JP2009520982A

JP2009520982A - バイオセンサ装置

Info

Publication number: JP2009520982A
Application number: JP2008546812A
Authority: JP
Inventors: トーンデルヤコブエムジェイデン; ヘンドリクアールスタペルト; リヒャルドジェイエムスヒルデルス
Original assignee: Koninklijke Philips NV; Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2009-05-28
Also published as: WO2007072444A3; US20080311679A1; CN101346627A; WO2007072444A2; EP1966606A2

Abstract

本発明は、関心ある試料からのターゲット分子を結合することができるバイオ認識素子を有する作動素子を備えるバイオセンサ装置に関し、前記作動素子は、ポリマ材料を有し、第１位置と第２位置との間で作動手段により作動させられ得る。

Description

本発明は、バイオセンサ装置に関し、試料の関心あるターゲット分子を測定する方法に関する。

バイオセンサは、まさにその性質から非常に高感度でなければならず、すなわち、好ましくは１分子／１μｍ^２よりもよく、非常に低い表面被覆のターゲットを検出することができなければならない。関心ある試料が、関心あるターゲット分子を結合することができるプローブを含むバイオ認識表面を有するバイオセンサと接触される場合、適切なインキュベーション環境の下のターゲット分子がプローブに結合するであろう。バイオセンサにおいて使用されるもののような、大抵の現行のバイオ認識表面は、移動されない。これらの静的センサは、フラット（R．Ekins，J．Clin．Lig Assay，1996，19(2)，146-156，US5432099）か、突起を含む（WO2005022151，US2005100947）か、又は多孔性（Benoit et al.,_Anal.Chem_73，2412-2420（2001）；Kessler et al.,J．Clin．Microbiol，2004，42（5），2173-2185）である。最後の場合において、分析されるべき流体は、基板を通じて送り出される。

テストの最大感度にとって、所与のインキュベーション時間においてできる限り多くのターゲット分子をバイオ認識表面の素子に結合することが重要である。ターゲットの基板への吸着率は、表面の「反応度」又は親和性、及び表面に対するターゲット分子の質量輸送特性に依存する。結合率は、r(on)=k(on)[T][S]により記載され得、ここで[T]はターゲット濃度に等しく、[S]は表面プローブ濃度に等しく、k(on)は結合定数に等しい。質量輸送特性は、拡散率r(diff)=D*d[T]/dx及び対流率 r(conv)=v*delta*omega*[T]により決定される。ここで、DはTの拡散係数であり、deltaは空乏層の厚さ、vはフローレート、omegaはセンサ幅である。吸着率は、結合率が質量輸送率よりも高い場合、すなわち空乏層が十分に速く補充されず、プローブが測定されるべき試料のターゲット分子と十分な接続をすることができない場合、拡散制限的となる。ターゲットに対する表面親和性が高い（k(on)が大きい）か、又は（生理的又は臨床的試料と通常同様に）低い濃度のターゲットが関心ある試料にある場合、ターゲット分子が表面に結合するレートは、拡散制限的となるであろう。しかしながら、バイオセンサは、吸着動力学が反応制限的となる場合、最大の性能及び速度に達する。

このような装置は、中でも米国特許ＵＳ４９５６１４９から知られており、ここでは、互いに取り付けられたセンサ及び圧電アクチュエータを有するバイオセンサが記載される。センサは、膜内で動かなくされるとともに、電界効果トランジスタのゲート電極に位置されるブドウ糖酸化酵素により形成されるグルコースセンサである。センサは、検出されることが可能である物質を測定するため試料（この場合グルコース）内に浸される。圧電素子を作動させることにより、試料は攪拌され、信号出力は、攪拌されていない試料と比較して増加される。しかしながら、この装置においてセンサ及び作動素子は、２つの別個の素子である。動作される場合、圧電アクチュエータは、流体中を移動しないが、検体及び／又は検出体を含む流体のみが移動する。これは、小型化が高速で進む分野において、異なるアプローチであり、技術的に不利である。これより、例えば米国特許ＵＳ６０６８７５１に記載されるように、すべての部品がマイクロ流体系に組み込まれ得ることが好ましい。

本発明の目的は、改善されたバイオセンサを提供することであり、ここでセンサの吸着動力学は、かなり増加され、好ましくは拡散限界を超える。本発明の更なる目的は、検出されるべきターゲット分子を実際に取り込むことができる一体化されたバイオ認識素子を含むアクチュエータを提供することである。

