JP2009058288A - 液体試料分注方法、加温装置、並びに液体試料の自動分注方法および自動分注装置 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸の検出など、生体関連物質の解析を高精度かつ簡便に行うのに好適な液体試料の分注方法およびこれに用いる装置を提供する。
【解決手段】液体試料分注用のピペットチップを加温して、該ピペットチップ内にて、分注に供する液体試料を加温処理する工程を有することを特徴とする液体試料分注方法；かかる分注方法に用いる加温装置であって、液体試料分注用のピペットチップを４０〜１００℃に加温する加温手段と、前記ピペットチップを、その吸引吐出口を該加温手段に接触させずに保持する保持手段とを備えることを特徴とする加温装置。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体関連物質の解析を高精度かつ簡便に行うのに好適な液体試料の分注方法および自動分注方法、並びにこれらに用いる液体試料の加温装置および自動分注装置に関する。

近年、遺伝子発現頻度を検出する手法として、検出対象である標的核酸に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を基板に固相化し、標的核酸を該プローブ核酸にハイブリダイゼーションさせて検出する、所謂プローブアレイによる解析法が採用されている。
そして従来は、基板としてナイロン膜を使用し、プローブ核酸を、その分子中の正電荷を利用してナイロン膜に固相化していた。
さらに近年では、マイクロアレイ技術の進歩により、効率的な解析法が提案されている。例えば、一定規格のスライドグラス（約７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を用いて、多種類のプローブ核酸を高密度に基板に固相化する方法や、フォトリソグラフィー技術により半導体基板にプローブ核酸を結合させる方法などが知られている。これらのマイクロアレイ技術の採用により、従来、基板としてナイロン膜を使用した場合では、一つあたりのスポットの径が３〜５ｍｍであったのに対し、ガラス基板を使用してスポットの径を１００〜３００μｍと極微小にすることが可能になり、基板に固相化されるプローブは大幅に高密度化されてきている。具体的には、一枚のマイクロアレイ上に数千個から数万個のプローブを固相化することが可能となり、大規模な遺伝子発現頻度解析の有用な手段となっている。今後さらに、検出感度の向上、マイクロ化による試料使用量の削減、データ取得および処理の自動化による簡略化などによって、一層の飛躍的な進歩が期待されている。

一方、ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出は、従来、化学発光やラジオアイソトープの検出によって行われている。そして、検出感度や検出結果の再現性などといった検出精度は、マイクロアレイの精度は勿論のこと、ハイブリダイゼーションそのものの精度によっても大きく左右される。
例えば、ハイブリダイゼーションでは、使用する液体試料の塩濃度および温度、並びに手技によって結果が大きく左右される。よって、これらの変動を抑制することが、検出精度の向上には不可欠である。
例えば、解析中の液体試料の温度を管理することで精度の高い検出結果を得る方法が開示されている（特許文献１参照）。この方法は、核酸の検出において最も時間を要しかつ広い実験スペースを要するハイブリダイゼーション工程を、核酸が固定化された磁性粒子を使用し、極めて単純な動作で自動化して行うことで、より正確な検出結果を得ようとするものである。特に磁気分離のステージとアニーリングステージが一体化されているので、液体試料が注入された容器を移動する必要がなく、磁気分離工程からハイブリダイゼーション工程への温度変化が最小限に抑制される。また、解析用の液体試料を９５℃に加温することにより、該試料中の核酸を一本鎖化（熱変性）することで、ハイブリダイゼーション時の非特異的吸着を最小限に抑制し、高精度に検出を行おうとするものである。
特開２００３−２７４９２５号公報

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、液体試料が９５℃で５分間保持され、さらに磁気制御装置の動作中や待機状態中も９５℃で保持されるため、加温中に該試料中の溶媒が蒸発して、液体試料の塩濃度が変動したり、最悪の場合は溶媒がなくなってしまうという問題点があった。このような問題点は、特に検体数が多くなるほど、ハイブリダイゼーションを行う際の液体試料の分注時間が長くなるため顕著であり、初期に分注したものと後期に分注したものとでは液体試料の塩濃度の差が大きくなり、ハイブリダイゼーションを一定の条件下で行うことが困難で、高精度な検出結果が得られないという問題点があった。また、検出装置が大きく複雑であるという問題点もあった。そして、このような問題点を解決した方法や装置はこれまでに提案されていないのが実情であった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、核酸の検出など、生体関連物質の解析を高精度かつ簡便に行うのに好適な液体試料の分注方法およびこれに用いる装置を提供すること課題とする。

上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、液体試料分注用のピペットチップを加温して、該ピペットチップ内にて、分注に供する液体試料を加温処理する工程を有することを特徴とする液体試料分注方法である。
請求項２に記載の発明は、前記液体試料が、核酸を含有する水溶液、または水への溶解度がドデシル硫酸ナトリウムと同等以下の水溶性物質を含有する水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の液体試料分注方法である。
請求項３に記載の発明は、前記液体試料が、核酸のハイブリダイゼーションに用いられるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の液体試料分注方法である。

