JP2008545402A - 神経変性疾患の診断及び治療ターゲットとしてのｋｃｎｎ３ - Google Patents

Abstract

本発明はアルツハイマー病患者及びアルツハイマー病を発症する危険のある個体におけるＫＣＮＮ３遺伝子及びその蛋白産物の調節異常について開示する。この知見に基づき、本発明は対象におけるアルツハイマー病を診断及び予後診断し、対象がアルツハイマー病を発症する危険が増加しているか否かを判定するための方法を提供する。更に、本発明はＫＣＮＮ３遺伝子とその対応する遺伝子産物を使用してアルツハイマー病及び関連神経変性疾患を治療及び予防するための治療及び予防方法を提供する。神経変性疾患の調節剤のスクリーニング方法も開示する。

Description

本発明は対象における神経変性疾患の進行の診断、予後診断及びモニター方法に関する。更に、神経変性疾患の治療抑制方法と調節剤のスクリーニング方法も提供する。本発明は更に医薬組成物、キット、及び組換え動物モデルも開示する。

神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は患者の生活を著しく悪化させる。更に、これらの疾患は健康面、社会面及び経済面において多大な負担となる。ＡＤは全痴呆患者の約７０％を占める最も一般的な神経変性疾患であり、恐らく最も破壊的な加齢性神経変性疾患であり、６５歳以上の人口の約１０％を冒し、８５歳以上では４５％にも及ぶ（Ｖｉｃｋｅｒｓら，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００，６０：１３９−１６５；Ｗａｌｓｈ ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ，Ｎｅｕｒｏｎ ２００４，４４：１８１−１９３）。現在、米国、ヨーロッパ及び日本の患者数は１２００万人と推定される。この状況は先進国の高齢者人口増加とともに不可避的に悪化すると思われる。ＡＤ個体の脳に生じる神経病理的特徴はアミロイドβ蛋白から構成される老人斑と、異常線維状構造物の出現及び神経原線維変化の形成を伴う顕著な細胞骨格変化である。

アミロイドβ蛋白はアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）が種々のプロテアーゼにより分解することにより生成する（Ｓｅｌｋｏｅ ａｎｄ Ｋｏｐａｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００３，２６：５６５−５９７；Ｌｉｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３，３５：１５０５−１５３５）。ＡＤ患者の脳には瀰漫性プラークと神経突起プラークの２種のプラークを検出することができる。これらのプラークは主に大脳皮質と海馬に検出される。脳における毒性Ａβ沈着物の形成はＡＤ過程の非常に初期に開始し、ＡＤ病理に至るその後の破壊的過程に重要な役割を果たすと言われている。ＡＤの他の病理特徴は神経原線維変化（ＮＦＴ）と神経突起異常（神経網スレッドと言う）である（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １９９８，５３：１２７−１４０）。ＮＦＴはニューロンの内側に発生し、タウ蛋白が化学的に変化し、線維が２本ずつ螺旋状に相互に捩れたものである。ＮＦＴの形成に伴い、ニューロン減少を観察することができる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９６，１：３８−５８；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｔｉｇａｎ，Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９９，１：３２９−３５１）。神経原線維変化の出現とその数の増加はＡＤの臨床重篤度によく相関している（Ｓｃｈｍｉｔｔら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０００，５５：３７０−３７６）。ＡＤは記憶形成の早期低下から最終的に高次認知機能の完全な喪失に至る進行性疾患である。認知障害としては特に記憶障害、失語症、失認及び実行機能低下が挙げられる。ＡＤの病因の１つの特徴は特定脳領域及び神経細胞亜集団が選択的に変性プロセスを受け易い点である。具体的に言うと、下側頭葉領域と海馬は疾患の進行中の初期に重度損傷を受ける。他方、前頭葉皮質、後頭葉皮質及び小脳内のニューロンはほぼ無傷のままで神経変性から保護される（Ｔｅｒｒｙら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１，１０：１８４−９２）。現在ＡＤの治癒法はなく、ＡＤの進行を止めるために有効な治療法もなく、死前にＡＤを高い確率で診断するために有効な方法すら存在しない。個体にＡＤを発症する素因を与える数種の危険因子が同定されており、そのうちで最もよく知られているのはアポリポ蛋白Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の３個の異なる既存対立遺伝子（ε２，３及び４）のうちのε４対立遺伝子である（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３，９０：１９７７−８１；Ｒｏｓｅｓ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９８，８５５：７３８−４３）。染色体２１のアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）、染色体１４のプレセニリン１、及び染色体１のプレセニリン２の遺伝子の遺伝的欠損に結びつけられている早発性ＡＤの希少例はあるが、一般的な形態の遅発性散発性ＡＤはまだ原因が分かっていない。神経変性障害の遅発性複合病因は治療薬及び診断薬の開発を阻む難問である。潜在的薬剤ターゲット及び診断マーカーのプールを拡大することが極めて重要である。

