JP2009249512A - Structure and magnetic biosensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高分子膜に標的物質を捕捉する捕捉分子を含む構造体、前記捕捉分子と相互作用する標的物質を高感度に測定する為の磁気バイオセンサに関するものである。 The present invention relates to a structure including a capture molecule that captures a target substance in a polymer film, and a magnetic biosensor for measuring a target substance that interacts with the capture molecule with high sensitivity.
従来から、検体中の標的物質を検出する手段として分子間の相互作用が用いられてきた。相互作用を用いた手段としては、一方の分子を捕捉分子として基体表面上に固定し標的物質を含む検体を接触させることによって反応を行わせる方法が一般的である。 Conventionally, interaction between molecules has been used as a means for detecting a target substance in a specimen. As a means using the interaction, a method is generally employed in which one molecule is immobilized on a substrate surface as a capture molecule and a reaction is performed by contacting a specimen containing a target substance.
固定した捕捉分子と相互作用する標的物質を定量的に測定するとき、基体表面の性質もしくは固定方法によっては、捕捉分子と相互作用した標的物質以外に、基体表面に非特異的に吸着した物質も同時に検出してしまう恐れがある。このことが、微量検出を必要とするセンサでは、最小検出感度を低下させる原因となる。そのため、非特異吸着を抑制しつつ、標的物質のみのが検出される手法が必要とされている。 When quantitatively measuring the target substance that interacts with the immobilized capture molecule, depending on the nature of the substrate surface or the immobilization method, in addition to the target substance that interacts with the capture molecule, there are substances that are non-specifically adsorbed on the substrate surface. There is a risk of detection at the same time. This causes a decrease in the minimum detection sensitivity in a sensor that requires a small amount of detection. Therefore, there is a need for a technique for detecting only the target substance while suppressing nonspecific adsorption.
基体表面への非特異吸着を防止する技術として、非特許文献１には、ＯＥＧＭＡ（オリゴエチレングリコールメタクリレート）をモノマーとして原子移動ラジカル重合によりＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）センサ表面にＯＥＧＭＡポリマーを高密度に形成し、タンパク質の非特異吸着を防止する技術が開示されている。しかし、ＯＥＧＭＡポリマーに捕捉分子を固定化するような工夫はなされていない。
As a technique for preventing non-specific adsorption on the substrate surface, Non-Patent
一方、特許文献１には、バイオセンサ表面に生適合性多孔質マトリックスを形成した後、更に前記マトリックス上に存在するカルボキシル基に捕捉分子を固定化し、夾雑物の非特異吸着を防止して標的物質を検出する技術が開示されている。
非特許文献１において、基体表面への生体分子の非特異吸着を防止する膜の形成方法とその非特異吸着防止の効果が報告されているが、しかしながら、その膜へ捕捉分子を固定化する方法は記載されていない。
Non-Patent
一方、特許文献１においては、バイオセンサ表面への生体分子の非特異吸着を防止した上で、捕捉分子を固定し、標的物質のみを検出する方法が報告されているが、非特異吸着を防止する効果は非特許文献１ほど高くない。
On the other hand,
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、基体上に高分子化合物からなる高分子膜を形成し、その上に標的物質を捕捉する捕捉分子を固定化することにより、夾雑物や標的物質の非特異吸着を良好に防止すると共に標的物質を特異的に捕捉できる構造体を提供するものである。 The present invention has been made in view of such background art, and by forming a polymer film made of a polymer compound on a substrate and immobilizing a capture molecule for capturing a target substance thereon, The present invention provides a structure that can satisfactorily prevent non-specific adsorption of impurities and target substances and can specifically capture the target substances.
また、本発明は、上記の構造体を用いて、標的物質のみを感度良く検出する磁気バイオセンサを提供するものである。 Moreover, this invention provides the magnetic biosensor which detects only a target substance with sufficient sensitivity using said structure.
上記の課題を解決する構造体は、捕捉分子を含む高分子化合物からなる高分子膜を基体上に備えた構造体であって、前記高分子化合物は下記一般式（１）で示される主鎖と側鎖とを有する重合体からなり、前記基体には前記高分子化合物の一端がグラフト化され、前記高分子化合物の側鎖に捕捉分子を結合できる官能基を有し、前記官能基のうちの少なくとも一部に捕捉分子が結合していることを特徴とする。 A structure that solves the above problem is a structure that includes a polymer film made of a polymer compound containing a trapping molecule on a substrate, and the polymer compound is a main chain represented by the following general formula (1). And a polymer having a side chain, one end of the polymer compound is grafted to the substrate, and has a functional group capable of binding a capture molecule to the side chain of the polymer compound. A capture molecule is bound to at least a part of the structure.
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基である。Ｒ２は酸素原子またはＮＨ基である。Ｒ３はカルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、アミノ基、マレイミド基、グリシジル基のいずれかである。Ｘは１以上の整数である。ｎは１０以上１０００００以下の整数である。）
前記高分子化合物の側鎖に有する捕捉分子を結合できる官能基が、前記一般式（１）のＲ３であることが好ましい。
(In the formula, R 1 is a hydrogen atom or a methyl group. R 2 is an oxygen atom or an NH group. R 3 is a carboxyl group, an aldehyde group, a succinimide group, an amino group, a maleimide group, or a glycidyl group. X is an integer greater than or equal to 1. n is an integer greater than or equal to 10 and less than or equal to 100,000.)
It is preferable that the functional group capable of binding the capture molecule in the side chain of the polymer compound is R 3 in the general formula (1).
上記の課題を解決する磁気バイオセンサは、磁気バイオセンサの検出領域近傍に位置する磁気マーカーの有無又は数を検知する事により検体中の標的物質の有無又は濃度を検出する磁気バイオセンサであって、前記磁気マーカーは標的物質を捕捉する第二の捕捉分子を含み、上記の標的物質を捕捉する第一の捕捉分子を含む高分子化合物からなる高分子膜を有する構造体が磁気バイオセンサの検出領域に配置され、前記第一の捕捉分子と前記第二の捕捉分子により標的物質を捕捉して磁気マーカーの有無又は数を検知することを特徴とする。 A magnetic biosensor that solves the above problem is a magnetic biosensor that detects the presence or concentration or concentration of a target substance in a sample by detecting the presence or number of magnetic markers located in the vicinity of the detection region of the magnetic biosensor. The magnetic marker includes a second capture molecule for capturing a target substance, and a structure having a polymer film made of a polymer compound including the first capture molecule for capturing the target substance is detected by a magnetic biosensor. It is arranged in a region, and the presence or number of magnetic markers is detected by capturing a target substance with the first capture molecule and the second capture molecule.
本発明は、夾雑物や標的物質の非特異吸着を良好に防止すると共に標的物質を特異的に捕捉できる構造体を提供することができる。
また、本発明は、上記の構造体を用いて、夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、高感度に標的物質を検出することができる磁気バイオセンサを提供することができる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide a structure that can prevent non-specific adsorption of impurities and target substances, and can specifically capture target substances.
In addition, the present invention provides a magnetic biosensor capable of detecting a target substance with high sensitivity by using the above-described structure to prevent non-specific adsorption of impurities and target substances to suppress noise. Can do.
まず、本発明に係る構造体の構成について説明する。
（構造体）
図１は本発明に係る構造体の一実施態様を示す概略図である。同図１に示す様に、本発明に係る構造体は、図１に示すように、標的物質を捕捉する第一の捕捉分子４を含む高分子化合物２からなる高分子膜５を基体１上に備えた構造体であって、前記高分子化合物２は下記一般式（１）で示される主鎖と側鎖とを有する重合体からなり、前記基体には前記高分子化合物の一端がグラフト化され、前記高分子化合物の側鎖に捕捉分子を結合できる官能基３を有し、前記官能基のうちの少なくとも一部に捕捉分子４が結合していることを特徴とする構造体である。
First, the structure of the structure according to the present invention will be described.
(Structure)
FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of a structure according to the present invention. As shown in FIG. 1, the structure according to the present invention has a
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基である。Ｒ２は酸素原子またはＮＨ基である。Ｒ３はカルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、アミノ基、マレイミド基、グリシジル基のいずれかである。Ｘは１以上の整数である。ｎは１０以上１０００００以下の整数である。） (In the formula, R 1 is a hydrogen atom or a methyl group. R 2 is an oxygen atom or an NH group. R 3 is a carboxyl group, an aldehyde group, a succinimide group, an amino group, a maleimide group, or a glycidyl group. X is an integer greater than or equal to 1. n is an integer greater than or equal to 10 and less than or equal to 100,000.)
（基体）
本発明における基体とは、基体の表面に、捕捉分子を含む高分子化合物からなる高分子膜を形成することが可能なものである。
(Substrate)
The substrate in the present invention is a substrate on which a polymer film made of a polymer compound containing a trapping molecule can be formed.
