換的に使用される「アプタマー」という用語は、特異的な三次元立体構造を採るその能力を通じて、標的に結合し、標的に対して拮抗的（すなわち、阻害的）効果を有する核酸を意味する。本発明の標的はＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体ＶＥＧＦＲの１つ）であり、従って、ＶＥＧＦアプタマー又は核酸リガンド（又はＶＥＧＦＲアプタマー若しくは核酸リガンド）という用語が使用される。アプタマーによる標的の阻害は、標的の結合によって、標的を触媒的に変化させることによって、標的又は標的の機能的活性を修飾／変化させる態様で標的と反応することにより、自殺阻害剤におけるように、標的へ共有結合することによって、標的と別の分子間の反応を促進することによって起こり得る。アプタマーは、複数のリボヌクレオチド単位、デオキシリボヌクレオチド単位又はヌクレオチド残基の両タイプの混合物から構成され得る。アプタマーは、本明細書中にさらに詳しく記載されているように、１つ又はそれ以上の修飾された塩基、糖又はホスファート骨格単位をさらに含み得る。

「抗体アンタゴニスト」は、標的ＶＥＧＦの１つ又はそれ以上の活性を遮断し、又は著しく低減することができる、本明細書において定義される抗体分子を意味する。例えば、ＶＥＧＦ阻害抗体は、ＶＥＧＦが血管新生を刺激する能力を阻害し、又は低減し得る。

ヌクレオチド配列は、２つの配列の塩基の各々が合致する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対を形成することができれば、別のヌクレオチド配列と「相補的」である。本明細書で使用される「相補鎖」という用語は、「相補物」という用語と互換的に使用される。核酸鎖の相補物は、コード鎖の相補物又は非コード鎖の相補物であり得る。

「保存された残基」又は「保存的アミノ酸置換」という用語は、ある種の共通の特性に基づいて、アミノ酸をグループに分けることを表す。各アミノ酸間の共通の特性を定義するための機能的な方法は、相同な生物の対応するタンパク質間で、アミノ酸変化の標準化された頻度を分析することである。このような分析に従って、群内のアミノ酸が優先的に互いと交換され、従って、総合的なタンパク質構造に対するそれらの影響において最も互いに類似する場合に、アミノ酸のグループが定義され得る（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）。このようにして定義されたアミノ酸グループの例には、以下のものが含まれる。

（１）Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる帯電した基、
（２）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる正に帯電した基、
（３）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる負に帯電した基、
（４）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる芳香族基、
（５）Ｈｉｓ及びｔｒｐからなる窒素環基、
（６）Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる巨大な脂肪族非極性基、
（７）Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる僅かに極性の基、
（８）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ及びＰｒｏからなる小残基の基、
（９）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる脂肪族基、並びに
（１０）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる小さなヒドロキシル基。

上に示されている基の他に、各アミノ酸残基は、それ自身の基を形成し得、各アミノ酸によって形成された基は、本分野で一般的に使用される、そのアミノ酸に対する一文字及び／又は三文字略号によって単純に表記され得る。

本明細書において使用される「相互作用する」という用語は、性質上、タンパク質−タンパク質間、タンパク質−核酸、核酸−核酸及びタンパク質−小分子又は核酸−小分子間の相互作用など、分子間の検出可能な関係又は会合（例えば、生化学的相互作用）を含むものとする。

「相互作用するタンパク質」という用語は、例えば、ＶＥＧＦタンパク質又はそれらの対応する同族受容体など、目的のタンパク質と相互作用し、結合し、及び／又はその他目的のタンパク質に会合することができるタンパク質を表す。

ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸に関して本明細書において使用される「単離された」という用語は、それぞれ、高分子の天然源中に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離された分子を表す。同様に、ポリペプチドに関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、ポリペプチド源中に存在する他のタンパク質から分離されたタンパク質分子を表す。本明細書において使用される、本明細書において使用される単離されたという用語は、組み換えＤＮＡ技術によって産生された場合に細胞物質、ウイルス物質若しくは培地を実質的に含まず、又は化学的に合成された場合に、化学的前駆体若しくは他の化学物質を含まない核酸又はペプチドも表す。

「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然の状態で見出されない核酸断片を含むものとする。「単離された」という用語は、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを表すためにも使用され、精製されたポリペプチド及び組み換えポリペプチドの両方を包含するものとする。

本明細書において使用される「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、放射性同位体、蛍光色素、化学発光部分、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、リガンド（例えば、ビオチン又はハプテン）などを含む（但し、これらに限定されない。）、検出可能な分子を表す。「蛍光発光体ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ」という用語は、検出可能な範囲で蛍光を発することができる物質又はその部分を表す。本発明において使用され得る標識の具体例には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。

「細胞中での遺伝子の発現のレベル」とは、細胞中の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ並びに前ｍＲＮＡ新生転写物、転写物プロセッシング中間体、成熟したｍＲＮＡ及び分解産物、並びにその遺伝子から翻訳されたタンパク質のレベルを表す。

本明細書で使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及び、適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを表す。本用語は、ヌクレオチド類縁体から作製されたＲＮＡ又はＤＮＡの均等物、類縁体を含むことを理解すべきであり、記載されている実施形態に対して適応可能なように、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチド、ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｒＲＮＡが、核酸と表記され得る分子の代表例である。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシド単量体のオリゴマー又は多量体を表す。本用語には、同様に機能する、天然に存在しない単量体又はその一部を含む修飾又は置換されたオリゴマーも含まれる。置換されたオリゴマーの取り込みは、増強された細胞の取り込み又は増加されたヌクレアーゼ耐性などの因子に基づき、本分野で公知のように選択される。完全なオリゴヌクレオチド又はその一部のみは、置換されたオリゴマーを含有し得る。

「パーセント同一」という用語は、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を表す。同一性は、比較のために並置され得る各配列中の位置を比較することによって、それぞれ決定することが可能である。比較された配列中の等価な位置が同じ塩基又はアミノ酸によって占められている場合には、分子は、その位置において同一であり、等価な部位が、同一又は類似の（例えば、立体的及び／又は電気的性質が類似）アミノ酸配列によって占められている場合には、分子は、その位置において、相同（類似）と称することができる。相同性、類似性又は同一性のパーセントとしての表現は、比較される配列によって共有される位置における同一又は類似のアミノ酸の数の関数を表す。Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴなど、様々なアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用し得る。ＨＮｉＭ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＥＢＩを通じて入手することが可能である。一実施形態において、１のギャップウエイト（例えば、２つの配列間において単一のアミノ酸又はヌクレオチドミスマッチであるかのように、各アミノ酸ギャップが重み付けられる。）を用いて、これらのＧＣＧプログラムによって、２つの配列のパーセント同一性を決定することが可能である。アラインメントのための他の技術が、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｖ， ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）， ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡに記載されている。望ましい場合には、配列中にギャップを許容するアラインメントプログラムは、配列を並置するために使用される。Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント中にギャップを許容するアルゴリズムの１つの種類である（（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７参照。）。また、配列を並置するために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアランメント法を用いたＧＡＰプログラムを使用することが可能である。ＨＭＭの使用を含む、さらに多くの技術及びアルゴリズムが、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ａｎｄ Ｄａｔａｂａｎｋｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（２０００）， ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ａｎｄ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）ｅｄ．Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記載されている。別の検索戦略は、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で実行されるＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用する。ＭＰＳＲＣＨは、大規模なパラレルコンピュータ上で配列に対してスコア付けするために、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍｎａｎアルゴリズムを使用する。このアプローチは、関連が低い合致を拾い上げる能力を改善し、特に、小さなギャップ及びヌクレオチド配列の誤りを許容する。タンパク質及びＤＮＡ両データベースを検索するために、核酸によってコードされたアミノ酸を使用することが可能である。各配列を有するデータベースは、上記「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｖ， ｅｄ． Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ」に記載されている。データベースには、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＤＮＡ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）が含まれる。

二重鎖に関する「完全に合致した」とは、各鎖中の全てのヌクレオチドが他の鎖中のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対を形成するように、二重鎖を構成するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド鎖が他のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド鎖と二本鎖構造を形成することを意味する。本用語は、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど、使用され得るヌクレオシド類縁体の対形成も包含する。標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド間の二重鎖中のミスマッチとは、二重鎖中のヌクレオチドの対がワトソン−クリック結合を行うことができないことを意味する。三重鎖に関しては、本用語は、三重鎖が完全に合致する二重鎖と、及び全てのヌクレオチドが、完全に合致した二重鎖の塩基対とＨｏｏｇｓｔｅｅｎ又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ会合を行っている第三の鎖とからなることを意味する。

「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」又は「ｓｉＲＮＡ」という用語は全て、目的の遺伝子に対して（特に、目的の遺伝子、例えば、ＶＥＧＦのｍＲＮＡに対して）相同的である１つ又はそれ以上の二本鎖ＲＮＡを標的細胞中に導入することによって、遺伝子又は遺伝子産物の発現を減少させる全ての方法を表す。

多型バリアントは、ポリヌクレオチド配列が１塩基だけ変化している（例えば、ＶＥＧＦ中の一塩基の変化）「一塩基多型」（ＳＮＰ）も包含し得る。ＳＮＰの存在は、例えば、ある種の集団、病状又は病状に対する傾向の指標であり得る。

異常な、例えば腫瘍細胞の生物状態の「プロファイル」とは、病状に応答して変化する細胞の様々な構成成分のレベルを表す。細胞の構成成分には、ＲＮＡのレベル、タンパク質の豊富さのレベル又はタンパク質活性のレベルが含まれる。

本明細書において、「タンパク質」という用語は、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語と互換的に使用される。「組み換えタンパク質」という用語は、一般に、発現されるタンパク質又はＲＮＡをコードするＤＮＡが適切な発現ベクター中に挿入されており、次いで、異種タンパク質又はＲＮＡを産生するために宿主細胞を形質転換するために前記発現ベクターが使用される組み換えＤＮＡ技術によって産生された本発明のタンパク質を表す。さらに、組み換えタンパク質をコードする組み換え遺伝子に関する「に由来する」という用語は、「組み換えタンパク質」の意味の中に、固有タンパク質のアミノ酸配列、又は天然に存在するタンパク質の変異（置換及び欠失を含む。）によって作製された、これに類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を含むものとする。

本明細書において使用される「導入遺伝子」という用語は、細胞中に導入された（例えば、標的核酸の１つ又はこれに対するアンチセンス転写物をコードする）核酸配列を意味する。導入遺伝子は、導入遺伝子がその中に導入されているトランスジェニック動物若しくは細胞に対して、部分的に若しくは完全に異種、すなわち外来であり得、又は導入遺伝子がその中に導入されているトランスジェニック動物若しくは細胞の内在遺伝子に対して相同であるが、導入遺伝子がその中に挿入されている細胞のゲノムを変化させる様式で、動物のゲノム中に挿入されるように設計され、若しくは挿入されている（例えば、導入遺伝子は、天然遺伝子の位置とは異なる位置に挿入され、又はその挿入がノックアウトをもたらす。）。導入遺伝子は、エピソームの形態で細胞中にも存在し得る。導入遺伝子は、１つ又はそれ以上の転写制御配列及び選択された核酸の最適な発現に必要であり得るイントロンなどのあらゆる他の核酸を含むことが可能である。

「血管新生疾患」とは、変化された又は制御されていない血管新生によって特徴付けられる疾患を意味する。血管新生疾患の例には、乾癬、関節リウマチ、癌並びに糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜の静脈閉塞及び加齢性黄斑変性などの眼の血管新生疾患が含まれる。

本明細書中で使用される場合、「新血管新生」及び「血管新生」という用語は、互換的に使用される。新血管新生及び血管新生は、細胞、組織又は臓器中への新しい血管の生成を表す。血管新生の調節は、典型的には、ある種の病状において変化し、多くの症例では、疾病に伴う病的な損傷は、変化され、制御されない、又は調節されない血管新生に関連する。制御されない持続的血管新生は、内皮細胞の異常な増殖によって特徴付けられるものなど、複数の病状において発生し、血管の漏出及び透過性など、これらの症状で見られる病的な損傷を支える。

「眼の血管新生疾患」とは、患者の眼における変化された又は制御されていない血管新生によって特徴付けられる疾患を意味する。典型的な眼の血管新生疾患には、視神経円板新血管新生、光彩新血管新生、網膜新血管新生、脈絡膜新血管新生、角膜新血管新生、硝子体新血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、血管網膜症、網膜変性、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患及び増殖性硝子体網膜症が含まれる。

対象中の血管新生疾患を「治療する」又は血管新生疾患を有する対象を「治療する」という用語は、血管新生疾患の少なくとも１つの症候が減少されるように、対象に医薬治療、例えば、薬物の投与を供することを表す。従って、本明細書において使用される「治療する」という用語は、血管新生症状又は疾病の少なくとも１つの症候を治癒及び軽減させることを包含するものとする。従って、本明細書において使用される「治療する」とは、血管新生疾患の治療又は予防のために医薬組成物を投与又は処方することを含む。

「患者」とは、全ての動物を意味する。「動物」という用語には、ヒト及び他の霊長類を含む（但し、これらに限定されない。）哺乳動物が含まれる。本用語は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ及びネコなどの家畜動物も含む。

「ＶＥＧＦ」又は「血管内皮成長因子」は、血管新生又は血管新生プロセスに影響を与える哺乳動物の血管内皮成長因子を意味する。本明細書において使用される「ＶＥＧＦ」という用語には、ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１６５及びＶＥＧＦ_１８８など、例えばＶＥＧＦ−Ａ／ＶＰＦ遺伝子の選択的スプライシングによって生じるＶＥＧＦ（血管透過性因子（ＶＰＦ）及びＶＥＧＦ−Ａとしても知られる。）（図２（Ａ）及び（Ｂ）参照）の様々なサブタイプも含まれる。さらに、本明細書において使用される「ＶＥＧＦ」という用語は、血管新生又は血管新生プロセスを刺激するために、同族ＶＥＦＧ受容体を通じて作用する、ＰＩＧＦ（胎盤成長因子）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＶＥＧＦ−ＥなどのＶＥＧＦ関連血管新生因子を表す。特に、「ＶＥＧＦ」という用語は、（１）ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）（図４（Ａ）及び（Ｂ）参照）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）（図４（Ｃ）及び（Ｄ）参照）又はＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ−４）などのＶＥＧＦ受容体に結合し、（２）ＶＥＧＦ受容体に付随するチロシンキナーゼ活性を活性化し、及び（３）これにより、血管新生又は血管新生プロセスに影響を与える成長因子のクラスのあらゆるメンバーを意味する。「ＶＥＧＦ」という用語は、「ＶＥＧＦ」ポリペプチド及びその対応する「ＶＥＧＦ」コード遺伝子又は核酸の両方を含むものとする。

「ＶＥＧＦアンタゴニスト」とは、ＶＥＧＦの活性又は産生を部分的に又は完全に、抑制又は阻害する因子を意味する。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ_１６５などの特異的なＶＥＧＦを、直接的に又は間接的に抑制又は阻害し得る。さらに、「アンタゴニスト」の上記定義と合致する「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦリガンド又はその同族受容体の何れかに対して作用して、ＶＥＧＦ関連受容体シグナルを抑制又は阻害する因子を含み得る。従って、このような「ＶＥＧＦアンタゴニスト」の例には、例えば、ＶＥＧＦを標的とするアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；抗ＶＥＧＦアプタマー、抗ＶＥＧＦ抗体又は可溶性ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦのその同族受容体への結合を妨げる抗ＶＥＧＦアプタマー、抗ＶＥＧＦ抗体又は可溶性ＶＥＧＦ受容体囮；同族ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；同族ＶＥＧＦＲ受容体へ結合する抗ＶＥＧＦＲアプタマー又は抗ＶＥＧＦＲ抗体及びＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が含まれる。

