JP2009263341A

JP2009263341A - 光学活性ニペコチン酸エステル誘導体の製造法

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Publication number: JP2009263341A
Application number: JP2009062860A
Authority: JP
Inventors: Naoaki Taoka; 直明田岡
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2008-03-24
Filing date: 2009-03-16
Publication date: 2009-11-12

Abstract

【課題】医薬品中間体として有用な光学活性ニペコチン酸エステル誘導体をそのラセミ化合物から簡便に製造できる方法を提供する。
【解決手段】ラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をR体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いて、アシル供与体存在下、ラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をＲ体選択的にアシル化した後、反応混合物から残存する（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体を単離することにより、光学活性ニペコチン酸エステル誘導体を製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性ニペコチン酸エステル誘導体、とりわけ（Ｓ）−ニペコチン酸エチルの製造法に関する。

従来、光学活性ニペコチン酸エステル誘導体の製造法としては、以下の様な方法が知られていた。

１）（±）−ニペコチン酸エチルをジベンゾイル−（Ｌ）−酒石酸を用いて光学分割することにより、（Ｓ）−ニペコチン酸エチルを収率３５％にて得る方法（特許文献１）。

２）（±）−ニペコチン酸エチルを（Ｒ）−カンファースルホン酸を用いて光学分割することにより、（Ｓ）−ニペコチン酸エチルを収率１０％にて得る方法（非特許文献１）。

しかしながら、上記の（Ｓ）−ニペコチン酸エチルを得る為には高価な光学分割剤が必要であること、および、収率が低いこと等、工業的製法としては改善すべき課題を有していた。

国際公開公報ＷＯ２００２０６８３９１号

Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２（１７），３９５５−４００４

上記に鑑み、本発明の目的は、医薬品の中間体として有用な光学活性ニペコチン酸エステル誘導体、中でも（Ｓ）−ニペコチン酸エチルをそのラセミ化合物から簡便に製造する方法を提供することにある。

本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、ラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をＲ体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いて、アシル基供与体（Ａｃｙｌ−ｄｏｎｏｒ）存在下、ラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をＲ体選択的にアシル化し、残存する高い光学純度を有する（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体を取得する方法、また、ラセミの２級アミンを立体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いて、マロン酸ジエステル存在下、ラセミの２級アミンのアミノ基を立体選択的にアシル化し、残存する高い光学純度を有する光学活性アミンを取得する方法を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、一般式（１）；

（式中、Ｒ₁は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数５〜１５の置換基を有しても良いアリール基、又は炭素数６〜１６の置換基を有しても良いアラルキル基を表す。）で表されるラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をR体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いて、アシル基供与体存在下、前記一般式（１）で表されるラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をＲ体選択的にアシル化し、一般式（２）；

（式中、Ｒ₁は前記と同じ。Ｒ₂は炭素数１〜１０の置換基を有しても良いアルキル基を表す。）で表される（Ｒ）−アシルニペコチン酸エステル誘導体、及び残存する一般式（３）；

（式中、Ｒ₁は前記と同じ。）で表される（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体の混合物に変換することを特徴とする、前記一般式（３）で表される（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体の製造法である。

また、更に反応混合物から前記一般式（３）で表される（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体を単離する工程を含むことを特徴とする、上記の製造法である。

また、本発明は、ラセミの２級アミンを立体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いて、マロン酸ジエステル存在下、ラセミの２級アミンのアミノ基を立体選択的にアシル化し、光学活性マロン酸アミド、及び残存する光学活性アミンの混合物に変換することを特徴とする、光学活性マロン酸アミド、および、光学活性アミンの製造法である。

また、更に反応混合物から前記光学活性アミンを単離する工程を含むことを特徴とする、上記の製造法である。

また、本発明は、一般式（８）；

（式中、Ｘはメチレン基、アミノ基、または酸素原子を表す。Ｒ₄はエステル基、カルボキシアミド基、ニトリル基、保護されていても良いアミノ基、または保護されても良い水酸基を表す。Ｒ₇は置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基を表す。ｎは０または１を表す。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される化合物を提供する。