本願発明者は、バイオ認識素子と組み合わされた（ポリマ）作動素子を含むバイオセンサが使用されるとき、このことが達成され得ることを見出した。したがって、センサの作動素子は、関心ある試料からのターゲット分子を結合することができるアレイのバイオ認識素子を含む。

第１の態様において、本発明は、関心ある試料からのターゲット分子を結合することができるバイオ認識素子を含む作動素子を有するバイオセンサ装置に関し、ここで作動素子は、ポリマ材料を有し、第１位置と第２位置との間で作動手段により作動させられ得る。

更なる態様において、本発明は、本発明によるバイオセンサを使用するステップを含む、関心ある試料においてターゲット分子を検出する方法に関する。

本発明のこれら及び他の態様は、以下に記載される実施例から明らかであり、該実施例を参照して明確にされるであろう。

図１は、本発明によるバイオセンサの概略的な側面図を示す。図１（ａ）は、バイオ認識表面素子（３）を有する第１（作動されていない）位置において、作動する（ポリマ）センサ素子（２）を有するバイオセンサ（１）の一実施例を開示する。様々なターゲット分子（４）を有する試料のフロー（５）と接触する場合、作動素子２は、第１位置（ａ）から第２（作動された）位置（ｂ）に移動させられ得、これにより、改善された吸着動力学、すなわち拡散制限的である代わりに反応制限的となることを通じてセンサの改善された感度を得るとともに、よりよい洗浄効率を得る。

作動素子は、バイオ認識表面が取り付けられるフラップ又は梁状の可撓性材料からなり得る。材料は、好ましくは可撓性ポリマである。静止状態では、フラップは水平位置にある。フラップは、ある刺激、例えば温度、光、電場、又は（電）磁場により運動を設定され得る。好ましくは磁場、非常に好ましくは電磁場が使用される。センサが作動される場合、フラップは、流体試料との改善された接触をもたらすため、第２位置に移動させられ、表面は、ターゲット分子のために流体中を探ることができる。フラップを第２位置に移動させることにより、表面に対する拡散長が減少し、吸着動力学が作動運動により向上されると、流体試料と活発な接触をする領域がかなり増加する。運動は、流体試料との接触を更に改善するため、一つの測定の間、繰り返され得る。

したがって、本発明の第１の態様において、関心ある試料からのターゲット分子を結合することができるバイオ認識素子を有する作動素子を備えたバイオセンサ装置が設けられ、該作動素子は、第１位置と第２位置との間で作動手段により作動され得る。活性化素子は、好ましくは可逆的に取り付けられ得る。ある実施例において、作動素子は、ポリマ作動素子を有し、好ましくはポリマ作動素子からなる。このような材料は、従来技術において知られ、例えばゴム、エラストマ（例えばポリシロキサン）、熱可塑性エラストマ（例えばポリエステル、ポリエーテルエステル、又はポリエーテルウレタン）、架橋ポリマ、及び（ヒドロ）ゲル、フォトポリマ、例えばメゾスコピックなオーダーの素子を備えた／なしのポリ（メタ）アクリレートである。他の例は、積層された導電性且つポリマのフィルム、及び分散した磁気（ナノ）粒子（例えばＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子）を備えたポリマ材料の組合せからなる合成材料構造である。（例えばD.J.Broer et al．Smart Materials．Chapter 4 in True Visions: Tales on the Realization of Ambient Intelligence, ed．by Emile Aarts and Jose Encarnacao，Springer Verlag，2005 or G.N.Mol et al．Adv．Funct．Mat._15，1155-1159(2005)を参照されたい。）ポリマ作動微小素子は、出願人の同時継続特許出願 "Microfluidic system based on actuator elements" にも記載される。これらの材料は、特定の刺激の下で著しく変形させられることが知られ、したがって好ましくは作動ポリマ材料として役立ち得る。ポリマ作動素子を使用することにより、より大きな形状の変化が達成され得、このことはより柔軟な設計を可能にする。作動素子にバイオ認識素子を組み込むことは、圧電素子のような外部アクチュエータの必要性を取り除く。

バイオ認識素子の表面の層は、上に結合剤（以下プローブと称す）を備える単分子層又は複分子層であり得る。バイオ認識素子は、例えばビーズを作動素子に接合することにより作動素子に取り付けられる微小ビーズも有し得る。好ましくは、ビーズは、ポリマビーズである。代替として、バイオ認識素子は、シート又はプレートの形態で作動素子に取り付けられ得、結合剤（又はプローブ）のドットのアレイで点在される。プローブは、ターゲット分子を可逆又は不可逆的に結合するように設計され得る。