「血管新生疾患を抑制するのに十分な量」とは、血管新生疾患又はその症候を治療又は予防するために必要とされる、本発明の組み合わせにおけるアンタゴニストの有効量を意味する。血管新生疾患によって引き起こされる症状又は血管新生疾患に寄与する症状の治療的処置のために、本発明を実施するために使用される活性なアンタゴニストの「有効量」は、投与の様式、血管新生疾患の解剖学的な位置、患者の年齢、体重及び一般的な健康に応じて変動する。最終的には、医師又は獣医師が、適切な量及び投薬計画を決定する。このような量は、血管新生疾患を抑制するのに十分な量と称される。

本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な記載及び特許請求の範囲から明らかとなる。

ポリペプチドＸの「バリアント」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が変化されているペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有する「保存的な」変化を有し得る（例えば、ロイシンをイソロイシンに置換）。さらに稀には、バリアントは、「非保存的な」変化を有し得る（例えば、グリシンをトリプトファンに置換）。類似の僅かな変化は、アミノ酸の欠失若しくは挿入又は両者も含み得る。生物活性又は免疫学的活性を損なわずに、何れのアミノ酸残基が置換、挿入又は欠失され得るかを決定する上での指針は、本分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて見出し得る。

「バリアント」という用語は、ポリヌクレオチド配列に関して使用された場合、遺伝子又はそのコード配列に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多型」バリアントも含まれ得る。スプライスバリアントは、基準分子に対して著しい同一性を有するが、一般的には、ｍＲＮＡのプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングのために、ポリヌクレオチドのより多い数又はより少ない数を有する。対応するポリペプチドは、付加的な機能的ドメイン又はドメインの不存在を有し得る。種バリアントは、種によって変動するポリヌクレオチド配列である。得られたポリペプチドは、一般的には、互いに対して著しいアミノ酸同一性を有する。多型バリアントは、ある種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が変動することである。

「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を表すものとする。有用なベクターの１つの種類は、エピソーム、すなわち、染色体外複製を行うことができる核酸である。有用なベクターは、当該ベクターに連結されている核酸の自律的複製及び／又は発現を行うことができるベクターである。本明細書において、ベクターが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能なベクターは、「発現ベクター」と称される。一般的に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、「プラスミド」（それらのベクター形態において、染色体に結合されていない環状二本鎖ＤＮＡループの総称である。）形態である。本明細書において、プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用される。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たし、その後に本分野で公知となる発現ベクターのこのような他の形態を含むものとする。

組み合わせ療法
ＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせの投与は、増強された安全性及び服用遵守を患者に付与しながら、単独で投与された何れかのアンタゴニスに比べて、血管新生疾患を治療するためのより大きな治療的利点を与える。本発明によれば、第一の汎ＶＥＧＦＡアンタゴニスト及び第二の選択的ＶＥＧＦアンタゴニスト（ＶＥＧＦ_１６５に対して特異的なアンタゴニストなど）を投与することを含む、血管新生疾患を治療するための組み合わせ療法が開示される。２つのＶＥＧＦ阻害剤は、一緒に又は個別に投与され得る。特定の実施形態において、第一の汎ＶＥＧＦアンタゴニストは、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ^ＴＭ（ラニビズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＵＳＡ）又はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＵＳＡ）などの抗体又はその断片であり、第二の選択的ＶＥＧＦアンタゴニストは、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム、（ＯＳＩ）Ｅｙｅｔｅｃｈ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）などのアプタマーである。

従って、本発明は、組み合わせ療法を用いて、血管新生疾患を抑制するための方法及び組成物を特徴とする。この組み合わせ法は、特に、視神経円板新血管新生、光彩新血管新生、網膜新血管新生、脈絡膜新血管新生、角膜新血管新生、硝子体新血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、血管網膜症、網膜変性、黄斑変性、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患及び増殖性硝子体網膜症など（但し、これらに限定されない。）、眼の新血管新生の発達を特徴とする眼の疾病及び疾患のあらゆる数を治療するのに特に有用である。

加齢性黄斑変性を治療することに向けられた一実施形態において、浮腫の存在、血液及び血管新生組織など、新血管加齢性黄斑変性の特徴が存在する場合に、第一の非選択的ＶＥＧＦ阻害剤が投与される。これらの特徴は、検眼鏡、フルオレセイン血管造影、光コヒーレンス断層映像法又は他のこのような装置など、本分野で一般的な診断ツールを用いて観察され得る。第二の選択的なＶＥＧＦ阻害剤は、長期的療法の一環として、好ましい応答を保持するために、疾病が応答した場合に投与される。応答は、先述されている解剖学的特徴又は患者の視覚的機能の変化など、血管新生ＡＭＤの徴候又は症候の何れかの減少として定義され得る。

本発明の抗ＶＥＧＦ組み合わせ療法は、単独で、又は別の療法と組み合わせて実施することができ、自宅、医師の職場、診療所、病院の外来部門又は病院で付与され得る。医師が治療の効果を詳しく観察し、必要とされる何らかの調整を加えることができるように、治療は、一般的には、医師の職場で開始される。組み合わせ療法の期間は、治療されている血管新生疾患の種類、患者の年齢及び症状、患者の疾病の段階及び種類並びに治療に対する患者の応答の仕方に依存する。さらに、血管新生疾患を発症するより大きなリスクを有する者（例えば、糖尿病患者）は、症候の開始の阻害又は遅延のための治療を受け得る。

ＶＥＧＦアンタゴニスト標的
ＶＥＧＦは、内皮細胞を選択的に刺激して増殖させ、遊走させ、マトリックス分解酵素を産生させる、ジスルフィド連結された分泌型ホモ二量体であり（Ｃｏｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：１３２３−１３２７）；Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ｈｅｎｚｅｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：８５１−８５８）；Ｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１：９０２−９０６；Ｕｎｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５３：５５７−５６２）、これらは全て、新しい血管の形成のために必要とされるプロセスである。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ遺伝子の選択的スプライシングの結果として、主に、４つの形態で存在する（ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ− １６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６）（Ｈｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５：１８０６−１８１４：Ｔｉｓｃｈｅｒｅｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１９４７−１１９５４）。２つのより小さな形態は拡散性であるのに対して、より大きな２つの形態は、ヘパリンに対する親和性が高いので、主として、細胞膜に局在化されたままとなる。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンに結合し、最も豊富に存在する形態である。ヘパリンに結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、ＶＥＧＦ受容体に対してより低い親和性を有するとともに（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５５１９−５５２３）、より低い有糸分裂能力を有するようである（Ｋｅｙｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７８８− ７７９５）。ＶＥＧＦの生物学的効果は、その発現が内皮細胞期限の細胞に著しく限定されている２つのチロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ）によって媒介される（ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９９１ ；Ｍｉｌｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：８３５−８４６；Ｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：５１９−５２４）。両機能的受容体の発現は高親和性結合のために必要とされるのに対して、内皮細胞における化学走性及び有糸分裂シグナル伝達は、主にＫＤＲ受容体を通じて起こるようである（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５６４６−２５６５４；Ｓｅｅｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：１３５−１４７；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔａｌ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９８８− ２６９９５）。ＶＥＧＦ遺伝子に対する単一の対立遺伝子（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４４２）又はＦｌｔ−１（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６６−７０）若しくはＦｌｋ遺伝子（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６２−６６）の両対立遺伝子を欠如するマウスにおいて、最近、血管の発達に対するＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体の重要性が示された。各事例において、血管の形成の際立った異常が観察され、胚の致死をもたらした。

組織低酸素症によって誘導された補償的血管新生は、現在、ＶＥＧＦによって媒介されることが知られている（Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４６−２７５３）；Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３−８４５）。ヒトでの研究は、ＶＥＧＦの高濃度が血管新生性の網膜疾患において硝子体中に存在するが、不活性な病状又は非新血管新生病状では存在しないことを示した。実験的黄斑下手術後に切り出されたヒト脈絡膜組織も、高いＶＥＧＦレベルを示した。

内皮細胞特異的な唯一の公知の有糸分裂促進物質である他、ＶＥＧＦは、高分子に対する血管の透過性の一過的な増加を誘導する能力において、血管新生性増殖因子の中で特有である（このため、その最初の名称及び別名は、血管透過性因子、ＶＰＦである。）（Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ，（１９７９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：１６６−１７４；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３−９８５；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：５６２９−５６３２）。増加した血管透過性及びその結果生じる、血管外空間中への血漿タンパク質の堆積は、内皮細胞が遊走するための仮設マトリックスを提供するによって、新たな血管の形成を補助する（Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。実際、過剰透過性は、腫瘍に伴う新たな血管を含む新しい血管の特徴的な側面である。

ＶＥＧＦアンタゴニスト
総論
本発明は、新血管新生疾患に対する組み合わせ療法において一緒に使用するためのＶＥＧＦのアンタゴニスト（すなわち、阻害剤）を提供する。本分野において、特異的なＶＥＧＦアンタゴニストが公知であり、以下の部で簡潔に記載されている。現在当業者に利用可能であり、又は利用可能となったさらに別のＶＥＧＦアンタゴニストには、以下に、さらに記載されているセクションなど、本明細書の教示及び指針と組み合わされた、本分野で一般的な手技を用いて同定及び作製され得る抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴマー、リボザイム及びＲＮＡｉ組成物が含まれる。

ＶＥＧＦアンタゴニスト
ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）の阻害は、様々な様式で達成される。例えば、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ分子及びＶＥＧＦ抗体などの核酸分子を含む、ＶＥＧＦの活性又は産生を阻害する様々なＶＥＧＦアンタゴニストが利用可能であり、本発明の方法において使用することが可能である。典型的なＶＥＧＦアンタゴニストには、以下に記載されているものなど、ＶＥＧＦの核酸リガンド又はアプタマーが含まれる。ＶＥＧＦ−Ａに対して特に有用なアンタゴニストは、Ｍａｃｕｇｅｎ（以前には、ＥＹＥ００１又はＮＸ１８３８と呼ばれていた。）であり、これは、主な可溶性ヒトＶＥＧＦイソフォームに、高い特異的な親和性で結合する、修飾され、ＰＥＧ化されたアプタマーである（米国特許番号６，０１１，０２０；６，０５１，６９８；及び６，１４７，２０４参照）。アプタマーは、ＶＥＧＦに対して誘導された高親和性抗体と類似の様式で、ＶＥＧＦに結合し、不活化する。あるいは、ＶＥＧＦアンタゴニストは、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片であり得る。従って、ＶＥＧＦ分子は、受容体へのＶＥＧＦ分子の結合を阻害することによって、不活性にされる。さらに、核酸レベルでＶＥＧＦ発現又はＲＮＡ安定性を阻害するアンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＲＮＡｉ分子などの核酸分子は、本発明の方法及び組成物における有用なアンタゴニストである。他のＶＥＧＦアンタゴニストには、ペプチド、タンパク質、環状ペプチド及び小有機化合物が含まれる。例えば、シグナル伝達活性を伴わずに、ＶＥＧＦ受容体に結合するＶＥＧＦの可溶性末端切断形態も、アンタゴニストとして機能する。さらに、ＶＥＧＦのシグナル伝達活性は、例えば、以下でさらに記載されているように、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性の小分子阻害剤など多数のアンタゴニストを使用することによって、その下流のシグナル伝達を破壊することによって阻害され得る。

化合物又は因子がＶＥＧＦアンタゴニストとして機能する能力は、本分野で周知の標準的な方法のあらゆる数に従って決定され得る。例えば、ＶＥＧＦの生物学的活性の１つは、血管内皮細胞上の受容体への特異的結合を通じて、血管透過性を増加させることである。相互作用は、緊密な内皮細胞の結合の緩和をもたらし、血管の液体のその後の漏出を伴う。ＶＥＧＦによって誘導された血管の漏出は、ＶＥＧＦの皮内注射の結果、モルモットの脈管構造からエバンスブルー色素が漏出することを追跡することによって、インビボで測定することが可能である（Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ／Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｈｖｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｖ． ａｎｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ；及び（１９９５）Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４６：１０２９）。同様に、アンタゴニストが、ＶＥＧＦのこの生物活性を遮断するための能力を測定するために、本アッセイを使用することが可能である。

血管透過性アッセイの１つの有用な例では、ＶＥＧＦ_１６５（２０から３０ｎＭ）が、ＥＹＥ００１（３０ｎＭから１μＭ）又は候補ＶＥＧＦアンタゴニストとともに、生体外で予め混合され、続いて、モルモットの背側上の剃毛された皮膚中への皮内注射によって投与される。注射から３０分後、注射部位周囲のエバンスブルー色素漏出は、コンピュータ化された形態計測分析系の使用によって、標準的な方法に従って定量化される。ＶＥＧＦによって誘発された、脈管構造からの指標色素の漏出を阻害する化合物は、本発明の方法及び組成物において有用なアンタゴニストと考えられる。

化合物がＶＥＧＦアンタゴニストであるかどうかを決定するための別のアッセイは、いわゆる角膜血管新生アッセイである。このアッセイでは、正常な無血管の角膜中への血管増殖を誘導するために、ラットの角膜実質中に、ＶＥＧＦ_１６５（３ｐｍｏｌ）を含有するメタクリラートポリマーペレットが移植される。次いで、５日間、１日１回又は２回、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で、候補ＶＥＧＦアンタゴニストがラットに静脈内投与される。処理期間の終了時に、各角膜の全てを光学顕微鏡で撮影する。次いで、光学顕微鏡の標準化された形態計測分析によって、新たな血管が角膜組織中に発達する程度及び候補化合物によるそれらの阻害が定量化される。リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）での処理と比較したときに、角膜中のＶＥＧＦ依存性血管新生を阻害する化合物は、本発明の方法及び組成物において有用なアンタゴニストと考えられる。

候補ＶＥＧＦアンタゴニストは、未成熟の網膜症のマウスモデルを用いても同定される。１つの有用な例では、それぞれ、９、８、８、７及び７匹のマウスの同腹仔が部屋の空気中に放置され、又は高酸素濃度とされ、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）又は候補ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ／日）で、腹腔内処理される。次いで、顕微鏡による同定並びに処理されたマウス及び対照マウスの全てから得た各眼の２０個の組織学的切片中に存在する新血管の芽を計数することによって、アッセイの終点（網膜の内部境界膜を通じた、硝子体液内への新しい毛細血管の成長）が評価される。処理されていない対照に比べて、処理されたマウスで網膜の新脈管構造が減少していれば、有用なＶＥＧＦアンタゴニストを同定したと考えられる。

さらに別の典型的なスクリーニングアッセイでは、候補ＶＥＧＦアンタゴニストは、インビボヒト腫瘍異種移植アッセイを用いて同定される。このスクリーニングアッセイでは、候補ＶＥＧＦアンタゴニストのインビボ効力は、ヌードマウス中に移植されたヒト腫瘍異種移植片（Ａ６７３横紋筋肉腫及びウィルムス腫瘍）中で検査される。次いで、マウスは、候補ＶＥＧＦアンタゴニストで処理される（例えば、１日１回腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇ投与された後、確立された腫瘍が発達する（２００ｍｇ）。）。対照群は、対照因子で処理される。対照と比べて、Ａ６７３横紋筋肉腫の腫瘍増殖及びウィルムス腫瘍を阻害するものとして同定された候補化合物は、本発明の方法及び組成物において有用なアンタゴニストと考えられる。