本発明の方法により、医薬品中間体として有用な光学活性２級アミン、とりわけ光学活性ニペコチン酸エステル誘導体をそのラセミ化合物から簡便に製造することができる。

以下に本発明を詳細に説明する。

まず、本発明に関わる化合物について説明する。前記一般式（１）、（２）、（３）、（８）、下記一般式（４）；

、下記式（５）；

、下記式（６）；

、及び、下記式（７）；

で表される化合物において、Ｒ₁としては炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数５〜１５の置換基を有しても良いアリール基、又は炭素数６〜１６の置換基を有しても良いアラルキル基が挙げられる。例えば、アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デカン基等が挙げられる。アリール基としては、フェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等が挙げられる。上記のなかでもＲ₁として好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、又はｎ−ペンチル基であり、より好ましくは、エチル基である。上記のＲ₁を有する化合物（１）は工業的に入手可能、或いは入手可能な原料から容易に合成できる。例えば、ニペコチン酸を、酸触媒存在下にエタノールと反応することにより、ニペコチン酸エチルを容易に入手／調製することができる。

また、Ｒ₂としては炭素数１〜１０の置換基を有しても良いアルキル基が挙げられる。例えば、炭素数１〜１０の置換基を有しても良いアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デカン基、クロロメチル基、シアノメチル基、メトキシメチル基、メチルオキシカルボニルメチル基、エチルオキシカルボニルメチル基等が挙げられる。上記のなかでもＲ₂として好ましくは、メチル基、エチルオキシカルボニルメチル基であり、より好ましくは、エチルオキシカルボニルメチル基である。

また、Ｒ₃としては炭素数１〜１０の置換基を有しても良いアルキル基、炭素数５〜１５の置換基を有しても良いアリール基、又は炭素数６〜１６の置換基を有しても良いアラルキル基が挙げられる。例えば、炭素数１〜１０の置換基を有しても良いアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デカン基等が挙げられる。炭素数５〜１５の置換基を有しても良いアリール基としては、フェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基等が挙げられる。炭素数６〜１６の置換基を有しても良いアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等が挙げられる。上記のなかでもＲ₃として好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であり、より好ましくは、エチル基である。

また、Ｒ₄としてはエステル基、カルボキシアミド基、ニトリル基、保護されていても良いアミノ基、または保護されても良い水酸基が挙げられる。例えば、エステル基としては、アルキルエステル基、ベンジルエステル基等が挙げられ、好ましくは、メチルエステル基、エチルエステル基が挙げられる。

また、Ｒ₅としては置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基、置換基を有していても良い炭素数６〜１６のアラルキル基、アルキルアミノ基、アルコキシ基が挙げられ、Ｒ₆と結合して環を形成していても良い。例えば、置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デカン基等が挙げられる。置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基としては、フェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基等が挙げられる。置換基を有していても良い炭素数６〜１６のアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等が挙げられる。アルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基等が挙げられる。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基等が挙げられる。

また、Ｒ₆としては置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基、置換基を有していても良い炭素数６〜１６のアラルキル基、アルキルアミノ基、アルコキシ基が挙げられ、Ｒ₅と結合して環を形成していても良い。例えば、置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デカン基等が挙げられる。置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基としては、フェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基等が挙げられる。置換基を有していても良い炭素数６〜１６のアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等が挙げられる。

また、上記のＲ₅とＲ₆とは結合して環を形成しても良く、例えば、ピロリジンなどの５員環、ピペリジン、ピペラジン、モルホリンなどの６員環を形成しても良い。

また、Ｒ₇としては、置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられる。例えば、置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デカン基等が挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基が挙げられる。

また、Ｘとしてはメチレン基、アミノ基、または酸素原子などが挙げられ、好ましくは、メチレン基である。

ｎは０または１を表す。

次に本発明における光学活性２級アミン、中でも前記一般式（２）で表される、（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体の製造法について説明する。

前記酵素を用いて、前記一般式（４）で表されるアシル基供与体存在下、前記一般式（１）で表されるラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をＲ体選択的にアシル化した後、反応混合物から（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体を単離することにより、（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体を製造することができる。本発明において、上記Ｒ体選択的アシル化反応は、実質的に加水分解が起こらない条件下で行われる。例えば、反応系に水が存在する場合には、アシル基供与体の加水分解反応が進行してしまうので、上記アシル化反応は水を含まない溶媒か、又は、極めて微量しか含まない溶媒の存在下で行うのが良い。また、アシル化反応の進行に伴い、アシル基供与体からアルコールが副生する。反応系にアルコールが存在する場合には、アシル基供与体とアルコールとのエステル交換反応により、上記アシル化反応の進行が阻害されることから、蒸留操作等により反応系から副生したアルコールを除くことが好ましい。