本発明における基体の材質は、本発明の構造体を形成しうるものであれば、いかなる材質でもよいが、好ましくは、アミノ基もしくはチオール基が結合可能である金、銀、銅、白金、アルミニウム等の金属、ＣｄＳ、ＺｎＳ等の半導体、酸化チタン、酸化アルミニウム等の金属酸化物、もしくは、シラノール基が結合可能なガラス、シリコン、酸化チタン、セラミック、もしくは、カルボキシル基が結合可能なセラミック、カーボンが好適である。酸素プラズマ処理、ＵＶ処理等により表面を酸化することによりカルボキシル基を提示することが可能なプラスチックでもよい。上記の理由は基体表面への高分子化合物からなる高分子膜の形成方法が深く関与する。高分子化合物からなる高分子膜の形成方法については後に説明する。 The material of the substrate in the present invention may be any material as long as it can form the structure of the present invention, but preferably gold, silver, copper, platinum, aluminum to which an amino group or thiol group can be bonded. Metals such as CdS and ZnS, metal oxides such as titanium oxide and aluminum oxide, glass capable of binding silanol groups, silicon, titanium oxide, ceramics, ceramics capable of binding carboxyl groups, carbon Is preferred. It may be a plastic capable of presenting a carboxyl group by oxidizing the surface by oxygen plasma treatment, UV treatment or the like. The above reason is deeply related to the method of forming a polymer film made of a polymer compound on the substrate surface. A method for forming a polymer film made of a polymer compound will be described later.
また、本発明における基体の形状は、平板もしくは粒子、微小構造体などいかなる形状でもよい。特に、平板上に数ｎｍ程度の凹凸がある場合、本発明の構造体では凹凸に応じて隙間を埋めるように高分子膜を形成することが可能である。そのため、他の方法で形成した非特異吸着防止のための層よりも有効であり、層表面に捕捉分子を固定する方法としても有効である。また、基体の形状が粒子や微小構造体の場合、従来の方法では基体表面の微小な空間に対してポリマー層を薄く形成した上に捕捉分子を固定することが困難である。しかし、本発明では基体の微小な変化を有する表面形状に沿って高密度の高分子膜を構築することが可能であり、また、その表面に捕捉分子を固定化することができる。 Further, the shape of the substrate in the present invention may be any shape such as a flat plate, a particle, or a microstructure. In particular, when there are unevenness of about several nm on the flat plate, the structure of the present invention can form a polymer film so as to fill the gap according to the unevenness. Therefore, it is more effective than a layer for preventing nonspecific adsorption formed by other methods, and is also effective as a method for immobilizing capture molecules on the layer surface. Further, when the shape of the substrate is a particle or a microstructure, it is difficult to fix the trapping molecule while forming a thin polymer layer in a minute space on the surface of the substrate by the conventional method. However, in the present invention, it is possible to construct a high-density polymer film along the surface shape having a minute change of the substrate, and it is possible to immobilize capture molecules on the surface.
（高分子膜）
本発明における高分子膜は、高分子化合物からなる膜である。前記高分子化合物は下記一般式（１）で示される主鎖と側鎖とを有する重合体からなり、前記高分子化合物は一端が基体に固定されており、高分子化合物の側鎖には生体分子の非特異吸着を防止するエチレングリコール鎖が存在し、更にその末端に捕捉分子を固定化する為の官能基（Ｒ３）を有する。
(Polymer film)
The polymer film in the present invention is a film made of a polymer compound. The polymer compound is composed of a polymer having a main chain and a side chain represented by the following general formula (1), and one end of the polymer compound is fixed to a substrate. There is an ethylene glycol chain that prevents non-specific adsorption of the molecule, and further has a functional group (R 3 ) for immobilizing the capture molecule at its end.
（式中、Ｒ１は水素原子、またはメチル基である。Ｒ２は酸素原子、またはＮＨ基である。Ｒ３はカルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、アミノ基、マレイミド基、グリシジル基のいずれかである。Ｘは１以上の整数である。ｎは１０以上１０００００以下の整数である。）
本発明において、高分子化合物は、下記反応式１に示すように一般式（２）のモノマーを重合した後、側鎖末端の水酸基を酸化することによって、官能基（Ｒ３）がカルボキシル基やアルデヒド基である高分子化合物を得ることができる。
(In the formula, R 1 is a hydrogen atom or a methyl group. R 2 is an oxygen atom or an NH group. R 3 is any of a carboxyl group, an aldehyde group, a succinimide group, an amino group, a maleimide group, and a glycidyl group. X is an integer greater than or equal to 1. n is an integer greater than or equal to 10 and less than or equal to 100,000.)
In the present invention, the polymer compound is obtained by polymerizing the monomer of the general formula (2) as shown in the following
側鎖末端の水酸基をカルボキシル基へ酸化する方法として、ジョーンズ酸化を挙げることができる。
また、側鎖末端の水酸基をアルデヒド基へ酸化する方法として、コリンズ酸化、ＰＣＣ酸化、ＰＤＣ酸化等を挙げることができる。
An example of a method for oxidizing the hydroxyl group at the end of the side chain to a carboxyl group is Jones oxidation.
Examples of the method for oxidizing the hydroxyl group at the side chain end to an aldehyde group include Collins oxidation, PCC oxidation, PDC oxidation and the like.
あるいは、下記反応式２に示すように一般式（３）のモノマーを重合した後、ターシャリーブチル基を脱保護することによって、官能基（Ｒ３）がカルボキシル基である高分子化合物を得ることができる。 Alternatively, as shown in the following reaction formula 2, after polymerizing the monomer of the general formula (3), the tertiary butyl group is deprotected to obtain a polymer compound in which the functional group (R3) is a carboxyl group. it can.
あるいは、下記反応式３に示すように一般式（４）のモノマーを重合して、官能基（Ｒ３）がカルボキシル基である高分子化合物を得ることができる。
Alternatively, as shown in the following
あるいは、下記反応式４で示すように一般式（５）のモノマーを重合して、官能基（Ｒ３）がアミノ基である高分子化合物を得ることができる。更に、アミノ基に無水マレイン酸を反応させて、Ｒ３がマレイミド基である高分子化合物を得ることができる。 Alternatively, as shown in the following reaction formula 4, the monomer of the general formula (5) can be polymerized to obtain a polymer compound in which the functional group (R3) is an amino group. Furthermore, a polymer compound in which R3 is a maleimide group can be obtained by reacting an amino group with maleic anhydride.
あるいは、下記反応式５で示すように一般式（６）のモノマーを重合して、官能基（Ｒ３）がグリシジル基である高分子化合物を得ることができる。
Alternatively, as shown in the following
前記基体上における前記高分子化合物の数平均分子量は５０００以上１００００００以下であり、好ましくは１００００以上１００００００以下である。分子量分布は１以上２未満が好ましい。また、前記高分子膜における高分子化合物の密度は０．１分子／ｎｍ２以上が好ましい。 The number average molecular weight of the polymer compound on the substrate is from 5,000 to 1,000,000, preferably from 10,000 to 1,000,000. The molecular weight distribution is preferably 1 or more and less than 2. The density of the polymer compound in the polymer film is preferably 0.1 molecule / nm 2 or more.
高分子化合物からなる高分子膜の一端を基体へ固定化する方法として、既に合成された高分子高分子化合物を基体表面に接触させて固定させても良いが、好ましくは重合によって合成されるものであり、より好ましくは、重合がリビングラジカル重合であるものである。リビングラジカル重合については後に説明する。 As a method of immobilizing one end of a polymer film made of a polymer compound to a substrate, a polymer polymer compound that has already been synthesized may be brought into contact with the substrate surface and immobilized, but is preferably synthesized by polymerization. More preferably, the polymerization is living radical polymerization. Living radical polymerization will be described later.
また、本発明の高分子化合物の官能基において、前記官能基の少なくとも一部に第一の捕捉分子が固定化されている。捕捉分子の固定化に関しては、後に説明する。
（リビングラジカル重合）
一般的にリビングラジカル重合は、合成されるポリマーの分子量分布が狭く、かつ基体上に高密度にポリマー層をグラフト化できる。よって、本発明においては、一般式（１）に相当するモノマーを重合すれば、基体上に高密度な高分子化合物からなる高分子膜を設けることが可能であり、その重合体の官能基の少なくとも一部に第一の捕捉分子を固定することが可能である。
In the functional group of the polymer compound of the present invention, the first capture molecule is immobilized on at least a part of the functional group. The immobilization of the capture molecule will be described later.
(Living radical polymerization)
In general, the living radical polymerization has a narrow molecular weight distribution of a polymer to be synthesized and can graft a polymer layer on a substrate at a high density. Therefore, in the present invention, if a monomer corresponding to the general formula (1) is polymerized, it is possible to provide a polymer film made of a high-density polymer compound on the substrate. It is possible to immobilize the first capture molecule at least in part.