ＶＥＧＦアンタゴニスト活性に対するアッセイのさらなる方法が本分野において公知であり、以下でさらに詳しく記載されている。

本発明は、さらに、本分野で公知のＶＥＧＦアンタゴニスト並びに以下で裏付けられているＶＥＧＦアンタゴニスト及び作製のための通常の技術範囲に属する全ての均等物を含む。例えば、例えば、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏｓ．６，５２４，５８３、６，４５１，７６４（ＶＲＰ抗体）、６，４４８，０７７、６，４１６，７５８、６，４０３，０８８（ＶＥＧＦ−Ｃに対する）、６，３８３，４８４（ＶＥＧＦ−Ｄに対する）、６，３４２，２２１（抗ＶＥＧＦ抗体）、６，３４２，２１９、６，３３１，３０１（ＶＥＧＦ−Ｂ抗体）及び５，７３０，９７７及びＰＣＴ公報ＷＯ９４／１０２０２、ＷＯ９６／３００４６、ＷＯ９７／４４４５３、ＷＯ９８／４５３３１及びＷＯ００／３７５０２に記載されているものなど（その内容全体が、参照により組み込まれる。）、ＶＥＧＦに対して誘導された阻害的抗体が本分野で公知である。

例えば、米国特許番号５，８４０，３０１、５，８７４，５４２、５，９５５，３１１、６，３６５，１５７及びＰＣＴ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ０４／００３２１１（その内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているものなど、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体も本分野で公知である。

例えば、米国特許番号６，５１４，９７１、６，４４８，２７７、６，４１４，１４８、６，３６２，３３６、６，２９１，４５５、６，２８４，７５１、６，１７７，４０１、６０７１，９２１及び６００１，８８５（ＶＥＧＦ発現のレチノイド阻害剤）に記載されているものなど（それぞれの内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）、例えば、ＶＥＧＦＲに伴うチロシンキナーゼ活性を阻害することによってＶＥＧＦの作用を遮断する小分子が本分野において公知である。

例えば、米国特許番号６，５７６，６０８、６，５５９，１２６、６，５４１，００８、６，５１５，１０５、６，３８３，４８６（ＶＥＧＦ囮受容体）、６，３７５，９２９（ＶＥＧＦ囮受容体）、６，３６１，９４６（ＶＥＦＧペプチド類縁体阻害剤）、６，３４８，３３３（ＶＥＧＦ囮受容体）、６，５５９，１２６（ＶＥＧＦを結合し、ＶＥＧＦＲへの結合を遮断するポリペプチド）、６，１００，０７１（ＶＥＧＦ囮受容体）及び５，９５２，１９９（各々の内容全体が、参照により組み込まれる。）など、ＶＥＧＦの作用を遮断するタンパク及びポリペプチドが本分野において公知である。

ＷＯ２００５／０００８９５（参照により、全体が本明細書に組み込まれる。）に開示されているものなど、ＶＥＧＦを結合することができる核酸分子及び多量体タンパク質（ＶＥＧＦトラップ）も、本発明に係る使用に対して適切であり得る。一実施形態において、このようなＶＥＧＦトラップは、本発明の第一の汎ＶＥＧＦアンタゴニストとして使用される。

例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７０９１０（その内容全体が、参照により組み込まれる。）に開示されているような、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲ遺伝子発現及び／又は活性に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が本分野において公知である。

例えば、米国特許番号５，６１１，１３５、５，８１４，６２０、６，３９９，５８６、６，４１０，３２２及び６，２９１，６６７（各々の内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているものなど、ＶＥＧＦの阻害用アンチセンスオリゴヌクレオチドが本分野において公知である。

例えば、例えば米国特許番号６，７６２，２９０、６，４２６，３３５、６，１６８，７７８、６，０５１，６９８及び５，８５９，２２８（各々の内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているものなど、ＶＥＧＦの阻害用アプタマー（核酸リガンドとしても知られる。）が本分野において公知である。

抗体アンタゴニスト
本発明は、ＶＥＧＦ及びそれらの同族受容体ＶＥＧＦＲに対して誘導されたアンタゴニスト抗体を含む。本発明の抗体アンタゴニストは、リガンドがその同族受容体と結合するのを遮断する。従って、本発明のＶＥＧＦアンタゴニスト抗体には、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ標的に対して誘導された抗体が含まれる。

本発明のアンタゴニスト抗体には、モノクローナル阻害的抗体が含まれる。モノクローナル抗体又はその断片には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ若しくはそれらのサブクラス（ＩｇＧサブクラスなど）又はそれらの混合物など、全ての免疫グロブリンクラスが包含される。ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_２ａ、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_Ｍなど、ＩｇＧ及びそのサブクラスが有用である。ＩｇＧサブクラスＩｇＧ_１／κ及びＩｇＧ２_ｂ／κが有用な実施形態として含まれる。挙げることができる断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２断片又は一本鎖断片など、抗体に対応し、軽鎖及び重鎖によって形成される結合部位を有する抗体の一部など、哺乳動物のＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体）に対して高い結合及び中和活性を示す１つ又は２つの抗原相補的結合部位を有する、末端切断された又は修飾された全ての抗体断片である。Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２などの末端切断された二本鎖断片が特に有用である。これらの断片は、例えば、パパイン又はペプシンなどの酵素を用いて抗体のＦｃ部分を除去することによる酵素的手段によって、化学的酸化によって、又は抗体遺伝子の遺伝学的操作によって取得することが可能である。遺伝的に操作された、末端切断されていない断片を使用することも可能であり、有利である。抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片は、単独で又は混合物中で使用することが可能である。

新規抗体、抗体断片、その混合物又は誘導体は、１×１０^−７Ｍから１×１０^−１２Ｍ、又は１×１０^−８Ｍから１×１０^−１１Ｍ、又は１×１０^−９Ｍから５×１０^−１０の範囲で、ＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体）に対する結合親和性を有利に有する。

遺伝学的操作のための抗体遺伝子は、例えば、当業者に公知の様式で、ハイブリドーマ細胞から単離することが可能である。この目的のために、抗体産生細胞が培養され、細胞の光学密度が十分であれば、チオシアン酸グアニジニウムで細胞を溶解し、酢酸ナトリウムで酸性化し、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、エタノールで洗浄することによって、公知の様式で、細胞からｍＲＮＡを単離する。次いで、逆転写酵素を用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。合成されたｃＤＮＡは、例えば、部位指定突然変異誘発、適切な動物、真菌、細菌又はウイルスベクター中への挿入、反転、欠失又は塩基交換の導入によって、直接的に又は遺伝学的操作後に挿入し、適切な宿主生物中で発現させることが可能である。有用な細菌又は酵母ベクターは、イー・コリなどの細菌中で、又はサッカロミセス・セレビシアエなどの酵母中で遺伝子をクローニング及び発現するためのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＡＣＹＣ１８４、λ又は酵母μベクターである。

本発明は、さらに、ＶＥＧＦ抗体を合成する細胞に関する。これらには、上記のように形質転換した後の動物、真菌、細菌細胞又は酵母細胞が含まれる。これらは、有利には、ハイブリドーマ細胞又はトリオーマ細胞であり、典型的には、ハイブリドーマ細胞である。これらのハイブリドーマ細胞は、例えば、ＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体）で免疫化された動物から公知の様式で、及びそれらの抗体産生Ｂ細胞の単離、ＶＥＧＦ結合抗体に対してこれらの細胞を選択し、続いて、ヒト又は動物、例えば、マウス骨髄腫細胞、ヒトリンパ芽球様細胞又はヘテロハイブリドーマ細胞（例えば、Ｋｅｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９６参照）にこれらの細胞を融合し、又は不死化された細胞株を産生するために、これらの細胞を適切なウイルスに感染させることによって、作製することが可能である。融合によって産生されたハイブリドーマ細胞株は有用であり、マウスハイブリドーマ細胞株は特に有用である。本発明のハイブリドーマ細胞株は、ＩｇＧ型の有用な抗体を分泌する。本発明のｍＡｂ抗体の結合は、高い親和性で結合し、ＶＥＧＦの生物学的（例えば、血管新生）活性を低下又は中和する。

さらに、本発明は、医薬としてのそれらの使用に関連する１つ又はそれ以上の他の特性（例えば、血清安定性又は産生の効率）を変化させながら、それらのＶＥＧＦ阻害活性を保持するこれらの抗ＶＥＧＦ抗体の誘導体を含む。このようなＶＥＧＦ抗体誘導体の例には、ペプチド、抗体の抗原結合領域から誘導されたペプチド模倣体、及びポリエチレングリコール、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどの合成ポリマー、又はセルロース、セファロース若しくはアガロースなどの天然ポリマーなどの固体若しくは液体に結合された抗体、断片若しくはペプチド、又は酵素との連結体、毒素又は^３Ｈ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^５１Ｃｒ、^３６Ｃｌ、^５７Ｃｏ、^５５Ｆｅ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^９９ｍＴｃ、^７５Ｓｅなどの放射性若しくは非放射性マーカー、又はローダミン、フルオレセイン、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレスカミン、金属キレート物質、アビジン、ストレプトアビジン若しくはビオチンなどの蛍光／化学発光標識に共有結合された抗体、断片又はペプチドが含まれる。

新規抗体、抗体断片、その混合物及び誘導体は、直接使用することが可能であり、乾燥（例えば、凍結乾燥）後に、上記担体への付着後に、又は医薬調製物を作製するための他の医薬活性及び補助物質との製剤化後に使用することが可能である。活性及び補助物質の例として挙げることができるのは、他の抗体、抗生物質全般又はスルホンアミドなどの殺微生物作用又は微生物鎮静作用を有する抗微生物活性物質、抗癌剤、水、緩衝液、生理的食塩水、アルコール、脂肪、蝋、非経口製品に対して慣用されている不活性ビヒクル又はその他の物質（アミノ酸など）、濃縮剤又は糖である。これらの医薬調製物は、疾病を抑制するために使用され、ＡＭＤ及び糖尿病性網膜症などの眼の血管新生疾患及び疾病を抑制するのに有用である。

新規抗体、抗体断片、その混合物又は誘導体は、直接に、又は上述のような固体若しくは液体担体、酵素、毒素、放射性若しくは非放射性標識若しくは蛍光／化学発光標識に結合した後に、治療又は診断において使用することが可能である。

本発明のヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体は、本分野で公知のあらゆる手段によって取得され得る。例えば、哺乳動物は、ヒトＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体）で免疫化される。精製されたヒトＶＥＧＦが、（例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｏｒｗｏｏｄ， ＭＡ及び他の業者から）市販されている。あるいは、ヒトＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体）は、ヒト胎盤組織から容易に精製され得る。抗ヒトＶＥＧＦ抗体を産生するために使用される哺乳動物は限定されず、霊長類、げっ歯類（マウス、ラット又はウサギなど）、ウシ、ヒツジ、ヤギ又はイヌであり得る。

次に、免疫された動物から脾細胞などの抗体産生細胞を取り出し、骨髄腫細胞と融合させる。骨髄腫細胞は、本分野において周知である（例えば、ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＮＳ−０、ＮＳ−１又はＰ３Ｕ１細胞を使用し得る。）。細胞融合操作は、本分野で公知のあらゆる慣用方法によって実施され得る。

細胞融合操作に供された後、細胞は、次いで、ハイブリドーマを選択するためにＨＡＴ選択培地中で培養される。次いで、抗ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマがスクリーニングされる。このスクリーニングは、例えば、ヒトＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体）が固定化されたウェルに、産生されたモノクローナル抗体が結合されているサンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などによって実施され得る。この事例では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素で標識されている、免疫化された動物の免疫グロブリンに対して特異的な抗体を、二次抗体として使用し得る。標識は、標識酵素をその基質と反応させ、生成された色を測定することによって検出され得る。基質として、３，３−ジアミノベンジジン、２，２−ジアミノビス−ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール、４−アミノアンチピリン、ｏ−フェニレンジアミンなどが作製され得る。

上記操作によって、抗ヒトＶＥＧＦ抗体を産生する抗体を選択することが可能である。選択されたハイブリドーマは、次いで、慣用の限界希釈法又は軟寒天法によってクローニングされる。所望であれば、クローニングされたハイブリドーマは、血清含有培地若しくは無血清培地を用いて大規模に培養することができ、又はマウスの腹腔内に接種され、腹水から回収することができ、これによって、クローニングされたハイブリドーマが大量に取得され得る。

次いで、さらなる分析及び操作のために、対応するリガンド／受容体対（例えば、細胞をベースとしたＶＥＧＦアッセイ系（上記参照））の結合及び活性化を抑制する能力を有するものが、選択された抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体から選択される。抗体が受容体／リガンド結合及び／又は活性化を遮断すれば、検査されたモノクローナル抗体は、ヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ活性を低下又は中和する能力を有することを意味する。すなわち、モノクローナル抗体は、ヒトＶＥＧＦ（又はそれらの同族受容体）の重要な結合部位を特異的に認識し、及び／又は妨害する。

さらに、本明細書において、モノクローナル抗体には、抗ＶＥＧＦ抗体の可変（超可変を含む。）ドメインを定常ドメインと（例えば、「ヒト化」抗体）、若しくは軽鎖を重鎖と、若しくはある種から得られた鎖を別の種から得られた鎖とスプライシングすることによって作製されたハイブリッド及び組み換え抗体、又は異種タンパク質との融合物（起源となる種又は免疫グロブリンクラス若しくはサブクラスの指定に関わらない。）及び（それらが、所望の生物学的活性を示す限り）抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２及びＦｖ）が含まれる。［例えば、米国特許番号４，８１６，５６７及びＭａｇｅ ＆ Ｌａｍｏｙｉ， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）参照］。

従って、「モノクローナル抗体」という用語は、得られた抗体の特性が、抗体の実質的に均一な集団に由来することを示し、何らかの特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈すべきでない。例えば、本発明において使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製することができ、又は組み換えＤＮＡ法（米国特許番号４，８１６，５６７）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、「ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）」に記載されている技術を用いて作製されたファージライブラリーからも単離され得る。

非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２又は抗体の他の抗原結合配列など）である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、マウス、ラット又はウサギなどのヒト以外の種のＣＤＲに由来する、所望の特異性、親和性及び能力を有する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、輸入されたＣＤＲ又はＦＲ配列中にも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＦＲ残基の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものも含む。

ヒト以外の抗体をヒト化するための技術は、本分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の取得源に由来する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基がその中に導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基と称され、典型的には、「輸入可変ドメイン」から採取される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１ ：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）に従い、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に置換することによって実施することが可能である。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり、ここでは、完全な状態の可変ドメインより大幅に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及び、おそらくは幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。

ヒト化抗体を作製する際に使用すべきヒト可変ドメインの選択（軽及び重の両方）は、抗原性を低下させるために極めて重要である。いわゆる「最適適合」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、次いで、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。幾つかの異なるヒト化抗体に対して、同じフレームワークを使用し得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）,８９：４２８５；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ．１５１：２６２３）。

さらに、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化することが重要である。この目標を達するために、１つの有用な方法に従い、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析の方法によって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列が採り得る三次元立体構造を図式及び表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これら表示を検査することによって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析を可能とする。このようにして、所望される抗体特性（標的抗原に対して増加された親和性など）が達成されるように、コンセンサス及び輸入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることが可能である。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接、及び最も実質的に関与する。

ＶＥＧＦに対して誘導されたヒトモノクローナル抗体も、本発明に含まれる。このような抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することが可能である。ヒトモノクローナル抗体作製用のヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、例えば、「Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３， ３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ， ｅｔ ａｌ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５」によって記載されている。

現在では、免疫化されたときに、内在性免疫グロブリン産生の不存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウス中の抗体重鎖連結領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合欠失は、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異体マウス中にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入することにより、抗原曝露時にヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）， ９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５−２５８；及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．， ７：３３を参照されたい。）。