ここで、「酵素」とは、前記Ｒ体選択的アシル化活性を有する酵素自体はもちろんのこと、前記活性を有する微生物の培養物およびその処理物も含まれる。Ｒ体選択的アシル化活性を有する酵素をコードする遺伝子を含んでなる形質転換体もこれに含まれる。「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥微生物菌体、アセトン乾燥微生物菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。ニペコチン酸エステル誘導体のＲ体選択的アシル化反応を触媒する活性が残存する限りは本発明に用いることができる。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、担体結合法、架橋法、包括法等）で行うことができる。

前記酵素としては、特に限定されず、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ又はプロテアーゼ等の加水分解酵素を挙げることができ、好ましくは、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、及びサーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する加水分解酵素、より好ましくは、アルカリゲネス・スピーシズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ）、キャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓ）、シュードモナス・スピ−シーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）、シュードモナス・スツッチェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、リゾムコール・メイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｅｉｈｅｉ）、及びサーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）に属する微生物に由来する加水分解酵素、特に好ましくはキャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）に属する微生物に由来する加水分解酵素である。また、前記キャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）に属する微生物に由来する固定化酵素としては、「Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５」（ノボザイム社製）等を挙げることができる。

前記アシル基供与体としては、例えば、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、酪酸エチル、ヘキサン酸エチル等の脂肪族アルキルカルボン酸エステル；クロロ酢酸エチル、シアノ酢酸エチル、メトキシ酢酸メチル、マロン酸ジエチル、マロン酸ジメチル等の置換基を有するアルキルカルボン酸エステルが挙げられ、好ましくはマロン酸ジエチルである。アシル基供与体の使用量は、特に制限されないが、普通、基質に対するモル比として、下限０．５、好ましくは０．６、より好ましくは０．７であり、また、上限は特に制限されないが、普通、上限１００、好ましくは１０、より好ましくは２、さらに好ましくは１である。

本反応に使用できる溶媒としては、前記酵素を失活させないものであれば特に限定されず、例えば、ヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素系溶剤；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶剤；アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶剤；酢酸メチル、酢酸エチル、酪酸エチル、安息香酸エチル等のエステル系溶剤；塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン系溶剤；ジメチルホルムアミド、アセトアミド、ホルムアミド、アセトニトリル、プロピオニトリル等の含窒素系溶剤；ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶剤が挙げられ、好ましくはヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素系溶剤、より好ましくは、ベンゼン、トルエン等芳香族炭化水素系溶剤、特に好ましくはトルエンである。前記溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。反応溶媒の使用量は、（Ｓ）−ニペコチン酸エスエル誘導体と反応溶媒の容量比として、１：０．１〜１：１００、好ましくは１：１〜１：１０である。

本反応の反応温度としては、前記酵素が失活しない限りは特に限定されず、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは２０〜６０℃である。本反応の反応時間としては、特に制限されないが、普通１時間〜９６時間、好ましくは２時間〜４８時間、より好ましくは３時間から２４時間である。また、本反応はバッチ方式又は連続方式で行うことができ、前記酵素は、複数バッチ繰り返して利用する、又は連続して利用することもできる。

固定化酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）の使用量としては、特に制限されないが、基質に対する重量比として、普通０．０１〜１．０、好ましくは０．０５〜０．５、より好ましくは０．１〜０．３である。

反応終了後、前記一般式（２）で表される（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体は前記一般式（３）で表される（Ｒ）−アシルニペコチン酸エステル誘導体との混合物として得られ、この混合物より高純度の（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体を得る方法としては、抽出、カラムクロマトグラフィー、蒸留、又は晶析等の一般的な単離精製操作を組み合わせて行うことができる。例えば、前記反応混合物を塩酸、硫酸、燐酸等の酸存在下、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒及び水とからなる混合溶媒中で処理することで、（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体と酸との塩を水層に、（Ｒ）−アシルニペコチン酸エステル誘導体を有機層に効率良く分配できる。さらに、上記（Ｓ）−ニペコチン酸エスエル誘導体と酸との塩の水溶液を、水酸化ナトリウム、アンモニア、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等の塩基を用いて処理することにより、（Ｓ）−ニペコチン酸エスエル誘導体のアミン遊離体に変換した後、有機溶媒で抽出、濃縮することにより、高純度の（Ｓ）−ニペコチン酸エスエル誘導体を効率よく取得できる。この（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体は、そのまま使用することもできるが、必要に応じ、蒸留精製して使用することもでき、さらには適当な酸との塩として晶析等の操作により結晶として使用することもできる。