請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体試料分注方法に用いる加温装置であって、液体試料分注用のピペットチップを４０〜１００℃に加温する加温手段と、前記ピペットチップを、その吸引吐出口を該加温手段に接触させずに保持する保持手段とを備えることを特徴とする加温装置である。
請求項５に記載の発明は、前記加温装置は箱状であり、前記保持手段は前記ピペットチップを、その吸引吐出口を前記加温装置内部に突出させて保持し、さらに前記加温装置内部の気体を循環させる気体循環手段を備えることを特徴とする請求項４に記載の加温装置である。
請求項６に記載の発明は、前記加温装置はピペット状であり、さらに液体試料の吸引および吐出を操作する操作手段を備え、前記保持手段に前記加温手段が一体化されたことを特徴とする請求項４に記載の加温装置である。
請求項７に記載の発明は、前記加温手段が、金属、ガラス、エンジニアリング・プラスチックおよびスーパーエンジニアリング・プラスチックからなる群から選択される一種以上の材質からなることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の加温装置である。
請求項８に記載の発明は、前記加温装置は金属ブロックであり、前記保持手段は、該金属ブロックに形成された、前記ピペットチップを該金属ブロックに挿入させる挿入孔の開口部であることを特徴とする請求項４に記載の加温装置である。
請求項９に記載の発明は、前記保持手段を複数備え、隣り合う前記ピペットチップの中心間距離を８〜１０ｍｍとすることを特徴とする請求項４〜８のいずれか一項に記載の加温装置である。
請求項１０に記載の発明は、前記加温手段が、加温時の温度を自動で制御する温度制御手段に電気的に接続されていることを特徴とする請求項４〜９のいずれか一項に記載の加温装置である。

請求項１１に記載の発明は、液体試料分注用のピペットチップを用いて自動で液体試料を吸引する工程、前記ピペットチップを加温して、該ピペットチップ内にて液体試料を自動で加温処理する工程、および自動で該ピペットチップ内の液体試料を吐出する工程を有することを特徴とする液体試料の自動分注方法である。

請求項１２に記載の発明は、請求項１１に記載の液体試料の自動分注方法に用いる液体試料の自動分注装置であって、液体試料の吸引および吐出を操作する操作部と、前記ピペットチップを４０〜１００℃に加温する加温手段、および前記ピペットチップを、その吸引吐出口を該加温手段に接触させずに保持する保持手段とを備える加温装置部を有し、前記操作部および加温手段が、前記液体試料の吸引、吐出および加温を自動で制御する制御手段に電気的に接続されていることを特徴とする液体試料の自動分注装置である。
請求項１３に記載の発明は、前記加温装置部が金属ブロックであり、前記保持手段が、該金属ブロックに形成された、前記ピペットチップを該金属ブロックに挿入させる挿入孔の開口部であることを特徴とする請求項１２に記載の液体試料の自動分注装置である。
請求項１４に記載の発明は、前記加温装置部が箱状であり、前記保持手段は前記ピペットチップを、その吸引吐出口を前記加温装置部内部に突出させて保持し、さらに前記加温装置部内部の気体を循環させる気体循環手段を備えることを特徴とする請求項１２に記載の液体試料の自動分注装置である。
請求項１５に記載の発明は、前記加温装置部がピペット状であり、前記保持手段に前記加温手段が一体化されたことを特徴とする請求項１２に記載の液体試料の自動分注装置である。

本発明によれば、生体関連物質の解析を高精度かつ簡便に行うことができ、特にハイブリダイゼーションを伴う核酸の検出に、本発明は好適である。

以下、本発明について、詳しく説明する。
＜液体試料分注方法＞
本発明の液体試料分注方法は、液体試料分注用のピペットチップを加温して、該ピペットチップ内にて、分注に供する液体試料を加温処理する工程を有するものである。
そして、本発明は、加温が必要な液体試料を分注するに際し、その溶媒の蒸発を抑制することで、濃度変化等の品質変化を抑制するものである。具体的には、ピペットチップ内に吸引および保持された液体試料を、ピペットチップを通じて加温する。この時、ピペットチップはその吸引吐出口が大気中に開放されているが、開口面積が小さいので、溶媒の蒸発量が少ない。さらに、加温後の液体試料の保持時間をおよそ１〜５分以内の一定時間とすることで、溶媒の蒸発量を極めて少なくできる。

分注に供する液体試料は、目的に応じて適宜選択すれば良く、特に限定されない。本発明の分注方法は、検出対象物質が微量な場合に特に好適であり、微量成分の解析が必要な試料はいずれも用いることができる。例えば、生体関連物質を含有する試料が好適である。
ここで生体関連物質とは、生体から抽出、単離等された物質、あるいはこれらを化学処理、化学修飾等したものを指す。具体的には、例えば、抗原、抗体、酵素、アブザイム、サイトカイン、腫瘍マーカー、その他のタンパク質、またはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の核酸、あるいはホルモン類、ハプテン等を挙げることができ、さらにこれらを化学処理あるいは化学修飾したもの等を挙げることができる。

なかでも液体試料としては、核酸、好ましくは非特異的に二本鎖構造をとっている核酸を含有する液体試料を用いた場合に、本発明はより優れた効果を奏する。核酸の検出には、この検出対象の核酸にプローブ核酸をハイブリダイゼーションさせる手法が汎用される。ハイブリダイゼーションを高精度に行うためには、加温により核酸を変性させて一本鎖とすることが必要であるが、ハイブリダイゼーションさせるまで核酸を変性した状態で維持する必要性から、核酸を含有する試料を加温する時間が長くなりがちである。特に、核酸のハイブリダイゼーションに用いられる試料の濃度が低いほど、溶媒の蒸発による濃度変化の影響を受け易い。