リビングラジカル重合法としては、有機ハロゲン化物などを開始剤とし、遷移金属錯体を触媒とする原子移動ラジカル重合（Ａｔｏｍ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｒａｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＡＴＲＰ）、ニトロキシド化合物などのラジカル捕捉剤を用いるニトロキシド媒介重合（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＮＭＰ）や、ジチオカルバメイトなどのラジカル捕捉剤を用いる光イニシエーター重合などが挙げられる。本発明においてはいずれの方法により前記構造体を製造してもよい。 Living radical polymerization methods include atom transfer radical polymerization (ATRP) using organic halides as initiators and transition metal complexes as catalysts, and nitroxide-mediated polymerization using radical scavengers such as nitroxide compounds (Nitroxide). Examples thereof include photopolymerization using a radical scavenger such as mediated polymerization (NMP) and dithiocarbamate. In the present invention, the structure may be manufactured by any method.
基体表面への高分子膜の形成方法を説明する。
（原子移動ラジカル重合）
リビングラジカル重合が原子移動ラジカル重合の場合、化学式１から３に示すような有機ハロゲン化物、又は化学式４に示すようなハロゲン化スルホニル化合物を重合開始剤として用いることができる。
A method for forming a polymer film on the substrate surface will be described.
(Atom transfer radical polymerization)
When the living radical polymerization is atom transfer radical polymerization, an organic halide as shown in
原子移動ラジカル重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、高分子膜となる一般式（１）に相当するモノマー、遷移金属錯体を添加し、反応系を不活性ガスで置換して原子移動ラジカル重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての高分子膜を基体上にほぼ均等に成長させることができる。 After adding the substrate into which the atom transfer radical polymerization initiator has been introduced to the reaction solvent, the monomer corresponding to the general formula (1) to be a polymer film and a transition metal complex are added, and the reaction system is replaced with an inert gas. Atom transfer radical polymerization. This allows the polymerization to proceed while keeping the graft density constant. That is, the polymerization can proceed like a living room, and all the polymer films can be grown almost uniformly on the substrate.
反応溶媒としては、特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ピリジン、水、メタノール、エタノール、プロパノ−ル、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、イソプロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、トリオキサン、テトラヒドロフラン等を使用することができる。これらは単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。 The reaction solvent is not particularly limited, but for example, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, acetonitrile, pyridine, water, methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, cyclohexanol, methyl cellosolve, ethyl cellosolve, Isopropyl cellosolve, butyl cellosolve, acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, ethyl acetate, butyl acetate, ethyl propionate, trioxane, tetrahydrofuran and the like can be used. These may be used alone or in combination of two or more.
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
使用する遷移金属錯体はハロゲン化金属とリガンドからなる。ハロゲン化金属の金属種としては、原子番号２２番のＴｉから３０番のＺｎまでの遷移金属が好ましく、特にＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕが好ましい。その中でも、塩化第一銅、臭化第一銅が好ましい。
Nitrogen gas or argon gas can be used as the inert gas.
The transition metal complex used consists of a metal halide and a ligand. The metal species of the metal halide is preferably a transition metal from Ti of atomic number 22 to Zn of 30, and particularly preferably Fe, Co, Ni, and Cu. Among these, cuprous chloride and cuprous bromide are preferable.
リガンドとしては、ハロゲン化金属に配位可能であれば特に限定されないが、例えば、２，２’−ビピリジル、４，４’−ジ−（ｎ−ヘプチル）−２，２’−ビピリジル、２−（Ｎ−ペンチルイミノメチル）ピリジン、（−）−スパルテイン、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、エチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、ヘキサメチル（２−アミノエチル）アミン等を使用することができる。 The ligand is not particularly limited as long as it can be coordinated to a metal halide. For example, 2,2′-bipyridyl, 4,4′-di- (n-heptyl) -2,2′-bipyridyl, 2- (N-pentyliminomethyl) pyridine, (-)-sparteine, tris (2-dimethylaminoethyl) amine, ethylenediamine, dimethylglyoxime, 1,4,8,11-tetramethyl-1,4,8,11 -Tetraazacyclotetradecane, 1,10-phenanthroline, N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetriamine, hexamethyl (2-aminoethyl) amine and the like can be used.
遷移金属錯体の添加量は、高分子膜となるモノマーに対して、０．００１重量％から１０重量％、好ましくは０．０５重量％から５重量％である。
重合温度は、０℃から１００℃の範囲であり、好ましくは１０℃から８０℃の範囲である。
The addition amount of the transition metal complex is 0.001% by weight to 10% by weight, preferably 0.05% by weight to 5% by weight, based on the monomer to be a polymer film.
The polymerization temperature is in the range of 0 ° C to 100 ° C, preferably in the range of 10 ° C to 80 ° C.
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加しても良い。フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された高分子膜の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。 Moreover, when performing superposition | polymerization, you may add the free polymerization initiator which is not fixed to the base | substrate. The free polymer produced from the free polymerization initiator can be used as an indicator of the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer film grafted on the substrate.
フリーな重合開始剤としては、基体に固定している原子移動ラジカル重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。つまり、化学式１（Ｘ＝Ｂｒ）の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は２−ブロモイソ酪酸エチルであることが好ましい。また、化学式２（Ｘ＝Ｂｒ）の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は２−ブロモプロピオン酸エチルであることが好ましい。 As the free polymerization initiator, it is preferable to select the same type as the atom transfer radical polymerization initiator fixed to the substrate. That is, it is preferable that the free polymerization initiator is ethyl 2-bromoisobutyrate with respect to the polymerization initiator of Chemical Formula 1 (X = Br). Moreover, it is preferable that a free polymerization initiator is ethyl 2-bromopropionate with respect to the polymerization initiator of Chemical formula 2 (X = Br).
重合終了後、基体を前記した反応溶媒で十分に洗浄して、高分子化合物からなる高分子膜がグラフト化された基体を得ることができる。
（ニトロキシド媒介重合）
リビングラジカル重合がニトロキシド媒介重合である場合、化学式５から７に示すようなニトロキシド化合物を重合開始剤として用いることができる。
After the polymerization is completed, the substrate can be sufficiently washed with the reaction solvent described above to obtain a substrate on which a polymer film made of a polymer compound is grafted.
(Nitroxide-mediated polymerization)
When the living radical polymerization is nitroxide-mediated polymerization, a nitroxide compound represented by
ニトロキシド媒介重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、高分子膜となる一般式（１）に相当するモノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換してニトロキシド媒介重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての高分子膜を基体上にほぼ均等に成長させることができる。 After adding the substrate into which the nitroxide-mediated polymerization initiator has been introduced to the reaction solvent, a monomer corresponding to the general formula (1) to be a polymer film is added, and the reaction system is replaced with an inert gas to perform nitroxide-mediated polymerization. Do. This allows the polymerization to proceed while keeping the graft density constant. That is, the polymerization can proceed like a living room, and all the polymer films can be grown almost uniformly on the substrate.
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
Although it does not specifically limit as a reaction solvent, The above-mentioned similar solvent can be used. Moreover, you may use them individually or may use 2 or more types together.
Nitrogen gas or argon gas can be used as the inert gas.
重合温度は、４０℃から１２０℃の範囲であり、好ましくは、４０℃から１００℃の範囲である。重合温度が４０℃未満では、形成される高分子化合物が低分子量であったり、あるいは重合が進行し難いので好ましくない。 The polymerization temperature is in the range of 40 ° C to 120 ° C, and preferably in the range of 40 ° C to 100 ° C. When the polymerization temperature is less than 40 ° C., the formed polymer compound has a low molecular weight or the polymerization does not easily proceed.
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加しても良い。
フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された高分子化合物の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
Moreover, when performing superposition | polymerization, you may add the free polymerization initiator which is not fixed to the base | substrate.
The free polymer produced from the free polymerization initiator can be used as an indicator of the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer compound grafted on the substrate.
フリーな重合開始剤としては、基体に固定しているニトロキシド媒介重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。つまり、化学式５の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は化学式８に示されるニトロキシド化合物であることが好ましい。化学式８に示されるニトロキシド化合物は、反応溶媒に溶解する為に、ベンゼン環に置換基が導入されていても良い。
As the free polymerization initiator, it is preferable to select the same type as the nitroxide-mediated polymerization initiator fixed to the substrate. That is, it is preferable that the free polymerization initiator is a nitroxide compound represented by Chemical Formula 8 with respect to the polymerization initiator represented by
重合終了後、基体を前記した反応溶媒で十分に洗浄して、高分子膜がグラフト化された基体を得ることができる。
（光イニシエーター重合）
リビングラジカル重合が光イニシエーター重合である場合、化学式９に示すようなＮ，Ｎ−ジチオカルバミン系化合物を重合開始剤として用いることができる。
After completion of the polymerization, the substrate can be sufficiently washed with the above-described reaction solvent to obtain a substrate on which the polymer film is grafted.
