JP2009045142A - Substrate treatment method for inducing bone formation around a substrate in vivo - Google Patents
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Abstract
【課題】生体内に埋植した基材が迅速に生着する簡便かつ安価な技術を実現する。
【解決手段】骨形成因子溶液中に基材を浸漬する工程を包含する、埋植前の基材に施す前処理方法を提供する。
【選択図】なし[PROBLEMS] To realize a simple and inexpensive technique in which a base material implanted in a living body can be quickly engrafted.
A pretreatment method is provided for applying to a substrate prior to implantation, the method comprising immersing the substrate in an osteogenic factor solution.
[Selection figure] None
Description
本発明は、生体への埋植前の基材に対する処理方法に関するものであり、より詳細には、生体内にて基材の周囲に骨形成を誘導するために生体へ埋植する前の基材に施す前処理方法に関するものである。 The present invention relates to a treatment method for a base material before being implanted into a living body, and more specifically, a base before being implanted into a living body in order to induce bone formation around the base material in a living body. The present invention relates to a pretreatment method applied to a material.
総人口の２０％が高齢者となった昨今、加齢による歯の欠損には可撤性床義歯が主に用いられているが、患者のＱｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）の改善に十分成功しているとは言いがたい。義歯に代わる機能回復法として歯科インプラント治療が用いられているが、埋入した歯科用インプラント体が骨にしっかりと固定された状態（オッセオインテグレーション）を獲得するまでに３〜５ヶ月の期間を要する。 Now that 20% of the total population has become elderly, removable dentures are mainly used for tooth loss due to aging, but the patient's quality of life (QOL) has been successfully improved. It's hard to say. Dental implant treatment is used as a functional recovery method in place of dentures, but it takes 3 to 5 months for the implanted dental implant body to be firmly fixed to the bone (Osseointegration). Cost.
この期間を短縮することで患者の負担は軽減されるため、オッセオインテグレーションの獲得能に優れた歯科用インプラント体の改良が進められてきた。これまでに、表面形状を粗面にし骨芽細胞の骨沈着を促進させる方法（非特許文献１および２参照）、表面に細胞接着を促進するタンパク質を固定する方法（非特許文献３および４参照）、表面にリン酸カルシウムをコーティングする方法（非特許文献５および６参照）が検討されている。
しかし、上記方法（非特許文献１〜６記載の方法）を臨床現場において実用化することは難しい。また、タンパク質はその生理活性を発揮する正しい立体構造を維持させるために大腸菌を用いた生産が不向きなものも多く、哺乳動物細胞を用いた生産システムが用いられる場合はコストがかかる。 However, it is difficult to put the above method (the methods described in Non-Patent Documents 1 to 6) into practical use in the clinical field. In addition, many proteins are unsuitable for production using Escherichia coli in order to maintain the correct three-dimensional structure that exhibits their physiological activity, and costs are incurred when production systems using mammalian cells are used.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体内に埋植した基材が迅速に生着する簡便な技術を安価にて提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a simple technique that allows a base material implanted in a living body to be quickly engrafted at low cost.
本発明者らは、オッセオインテグレーションに優れたインプラント体を得るための短時間で簡便な埋植前処理方法について検討した。オッセオインテグレーションの獲得には初期の細胞接着が重要であることから、リン酸カルシウムなどで表面をコーティングする方法が考案されているが、このような方法では均一なコーティングが困難であり、長期的な予後に問題が残ると考えられている。しかし、本発明者らは、大腸菌発現系で生産した骨形成因子を含む少量の溶液に短時間浸漬させたインプラント体を用いれば、インプラント体のオッセオインテグレーションが速やかに獲得され、インプラント体周囲に骨形成が認められることを見出した。 The present inventors examined a simple pre-implantation treatment method in a short time to obtain an implant body excellent in osseointegration. Since the initial cell adhesion is important for the acquisition of osseointegration, a method of coating the surface with calcium phosphate or the like has been devised, but it is difficult to uniformly coat with such a method, and long-term prognosis It is believed that problems remain. However, when using an implant body immersed in a small amount of a solution containing an osteogenic factor produced by an E. coli expression system for a short time, the present inventors can quickly acquire osseointegration of the implant body, and around the implant body. We found that bone formation was observed.
すなわち、本発明に係る前処理方法は埋植前の基材に施す方法であって、骨形成因子を含む溶液中に基材を浸漬する工程を包含することを特徴としている。 That is, the pretreatment method according to the present invention is a method applied to a base material prior to implantation, and includes a step of immersing the base material in a solution containing an osteogenic factor.
本発明に係る前処理方法において、上記骨形成因子は、大腸菌を宿主細胞として発現させた組換えタンパク質であることが好ましい。 In the pretreatment method according to the present invention, the osteogenic factor is preferably a recombinant protein in which E. coli is expressed as a host cell.
本発明に係る前処理方法において、上記基材は主成分としてチタンを含んでいることが好ましい。 In the pretreatment method according to the present invention, the base material preferably contains titanium as a main component.
本発明に係る前処理方法において、基材を浸漬する時間は、少なくとも０．１秒間であることが好ましく、１〜６０分間であることがより好ましく、３分間程度が最も好ましい。 In the pretreatment method according to the present invention, the time for immersing the substrate is preferably at least 0.1 second, more preferably 1 to 60 minutes, and most preferably about 3 minutes.
本発明に係る前処理方法において、上記溶液における骨形成因子の濃度は、少なくとも０．５μｇ／μＬであればよく、１．０〜１０．０μｇ／μＬの範囲内であることが好ましく、５．０μｇ／μＬ程度が最も好ましい。 In the pretreatment method according to the present invention, the concentration of the osteogenic factor in the solution may be at least 0.5 μg / μL, preferably in the range of 1.0 to 10.0 μg / μL. About 0 μg / μL is most preferable.
本発明に係る前処理方法において、上記骨形成因子は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＢＭＰ−８（ＯＰ−２）からなる群より選択されるタンパク質の少なくとも１種であることが好ましい。 In the pretreatment method according to the present invention, the osteogenic factor is composed of BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1) and BMP-8 (OP-2). It is preferably at least one protein selected from the group.