液体試料として、特に核酸等の生体関連物質を含有する試料を用いる場合には、洗浄液の分注操作が必要とされることが多い。そして洗浄液の中には、室温程度でも結晶化し易い成分を含有するものがある。このような洗浄液としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略記する）水溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびクエン酸緩衝生理食塩水（ＳＳＣ）、並びにこれらの混合液等が挙げられる。特にＳＤＳは結晶化し易い成分であり、その溶解度は、約１０g／１００mlである。洗浄液を用いる場合には、成分の一部が結晶化していると種々の弊害がある。例えば、洗浄能力が低下することは勿論のこと、検出に用いるマイクロアレイ上に析出した結晶が付着すると、これが不純物として認識され、解析精度を低下させることがある。また、流路の狭いマイクロアレイを用いる場合には、析出した結晶によって流路が詰まり、解析が行えなくなることがある。
しかし、本発明によれば、水への溶解度がＳＤＳと同等以下の水溶性物質を含有する水溶液を、分注に供する液体試料として用いた場合でも、加温によって結晶の析出が抑制されるので、洗浄液の分注により洗浄効率、洗浄精度が向上し、解析を高精度に行うことができる。

液体試料分注用のピペットチップは、加温時に耐熱性を有するものであれば特に限定されず、使い捨て専用のものでも、再利用可能なものでも良く、通常使用される市販品で良い。生化学分野で使用される市販品のピペットチップは、通常オートクレーブ処理可能であり、本発明において使用可能である。
市販品のピペットチップは、熱伝導率の低い０．１４Ｗ／ｍＫのポリプロピレン製のものや、０．１９Ｗ／ｍＫのポリカーボネート製のものが多いが、液体試料の加温を効率良く行えるという観点から、例えば、熱伝導率が高いカーボン（熱伝導率；１２９Ｗ／ｍＫ）が含有されたＷＡＴＯＳＯＮ社製のピペットチップがより好適である。ＰＣやＡＢＳなどのカーボン充填率が高い樹脂材料のピペットチップを用いても良い。なお、ＰＣにカーボン線維を１０質量％添加した場合の熱伝導率の上昇は、およそ０．２Ｗ／ｍＫである（ＪＩＳ Ｒ２６１６、プローブ法）。

液体試料の加温処理は、例えば、予め加温されたピペットチップを用いて液体試料を吸引および保持し、ピペットチップを介して該液体試料を加温処理しても良いし、予め液体試料を吸引および保持した状態のピペットチップを加温することで行っても良い。この時の液体試料の温度は、目的に応じて適宜選択すれば良く、特に限定されない。ただし、ピペットチップの材質や通常必要とされる液体試料の温度等を考慮すると、ピペットチップの温度が４０〜１００℃となるように加温することが好ましい。

＜加温装置＞
次に、上記本発明の液体試料分注方法で用いる加温装置について説明する。
前記加温装置は、前記ピペットチップを４０〜１００℃に加温する加温手段と、前記ピペットチップを、その吸引吐出口を該加温手段に接触させずに保持する保持手段とを備えるものである。

前記加温手段は、熱源より発生した熱を直接、あるいはガスや適当な壁材などを介して間接的に、前記ピペットチップへ伝達するものである。その材質は、耐熱性を有するものであれば特に限定されるものではなく、アルミニウム、鉄、銅などの各種金属類、ステンレスなどの各種合金類、熱伝導性の各種樹脂類が例示できる。なかでも安定性、熱伝導性に優れることからアルミニウムが好ましい。

前記保持手段が前記ピペットチップを保持する形態は、ピペットチップの吸引吐出口を前記加温手段に接触させなければ如何なるものでも良い。例えば、保持手段の一部をピペットチップのピペットへの装着口に嵌合させて保持するようにしても良いし、保持手段の一部にピペットチップ外径よりも小さい孔径の孔を穿設して、ここへピペットチップを挿入して、前記孔に吸引吐出口以外の部位を接触させて保持するようにしても良い。あるいは、ピペットチップの吸引吐出口以外の部位を把持するようにして保持しても良い。

本発明においては、ピペットチップの吸引吐出口を加温手段に接触させないので、例えば、加温手段に不純物が付着していても、この不純物はピペットチップの吸引吐出口に付着することが無く、液体試料の解析を阻害することがない。ここで不純物とは、例えば、液体試料を解析に供した際にこの解析を阻害する薬品や微生物等のことを指す。

前記加温手段は、分注操作時にピペットチップを加温するために温度が上昇するので、加温温度が高いほど、微生物の加温手段表面での生育が抑制され、液体試料中への微生物混入が抑制される。
さらに、前記加温手段は、滅菌または洗浄処理可能な材質からなることが好ましい。加温装置を分注操作に供する前に、例えば、オートクレーブ、紫外線照射、煮沸滅菌、超音波洗浄等により滅菌または洗浄することで、一層高精度に解析を行うことができる。滅菌または洗浄処理可能な具体的な材質としては、金属、ガラス、エンジニアリング・プラスチックおよびスーパーエンジニアリング・プラスチックからなる群から選択される一種以上のものが例示できる。これらのうち二種以上の材質を併用する場合には、その組み合わせは目的に応じて適宜選択すれば良い。

