JP2009236709A - 表面プラズモンセンシング方法および表面プラズモンセンシング装置 - Google Patents

Abstract

【課題】表面プラズモンセンサにおいて、複屈折率を有する誘電体プリズムを用いても表面プラズモンを有効に励起することができるようにする。
【解決手段】表面プラズモンセンサにおいて、誘電体プリズム６による複屈折の影響により生じる位相差を相殺できるように、あらかじめ励起光Ｌｉの偏光状態を上記の位相差と逆の位相差を持つ偏光状態にしてから、励起光Ｌｉを誘電体プリズム６に入射する。このとき、反射光Ｌｓを第１の光検出器３０ａでモニタリングして、その検出信号に応じ自動偏光調整機構４０で偏光調整素子Ｄを操作することによって励起光Ｌｉの偏光状態を自動的に調整できるようにする。
【選択図】図２Ａ

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴を利用した表面プラズモンセンシング方法および表面プラズモンセンシング装置に関するものである。

従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したＳＰＲ法および表面プラズモン励起増強蛍光分光（ＳＰＦＳ）法が注目されている。

このＳＰＲ法は、金、銀等からなる金属膜が形成された誘電体プリズムへ全反射条件を満たすように励起光を入射させ、その反射光の角度スペクトルを求めて、スペクトル中に現れる吸収ピークから、金属膜に接している被検出物質の屈折率あるいはその変化等の物性を測定する手法である。これは、ＳＰＲが発現する入射角や、ＳＰＲが発現している入射角付近における反射光強度が、金属膜の表面上の付着物の厚さ、誘電率によって変化することを利用している。或いは、金属膜の表面上に被検出物質と結合あるいは吸着する物質を表面修飾しておき、被検出物質が金属膜表面付近に結合あるいは吸着した際に生じる入射角や反射率の変化を検出することにより、被検出物質の結合量（膜厚あるいは質量）を得ることもできる。さらに、ＳＰＲ測定は、in situ測定が可能なため、生体分子間の反応・結合量の測定および速度論的解析がノンラベルかつリアルタイムで行うことが可能である（特許文献１・２）。

一方、ＳＰＦＳ法は、同様に金属膜が形成された誘電体プリズムへ励起光を入射し、屈折率の異なる界面で励起光が全反射する際に界面からしみ出す光、すなわちエバネッセント波と、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている標識との吸収、発光等の光学的な相互作用を分析することにより、上記被検出物質の存在またはその量を検出する方法である。とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光 ５２５ｎｍ、蛍光量子収率 ０．６）やＣｙ５（蛍光 ６８０ｎｍ、蛍光量子収率 ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている（特許文献３）。

上記のようなＳＰＲを利用する全反射光学測定では、表面プラズモンによる電場増強場の強度に寄与する因子が多く、Ｓ／Ｎ比を向上させることは難しい。これらの因子としては、例えば、センサチップの形状誤差およびセッティング誤差、センシング誤差および光学系誤差等の人為的要因による励起光の入射角度のずれや、サンプルの屈折率、センサチップの屈折率およびその表面の凹凸並びに金属膜の厚みおよびその密度等の物理的要因による表面プラズモンの発生条件のずれ等が挙げられる。また、測定環境における温度変化についても、上記のような条件のずれを後発的に生じさせる可能性があるため、充分に考慮する必要がある。

そこで、表面プラズモンの発生条件を最適化して電場増強場の強度を向上させる種々の検討がなされてきた（特許文献１〜３）。
特開２００２−２９６１７７号公報 特開２００６−２７５５３５号公報 特開２００６−２０８０６９号公報

しかしながら、上記特許文献１〜３の方法では、複屈折率を有する誘電体プリズム内を励起光が進行する際に励起光が偏光されることにより、電場増強場の強度が低減するという問題を解決することはできない。

通常ＳＰＲを励起する際には、誘電体プリズムと金属膜との界面に垂直な偏光状態を持った光、すなわちｐ偏光の励起光を誘電体プリズムに入射する。これは、励起光のうち表面プラズモンの励起に有効に寄与するのがｐ偏光であり、ｓ偏光は寄与しないからである。複屈折率のない誘電体プリズムを使用すれば特に大きな問題はないが、例えば複屈折率を有する樹脂製の誘電体プリズムを用いた場合には問題となる。樹脂製の誘電体プリズムは、複屈折率のない誘電体プリズムに比べて安価であり、かつ成形が容易であるといった利点を有することから利用されることが多い。したがって、ＳＰＲを利用する全反射光学測定において、複屈折率を有する誘電体プリズムを用いても、その複屈折率に左右されず表面プラズモンを有効に励起することが可能な測定方法が望まれている。