あるいは、免疫化されていないドナーから得られる免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体断片をインビトロで作製するために、ファージディスプレイ技術（ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３）を使用することが可能である（概説として、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３：５６４−５７１を参照されたい。）。ファージディスプレイのために、Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの採取源を使用することが可能である。例えば、「Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８）は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することが可能であり、Ｍａｒｋｓらによって記載された技術（（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７， ｏｒ Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４）に実質的に従って、抗原（自己抗原を含む。）の多様なアレイに対する抗体を単離することが可能である。

天然の免疫応答において、抗体遺伝子は高い速度で変異を蓄積する（体細胞高頻度変異）。導入された変化の幾つかは、より高い親和性を付与し、高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、その後の抗原曝露の間、優先的に複製及び分化される。この天然の過程は、「チェーンシャフリング」として知られる技術（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３参照）を用いることによって模倣することが可能である。この方法において、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫化されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアントのレパートリー（レパートリー）と順次交換することによって改善することが可能である。この技術は、ｎＭ域の親和性を有する抗体及び抗体断片の作製を可能とする。極めて巨大なファージ抗体レパートリーを作製するための戦略が、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６）によって記載されている。

げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導するために遺伝子シャッフリングを使用することも可能であり、ヒト抗体は、初発げっ歯類抗体と類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法に従って、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖又は軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと交換され、げっ歯類−ヒトキメラを作出する。抗原に対する選択は、機能的な抗原結合部位を回復することが可能なヒト可変の単離をもたらす。すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配（インプリント）する。残存するげっ歯類Ｖドメインを置換するために本過程が反復される場合には、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された、ＰＣＴＷＯ９３／０６２１３号を参照。）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を持たない完全なヒト抗体を提供する。

アプタマーアンタゴニスト
本発明は、ＶＥＧＦ（又はその同族受容体）に対して誘導されたアンタゴニストを提供する。核酸リガンドとしても知られるアプタマーは、予め選択された標的に結合し、一般的には、予め選択された標的を拮抗する（すなわち、阻害する）、天然には存在しない核酸である。

アプタマーは、オリゴマー又はオリゴヌクレオチドを作製するあらゆる公知の方法によって作製することが可能である。多くの合成方法が当分野において公知である。例えば、３’−エキソヌクレアーゼによる最終的な分解を防ぐために、逆転されたチミジン残基（Ｏｒｔｉｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２：１２９−１４６（１９９２））又は３’末端に２つのホスホロチオアート結合などの適切な３’末端を有し、残りはプリンリボヌクレオチドを含有する２’−Ｏ−アリル修飾されたオリゴマーは、あらゆる市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上での固相β−シアノエチルホスホルアミダイト化学（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４５３９−４５５７（１９８４））によって合成することが可能である。１つの方法は、リボヌクレオチドに対する２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護戦略（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５−７８５４（１９８７））であり、必要とされる全ての３’−Ｏ−ホスホルアミダイトが市販されている。さらに、その有利な特性故に、支持体材料として、アミノメチルポリスチレンを使用し得る（ＭｃＣｏｌｌｕｍ ａｎｄ Ａｎｄｒｕｓ（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３２：４０６９−４０７２）。市販のフルオレセインホスホルアミダイトを用いることによる合成の間、基質ＲＮＡの５’末端に、フルオレセインを付加することが可能である。一般に、アプタマーオリゴマーは、標準的なＲＮＡサイクルを用いて合成することが可能である。集合の完了時に、密封されたバイアル中の濃アンモニア水／エタノール（３：１ｖ／ｖ）で、５５℃で８時間処理することによって、塩基に対して脆弱な全ての保護基が除去される。エタノールは、エタノールがない場合に、脱保護の塩基性条件下で、生じたリボヌクレオチド部分に、かなりの鎖切断をもたらす２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の未成熟な除去を抑制する（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５−７８５４）。凍結乾燥後、ＴＢＤＭＳ保護されたオリゴマーは、中性条件下で、シリル保護基の迅速且つ効率的な除去を与えるために、６０℃で２時間、トリエチルアミントリヒドロフルオリド／トリエチルアミン／Ｎ−メチルピロリジノンの混合物で処理される（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４参照）。次いで、Ｃａｔｈａｌａ及びＢｒｕｎｅｉの手法（（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２０１）に従って、完全に脱保護されたオリゴマーをブタノールで完全に沈殿させることが可能である。精製は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、又はイオン交換ＨＰＬＣ（Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．１４：２５５−２７３）と逆相ＨＰＬＣの組み合わせの何れかによって実施することが可能である。細胞中で使用する場合、合成されたオリゴマーは、アセトン中の過塩素酸ナトリウムでの沈殿によって、それらのナトリウム塩へと転化される。次いで、市販の小さな使い捨てゲルろ過カラムを用いて、残りの塩の微量を除去し得る。最終工程として、単離されたオリゴマーの正しさは、マトリックス支援レーザー脱離質量分析（Ｐｉｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３１９１−３１９６）によって、及びヌクレオシド塩基組成分析によってチェックし得る。

酵素的操作のためにヌクレオチドサブユニットを利用可能な場合には、開示されたアプタマーは、酵素的方法を通じて作製することも可能である。例えば、ＲＮＡ分子は、インビトロＲＮＡポリメラーゼＴ７反応を通じて作製することが可能である。ＲＮＡ分子は、Ｔ７を発現している細菌又は細胞株の系統によって作製し、次いで、その後、これらの細胞から単離することも可能である。以下に論述されているように、開示されているアプタマーは、ベクター及びプロモーターを用いて、直接、細胞中で発現させることも可能である。

アプタマーは、本発明の他の核酸分子と同様、化学的に修飾されたヌクレオチドをさらに含有し得る。核酸の診断的使用又は治療的使用において対処すべき１つの問題は、所望の効果が現れる前に、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼなどの細胞内及び細胞外酵素によって、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが体液中で急速に分解される可能性があるということである。核酸リガンドのインビボでの安定性を増加させるために、又は核酸リガンドの送達を増強若しくは媒介するために、核酸リガンドのある種の化学的修飾を施すことが可能である（例えば、“Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題されたＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．５，６６０，９８５（参照により、本明細書中に具体的に組み込まれる。）を参照されたい。）。

本発明において想定される核酸リガンドの修飾には、さらなる電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電的相互作用及び核酸リガンド塩基への、又は核酸リガンド全体への流動性を取り込む他の化学基を与えるものが含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオアート又はリン酸アルキル修飾、メチル化、イソ塩基であるイソシチジン及びイソグアニジンなどの一般的でない塩基対の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。修飾は、キャッピング又は糖部分での修飾など、３’及び５’修飾も含むことが可能である。本発明の幾つかの実施形態において、核酸リガンドは、ピリミジン残基の糖部分上で２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されているＲＮＡ分子である。

アプタマーの安定性は、このような修飾の導入によって、並びにＲＮＡのホスファート骨格に沿った修飾及び置換によって大幅に増加させることが可能である。さらに、分解を阻害し、及び望ましいヌクレオチド相互作用を増加させ、又は望ましくないヌクレオチド相互作用を減少させることができる様々な修飾を、ヌクレオ塩基自体に対して施すことが可能である。従って、アプタマーの配列が明らかとなったら、以下に記載されている合成手法によって、又は当業者に公知の手法によって、修飾又は置換を施すことが可能である。

他の修飾には、リボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）及びデオキシリボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）中に存在する標準的な塩基、糖及び／又はホスファート骨格化学構造の変形である修飾された塩基（又は修飾されたヌクレオシド若しくは修飾されたヌクレオチド）の取り込みが含まれる。この範囲に含まれるのは、例えば、Ｇｍ（２’−メトキシグアニル酸）、Ａｍ（２’−メトキシアデニル酸）、Ｃｆ（２’−フルオロシチジル酸）、Ｕｆ（２’−フルオロウリジル酸）、Ａｒ（リボアデニル酸）である。アプタマーは、シトシン又は５−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、３−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシトシン、５−ハロシトシン（例えば、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン及び５−ヨードシトシン）、５−プロピニルシトシン、６−アゾシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、Ｎ４、Ｎ４−エタノシトシン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、カルバゾールシチジン若しくはピリドインドールシチジンなどのあらゆるシトシン関連塩基も含み得る。さらに、アプタマーは、グアニン又は６−メチルグアニン、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、６−プロピルグアニン、８−ハログアニン（例えば、８−フルオログアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン及び８−ヨードグアニン）、８−アミノグアニン、８−スルフヒドリルグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニン若しくは３−デアザグアニンなどのグアニン関連塩基も含み得る。さらに、アプタマーは、アデニン又は６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、８−ハロアデニン（例えば、８−フルオロアデニン、８−ブロモアデニン、８−クロロアデニン及び８−ヨードアデニン）、８−アミノアデニン、８−スルフヒドリルアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、７−メチルアデニン、２−ハロアデニン（例えば、２−フルオロアデニン、２−ブロモアデニン、２−クロロアデニン及び２−ヨードアデニン）、２−アミノアデニン、８−アザアデニン、７−デアザアデニン若しくは３−デアザアデニンなどのあらゆるアデニン関連塩基を含み得る。ウラシル又は５−ハロウラシル（例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ｌ−メチルシュードウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾウラシル若しくは４−チオウラシルなどのあらゆるウラシル関連塩基も含まれる。

本分野において公知の他の修飾された塩基バリアントの例には、米国特許法施行規則§１．８２２（ｐ）（１）に列記されているもの、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−メトキシシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、ｂ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデンシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、ｂ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウリジン、キュエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジンＮ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンが含まれるが、これらに限定されるものではない。

米国特許番号３，６８７，８０８、３，６８７，８０８、４，８４５，２０５、５，１３０，３０２、５，１３４，０６６、５，１７５，２７３、５，３６７，０６６、５，４３２，２７２、５，４５７，１８７、５，４５９，２５５、５，４８４，９０８、５，５０２，１７７、５，５２５，７１１、５，５５２，５４０、５，５８７，４６９、５，５９４，１２１、５，５９６，０９１、５，６１４，６１７、５，６４５，９８５、５，８３０，６５３、５，７６３，５８８、６，００５，０９６及び５，６８１，９４１に記載されている修飾された核酸塩基も含まれる。本分野において公知の修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド糖骨格バリアントの例には、Ｆ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２、ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２、ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、Ｏ（Ｃ_１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ_２−１０アルケニル）、Ｏ（Ｃ_２−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ_１−１０アルキル）、Ｓ（Ｃ_２−１０アルケニル）、Ｓ（Ｃ_２−１０アルキニル）、ＮＨ（Ｃ_１−１０アルキル）、ＮＨ（Ｃ_２−１０アルケニル）、ＮＨ（Ｃ_２−１０アルキニル）及びＯ−アルキル−Ｏ−アルキルなどの、例えば、２’リボシル置換基を有するものが含まれるが、これらに限定されない。望ましい２’リボシル置換基には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２^’ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’−アリル（２’−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−置換基は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置であり得る。

本発明のアプタマーは、上述のものなどのヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類縁体又は両者の組み合わせから構成され得、又はオリゴヌクレオチド類縁体である。本発明のアプタマーは、オリゴマーがＶＥＧＦ（又はその同族受容体）を結合する機能に提供を与えない位置にヌクレオチド類縁体を含有し得る。

特定の標的分子への核酸リガンド結合の精緻化若しくは強化又はさらなるアプタマーの選択のために適合させ得る幾つかの技術が存在する。一般に「インビトロ遺伝学」と称される１つの技術（Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９２）ＴＩＢＳ．１９：８９を参照されたい。）は、ランダムな配列のプールから選択することによって、アプタマーアンタゴニストを単離することを含む。開示されたアプタマーがそこから単離され得る核酸分子のプールには、約２０から４０個のヌクレオチドの可変配列に隣接する非可変配列が含まれ得る。この方法は、指数関数的濃縮によるリガンドの選択的進化（ＳＥＬＥＸ；Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）という用語で呼ばれている。ＳＥＬＥＸ及び関連する方法によって本発明のアプタマーアンタゴニストを作製するための組成物及び方法は、本分野において公知であり、例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された米国特許番号５，４７５，０９６及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された米国特許番号５，２７０，１６３（これらの各々の全体が、参照により、本明細書中に具体的に組み込まれる。）中に教示されている。例えば、米国特許番号５，６６８，２６４、５，６９６，２４９、５，６７０，６３７、５，６７４，６８５、５，７２３，５９４、５，７５６，２９１、５，８１１，５３３、５，８１７，７８５、５，９５８，６９１、６，０１１，０２０、６，０５１，６９８、６，１４７，２０４、６，１６８，７７８、６，２０７，８１６、６，２２９，００２、６，４２６，３３５、６，５８２，９１８（これらの各内容は、参照により、本明細書中に具体的に組み込まれる。）には、ＳＥＬＥＸ法が一般的に記載されており、並びに、特にＶＥＧＦアプタマー及び製剤がさらに記載されている。

簡潔に述べると、ＳＥＬＥＸ法は、結合親和性及び選択性の実質的にあらゆる所望される基準を達成するために同じ一般的選択スキームを使用する、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択及び選択された標的への結合の段階的反復、分配及び増幅を含む。ＳＥＬＥＸ法は、典型的には、無作為化された配列のセグメントを含む核酸の混合物から開始し、混合物を、結合に適した条件下で標的と接触させる工程、結合していない核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分配する工程、核酸−標的複合体を解離する工程、リガンドが濃縮された核酸の混合物を生成させるために、核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅する工程、次いで、標的分子への高度に特異的な高親和性核酸リガンドを生成するために望まれる可能な限り多くのサイクルを通じて、結合、分配、解離及び増幅の工程を反復することを含む。

多数の具体的な目的を達成するために、基本的なＳＥＬＥＸ法が改変されてきた。例えば、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」と題された 米国特許番号５，７０７，７９６は、屈曲ＤＮＡなど、特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するために、ゲル電気泳動と組み合わせて、ＳＥＬＥＸ法を使用することを記載している。「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」と題された米国特許番号５，７６３，１７７は、標的分子に結合し、及び／又は光架橋し、及び／又は光不活化することができる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するための、ＳＥＬＥＸを基礎とする方法を記載している。「Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｔｈａｔ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ ａｎｄ Ｃａｆｆｅｉｎｅ」と題された米国特許番号５，５８０，７３７は、カウンター−ＳＥＬＥＸと名づけられた密接に関連する分子（非ペプチド性であり得る。）間を識別することが可能な高度に特異的な核酸リガンドを同定する方法を記載している。「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」と題された米国特許番号５，５６７，５８８は、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと低い親和性を有するオリゴヌクレオチド間の高度に効率的な分配を達成するＳＥＬＥＸをベースとした方法を記載している。

ＳＥＬＥＸ法は、改善されたインビボでの安定性又は改善された送達特性など、改善された特性をリガンドに対して付与する修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボース及び／又はホスファート及び／又は塩基位置での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ法によって同定された、修飾されたヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題された米国特許番号５，６６０，９８５に記載されており、本特許は、ピリミジンの５位及び２’位に、化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載している。上記米国特許番号５，５８０，７３７は、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ又はそれ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドを記載する。１９９４年６月２２日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｗｎ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ ２’ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｂｙ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ」と題された米国特許出願番号０８／２６４，０２９（現在、放棄されている。）は、様々な２’修飾されたピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載している。

ＳＥＬＥＸ法は、それぞれ「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＳＥＬＥＸ」と題された米国特許番号５，６３７，４５９及び「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｂｌｅｎｄｅｄ ＳＥＬＥＸ」と題された米国特許番号５，６８３，８６７に記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを包含する。これらの特許は、オリゴヌクレオチドの多岐にわたる形状及びその他の特性並びに効率的な増幅及び複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることを可能とする。