以下、図面を参照しながら、具体的な実施形態を挙げて、液体試料分注方法と共にさらに詳しく説明する。
（第一の実施形態）
図１は、本発明の第一の実施形態に係る加温装置を例示する概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線における縦断面図である。
加温装置１は箱状であり、上面１２には、ピペットチップ１０を挿入する円形状の挿入孔１２ａ，１２ａ，・・が穿設されている。挿入孔１２ａ，１２ａ，・・の孔径は、ピペットチップ１０のピペット（図示略）への装着口１０ａの装着端の外径よりもやや小さく設定されている。挿入孔１２ａ，１２ａ，・・の数は、一列につき三個ずつで合計三列、すなわち九個である。
そして、該挿入孔１２ａより、ピペットチップ１０をその吸引吐出口１０ｂより加温装置１内部へ挿入することにより、装着口１０ａ近傍の外表面が前記挿入孔１２ａの周縁部に接触した状態で、ピペットチップ１０が着脱可能に保持される。すなわち、前記挿入孔１２ａは保持手段として機能する。

ピペットチップ１０は、このように挿入孔１２ａによって保持された状態で、その保持部から吸引吐出口１０ｂまでの長さＨ_Ｌが、加温装置１内部の空間の高さＨ_１よりもサイズが小さい。すなわち、ピペットチップ１０は、その吸引吐出口１０ｂが加温装置１内部に突出されて保持された状態で、該吸引吐出口１０ｂは、加温装置１の如何なる部位とも接触していない。

加温装置１内部には、加温手段としてヒーター１１が上面１２上に配置され、さらに、加温装置１内部において気体を循環させる気体循環手段としてファン１３が側面上に配置されている。そしてこれらは、ファン１３の回転軸と、ヒーター１１の熱発生源である螺旋部位の中心軸とが略一直線上に位置するように配置されており、ヒーター１１で加温された気体が、ファン１３で効率良く循環されるようになっている。なお、ここでは図示を省略するが、同様に加温された気体が効率よく循環されるようにするためには、例えば、図１において、ファン１３が、加温装置１の底部近傍の側面上に配置され、かつファン１３の回転軸の延長線が、ヒーター１１の螺旋部位の中心軸と交差するようにされていても良い。また、図１において、ヒーター１１が、その螺旋部位の中心軸がファン１３の回転軸の延長線と直交するように配置されていても良い。ただし、ヒーター１１およびファン１３が、上記のような位置関係で配置されていなくても、加温装置１内部において気体を十分循環させることができる。

ヒーター１１は、ピペットチップを４０〜１００℃に加温できるものであれば良く、そのためには、加温装置１内の気体を少なくとも４０℃以上に加温できることが必要である。このようなものであれば、例えば、ニクロム線ヒーターなど公知の如何なるものでも良い。
また、ファン１３も気流を生じさせることができるものであれば、ここに示すような回転翼を有するものをはじめ、公知の如何なるものでも良い。

加温装置１のうち、上面１２を始めとする六つの壁面の材質は、断熱性の高いものが好ましい。例えば、加温装置１の強度を高くするという観点からは、六つの壁面は金属製であることが好ましいが、金属製の壁面は熱伝導率が高いため、加温装置１内の気体の熱が外部へ逃げ易い。そこで、強度と断熱性を両立させるために、例えば、壁面として断熱材および金属製プレートを一層ずつ積層したもの、断熱材で金属製プレートを挟み込んだ構造のもの、金属製プレートで断熱材を挟み込んだ構造のものなどを用いると良い。あるいは、金属製の壁面からなる加温装置１の外表面を断熱材で覆うだけでも良い。ここで断熱材としては、グラスウールや発泡スチロールなど公知のものが例示できる。あるいは、このように断熱材を使用しなくても、加温装置１をウォータージャケットなど、公知の手段で直接加温しても良い。

上面１２は、加温装置１本体に対して着脱可能または開閉可能としておくことが好ましく、着脱可能としておくことがより好ましい。着脱可能または開閉可能とすることで、例えば、加温装置１の保守管理などの作業性が向上する。特に、着脱可能とすることで、ピペットチップ１０をあらかじめ保持した複数の上面１２を別途用意しておけば、これらの交換を瞬時に行うことができ、分注操作をより一層効率的に行うことができる。

加温装置１内部の気体は、不活性で爆発などの問題が無いものであればいずれでも良く、例えば、空気、窒素、ヘリウム、アルゴン等が挙げられる。なかでも、汎用性および経済性を考慮すると、空気が最も好ましい。

本実施形態においては、ピペットチップ１０を、その吸引吐出口１０ｂより、前記挿入孔１２ａから加温装置１内部へ挿入することで、吸引吐出口１０ｂを加温装置１に接触させることなく保持できる。そしてこの状態でヒーター１１およびファン１３を稼動させることで、加温された気体を加温装置１内部で循環させることができ、加温装置１内部の温度が場所によらずほぼ一定に保たれる。
そして、加温された気体を介してピペットチップ１０が加温され、次いでこのように加温されたピペットチップ１０をピペット（図示略）に装着してから、液体試料を吸引すると、該液体試料はピペットチップ１０を熱源として加温処理される。