本発明に係る前処理方法において、上記骨形成因子は、野生型タンパク質であっても、野生型タンパク質のＮ末端領域にヘパリン結合ドメイン配列を含むペプチドが挿入されている改変型タンパク質であってもよい。 In the pretreatment method according to the present invention, the osteogenic factor may be a wild-type protein or a modified protein in which a peptide containing a heparin-binding domain sequence is inserted into the N-terminal region of the wild-type protein. Good.
本発明に係る前処理方法において、上記ヘパリン結合ドメイン配列は、（ａ）リジン−ヒスチジン−リジン；および（ｂ）アルギニン−リジン−アルギニン、の少なくともいずれかであることが好ましい。 In the pretreatment method according to the present invention, the heparin binding domain sequence is preferably at least one of (a) lysine-histidine-lysine; and (b) arginine-lysine-arginine.
本発明を用いて前処理したインプラント体は、被覆した骨形成因子の量が少なくても骨再生能が増強した。また、本発明における前処理の時間が短時間であっても、インプラント体の骨再生能は増強し得る。このように、本発明は、臨床現場において非常に実用的である。特に、大腸菌発現系を用いればタンパク質を簡便に生産することができる。 The implant body pretreated using the present invention has enhanced bone regeneration ability even when the amount of the bone formation factor coated is small. Moreover, even if the pretreatment time in the present invention is short, the bone regeneration ability of the implant body can be enhanced. Thus, the present invention is very practical in the clinical field. In particular, if an E. coli expression system is used, a protein can be easily produced.
臨床において実用的な本発明は、抜歯即時埋入法およびソケットリフト法への適応拡大が期待され得る。また、ヘパリン結合活性を増強した改良型骨形成因子を用いれば、より強い効果が認められ、治療時間の更なる短縮が期待され得る。 The present invention, which is practical in clinical practice, can be expected to expand its application to the immediate extraction method and the socket lift method. In addition, if an improved bone morphogenetic factor with enhanced heparin binding activity is used, a stronger effect can be recognized and further shortening of the treatment time can be expected.
ＢＭＰ−２は、２量体を形成して活性を示すが、大腸菌で発現させた場合、単量体として発現されるため、得られた組換えタンパク質はそのままでは活性を示さない。成熟活性型ＢＭＰ−２には７つのシステイン残基があり、分子内の３つのジスルフィド結合と分子間の１つのジスルフィド結合を形成する。リフォールディングの過程で２分子、７つのジスルフィド結合を正しく形成する必要があり、正確な２量体を形成して初めて活性を示し得る。このように、大腸菌で発現させた場合、従来はリフォールディングの効率が悪く、活性を示すＢＭＰ−２を効率良く大量に取得することができなかった。 BMP-2 forms a dimer and exhibits activity. However, when expressed in E. coli, BMP-2 is expressed as a monomer, and thus the obtained recombinant protein does not exhibit activity as it is. Mature active BMP-2 has seven cysteine residues, forming three disulfide bonds within the molecule and one disulfide bond between the molecules. It is necessary to correctly form two molecules and seven disulfide bonds in the refolding process, and the activity can be exhibited only after forming an accurate dimer. Thus, when expressed in E. coli, the efficiency of refolding has been poor so far, and BMP-2 showing activity could not be obtained in large quantities efficiently.
本発明者らは、最適化の検討を重ねた結果、従来哺乳動物発現系でのみ生産されていたタンパク質と同等の活性を有する大腸菌発現系タンパク質の大量生産に成功し、これらの大腸菌発現系タンパク質をインプラント体に付着させる前処理を行うことによって、インプラント体のオッセオインテグレーションが迅速に獲得され、インプラント体周囲の迅速な骨再生が得られることを確認した。 As a result of repeated examination of optimization, the present inventors succeeded in mass production of E. coli expression system proteins having the same activity as proteins produced only in mammalian expression systems, and these E. coli expression system proteins. It was confirmed that the osseointegration of the implant body was quickly acquired by performing the pretreatment for attaching the to the implant body, and quick bone regeneration around the implant body was obtained.
具体的には、大腸菌発現系で生産したタンパク質の溶液中に１晩浸漬させた歯科用インプラント体を、ラット皮下に埋植したところ、歯科用インプラント体周囲に骨の再生を確認した。長時間の浸漬は臨床現場に適応しないが、短時間の浸漬時間であってもインプラント体周囲に首尾よく骨が再生することを確認した。 Specifically, when a dental implant body immersed overnight in a protein solution produced by the E. coli expression system was implanted subcutaneously in a rat, bone regeneration was confirmed around the dental implant body. Long-term immersion is not suitable for clinical practice, but it was confirmed that bone regenerated successfully around the implant body even with a short immersion time.
〔１：骨形成因子〕
骨形成因子（bone morphogenetic protein ;ＢＭＰ）は強力な骨誘導能を有しており、近年その骨再生能力の高さから注目されている。ＢＭＰは異所性の骨形成を誘導する因子として１９６５年に発見されたが、完全な精製タンパク質として単離されず、具体的な構造は未解明であった。しかし、１９８８年にＷｏｚｎｅｙらによってヒトＢＭＰをコードする遺伝子がクローニングされたことによってその構造が明らかとなり、組換えタンパク質としての製造が可能となった（特開２００４−２０３８２９号公報（２００４（平成１６）年７月２２日公開）を参照）。また、その後の研究により、ＢＭＰはＴＧＦβファミリーに属する成長因子の一群でＢＭＰサブファミリーとして分類され、ＢＭＰサブファミリーに分類される多数のタンパク質が報告されている。
[1: Osteogenic factor]
Bone morphogenetic protein (BMP) has a strong osteoinductive ability, and has recently attracted attention because of its high bone regeneration ability. Although BMP was discovered in 1965 as a factor that induces ectopic bone formation, it was not isolated as a completely purified protein, and the specific structure was unclear. However, the structure of the gene encoding human BMP was clarified by Wozney et al. In 1988, and the structure thereof was clarified, making it possible to produce a recombinant protein (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-203829 (2004 (Heisei 16)). ) (Released July 22, 2012)). Subsequent studies have reported that BMP is classified as a BMP subfamily in a group of growth factors belonging to the TGFβ family, and many proteins are classified into the BMP subfamily.