さらに、ＳＥＬＥＸ法は、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」と題された米国特許番号６，０１１，０２０（本明細書中に、その全体が、参照により、具体的に組み込まれる。）中に記載されているように、診断用又は治療法複合体中において、選択された核酸リガンドを、親油性化合物又は非免疫原性高分子量化合物と組み合わせることを含む。

アプタマーアンタゴニストは、コンピュータモデリング技術の使用を通じて、精緻化することも可能である。分子モデリング系の例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．））である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギーの最小化及び分子動力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング及び分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子相互の挙動の相互作用的構築、修飾、可視化及び分析を可能とする。これらのアプリケーションは、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の二次構造を定義及び表示するように適合させることが可能である。

次いで、ＶＥＧＦ細胞をベースとした増殖活性アッセイなど、目的のＶＥＧＦ機能に対するあらゆる適切なアッセイを用いて、これらの様々な修飾を有するアプタマーを機能について検査することが可能である。

修飾は、ＳＥＬＥＸプロセス前又は後の修飾であり得る。ＳＥＬＥＸプロセス前の修飾は、核酸リガンドのＳＥＬＥＸ標的に対する特異性及び改善されたインビボ安定性の両方を核酸リガンドに付与する。２’−ＯＨ核酸リガンドに対して施されるＳＥＬＥＸプロセス後の修飾は、核酸リガンドの結合能に対して悪影響を与えずに、改善されたインビボ安定性をもたらすことが可能である。

本発明のアプタマーを作製するために有用な他の修飾は、当業者に公知である。このような修飾は、ＳＥＬＥＸプロセスの後に（予め同定された修飾されていないリガンドの修飾）、又はＳＥＬＥＸプロセス中への取り込みによって施し得る。

アンチセンス、リボザイム及びＤＮＡ酵素アンタゴニスト
ＶＥＧＦに対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、それぞれ、これらのメッセンジャーＲＮＡからのタンパク質翻訳を阻害することによって、又は対応するＶＥＧＦｍＲＮの分解を標的化することによって、ＶＥＧＦの阻害を実施する。これらの上記ＶＥＧＦ標的化された核酸は、これらのＶＥＧＦリボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び合成のための有用な配列を提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの設計及び合成の方法は、本分野において公知である。さらなる指針が、本明細書に提供されている。

特異的且つ効果的なｍＲＮＡ標的化されたオリゴヌクレオチド（アンチセンスＯＤＮ）及びリボザイム及びアンチセンスを設計する上での１つの問題は、アンチセンス対合の接近可能な部位を標的ｍＲＮＡ（それ自体、部分的に自己対合された二次構造へと折り畳まれる。）内に同定するという問題である。ＲＮＡ対合の接近可能性を予測するためのコンピュータ補助されたアルゴリズムと分子スクリーニングの組み合わせは、多くのｍＲＮＡ標的に対して誘導された特異的且つ有効なリボザイム及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製を可能とする。実際に、アンチセンス又はリボザイム阻害剤への標的ＲＮＡ分子の接近性を決定するために、幾つかのアプローチが記載されてきた。１つのアプローチは、可能限り多くのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを適用するインビトロスクリーニングアッセイを使用する（Ｍｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：６６８−６７５；及びＭｉｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５：５３７−５４１を参照）。別のアプローチは、ＯＤＮのランダムライブラリーを使用する（Ｈｏ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：１９０１−１９０７；Ｂｉｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ，（１９９７）ＲＮＡ ３：４２９−４３７；及びＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６２６−６３８）。接近可能な部位は、ＲＮアーゼＨ切断によってモニターすることが可能である（Ｂｉｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ．，上記；及びＨｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５９−６３参照）。ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖のホスホジエステル骨格の加水分解的切断を触媒する。

別のアプローチでは、インビトロで合成されたＲＮＡ標的上の、ＲＮアーゼによって切断される接近可能な部位を同定するために、半ランダムな化学合成されたキメラＯＤＮのプールが使用される。次いで、標的分子中のこれらの部位を同定するために、プライマー伸長分析が使用される（Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。ＲＮＡ中のアンチセンス標的を設計するための別のアプローチは、コンピュータ補助されたＲＮＡ用の折り畳みモデルを基礎とする。効果的な切断をスクリーニングするためにランダムなリボザイムライブラリーを使用することに関して、幾つかの報告が公表されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＲＮＡ １：５９８−６０９；Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：５４０−５５１；及びＶａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：６４５９−６５０１参照）。

ＯＤＮ及びＲＮアーゼＨのランダム又は半ランダムなライブラリーを使用する他のインビトロアプローチは、コンピュータシミュレーションよりさらに有用であり得る（Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，上記）。しかしながら、最近の観察は、ポリヌクレオチドのアニーリング相互作用がＲＮＡ結合タンパク質によって影響を受けることを示唆しているので、インビトロで合成されたＲＮＡの使用は、インビボでのアンチセンスＯＤＮの接近性を予測しない（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６７：９９−１０２；Ｐｏｒｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：２１３−２２１；及びＢｅｒｔｒａｎｄ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：２９０４−２９１２参照）。米国特許番号６，５６２，５７０（その内容は、参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、インビボ条件を模倣する細胞抽出液の存在下で、ｍＲＮＡ内の接近可能部位を決定するための組成物及び方法を提供する。

簡潔に述べると、この方法は、内在性ＲＮＡ結合タンパク質を含有する細胞抽出物を含み、又は１つ若しくはそれ以上のＲＮＡ結合タンパク質の存在のために細胞抽出物を模倣する反応媒体中において、ハイブリド形成条件下で、固有のＲＮＡ又はインビトロ合成されたＲＮＡを、所定のアンチセンスＯＤＮ、リボザイム若しくはＤＮＡザイムとともに温置すること、又はランダム若しくは半ランダムＯＤＮ、リボザイム若しくはＤＮＡザイムライブラリーとともに温置することを含む。標的ＲＮＡ中の接近可能な部位に対して相補的である全てのアンチセンスＯＤＮ、リボザイム又はＤＮＡザイムが、その部位にハイブリド形成する。所定のＯＤＮ又はＯＤＮライブラリーが使用される場合には、ハイブリド形成が起こったＲＮＡを切断するために、ＲＮアーゼＨは、ハイブリド形成の最中に存在し、又はハイブリド形成後に添加される。リボザイム及びＤＮＡザイムは、ハイブリド形成が起こったＲＮＡを切断するので、ＲＮアーゼＨは、リボザイム又はＤＮＡザイムが使用されている場合に存在することが可能であるが、必要ではない。幾つかの事例では、内在性ｍＲＮＡ、ＲＮＡ結合タンパク質及びＲＮアーゼＨを含有する細胞抽出物中のランダム又は半ランダムＯＤＮライブラリーが使用される。

次に、アンチセンスＯＤＮ、リボザイム又はＤＮＡザイムが結合し、切断が起こった標的ＲＮＡ上の部位を同定するために、様々な方法を使用することが可能である。例えば、この目的のために、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素依存性ポリメラーゼ連鎖反応（ＴＤＰＣＲ）を使用し得る（Ｋｏｍｕｒａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２６：１８０７−１１参照）。ＲＮＡテンプレートをＤＮＡへ転化するために逆転写工程が使用され、続いて、ＴＤＰＣＲが使用される。本発明において、ＴＤＰＣＲ法のために必要とされる３’末端は、あらゆる適切なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いて、目的の標的ＲＮＡを逆転写することによって作出される。これは、研究されている標的ＲＮＡ分子の一部から下流にある（すなわち、ＲＮＡ分子上の５’から３’方向）領域中において、第一のＯＤＮプライマー（Ｐ１）をＲＮＡにハイブリド形成させることによって達成される。ｄＮＴＰの存在下にある本ポリメラーゼは、Ｐ１の３’末端からＲＮＡをＤＮＡへ複製し、アンチセンスＯＤＮ／ＲＮアーゼＨ、リボザイム又はＤＮＡザイムの何れかによって作出された切断の部位で複製を終結する。新たなＤＮＡ分子（第一鎖ＤＮＡと称される。）は、ＴＤＰＣＲ法のＰＣＲ部分のための第一のテンプレートとしての役割を果たし、これは、ＲＮＡ上に存在する対応する接近可能な標的配列を同定するために使用される。

例えば、次いで、ＴＤＰＣＲ手法が使用され得る。すなわち、ＤＮＡ分子の３’末端上に（ｒＧ）２−４尾部を付加するために、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（ＴｄＴ）の存在下で、逆転写された、グアノシン三リン酸を有するＤＮＡ（ｒＧＴＰ）を反応させる。次に、（ｒＧ）２−４尾部と塩基対を形成する３’２−４突出部を１つの鎖上に有する二本鎖ＯＤＮリンカーを連結させる。次いで、２つのＰＣＲプライマーを添加する。第一のプライマーは、（ｒＧ）２−４尾部に連結されたＴＤＰＣＲリンカーの鎖（下方鎖と称される場合がある。）に対して相補的であるリンカープライマー（ＬＰ）である。他方のプライマー（Ｐ２）は、Ｐ１と同じにすることが可能であるが、Ｐ１に関して入れ子状にし得る。すなわち、他方のプライマー（Ｐ２）は、Ｐ１によって結合されている領域から少なくとも部分的に上流にあるが、研究されている標的ＲＮＡ分子の一部の下流にある（すなわち、ＲＮＡ分子上の３’から５’への方向）領域中において、標的ＲＮＡに対して相補的である。すなわち、接近可能な結合部位を有するかどうかを決定するために研究されている、標的ＲＮＡ分子の部分は、Ｐ２に対して相補的である領域の上流にある部分である。次いで、プライマーＬＰ及びＰ２によって規定されるＤＮＡセグメントを増幅するために、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下において、公知の様式でＰＣＲを実施する。次いで、様々な公知の方法の何れかによって、増幅された生成物を捕捉し、続いて、自動化されたＤＮＡ配列決定装置上で配列を決定して、切断部位を正確に同定することが可能である。一旦、この同定が決定されたら、インビトロ又はインビボでの使用のために、所定の配列アンチセンスＤＮＡ又はリボザイムを合成することが可能である。

特異的遺伝子の発現におけるアンチセンス介入は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の使用によって達成することが可能である（例えば、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ−ｄ’Ｈｅｌｌｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．６：７；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ．１４：３７６；及びＬｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐ．Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｃｅｋ， ｅｄｓ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）参照）。簡潔に述べると、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、目的の標的ｍＲＮＡと相補的であり、ＲＮＡ：ＡＳ二重鎖を形成するように設計された、ＤＮＡの短い配列（典型的には１５から３０マーであるが、最小７マーであり得る。）（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ．３７２：３３３参照）であり得る。この二重鎖形成は、関連するｍＲＮＡのプロセッシング、スプライシング、輸送又は翻訳を妨害することが可能である。さらに、ある種のＡＳヌクレオチド配列は、それらの標的ｍＲＮＡとハイブリド形成されたときに、細胞性ＲＮアーゼＨ活性を示すことが可能であり、ｍＲＮＡ分解をもたらす（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｅｍｉｎ． ｎｃｏｌ．．２３：７８参照）。その場合には、ＲＮアーゼＨは、二重鎖のＲＮＡ成分を切断し、標的ＲＮＡのさらなる分子とさらにハイブリド形成するために、ＡＳを放出できる可能性を秘める。さらなる作用の様式は、転写的に不活性であり得る三重螺旋を形成するために、ＡＳのゲノムＤＮＡとの相互作用から生じる。

本明細書において上記されているアンチセンス配列に加えて、又はこれに代わるものの非限定的な例では、遺伝子機能の抑制のために、リボザイムを使用し得る。これは、化学量論的な考慮によってアンチセンス療法が限定される場合に特に必要である。次いで、同一の配列を標的とするリボザイムを使用することが可能である。リボザイムは、標的ＲＮＡ中の特異的部位を切断するＲＮＡ触媒能を保有するＲＮＡ分子である。リボザイムによって切断されるＲＮＡ分子の数は、１：１化学量論によって予想された数より多い（Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：４９２９−３３；及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ．３２８：５９６−６００参照）。従って、本発明は、ＶＥＧＦｍＲＮＡ種の接近可能なドメインへ標的化され、及び適切な触媒中心を含有するリボザイム配列の使用も可能とする。リボザイムは、本分野において知られているように作製及び送達され、本明細書中でさらに考察されている。リボザイムは、アンチセンス配列と組み合わせて使用し得る。

リボザイムは、ＲＮＡのホスホジエステル結合切断を触媒する。グループＩイントロン、ＲＮアーゼＰ、肝炎δウイルスリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム及びタバコ輪斑ウイルスサテライトＲＮＡ（ｓＴＲＳＶ）の負の鎖から最初に得られたヘアピンリボザイムなど、幾つかのリボザイム構造ファミリーが同定されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９９４）Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇ．（Ｓｕｐｐｌ．）１０３：９５Ｓ；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２２５，３４７参照）。後者２つのファミリーは、ウイロイド及びウイルソイドに由来し、ここで、リボザイムは、ローリングサークル複製の間に作製されたオリゴマーから単量体を分離するものと考えられている（Ｓｙｍｏｎｓ（１９８９）ＴＩＢＳ， １４：４４５−５０；Ｓｙｍｏｎｓ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：６４１−７１参照）。ハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムモチーフは、最も一般的には、遺伝子療法用のｍＲＮＡのトランス切断のために適合される。本発明において使用されるリボザイムの種類は、本分野において公知であるように選択される。現在、ヘアピンリボザイムは臨床試験中であり、特に有用な種類である。一般に、リボザイムは、３０から１００ヌクレオチドの長さである。

標的ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は本分野において公知であり（例えば、ＶＥＧＦ（配列番号３））、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるために使用することも可能である（例えば、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂ．ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．_，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４７：１２２２−１２２５及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，０９３，２４６参照）。特定のｍＲＮＡを破壊するために、部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用できるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が特に有用である。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡとともに相補的な塩基対を形成する隣接領域によって指令される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが２つの塩基の以下の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び作製は、本分野において周知であり、「Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ．３３４：５８５）」中に、さらに完全に記載されている。

本発明のリボザイムには、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）中に天然に存在するもの（ＩＶＳ又はＬ−１９ＩＶＳＲＮＡとして知られる。）及びＴｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈ及び共同研究者によって詳しく記載されているもの（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２４：５７４−５７８；Ｚａｕｇ ａｎｄ Ｃｅｃｈ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇ， ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ， ３２４：４２９−４３３；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．Ｗ０８８／０４３００；Ｂｅｅｎ ａｎｄ Ｃｅｃｈ（１９８６）Ｃｅｌｌ．４７：２０７−２１６））など、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）も含まれる。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリド形成する８塩基対の活性部位を有し、この部位の後で、標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明は、８塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。本発明は、作用機序の特定の理論に限定されるものではないが、ハンマーヘッドリボザイムは、ｍＲＮＡ標的のＲＮＡ翻訳及び／又は特異的な切断を遮断することによって作用することが、最近の報告によって示されているので、本発明においては、ハンマーヘッドリボザイムの使用が、ＶＥＧＦ誘導されたアンチセンスの使用より有利であり得る。

アンチセンスアプローチと同様、リボザイムは、（例えば、改善された安定性、標的化などのために）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成されることが可能であり、標的ｍＲＮＡを発現する細胞へ送達される。有用な送達方法は、形質移入された細胞が、標的化されたメッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分なリボザイムの量を産生するように、強力な恒常的ｐｏＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモーターの制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒性であるので、効率のために、より低い細胞内濃度が必要とされる。