従って、本発明の課題は神経疾患の病因を突き止め、特にこれらの疾患の診断と治療薬の開発に適した方法、材料、作用剤、組成物及び動物モデルを提供することである。この課題は独立クレームの構成要素により解決された。サブクレームは本発明の好ましい態様を定義する。

本発明はヒトアルツハイマー病脳サンプルにおけるカリウムイオンチャネル、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＫＣＮＮ３（別称ＳＫ３）をコードする遺伝子及びＫＣＮＮ３の蛋白産物の調節異常差異的発現の検出に基づく。カリウムイオン（Ｋ^＋）チャネルは細胞興奮性（心臓拍動、筋肉収縮及び神経シグナル伝達）やインスリン分泌、細胞増殖、細胞容量調節等の多様な生理的プロセスに関与する膜貫通蛋白である。カリウムイオンチャネルのうちで小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫチャネル）はそれらの活性が細胞内カルシウムイオンにより調節されるという点でＢＫチャネル及びＩＫチャネルと共に特殊な特徴を示す。特にＳＫチャネルはニューロン内の作用電位に従う後過分極に重要な役割を果たす。従って、ニューロンの発火周波数の設定に非常に重要である。１９９６年に３種のＳＫチャネルがラット及びヒト脳からクローニングされ（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７３：１７０９−１７１４）、Ｓｋ１〜３と命名された。その後、４番目のメンバーが数グループにより同定された（例えばＩｓｈｉｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４：１１６５１）。

ＳＫ１−４チャネル（別称ＫＣＮＮ１−４）は６個の膜貫通螺旋から構成され、主にホモマー複合体として活性であるが、ヘテロ四量体複合体の形成も示唆されている（Ｉｓｈｉｉら１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１６５１）。ＫＣＮＮ３はこのチャネルが双極性障害に関与していると言われている２個のポリグルタミンリピートをもつ延長Ｎ末端をもつという点でＫＣＮＮ１及びＫＣＮＮ２と相違する（Ｃｈａｎｄｙら，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．１９９８，３：３２−３７）。しかし、他の研究グループはこの知見を確認できなかった（例えばＦｒｅｂｏｕｒｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（ｓｕｐｐｌ．）１９９８，６３：Ａ３２６限定；Ａｕｓｔｉｎら，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．１９９９，４：２６１−２６６；Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄｔら，Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９８，１：２５９−２６５）。

ＫＣＮＮ３のコーディング配列は７３６アミノ酸と分子量計算値８２ｋＤａをもつ蛋白質をコードする２２１１塩基対から構成される。この遺伝子は染色体１ｑ２２にマッピングされており、その８個のエキソンは約１６３ｋｂｐに及ぶ（Ｓｕｎら，Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１，４６：４６３−４７０）。ＫＣＮＮ３はヒト及びマウス海馬で高度に発現され（Ｂｌａｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：２００３，９１１−９１２；Ｔａｃｃｏｎｉら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，１０２：２０９−２１５）、海馬ではその発現が加齢と共に増加すると報告されている（Ｂｌａｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３，６：９１１−９１２）。精密発現分析によると、ＫＣＮＮ３は特に海馬歯状回及びＣＡ１−４領域と嗅内皮質で発現され、更に基底核、視床及び各種脳幹核でも発現されることが分かった（Ｓａｉｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２６：４５８−４６９）。ＫＣＮＮ３は選択的にスプライスされ、ＫＣＮＮ１−３の機能を抑制するドミナントネガティブアイソフォームを生じることが報告されている（Ｋｏｌｓｋｉ−Ａｎｄｒｅａｃｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９：６８９３−６９０４）。

ＫＣＮＮ３のその他の機能も報告されており、特に呼吸と分娩（Ｂｏｎｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，２８９：１９４２−１９４６）及び血圧調節（Ｔａｙｌｏｒら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００３，９３：１２４−１３１）における役割が挙げられる。興味深いことに、ＫＣＮＮ３の加齢性発現上昇はアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＫＣＮＮ３−ｍＲＮＡの選択的発現低下により克服できない多少の認知障害をマウスに生じたので、ＫＣＮＮ３の発現レベルはシナプス可塑性に結び付けられている（Ｂｌａｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３，６：９１１−９１２）。更に、ＫＣＮＮ３は膜興奮性の調節と中枢ニューロンの発火特性の決定に関与していることも示されている（Ｐｅｄａｒｚａｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：９７６２−９７６９）。トランスジェニック動物が樹立されている（Ｂｏｎｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，２８９：１９４２−１９４６）。この場合、正常ＫＣＮＮ３プロモーター機能を維持しながら遺伝子スイッチの導入によりＫＣＮＮ３遺伝子の発現を調節することはできない。著者らはＫＣＮＮ３が例えば睡眠時無呼吸や乳幼児突然死のターゲットになると仮定している。