あるいは、ピペットチップ１０をピペットに装着し、液体試料を予め吸引および保持しておき、そのままピペットチップ１０をピペットに装着したまま、挿入孔１２ａに保持させても良い。この時、ピペットが転倒しないようにスタンドを別途併用すると良い。
この場合は、加温された気体およびピペットチップ１０を介して、ピペットチップ１０内の液体試料が加温処理される。そして、ピペットチップ１０を挿入孔１２ａに保持させている限り、液体試料は継続して加温処理される。

なお、ここでは上面１２に穿設されている挿入孔１２ａ，１２ａ，・・・の数が九個である例について説明したが、本発明においてはこれに限定されず、目的に応じて適宜調整すれば良い。例えば、生化学分野では、ピペットチップを直列に八個装着できる八連ピペットなど、ピペットチップ装着部位を複数備えたものが市販されており、汎用されるが、これらの複数のピペットチップ装着部位の配置状態を考慮して、例えば、挿入孔１２ａを一列につき八の倍数だけ設けることが好ましい。さらに、前記八連ピペットなど、通常は隣り合うピペットチップ装着部位の中心間距離は、９ｍｍ程度であるので、本発明においても、隣り合う挿入孔１２ａの中心間距離を、８〜１０ｍｍとすることが好ましく、９ｍｍとすることが特に好ましい。このようにすることで、分注操作をより一層効率良く行うことができる。

また、加温装置１内部に設けられているヒーター１１およびファン１３の数は、ここでは一つずつであるが、本発明においてはこれに限定されず、目的に応じて適宜調整すれば良い。

さらにここでは図示を省略するが、ヒーター１１は、加温時の温度を自動で制御する温度制御手段に電気的に接続されていることが好ましい。このようにすることで、ピペットチップ１０の加温処理を簡便かつ安定して行うことができる。

（第二の実施形態）
図２は、本発明の第二の実施形態に係る加温装置を例示する正面図である。
ここに示す加温装置２はピペット状であり、片手で把持可能な本体部２３、ピペットチップ１０を、その装着口１０ａを嵌合させて保持する保持手段である装着部２１、該装着部２１に装着したピペットチップ１０内への液体試料の吸引およびピペットチップ１０外への液体試料の吐出を操作する操作部２２を備える。そして、前記装着部２１は、その内部にヒーター（図示略）を備えており、このヒーターによって加温可能とされている。すなわち、本実施形態では、保持手段に加温手段が一体化されており、それ以外の点では、通常使用されるピペットと同様の構造を有するものである。

ヒーターは、装着部２１内に配置でき、ピペットチップを４０〜１００℃に加温できるものであれば特に限定されない。例えば、ニクロム線ヒーターやセラミックヒーターなどの電熱式のものでも良いし、可燃性ガスを燃焼させる方式のものでも良く、公知のものを適宜選択すれば良い。

装着部２１の材質は、加温手段の材質として先に挙げたものと同様で良い。

なお、ここでは加温装置２として、装着部２１の数が一つであるものを示しているが、本発明においてはこれに限定されず、第一の実施形態で述べた八連ピペットなどのように、装着部２１を複数備えたものでも良い。
また、第一の実施形態と同様に、装着部２１内のヒーターは、加温時の温度を自動で制御する温度制御手段に電気的に接続されていることが好ましい。

本実施形態においては、加温装置２にピペットチップ１０を装着し、ピペットチップ１０を加温することで、ピペットチップ１０を介して、その内部に保持された液体試料が加温処理される。そして、液体試料をピペットチップ１０内に保持している限り、液体試料は継続して加温処理される。勿論、ピペットチップ１０の加温を開始するのは、液体試料を吸引する前または吸引した後のいずれでも良い。
そして、本実施形態においては言うまでも無く、ピペットチップ１０は、その吸引吐出口１０ｂが加温装置２に接触することなく保持される。

本発明の加温装置および液体試料分注方法によれば、生体関連物質の解析を高精度かつ簡便に行うことができ、特に解析に供する液体試料の数が多いほど、その効果は顕著なものとなる。

＜液体試料の自動分注方法＞
本発明の液体試料の自動分注方法は、液体試料分注用のピペットチップを用いて自動で液体試料を吸引する工程、前記ピペットチップを加温して、該ピペットチップ内にて液体試料を自動で加温処理する工程、および自動で該ピペットチップ内の液体試料を吐出する工程を有するものである。
液体試料の吸引および吐出を自動で行うためには、液体試料の吸引および吐出の操作を自動で制御する吸引吐出制御手段に電気的に接続されたピペットを用いて、このピペットにピペットチップを装着して用いれば良い。ここで用いるピペットは、吸引吐出制御手段に電気的に接続されていること以外は、公知のピペットと同様のもので良い。さらに、例えば、前記第二の実施形態に係る加温装置２において、操作部２２が吸引吐出制御手段に電気的に接続されたものでも良い。

ピペットチップ内の液体試料を自動で加温処理するためには、例えば、先に述べた加温装置において、加温手段が加温時の温度、並びに加温の開始および停止を自動で制御する温度制御手段に電気的に接続されたものを用いれば良い。具体的には、前記第一または第二の実施形態におけるヒーターを温度制御手段に電気的に接続したものが例示できる。