以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
ラセミのニペコチン酸エチル１０ｍｇ、各種リパーゼ１０ｍｇ、及び酢酸エチル１ｍｌを栓付試験管に加え、温度３０℃で１５時間攪拌した。反応後、反応液中の基質及び生成物量を下記条件にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により分析することにより、変換率（％）及び生成物の光学純度（％ｅｅ）を求めた。また、変換率及び生成物の光学純度をもとにして、Ｅ値を算出した。結果を表１に示す。

ＨＰＬＣ分析条件、変換率、光学純度、及びＥ値の計算方法は以下の通りである。

ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＣｈｉｒａｌｃｅｌＡＤ−ＲＨ０．４６ｃｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ（カラム：株式会社ダイセル製）、溶離液：０．１％リン酸水溶液／アセトニトリル＝５０／５０、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２２０ｎｍ、カラム温度：３０℃
変換率（％）＝Ｐ₁／（Ｓ₁＋Ｐ₁）×１００
（Ｐ₁：生成物量（ｍｏｌ）、Ｓ₁：残存基質量（ｍｏｌ））
光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表わし、Ａ＞Ｂである。）
Ｅ値＝ｌｎ（（１−変換率（％）／１００）×（１＋光学純度（％ｅｅ）／１００））／ｌｎ（（１−変換率（％）／１００）×（１−光学純度（％ｅｅ）／１００））

（実施例２）
ラセミのニペコチン酸エチル１００ｍｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）２０ｍｇ、各種アシル供与体０．５ｍｌを栓付試験管に加え、温度３０℃で２０時間攪拌した。反応後、実施例１記載の方法に従い、変換率及び生成物の光学純度を測定した。また、残存する基質の光学純度については、ベンジルオキシカルボニルクロライドを用いて誘導化した後、上記同様の方法に従い分析した。結果を表２に示す。

（実施例３）
攪拌器、温度計を取り付けた１００ｍｌ容四つ口フラスコに、ニペコチン酸エチル１０ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）２ｇ、及び酢酸エチル５０ｍｌを加え、温度４０℃、減圧条件下にて酢酸エチルを留出させながら２０時間攪拌した。反応後、実施例１の方法に従い、変換率及び残存する基質の光学純度を測定した。その結果、変換率は６２．８％、（Ｓ）−ニペコチン酸エチルの光学純度は９４．２％ｅｅであった。

（実施例４）
攪拌器、温度計を取り付けた１００ｍｌ容四つ口フラスコに、ニペコチン酸エチル１０ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）２ｇ、マロン酸ジエチル１０．２ｇ及びトルエン５０ｍｌを加え、温度４０℃、減圧条件下にてトルエンを留出させながら２０時間攪拌した。反応後、実施例１の方法に従い、変換率及び残存する基質の光学純度を測定した。その結果、変換率は５５．３％、（Ｓ）−ニペコチン酸エチルの光学純度は９６．３％ｅｅであった。

（実施例５）
攪拌器、温度計を取り付けた１００ｍｌ容四つ口フラスコに、ニペコチン酸エチル５０ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）１０ｇ、及びマロン酸ジエチル５０．９ｇを加え、温度３０℃、減圧条件下にて副生するエタノールを留出させながら４時間攪拌した。４０ｍｌのトルエンを添加しながら、さらに上記同様に８時間攪拌した。反応後、実施例１の方法に従い、変換率及び残存する基質の光学純度を測定した。その結果、変換率は５４．５％、（Ｓ）−ニペコチン酸エチルの光学純度は９５．７％ｅｅであった。

上記反応液にトルエン１００ｍｌを添加した後、酵素を濾別し、１Ｎ塩酸１４５ｍｌを用いて水層に抽出した（ｐＨ２）。この酸性水溶液を酢酸エチルで洗浄し、炭酸ナトリウムを添加してｐＨ９以上とした後、酢酸エチルを用いて抽出することにより、（Ｓ）−ニペコチン酸エチル２０．５ｇを薄透明油状物として取得した。

（実施例６）
攪拌器、温度計を取り付けた１００ｍｌ容四つ口フラスコに、ニペコチン酸エチル１０ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）２ｇ、マロン酸ジエチル１０．２ｇ及びトルエン５０ｍｌを加え、温度４０℃、減圧条件下にてトルエンを留出させながら１０時間攪拌した。反応後、実施例１の方法に従い、変換率及び残存する基質の光学純度を測定した。その結果、変換率は４６．１％、（Ｓ）−ニペコチン酸エチルの光学純度は８７．１％ｅｅであった。