ＳＫチャネルの数種の遮断薬が記載されており、特に低ナノモル範囲でチャネルを遮断するハチ毒アパミンとサソリ毒スキラトキシンが挙げられる。しかし、これらの毒素は全ＳＫチャネルを非特異的に遮断する。低分子量化合物がＳＫチャネル活性を妨害することも記載されているが、上記毒素に比較するとその効力は低い（例えばツボクラリン、ＵＣＬ−１６８４、ガラミン）。

本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。例えば「細胞」は複数の細胞も意味し、他の用語についても同様である。

本明細書と特許請求の範囲で使用する「及び／又は」なる用語はこの用語の前後の用語がそのいずれか一方又は両方であるとみなされることを意味する。例えば、「レベル及び／又は活性の測定」なる用語はレベルのみ又は活性のみ又はレベルと活性の両方を測定することを意味する。

本明細書で使用する「レベル」なる用語は転写産物（例えばｍＲＮＡ）又は翻訳産物（例えば蛋白質又はポリペプチド）の量又は濃度の程度又は尺度を意味する。

本明細書で使用する「活性」なる用語は転写産物もしくは翻訳産物が生物学的効果を生じる能力の尺度又は生物活性分子のレベルの尺度を意味する。

「活性」なる用語は更に、限定されないが配列番号１の新規カリウムチャネルポリペプチド等のカリウムチャネル又はカリウムチャネルサブユニットの結合、阻害、抑制、遮断、中和又は分離と、発現上昇又はカリウムチャネルサブユニットの活性化、アゴニスト作用、発現上昇に関する生物活性及び／又は薬理活性を意味する。「生物活性」としては限定されないが、カリウムイオン及び／又は膜貫通カリウムイオン流の膜貫通輸送及び／又はその調節が挙げられる。「薬理活性」としては限定されないが、カリウムチャネル又はカリウムチャネルサブユニットがリガンド、化合物、作用剤、モジュレーター及び／又は別のカリウムチャネルサブユニットと結合する能力が挙げられる。

本明細書で使用する「レベル」及び／又は「活性」なる用語は更に遺伝子発現レベル又は遺伝子活性を意味する。遺伝子発現は遺伝子に含まれる情報が転写及び翻訳により利用され、遺伝子産物が生産されることとして定義することができる。

「調節異常」とは遺伝子発現の発現上昇もしくは発現低下及び／又は遺伝子産物の安定性の増加もしくは低下を意味する。遺伝子産物はＲＮＡ又は蛋白質を含み、遺伝子発現の結果である。遺伝子産物の量を使用して遺伝子の活性の程度及びその遺伝子産物の安定性の程度を測定することができる。

本明細書と特許請求の範囲で使用する「遺伝子」なる用語はコーディング領域（エキソン）と非コーディング領域（例えばプロモーター又はエンハンサー等の非コーディング調節因子、イントロン、リーダー配列及びトレーラー配列）の両者を意味する。

「ＯＲＦ」なる用語は「オープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）」の頭文字であり、少なくとも１個の読み枠に停止コドンをもたないため、潜在的にアミノ酸配列に翻訳することができる核酸配列を意味する。「調節因子」とは誘導型及び非誘導型プロモーター、エンハンサー、オペレーター、並びに遺伝子発現を誘導及び調節する他の因子を意味する。

本明細書で使用する「フラグメント」なる用語は例えば選択的スプライシング又は短縮又は他の方法で開裂した転写産物又は翻訳産物を意味する。

本明細書で使用する「誘導体」なる用語は突然変異もしくはＲＮＡ編集もしくは化学修飾もしくは他の方法で改変された転写産物又は突然変異もしくは化学修飾もしくは他の方法で改変された翻訳産物を意味する。分かりやすく言うならば、例えば誘導体転写産物とは一塩基又は多塩基欠失、挿入又は置換等の改変を核酸配列にもつ転写産物を意味する。例えば誘導体翻訳産物はリン酸化もしくはグリコシル化もしくはアセチル化もしくは脂質化の改変又はシグナルペプチド開裂もしくは他の型の成熟開裂の改変等の方法により作製することができる。これらの方法は翻訳後に実施することができる。

本明細書と特許請求の範囲で使用する「モジュレーター」なる用語は遺伝子又は遺伝子の転写産物又は遺伝子の翻訳産物のレベル及び／又は活性を変化又は変更させることが可能な分子を意味する。「モジュレーター」とはカリウムチャネルサブユニット又はカリウムチャネルの機能特性を亢進又は抑制し、従って、前記機能特性を「調節」し、カリウムチャネル又はカリウムチャネルサブユニットの結合、阻害、抑制、遮断、中和又は分離を「調節」し、活性化、アゴニスト作用及び発現上昇を「調節」することが可能な分子を意味する。「調節」は細胞の生物活性を変化させる能力という意味でも使用する。「モジュレーター」は遺伝子の転写産物又は翻訳産物の生物活性を変化又は変更させることができる。例えば前記調節としては、生物活性及び／又は薬理活性の増加もしくは低下、結合特性の変化、又は遺伝子の前記翻訳産物の生物学的、機能的もしくは免疫学的特性の他の任意変化もしくは変更が挙げられる。