本明細書中において使用される場合、「骨形成因子」は、未分化の間葉系細胞を軟骨細胞や骨芽細胞へ分化させる活性あるいは軟骨または骨を形成させる活性を有するタンパク質が意図される。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２Ｂともいう）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＯＰ−２）、もしくはＢＭＰ−９、またはこれらの機能的等価改変体（すなわち天然に存在するＢＭＰのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然に存在するＢＭＰと同じ活性を有するタンパク質）が挙げられる。骨形成因子としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＢＭＰ−８（ＯＰ−２）が好ましく、骨形成能が最も高いことが従来の基礎研究で明らかにされていることからＢＭＰ−２がより好ましい。 As used herein, “bone-forming factor” is intended to mean a protein having the activity of differentiating undifferentiated mesenchymal cells into chondrocytes or osteoblasts or forming cartilage or bone. . For example, BMP-2, BMP-3, BMP-4 (also referred to as BMP-2B), BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (OP-2), or BMP- 9, or a functionally equivalent variant thereof (ie, having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of a naturally occurring BMP, and A protein having the same activity). As the bone forming factor, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1) and BMP-8 (OP-2) are preferable and have the highest bone forming ability. BMP-2 is more preferred because it has been clarified by conventional basic research.
本明細書中において使用される場合、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることが意図される。 As used herein, “one or several amino acids are deleted, substituted or added” means deletion, substitution or substitution by a known mutant peptide production method such as site-directed mutagenesis. It is intended that as many amino acids as can be added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less) are deleted, substituted or added.
タンパク質のアミノ酸配列中におけるアミノ酸のいくつかが、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。 It is well known in the art that some of the amino acids in a protein's amino acid sequence can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the protein. Furthermore, it is also well known that there are variants that not only artificially modify, but also do not significantly alter the structure or function of the protein in the native protein.
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。 Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Silent substitution, addition and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not alter the polypeptide activity according to the invention.
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。 Typically seen as conservative substitutions are substitutions of one amino acid with another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile, exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.
本明細書中において使用される場合、「野生型タンパク質」は天然に存在するタンパク質またはその機能的等価改変体が意図される。ヒトＢＭＰ−２のｍＲＮＡの塩基配列は、GenBank Accession NM_001200に開示されており、preproproteinのアミノ酸配列は、GenPept Accession NP_001191に開示されている。ヒトＢＭＰ−２の成熟タンパク質はpreproprotein（全３９６アミノ酸）の第２８３位〜第３９６位に該当し（配列番号１）、ヒトＢＭＰ−２の成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、ヒトＢＭＰ−２のｍＲＮＡの塩基配列（全３１５０塩基）の第１６３２位〜第１９７３位（配列番号２）に該当する。ＢＭＰに関する場合、野生型タンパク質（野生型ＢＭＰ）は成熟タンパク質が意図される。 As used herein, “wild-type protein” intends a naturally occurring protein or a functionally equivalent variant thereof. The nucleotide sequence of human BMP-2 mRNA is disclosed in GenBank Accession NM_001200, and the amino acid sequence of preproprotein is disclosed in GenPept Accession NP_001191. The mature protein of human BMP-2 corresponds to positions 283 to 396 of preproprotein (all 396 amino acids) (SEQ ID NO: 1), and the base sequence of the polynucleotide encoding the mature protein of human BMP-2 is human BMP. -2 corresponds to positions 1632 to 1973 (SEQ ID NO: 2) of the base sequence of mRNA (total 3150 bases). When referring to BMP, wild type protein (wild type BMP) is intended to be a mature protein.
本明細書中において使用される場合、「改変型タンパク質」は、野生型タンパク質のアミノ酸配列を改変することによって野生型タンパク質の特定の機能が増強されている（または野生型タンパク質に特定の機能が付与されている）タンパク質が意図される。ＢＭＰに関する場合、改変型タンパク質（改変型ＢＭＰ）は、野生型ＢＭＰよりもヘパリン結合能が亢進するようにアミノ酸配列が改変されている。好ましくは、改変型ＢＭＰのアミノ酸配列は、野生型ＢＭＰのＮ末端領域にヘパリン結合ドメイン配列を含むペプチドが挿入されている。ここで、野生型ＢＭＰの「Ｎ末端領域」とは、成熟型ＢＭＰのアミノ酸配列（配列番号１）におけるＮ末端から第２０位までのアミノ酸配列の範囲が意図される。 As used herein, a “modified protein” is a specific function of a wild-type protein that has been enhanced by modifying the amino acid sequence of the wild-type protein (or a specific function of the wild-type protein). Protein) is contemplated. In the case of BMP, the amino acid sequence of the modified protein (modified BMP) is modified so that heparin-binding ability is enhanced as compared to wild-type BMP. Preferably, in the amino acid sequence of the modified BMP, a peptide containing a heparin binding domain sequence is inserted into the N-terminal region of the wild-type BMP. Here, the “N-terminal region” of wild-type BMP is intended to be the range of the amino acid sequence from the N-terminal to the 20th position in the amino acid sequence of mature BMP (SEQ ID NO: 1).
ヘパリン結合ドメイン配列を含むペプチドは、ヘパリン結合能の亢進および骨形成活性に対して悪影響を及ぼさない限り、ヘパリン結合ドメイン配列以外のアミノ酸を含んでいてもよい。また、複数の異なるヘパリン結合ドメイン配列を含んでいてもよく、同一のヘパリン結合ドメイン配列を複数重複して含んでいてもよく、これらを複合的に含んでいてもよい。ヘパリン結合ドメイン配列としては、具体的には、例えば、（ａ）リジン−ヒスチジン−リジン、および（ｂ）アルギニン−リジン−アルギニンを挙げることができる。 The peptide containing a heparin-binding domain sequence may contain amino acids other than the heparin-binding domain sequence as long as it does not adversely affect the enhancement of heparin-binding ability and osteogenic activity. In addition, a plurality of different heparin-binding domain sequences may be included, the same heparin-binding domain sequences may be included in duplicate, or these may be included in combination. Specific examples of heparin-binding domain sequences include (a) lysine-histidine-lysine and (b) arginine-lysine-arginine.