(Photoinitiator polymerization)
When the living radical polymerization is photoinitiator polymerization, an N, N-dithiocarbamine compound as shown in
光イニシエーター重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、高分子膜となる一般式（１）に相当するモノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換して光照射することによって光イニシエーター重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての高分子化合物を基体上にほぼ均等に成長させることができる。 After adding the substrate into which the photoinitiator polymerization initiator has been introduced to the reaction solvent, a monomer corresponding to the general formula (1) to be a polymer film is added, and the reaction system is replaced with an inert gas and irradiated with light. Photoinitiator polymerization. This allows the polymerization to proceed while keeping the graft density constant. That is, the polymerization can proceed in a living manner, and all the polymer compounds can be grown almost uniformly on the substrate.
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
Although it does not specifically limit as a reaction solvent, The above-mentioned similar solvent can be used. Moreover, you may use them individually or may use 2 or more types together.
Nitrogen gas or argon gas can be used as the inert gas.
照射する光の波長は、使用する光イニシエーター重合開始剤の種類によって異なる。化学式９に例示する光イニシエーター重合開始剤を有する基体表面に高分子膜をグラフト化する場合、反応系に３００ｎｍから６００ｎｍの波長を示す光を照射することによって光イニシエーター重合が良好に進行する。
The wavelength of the irradiated light varies depending on the type of the photoinitiator polymerization initiator used. When a polymer film is grafted onto the surface of a substrate having a photoinitiator polymerization initiator exemplified in
重合温度は、副反応を抑制するため、室温あるいはそれ以下の温度であることが好ましい。但し、同様の効果が得られる範囲においてこの温度領域に限定されるわけではない。
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加しても良い。フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された高分子化合物の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
The polymerization temperature is preferably room temperature or lower in order to suppress side reactions. However, the temperature range is not limited within a range in which the same effect can be obtained.
Moreover, when performing superposition | polymerization, you may add the free polymerization initiator which is not fixed to the base | substrate. The free polymer produced from the free polymerization initiator can be used as an indicator of the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer compound grafted on the substrate.
フリーな重合開始剤としては、基体に固定している光イニシエーター重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。つまり、化学式９の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は下記化学式１０に示されるジチオカルバメイト系化合物であることが好ましい。化学式１０に示されるジチオカルバメイト系化合物は、反応溶媒に溶解する為に、ベンゼン環に置換基が導入されていても良い。
As the free polymerization initiator, it is preferable to select the same type as the photoinitiator polymerization initiator fixed to the substrate. That is, it is preferable that the free polymerization initiator is a dithiocarbamate compound represented by the following chemical formula 10 with respect to the polymerization initiator represented by the
重合終了後、基体を前記した反応溶媒で十分に洗浄して、高分子膜がグラフト化された基体を得ることができる。
基体表面に重合開始剤を固定する方法は特に限定されるものではないが、基体が金属であれば、チオール化合物を含む重合開始剤を基体表面に結合するか、又は、前記基体をチオール化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
After completion of the polymerization, the substrate can be sufficiently washed with the above-described reaction solvent to obtain a substrate on which the polymer film is grafted.
The method for fixing the polymerization initiator to the substrate surface is not particularly limited. If the substrate is a metal, a polymerization initiator containing a thiol compound is bound to the substrate surface, or the substrate is bonded with a thiol compound. A method in which a polymerization initiator is subsequently bonded after pretreatment is preferred.
基体が酸化膜を有する金属であれば、シランカップリング剤を含む重合開始剤を結合するか、又は、前記基体をシランカップリング剤で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。 If the substrate is a metal having an oxide film, there is a method in which a polymerization initiator containing a silane coupling agent is bonded, or after the substrate is pretreated with a silane coupling agent, the polymerization initiator is subsequently bonded. preferable.
基体がプラスチックであれば、酸素プラズマ処理、ＵＶ処理等により表面を酸化してカルボキシル基を発現させた後、アミノ化合物を含む重合開始剤を結合するか、又はアミノ化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。 If the substrate is plastic, the surface is oxidized by oxygen plasma treatment, UV treatment, etc. to express carboxyl groups, and then a polymerization initiator containing an amino compound is bound or pretreated with an amino compound, followed by A method of binding a polymerization initiator is preferred.
（捕捉分子）
本発明における捕捉分子とは、標的物質と相互作用することにより捕捉、あるいは変換を行う分子であってもよく、具体的には核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体などが挙げられる。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、抗体フラグメント、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは生体物質を捕捉、あるいは変換することができる抗体、抗体フラグメント、あるいは酵素である。
(Capture molecule)
The capture molecule in the present invention may be a molecule that captures or converts by interacting with a target substance, and specifically includes nucleic acids, proteins, sugar chains, lipids, and complexes thereof. . Specific examples include DNA, RNA, aptamer, gene, chromosome, cell membrane, virus, antigen, antibody, antibody fragment, lectin, hapten, hormone, receptor, enzyme, peptide, sphingosaccharide, sphingolipid, etc. It is not limited to. Preferably, it is an antibody, an antibody fragment, or an enzyme that can capture or convert a biological substance.
（捕捉分子の固定）
本発明において捕捉分子を固定化する方法として、高分子化合物の官能基に第一の捕捉分子を共有結合させる方法を使用することができる。即ち、一般式（１）で示される高分子化合物からなる高分子膜を形成した場合、側鎖の官能基に第一の捕捉分子を固定化することができる。
(Immobilization of capture molecules)
In the present invention, as a method of immobilizing the capture molecule, a method of covalently bonding the first capture molecule to the functional group of the polymer compound can be used. That is, when the polymer film made of the polymer compound represented by the general formula (1) is formed, the first capture molecule can be immobilized on the functional group of the side chain.
下記反応式６に示すように、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等を使用して、高分子化合物の側鎖カルボキシル基をスクシンイミド基に置換して活性エステル化する。このスクシンイミド基（活性エステル基）に第一の捕捉分子のアミノ基を反応させて、高分子化合物の側鎖に捕捉分子を固定化することができる。 As shown in the following reaction formula 6, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) or the like is used to change the side chain carboxyl group of the polymer compound. Substitution with a succinimide group results in active esterification. The succinimide group (active ester group) can be reacted with the amino group of the first capture molecule to immobilize the capture molecule on the side chain of the polymer compound.
上記の捕捉分子の固定化後、高分子化合物の未反応のスクシンイミド基に対して、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコールと反応させてスクシンイミド基を失活させる。 After immobilization of the capture molecule, the unreacted succinimide group of the polymer compound is reacted with ethanolamine and oligoethylene glycol or polyethylene glycol having an amino group at the terminal to deactivate the succinimide group.
あるいは、下記反応式７に示すように、高分子化合物の側鎖アルデヒド基に第一の捕捉分子のアミノ基を反応させて、高分子化合物の側鎖に捕捉分子を固定化することができる。上記の捕捉分子の固定化後、高分子膜の未反応のアルデヒド基に対して、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコールと反応させてアルデヒド基を失活させる。 Alternatively, as shown in the following reaction formula 7, the capture molecule can be immobilized on the side chain of the polymer compound by reacting the side chain aldehyde group of the polymer compound with the amino group of the first capture molecule. After immobilization of the capture molecules, the unreacted aldehyde group of the polymer membrane is reacted with ethanolamine and oligoethylene glycol or polyethylene glycol having an amino group at the terminal to deactivate the aldehyde group.
あるいは、反応式４において、官能基としてアミノ基を有する高分子化合物の場合、捕捉分子をアミノ基に固定化することができる。即ち、グルタルアルデヒド架橋剤等を用いて、前記アミノ基と捕捉分子のアミノ基を反応させて、捕捉分子を高分子化合物の側鎖に固定化することができる。捕捉分子の固定化後、高分子化合物の未反応のアミノ基に対して、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコールと反応させてアミノ基を失活させる。 Alternatively, in Reaction Scheme 4, in the case of a polymer compound having an amino group as a functional group, the capture molecule can be immobilized on the amino group. That is, using a glutaraldehyde crosslinking agent or the like, the amino group and the amino group of the capture molecule can be reacted to immobilize the capture molecule on the side chain of the polymer compound. After the capture molecule is immobilized, the amino group is deactivated by reacting the unreacted amino group of the polymer compound with ethanolamine and oligoethylene glycol or polyethylene glycol having an amino group at the terminal.