「作用剤」、「試薬」又は「化合物」なる用語は細胞、組織、体液又は任意生体系もしくは任意試験アッセイ系の状況内に正又は負の生物学的効果をもつ任意物質、化学薬品、組成物又は抽出物を意味する。例えば、ターゲットのアゴニスト、アンタゴニスト、部分アゴニスト又は逆アゴニストが挙げられる。このような作用剤、試薬又は化合物としては核酸、天然もしくは合成ペプチドもしくは蛋白複合体又は融合蛋白が挙げられる。更に、抗体、有機又は無機分子又は組成物、小分子、薬剤及び上記物質の任意のものの任意組合わせでもよい。これらは試験、診断又は治療目的に使用することができる。

「オリゴヌクレオチドプライマー」又は「プライマー」なる用語は相補塩基対のハイブリド形成により所与ターゲットポリヌクレオチドとアニールすることができ、ポリメラーゼにより伸長することができる短い核酸配列を意味する。これらの配列は特定配列に対して特異的になるように選択してもよいし、ランダムに選択してもよく、例えば混合物中の可能な全配列をプライミングする。変発明で使用するプライマー長は１０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチドとすることができる。「プローブ」は本明細書に記載及び開示する核酸配列の短い核酸配列又はその相補配列である。これらの配列は全長配列でもよいし、所与配列のフラグメント、誘導体、アイソフォーム又は変異体でもよい。「プローブ」とアッセイサンプルのハイブリダイゼーション複合体の同定により、このサンプル内の他の類似配列の存在の検出が可能になる。

本明細書で使用する「ホモログ又はホモロジー」なる用語はヌクレオチド又はペプチド配列と別のヌクレオチド又はペプチド配列の近縁度を意味し、比較する前記配列間の一致度及び／又は類似度により決定される。当分野では、「一致度」及び「類似度」なる用語はクエリー配列と好ましくは同一型の他の配列（核酸又は蛋白質配列）の相互マッチングにより決定されるポリペプチド又はポリヌクレオチド配列近縁度を意味する。「一致度」及び「類似度」を計算及び決定するための好ましいコンピュータープログラムとしては限定されないが、ＧＣＧ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９−３４０２；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４，１２：３８７）、ＢＬＡＳＴＮ ２．０（Ｇｉｓｈ Ｗ．，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ，１９９６−２００２）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，８５：２４４４−２４４８）及び最長オーバーラップをもつ１対のコンティグを決定し、整列させるＧＣＧ ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Ｗｉｌｂｕｒ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８４，４４：５５７−５６７；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３）が挙げられる。

本明細書で使用する「変異体」なる用語は本発明に開示するポリペプチド及び蛋白質に関して、本発明の天然ポリペプチド又は蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端及び／又は天然アミノ酸配列内に１個以上のアミノ酸が付加され及び／又は置換され及び／又は欠失され及び／又は挿入されているが、その本質的特性を維持する任意ポリペプチド又は蛋白質を意味する。更に、「変異体」なる用語はポリペプチド又は蛋白質の任意短縮形態又は延長形態を含む。「変異体」はＫＣＮＮ３蛋白質のアミノ酸配列、特に配列番号１に対して少なくとも約８０％の配列一致度、より好ましくは少なくとも約９０％の配列一致度、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列一致度をもつ配列も含む。「変異体」としては例えば高度保存領域に保存アミノ酸置換をもつ蛋白質が挙げられる。本発明の「蛋白質及びポリペプチド」は、ＫＣＮＮ３蛋白質のアミノ酸配列、特に配列番号１を含む蛋白質の変異体、フラグメント及び化学誘導体を含む。コドンが代替塩基配列により別のコドンで置換されているが、ＤＮＡ配列により翻訳されたアミノ酸配列が変化していない配列変異が含まれる。当分野で公知のこの現象は特定アミノ酸を翻訳するコドンセットの冗長と呼ばれる。機能性に影響を与えないこのようなアミノ酸置換（例えばリジン→アルギニン、ロイシン→バリン、グルタミン→アスパラギン）が含まれる。自然界から単離可能であるか又は組換え及び／又は合成手段により生産可能な蛋白質及びポリペプチドが含まれる。天然蛋白質又はポリペプチドとは天然に存在する短縮又は分泌形態、天然に存在する変異体形態（例えばスプライス変異体）及び天然に存在する対立遺伝子変異体を意味する。本明細書で使用する「単離」なる用語はその天然環境から変化しているか及び／又は取出されており、即ちそれらが通常存在する細胞又は生体から単離されており、それらが自然界で結合していることが分かっている共存成分から分離されているか又は本質的に精製されている分子又は物質を意味する。この概念は更にこのような分子をコードする配列がその天然状態では結合していないポリヌクレオチドとこの配列を人為的に結合することができ、このような分子を組換え及び／又は合成手段により生産できることを意味し、「非天然」とも言う。前記目的のためにこれらの配列を当業者に公知の方法により生体又は非生体に導入することができるとしても、また、これらの配列が前記生体又は非生体に依然として存在しているとしても、これらの配列は単離されているとみなされる。本発明では、「危険」、「感受性」及び「素因」なる用語は同等であり、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する確率に関して使用する。