上記反応液にトルエン１００ｍｌを添加した後、酵素を濾別し、１Ｎ塩酸を用いて洗浄した（ｐＨ２）。得られた有機層を濃縮した後、カラムクロマトグラフィーを用いて精製することにより、光学純度８７．１％ｅｅの（Ｒ）−Ｎ−エチルマロニルニペコチン酸エチル９．１ｇを薄透明油状物として取得した。取得した（Ｒ）−Ｎ−エチルマロニルニペコチン酸エチルのＮＭＲ解析の結果を以下に示す。

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．２４−４．１１（ｍ，４Ｈ），３．７１−３．０９（ｍ，４Ｈ），２．８９（ｄｄ，１Ｈ），１．８３−１．５１（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．２３（ｍ，６Ｈ）。

（実施例７）
攪拌器、温度計を取り付けた１００ｍｌ容四つ口フラスコに、３−ヒドロキシアミノピペリジン５ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）１ｇ、マロン酸ジエチル７．８ｇ及びトルエン５０ｍｌを加え、温度４０℃、減圧条件下にてトルエンを留出させながら１０時間攪拌した。反応後、実施例１の方法に従い、変換率及び残存する基質の光学純度を測定した。その結果、変換率は３０．１％、（Ｓ）−３−ヒドロキシアミノピペリジンの光学純度は３５．１％ｅｅであった。

上記反応液にトルエン１００ｍｌを添加した後、酵素を濾別し、１Ｎ塩酸を用いて洗浄した（ｐＨ２）。得られた有機層を濃縮した後、カラムクロマトグラフィーを用いて精製することにより、（Ｒ）−Ｎ−エチルマロニル−３−ヒドロキシアミノピペリジン３ｇを薄透明油状物として取得した。取得した（Ｒ）−Ｎ−エチルマロニル−３−ヒドロキシアミノピペリジンのＮＭＲ解析の結果を以下に示す。

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．２４−４．１６（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．３１（ｍ，７Ｈ），１．８６−１．４８（ｍ，４Ｈ），１．２８（ｔ，３Ｈ）。

Claims

一般式（１）；

（式中、Ｒ₁は炭素数１から１０のアルキル基、炭素数５〜１５の置換基を有しても良いアリール基、又は炭素数６〜１６の置換基を有しても良いアラルキル基を表す。）で表されるラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をR体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いて、アシル基供与体存在下、前記一般式（１）で表されるラセミのニペコチン酸エステル誘導体の２級アミノ基をＲ体選択的にアシル化し、一般式（２）；

（式中、Ｒ₁は前記と同じ。Ｒ₂は炭素数１〜１０の置換基を有しても良いアルキル基を表す。）で表される（Ｒ）−アシルニペコチン酸エステル誘導体、及び残存する一般式（３）；

（式中、Ｒ₁は前記と同じ。）で表される（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体の混合物に変換することを特徴とする、前記一般式（２）で表される（Ｒ）−アシルニペコチン酸エステル誘導体、および、前記一般式（３）で表される（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体の製造法。
更に反応混合物から前記一般式（３）で表される（Ｓ）−ニペコチン酸エステル誘導体を単離する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造法。
前記アシル基供与体が一般式（４）；