あるいは、反応式４において、官能基としてマレイミド基を有する高分子化合物の場合、捕捉分子をマレイミド基に固定化することができる。即ち、前記マレイミド基と捕捉分子のチオール基を反応させて、捕捉分子を高分子化合物の側鎖に固定化することができる。捕捉分子の固定化後、高分子化合物の未反応のマレイミド基に対して、メルカプトエタノール、末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコールと反応させてマレイミド基を失活させる。 Alternatively, in Reaction Scheme 4, in the case of a polymer compound having a maleimide group as a functional group, the capture molecule can be immobilized on the maleimide group. That is, the maleimide group can be reacted with the thiol group of the capture molecule to immobilize the capture molecule on the side chain of the polymer compound. After immobilization of the capture molecule, the unreacted maleimide group of the polymer compound is reacted with mercaptoethanol and oligoethylene glycol or polyethylene glycol having a thiol group at the terminal to deactivate the maleimide group.
あるいは、反応式５において、官能基としてグリシジル基を有する高分子化合物の場合、捕捉分子のアミノ基をグリシジル基に固定化することができる。捕捉分子の固定化後、高分子化合物の未反応のグリシジル基に対して、エタノールアミン、末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコールやポリエチレングリコールと反応させてアルデヒド基を失活させる。
Alternatively, in the
（高分子膜の吸着防止能）
本発明における高分子化合物からなる高分子膜の吸着防止能は、高分子化合物の側鎖が基体表面への物質の非特異的な吸着を防止することにより発揮される。即ち、一般式（１）の側鎖はエチレングリコール鎖であり、このようなエチレングリコール鎖は、検体中の夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止するのに優れた機能を有している。また、高分子化合物の官能基へ捕捉分子を反応させると捕捉分子を固定化できる。また、未反応の官能基に対して、前記したように適切な化合物で失活させると、検体中の夾雑物や標的物質の非特異吸着を防止することできる。
(Adsorption prevention ability of polymer membrane)
The adsorption preventing ability of the polymer film comprising the polymer compound in the present invention is exhibited by preventing the non-specific adsorption of the substance on the substrate surface by the side chain of the polymer compound. That is, the side chain of the general formula (1) is an ethylene glycol chain, and such an ethylene glycol chain has an excellent function for preventing nonspecific adsorption of contaminants and target substances in a specimen. . Further, the capture molecule can be immobilized by reacting the capture molecule with the functional group of the polymer compound. Further, when the unreacted functional group is deactivated with an appropriate compound as described above, it is possible to prevent non-specific adsorption of contaminants and target substances in the specimen.
以下に、本発明に関わる磁気バイオセンサについて説明する。
本発明に係る磁気バイオセンサは、磁気バイオセンサの検出領域近傍に位置する磁気マーカーの有無又は数を検知する事により検体中の標的物質の有無又は濃度を検出する磁気バイオセンサであって、前記磁気マーカーは標的物質を捕捉する第二の捕捉分子を含み、上記の標的物質を捕捉する第一の捕捉分子を含む高分子化合物からなる高分子膜を有する構造体が磁気バイオセンサの検出領域に配置され、前記第一の捕捉分子と前記第二の捕捉分子により標的物質を捕捉して磁気マーカーの有無又は数を検知することを特徴とする。
The magnetic biosensor according to the present invention will be described below.
A magnetic biosensor according to the present invention is a magnetic biosensor that detects the presence or concentration of a target substance in a sample by detecting the presence or absence or number of magnetic markers located in the vicinity of a detection region of the magnetic biosensor, The magnetic marker includes a second capture molecule that captures the target substance, and a structure having a polymer film made of a polymer compound that includes the first capture molecule that captures the target substance is present in the detection region of the magnetic biosensor. It is arranged, and the presence or number of magnetic markers is detected by capturing a target substance with the first capture molecule and the second capture molecule.
図２は本発明に関わる磁気バイオセンサ一例を示す概略図である。
本発明の磁気バイオセンサ６は、図２に示すように、標的物質１０を捕捉する第一の捕捉分子４を含む高分子化合物２の一端が検出領域に結合している。また、該高分子化合物の側鎖官能基３の少なくとも一部に第一の捕捉分子が結合し、該高分子膜が一般式（１）で示される高分子化合物の重合体からなることを特徴とする磁気バイオセンサである。
FIG. 2 is a schematic view showing an example of a magnetic biosensor according to the present invention.
In the magnetic biosensor 6 of the present invention, as shown in FIG. 2, one end of the polymer compound 2 including the first capture molecule 4 that captures the target substance 10 is bonded to the detection region. Further, the first capture molecule is bonded to at least a part of the side chain
また、本発明の磁気バイオセンサは、磁気バイオセンサの検出領域近傍に位置する磁気マーカー９の有無、数を検知する事により検体中の標的物質１０の有無、濃度を検出する磁気バイオセンサであって、前記磁気マーカー９は第二の捕捉分子８を含み、検出領域近傍に位置する第一の捕捉分子４に標的物質１０が反応し、更に、第二の捕捉分子８を含む磁気ビーズ７が標的物質１０と反応することによって伴う磁気的な変化量を検出する。
The magnetic biosensor of the present invention is a magnetic biosensor that detects the presence and concentration of the target substance 10 in the sample by detecting the presence and number of
以下に、本発明に関わる磁気バイオセンサおよび標的物質について説明する。
（検出方法）
本発明では、磁気マーカーの磁気的な変化量を検出する手段として、磁界効果を利用する方式が好ましく、特に、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、超電導量子干渉計素子が好適に用いることができる。
Hereinafter, the magnetic biosensor and the target substance according to the present invention will be described.
(Detection method)
In the present invention, as a means for detecting the magnetic change amount of the magnetic marker, a method using a magnetic field effect is preferable, and in particular, a magnetoresistive effect element, a Hall effect element, and a superconducting quantum interferometer element can be suitably used. .
（磁気マーカー）
本発明に用いる磁気マーカー９は、図２に示すように、磁気ビーズ７の表面に第二の捕捉分子８が固定化されている。
(Magnetic marker)
As shown in FIG. 2, the
磁気マーカー９を構成する磁気ビーズ７としては、例えばフェライトを使用することができる。フェライトは、生理活性条件下で十分な磁性を有し、溶媒中で酸化等の劣化が起こりにくいことから好ましい。フェライトは、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、及びこれらのＦｅの一部を他の原子で置換した複合体から選択される。他の原子としては、Ｌｉ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｃａ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｗの少なくともいずれかが挙げられる。
For example, ferrite can be used as the magnetic beads 7 constituting the
磁気ビーズの平均粒径は、数十ｎｍから数百μｍが好ましく、更に２０ｎｍから１０μｍが好ましい。尚、磁気ビーズの平均粒径は、動的光散乱法で測定できる。
本発明に用いる磁気マーカーとして、例えば、Ｄｙｎａｌ社から市販されているダイナビーズ、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社から市販されているｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ、ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ、メルク社から市販されているエスタポール等を使用することができる。
The average particle size of the magnetic beads is preferably several tens of nm to several hundreds of μm, and more preferably 20 nm to 10 μm. The average particle size of the magnetic beads can be measured by a dynamic light scattering method.
As the magnetic marker used in the present invention, for example, Dynabeads commercially available from Dynal, micromer-M, nanomag-D commercially available from Micromod, and Estapol commercially available from Merck are used. it can.
このような磁気マーカーの大きさは、磁気バイオセンサの形状、大きさ、或いは用途によって様々に選択する事が可能であるが、数十ｎｍから数百μｍが好ましく、更に２０ｎｍから１０μｍが好ましい。 The size of such a magnetic marker can be variously selected depending on the shape, size, or application of the magnetic biosensor, but is preferably several tens of nm to several hundreds of μm, and more preferably 20 nm to 10 μm.
（標的物質）
本発明の標的物質は、前記捕捉分子と反応する物質であればいかなるものでもよい。より好ましくは生体物質である。生体物質としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質が含まれ、更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものであり、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質の何れかから選択された物質を含むものであれば、如何なる物質にも本発明を適用することができる。更には、前記の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、本発明が対象とする「生体物質」として標的物質となり得る。
(Target substance)
The target substance of the present invention may be any substance as long as it reacts with the capture molecule. More preferably, it is a biological material. Biological materials include biological materials selected from nucleic acids, proteins, sugar chains, lipids, and complexes thereof, and more specifically, biomolecules selected from nucleic acids, proteins, sugar chains, and lipids. Specifically, selected from DNA, RNA, aptamer, gene, chromosome, cell membrane, virus, antigen, antibody, lectin, hapten, hormone, receptor, enzyme, peptide, sphingosaccharide, sphingolipid The present invention can be applied to any substance as long as it contains any other substance. Furthermore, bacteria and cells themselves that produce the above-mentioned “biological substances” can also be target substances as “biological substances” targeted by the present invention.