＜液体試料の自動分注装置＞
本発明の液体試料の自動分注装置は、上記本発明の液体試料の自動分注方法に用いるものであって、液体試料の吸引および吐出を操作する操作部と、前記ピペットチップを４０〜１００℃に加温する加温手段、および前記ピペットチップを、その吸引吐出口を該加温手段に接触させずに保持する保持手段とを備える加温装置部を有するものである。
そして、前記操作部および加温手段は、液体試料の吸引、吐出および加温を自動で制御する制御手段に電気的に接続されている。ここで、液体試料の加温を自動で制御するとは、液体試料加温時の温度、並びに加温の開始および停止を自動で制御することを意味する。
以下、図面を参照しながら、具体的な実施形態を挙げて、自動分注方法と共にさらに詳しく説明する。

（第三の実施形態）
図３は、本発明の第三の実施形態に係る液体試料の自動分注装置を例示する図であり、（ａ）は概略構成図、（ｂ）は加温手段の拡大縦断面図である。
自動分注装置３は、操作部３３および加温装置部３０を備える。
操作部３３は、液体試料の吸引および吐出を行うピペット部３３１、該ピペット部３３１の配置位置のうち、Ｙ方向の位置を調節する第一の位置調節部３３２、並びにＸ方向およびＺ方向の位置を調節する第二の位置調節部３３３を備える。第一の位置調節部３３２は、前記ピペット部３３１と一体に設けられ、第二の位置調節部３３３上を、該調節部３３３の長手方向（Ｙ方向）に移動可能とされ、第二の位置調節部３３３は、駆動部（図示略）によって長手方向と直行する方向（Ｘ方向およびＺ方向）に移動可能とされている。さらに、操作部３３は制御手段３４に電気的に接続されており、操作部３３の配置位置並びに液体試料の吸引および吐出が自動で制御可能とされている。

加温装置部３０は金属ブロックであり、その本体３１が加温手段として機能するものであり、前記操作部３３の下部に設置されている。そして、該本体３１の前記操作部３３と対抗する面上には、ピペットチップ１０を該金属ブロックに挿入させる挿入孔３２が複数穿設されている。
該挿入孔３２は略円錐形状であり、その開口部３２ａは、ピペットチップ１０のピペット部３３１への装着口１０ａの装着端の外径よりもやや小さい径からなる。そして、該開口部３２ａ以外の部位の径は、ピペットチップ１０の前記装着端以外の部位の外径よりも大きく設定されている。
そしてピペットチップ１０は、その吸引吐出口１０ｂより該挿入孔３２へ挿入することにより、装着口１０ａ近傍の外表面が前記開口部３２ａに接触した状態で、着脱可能に保持される。

ピペットチップ１０は、このように開口部３２ａによって保持された状態で、その保持部から吸引吐出口１０ｂまでの長さＨ_Ｍが、挿入孔３２の高さＨ_３２よりもサイズが小さい。すなわち、ピペットチップ１０は、挿入孔３２へ挿入され保持された状態で、その吸引吐出口１０ｂが、加温装置部本体３１の如何なる部位とも接触していない。

加温装置部３０を加温する方法は、例えば、ペルチェ素子などを用いて加温する方法など、電気を使用して熱を伝導できる方法であれば、公知の如何なる方法でも良い。

加温装置部本体３１は、制御手段３４に電気的に接続されており、加温時の温度を自動で制御可能とされている。

なお、加温装置部３０は、前記第一および第二の実施形態で示した加温装置と同様の目的で、液体試料分注時の加温装置として使用できる。この場合の該加温装置は、加温時の温度を制御手段により自動で制御する代わりに、例えば、目的に応じて適温に温度調整した液体に浸漬することで、加温しても良い。

さらに、加温装置部３０の近傍には、分注に供する液体試料を保持する試料保持部３７と、加温処理された液体試料を分注する加温試料保持部３５が備えられている。さらに、例えば、加温試料保持部３５を複数用いる場合には、これらを整列して配置する試料配置手段３６を用いることが好ましい。

試料保持部３７は、充填された液体試料を安定して保持できるものであればその材質および形状は如何なるものでも良く、例えば、各種樹脂類やガラス類等の材質からなる公知のサンプル瓶状のものやこれを複数備えたもの、ウェルプレートなどを用いれば良い。

加温試料保持部３５は、前記ピペットチップと同等の耐熱性を有するものであればその材質は如何なるものでも良い。またその形状は、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分注された液体試料を貯留する必要がある場合などには、前記試料保持部３７と同様の形状とすれば良い。一方、液体試料をスポットするだけの場合には、プレート状またはシート状のものでも良く、例えば、液体試料中の分子や原子を補足するための補足物質が固相化されたマイクロアレイなどが好適であり、ハイブリダイゼーションによる核酸検出用のマイクロアレイが特に好適である。
そして、試料配置手段３６は、該加温試料保持部３５を着脱可能に配置できるものであれば、如何なるものでも良い。

本実施形態において、加温装置部３０は異なる形態でも良く、図３（ｃ）は、このような加温手段の他の例を示す拡大断面図である。
ここで示す加温装置部３０’では、加温装置部本体３１’に、ピペットチップ１０を挿入させる略円柱状の貫通孔３２’が複数設けられている。このように、貫通孔が設けられていること以外は、前記加温装置部３０と同様である。