本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、ＳＰＲを利用する全反射光学測定において、複屈折率を有する誘電体プリズムを用いても表面プラズモンを有効に励起することが可能な表面プラズモンセンシング方法および表面プラズモンセンシング装置の提供を目的とするものである。

上記目的を達成するために、本発明者は、励起光をプリズムに入射する前に励起光の偏光状態を制御することに注目して、本発明に至った。

すなわち、本発明による散乱光検出方法は、誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面の所定領域に設けられ、かつ被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
誘電体プリズムと金属膜との界面に対して、金属膜に表面プラズモンを発生せしめるように、誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
この表面プラズモンを利用して被検出物質を検出する表面プラズモンセンシング方法において、
上記界面に入射される際に励起光のｐ偏光の強度が最大となるように、誘電体プリズムに入射される前の励起光の偏光状態を調整することを特徴とするものである。

ここで、「ｐ偏光」とは、励起光または反射光のうち誘電体プリズムと金属膜との界面に対してｐ偏光の状態にある成分光を意味するものとする。なお、本発明において同様に「ｓ偏光」とは、励起光または反射光のうち誘電体プリズムと金属膜との界面に対してｓ偏光の状態にある成分光を意味するものとする。

さらに、本発明による表面プラズモンセンシング方法において、励起光の上記界面における反射光を光検出器によって検出し、反射光の強度が最小となるように、励起光を発する光源の前に配置された偏光調整素子を、自動偏光調整機構により自動的に操作して、偏光状態を調整することが好ましい。

なおこの場合には、反射光のｓ偏光を検出し、このｓ偏光の強度が最小となるように偏光状態を調整することが好ましく、或いは反射光のｐ偏光を検出し、このｐ偏光の強度が最大となるように偏光状態を調整することが好ましい。

一方、本発明による表面プラズモンセンシング装置は、誘電体プリズムと、
誘電体プリズムの一面の所定領域に設けられ、かつ被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
誘電体プリズムと金属膜との界面に対して、金属膜に表面プラズモンを発生せしめるように、誘電体プリズムを通して励起光を照射する光源とを有し、
表面プラズモンを利用して被検出物質を検出する表面プラズモンセンシング装置において、
界面に入射される際に励起光のｐ偏光の強度が最大となるように、誘電体プリズムに入射される前の励起光の偏光状態を調整する偏光調整手段を有することを特徴とするものである。

さらに、本発明による表面プラズモンセンシング装置において、偏光調整手段が、
励起光の上記界面における反射光を検出するように配置された光検出器と、
光源の前に配置された、偏光状態を調整する偏光調整素子と、
反射光の強度が最小となるように、偏光調整素子を自動的に操作する自動偏光調整機構とを有することが好ましい。

なおこの場合には、反射光のｓ偏光を検出するように配置された偏光子と、このｓ偏光の強度が最小となるように、偏光状態を調整する手段を有することが好ましく、或いは反射光のｐ偏光を検出するように配置された偏光子と、このｐ偏光の強度が最大となるように、偏光状態を調整する手段を有することが好ましい。

本発明による散乱光検出方法によれば、ＳＰＲを利用する全反射光学測定において、誘電体プリズムと金属膜との界面に入射される際に励起光のｐ偏光の強度が最大となるように、誘電体プリズムに入射される前の励起光の偏光状態を調整しているため、複屈折率を有する誘電体プリズムを用いても表面プラズモンを有効に励起することができる。すなわち、安価な樹脂製の誘電体プリズム等を用いても測定が行えるようになるためコストを低減することが可能となる。さらに、効率よくかつ測定ごとに再現性よく励起光のエネルギーを表面プラズモンの励起に利用することができるため、測定効率を上げると共に検出の定量性を向上させることも可能となる。

以下、本発明における最良の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。

「表面プラズモンセンシング方法および装置」
＜第１の実施形態＞
複屈折率を有する誘電体プリズム６を用いて、ＳＰＲを利用する全反射光学測定を行う場合を考える（図１Ａ・Ｂ）。座標系を光軸に沿ってｐ偏光方向、ｓ偏光方向（紙面垂直方向）のそれぞれがｙ軸、ｘ軸になるようにとる。

図１Ａに示すように、ｐ偏光のみを持つ直線偏光状態Ｐで誘電体プリズム６に入射した励起光Ｌｉは、誘電体プリズム６が有する複屈折率によって偏光状態が変わる。より具体的には、励起光Ｌｉが誘電体プリズム６に入射してから誘電体プリズム６と金属膜２０との界面２０ａに至るまでに、ｐ偏光およびｓ偏光の間に位相差δが生じて、例えば右回り楕円偏光状態Ｃ１に変化する。