これら標的物質と捕捉分子との相互作用は、本発明の磁気バイオセンサにより結合前後の磁気的な変化量が検出可能であればいかなる相互作用でもよいが、より好ましくは、「抗原−抗体反応」、「抗原−アプタマー（特定構造を有するＲＮＡ断片）」「リガンド−レセプター相互作用」、「ＤＮＡハイブリダイゼーション」「ＤＮＡ−タンパク質（転写因子等）相互作用」、「レクチン−糖鎖相互作用」等が挙げられる。 The interaction between the target substance and the capture molecule may be any interaction as long as the magnetic change before and after the binding can be detected by the magnetic biosensor of the present invention, but more preferably, the “antigen-antibody reaction”. , “Antigen-aptamer (RNA fragment having a specific structure)”, “ligand-receptor interaction”, “DNA hybridization”, “DNA-protein (transcription factor etc.) interaction”, “lectin-sugar chain interaction”, etc. Can be mentioned.
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有するバイオセンサが得られる範囲で自由に変えることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples, and biomaterials having similar functions and effects such as materials, composition conditions, reaction conditions, and the like. It can be freely changed within the range where the sensor can be obtained.
実施例１
本実施例は、第一の捕捉分子としてＰＳＡ（前立腺特異抗原）を捕捉する一次抗体を含む高分子化合物からなる高分子膜が検出領域に形成された磁気バイオセンサと、第二の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を備えたマグネタイトからなる磁気マーカーを作製し、磁気バイオセンサとしてＰＳＡを検出する例である。尚、磁気バイオセンサの検出方式としては、磁気抵抗効果素子を使用する。
Example 1
In this example, a magnetic biosensor in which a polymer film made of a polymer compound containing a primary antibody that captures PSA (prostate specific antigen) as a first capture molecule is formed in a detection region, and a second capture molecule This is an example in which a magnetic marker made of magnetite provided with a secondary antibody that captures PSA is prepared, and PSA is detected as a magnetic biosensor. In addition, a magnetoresistive effect element is used as a detection method of the magnetic biosensor.
（１）磁気マーカーの作製
まず、第二の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を有する磁気マーカーを作製する。
(1) Production of Magnetic Marker First, a magnetic marker having a secondary antibody that captures PSA as a second capture molecule is produced.
マグネタイト粒子（平均粒径１００ｎｍ）を乾燥窒素雰囲気下、加熱処理した後、無水トルエンに分散させる。このマグネタイト粒子／トルエン分散液に、シランカップリング剤であるアミノプロピルトリメトキシシランを添加し、マグネタイト粒子表面にアミノ基を導入する。次に、第二の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する二次抗体を固定化する為にグルタルアルデヒド架橋剤を用いて、前記アミノ基と二次抗体のアミノ基を共有結合させ、第二の捕捉分子をマグネタイト粒子表面に固定化することができる。
以上の操作を経ることで、第二の捕捉分子を備えた磁気マーカーを得ることができる。
Magnetite particles (average particle size 100 nm) are heat-treated in a dry nitrogen atmosphere and then dispersed in anhydrous toluene. To this magnetite particle / toluene dispersion, aminopropyltrimethoxysilane, which is a silane coupling agent, is added to introduce amino groups on the surface of the magnetite particles. Next, in order to immobilize the secondary antibody that captures PSA as the second capture molecule, a glutaraldehyde cross-linking agent is used, and the amino group and the amino group of the secondary antibody are covalently bonded to each other. Can be immobilized on the surface of the magnetite particles.
Through the above operation, a magnetic marker provided with the second capture molecule can be obtained.
（２）磁気バイオセンサの作製
次に、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を有する高分子膜が検出領域に形成された磁気バイオセンサを作製する。
(2) Production of Magnetic Biosensor Next, a magnetic biosensor in which a polymer film having a primary antibody that captures PSA as the first capture molecule is formed in the detection region is produced.
まず、図２のように、磁気バイオセンサの検出領域上面にＡｕ膜を形成する。本実施例では、検出方式としては、磁気抵抗効果素子を使用するため、前記検出領域は磁気抵効果膜を意味する。 First, as shown in FIG. 2, an Au film is formed on the upper surface of the detection region of the magnetic biosensor. In this embodiment, since the magnetoresistive effect element is used as the detection method, the detection region means a magnetoresistive effect film.
次に、検出領域であるＡｕ表面に高分子膜を形成する。まず、化学式１１で示される原子移動ラジカル重合開始剤を含むエタノール溶液にＡｕ膜を侵漬し、前記開始剤とＡｕ膜を反応させて、Ａｕ膜表面に原子移動ラジカル重合開始剤を導入することができる。 Next, a polymer film is formed on the Au surface that is the detection region. First, an Au film is immersed in an ethanol solution containing an atom transfer radical polymerization initiator represented by the chemical formula 11, and the initiator and the Au film are reacted to introduce an atom transfer radical polymerization initiator to the Au film surface. Can do.
次に、原子移動ラジカル重合開始剤を導入した検出領域を水−メタノール混合溶媒（体積比４：１）に浸漬させた後、フリーな重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２’−ビピリジルを加える。凍結真空脱気により反応系内の酸素を除去した後、窒素で置換し、化学式１２で示されるモノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。重合後、メタノール洗浄、次いで水洗浄を経て、検出領域上に側鎖官能基が水酸基である高分子化合物（化学式１２の重合体）を得ることができる。 Next, after immersing the detection region into which the atom transfer radical polymerization initiator was introduced in a water-methanol mixed solvent (volume ratio 4: 1), ethyl 2-bromoisobutyrate was added as a free polymerization initiator, and CuBr, , 2'-bipyridyl is added. After removing oxygen in the reaction system by freeze vacuum deaeration, the reaction system is replaced with nitrogen, and the monomer represented by Chemical Formula 12 is reacted for a predetermined time by atom transfer radical polymerization. After polymerization, the polymer is washed with methanol and then with water to obtain a polymer compound (polymer of formula 12) having a hydroxyl group as a side chain functional group on the detection region.
また、フリーな重合開始種として加えておいた２−ブロモイソ酪酸エチルから生成したポリマーの分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が９００００で、分子量分布が１．１４である。このことから、検出領域にグラフト化された高分子化合物は鎖長の揃ったポリマーであることを確認できる。 Further, when the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer produced from ethyl 2-bromoisobutyrate added as a free polymerization starting species were measured, the number average molecular weight was 90000 and the molecular weight distribution was 1.14. From this, it can be confirmed that the polymer compound grafted to the detection region is a polymer having a uniform chain length.
検出領域にグラフト化された高分子化合物からなる高分子膜の膜厚と重量を測定することによって、高分子化合物のグラフト密度は、０．６６分子／ｎｍ２であることを確認できる。 By measuring the film thickness and weight of the polymer film composed of the polymer compound grafted on the detection region, it can be confirmed that the graft density of the polymer compound is 0.66 molecule / nm 2 .
次に、検出領域に形成された高分子膜の高分子化合物の側鎖末端の水酸基をアセトン中でＪｏｎｅｓ酸化することによって、側鎖末端の水酸基がカルボキシル基へ変換された高分子化合物（化学式１３）を得ることができる。 Next, the hydroxyl group at the end of the side chain of the polymer compound of the polymer film formed in the detection region is subjected to Jones oxidation in acetone, thereby converting the hydroxyl group at the end of the side chain to a carboxyl group (Chemical Formula 13). ) Can be obtained.
次に、高分子膜の高分子化合物の側鎖カルボキシル基に第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化する。まず、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド水溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液を同様に塗布する。これらの操作により、高分子化合物の側鎖カルボキシル基にスクシンイミド基（活性エステル基）が露出することになる。前記スクシンイミド基と一次抗体のアミノ基を反応させ、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、高分子膜上の未反応のスクシンイミド基は、エタノールアミンによって失活させる。 Next, a primary antibody that captures PSA as a first capture molecule is immobilized on the side chain carboxyl group of the polymer compound of the polymer membrane. First, an N-hydroxysulfosuccinimide aqueous solution and a 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride aqueous solution are applied in the same manner. By these operations, a succinimide group (active ester group) is exposed to the side chain carboxyl group of the polymer compound. The primary antibody that captures PSA as the first capture molecule can be immobilized by reacting the succinimide group with the amino group of the primary antibody. Thereafter, unreacted succinimide groups on the polymer film are deactivated with ethanolamine.
以上の操作により、検出領域において、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体が固定化された高分子化合物からなる高分子膜を備えた磁気バイオセンサを作製することができる。 By the above operation, a magnetic biosensor including a polymer film made of a polymer compound to which a primary antibody that captures PSA as a first capture molecule is immobilized in the detection region can be produced.