また、挿入孔３２や貫通孔３２’の数や配置形態は、ここに示すものに限定されるものではなく、例えば、前記第一の実施形態で説明した挿入孔１２ａのように、ピペットチップ装着部位を複数備えた市販品のピペットが使用可能なように、適宜調整しても良い。

本実施形態においては、液体試料の吸引および吐出量並びに吸引から吐出までの時間、一回あたりの分注量、分注回数、試料保持部３７および加温試料保持部３５の配置位置、加温装置部３０の加温時の温度並びに加温の開始および停止時間など、必要な情報を予め制御手段３４に入力しておくことで、液体試料の分注操作を自動で行うことができる。

具体的には、加温装置部本体３１にピペットチップ１０を保持させた後、制御手段３４を稼動させることで、入力情報に基づいてピペットチップ１０の加温処理を行う。加温処理終了後、入力情報に基づいてピペット部３３１を所定の箇所に移動させ、加温処理されたピペットチップ１０を装着させた後、さらに入力情報に基づいてピペット部３３１を所定の箇所に移動させ、試料保持部３７中の液体試料を吸引し、所定時間液体試料をピペットチップ１０内で保持することで、該液体試料を加温処理する。次いで、入力情報に基づいてピペット部３３１を所定の箇所に移動させ、加温処理済みの液体試料を加温試料保持部３５内に吐出する。なおこの時は、液体試料の加温処理と、ピペット部３３１の加温試料保持部３５方向への移動を並行して行っても良い。

ここでは、ピペットチップ１０を加温装置部本体３１に保持させる操作を自動では行わない例を示したが、他の例として、入力情報に基づいて、ピペット部３３１に加温処理を行っていないピペットチップ１０を装着させた後、ピペット部３３１を所定の箇所に移動させて加温装置部本体３１にピペットチップ１０を保持させても良い。

また、さらに他の例として、ピペットチップ１０の加温処理を液体試料の吸引後に行っても良い。
すなわち、入力情報に基づいて、ピペット部３３１に加温処理を行っていないピペットチップ１０を装着させた後、ピペット部３３１を所定の箇所に移動させ、試料保持部３７中の液体試料を吸引し、次いで、ピペット部３３１を所定の箇所に移動させて加温装置部本体３１にピペットチップ１０を保持させ、所定時間この状態を維持し、液体試料をピペットチップ１０内で加温処理する。次いで、入力情報に基づいてピペット部３３１を所定の箇所に移動させ、加温処理済みの液体試料を加温試料保持部３５内に吐出すれば良い。

（第四の実施形態）
本発明の第四の実施形態に係る液体試料の自動分注装置は、前記第三の実施形態に係る自動分注装置において、加温装置部３０が、前記第一の実施形態に係る加温装置１で置き換えられたものである。ただし、ここでは加温装置１に備えられたヒーター１１が制御手段３４と電気的に接続され、液体試料の加温が自動で制御可能とされる。また、必要に応じてファン１３も制御手段３４と電気的に接続され、その稼動が自動で制御可能とされていても良い。
本実施形態においても、前記第三の実施形態と同様に液体試料を自動分注することができる。

（第五の実施形態）
本発明の第五の実施形態に係る液体試料の自動分注装置は、前記第三の実施形態に係る自動分注装置において、加温装置部３０が取り外されると共に、操作部３３に備えられたピペット部３３１が、前記第二の実施形態に係る加温装置２で置き換えられたものである。ただし、ここでは加温装置２の装着部２１内のヒーターが制御手段３４と電気的に接続されて、液体試料の加温が自動で制御可能とされる。
本実施形態においては、ピペットチップ１０を、加温装置部本体３１に保持させて加温する代わりに、加温装置２の装着部２１に装着して保持し、加温すること以外は、前記第三の実施形態と同様に液体試料を自動分注することができる。

本発明の液体試料の自動分注装置および自動分注方法によれば、生体関連物質の解析を、より高精度かつ簡便に行うことができ、大量の液体試料も迅速に解析できる。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例）
前記第三の実施形態に係る自動分注装置３を用いて、核酸のハイブリダイゼーションを行った。
すなわち、加温装置部３０を９０℃に加温し、さらに、加温装置部本体３１にピペットチップを保持させて５分間静置して、ピペットチップを十分に加温した。
そして、変性（一本鎖化）されていない蛍光標識された核酸を含有する水溶液を、加温処理された前記ピペットチップを用いて１分〜５分程度保持し、加温試料保持部３５としてのＮＧＫ社製のマイクロアレイ上に分注した。
分注後、遮光条件化において３８℃で３０分間ハイブリダイゼーションを行い、次いで、マイクロアレイ上の溶液を除去して、前記核酸を含有する水溶液の場合と同様に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄液を加温処理されたピペットチップを用いて、マイクロアレイ上の該当箇所に分注して洗浄を行った。
洗浄後、マイクロアレイ上の洗浄液を除去して、ｍｉｌｌｉ Ｑでマイクロアレイをすすぎ、２０００ｒｐｍで１分間遠心をかけて、マイクロアレイを乾燥させた。
そして、乾燥させたマイクロアレイ上の蛍光シグナルをレーザースキャナで検出し、データを解析した（ｎ＝４）。

（比較例）
蛍光標識された核酸を含有する水溶液、および１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄液を、加温処理されていないピペットチップを用いて、マイクロアレイ上へ分注したこと以外は、上記実施例と同様にハイブリダイゼーションを行い、蛍光シグナルを検出して、データを解析した（ｎ＝４）。