このとき、励起光Ｌｉのうちｐ偏光成分は表面プラズモン励起に寄与できるが、偏光状態の回転により生じたｓ偏光成分は表面プラズモンを励起することができない。すなわち、表面プラズモンを励起することができる励起光量が実質的に減少するという問題が生じることになる。

この問題を解決するために本発明による表面プラズモンセンシング方法および装置では、あらかじめ励起光Ｌｉの偏光状態を上記の位相差と逆の位相差を持つ左回り楕円偏光状態Ｃ２にしてから、励起光Ｌｉを誘電体プリズム６に入射する。例えば、誘電体プリズム６による複屈折の影響により、上記のように誘電体プリズム６内で位相差δの右回り楕円偏光状態Ｃ１となってしまう場合には、誘電体プリズムに入射される前に、あらかじめ励起光Ｌｉの偏光状態を位相差−δの左回り楕円偏光状態Ｃ２になるように調整する。このように誘電体プリズム６内で生じる位相差δをあらかじめ与えておいた位相差−δによって相殺することで、励起光Ｌｉの上記界面２０ａに到達した際の偏光状態をｐ偏光のみを持つ直線偏光状態Ｐとする（図１Ｂ）ことにより、励起光のエネルギーを表面プラズモンの励起に有効に利用することが可能となる。

上記のような偏光状態の調整方法を踏まえて、以下第１の実施形態について図面を用いて説明する。

図２Ａは、本実施形態による表面プラズモンセンシング方法を用いて、試料１の物性を測定する場合に用いる表面プラズモンセンシング装置の概略部分断面図である。

図示の通り、この表面プラズモンセンシング装置は、励起光Ｌｉを発する光源８と、誘電体プリズム基板６と、誘電体プリズム基板６上に形成された金属膜２０と、励起光Ｌｉの偏光状態を調整することができるように配置された偏光調整素子Ｄと、誘電体プリズム基板６と金属膜２０との界面２０ａによる励起光Ｌｉの反射光Ｌｓを検出するように配置された第１の光検出器３０ａと、第１の光検出器３０ａの前に配置された反射光Ｌｓの特定偏光成分のみを抽出する偏光子Ｈと、第１の光検出器３０ａからの検出信号に応じ偏光調整素子Ｄを操作する自動偏光調整機構４０とを備えてなるものである。なお、光源８は、界面２０ａで全反射条件を満たすような位置に配置されている。また、図中には金属膜２０上に供給された試料１も同時に示している。

励起光Ｌｉは、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、測定条件により適宜選択される。

光源８は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源８は、励起光Ｌｉを界面２０ａで全反射条件を満たすように誘電体プリズム基板６を通して入射させるために、励起光Ｌｉを導光するためのミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることが好ましい。

誘電体プリズム基板６は、例えば樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。樹脂製基板を用いた場合には、基板が安価であるという利点があり、ガラス製基板を用いた場合には、不純物や表面凹凸による散乱（この散乱は検出信号に対するノイズとなる）が小さいという利点があるため、用途および検出条件に合わせ適宜選択することが好ましい。誘電体プリズム基板６を樹脂から形成する場合には、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等を用いることができる。

金属膜２０は、その薄膜材料として、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ等を用いることが望ましい。また、金属膜２０の堆積方法は、例えば、スパッタリング法、蒸着法、めっき法、金属コロイドを用いた塗布法やスプレー法などの各種の薄膜作製方法によって形成することができ、これらの方法は使用する材料に応じて適宜選択することができる。一方その膜厚も、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から、２０ｎｍ〜６０ｎｍ の範囲にあることが望ましい。

偏光調整素子Ｄは、例えばλ／２板Ｄ１およびλ／４板Ｄ２からなるものであり、λ／２板Ｄ１によって偏光軸の傾きを調整し、λ／４板Ｄ２によって偏光状態の広がり具合を調整する。なお、偏光調整素子Ｄは、これらに制限されるものではなく、ポッケルスセル等を用いてもよい。

第１の光検出器３０ａは、試料１中に含まれる蛍光標識が発する微弱な蛍光を定量的に検出するもので、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。しかしながら、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、第１の光検出器３０ａは、検出条件に応じてフィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。

偏光子Ｈは、散乱光Ｌｓの特定偏光成分を抽出することができれば、特に制限されず偏光プリズムおよび偏光板等を用いることできる。

自動偏光調整機構４０は、第１の光検出器３０ａからの検出信号に応じて、界面２０ａに入射される際に励起光Ｌｉのｐ偏光の強度が最大となるように、誘電体プリズム基板６に入射される前の励起光Ｌｉの偏光状態を調整するため偏光調整素子Ｄを操作するものである。自動偏光調整機構４０は、パーソナルコンピューター（ＰＣ）等を含む。