（３）ＰＳＡの検出
上述の（１）、（２）において作製される磁気マーカーと磁気バイオセンサを用い、以下の操作を行うことで、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡの検出を試みることができる。
(3) Detection of PSA By using the magnetic marker and magnetic biosensor produced in (1) and (2) above, the following operations are performed to try to detect PSA known as a prostate cancer marker. be able to.
１）標的物質（抗原）であるＰＳＡ、及び夾雑物であるＢＳＡとＩｇＧを含むリン酸緩衝液に上記磁気バイオセンサの検出領域を浸す。
２）未反応のＰＳＡと夾雑物をリン酸緩衝生液で洗浄する。
1) The detection region of the magnetic biosensor is immersed in a phosphate buffer containing PSA as a target substance (antigen) and BSA and IgG as contaminants.
2) Wash unreacted PSA and contaminants with phosphate buffered saline.
３）磁気マーカーを含むリン酸緩衝生理食塩水に工程１）及び２）が終了した上記磁気バイオセンサの検出領域を浸し、５分間インキュベートする。
４）未反応の磁気マーカーをリン酸緩衝液で洗浄する。
3) Immerse the detection region of the magnetic biosensor in which steps 1) and 2) have been completed in phosphate buffered saline containing a magnetic marker and incubate for 5 minutes.
4) Wash unreacted magnetic marker with phosphate buffer.
上記操作によって、標的物質（抗原）が第一の捕捉分子、第二の捕捉分子により捕捉され、磁気マーカーが図２に示すように磁気バイオセンサの検出領域に固定化される。つまり、検体中に抗原が存在しない場合には、磁気マーカーは磁気バイオセンサの検出領域上に固定化されないので、磁気マーカーの有無を検出することによって、抗原の検出が可能である。また、固定化された磁気マーカーの数を検出することによって、検体中に含まれる抗原の量を間接的に知ることも可能である。 By the above operation, the target substance (antigen) is captured by the first capture molecule and the second capture molecule, and the magnetic marker is immobilized on the detection region of the magnetic biosensor as shown in FIG. That is, when no antigen is present in the specimen, the magnetic marker is not immobilized on the detection region of the magnetic biosensor, and therefore the antigen can be detected by detecting the presence or absence of the magnetic marker. It is also possible to indirectly know the amount of antigen contained in the specimen by detecting the number of immobilized magnetic markers.
本実施例の磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子膜において、側鎖のエチレングリコール鎖が検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。 In the polymer membrane in the detection region of the magnetic biosensor of this example, the side chain ethylene glycol chain suppresses noise by preventing non-specific adsorption of contaminants and target substance (antigen) contained in the sample, and the target substance Can be detected with high sensitivity.
実施例２
実施例１の化学式１２で示されるモノマーからなる高分子化合物の側鎖末端の水酸基をジクロロメタン中クロロクロム酸ピリジニウムで酸化することによって、側鎖末端の水酸基がアルデヒド基へ変換された高分子化合物（化学式１４）が得られる。
Example 2
A polymer compound in which the hydroxyl group at the end of the side chain of the polymer compound comprising the monomer represented by the chemical formula 12 of Example 1 is converted to an aldehyde group by oxidizing the hydroxyl group at the end of the side chain with pyridinium chlorochromate in dichloromethane ( The chemical formula 14) is obtained.
実施例１と同様にして、高分子化合物のアルデヒド基と一次抗体のアミノ基を反応させ、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、高分子化合物からなる高分子膜上の未反応のアルデヒド基は、エタノールアミンによって失活させる。 In the same manner as in Example 1, the primary antibody that captures PSA as the first capture molecule can be immobilized by reacting the aldehyde group of the polymer compound with the amino group of the primary antibody. Thereafter, unreacted aldehyde groups on the polymer film made of the polymer compound are deactivated with ethanolamine.
実施例１と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子化合物からな高分子膜において、側鎖のエチレングリコール鎖が検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。 When PSA is detected in the same manner as in Example 1, in the polymer film made of the polymer compound in the detection region of the magnetic biosensor, the side chain ethylene glycol chain contains contaminants and target substances (antigens). By preventing non-specific adsorption, noise can be suppressed and the target substance can be detected with high sensitivity.
実施例３
実施例１の化学式１２で示されるモノマーを化学式１５で示されるモノマーに替えて重合すると、側鎖官能基がグリシジル基である高分子化合物膜が得られる。
Example 3
When the monomer represented by Chemical Formula 12 in Example 1 is polymerized in place of the monomer represented by Chemical Formula 15, a polymer compound film in which the side chain functional group is a glycidyl group is obtained.
実施例１と同様にして、高分子化合物のグリシジル基と一次抗体のアミノ基を反応させ、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、高分子化合物からなる高分子膜上の未反応のグリシジル基は、エタノールアミンによって失活させる。 In the same manner as in Example 1, the primary antibody that captures PSA as the first capture molecule can be immobilized by reacting the glycidyl group of the polymer compound with the amino group of the primary antibody. Thereafter, unreacted glycidyl groups on the polymer film made of the polymer compound are deactivated with ethanolamine.
実施例１と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子化合物からなる高分子膜において、側鎖のエチレングリコール鎖が検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。 When PSA is detected in the same manner as in Example 1, in the polymer film composed of the polymer compound in the detection region of the magnetic biosensor, the side chain ethylene glycol chain contains contaminants and target substances (antigens). By preventing non-specific adsorption, noise can be suppressed and the target substance can be detected with high sensitivity.
実施例４
実施例１の化学式１１で示される原子移動ラジカル重合開始剤を化学式１６で示される光イニシエーター重合開始剤に替えて、検出領域のＡｕ表面に導入することができる。
Example 4
The atom transfer radical polymerization initiator represented by Chemical Formula 11 in Example 1 can be introduced to the Au surface of the detection region in place of the photoinitiator polymerization initiator represented by Chemical Formula 16.
光イニシエーター重合開始剤を導入した検出領域を水−メタノール混合溶媒（体積比４：１）に浸漬させた後、化学式１７で示されるモノマーを添加して反応系を窒素ガスで置換し、光照射することによってモノマーの光イニシエーター重合を室温にて所定時間行う。また、検出領域にグラフト化される高分子膜の分子量および分子量分布の指標となるように、フリーな重合開始種としてベンジルＮ、Ｎ−ジエチルジチオカルバメートを反応系内に予め加えておく。尚、光照射には４００Ｗ高圧ＵＶランプを使用し、照射波長は３１２ｎｍから５７７ｎｍ、ピーク波長は３６５ｎｍとする。 After the detection region where the photoinitiator polymerization initiator has been introduced is immersed in a water-methanol mixed solvent (volume ratio 4: 1), the monomer represented by the chemical formula 17 is added to replace the reaction system with nitrogen gas. Irradiation causes photoinitiator polymerization of the monomer at room temperature for a predetermined time. In addition, benzyl N, N-diethyldithiocarbamate is added in advance to the reaction system as a free polymerization initiating species so as to be an indicator of the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer film grafted on the detection region. A 400 W high-pressure UV lamp is used for light irradiation, the irradiation wavelength is 312 nm to 577 nm, and the peak wavelength is 365 nm.
重合後、メタノール洗浄、次いで水洗浄を経て、検出領域上に側鎖官能基がアミノ基である高分子化合物を得ることができる。
また、フリーな重合開始種として加えておいたジＮ、Ｎ−ジエチルジチオカルバメートから生成したポリマーの分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が８００００で、分子量分布が１．１６である。このことから、検出領域にグラフト化された高分子化合物は鎖長の揃ったポリマーであることを確認できる。
After polymerization, the polymer is washed with methanol and then with water to obtain a polymer compound in which the side chain functional group is an amino group on the detection region.
Further, when the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer formed from di-N, N-diethyldithiocarbamate added as a free polymerization starting species were measured, the number average molecular weight was 80000 and the molecular weight distribution was 1.16. From this, it can be confirmed that the polymer compound grafted to the detection region is a polymer having a uniform chain length.
検出領域にグラフト化された高分子化合物からなる高分子膜の膜厚と重量を測定することによって、高分子化合物からなる高分子膜のグラフト密度は、０．６１分子／ｎｍ２であることを確認できる。 By measuring the thickness and weight of the polymer film composed of the polymer compound grafted on the detection region, the graft density of the polymer film composed of the polymer compound is 0.61 molecule / nm 2. I can confirm.
第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化する為にグルタルアルデヒド架橋剤を用いて、高分子化合物の側鎖アミノ基と一次抗体のアミノ基を反応させ、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、高分子化合物上の未反応のアミノ基は、エタノールアミンによって失活させる。 In order to immobilize the primary antibody that captures PSA as the first capture molecule, a glutaraldehyde cross-linking agent is used to react the side chain amino group of the polymer compound with the amino group of the primary antibody as the first capture molecule. A primary antibody that captures PSA can be immobilized. Thereafter, unreacted amino groups on the polymer compound are deactivated with ethanolamine.