実施例および比較例の解析結果を比較したところ、実施例では、蛍光シグナルの検出輝度が比較例よりも約１０％高く、さらに再現性も高かった。
一方、比較例では、マイクロアレイ上に析出した不純物が付着しており、この不純物とハイブリダイゼーションの結果得られた蛍光シグナルとの識別が困難となり、データの再現性が悪くなっただけでなく、データの解析にも時間を要して作業効率が悪くなった。実施例および比較例における検出輝度の具体的データを表１に示す。

以上の結果から、本発明により、ハイブリダイゼーションを伴う核酸の検出を、高精度かつ簡便に行えることが確認された。

本発明は、医療分野や生化学研究における生体関連物質の解析に利用可能である。

本発明の第一の実施形態に係る加温装置を例示する概略図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線における縦断面図である。 本発明の第二の実施形態に係る加温装置を例示する正面図である。 本発明の第三の実施形態に係る液体試料の自動分注装置を例示する図であり、（ａ）は概略構成図、（ｂ）は加温手段の拡大縦断面図、（ｃ）は加温手段の他の例を示す拡大縦断面図である。

符号の説明

１，２・・・加温装置、３・・・自動分注装置、１０・・・ピペットチップ、１０ａ・・・装着口、１０ｂ・・・吸引吐出口、１１・・・ヒーター、１２・・・上面、１２ａ，３２・・・挿入孔、１３・・・ファン、２１・・・装着部、２２，３３・・・操作部、３０，３０’・・・加温装置部、３２’・・・貫通孔、３４・・・制御手段、３３１・・・ピペット部

Claims (15)

1. 液体試料分注用のピペットチップを加温して、該ピペットチップ内にて、分注に供する液体試料を加温処理する工程を有することを特徴とする液体試料分注方法。
2. 前記液体試料が、核酸を含有する水溶液、または水への溶解度がドデシル硫酸ナトリウムと同等以下の水溶性物質を含有する水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の液体試料分注方法。
3. 前記液体試料が、核酸のハイブリダイゼーションに用いられるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の液体試料分注方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体試料分注方法に用いる加温装置であって、
   液体試料分注用のピペットチップを４０〜１００℃に加温する加温手段と、前記ピペットチップを、その吸引吐出口を該加温手段に接触させずに保持する保持手段とを備えることを特徴とする加温装置。
5. 前記加温装置は箱状であり、
   前記保持手段は前記ピペットチップを、その吸引吐出口を前記加温装置内部に突出させて保持し、さらに前記加温装置内部の気体を循環させる気体循環手段を備えることを特徴とする請求項４に記載の加温装置。
6. 前記加温装置はピペット状であり、
   さらに液体試料の吸引および吐出を操作する操作手段を備え、前記保持手段に前記加温手段が一体化されたことを特徴とする請求項４に記載の加温装置。
7. 前記加温手段が、金属、ガラス、エンジニアリング・プラスチックおよびスーパーエンジニアリング・プラスチックからなる群から選択される一種以上の材質からなることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の加温装置。
8. 前記加温装置は金属ブロックであり、
   前記保持手段は、該金属ブロックに形成された、前記ピペットチップを該金属ブロックに挿入させる挿入孔の開口部であることを特徴とする請求項４に記載の加温装置。
9. 前記保持手段を複数備え、隣り合う前記ピペットチップの中心間距離を８〜１０ｍｍとすることを特徴とする請求項４〜８のいずれか一項に記載の加温装置。
10. 前記加温手段が、加温時の温度を自動で制御する温度制御手段に電気的に接続されていることを特徴とする請求項４〜９のいずれか一項に記載の加温装置。
11. 液体試料分注用のピペットチップを用いて自動で液体試料を吸引する工程、前記ピペットチップを加温して、該ピペットチップ内にて液体試料を自動で加温処理する工程、および自動で該ピペットチップ内の液体試料を吐出する工程を有することを特徴とする液体試料の自動分注方法。
12. 請求項１１に記載の液体試料の自動分注方法に用いる液体試料の自動分注装置であって、
    液体試料の吸引および吐出を操作する操作部と、前記ピペットチップを４０〜１００℃に加温する加温手段、および前記ピペットチップを、その吸引吐出口を該加温手段に接触させずに保持する保持手段とを備える加温装置部を有し、
    前記操作部および加温手段が、前記液体試料の吸引、吐出および加温を自動で制御する制御手段に電気的に接続されていることを特徴とする液体試料の自動分注装置。
13. 前記加温装置部が金属ブロックであり、前記保持手段が、該金属ブロックに形成された、前記ピペットチップを該金属ブロックに挿入させる挿入孔の開口部であることを特徴とする請求項１２に記載の液体試料の自動分注装置。
14. 前記加温装置部が箱状であり、前記保持手段は前記ピペットチップを、その吸引吐出口を前記加温装置部内部に突出させて保持し、さらに前記加温装置部内部の気体を循環させる気体循環手段を備えることを特徴とする請求項１２に記載の液体試料の自動分注装置。
15. 前記加温装置部がピペット状であり、前記保持手段に前記加温手段が一体化されたことを特徴とする請求項１２に記載の液体試料の自動分注装置。

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