そして、本実施形態による表面プラズモンセンシング方法は、界面２０ａで全反射条件を満たすように励起光Ｌｉを入射して、金属膜２０内に表面プラズモンを励起させるように界面２０ａでの反射角を変えながら、偏光子Ｈを通して反射光Ｌｓを第１の光検出器３０ａでモニタリングし、その反射光Ｌｓの角度スペクトルを求めて、スペクトル中に現れる吸収ピーク（暗線）から、金属膜２０に接している試料１の屈折率あるいはその変化等の物性を測定する。このとき、第１の光検出器３０ａは、反射光Ｌｓのｓ偏光成分を偏光子Ｈで抽出しながら、その検出信号を自動偏光調整機構４０にフィードバックして、自動偏光調整機構４０はこのｓ偏光の強度が最小となるように偏光調整素子Ｄを操作して励起光Ｌｉの偏光状態を調整する。なお暗線測定時は、偏光子を取り除くか反射光Ｌｓのｐ偏光成分のみが透過するように調整する。

上記の方法では、励起光Ｌｉが金属膜２０に反射され反射光Ｌｓが誘電体プリズム基板６内を伝搬するときにも、誘電体プリズム基板６による複屈折の影響を受けるが、これは励起光Ｌｉの照射点を調整して、反射光Ｌｓが反射して誘電体プリズム基板６内を伝搬する距離を極力短くすることによって回避できる。本実施形態では、励起光Ｌｉの照射点を誘電体プリズム基板６の端に近づけることにより、反射光Ｌｓが誘電体プリズム基板６内を伝搬する距離を短くしている。

以下、本実施形態における作用を示す。

図２Ｂは、横軸が誘電体プリズム基板６による複屈折の位相差量、縦軸が入射光に対する反射光Ｌｓのｓ偏光の相対強度である。

誘電体プリズム基板６による複屈折の影響がない場合、つまり励起光Ｌｉが誘電体プリズム６に入射してから界面２０ａに至るまでに生じる位相差が０である場合には、反射光Ｌｓにはｓ偏光が含まれないので、検出光のジョーンズベクトルのｘ成分の大きさは０になる。一方、位相差がδである場合には、複屈折によりｓ偏光成分が現れるので、検出光のジョーンズベクトルのｘ成分の大きさは［（１−ｃｏｓδ）／２］^１／２となる。

図２Ｂより、界面２０ａにおいて励起光Ｌｉがｐ偏光のみを持つ直線偏光状態Ｐであるためには、第１の光検出器３０ａで検出される反射光Ｌｓのｓ偏光の強度が０となればよい。したがって、本発明による表面プラズモンセンシング方法においては、第１の光検出器３０ａにより反射光Ｌｓのｓ偏光成分を偏光子Ｈで抽出しながら、その検出信号を自動偏光調整機構４０にフィードバックして、自動偏光調整機構４０よりこのｓ偏光の強度が最小となるように偏光調整素子Ｄを操作して励起光Ｌｉの偏光状態を調整している。

これにより、界面２０ａに入射される際に励起光Ｌｉのｐ偏光の強度が最大となるため、複屈折率を有する誘電体プリズム６を用いても表面プラズモンを有効に励起することができる。すなわち、安価な樹脂製の誘電体プリズム等を用いても測定を行えるようになるためコストを低減することが可能となる。さらに、効率よくかつ測定ごとに再現性よく励起光Ｌｉのエネルギーを表面プラズモンの励起に利用することができるため、測定効率を上げると共に検出の定量性を向上させることも可能となる。

＜第２の実施形態＞
図３は、本実施形態による表面プラズモンセンシング方法を用いて、被検出物質としての抗原２を含む試料１から、抗原２を検出する場合に用いる表面プラズモンセンシング装置の概略部分断面図である。本実施形態は、第１の実施形態において金属膜２０上に試料保持部７と、不撓性膜２１と、不撓性膜２１上に固定された抗原２に特異的に結合する１次抗体３と、蛍光標識５から発せられる蛍光を検出する第２の光検出器３０ｂを有する点において異なる。したがって、第１の実施形態と同様の要素の説明は特に必要のない限り省略する。