実施例１と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子化合物からなる高分子膜において、側鎖のエチレングリコール鎖が検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。 When PSA is detected in the same manner as in Example 1, in the polymer film composed of the polymer compound in the detection region of the magnetic biosensor, the side chain ethylene glycol chain contains contaminants and target substances (antigens). By preventing non-specific adsorption, noise can be suppressed and the target substance can be detected with high sensitivity.
実施例５
実施例４の高分子化合物の側鎖アミノ基を無水マレイン酸と反応させて、官能基がマレイミド基である高分子化合物に変換することができる。
Example 5
The side chain amino group of the polymer compound of Example 4 can be reacted with maleic anhydride to convert it to a polymer compound whose functional group is a maleimide group.
次に、高分子化合物の側鎖マレイミド基と一次抗体のチオール基を反応させて、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、高分子膜上の未反応のマレイミド基は、メルカプトエタノールによって失活させる。 Next, the primary antibody that captures PSA as the first capture molecule can be immobilized by reacting the side chain maleimide group of the polymer compound with the thiol group of the primary antibody. Thereafter, unreacted maleimide groups on the polymer film are deactivated with mercaptoethanol.
実施例１と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子化合物からなる高分子膜において、側鎖のエチレングリコール鎖が検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。 When PSA is detected in the same manner as in Example 1, in the polymer film composed of the polymer compound in the detection region of the magnetic biosensor, the side chain ethylene glycol chain contains contaminants and target substances (antigens). By preventing non-specific adsorption, noise can be suppressed and the target substance can be detected with high sensitivity.
実施例６
実施例４のモノマーを化学式１８で示されるモノマーに替えて同様の操作を行い、検出領域上に側鎖官能基がアミノ基である高分子化合物を得ることができる。
Example 6
A similar operation can be performed by replacing the monomer of Example 4 with the monomer represented by Chemical Formula 18 to obtain a polymer compound in which the side chain functional group is an amino group on the detection region.
また、フリーな重合開始種として加えておいたジＮ、Ｎ−ジエチルジチオカルバメートから生成したポリマーの分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が８８０００で、分子量分布が１．１８である。このことから、検出領域にグラフト化された高分子化合物は鎖長の揃ったポリマーであることを確認できる。 Further, when the molecular weight and molecular weight distribution of a polymer formed from di-N, N-diethyldithiocarbamate added as a free polymerization starting species were measured, the number average molecular weight was 88,000 and the molecular weight distribution was 1.18. From this, it can be confirmed that the polymer compound grafted to the detection region is a polymer having a uniform chain length.
検出領域にグラフト化された高分子化合物からなる高分子膜の膜厚と重量を測定することによって、高分子化合物からなる高分子膜のグラフト密度は、０．６３分子／ｎｍ２であることを確認できる。 By measuring the film thickness and weight of the polymer film composed of the polymer compound grafted on the detection region, the graft density of the polymer film composed of the polymer compound is 0.63 molecule / nm 2. I can confirm.
第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化する為にグルタルアルデヒド架橋剤を用いて、高分子化合物の側鎖アミノ基と一次抗体のアミノ基を反応させ、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。その後、高分子化合物からなる高分子膜上の未反応のアミノ基は、エタノールアミンによって失活させる。 In order to immobilize the primary antibody that captures PSA as the first capture molecule, a glutaraldehyde cross-linking agent is used to react the side chain amino group of the polymer compound with the amino group of the primary antibody as the first capture molecule. A primary antibody that captures PSA can be immobilized. Thereafter, unreacted amino groups on the polymer film made of the polymer compound are deactivated with ethanolamine.
実施例１と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子膜において、側鎖のエチレングリコール鎖が検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。 When PSA is detected in the same manner as in Example 1, non-specific adsorption of contaminants and target substances (antigens) containing ethylene glycol chains in the side chains in the polymer membrane in the detection region of the magnetic biosensor is prevented. By doing so, noise can be suppressed and the target substance can be detected with high sensitivity.
実施例７
実施例４のモノマーを化学式１９で示されるモノマーに替えて同様の操作を行い、検出領域上に側鎖官能基がカルボキシル基である高分子化合物を得ることができる。
Example 7
A similar operation can be performed by replacing the monomer of Example 4 with the monomer represented by Chemical Formula 19, and a polymer compound in which the side chain functional group is a carboxyl group on the detection region can be obtained.
また、フリーな重合開始種として加えておいたジＮ、Ｎ−ジエチルジチオカルバメートから生成したポリマーの分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が９１０００で、分子量分布が１．１９である。このことから、検出領域にグラフト化された高分子化合物は鎖長の揃ったポリマーであることを確認できる。 Further, when the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer formed from di-N, N-diethyldithiocarbamate added as a free polymerization starting species were measured, the number average molecular weight was 91,000 and the molecular weight distribution was 1.19. From this, it can be confirmed that the polymer compound grafted to the detection region is a polymer having a uniform chain length.
検出領域にグラフト化された高分子化合物からなる高分子膜の膜厚と重量を測定することによって、高分子化合物からなる高分子膜のグラフト密度は、０．６５分子／ｎｍ２であることを確認できる。 By measuring the thickness and weight of the polymer film composed of the polymer compound grafted on the detection region, the graft density of the polymer film composed of the polymer compound is 0.65 molecule / nm 2. I can confirm.
次に、高分子化合物の側鎖カルボキシル基の少なくとも一部に第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化する。実施例１と同様の操作により、第一の捕捉分子としてＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。 Next, a primary antibody that captures PSA as a first capture molecule is immobilized on at least a part of the side chain carboxyl group of the polymer compound. By the same operation as in Example 1, the primary antibody that captures PSA as the first capture molecule can be immobilized.
実施例１と同様にＰＳＡの検出を行うと、磁気バイオセンサにおける検出領域の高分子膜において、側鎖のエチレングリコール鎖が検体に含まれる夾雑物や標的物質（抗原）の非特異吸着を防止することによってノイズを抑え、標的物質を高感度に検出することができる。 When PSA is detected in the same manner as in Example 1, non-specific adsorption of contaminants and target substances (antigens) containing ethylene glycol chains in the side chains in the polymer membrane in the detection region of the magnetic biosensor is prevented. By doing so, noise can be suppressed and the target substance can be detected with high sensitivity.
比較例１
実施例１の高分子膜をデキストラン膜（生適合性多孔質マトリックス）に替え、デキストラン膜上のカルボキシル基を活性エステル化して一次抗体を固定化する。また、未反応のスクシンイミド基をエタノールアミンで失活させる。その後、実施例１と同様にＰＳＡの検出を行うと、デキストラン膜に夾雑物や標的物質（抗原）が非特異的に吸着することによってノイズが大きくなり、実施例１から７のいずれの感度よりも劣ることが確認される。
Comparative Example 1
The polymer membrane of Example 1 is replaced with a dextran membrane (biocompatible porous matrix), and the carboxyl group on the dextran membrane is activated to immobilize the primary antibody. In addition, unreacted succinimide groups are deactivated with ethanolamine. Thereafter, when PSA is detected in the same manner as in Example 1, noise increases due to nonspecific adsorption of contaminants and target substances (antigens) to the dextran membrane. Is confirmed to be inferior.
本発明により、基体表面へ官能基を含む高分子化合物からなる高分子膜を構築し、更に前記高分子化合物の官能基の少なくとも一部に第一の捕捉分子を固定化した構造体を提供することができる。また、前記構造体の捕捉分子と相互作用する標的物質を高感度に測定するためのバイオセンサを提供することができる。本発明は、主に磁気バイオセンサの感度向上を目的とした反応場に使用することができる。 According to the present invention, there is provided a structure in which a polymer film comprising a polymer compound containing a functional group is constructed on the surface of a substrate, and a first capture molecule is immobilized on at least a part of the functional group of the polymer compound. be able to. In addition, a biosensor for measuring a target substance that interacts with a capture molecule of the structure with high sensitivity can be provided. The present invention can be used in a reaction field mainly for the purpose of improving the sensitivity of a magnetic biosensor.
１ 基体
２ 高分子化合物
３ 官能基
４ 第一の捕捉分子
５ 高分子膜
６ 磁気バイオセンサ
７ 磁気ビーズ
８ 第二の捕捉分子
９ 磁気マーカー
１０ 標的物質
１１ 夾雑物
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|---|---|---|---|---|
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| JP2020534507A (en) * | 2018-07-27 | 2020-11-26 | ゼプト ライフ テクノロジー， エルエルシーＺｅｐｔｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｌｃ | Systems and methods for detecting test substances in the detection of biomarkers by GMR |
-
2008
- 2008-04-07 JP JP2008099679A patent/JP2009249512A/en active Pending
Cited By (7)
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