「ＡＤ」なる用語はアルツハイマー病を意味する。

本明細書で使用する「ＡＤ型神経病理」、「ＡＤ病理」なる用語は本明細書に記載し、最先端文献から広く公知の神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的及び臨床的特徴、徴候及び症状を意味する（Ｉｑｂａｌ，Ｓｗａａｂ，Ｗｉｎｂｌａｄ ａｎｄ Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ），Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，１９９９；Ｓｃｉｎｔｏ ａｎｄ Ｄａｆｆｎｅｒ，Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２０００；Ｍａｙｅｕｘ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ｔａｎｚｉ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ，Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８参照）。

「ブラークステージ（Ｂｒａａｋ ｓｔａｇｅ）」又は「ブラークステージ分類」なる用語はＢｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋにより提案された基準による脳分類を意味する（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１，８２：２３９−２５９；Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １９９８，５３：１２７−１４０）。ＡＤのブラークステージ分類は前脳の所定領域における神経原線維病理の程度と分布をランク付けし、ＡＤの神経病理進行を６段階（ステージ０〜６）に分けている。これはＡＤの死後神経病理段階分類において広く許容されている確立された方法である。精神状態及び認知機能／障害に関するＡＤ患者の臨床症状と検死後に得られる対応するブラークステージの間には有意の相関があることが説得力をもって示されている（Ｂａｎｃｈｅｒら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９３，１６２：１７９−１８２；Ｇｏｌｄら，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ２０００，９９：５７９−５８２）。同様に、神経原線維変化とニューロン細胞病理の相関も認められており（Ｒｏｓｓｌｅｒら，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ２００２，１０３：３６３−３６９）、これらはどちらも認知機能を予測することが報告されている（Ｇｉａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３，６０：１４９５−１５００；Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２００４，６１：３７８−３８４）。更に、βアミロイドペプチド沈着から最終的に神経原線維変化の形成に至る発症カスケードも提示されており、こうして分子／細胞レベルにおける初期ＡＤ特異的イベントの先行が証明されている（Ｍｅｔｓａａｒｓら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ ２００３，２４：５６３−５７２）。

従って、本発明では個体ドナーの臨床徴候／症状に依存しない（即ち精神障害、認知障害、他の神経精神病学的パラメーターの低下又はＡＤの明白な臨床診断の報告の有無に依存しない）疾患進行の代替マーカーとしてブラークステージを使用する。即ち、ブラークステージ分類の基準となる神経原線維変化はその根底にある分子及び細胞病理メカニズム一般を反映し、従って、脳の病的（又は病前）状態を定義すると推測され、即ち、例えばブラークステージ１のドナーは定義によると、ステージ２（以上）のドナーよりも初期の分子／細胞発症段階にあり、従って、ブラークステージ１のドナーは例えばブラークステージ２以上のドナーと比較する場合の対照個体とみなすことができる。この点で、対照個体と疾患個体の区別は臨床診断に基づく「健常対照ドナー」と「ＡＤ患者」の区別と必ずしも同一である必要はなく、代替マーカーであるブラークステージにより推定及び分類した病的（又は病前）状態の推定相違を意味する。

「対照」から得られた値は「既知健常状態」を表す「参照値」であり、「ＡＤ患者」から得られた値は「既知疾患状態」を表す「参照値」である。本発明では、ブラークステージ０はアルツハイマー病の徴候及び症状をもつとみなされないヒトを表すことができ、ブラークステージ１〜４は既にＡＤの臨床徴候及び症状があるか否かに応じて健常対照ヒト又はＡＤ患者を表すことができる。ブラークステージの数値が高いほど、ＡＤの徴候及び症状を示す可能性又はＡＤの徴候及び症状を発症する危険が高くなる。神経病理評価即ちＡＤの病理変化が痴呆の根本原因である確率の推定については、Ｂｒａａｋ Ｈ．（ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ）によりアドバイスが与えられている。

本発明による神経変性疾患又は障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型痴呆、進行性核性麻痺、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆、多発性全身萎縮症、嗜銀顆粒性痴呆及び他のタウパチー並びに軽度認知障害が挙げられる。神経変性プロセスに関する他の疾患としては、例えば虚血性脳卒中、加齢黄斑変性、ナルコレプシー、運動ニューロン疾患、プリオン疾患、外傷性神経損傷及び修復、並びに多発性硬化症が挙げられる。