図示の通り、この表面プラズモンセンシング装置は、所定波長の励起光Ｌｉを発する光源８と、この励起光Ｌｉを一面から透過させるように配された、励起光Ｌｉを透過させる材料からなる誘電体プリズム基板６と、この誘電体プリズム基板６上に成膜された金属膜２０と、金属膜２０上に形成された不撓性膜２１と、不撓性膜２１上に固定されかつ抗原２に特異的に結合する１次抗体３と、不撓性膜２１に試料１が接するように試料１を保持する試料保持部７と、励起光Ｌｉの偏光状態を調整することができる偏光調整素子Ｄと、誘電体プリズム基板６と金属膜２０との界面２０ａでの反射光Ｌｓを検出する第１の光検出器３０ａと、蛍光標識５が発する蛍光を検出可能な位置に配された第２の光検出器３０ｂと、第１の光検出器３０ａの前に配置された反射光Ｌｓの特定偏光成分のみを抽出する偏光子Ｈと、第１の光検出器３０ａからの検出信号に応じ偏光調整素子Ｄを操作する自動偏光調整機構４０とを備えてなるものである。そして、図中には、試料１中に含まれる蛍光標識５と、これに施され特異的結合性を付与する２次抗体４も同時に示している。

不撓性膜２１は、その薄膜材料として、例えばシリコン酸化膜やポリマー材料等を用いることができる。この場合、特に成膜条件や表面処理条件等の観点からポリマー材料が望ましい。例えばこの場合、スピンコート等の簡便な方法により作成することができる。また、本発明のように不撓性膜２１が疎水性材料から形成されている場合には、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる因子が不撓性膜２１の内部にまで入り込むことが無く、これらの消光因子によって蛍光標識５の励起エネルギーが奪われることが防止される。

そして、不撓性膜２１の膜厚は１０ｎｍ〜１００ｎｍとする。ここで、上記膜厚の下限値および上限値をそれぞれ１０ｎｍ、１００ｎｍと規定したのは以下の理由による。

金属の近傍に存在する蛍光材料は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして、金属膜の場合は、金属と蛍光材料との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。これにより、本発明では不撓性膜２１の膜厚の下限値を１０ｎｍとする。一方、蛍光材料は、エバネッセント波によって励起される。このエバネッセント波は、金属膜表面から高々励起光の波長程度であり、その電界強度は金属膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際に、波長６３５ｎｍの可視光について両者の関係を計算によって求めると、エバネッセント波が到達するのは波長（６３５ｎｍ）程度である。しかしながら、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光材料を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属膜表面と蛍光材料との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。これにより、本発明では不撓性膜２１の膜厚の上限値を１００ｎｍとする。

試料保持部７は、試料１を検出部上（本実施形態において、より正確には不撓性膜２１上）に接するように保持でき、試料１中に含まれる蛍光標識５から発せられる蛍光の検出を妨げないような形状や材料であれば特に制限されるものではない。蛍光を上方から検出する場合には、例えば図３中に示すような、光を透過させない側面と光をよく透過させる上端面からなる試料保持部７等を用いることができる。ここで、光を透過させない側面を用いているのは、意図しない外部からの光を遮断するためである。

第２の光検出器３０ｂは、第１の光検出器３０ａと同様である。

１次抗体３は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原２がＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原と特異的に結合するモノクロナール抗体（２次抗体４と少なくともエピトープが異なる）等を用いることができ、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、ポリマー材料からなる場合の不撓性膜２１に固定することができる。上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、３０ｕｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。

（１）リンカー部先端（末端）の−ＣＯＯＨ基を活性化
０．１ＭのＮＨＳと０．４ＭのＥＤＣとを等体積混合した溶液を３０ｕｌ加え、３０分間室温静置する。

NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
（２）１次抗体の固定化
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１次抗体溶液（５００ｕｇ／ｍｌ）を３０ｕｌ加え、３０〜６０分間室温静置する。

（３）未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキング
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０ｕｌ加え、２０分間室温静置する。さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄する。

そして、本実施形態による表面プラズモンセンシング方法は、不撓性膜２１上に１次抗体３を固定し、抗原２を含む試料１を流して、この抗原２を１次抗体３に結合させ、その後蛍光標識５で標識されかつ抗原２と特異的に結合する２次抗体４を流し、１次抗体３に結合した抗原２に結合させて、いわゆるサンドイッチ方式により蛍光標識５を不撓性膜２１に固定し、その後界面２０ａに対し全反射条件を満たすように励起光Ｌｉを入射して、エバネッセント波２２を発生させると同時に表面プラズモンを励起し、不撓性膜２１に固定された蛍光標識５による蛍光を第２の光検出器３０ｂによって検出するものである。このとき、第１の光検出器３０ａは反射光Ｌｓのｓ偏光成分を偏光子Ｈで抽出しながら、その検出信号を自動偏光調整機構４０にフィードバックして、自動偏光調整機構４０はこのｓ偏光の強度が最小となるように偏光調整素子Ｄを操作して励起光Ｌｉの偏光状態を調整する。

ここで、以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識５であるが、この蛍光標識５は抗原２がなければ不撓性膜２１上に固定されないものと考えて、この蛍光標識５の存在を確認することにより、間接的に抗原２の存在を確認している。