ある好ましい実施例において、バイオ認識素子は多孔性である。ある実施例において、プローブは、多孔性素子の孔に位置される。多孔性バイオ認識素子の使用は、この分子サイズに依存してプローブが支持体の孔に担持され得、濃度が決定されるべきターゲット分子への支持体の露出は、孔の配置により同様に影響され得る。通常、試料のフローの向きと実質的に垂直である第２位置に、作動素子が作動させられる場合、流体は、多孔性素子を通じて流れるであろう。検出されるべきターゲット分子は、多孔性素子の孔に容易に取り込まれ得る。

表面又は孔は、特定のターゲット分子取り込みのためにプローブを備え得る。このようなプローブは、中でも、例えばAffymetrix，Agilent，GE healthcare，Metrigenix，Pamgene，Dow Corning等のもののようなバイオテクノロジのマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）から知られる方法により、表面上又は孔の内部に設けられ得る。通常、このようなプローブは、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ若しくはＲＮＡシーケンス又はこれらの組合せ、細胞受容体、酵素、蛋白質、（オリゴ若しくはポリ）ペプチド、キレート、アプタマ、ナノボディと反応し得る試薬を含むグループから選択され得る。代替として、作動素子材料に依存して、プローブに対して高い結合能力を有する材料が選択又は合成され得る。例えば、ＤＮＡプローブを結合することができる正に帯電された材料が使用され得る。代替として、プローブ分子を基板に対して化学的に固定するために使用され得る、特定の反応基（例えばカルボキシル酸、エポキシド、アミン、スルフヒドリル等）を有する材料が使用され得る。更に代替として、プローブに対する高い結合性能を有する作動材料に被覆が適用され得、これにより、例えば作動特性（バルク材料）を特定の表面特性（被覆）と組み合わせる。これらの材料、該材料の化学物質及び合成方法は、この目的のための従来技術において広く知られ、当業者は、容易にこの中から選択することができる。

使用されるプローブは、異なる特異度のプローブ、すなわち異なるターゲット分子に特化したプローブであり得るか、又はこれらの２又はそれより多くは、同じ特異度であるが、異なる親和性であるプローブ、すなわち同じターゲット分子に特化しているが、反応に対して異なる平衡定数Ｋを有するプローブであり得る。後者の代替は、未知の試料において分析されるべき検体の濃度が、かなりの範囲、例えば２又は３桁に渡って変化し得る場合、例えば０．１乃至１００又はそれより多くのＩＵ／ｍｌの範囲で変化し得る、妊娠中の女性の尿のＨＣＧ測定の場合に、特に役立つ。

使用されるプローブは、好ましくは抗体、又は抗体の機能部分、より好ましくはモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体の機能部分である。幅広い種類の材料の生理的流体に対するモノクローナル抗体は、商業的に利用可能であるか、又は既知の技術により作られ得る。使用される抗体は、例えば１０の８乗又は１０の９乗リットル／モルより高い、例えば１０の１０乗又は１０の１１乗リットル／モルのオーダーの従来の親和定数を示し得るが、１０の１２乗乃至１０の１３乗リットル／モルの親和定数をもつ高い親和性の抗体も使用され得る。本発明は、ラベル付けされていないこのようなプローブとともに使用され得るが、これに制限されない。

プローブは、例えば支持体の上の各々の間隔を隔てられた位置を１ｍｍ^２のスポットにおいて、例えば０．５マイクロリットルの小さな滴の形態の結合剤の溶液と接触させ、前記滴を洗い流す前の期間、接触を維持することを可能にすることにより、既知の態様又は管のような支持体の上に被覆するために従来使用される態様のいずれかにおいて、バイオ認識素子に適用され得る。他のバイオプリント又はエンボス技術は、同様に適用され得る。小さな滴の体積は、例えばインクジェット印刷に使用する場合に適用され得る。数ピコリットル乃至ナノリットルの液滴の体積が現行の技術であり、その結果、通常１０乃至５００μｍの範囲のスポット直径となり、したがって、小さな（作動）基板において、より多くの（異なる）取り込みスポットを可能にする。