本発明は特定サンプル、ＡＤ患者の特定脳領域、各種ブラークステージのヒトの特定脳領域におけるカリウムチャネル、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルである小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル蛋白３（別称ＫＣＮＮ３又はＫ３、別称ＳＫ３又はＳＫＣａ３）をコードする遺伝子及び前記遺伝子ＫＣＮＮ３（別称ＳＫ３）の蛋白産物の同定、差異的発現、差異的調節、調節異常を相互間比較及び／又は年齢一致対照ヒトとの比較により開示する。本発明はＡＤ患者の下側頭葉皮質と前頭葉皮質ではＫＣＮＮ３（ＳＫ３）ｍＲＮＡレベルが増加し、発現が増加されるという点で、対照ヒトの各脳領域に比較してＡＤ患者の脳ではＫＣＮＮ３（ＳＫ３）の遺伝子発現が変化し、異常調節されることを開示する。更に、本発明はＫＣＮＮ３（ＳＫ３）発現が各種ブラークステージで異なり、初期ブラークステージで既に発現レベル増加が開始しており、主に下側頭葉皮質で病理ブラークステージの進行に伴って漸進的に増加することを開示する。

ＡＤ型病理の発症に平行するＫＣＮＮ３（ＳＫ３）のこの調節異常はＫＣＮＮ３とＡＤの関係を明白に反映しており、疾患の過程における進行性病理イベントの指標である。ＡＤ患者と対照を比較した場合だけでなく各種ブラークステージ間で比較した場合にも観察されるＫＣＮＮ３（ＳＫ３）遺伝子転写レベルの差異はＫＣＮＮ３（ＳＫ３）蛋白質レベルに認められる実質的な差異により更に裏付けられる。対照とは対照的に、ＡＤ患者からの脳検体ではＫＣＮＮ３（ＳＫ３）蛋白質は反応性星状細胞に高レベルで含まれており、蓄積し、皮質βアミロイド斑と同時沈着する。ＫＣＮＮ３（ＳＫ３）遺伝子発現のこの調節異常と、ＡＤ型病理の発症に平行する対応する遺伝子産物のレベル及び局在変化はＫＣＮＮ３（ＳＫ３）とＡＤの関係を明白に反映しており、疾患の過程における進行性病理イベントの指標である。ＫＣＮＮ３（ＳＫ３）遺伝子発現の調節異常及び対応する遺伝子産物のレベル及び局在変化と神経変性疾患、特にＡＤの病理の関係を実証する実験はまだ記載されていない。同様に、ＫＣＮＮ３（ＳＫ３）遺伝子における突然変異が前記疾患と関連することも記載されていない。ＫＣＮＮ３（ＳＫ３）遺伝子をこのような疾患と関連付けることにより、特に前記疾患の診断及び治療の新規方法が得られる。更に、ＫＣＮＮ３をＡＤの過程の初期に既に発生する病理イベントと関連付けることにより、脳の修復不能な損傷が生じる前に適用してＡＤ病理の開始を予防する治療の可能性が得られる。従って、本発明は神経変性疾患、特にＡＤの素因の診断評価、治療中のヒトの診断モニター、予後診断及び識別に有用である。

本発明はＡＤ患者の特定脳領域におけるＫＣＮＮ３（ＳＫ３）をコードする遺伝子及びその遺伝子産物の調節異常を開示する。下側頭葉、内側嗅領、海馬及び扁桃核内のニューロンはＡＤで変性プロセスを受ける（Ｔｅｒｒｙら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１，１０：１８４−１９２）。これらの脳領域は主に学習及び記憶機能の処理に関与しており、ＡＤでニューロン減少と変性に選択的感受性を示す。他方、前頭葉皮質、後頭葉皮質及び小脳内のニューロンはほぼ無傷のままであり、神経変性プロセスから保護される。本明細書に開示する実施例では、ＡＤ患者と年齢一致対照個体の前頭葉皮質（Ｆ）と下側頭葉皮質（Ｔ）に由来する脳組織を使用した。従って、ＫＣＮＮ３（ＳＫ３）遺伝子とその対応する転写及び／又は翻訳産物は原因としての役割を果たし、選択的ニューロン変性及び／又は神経保護に影響を与える。

１側面では、本発明は対象における神経変性疾患を診断もしくは予後診断する又は対象が前記疾患を発症する素因をもつか否かを判定する又は神経変性疾患をもつ対象に投与した治療薬の効果をモニターする方法に関する。本方法は前記対象から得られたサンプル中の（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物の及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物の及び／又は（ｉｉｉ）前記転写産物もしくは翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル、発現もしくは活性、又は前記レベル、発現及び前記活性の両者を測定する段階と、既知疾患状態（患者）を表す参照値及び／又は既知健常状態（対照）を表す参照値及び／又は既知ブラークステージを表す参照値と前記転写産物及び／又は前記翻訳産物の前記レベル、発現及び／又は前記活性を比較する段階と、前記レベル、発現及び／又は前記活性が既知健常状態を表す参照値に比較して変動、変化しているか否か、及び／又は既知疾患状態を表す参照値と同様もしくは同一であるか否か、及び／又は前記対象が神経変性疾患をもつこともしくは前記対象が前記疾患を発症する危険が増加していることの指標である既知ブラークステージを表す参照値と同様もしくは同一であるか否かを分析することにより、前記対象における前記神経変性疾患を診断もしくは予後診断する又は前記対象が前記神経変性疾患を発症する危険が増加しているか否かを判定する段階を含む。「対象における」なる用語は対象を冒す疾患に関する限りにおいて開示方法の結果を意味し、即ち、前記疾患は対象「における」。