以下、本実施形態における作用を示す。

上記のように本実施形態においても、第１の光検出器３０ａにより反射光Ｌｓのｓ偏光成分を偏光子Ｈで抽出しながら、その検出信号を自動偏光調整機構４０にフィードバックして、自動偏光調整機構４０よりこのｓ偏光の強度が最小となるように偏光調整素子Ｄを操作して励起光Ｌｉの偏光状態を調整しているため、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。

さらに、上記のようなエバネッセント波２２の到達領域に関する特性により、意図せず試料中に残ってしまった不純物９０からの散乱や浮遊蛍光標識５’からの発光等の影響を大幅に低減することができるため、Ｓ／Ｎ比のよい蛍光検出が可能となる。また、金属膜２０を用いて表面プラズモン励起することにより、この表面プラズモンの電場増強効果によって蛍光の強度を増強させることができるため、よりＳ／Ｎ比のよい蛍光検出が可能となる。

＜第３の実施形態＞
図４は、本実施形態による表面プラズモンセンシング方法を用いて、被検出物質としての抗原２を含む試料１から、抗原２を検出する場合に用いる表面プラズモンセンシング装置の概略部分断面図である。本実施形態は、第２の実施形態において、不撓性膜２１が無く、かつ抗原２に特異的に結合する１次抗体３が金属膜２０上に固定されている点と、蛍光標識として蛍光ビーズＦＢを用いている点において異なる。したがって、第２の実施形態と同様のその他の要素の説明は特に必要のない限り省略する。

図示の通り、この表面プラズモンセンシング装置は、所定波長の励起光Ｌｉを発する光源８と、この励起光Ｌｉを一面から透過させるように配された、励起光Ｌｉを透過させる材料からなる誘電体プリズム基板６と、この誘電体プリズム基板６上に成膜された金属膜２０と、金属膜２０上に固定されかつ抗原２に特異的に結合する１次抗体３と、金属膜２０に試料１が接するように試料１を保持する試料保持部７と、励起光Ｌｉの偏光状態を調整することができる偏光調整素子Ｄと、誘電体プリズム基板６と金属膜２０との界面２０ａでの反射光Ｌｓを検出する第１の光検出器３０ａと、蛍光標識５が発する蛍光を検出可能な位置に配された第２の光検出器３０ｂと、第１の光検出器３０ａの前に配置された反射光Ｌｓの特定偏光成分のみを抽出する偏光子Ｈと、第１の光検出器３０ａからの検出信号に応じ偏光調整素子Ｄを操作する自動偏光調整機構４０とを備えてなるものである。そして、図中には、試料１中に含まれる蛍光ビーズＦＢと、これに施され特異的結合性を付与する２次抗体４も同時に示している。

蛍光ビーズＦＢは、蛍光色素分子１５と、蛍光色素分子１５を内包すると共に蛍光色素分子１５から生じる蛍光を透過する透光材料１６とからなるものである。そして蛍光ビーズＦＢは、粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましく、５００ｎｍ以下のものがさらに好ましく、１３０〜５００ｎｍのものが特に好ましい。透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ_２などが挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、この蛍光色素１５からの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。蛍光ビーズＦＢは蛍光色素分子１５が透光材料１６で覆われているものであるため、金属膜２０上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜２０と蛍光色素分子１５との距離をある程度を離間させることができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。蛍光ビーズＦＢの透光材料１６に含まれる蛍光色素分子１５の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。

なお、光源８と蛍光ビーズＦＢの好適な組合せの具体例としては以下の組合せが挙げられる。
例えば、波長６５５ｎｍのＬＤ光源(品番ＤＬ−３１４７−１６０Ｆ、ＤＬ−３３５７−１６５、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製)に対して蛍光ビーズ(品番ＦＣ０３Ｆ／８１９６、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製)あるいは蛍光ビーズ（品番Ｆ８８０７、直径２００ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）、もしくは波長６３５ｎｍのＬＤ光源（品番ＤＬ−３１４８−０２３、ＤＬ−３０３８−０１１、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製）に対して、蛍光ビーズ（品番Ｆ８８１６、直径１０００ｎｍ、励起波長６２５ｎｍ、蛍光波長６４５ｎｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の組合せがある。

蛍光ビーズＦＢへの２次抗体４修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
蛍光粒子（ビーズ）溶液（品番ＦＣ０３Ｆ／８１９６、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクロナール抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光ビーズＦＢへの抗体の修飾がなされる。

次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により蛍光粒子を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、蛍光粒子を再分散させて標識用溶液とする。