（式中、Ｒ₂は前記と同じ。Ｒ₃は炭素数１〜１０の置換基を有しても良いアルキル基、炭素数５〜１５の置換基を有しても良いアリール基、又は炭素数６〜１６の置換基を有しても良いアラルキル基を表す。）で表されるカルボン酸エステル誘導体である請求項１または２に記載の製造法。
前記一般式（１）、（２）、（３）、及び（４）において、Ｒ₁及びＲ₃がエチル基、Ｒ₂がメチル基、又はエチルオキシカルボニルメチル基である請求項１〜３のいずれか一つに記載の製造法。
前記一般式（４）で表されるカルボン酸エステル誘導体がマロン酸ジエチルである請求項３または４に記載の製造法。
Ｒ体選択的にアシル化する能力を有する酵素がアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、及びサーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属のいずれかに属する微生物由来である請求項１〜５のいずれか一つに記載の製造法。
Ｒ体選択的にアシル化する能力を有する酵素がアルカリゲネス・スピーシズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ）、キャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓ）、シュードモナス・スピ−シーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）、シュードモナス・スツッチェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、リゾムコール・メイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｅｉｈｅｉ）、及びサーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）のいずれかに属する微生物由来である請求項６に記載の製造法。
Ｒ体選択的にアシル化する能力を有する酵素が固定化酵素である請求項１〜７のいずれか一つに記載の製造法。
前記固定化酵素が、担体結合法、架橋法、又は包括法により固定化されている請求項８に記載の製造法。
前記固定化酵素に固定化されている酵素がキャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）に属する微生物由来のリパーゼである請求項９に記載の製造法。
ラセミの２級アミンを立体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いて、マロン酸ジエステル存在下、ラセミの２級アミンのアミノ基を立体選択的にアシル化し、光学活性マロン酸アミド、及び残存する光学活性アミンの混合物に変換することを特徴とする、光学活性マロン酸アミド、および、光学活性アミンの製造法。
ラセミの２級アミンをβ位立体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いることを特徴とする、請求項１１に記載の製造法。
ラセミの２級アミンをＲ体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いることを特徴とする、請求項１２に記載の製造法。
更に反応混合物から光学活性アミンを単離する工程を含むことを特徴とする、請求項１１〜１３に記載の製造法。
前記ラセミの２級アミンが一般式（５）；

（式中、Ｒ₄はエステル基、カルボキシアミド基、ニトリル基、保護されていても良いアミノ基、または保護されても良い水酸基を表す。Ｒ₅は置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基、置換基を有していても良い炭素数６〜１６のアラルキル基、アルキルアミノ基、アルコキシ基を表し、Ｒ₆と結合して環を形成していても良い。Ｒ₆は置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基、置換基を有していても良い炭素数６〜１６のアラルキル基を表し、Ｒ₅と結合して環を形成していても良い。）で表される２級アミンである請求項１１〜１４に記載の製造法。
前記ラセミの２級アミンが一般式（６）；

（式中、Ｘはメチレン基、アミノ基、または酸素原子を表す。Ｒ₄は前記と同じ。ｎは０または１を表す。）で表される環状２級アミンである請求項１５に記載の製造法。
前記一般式（６）において、Ｘがメチレン基であり、Ｒ₄がメチルエステル基、エチルエステル基、カルボキシアミド基、ニトリル基、アミノ基、または水酸基であり、ｎが０または１である、請求項１１〜１６のいずれか一つに記載の製造法。
前記マロン酸ジエステルがマロン酸ジメチルまたはマロン酸ジエチルである請求項１１〜１７に記載の製造法。
前記立体選択的にアシル化する能力を有する酵素が、一般式（５）；

（式中、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆は前記と同じ。）で表されるラセミの２級アミンのうち、一般式（７）；

（式中、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆は前記と同じ。）で表される光学活性２級アミンを立体選択的にアシル化する能力を有する酵素を用いることを特徴とする、請求項１１〜１８に記載の製造法。
前記立体選択的にアシル化する能力を有する酵素が、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、及びサーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属のいずれかに属する微生物由来である請求項１１〜１９のいずれか一つに記載の製造法。
前記立体選択的にアシル化する能力を有する酵素がアルカリゲネス・スピーシズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ）、キャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓ）、シュードモナス・スピ−シーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）、シュードモナス・スツッチェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、リゾムコール・メイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｅｉｈｅｉ）、及びサーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）のいずれかに属する微生物由来である請求項２０に記載の製造法。
前記立体選択的にアシル化する能力を有する酵素が固定化酵素である請求項１１〜２１のいずれか一つに記載の製造法。
前記固定化酵素が、担体結合法、架橋法、又は包括法により固定化されている請求項２２に記載の製造法。
前記固定化酵素に固定化されている酵素がキャンディダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）に属する微生物由来のリパーゼである請求項２２に記載の製造法。
一般式（８）；

（式中、Ｘ、Ｒ₄、ｎは前記と同じ。Ｒ₇は置換基を有していても良い炭素数１〜１０のアルキル基を表す。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される化合物。
Ｘがメチレン基であり、Ｒ₄がメチル基またはエチル基であり、Ｒ₅がメチルエステル基、エチルエステル基、カルボキシアミド基、ニトリル基、アミノ基、または水酸基であり、ｎが０または１である、請求項２５記載の化合物。
立体化学がＲである、請求項２６記載の化合物。