ターゲット分子は、好ましくは、ＤＮＡ，ＲＮＡ，蛋白質、ペプチド、抗体、細胞、電解質、酵素、薬剤活性化合物、有機分子、又はこれらの代謝体を含むグループから選択される。検出されるべき所望のターゲット分子の選択に基づいて、該検出のためにプローブが設計され得る。例えば体液における抗体のような化合物の存在、不存在、又は量を検出するため、プローブの設計は、抗体に結合する抗原又は抗原の断片に基づく。特定のＤＮＡシーケンスを検出する場合、例えば遺伝性疾患の場合において、相補的なヌクレオチドシーケンスは、プローブの形態で設計され得、本発明の装置において使用され得る。

本発明は、体液、例えば血液、血清、唾液、又は尿のような人間の体液に存在するターゲット分子の分析に使用され得る。これらは、動物、植物、若しくは食物の起源から、又は汚水、生理的廃棄物、洗浄液等からもたらされ得る。これらは、流体試料において自然に存在するか、又は薬物、毒、重金属等のように人工的に存在し得る非常に様々なホルモン、蛋白質、酵素、又は他の検体の分析に使用され得る。試料は、バイオセンサと接触する前に事前に処理され得、すなわちある分析、例えば免疫的分析又はＰＣＲ分析が試料において実行され得るか、又は試料は、バイオセンサと接触する前に孤立又は浄化されなければならない。この実施例において、バイオセンサは、所与の分析に対する検出プラットホームとして役立つ。

例えば本発明は、ＦＳＨ，ＬＨ，ＨＣＧ，プロラクチンのような妊娠及び生殖に関する様々なホルモン、及びステロイドホルモン（例えばプロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、及びアンドロステンジオン）又は例えばコルチゾール、ＡＣＴＨ及びアルドステロンのような副腎の下垂体軸のホルモン、又は甲状腺関連のホルモン、例えばＴ４，Ｔ３及びＴＳＨ、及びこれらの結合蛋白質ＴＢＧ、又はウィルス、例えば肝炎、ＡＩＤＳ又はヘルペスウィルス、又はブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、淋菌、及び腸球菌のようなバクテリア、又はカンジダ菌のような菌類若しくはＡＦＰ若しくはＣＥＡのような腫瘍関連のペプチド、アスリートの能力を違法に向上させるものとして禁止されるもののような薬物、又は食物汚染物質を定量的に分析する装置を提供するために使用され得る。各々の場合において使用されるプローブは、（試料における他のものと比較して）検査されるべきターゲット分子特有のものであり、モノクローナル抗体又はこれのための単一の鎖ＤＮＡプローブであり得る。

ある実施例において、流体は、例えばバッファ又はカオトロピック剤からもたらされる洗浄流体であり得、洗浄剤を含み得る。洗浄は、作動可能な表面が、上記ターゲット分子の検出と同じ理由で使用される場合、より効果的に実施され得る。洗浄は、好ましくは、非特異的に吸着された分子から、又は分子を含む流体からの干渉により生じ得るバックグラウンド信号を除去または低減するために含まれる。

センサは、好ましくは、表面感知性検出技術に頼る検出器を更に有し得る。この例は、（巨大）磁気抵抗（ＧＭＲ）センサ、エバネッセント波検出（表面プラズモン共鳴）又は励起、又はエバネッセント波励起（導波路蛍光発光）インピーダンス法（impedimetric）センサ、発光分子又は反射分子（例えば金属）又はインターフェロメトリック層構造の表面結合に基づく光学センサの使用を含む。

センサにおいて、未知の濃度のターゲット分子の試料におけるプローブの占有率を表す信号は、既知の濃度の同じターゲット分子を含む標準試料から得られる用量反応曲線を参照することにより較正され得る。このような標準試料は、ターゲット分子の各々が標準試料のいくつかに存在する場合、ターゲット分子すべてを一緒に含む必要はない。

検出器は、検出技術の特徴に依存して、好ましくはバイオセンサ（１）内又はこの近傍に位置される。信号の読み出しは、検出技術に依存して作動基板の下又は上から生じ得る。例えばＧＭＲセンサを使用する場合、ターゲット分子がバイオ認識分子の表面又は孔に吸着された後、アクチュエータが吸着されたターゲット分子を検出するための第１位置に戻ることが好ましい。使用される検出技術に依存して、作動可能な素子の大きさ又はこの表面は、変化し得る。例えばＧＭＲセンサの場合、ポリメリックアクチュエータの厚さは、好ましくは約０．２乃至約５μｍであり得る。エバネッセント波センサの場合において、通常約０．１乃至１μｍのアクチュエータが使用され得、一方インピーダンス法センサは、０．２μｍより薄いことを必要とし得る。上から読み出し及び励起がされる、例えば伝搬波を備える発光分子の励起、及び同じ光路で発光を検出することがなされる場合、ポリマ層の厚さが、好ましくはセットアップの焦点深度をカバーするようにされるべきである。これは、作動運動により生じる置換が、光学系の焦点深度内にあるように設計され得る。