上述のように、必要な場合には、使用及び送達方法に対して必要とされるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド又はリボザイムの生物学的活性を大幅に妨害しない本分野で公知のあらゆる方法によって、ヌクレアーゼ耐性が与えられる（Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−９９；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２；Ｓｐｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１１６９１−７０４；Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１７６３−６９；及びＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１１６９１−７０４）。アプタマーに関して上述されているように、ヌクレアーゼ耐性を強化するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムに対して施すことができる非限定的な代表的修飾には、ホスファート骨格、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖複素芳香族若しくは複素環式糖間結合中のリン又は酸素へテロ原子を修飾することが含まれる。これらには、例えば、２’−フルオロ化された、Ｏ−メチル化された、メチルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート及びモルホリノオリゴマーが含まれる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムは、４から６個の３’末端ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオアート結合を有し得る。あるいは、ホスホロチオアート結合は、全てのヌクレオチド塩基を連結し得る。ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、有効な濃度で著しい毒性を示さず、動物中で、十分な薬物動態学的半減期を示し（Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ．１４：３７６）、ヌクレアーゼ耐性である。あるいは、ＡＳ−ＯＤＮに対するヌクレアーゼ耐性は、ヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＡＧＣＧを有する９ヌクレオチドのループ形成配列を３’末端に有することによって付与することが可能である。血清ヌクレアーゼ分解に対するＡＳ−ＯＤＮの改善された保護のために、アビジン−ビオチン連結反応の使用も使用することが可能である（Ｂｏａｄｏ ａｎｄ Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｉ．Ｃｈｅｍ３：５１９−２３参照）。この概念に従って、ＡＳ−ＯＤＮ因子は、３’末端においてモノビオチニル化される。アビジンと反応させると、それらは、連結されていないＯＤＮと比べて６倍の改善された安定性を有する強固なヌクレオチド耐性複合体を形成する。

他の研究は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのインビボ伸長を示した（Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７５９５）。外来ＡＳ−オリゴヌクレオチドを循環から除去するための清掃機構として有用と思われるこのプロセスは、伸長が起こる付着されたオリゴヌクレオチド中に遊離の３’末端が存在することに依存する。従って、この重要な位置における部分的ホスホロチオアート、ループ保護又はビオチン−アビジンは、これらのＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの安定性を確保するのに十分であるべきである。

上記修飾された塩基を使用することに加え、ヌクレオチドの構造が基本的に変化されており、治療用試薬又は実験用試薬としてさらに適したヌクレオチドの類縁体を調製することが可能である。ヌクレオチド類縁体の例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）中のデオキシリボース（又はリボース）ホスファート骨格が、ペプチド中に見出されるものと類似するポリアミド骨格で置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類縁体は、酵素による分解に対して耐性を有し、インビボ及びインビトロで延長された寿命を有することが示されている。さらに、ＰＮＡは、ＤＮＡ分子より、相補的ＤＮＡ配列により強く結合することが示されている。この観察は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖間に電荷的反発が存在しないことに起因するものである。オリゴヌクレオチドに対して施すことが可能な他の修飾には、ポリマー骨格、モルホリノポリマー骨格（例えば、米国特許番号５，０３４，５０６（その内容は、参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照。）、環状骨格、又はアクリル骨格、糖模倣物又はオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善することが可能なものを含む他のあらゆる修飾が含まれる。

本発明のさらなる態様は、例えばＶＥＧＦのような標的ｍＲＮＡの発現を減少させるためのＤＮＡ酵素の使用に関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンス及びリボザイム技術の両方の機構的特徴の幾つかを取り込む。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと殆ど同様に、特定の標識核酸配列を認識するが、リボザイムと殆ど同様に触媒的であり、標的核酸を特異的に切断するように設計されている。

現在、ＤＮＡ酵素の２つの基本的種類が存在し、これらの両方が、ＳａｎｔｏｒｏとＪｏｙｃｅによって同定された（例えば、米国特許番号６，１１０，４６２参照）。１０−２３ＤＮＡ酵素は、２つのアームを接続するループ構造を含む。２つのアームは、特定の標的核酸配列を認識することによって特異性を付与するが、ループ構造は、生理的な条件下で触媒機能を付与する。

簡潔に述べれば、標的核酸を特異的に認識及び切断するＤＮＡ酵素を設計するために、当業者は、まず、特有な標的配列を同定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して概説したものと同一のアプローチを用いて行うことが可能である。ある種の例では、特有の配列又は実質的に特有の配列は、約１８から２２個のヌクレオチドを有し、Ｇ／Ｃに富んでいる。高いＧ／Ｃ含量は、ＤＮＡ酵素と標的配列間のより強い相互作用を確保するのに役立つ。

ＤＮＡ酵素を合成する場合、酵素をメッセージへ標的誘導する特異的アンチセンス認識配列は、ＤＮＡ酵素の２つのアームを含み、ＤＮＡ酵素ループが２つの特異的アーム間に配置されるように分割される。

ＤＮＡ酵素を作製及び投与する方法は、例えば、Ｕ．Ｓ．６１１０４６２中に見出すことが可能である。同様に、インビトロ又はインビボでのＤＮＡリボザイムの送達方法には、本明細書に概説されているようなＲＮＡリボザイムの送達方法が含まれる。さらに、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様、安定性を改善し、分解に対する耐性を改善するように、場合によって、ＤＮＡ酵素を修飾できることを認識する。

ＲＮＡｉアンタゴニスト
本発明の幾つかの実施形態は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、ＶＥＧＦの抑制を行うための材料及び方法を使用する。ＲＮＡｉは、真核細胞中で起こり得る配列特異的な翻訳後遺伝子抑制の過程である。一般に、この過程は、特定の配列に対して相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される前記配列のｍＲＮＡの分解を伴う。例えば、特定の一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓｍＲＮＡ）の配列に対応する長いｄｓＲＮＡの発現は、このメッセージを分解され易くすることによって、対応する遺伝子の発現を「妨害」する。従って、選択されたあらゆる遺伝子に対するｍＲＮＡの全て又は実質的な部分に対応するｄｓＲＮＡを導入することによって、選択されたあらゆる遺伝子を抑制し得る。長いｄｓＲＮＡが発現される場合、長いｄｓＲＮＡは、まず、リボヌクレアーゼＩＩＩによって、２１から２２塩基対の長さのより短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドへと加工される。従って、ＲＮＡｉは、相対的に短い相同的ｄｓＲＮＡの導入又は発現によって実施され得る。実際に、相対的に短い相同なｄｓＲＮＡの使用は、以下に論述されている幾つかの利点を有し得る。

哺乳動物細胞は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって影響を受ける少なくとも２つの経路を有する。ＲＮＡｉ（配列特異的）経路において、開始ｄｓＲＮＡは、上述のように、まず、短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡへと切断される。ｓｉＲＮＡは、２つのヌクレオチドの突出部を各３’末端に有し、約１９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを形成する約２１ヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。短い干渉ＲＮＡは、分解のために特異的なメッセンジャーＲＮＡが標的となるようにすることができる配列情報を提供すると考えられている。これに対して、非特異的な経路は、少なくとも約３０塩基対の長さのあらゆる配列のｄｓＲＮＡによって引き金が引かれる。ｄｓＲＮＡは、その活性形態において、翻訳開始因子ｅＩＦ２をリン酸化して、全てのタンパク質合成を停止するＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ）及び全てのｍＲＮＡを標的とする非特異的酵素ＲＮアーゼＬを活性化させる分子を合成する２’，５’オリゴアデニル酸合成酵素（２’，５’−ＡＳ）という２つの酵素を活性化させるので、非特異的な効果が生じる。非特異的経路は、ストレス又はウイルス感染に対する宿主応答に相当し得、一般に、非特異的経路の効果は、本発明の特に有用な方法において最小化される。重要なことに、非特異的経路を誘導するためには、より長いｄｓＲＮＡが必要とされるようであり、従って、約３０塩基対より短いｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉによる遺伝子抑制を実施するために特に有用である（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５０：４０９−１７；Ｍａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１２：５２３９−４８；Ｍｉｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１０１８０−３；及びＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ．４１１：４９４−８）。

ＲＮＡｉを実施するために使用されるある種の二本鎖オリゴヌクレオチドは、３０塩基対の長さより短く、リボ核酸の約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８又は１７塩基対を含み得る。場合によって、本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３’突出末端を含み得る。非限定的な典型的２ヌクレオチド３’突出部は、あらゆる種類のリボヌクレオチド残基から構成され得、ＲＮＡ合成のコストを低減し、細胞培地中及び形質移入された細胞内でのｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増強し得る２’−デオキシチミジン残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）から構成される場合さえあり得る（Ｅｌｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ， ４１１ ：４９４−８）。

５０，７５、１００若しくは５００塩基対又はそれ以上のより長いｄｓＲＮＡも、本発明のある種の実施形態において使用され得る。ＲＮＡｉを実施するためのｄｓＲＮＡの典型的な濃度は約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭ又は１００ｎＭであるが、処理される細胞の性質、遺伝子標的及び当業者が容易に理解できる他の因子に応じて、他の濃度を使用し得る。典型的なｄｓＲＮＡは化学的に合成され、又は適切な発現ベクターを用いて、インビトロ若しくはインビボで産生され得る。典型的な合成ＲＮＡは、本分野で公知の方法を用いて化学的に合成された２１ヌクレオチドのＲＮＡを含む（例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＲＮＡホスホルアミダイト及びチミジンホスホルアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。合成オリゴヌクレオチドは、本分野で公知の方法を用いて脱保護及びゲル精製され得る（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８−２００参照）。より長いＲＮＡは、本分野で公知のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどのプロモーターから転写され得る。インビトロプロモーターの下流に、可能な両配位で配置された単一のＲＮＡ標的は、標的の両鎖を転写して、所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを作製する。

オリゴヌクレオチドの設計において使用される特異的配列は、標的（例えば、ＶＥＧＦの（例えば配列番号４））の発現された遺伝子メッセージ内に含有されるヌクレオチドのあらゆる連続する配列であり得る。適切な標的配列を選択するために、本分野で公知のプログラム及びアルゴリズムを使用し得る。さらに、上にさらに記載されているように、指定の一本鎖核酸配列の二次構造を予測し、この配列の選択が、折り畳まれたｍＲＮＡの露出された一本鎖領域中に生じるように設計されたプログラムを用いて、最適な配列を選択し得る。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法及び組成物は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２５１，５８８（その内容は、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に見出し得る。ｍＲＮＡは、一般的に、リボヌクレオチドの配列内にタンパク質合成を誘導するための情報を含有する直鎖分子と考えられている。しかしながら、多くのＲＮＡ中に多数の二次構造及び三次構造が存在することが、研究によって明らかとなっている。概ね、ＲＮＡ中の二次構造要素は、同じＲＮＡ分子の異なる領域間でワトソン−クリックタイプの相互作用によって形成される。重要な二次構造要素には、細胞内二本鎖領域、ヘアピンループ、二重鎖ＲＮＡ中の出っ張り及び内部ループが含まれる。二次構造要素が互いに接触し、又は一本鎖領域と接触すると、三次構造要素が形成されて、より複雑な三次元構造を生じる。多数の研究者が、多数のＲＮＡ二重鎖構造の結合エネルギーを測定し、ＲＮＡの二次構造を予測するために使用することができる一群の規則を導いた（例えば、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：７７０６（１９８９）；及びＴｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１７：１６７参照）。前記規則は、ＲＮＡ構造要素の同定において有用であり、特に、発現停止ＲＮＡｉ、リボザイム又はアンチセンス技術のための標的とするのに特に有用なｍＲＮＡのセグメントであり得る一本鎖ＲＮＡ領域を同定するために有用である。従って、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを媒介するＲＮＡｉの設計のために、並びに本発明の適切なリボザイム及びハンマーヘッドリボザイム組成物の設計のために、ｍＲＮＡ標的の特定のセグメントを同定することが可能である。

ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、接着性細胞株に対して製造業者によって記載されているように、本分野において公知であるリポソーム（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ））などの担体組成物を用いて、異種標的遺伝子での形質移入によって細胞中に導入され得る。内在性遺伝子を標的化するためのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの形質移入は、Ｏｒｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施され得る。ｈＧＦＰをコードするｐＡＤ３の同時形質移入後に、哺乳動物細胞株に対して蛍光顕微鏡を使用して、形質移入効率をチェックし得る（Ｋｅｈｌｅｎｂａｃｋ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４１ ：８６３−７４）。ＲＮＡｉの有効性は、ｄｓＲＮＡの導入後に、多数のアッセイの何れかによって評価し得る。これらには、新しいタンパク質合成が抑制された後に、内在性プールの代謝回転のために十分な時間を置いて、標的化された遺伝子産物を認識する抗体を用いるウェスタンブロット分析及び存在する標的ｍＲＮＡのレベルを測定するためのノーザンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。

本発明において使用するためのＲＮＡｉ技術のさらなる組成物、方法及び応用は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，２７８，０３９、５，７２３，７５０及び５，２４４，８０５に提供されており、これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。

受容体チロシンキナーゼ阻害剤アンタゴニスト
本発明には、本分野で公知のチロシンキナーゼアンタゴニスト並びに本分野で一般的な技術を用いて取得され得るチロシンキナーゼアンタゴニストのバリアント及び代替物が含まれ、本分野の教示は、参照により本明細書中に組み込まれる。ＶＥＧＦの細胞外シグナルは、ＶＥＧＦ受容体によって行われるチロシンキナーゼ媒介性リン酸化現象を介して、細胞の他の部分に伝達され、細胞膜に結合されたシグナル伝達複合体の下流に存在する基質タンパク質に影響を与える。従って、ＶＥＧＦシグナル伝達の受容体キナーゼ段階に作用するアンタゴニストも、本発明の方法において有効である。

ＶＥＧＦＲなどのチロシンキナーゼ受容体酵素に対して選択的であるチロシンキナーゼ阻害剤の種類の多数が公知である（例えば、Ｓｐａｄａ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ（（１９９５）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ．５：８０５）及びＢｒｉｄｇｅｓ（（１９９５）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ， ５：１２４５参照）。さらに、ＬａｗとＬｙｄｏｎは、チロシンキナーゼ阻害剤が有する可能性がある抗癌能力をまとめている（（１９９６）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．２４１−２６０）。

ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の例には、シンノリン誘導体が含まれる（例えば、米国特許番号６，５１４，９７１（その内容全体が、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているもの）。その他のこのようなシンノリン誘導体も公知である。例えば、（１９９５）Ｊ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，３８：３４８２−７は、４−（３−ブロモアニリノ）シンノリンを開示し；（１９６８）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ．（９）：１１５２−５は、６−クロロ−４−フェノキシシンノリンを開示し；（１９８４）Ｊ．Ｋａｒｎａｔａｋ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．２９：８２−６は、ある種の４−アニリノシンノリンを開示し；及び（１９７３）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．１１：２１１−１３は、ある種のフェニルチオシンノリンを開示している。さらに、（１９７３）Ｊ． Ｋａｒｎａｔａｋ Ｕｎｉｖ．１８：２５−３０は、ある種の４−フェノキシシンノリンを開示し、（１９８４）Ｊ． Ｋａｒｎａｔａｋ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．２９：８２−６は、４−（４−メトキシアニリノ）−６，７−ジメトキシシンノリン及び４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシシンノリンという２つの化合物を開示している。さらに、４位の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−及び−ＣＨ_２−から選択される基を介して連結されたフェニル環を有するある種のシンノリンが、米国特許番号５，０１７，５７９、米国特許番号４，９５７，９２５、米国特許番号４，９９４，４７４及びＥＰ０３０２７９３Ａ２に記載されている。