別の１側面では、本発明は対象における神経変性疾患の進行をモニターする方法に関する。前記対象から得られたサンプル中の（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写産物もしくは翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル、発現もしくは活性、又は前記レベル、発現及び前記活性の両者を測定する。既知疾患状態又は既知健常状態又は既知ブラークステージを表す参照値と前記レベル、発現及び／又は前記活性を比較する。こうして、前記対象における前記神経変性疾患の進行をモニターする。

更に別の１側面では、本発明は神経変性疾患の治療の効果をモニターする治療評価方法に関し、本方法は前記疾患の治療中の対象から得られたサンプル中の（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写産物もしくは翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル、発現もしくは活性、又は前記レベル、発現及び前記活性の両者を測定する段階を含む。既知疾患状態又は既知健常状態又は既知ブラークステージを表す参照値と前記レベル、発現もしくは前記活性、又は前記レベル及び前記活性の両者を比較することにより、前記神経変性疾患の治療を評価する。

好ましい１態様では、前記疾患の進行をモニターするために、一定期間にわたって前記対象から採取したサンプル系列中の（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写産物もしくは翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル、発現もしくは活性、又は前記レベル及び前記活性の両者を比較する。他の好ましい態様では、前記サンプル採取の１回以上の前に前記対象を治療する。更に別の好ましい態様では、前記対象の前記治療の前後に前記レベル及び／又は活性を測定する。

本発明の方法、キット、組換え動物、分子、アッセイ及び使用の好ましい１態様では、前記ＫＣＮＮ３遺伝子及び蛋白質（別称小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル蛋白３、別称ＫＣＮＮ３又はＫ３、別称ＳＫ３又はＳＫＣａ３）は特に配列番号１の蛋白質（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９ＵＧＩ６）をコードするＫＣＮＮ３遺伝子により表される。前記蛋白質のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＪ２５１０１６のｃＤＮＡ配列（ＫＣＮＮ３，ＳＫ３，Ｋ３）に対応する配列番号５に対応するｍＲＮＡ配列から推定される。本発明では、ＫＣＮＮ３はヒトＫＣＮＮ３のコーディング配列（ｃｄｓ）を表す配列番号９の核酸配列も意味する。本発明では、前記配列は本明細書で使用する用語の意味で「単離」されている。更に、本発明では、前記ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子を一般にＫＣＮＮ３遺伝子又はＳＫ３遺伝子とも言い、簡単にＫＣＮＮ３又はＳＫ３とも言う。ＫＣＮＮ３又はＳＫ３の蛋白質は一般にＫＣＮＮ３蛋白質又はＳＫ３蛋白質とも言う。

本発明の方法、キット、組換え動物、分子、アッセイ及び使用の別の好ましい１態様では、前記神経変性疾患又は障害はアルツハイマー病であり、前記対象はアルツハイマー病の徴候及び症状をもつ。

分析及び測定するサンプルは脳組織もしくは他の組織又は体細胞からなる群から選択することが好ましい。サンプルは更に脳髄液又は他の体液（例えば唾液、尿、糞便、血液、血清、血漿又は粘液）でもよい。本発明の神経変性疾患の診断、予後診断、進行モニター又は治療評価方法は体外で実施することができ、このような方法は対象もしくは患者又は対照ヒトから分離、採取又は単離したサンプル（例えば体液又は細胞）に実施することが好ましい。

他の好ましい態様では、前記参照値は前記神経変性疾患をもたない対象から得られたサンプル（対照サンプル、対照、健常対照サンプル）又は神経変性疾患、特にアルツハイマー病をもつ対象から得られたサンプル（患者サンプル、患者、ＡＤサンプル）又はＡＤの徴候及び症状の有無を問わずに規定ブラークステージのヒトから得られたサンプル中の（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写産物もしくは翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル、発現もしくは活性、又は前記レベル及び前記活性の両者の値である。

好ましい態様では、前記対象から採取したサンプル細胞又は組織又は体液中のＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物及び／又はＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物及び／又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル及び／又は活性及び／又は発現が既知健常状態（対照サンプル）を表す参照値に対して変化しているならば、神経変性疾患、特にＡＤであると診断もしくは予後診断されるか又はＡＤになる危険が増加していると判定される。別の好ましい１態様では、対象から得られたサンプル細胞又は組織又は体液中のＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物及び／又はＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物及び／又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル及び／又は活性が神経変性疾患、特にアルツハイマー病の既知疾患状態（ＡＤ患者サンプル）を表す参照値に対して同一又は同様であるならば、前記神経変性疾患であると診断もしくは予後診断されるか又はその危険が増加していると判定される。