本発明の装置は、好ましくはマイクロ流体において用途を見出し、現在記載されたアプローチは、表面感知性検出及び流水式の基板を有する側方フローマイクロ流体の組合せを可能にする。

本発明の好ましい実施例において、アクチュエータは、複数の（アレイとも称される）バイオ認識素子を有し、各々のバイオ認識素子は、異なるターゲット分子を好ましくは独立して結合することができ、これにより、１つの試料における複数の異なるターゲット分子を同時に識別することができる。代替の実施例において、様々なターゲット分子に対してバイオ認識素子を担持するアクチュエータのセットは、一度の実行で様々なターゲット分子を取り込むため、並んで配置されるか、又は試料のフローの中で連続的に配置される。

更なる態様において、本発明は、関心ある試料におけるターゲット分子を検出する方法に関し、該方法は、
- 上で規定されるように、関心ある試料をバイオセンサと実質的に接触させるステップと、
- 第１位置から第２位置にポリマ作動素子を作動させるステップと、
- ターゲット分子がバイオ認識素子に結合することを可能にするステップと、
- オプションとして第２位置から第１位置に作動素子を作動させるステップと、
- バイオ認識素子におけるターゲット分子の存在、不存在又は量を検出するステップと、
を有する。

本発明の装置は、好ましくは分子診断、環境モニタリング、及びドラッグスクリーニングから選択される好ましい分野におけるバイオセンサとしての用途を見出す。

図１は、本発明によるバイオセンサの概略的な側面図である。図１（ａ）は、静止位置におけるセンサの定型化された図であり、該位置は、正常動作の下で、開始位置と、取り込まれたターゲット分子の検出が行われる位置とになり得る。図１（ｂ）は、試料流体のフロー及びターゲット分子の活発な取り込みのための垂直な作動位置におけるセンサの定型化された図である。この状況において検出が依然として行われ得ることが観測される。例えばセットアップの焦点深度が作動素子の移動の合計よりも大きい場合の光学検出である。

Claims

関心ある試料からのターゲット分子を結合することができるバイオ認識素子を有する作動素子を備えたバイオセンサ装置であって、該作動素子は、ポリマ材料を有するとともに、第１位置と第２位置との間で作動手段により作動され得る、バイオセンサ装置。
前記バイオ認識素子は、ターゲット分子を結合することができる表面を有する、請求項１に記載のバイオセンサ装置。
前記作動素子は、磁界及び／若しくは電界、光又は温度により作動される、請求項１又は２に記載のバイオセンサ装置。
前記センサが、表面感知性検出又は励起技術を使用した検出器を更に有する、請求項１乃至３の何れか一項に記載のバイオセンサ装置。
前記作動素子が前記第１位置にある場合、前記ターゲット分子の存在、不存在、又は量が測定され得るように、前記検出器が前記作動素子と相対して配置される、請求項１乃至４の何れか一項に記載のバイオセンサ装置。
前記ターゲット分子がＤＮＡ，ＲＮＡ，蛋白質、ペプチド、抗体、電解質、薬剤活性化合物、有機分子、又はこれらの代謝体を含むグループから選択される、請求項１乃至５の何れか一項に記載のバイオセンサ装置。
前記作動素子が、複数のバイオ認識素子を有し、各々のバイオ認識素子は、異なるターゲット分子を結合することができ、これにより、試料において同時に複数の異なるターゲット分子を同時に識別することができる、請求項１乃至６の何れか一項に記載のバイオセンサ装置。
前記関心ある試料が、人間から得られ、例えば唾液、痰、血液、糞、尿、動物、植物、食物、汚水、生理的廃棄物、洗浄流体起源である、請求項１乃至７の何れか一項に記載のバイオセンサ装置。
関心ある試料においてターゲット分子を検出する方法であって、
‐請求項１乃至８に規定されるように、前記関心ある試料を前記バイオセンサと接触させるステップと、
‐前記第１位置から前記第２位置に前記作動素子を作動させるステップと、
‐前記ターゲット分子が前記バイオ認識素子に結合することを可能にするステップと、
‐前記バイオ認識素子における前記ターゲット分子の前記存在、不存在、又は量を検出するステップと、
を有する方法。