なお、ヘパリン結合能が亢進しているか否かは、例えば、ヘパリンをコートした担体を用いた表面プラズモン共鳴分析によって測定することができる（参考文献：Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 237(1996), 252-261）。 Whether heparin-binding ability is enhanced or not can be measured, for example, by surface plasmon resonance analysis using a carrier coated with heparin (reference: Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 237). (1996), 252-261).
本発明に用いられる野生型ＢＭＰおよび改変型ＢＭＰは大腸菌を宿主細胞として発現させた組換えタンパク質であることが好ましい。 The wild-type BMP and modified BMP used in the present invention are preferably recombinant proteins in which E. coli is expressed as a host cell.
ＢＭＰの多くは２量体としてその活性を発揮するので、活性な２量体構造の組換えＢＭＰを生産するための宿主細胞として、通常、哺乳動物細胞、昆虫細胞などの真核生物の細胞が利用されている。また、大腸菌を宿主として生産された組換えタンパク質は真核生物細胞を宿主として生産された組換えＢＭＰと比較して糖鎖の修飾が大きく異なり得るので、キャリアとの所望の結合様式を有していない可能性が高い。特に、改変型タンパク質は、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列が挿入されているので、キャリアとの結合様式が大きく異なり得る。このような技術常識に基づけば、大腸菌を用いて生産された組換えＢＭＰタンパク質が有効に利用され得ることは容易に予測し得るものではなかった。 Since many BMPs exhibit their activity as dimers, eukaryotic cells such as mammalian cells and insect cells are usually used as host cells for producing active BMPs of recombinant BMP. It's being used. In addition, the recombinant protein produced using E. coli as a host may have a sugar chain modification greatly different from that of a recombinant BMP produced using a eukaryotic cell as a host, and thus has a desired binding mode with a carrier. Most likely not. Particularly, since the amino acid sequence of the heparin-binding domain is inserted in the modified protein, the binding mode with the carrier can be greatly different. Based on such common technical knowledge, it could not be easily predicted that the recombinant BMP protein produced using Escherichia coli could be used effectively.
真核生物を宿主とした場合は複雑な精製システムを用いる必要があるので、コストがかかる。しかし、大腸菌を宿主細胞とすることにより、安価な改変型ＢＭＰを生産することが可能となる。なお、野生型ＢＭＰおよび改変型ＢＭＰを大腸菌発現系にて生産する場合、成熟ＢＭＰのＮ末端に組換えタンパク質の発現に好適なメチオニン−アラニンを付加したアミノ酸配列を用いることが好ましい。 When a eukaryote is used as a host, it is necessary to use a complicated purification system, which is expensive. However, by using Escherichia coli as a host cell, it is possible to produce an inexpensive modified BMP. When producing wild-type BMP and modified BMP in an E. coli expression system, it is preferable to use an amino acid sequence in which methionine-alanine suitable for expression of a recombinant protein is added to the N-terminus of mature BMP.
改変型ＢＭＰの１種であるヒトＢＭＰ−２Ｔ３（以下、「ＢＭＰ２Ｔ３」と記す）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第９位のアルギニンと第１０位のロイシンとの間に、アラニン−アルギニン−リジン−アルギニン（配列番号７）が挿入されているとともに、Ｎ末端にメチオニン−アラニンが付加されたアミノ酸配列（配列番号３）からなる、全アミノ酸数が１２０のタンパク質である。また、改変型ＢＭＰの他の１種であるヒトＢＭＰ−２Ｔ４（以下、「ＢＭＰ２Ｔ４」と記す）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第９位のアルギニンと第１０位のロイシンとの間に、アラニン−リジン−ヒスチジン−リジン−グルタミン−アルギニン−リジン−アルギニン（配列番号８）が挿入されているとともに、Ｎ末端にメチオニン−アラニンが付加されたアミノ酸配列（配列番号５）からなる、全アミノ酸数が１２４のタンパク質である。これら２種類の改変型ＢＭＰは、野生型ＢＭＰ−２と比較してヘパリン結合能が高いことが知られており、本発明に好適に用いられ得る。また、これら２種類の改変型ＢＭＰの機能的等価改変体（配列番号３または配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、骨形成活性を維持しつつヘパリン結合能の亢進したタンパク質）も本発明に好適に用いられ得る。 Human BMP-2T3 (hereinafter referred to as “BMP2T3”), which is one type of modified BMP, has an alanine − between the arginine at position 9 and the leucine at position 10 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a protein having a total of 120 amino acids consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) in which arginine-lysine-arginine (SEQ ID NO: 7) is inserted and methionine-alanine is added to the N-terminus. Further, human BMP-2T4 (hereinafter referred to as “BMP2T4”), which is another type of modified BMP, is located between the arginine at the 9th position and the leucine at the 10th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. And an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) in which alanine-lysine-histidine-lysine-glutamine-arginine-lysine-arginine (SEQ ID NO: 8) is inserted and methionine-alanine is added to the N-terminus, It is a protein with 124 amino acids. These two types of modified BMP are known to have higher heparin-binding ability than wild-type BMP-2, and can be suitably used in the present invention. In addition, functionally equivalent variants of these two types of modified BMPs (consisting of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5) In addition, a protein having enhanced heparin-binding ability while maintaining osteogenic activity can also be suitably used in the present invention.