ＶＥＧＦＲを阻害するためのさらに別の関連化合物は、慣用アッセイを用いて、目的の受容体チロシンキナーゼ活性に対するそれらの効果に対して新規化合物をスクリーニングすることによって入手することが可能である。候補ＶＥＧＦＲ小分子有機阻害剤による効果的な阻害は、細胞をベースとしたアッセイ系及び本分野で公知の他のアッセイ系を用いてモニターすることが可能である。

例えば、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに対する活性のための１つの検査は、以下のとおりである。検査は、Ｆｌｔ−１ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを用いて行われる。詳細な手順は以下のとおりである。キナーゼ溶液３０μＬ（２０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌｐＨ７．５中のＦｌｔ−１のキナーゼドメイン１０ｎｇ（Ｓｈｉｂｕｙａ， ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：５１９−２４）、３ｍＭ二塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、３ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、１０μＭバナジン酸ナトリウム、０．２５ｍｇ／ｍｌポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００００、１ｍＭジチオスレイトール及び３μｇｍｕＬのポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、８ｕＭ［^３３Ｐ］−ＡＴＰ（０．２μＣｉ）、１％ジメチルスルホキシド及び検査すべき化合物の０から１００μＭが、室温で１０分間、一緒に温置される。次いで、０．２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ７の１０μＬの添加によって、反応を停止させる。マルチチャンネル分配装置（ＬＡＢ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＵＳＡ）を使用し、ＰＶＤＦ（＝二フッ化ポリビニル）に２０μＬの分取試料を適用した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を、マイクロタイターフィルター集合管を通じて、真空に接続した。液体が完全に除去された後、０．５％リン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）を含有する槽中で連続して４回、及びエタノールで膜を１回洗浄し、各回震盪させながら１０分間温置し、次いで、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ Ｍａｎｉｆｏｌｄ中に戴置し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ．ＲＴＭ（β−シンチレーションカウンター液）１０μＬの添加後に放射能を測定した。ＩＣ_５０値は、３つの濃度（一般に、０．０１μｍｏｌ、０．１μｍｏｌ及び１μｍｏｌ）における各化合物の阻害に対するパーセントの線形回帰分析によって求められる。活性なチロシン阻害剤化合物のＩＣ_５０値は、０．０１μＭから１００μＭの範囲であり得る。

さらに、ＶＥＧＦによって誘導されたＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ／自己リン酸化活性の阻害は、細胞に対するさらなる実験を用いて確認することが可能である。簡潔に述べれば、６ウェル細胞培養プレート中の（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えた）完全培地中に、ヒトＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ／ＫＤＲ）を恒常的に発現する形質移入されたＣＨＯ細胞を播種し、約８０％の集密状態を示すまで、５％ＣＯ_２下、３７℃で温置される。次いで、検査すべき化合物を培地（ＦＣＳなし、０．１％ウシ血清アルブミンを添加）中に希釈し、細胞に添加する。（対照は、被検化合物なしの培地を含む）。３７℃での２時間の温置後、組み換えＶＥＧＦを添加する。最終ＶＥＧＦ濃度は２０ｎｇ／ｍＬである。３７℃で、さらに５分間温置した後、氷冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、１００μＬ溶解緩衝液／ウェル中へ直ちに溶解する。次いで、細胞核を除去するために可溶化液を遠心し、市販のタンパク質アッセイ（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて上清のタンパク質濃度を測定する。次いで、可溶化液を直ちに使用し、又は必要であれば、−２００℃で保存することが可能である。

次いで、ＫＤＲ−受容体リン酸化を測定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施する。ＫＤＲに対するモノクローナル抗体を黒いＥＬＩＳＡプレート上に固定化する（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ^ＴＭ、Ｐａｃｋａｒｄ製のＨＴＲＦ−９６）。次いで、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、残った遊離タンパク質結合部位を飽和させる。次いで、アルカリホスファターゼが結合された抗ホスホチロシン抗体（例えば、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＫＹから得られるＰＹ２０：ＡＰ）と一緒に、４℃で一晩、これらのプレート中で、細胞可溶化液（２０μｇタンパク質／ウェル）を温置する。次いで、プレートを再び洗浄し、発光性ＡＰ基質（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、即時使用、Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩを使用；Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴＲＯＰＩＸ Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を用いて、捕捉されたリン酸化された受容体への抗ホスホチロシン抗体の結合が示される。発光は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ中で測定される。陽性対照（ＶＥＧＦで刺激される。）のシグナルと陰性対照（ＶＥＧＦで刺激されない。）のシグナル間の差は、ＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲ−受容体リン酸化に対応する（＝１００％）。検査された物質の活性は、ＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲ受容体リン酸化の％阻害として計算され、最大阻害を半分誘導する物質の濃度は、ＥＤ_５０（５０％阻害に対する有効用量）として定義される。活性なチロシン阻害剤化合物は、０．００１μＭから６μＭ、典型的には０．００５μＭから０．５μＭの範囲のＥＤ_５０値を有する。

医薬製剤及び治療的投与
抗ＶＥＧＦ因子は、乾癬、関節リウマチ、癌及び眼の血管新生疾患などの血管新生疾患の治療において有用である。特に興味深いのは、黄斑変性又は糖尿病性網膜症などの眼の血管新生疾患を抑制するために、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの組み合わせを使用する療法である。従って、患者が血管新生疾患を発症し、又は血管新生疾患を有するリスクがあると診断されたら、患者は、第二の選択的ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて、第一の汎ＶＥＧＦＡアンタゴニストの投与によって治療される。本発明の方法の実施は、角膜の浮腫をもたらさない。上に論述されているように、多様なＶＥＧＦアンタゴニストを本発明において使用し得る。

本発明の抗ＶＥＧＦ組み合わせ療法は、単独で、又は別の療法と組み合わせて実施することができ、自宅、医師の職場、診療所、病院の外来部門又は病院で付与され得る。医師が治療の効果を詳しく観察し、必要とされる何らかの調整を加えることができるように、治療は、一般的には、医師の職場で開始される。組み合わせ療法の期間は、治療されている血管新生疾患の種類、患者の年齢及び症状、患者の疾病の段階及び種類並びに治療に対する患者の応答の仕方に依存する。さらに、血管新生疾患を発症するより大きなリスクを有する者（例えば、糖尿病患者）は、症候の開始の阻害又は遅延のための治療を受け得る。

組み合わせ療法の各アンタゴニストの投与は、他のアンタゴニストと組み合わされる、血管新生疾患の治療に対して有効なアンタゴニストのある濃度をもたらすあらゆる適切な手段によって為され得る。各アンタゴニストは、例えば、適切な担体物質とともに組み合わされ得、一般に、組成物の総重量の１から９５重量％の量で存在する。組成物は、眼、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下）、直腸、経皮、経鼻又は吸入投与に適した剤形で与え得る。従って、組成物は、例えば、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、粒状物、懸濁液、エマルジョン、溶液、ヒドロゲルなどのゲル、ペースト、軟膏、クリーム、膏薬、送達装置、坐剤、浣腸、注射液、インプラント、スプレー又はエアロゾルの形態であり得る。単一のアンタゴニスト又は２つ若しくはそれ以上のアンタゴニストを含有する医薬組成物は、慣用の医薬慣行に従って製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（２０ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ． Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ． ａｎｄ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ．Ｊ． Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ． Ｃ． Ｂｏｙｌａｎ， １９８８−２００２， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。

ＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせは、一つの有用な態様において、非経口的に（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、眼内、硝子体内、眼球後方、結膜下、腱筋下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）又は皮下注射又はインプラントによって）又は全身的に投与される。非経口又は全身投与用の製剤は、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液又はエマルジョンを含む。様々な水性担体、例えば、水、緩衝化された水、生理的食塩水などを使用することが可能である。他の適切なビヒクルの例には、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、ヒドロゲル、水素化されたナフタレン及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。このような製剤は、防腐剤、湿潤剤、緩衝剤、乳化剤及び／又は分散剤などの補助物質も含有し得る。活性成分の放出を調節するために、生物適合性の生物分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を使用し得る。

例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、眼内への硝子体内注射並びに結膜下及び腱筋下注射によって、眼内に投与され得る。他の投与経路には、経強膜（ｔｒａｎｓｃｌｅｒａｌ）、眼球後方、腹腔内、筋肉内及び静脈内が含まれる。あるいは、薬物送達装置又は眼内インプラントを用いて、アンタゴニストの組み合わせを送達し得る（以下参照）。

経口投与用の液体剤形には、医薬として許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及び軟ゼラチンカプセルが含まれる。これらの形態は、水又は油溶媒など、本分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有し、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤などの佐剤も含むことが可能である。

幾つかの事例において、ＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせは、例えば、パッチによって、又は血管新生疾患に対して感受性があり、若しくは血管新生疾患によって冒される領域（表皮又は眼など）への直接適用によって、又はイオン泳動によって、局所的に投与することも可能である。

眼用製剤には、医薬として許容される非毒性賦形剤と混合された活性成分を含有する錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤又は充填剤（例えば、スクロース及びソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤及び抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油又はタルク）であり得る。

ＶＥＧＦアンタゴニストは、錠剤若しくはその他のビヒクル中で一緒に混合され得、又は分配され得る。１つの例において、第一のアンタゴニストの放出前に第二のアンタゴニストの相当部分が放出されるように、第一のアンタゴニストが錠剤の内側に含有され、第二のアンタゴニストが外側に含有される。所望であれば、錠剤形態のアンタゴニストは、薬物送達装置（以下参照）を用いて送達され得る。

一般的に、アンタゴニストの各々は、血管新生疾患の有害な効果又は症候を抑制又は低減又は除去するのに十分な量で投与すべきである。単一の投薬量を与えるために、担体材料と組み合わされる活性なアンタゴニスト成分の量は、治療されている対象及び具体的な投与様式に応じて変動する。

特許請求の範囲に記載されている組み合わせの各アンタゴニストの用量は、症状の重度、症状が治療されるべきか、又は予防されるべきか、並びに治療されるべき者の年齢、体重及び健康など幾つかの要因に依存する。さらに、特定の患者についての薬物ゲノム（治療薬の薬物速度論的、薬物動態学的又は効果特性に対する遺伝子型の効果、）情報は、使用される投薬量に影響を及ぼし得る。さらに、投与されているＶＥＧＦアンタゴニストの具体的な組み合わせ、投与の時間、投与の経路、製剤の性質、排出の速度、治療されている具体的な血管新生疾患、疾患の重度及び血管新生疾患の解剖学的位置（例えば、眼ｖｓ．体腔）など、様々な因子に応じて、正確な個別の投薬量を若干調節し得ることを、当業者は理解する。様々な投与経路の異なる効率性に照らして、必要とされる投薬量の広い変動を予測すべきである。例えば、経口投与は、一般的に、静脈内又は硝子体内注射による投与に比べて、より高い投薬量レベルを必要とすることが予測される。これらの投薬量レベルの変動は、本分野で周知である、最適化のための標準的な経験的手順を用いて調整することが可能である。正確な治療的有効用量レベル及びパターンは、典型的には、上記因子を考慮して、眼科医などの担当医によって決定される。

ヒトに対して眼科学的に投与される場合、ＶＥＧＦアンタゴニストの投薬量は、約０．００３／投与と３．０ｍｇ／投与の範囲にわたり得る。

例えば、眼に使用する場合、抗ＶＥＧＦ−Ａアプタマー薬物物質は、ｐＨ５から７のリン酸緩衝化された生理的食塩水中に製剤化される。ｐＨ調整のために、水酸化ナトリウム又は塩酸を添加し得る。１つの有効製剤において、ペガプタニブナトリウムなどの抗ＶＥＧＦ−Ａアプタマーは、無菌の２７ゲージ針が装着された、１ｍＬの無菌ＵＳＰＩ型メモリ付きガラス注射器中に封入された３つの異なる濃度：３ｍｇ／１００μＬ、２ｍｇ／１００μＬ及び１ｍｇ／１００μＬで個別に製剤化される。医薬品は、防腐剤を含まず、硝子体内注射のみによって単回使用が意図される。活性成分は、３０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ＶＥＧＦ−Ａ薬物物質である。賦形剤は、塩化ナトリウム、ＵＳＰ；第一リン酸ナトリウム、一水和物、ＵＳＰ；第二リン酸ナトリウム、七水和物、ＵＳＰ；水酸化ナトリウム、ＵＳＰ；塩酸、ＵＳＰ；及び注射用水、ＵＳＰである。この形態では、抗ＶＥＧＦ−Ａアプタマー医薬品は、単回使用ガラス注射器中に提供された即時使用の無菌溶液である。注射器は、溶液が室温に到達できるようにするために、使用の少なくとも３０分前（但し、４時間を超えない。）で冷蔵された保存から取り出される。注射器内容物の投与は、注射器の筒の内側にあるゴム製ストッパーに、可動式プラスチックプランジャー棒を付着させることを含む。次いで、製品の投与を可能とするために、ゴムの末端キャップを除去する。抗ＶＥＧＦ−Ａアプタマーは、４２日の間隔を置き、３つの時点で、１００μＬの硝子体内注射として投与される。患者には、訪問当り０．３ｍｇ／注射を与える。

投与される薬物の具体的な量は、成分の具体的な組み合わせに依存する。

有用な組み合わせ療法には、短期的使用のための第一の療法としての汎ＶＥＧＦＡ抗体アンタゴニスト及び長期的使用のための第二の療法としての選択的ＶＥＧＦ−Ａアプタマーアンタゴニストが含まれる。加齢した様々な異常な血管の変動する生物学的応答のために、アンタゴニストは組み合わせて使用される。

一実施例において、ＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせは、ＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせによる治療を必要としている哺乳動物へ、典型的には、注射可能な医薬組成物の形態で投与される。組み合わせの態様において、例えば、ＶＥＧＦ抗体及びＶＥＧＦ−Ａアプタマーは、別個に、又は両者を含む医薬組成物に入れて投与され得る。一般的に、このような投与は、注射によること、又は薬物送達装置を使用することによることが好ましい。非経口、全身又は経皮投与も許容され得る。

上に論述されているように、ＶＥＧＦアンタゴニストが一緒に投与される場合には、このような投与は、時間的に順次とし、又は同時とすることが可能であり、順次方法が投与の一様式である。ＶＥＧＦアンタゴニストが順次に投与される場合には、それぞれの投与は、同一又は別異の方法によることが可能である。しかしながら、順次投与の場合には、前記方法は、約５秒にわたって（最大約３つの注射）第一のＶＥＧＦアンタゴニストを投与した後、６週ごとに、持続的な投与を使用することが有用である。順次投与には、各アンタゴニストが異なる時点で、若しくは異なる経路によって、又はその両者で投与され得るが、共同で作用して、有益な効果を与える組み合わせ、例えば、血管新生疾患を抑制する組み合わせも含まれる。注射による投与は特に有用であることも注目される。

本発明の医薬組成物は、投与すると、実質的に直ちに活性なＶＥＧＦアンタゴニストを放出し、又は、徐放製剤を用いて、投与後の何れかの所定の期間に活性なＶＥＧＦアンタゴニストを放出するように製剤化され得る。例えば、各ＶＥＧＦアンタゴニストの少なくとも１つを含む医薬組成物を、徐放組成物中に付与し得る。即時放出組成物又は徐放組成物の使用は、治療されている症状の性質に依存する。症状が急性又は超急性疾患からなる場合には、通例、長期放出組成物より、即時放出形態を用いた治療が使用される。ある種の予防的治療又は長期治療については、徐放組成物も適切であり得る。

徐放製剤中のアンタゴニストの各々の投与は、アンタゴニストが、単独で又は組み合わせて、（１）狭い治療指数を有し（例えば、有害な副作用又は毒性反応をもたらす血漿濃度と治療効果をもたらす血漿濃度との差が小さい；一般的には、治療指数ＴＩは、中央有効用量（ＥＤ_５０）に対する中央致死用量（ＬＤ_５０）の比として定義される。）；（２）消化管中で狭い吸収ウィンドウを有し；又は（３）短い生物学的半減期を有するので、血漿レベルを治療レベルに維持するために、１日の間に頻繁な投薬が必要とされる場合に有用である。