１次抗体３は、第２の実施形態と同様のものである。

そして、本実施形態による表面プラズモンセンシング方法は、金属膜２０上に１次抗体３を固定し、抗原２を含む試料１を流して、この抗原２を１次抗体３に結合させ、その後蛍光ビーズＦＢで標識されかつ抗原２と特異的に結合する２次抗体４を流し、１次抗体３に結合した抗原２に結合させて、いわゆるサンドイッチ方式により蛍光ビーズＦＢを金属膜２０に固定し、その後界面２０ａに対し全反射条件を満たすように励起光Ｌｉを入射して、エバネッセント波２２を発生させると同時に表面プラズモンを励起し、金属膜２０に固定された蛍光ビーズＦＢによる蛍光を第２の光検出器３０ｂによって検出するものである。このとき、第１の光検出器３０ａは反射光Ｌｓのｓ偏光成分を偏光子Ｈで抽出しながら、その検出信号を自動偏光調整機構４０にフィードバックして、自動偏光調整機構４０はこのｓ偏光の強度が最小となるように偏光調整素子Ｄを操作して励起光Ｌｉの偏光状態を調整する。

以下、本実施形態における作用を示す。

上記のように本実施形態においても、第１の光検出器３０ａにより反射光Ｌｓのｓ偏光成分を偏光子Ｈで抽出しながら、その検出信号を自動偏光調整機構４０にフィードバックして、自動偏光調整機構４０よりこのｓ偏光の強度が最小となるように偏光調整素子Ｄを操作して励起光Ｌｉの偏光状態を調整しているため、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。

また、本実施形態においても、エバネッセント波２２を発生させると同時に表面プラズモンを励起しているため、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。

さらに、本実施形態の場合は、蛍光標識として複数の蛍光色素分子１５が透光材料１６で覆われている蛍光ビーズＦＢを用いることにより、第２の実施形態のように金属膜２０上に金属消光を防止するための不撓性膜２１を設けなくても、金属膜２０と蛍光色素分子１５との距離をある程度を離間させると共に、金属膜２０から１０〜１００ｎｍの距離の範囲に複数の蛍光色素分子１５が存在する状態を容易に達成することができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。

＜設計変更＞
上記の第１および第２の実施例では、励起光がただ一つの角度を持つ平行光であるとして説明してきたが、励起光は図５のようなある角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）Ｌｉ’を用いてもよい。ファンビームＬｉ’では、入射角が角度θ−Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲で入射することができる。ここでθはファンビームの中心入射角である。

これにより、この範囲内に共鳴角があれば、表面プラズモンを励起することができるため、共鳴角の微妙な調整を簡略化することが可能となる。例えば第１の実施形態において、平行光では、金属膜２０上に供給された試料１の屈折率が測定ごとに異なることによって、入射角が共鳴角とずれてしまうため入射角の調整がその測定ごとに必要となるが、ファンビームでは、試料１の屈折率が測定ごとに異なっても入射角に幅があるため入射角の調整をすることなく共鳴角と一致する励起光を照射することが可能になる。この場合には、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものがより好ましい。

さらに、第１および第２の実施例では、偏光状態の調整指標として反射光Ｌｓのｓ偏光の強度を用いたが、反射光Ｌｓのｐ偏光の強度を偏光状態の調整指標としてもよい。これは、ｓ偏光の強度が最小になっていればｐ偏光の強度が最大になっているためである。或いは、ｐ偏光およびｓ偏光を含む反射光Ｌｓの全強度を偏光状態の調整指標としてもよい。これは、反射光Ｌｓの全強度が最小になれば、励起光Ｌｉのエネルギーは表面プラズモンの励起に最適化されて用いられたことになるためである。

しかしながら、偏光状態の調整指標としては、以下に示す理由により反射光Ｌｓのｓ偏光の強度を用いることが好ましい。

図６は、反射光のｐ偏光およびｓ偏光それぞれの界面２０ａ（図２Ａ、図３および図４）に対する入射角とその反射率を示すグラフである。例えばｐ偏光の強度のみを偏光状態の調整指標として用いた場合があまり好ましくないのは、Ｑ点のようなｐ偏光の暗線が現れる角度でｐ偏光の反射光量自体が少なくなり、強度の最大値および最小値を区別することが困難となってしまうためである。

一方、反射光Ｌｓの全強度を偏光状態の調整指標として用いた場合があまり好ましくないのは、Ｑ点のような角度では大きな問題はないが、Ｒ点のようなｐ偏光およびｓ偏光それぞれの反射率の差が小さい角度で強度の最大値および最小値を区別することが困難となってしまうためである。これは、ｐ偏光およびｓ偏光の反射率がそれぞれ１０％、９５％であるＱ点では、ｓ偏光をｐ偏光へと変化させるとそのｐ偏光の大部分が表面プラズモンを励起するために吸収されるので、反射光Ｌｓの全強度の減少幅が大きいが、ｐ偏光およびｓ偏光の反射率がそれぞれ８５％、９５％であるＲ点では、ｓ偏光をｐ偏光へと変化させてもそのｐ偏光の大部分がそのまま反射されるので、反射光Ｌｓの全強度の減少幅が小さいためである。