ＢＭＰ２Ｔ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに挿入し宿主細胞である大腸菌に導入して発現させ、これを精製することにより製造することができる。同様に、ＢＭＰ２Ｔ４は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに挿入し宿主細胞である大腸菌に導入して発現させ、これを精製することにより製造することができる。 BMP2T3 can be produced by inserting a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 into an appropriate expression vector, introducing it into E. coli as a host cell, and expressing it, followed by purification. Similarly, BMP2T4 is produced by inserting a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 into an appropriate expression vector, introducing it into E. coli as a host cell, and purifying it. Can do.
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるものであれば限定されない。具体的には、例えば、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。配列番号４に示される塩基配列は、ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡの塩基配列における成熟ヒトＢＭＰ−２をコードする部分に該当する塩基配列（配列番号２）の第２７位のシトシンと第２８位のシトシンとの間にgctcgtaaacgt（配列番号９）を挿入するするとともに５’末端にatggct（配列番号１０）を付加することにより得ることができる。なお、塩基配列の挿入および付加は、公知の遺伝子工学的手法を用いることにより行うことができる。 The gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is not limited as long as it consists of the base sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. Specifically, for example, DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be mentioned. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 comprises cytosine at position 27 and cytosine at position 28 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) corresponding to the portion encoding mature human BMP-2 in the nucleotide sequence of human BMP-2 mRNA. It can be obtained by inserting gctcgtaaacgt (SEQ ID NO: 9) between and atggct (SEQ ID NO: 10) at the 5 ′ end. In addition, insertion and addition of a base sequence can be performed by using a known genetic engineering technique.
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるものであれば限定されない。具体定期には、例えば、配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。配列番号６に示される塩基配列は、ヒトＢＭＰ−２ｍＲＮＡの塩基配列における成熟ヒトＢＭＰ−２をコードする部分に該当する塩基配列（配列番号２）の第２７位のシトシンと第２８位のシトシンとの間にgctaagcataagcaacgtaagcgt（配列番号１１）を挿入するするとともに５’末端にatggct（配列番号１０）を付加することにより得ることができる。 The gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is not limited as long as it consists of the base sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. Specific examples of the periodicity include DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 comprises cytosine at position 27 and cytosine at position 28 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) corresponding to the portion encoding mature human BMP-2 in the nucleotide sequence of human BMP-2 mRNA. It can be obtained by inserting gctaagcataagcaacgtaagcgt (SEQ ID NO: 11) in between and adding atggct (SEQ ID NO: 10) to the 5 ′ end.
野生型ＢＭＰおよび改変型ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ２Ｔ３またはＢＭＰ２Ｔ４）を製造するために、当業者は、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることによって、これらのタンパク質をコードする遺伝子を容易に取得し、組換え発現ベクターを容易に構築し、種々の発現系を用いて組換えタンパク質を容易に発現させ、容易に精製して取得することができる。 In order to produce wild-type BMP and modified BMP (for example, BMP2T3 or BMP2T4), those skilled in the art can easily obtain genes encoding these proteins by appropriately combining known genetic engineering techniques. Recombinant expression vectors can be easily constructed, recombinant proteins can be easily expressed using various expression systems, and easily purified and obtained.
〔２：基材の前処理〕
組換えＢＭＰの効果は種々の動物実験で検討され、米国では臨床試験が実施されている。その結果、組換え型ＢＭＰは種々の骨欠損モデル動物に対して骨形成を促進し、骨欠損を修復し得ることが報告されている。しかし、上述したように、組換えＢＭＰの生産には哺乳動物細胞、昆虫細胞などの真核生物の細胞が利用されているので、コストがかかる。
[2: Pretreatment of substrate]
The effect of recombinant BMP has been studied in various animal experiments, and clinical trials are being conducted in the United States. As a result, it has been reported that recombinant BMP can promote bone formation and repair bone defects in various bone defect model animals. However, as described above, production of recombinant BMP is costly because eukaryotic cells such as mammalian cells and insect cells are used.
また、霊長類などの大型の実験動物に対して十分な骨修復効果を発揮させるためには、大量のＢＭＰを投与しなければならず、ヒト臨床試験においてもミリグラム単位という大量のＢＭＰ−２が使用されている。このような大量投与は、コストの問題だけでなく、副作用等の安全性面でも問題が生じる危険性がある。 In addition, in order to exert a sufficient bone repairing effect on large laboratory animals such as primates, a large amount of BMP must be administered, and a large amount of BMP-2 in milligram units is also present in human clinical trials. in use. Such a large-scale administration has a risk of not only cost problems but also safety problems such as side effects.
さらに、ＢＭＰについてのさらなる研究は、ＢＭＰが生体内において骨形成の促進因子として機能しているだけではなく、発生過程において四肢の形成や種々の臓器の器官形成過程に関与していることを示している。したがって、骨再生に有効な大量のＢＭＰを投与すれば、重篤な副作用が生じる危険性を否定できない。ＢＭＰ含有医薬組成物の研究においても徐放性が重要視されている点からも、上記のような危険性は十分考慮されるべきである（例えば、特開２００４−２０３８２９号公報（平成１６年７月２２日公開）、特開２００４−２７７３４８号公報（平成１６年１０月７日公開））。 Furthermore, further studies on BMP show that BMP not only functions as a bone formation promoting factor in vivo, but is also involved in the formation of limbs and the organ formation process of various organs during development. ing. Therefore, if a large amount of BMP effective for bone regeneration is administered, the risk of serious side effects cannot be denied. In view of the importance of sustained release in the study of BMP-containing pharmaceutical compositions, the above risks should be sufficiently considered (for example, JP 2004-203829 A (2004)). (Published July 22, 2004), JP-A-2004-277348 (published October 7, 2004)).
このように、ＢＭＰが生体内において骨形成の促進因子として機能していることが知られているにもかかわらず、ＢＭＰを用いる骨再生治療は、大量使用に伴う副作用やコストの面から臨床応用が遅れている。 Thus, although it is known that BMP functions as a bone formation promoting factor in vivo, bone regeneration treatment using BMP is clinically applied in terms of side effects and costs associated with mass use. Is late.