放出の速度が治療的アンタゴニストの分解又は代謝の速度を凌駕する徐放を得るために、多くの戦略を実行することが可能である。例えば、製剤パラメータ及び成分（例えば、適切な徐放組成物及びコーティング）の適切な選択によって、徐放を取得することが可能である。例には、単一又は複数単位錠剤又はカプセル組成物、油溶液、懸濁液、エマルジョン、ミクロカプセル、小球体、ナノ粒子、パッチ及びリポソームが含まれる。このような徐放製剤又は調節された放出製剤を調製するための方法は、本分野において周知である。

ＶＥＧＦアンタゴニストを含む医薬組成物は、インプラントなどの薬物送達装置を用いても送達され得る。このようなインプラントは、生物分解可能なインプラント及び／又は生物適合性のインプラントであり得、又は非生物分解可能なインプラントであり得る。インプラントは、活性因子に対して透過性又は非透過性であり得る。眼用薬物送達装置は、前房若しくは後房などの眼の房中に挿入し得、又は強膜（ｓｃｅｌｒａ）中若しくは強膜上、脈絡腔又は硝子体外の無血管領域中に植え込み得る。一実施形態において、薬物が所望の治療部位（例えば、眼内腔及び眼の黄斑）へ経強膜拡散を可能とするために、インプラントは、強膜上などの無血管領域上に配置され得る。さらに、経強膜拡散の部位は、黄斑に近接した部位など、新血管新生の部位に近接し得る。

上述のように、本発明は、別個の医薬組成物を医薬パック中に組み合わせることに関する。従って、本発明の組み合わせは、医薬パックの成分として提供される。少なくとも２つのアンタゴニストを、一緒に又は別個に、個別の投薬量で製剤化することが可能である。本発明のアンタゴニストは、塩として調合する場合にも有用である。

一般に、医薬パックは、（１）第一の単位剤形中に、第一のＶＥＧＦアンタゴニストの一定量、及び医薬として許容される担体、ビヒクル又は希釈剤、（２）第二の単位剤形中に、第二のＶＥＧＦアンタゴニストの一定量、及び医薬として許容される担体、ビヒクル又は希釈剤、並びに（３）容器を含む。容器は、成分を分割するために使用され、例えば、分割された瓶又は分割されたホイル小包が含まれ得る。所望であれば、別個のアンタゴニスト組成物を、単一の分割されていない容器内に含有させてもよい。医薬パックは、別個のＶＥＧＦアンタゴニストの投与のための指示も含み得る。別個の成分が異なる剤形で投与され、異なる投薬量レベルで投与される場合に、又は組み合わせの各成分の滴定が処方医によって所望される場合に、医薬パックは特に有利である。一実施形態において、医薬パックは、ＶＥＧＦアンタゴニストの予定される使用の順序で、一度に１つ、ＶＥＧＦアンタゴニストの用量を分配するように設計されている。別の例において、医薬パックは、パック中に並んで配置されたＶＥＧＦアンタゴニストの列を含有するように設計されており、アンタゴニストの一対が投与されるべき使用者に伝達するために、パック上に指示書を備える。典型的な医薬パックは、医薬梱包産業で周知であるいわゆるブリスターパックである。

有効性
血管新生疾患の抑制は、血管新生を遅くし、又は減弱されるかどうかを測定するあらゆる受容されている方法によって評価される。これは、客観的な症候又は主観的な生理的指標を評価することによるなど、直接的観察及び間接的評価を含む。治療効果は、例えば、新血管新生、微小血管症、血管漏出又は血管浮腫又はこれらのあらゆる組み合わせの安定化、予防又は反転に基づいて評価され得る。眼の血管新生疾患の抑制を評価するための治療効果は、視覚的鋭敏さを安定化又は改善する観点でも定義され得る。

眼の血管新生疾患を治療又は予防する上での特定の組み合わせ療法の有効性を決定する際には、患者は、注射から数日後及び少なくとも１ヵ月後、次の注射の直前に、眼科医によって臨床的にも評価され得る。ＥＴＤＲＳ視覚的鋭敏性、コダクローム写真及びフルオレセイン血管造影も、眼科医による要求に応じて、最初の４ヶ月間、毎月、実施される。

例えば、眼の新血管新生を治療するための組み合わせＶＥＧＦアンタゴニスト療法の有効性を評価するために、眼科学の分野で周知の標準的方法に従って、加齢性黄斑変性に続発した下中心窩脈絡膜新血管新生に罹患した患者において、第一の治療計画のために、第一のＶＥＧＦアンタゴニストの単回又は複数回硝子体内注射を投与した後に、第二の治療計画のために、第二のＶＥＧＦアンタゴニストを投与する研究が実施される。例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）に続発して生じる下中心窩脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）を有する患者は、疾病の進行を予防するために、第一の治療計画の一環として、計１から６回の注射のために、３から６週ごとに、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ又はＡｖａｓｔｉｎの硝子体内注射を受けた後、長期的な抗ＶＥＧＦ維持療法として、６週ごとに、Ｍａｃｕｇｅｎの硝子体内注射を受ける。組み合わせの有効性は、例えば、眼の評価によってモニターされる。治療から３ヶ月後に、安定した視力又は改善された視力を示す患者、例えば、ＥＴＤＲＳチャートにおいて、３行又はそれ以上の視力の改善を示す患者は、効果的な投薬量の組み合わせを受けたとみなされる。

別の例では、加齢性黄斑変性に続発して生じる下中心窩ＣＮＶを有し、及びＥＴＤＲＳチャートにおいて、２０／２００より悪い視覚的鋭敏性を有する患者は、第一の抗ＶＥＧＦ因子の単回硝子体内注射を受ける。出発用量は、硝子体内に１回注射される各アンタゴニスト０．２５ｍｇである。各アンタゴニストの０．５ｍｇ、１、２ｍｇ及び３ｍｇの投薬量も検査される。眼底写真及びフルオレセイン血管造影を用いた完全な眼科的検査も実施される。病変の乾燥が観察されたら、次いで、維持療法として、第二の抗ＶＥＧＦ因子が投与される。第一及び第二のＶＥＧＦアンタゴニストは、１００μＬの送達容量を提供するために、各因子について１ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ又は３０ｍｇ／ｍＬの薬物濃度で供給される。第一の抗ＶＥＧＦ因子の注射から約３ヶ月後、治療の有効性を評価するために視覚的鋭敏性の研究を行う。治療後に、安定した視力又は改善された視力を示す患者、例えば、ＥＴＤＲＳチャートにおいて、３行又はそれ以上の視力の増加を示す患者は、第一の因子の効果的な投薬を受けたとみなされ、第二の抗ＶＥＧＦ因子を用いた維持療法に配置される。第二の抗ＶＥＧＦ因子の維持用量は、約６週ごとに投与され得る。

実施例
抗ＶＥＧＦ抗体（短期療法、汎ＶＥＧＦ阻害）
Ｌｕｃｅｎｔｉｓ^ＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）
抗ＶＥＧＦアプタマー（長期療法、選択的ＶＥＧＦ阻害）
１ｍｇ／９０μＬ、０．３ｍｇ／９０μＬ、０．０３ｍｇ／９０μＬ又は０．００３ｍｇ／９０μＬで、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）（（ＯＳＩ）Ｅｙｅｔｅｃｈ、ＮＹ、ＮＹ）を製剤化し、ブロモブチルゴム製プランジャーストッパーで密封されたＵＳＰＩ型ガラス筒状注射器の中に入れた。注射器は、ゴム針シールド（チップキャップ）及び強固なプラスチック外側シールドを備えた、固定された２７ゲージ針を有する。ストッパー付き注射器を、ホイルの袋の中に詰めた。投与のために、プラスチックのプランジャー棒及びフランジアダプターも搭載されている。これらの要素は、別個のホイルの袋に入れられている。フランジは、場合によって使用され、注射を投与するためには必要とされない。医薬品は防腐剤を含まず、硝子体内注射のみによる単回使用が予定されている。医薬品が濁っており、又は粒子が存在する場合には、使用すべきではない。

活性成分：以下のように製剤化されたペガプタニブナトリウム注射：
・ペガプタニブナトリウム注射０．００３ｍｇの用量を送達するための０．０３４７ｍｇ／ｍｌ溶液
・ペガプタニブナトリウム注射０．０３ｍｇの用量を送達するための０．３４７ｍｇ／ｍｌ溶液
・ペガプタニブナトリウム注射０．３ｍｇの用量を送達するための３．４７ｍｇ／ｍｌ溶液
賦形剤：塩化ナトリウム、ＵＳＰ
第一リン酸ナトリウム、一水和物、ＵＳＰ
第二リン酸ナトリウム、七水和物、ＵＳＰ
水酸化ナトリウム、ＵＳＰ（必要に応じて）
塩酸、ＵＳＰ（必要に応じて）注射用水、ＵＳＰ
調製
医薬品ペガプタニブナトリウムは、単回用途ガラス注射器中に提供された即時使用可能な滅菌溶液である。注射器の内容物の投与は、可動式プラスチックプランジャー棒を、注射器の筒の内側のゴムストッパーに取り付けることを含む。次いで、製品の投与を可能とするために、ゴムのエンドキャップを除去する。場合によって使用されるフランジは、投与のために提供される。

治療計画及び期間
短期療法
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）に続発して起きた下中心窩脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）を有する患者は、第一の治療計画の一環として、計１から６回の注射に対して、３から６週ごとに、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ又はＡｖａｓｔｉｎの硝子体内注射を受ける。

長期療法
短期療法の完了に引き続き、６週ごとに、９０μＬ（名目送達容量）硝子体内注射として、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）を投与する。

硝子体内注射
十分な瞳孔の散大を達成するために、研究対象の眼に、１％Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ及び２．５％フェニルフリンを局所適用する。５０％生理的食塩水で希釈された１０％ポビドン−ヨウ素（ベタジン）溶液の２から３滴を眼の中に滴下させる。ヨウ素に対するアレルギーが生じた場合には、局所的抗生物質の一滴を、ヨウ素に代えて、結膜上に載せる。エピネフリンを含まない２％キシロカイン０．５ｍＬの結膜下注射は、全ての患者において、下側頭クアドラント（無水晶体／偽水晶体患者では、縁から３．０ないし３．５ｍｍ、有水晶体患者では、３．５ないし４．０ｍ）中に投与される。

実験者は、２つの注射前処置の１つを選択するように指示を受ける（オプションＡ及びＢ、以下）。ヨウ素アレルギーを有する患者については、実験者は、オプションＡに従う必要があり、ポビドンヨウ素の代わりに、抗生物質の追加の一滴を注入する。

Ａ．処置前に３日間、局所オフロキサシン、レボフロキサシン又は同等の抗微生物効果を有する抗生物質の適を投与した後、処置の直前に、抗生物質の３滴を連続投与し、５％ポビドンヨウ素の数的を投与する。

Ｂ．抗生物質の３滴を連続投与し、処置の直前に、少なくとも溶液１０ｃｃを用いて、脳弓及び涙丘に５％ポビドンヨウ素を流す。

処置の前に、処置前１時間以内に、少なくとも５分の間隔を隔てて、局所的な抗生物質の滴を３回投与する。

オプションＡに基づいて準備された患者については、抗生物質の最後の滴の後に、実験者は、眼内に５％ポビドンヨウ素の２滴又は３滴を注入する。無菌手袋及び５％ポビドンヨウ素中に浸された綿棒塗布器を用いて、実験者は、まぶだ、まぶたの上端及び下端並びに涙丘を、３回こする。ヨウ素に対してアレルギーが発生した場合には、ポビドンヨウ素に代えて、抗生物質の追加の１滴を注入する。

オプションＢの下で準備された患者については、５％ポビドンヨウ素洗浄を行うために、実験者は、抗生物質の最後の投薬から少なくとも５分待ち、機械的な創傷清拭を行うために、血管カテーテルに接続された注射器からの強制された流れを用いて、５％ポビドンヨウ素の少なくとも１０ｃｃで脳弓及び涙丘を洗浄する。

実験者は、手袋を交換した後、実験者は、まつげをまぶたに固定する覆い布を用いて眼領域を隔離し、治療が予定される部位の眼表面上に、５％ポビドンヨウ素の１滴又は２滴を加えた。全ての注射に対して、まぶたスペキュラムが使用される。

均等物
本発明の範囲及び精神を逸脱せずに、本発明の記載されている方法及び系の様々な修飾及び変形が当業者に自明である。具体的な望ましい実施形態に関して本発明を記載してきたが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような具体的実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は定型的な実験操作のみを用いて均等物を究明することが可能である。このような均等物は、本発明の範囲に包含されるものとする。

Claims (24)

1. （ａ）全てのＶＥＧＦイソフォームを阻害するのに有効な量で、第一の抗ＶＥＧＦ因子を投与すること；
   （ｂ）ＶＥＧＦ_１６５を選択的に阻害するのに有効な量で、第二の抗ＶＥＧＦ因子を投与すること；
   を含む、患者における血管新生疾患を治療する方法。
2. 前記血管新生疾患が眼の血管新生疾患である、請求項１に記載の方法。
3. 前記疾患が黄斑変性である、請求項２に記載の方法。
4. 前記第一の抗ＶＥＧＦ因子が、浮腫が存在する間に投与される、請求項２に記載の方法。
5. 前記第二の抗ＶＥＧＦ因子が、第一の抗ＶＥＧＦ因子に対する応答が観察された後に投与される、請求項４に記載の方法。
6. 前記第一の抗ＶＥＧＦ因子が抗体又は抗体断片を含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記第一の抗ＶＥＧＦ因子がラニビズマブ又はベバシズマブを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第二の抗ＶＥＧＦ因子がアプタマーを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記アプタマーがペガプタニブを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記疾患が、虚血性網膜症、光彩新血管新生、眼内新血管新生、加齢性黄斑変性、角膜新血管新生、網膜の新血管新生、脈絡膜の新血管新生、糖尿病性網膜虚血又は増殖性糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
11. 前記血管新生疾患が、癌、乾癬又は関節リウマチからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
12. （ａ）第一の治療期間に、汎ＶＥＧＦＡ阻害剤を投与すること；及び
    （ｂ）第二の治療期間に、選択的ＶＥＧＦ阻害剤を投与すること；
    を含む、血管新生疾患を治療する方法。
13. 前記選択的ＶＥＧＦ阻害剤がＶＥＧＦ_１６５を選択的に阻害する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記血管新生疾患が、虚血性網膜症、光彩新血管新生、眼内新血管新生、加齢性黄斑変性、角膜新血管新生、網膜の新血管新生、脈絡膜の新血管新生、糖尿病性網膜虚血、増殖性糖尿病性網膜症、癌、関節リウマチ又は乾癬からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記汎ＶＥＧＦＡ阻害剤が、３から６週ごとに投与される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記選択的ＶＥＧＦ阻害剤が、３から１２週ごとに投与される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第一の治療期間が３から３６週である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第二の治療期間が長期的な維持療法である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記疾患が黄斑変性である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記汎ＶＥＧＦＡ阻害剤が抗体又は抗体断片を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記汎ＶＥＧＦＡ阻害剤がラニビズマブ又はベバシズマブを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記選択的ＶＥＧＦ阻害剤がアプタマーを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記選択的ＶＥＧＦ阻害剤がペガプタニブを含む、請求項２２に記載の方法。
24. ペガプタニブ約０．００３から３．０ｍｇが、各投与中に投与される、請求項２３に記載の方法。