また、第１および第２の実施例では、標識物質として蛍光体分子や蛍光ビーズ等の蛍光標識を用いているが、本発明ではこのようなものに限定されず、金属微粒子、量子ドットおよび量子ドットビーズ等の光と相互作用する材料であれば適宜使用することができる。

従来法における励起光の誘電体プリズム内での偏光状態の変化を示す概略断面図 本発明における励起光の誘電体プリズム内での偏光状態の変化を示す概略断面図 第１の実施形態における表面プラズモンセンシング装置を示す概略断面図 入射光に対する反射光のｓ偏光の相対強度と複屈折の位相差の関係を示す図 第２の実施形態における表面プラズモンセンシング装置を示す概略断面図 第３の実施形態における表面プラズモンセンシング装置を示す概略断面図 ファンビームを入射した状態を示す概略断面図 反射光のｐ偏光およびｓ偏光それぞれの入射角とその反射率を示す図

符号の説明

１ 試料
２ 抗原
３ １次抗体
４ ２次抗体
５ 蛍光標識
５’ 浮遊蛍光標識
６ 誘電体プリズム基板
７ 試料保持部
８ 光源
１５ 蛍光色素分子
１６ 透光材料
２０ 金属膜
２０ａ 反射界面
２１ 不撓性膜
２２ エバネッセント波
３０ａ・ｂ 光検出器
４０ 自動偏光調整機構
９０ 試料中の不純物
Ｐ ｐ偏光状態
Ｃ１ 右回り楕円偏光状態
Ｃ２ 左回り楕円偏光状態
Ｄ 偏光調整素子Ｄ
Ｄ１ λ／２板
Ｄ２ λ／４板
Ｈ 偏光子
Ｌｉ 励起光
Ｌｉ’ ファンビーム
Ｌｓ 反射光
ＦＢ 蛍光ビーズ
θ ファンビームの中心入射角
Δθ ファンビームの角度幅

Claims (8)

1. 誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面の所定領域に設けられ、かつ被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
   前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して、該金属膜に表面プラズモンを発生せしめるように、該誘電体プリズムを通して励起光を照射し、
   該表面プラズモンを利用して前記被検出物質を検出する表面プラズモンセンシング方法において、
   前記界面に入射される際に前記励起光のｐ偏光の強度が最大となるように、前記誘電体プリズムに入射される前の前記励起光の偏光状態を調整することを特徴とする表面プラズモンセンシング方法。
2. 前記励起光の前記界面における反射光を光検出器によって検出し、該反射光の強度が最小となるように、前記励起光を発する光源の前に配置された偏光調整素子を、自動偏光調整機構により自動的に操作して、前記偏光状態を調整することを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモンセンシング方法。
3. 前記反射光のｓ偏光を検出し、該ｓ偏光の強度が最小となるように前記偏光状態を調整することを特徴とする請求項２に記載の表面プラズモンセンシング方法。
4. 前記反射光のｐ偏光を検出し、該ｐ偏光の強度が最大となるように前記偏光状態を調整することを特徴とする請求項２に記載の表面プラズモンセンシング方法。
5. 誘電体プリズムと、
   該誘電体プリズムの一面の所定領域に設けられ、かつ被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
   前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対して、該金属膜に表面プラズモンを発生せしめるように、該誘電体プリズムを通して励起光を照射する光源とを有し、
   該表面プラズモンを利用して前記被検出物質を検出する表面プラズモンセンシング装置において、
   前記界面に入射される際に前記励起光のｐ偏光の強度が最大となるように、前記誘電体プリズムに入射される前の前記励起光の偏光状態を調整する偏光調整手段を有することを特徴とする表面プラズモンセンシング装置。
6. 前記偏光調整手段が、
   前記励起光の前記界面における反射光を検出するように配置された光検出器と、
   前記光源の前に配置された、前記偏光状態を調整する偏光調整素子と、
   前記反射光の強度が最小となるように、前記偏光調整素子を自動的に操作する自動偏光調整機構とを有することを特徴とする請求項５に記載の表面プラズモンセンシング装置。
7. 前記反射光のｓ偏光を検出するように配置された偏光子と、
   該ｓ偏光の強度が最小となるように前記偏光状態を調整する手段を有することを特徴とする請求項６に記載の表面プラズモンセンシング装置。
8. 前記反射光のｐ偏光を検出するように配置された偏光子と、
   該ｐ偏光の強度が最大となるように前記偏光状態を調整する手段を有することを特徴とする請求項６に記載の表面プラズモンセンシング装置。

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