本発明は、生体内にて基材の周囲に骨形成を誘導することを目的とした、生体へ埋植する前の基材に施す前処理方法を提供する。本発明に係る前処理方法は、骨形成因子（ＢＭＰ）を含む溶液中に基材を浸漬する工程を包含することを特徴としている。また、本発明に係る前処理方法に用いられる骨形成因子は、大腸菌を宿主細胞として発現させた組換えタンパク質であることが好ましい。 The present invention provides a pretreatment method applied to a base material before being implanted in a living body, for the purpose of inducing bone formation around the base material in a living body. The pretreatment method according to the present invention is characterized by including a step of immersing a base material in a solution containing a bone forming factor (BMP). Further, the bone morphogenetic factor used in the pretreatment method according to the present invention is preferably a recombinant protein in which Escherichia coli is expressed as a host cell.
大腸菌を宿主として生産された組換えタンパク質は真核生物細胞を宿主として生産された組換えＢＭＰと比較して糖鎖の修飾が大きく異なり得るので、キャリアとの所望の結合様式を有していない可能性が高い。特に、改変型タンパク質は、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列が挿入されているので、キャリアとの結合様式が大きく異なり得る。よって、大腸菌を用いて生産された組換えＢＭＰタンパク質が生体への埋植前の基材に施す前処理に有効であることは容易に予測し得るものではなく、ましてや、大腸菌を用いて生産された組換えＢＭＰタンパク質を低濃度で用いる前処理が短時間であっても非常に有効であることは到底予測し得るものではなかった。 Recombinant proteins produced using E. coli as a host do not have the desired mode of binding to a carrier because the sugar chain modification can be significantly different compared to recombinant BMP produced using eukaryotic cells as a host. Probability is high. Particularly, since the amino acid sequence of the heparin-binding domain is inserted in the modified protein, the binding mode with the carrier can be greatly different. Therefore, it cannot be easily predicted that the recombinant BMP protein produced using E. coli is effective for pretreatment applied to the base material before being implanted in the living body. It was impossible to predict that the pretreatment using the recombinant BMP protein at a low concentration was very effective even for a short time.
上述したように、本発明は、生体内にて基材の周囲に骨形成を首尾よく誘導することを目的としている。骨形成を誘導すべき基材としては、歯科用インプラント材や医療補綴器具（例えば、腰、膝等の補綴器具）が挙げられるがこれらに限定されない。歯科用インプラント材や医療補綴器具には、任意の金属、金属合金、生体適合材料、およびこれらの混合物が利用可能であるが、チタン、チタン合金（例えば、チタン、アルミニウムおよびバナジウムの合金）、クロム合金（例えば、クロムおよびコバルトの合金またはコバルト、クロムおよびモリブデンの合金）などが好適に利用され得る。特に、主成分としてチタンが含まれていることが好ましく、いわゆるチタン製基材が最も好ましい。 As described above, the present invention is aimed at successfully inducing bone formation around a substrate in vivo. Examples of the base material on which bone formation should be induced include, but are not limited to, dental implant materials and medical prosthetic devices (for example, prosthetic devices such as the waist and knees). Any metal, metal alloy, biocompatible material, and mixtures thereof can be used for dental implants and medical prosthetic devices, but titanium, titanium alloys (eg, alloys of titanium, aluminum and vanadium), chromium An alloy (for example, an alloy of chromium and cobalt or an alloy of cobalt, chromium and molybdenum) can be preferably used. In particular, it is preferable that titanium is contained as a main component, and a so-called titanium substrate is most preferable.
本発明に係る前処理方法において、基材を浸漬する時間は、臨床での利用の観点から少なくとも０．１秒間であることが好ましく、１〜６０分間であることがより好ましく、３分間程度が最も好ましい。また、本発明に係る前処理方法において、上記溶液における骨形成因子の濃度は、副作用の危険性の観点から、少なくとも０．５μｇ／μＬであればよく、１．０〜１０．０μｇ／μＬの範囲内であることが好ましく、５．０μｇ／μＬ程度が最も好ましい。 In the pretreatment method according to the present invention, the time for immersing the substrate is preferably at least 0.1 seconds, more preferably 1 to 60 minutes, and more preferably about 3 minutes from the viewpoint of clinical use. Most preferred. In the pretreatment method according to the present invention, the concentration of the bone morphogenetic factor in the solution may be at least 0.5 μg / μL from the viewpoint of the risk of side effects, and may be 1.0 to 10.0 μg / μL. It is preferably within the range, and most preferably about 5.0 μg / μL.
本発明に係る前処理方法は骨形成治療に好適に用いられる。骨形成治療とは、骨組織や軟骨組織の形成が必要な疾患の予防または治療、あるいは、骨組織や軟骨組織の形成または補填が必要な症状の改善を意味する。具体的には、例えば、（１）事故、疾患、先天性異常、または各種手術に伴う骨または軟骨の欠損部位の修復、（２）各種骨折の治癒促進、（３）人工関節、人工骨、若しくは人工歯根等の人工インプラント周囲での骨の形成、人工インプラント使用時の固着促進、脊椎固定促進、または脚延長等の整形外科分野における骨若しくは軟骨の再生若しくは補填、または関節の再建、（４）形成外科分野での骨または軟骨の補填、あるいは、（５）歯科領域での顎骨の修復、歯槽骨の再生、象牙質およびセメント質の修復、またはインプラント使用のための骨の増大等が含まれる。また、骨組織での骨吸収と骨形成とのバランスが破綻した場合に生じる骨粗鬆症、線維性骨炎、骨軟化症、またはページェット病等を含む代謝性骨疾患や変形性関節炎の予防または治療も含まれる。 The pretreatment method according to the present invention is suitably used for osteogenesis treatment. Osteogenic treatment means prevention or treatment of a disease that requires formation of bone tissue or cartilage tissue, or improvement of symptoms that require formation or compensation of bone tissue or cartilage tissue. Specifically, for example, (1) repair of bone or cartilage defect sites associated with accidents, diseases, congenital abnormalities, or various operations, (2) promotion of healing of various fractures, (3) artificial joints, artificial bones, Alternatively, bone formation around an artificial implant such as an artificial tooth root, promotion of fixation when using an artificial implant, promotion of spinal fixation, regeneration or replacement of bone or cartilage in the orthopedic field such as leg extension, or reconstruction of a joint (4 ) Bone or cartilage replacement in the plastic surgery field, or (5) jaw bone repair in the dental area, alveolar bone regeneration, dentin and cementum repair, or bone augmentation for implant use, etc. It is. In addition, prevention or treatment of metabolic bone diseases and osteoarthritis, including osteoporosis, fibrotic osteoarthritis, osteomalacia, or Paget's disease, which occurs when the balance between bone resorption and bone formation in bone tissue is broken Is also included.
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。 It should be noted that the specific embodiments and the following examples made in the section of the best mode for carrying out the invention are intended to clarify the technical contents of the present invention, and to such specific examples. It is not to be construed as limiting in any way whatsoever, and those skilled in the art can implement the invention within the spirit of the invention and the scope of the appended claims.
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
野生型ヒトＢＭＰ（ＢＭＰ−２ ＷＴ）および改良型ヒトＢＭＰ（ＢＭＰ２Ｔ４）を以下の手順に従って作製した。 Wild-type human BMP (BMP-2 WT) and improved human BMP (BMP2T4) were prepared according to the following procedure.
ヒト骨肉腫細胞様細胞株（Ｕ２ＯＳ）からｍＲＮＡを抽出し逆転写酵素によりｃＤＮＡを得た。成熟型ＢＭＰ−２の塩基配列（Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８）の第２８３〜３９６位の領域を、Ｎ末端にＭｅｔ−Ａｌａが付加されるようにＰＣＲにて増幅した。増幅したフラグメントを、制限酵素部位（ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ）を有する発現ベクター（ＲＢＳＩＩＰＮ２５ｘ／ｏ）に挿入した。構築した発現ベクターを大腸菌（Ｍ１５株）に導入し、１ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−ｂ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ存在下でＢＭＰ−２を生成した。 MRNA was extracted from a human osteosarcoma cell-like cell line (U2OS) and cDNA was obtained by reverse transcriptase. The region of positions 283 to 396 of the base sequence of mature BMP-2 (Wozney et al., 1988) was amplified by PCR so that Met-Ala was added to the N-terminus. The amplified fragment was inserted into an expression vector (RBSIIP N25 x / o) with restriction enzyme sites (NcoI and BamHI). The constructed expression vector was introduced into Escherichia coli (M15 strain), and BMP-2 was produced in the presence of 1 mM isopropyrothio-b-D-glucopyranosid.
大腸菌発現系においてＢＭＰ−２は封入体に生成されるため、変性剤（５０ｍＭ Ｎａ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５）、８Ｍ ｕｒｅａ、１４ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を用いて封入体を可溶化し、室温で一晩抽出した。蒸留水を用いて抽出物を完全に透析した後に、リフォールディングを行った。ＣＭセファロースクロマトグラフィーを用いて生成タンパク質を濃縮し、ＦＰＬＣ（ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤ ＥＭＤ ＳＯ３ − ６５０，５０ ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， ｐＨ５ ３０％ ２−ｐｒｏｐａｎｏｌ）により最終精製を行い、塩化ナトリウムグラディエントにて溶出した。得られたタンパク質を、蒸留水を用いて透析した後に凍結乾燥し、使用時まで−２０℃で保存した。 Since BMP-2 is produced in inclusion bodies in the E. coli expression system, the inclusion bodies were solubilized using a denaturant (50 mM Na acetate (pH 5), 8M urea, 14 mM 2-mercaptoethanol) and extracted overnight at room temperature. . Refolding was performed after the extract was completely dialyzed with distilled water. CM Sepharose chromatography were concentrated product protein using, FPLC - performs a final purification by (FractogelEMD EMD SO 3 650,50 mM sodium acetate, pH5 30% 2-propanol), and eluted with sodium chloride gradient. The obtained protein was dialyzed with distilled water, lyophilized, and stored at −20 ° C. until use.
これらの組換えタンパク質の１０μｇ／μＬ溶液を調製し、これをＭｉｌｌｉＱ水でさらに希釈して１μｇ／μＬ溶液および５μｇ／μＬ溶液を調製した。タンパク質を含まない溶液（０μｇ／μＬ溶液）をネガティブコントロールに用いた。 10 μg / μL solutions of these recombinant proteins were prepared and further diluted with MilliQ water to prepare 1 μg / μL solution and 5 μg / μL solution. A solution containing no protein (0 μg / μL solution) was used as a negative control.
Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔ（雄性、８週齢、２２０〜２４０ｇ、日本クレア株式会社、東京）に、キシラジン（８ｍｇ／ｋｇ；バイエルメディカル株式会社、東京）およびケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ；第一三共株式会社、東京）の混合麻酔液を腹腔内注射した後、電動バリカンを用いてラット背部の毛を剃った。イソジンで消毒した後、ラット背部の外皮を、左右対象に２ヵ所ずつ。体軸に平行に１ｃｍ切開して、筋膜部分との隙間を作製した。 Wistar rat (male, 8 weeks old, 220-240 g, Claire Japan, Tokyo), xylazine (8 mg / kg; Bayer Medical, Tokyo) and ketamine (80 mg / kg; Daiichi Sankyo, Tokyo) After the intraperitoneal injection of the mixed anesthetic solution of), the hair on the back of the rat was shaved using an electric clipper. After disinfection with isodine, the outer skin of the back of the rat was placed in two places on the left and right subjects. A 1 cm incision was made parallel to the body axis to create a gap with the fascia portion.
組換えタンパク質溶液を用いて、ラットでの異所性の骨再生を調べた。上記組換えタンパク質溶液１００μｌを、ＰＣＲチューブ（Ｍｕｌｔｉ Ｕｌｔｒａ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ０．６５ｍｌ，Ｓｏｒｅｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ，ＵＳＡ）に移し、インプラント体（ＭｒｋIII Ｔｉｕｎｉｔｅ ＮＰ １０ｍｍ×φ３．３ｍｍ、ノーベルバイオケアインプラントシステム・ブローネマルクシステム、東京）をタンパク質溶液中に３分間浸漬した。タンパク質溶液から取り出したインプラント体を、上記ラットの背筋下の切開部分から２ｃｍ離れた場所に埋植し、インプラント体の埋植後に３糸縫合した。なお、ラット１匹あたり、右側にＴ４浸漬インプラント体、左側にＷＴ浸漬インプラント体を埋植した（タンパク質溶液の各濃度あたりｎ＝３）。 Ectopic bone regeneration in rats was examined using the recombinant protein solution. 100 μl of the above recombinant protein solution was transferred to a PCR tube (Multi Ultra PCR tube 0.65 ml, Sorenson Bioscience, Inc, USA) and an implant body (MrkIII Tinite NP 10 mm × φ3.3 mm, Nobel Biocare Implant System / Bronemark System) Tokyo) was immersed in the protein solution for 3 minutes. The implant body taken out from the protein solution was implanted at a location 2 cm away from the incision under the back muscle of the rat, and three sutures were sutured after the implant body was implanted. Each rat was implanted with a T4 immersion implant on the right side and a WT immersion implant on the left side (n = 3 for each concentration of the protein solution).
埋植４週間後に、ジエチルエーテルを用いてラットを屠殺し、埋植したインプラント体を摘出した後４％ＰＦＡ中に１日間浸漬固定した。固定後のインプラント体の重量計測および軟Ｘ線撮影を行った（ｍＦＸ−１０００、２０°ＫＶ、１００ｍＡ、照射時間５秒間）。画像解析ソフト（ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて得られた画像から、新生骨部分の面積を算出し、インプラント体周囲に再生された骨量を評価した。 Four weeks after implantation, the rats were sacrificed using diethyl ether, and the implanted implants were removed and fixed by immersion in 4% PFA for 1 day. The weight of the implant body after fixation and soft X-ray photography were performed (mFX-1000, 20 ° KV, 100 mA, irradiation time 5 seconds). From the image obtained using the image analysis software (image J), the area of the new bone part was calculated, and the amount of bone regenerated around the implant body was evaluated.
図に示すように、ラット皮下埋植試験にて前処理を行った歯科用インプラント体周囲への骨再生能が確認された（図１および２）。図１（ａ）はインプラント体を透過光にて撮影した結果であり、図１（ｂ）はインプラント体を軟Ｘ線撮影した結果であり、図１（ｃ）は軟Ｘ線撮影の結果を二値化した結果である。図１（ｃ）の白色部分が新生骨を示す。また、図２（ａ）は、インプラント体周囲に再生された新生骨部分の骨量を数値化したグラフであり、図２（ｂ）は、インプラント体周囲に再生された新生骨部分の軟Ｘ線不透過度を数値化したグラフである。 As shown in the figure, the ability of bone regeneration around the dental implant body pretreated in the rat subcutaneous implantation test was confirmed (FIGS. 1 and 2). FIG. 1A shows the result of imaging the implant body with transmitted light, FIG. 1B shows the result of soft X-ray imaging of the implant body, and FIG. 1C shows the result of soft X-ray imaging. This is the result of binarization. The white part of FIG.1 (c) shows a new bone. FIG. 2A is a graph in which the bone mass of the new bone portion regenerated around the implant body is quantified, and FIG. 2B is a soft X of the new bone portion regenerated around the implant body. It is the graph which digitized the line opacity.
骨再生能は大腸菌発現系野生型及び改良型タンパク質の双方で認められ、濃度依存性であった。なお、インプラント体に付着した液量は１２μＬであり、３分間の浸漬時間で十分な骨再生能を獲得し得ることがわかった。 Bone regeneration ability was observed in both wild-type and improved proteins of the E. coli expression system and was concentration-dependent. The amount of liquid adhering to the implant body was 12 μL, and it was found that sufficient bone regeneration ability could be obtained with an immersion time of 3 minutes.
このように、インプラント体を大腸菌発現系のタンパク質溶液に浸漬させることで、インプラント体周囲に骨再生能が生じた。インプラント体の骨再生能はタンパク質溶液への少量かつ短時間の浸漬だけで獲得された。また、野生型タンパク質を用いることによりインプラント体は十分な骨再生能を獲得したが、改良型タンパク質は野生型と比べて、インプラント体にさらに強い骨再生能を付与した。 Thus, the bone regeneration capability around the implant body was produced by immersing the implant body in the protein solution of the E. coli expression system. The bone regeneration ability of the implant body was acquired only by a small amount of short time immersion in the protein solution. Moreover, although the implant body acquired sufficient bone regeneration ability by using the wild type protein, the improved protein imparted stronger bone regeneration ability to the implant body as compared with the wild type.
ＢＭＰを用いる骨再生治療は、大量使用に伴う副作用やコストの面から臨床応用が遅れているが、本発明は、非常に意義のある成果を提供し得る。本発明を用いることにより、インプラント体のオッセオインテグレーションが簡便かつ安価な方法によって迅速に得られ、歯科用インプラント体の使用を希望する患者の負担の軽減にも大きく貢献し得る。また、チタン製のインプラント体は人工関節などの整形外科の分野でも広く用いられている材料であるため、適応範囲の拡大が期待される。 Although bone regeneration treatment using BMP has been delayed in clinical application due to side effects and costs associated with mass use, the present invention can provide very significant results. By using the present invention, osseointegration of an implant body can be quickly obtained by a simple and inexpensive method, and can greatly contribute to the reduction of the burden on a patient who desires to use a dental implant body. In addition, since the titanium implant is a material widely used in the field of orthopedics such as an artificial joint, an expansion of the application range is expected.
Claims (8)
（ａ）リジン−ヒスチジン−リジン；および
（ｂ）アルギニン−リジン−アルギニン
の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 The heparin binding domain sequence is
The method according to claim 7, wherein the method is at least one of (a) lysine-histidine-lysine; and (b) arginine-lysine-arginine.
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