更に別の好ましい態様では、対象から得られたサンプル細胞又は組織又は体液中のＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物及び／又はＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物及び／又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル及び／又は活性がＡＤの徴候及び症状を発症する高い危険を示す既知ブラークステージを表す参照値に対して同一又は同様であるならば、ＡＤであると診断もしくは予後診断されるか又はＡＤになる危険が増加していると判定される。

ＫＣＮＮ３の前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の前記レベル変動変化、発現変化及び／又は前記活性変化は増加、発現上昇であることが好ましい。

好ましい態様では、転写産物のレベル及び／又はＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の発現の測定はプライマーセットによる定量的ＰＣＲ分析を使用し、対象のサンプルから抽出したＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡに由来する前記遺伝子特異的配列を増幅することにより、対象から得られたサンプル中で実施される。本発明の実施例（ｖｉ）にプライマーセット（配列番号１３，配列番号１４）を示すが、本発明に開示する配列から作製した他のプライマーも使用することができる。前記遺伝子に特異的なプローブを使用したノーザンブロット又はリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）も適用できる。チップマイクロアレー技術により転写産物を測定すると更に好ましいと思われる。これらの技術は当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，２０００参照）。イムノアッセイの１例は特許出願ＷＯ０２／１４５４３に開示及び記載されているような酵素活性の検出及び測定である。

本発明は更に本発明に開示するような核酸配列又はそのフラグメントもしくは変異体に固有のプライマー及びプローブの構築及び使用に関する。オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブは蛍光、生物発光、磁気又は放射性物質で特異的に標識することができる。本発明は更に前記特異的オリゴヌクレオチドプライマーを適宜併用した前記核酸配列又はそのフラグメント及び変異体の検出及び生産に関する。前記プライマーセットを使用して当業者に周知の方法であるＰＣＲ分析を実施し、核酸を含むサンプルから前記遺伝子特異的核酸配列を増幅することができる。このようなサンプルは健常対象又は疾患対象又は規定ブラークステージの対象に由来する。増幅の結果として特異的核酸産物が生産されるか否かと、異なる長さのフラグメントを獲得できるか否かが神経変性疾患、特にアルツハイマー病の指標となる。従って、本発明は神経変性疾患、特にアルツハイマー病に関連し得る試験核酸配列を含む所与サンプル中の遺伝子突然変異及び一塩基多形の検出に有用な少なくとも１０塩基長から全長コーディング配列及び遺伝子配列までの核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを提供する。この特徴は高速ＤＮＡ塩基診断試験を開発するのに有利であり、このような試験はキットのフォーマットであることも好ましい。実施例１（ｖｉ）にＫＣＮＮ３のプライマーを例示する。

更に、イムノアッセイ、活性アッセイ及び／又は結合アッセイを使用し、ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物及び／又は前記翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル及び／又は活性及び／又は発現、及び／又は前記翻訳産物及び／又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の活性レベルを検出することができる。これらのアッセイは抗蛋白抗体又は抗蛋白抗体と結合する二次抗体に付けた酵素、クロモダイナミック、放射性、磁気又は蛍光ラベルを利用して前記蛋白分子と抗蛋白抗体の結合量を測定することができる。更に、他の高親和性リガンドも使用できる。使用可能なイムノアッセイとしては例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及び当業者に公知の他の技術が挙げられる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９及びＥｄｗａｒｄｓ Ｒ，Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９参照）。これらの全検出技術はマイクロアレー、蛋白アレー、抗体マイクロアレー、組織マイクロアレー、電子バイオチップ又は蛋白チップ技術のフォーマットで利用することもできる（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，２０００参照）。

別の側面では、本発明は対象における神経変性疾患、特にＡＤを診断もしくは予後診断するか、又は対象が神経変性疾患、特にＡＤを発症する性向もしくは素因の有無を判定するか、又は神経変性疾患、特にＡＤをもつ対象に投与した治療薬の効果をモニターするためのキットに関し、前記キットは、
（ａ）（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬、（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬から構成される群から選択される少なくとも１種の試薬と；
（ｂ）−前記対象から得られたサンプル中のＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又はフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベルもしくは活性、又は前記レベル及び前記活性の両者及び／又は発現を測定し；
−既知疾患状態（患者）を表す参照値及び／又は既知健常状態（対照）を表す参照値及び／又は既知ブラークステージを表す参照値と前記転写産物及び／又は前記翻訳産物の前記レベル及び／又は前記活性及び／又は発現を比較し；
−前記レベル及び／又は前記活性及び／又は発現が既知健常状態を表す参照値に比較して変化しているか否か、及び／又は既知疾患状態を表す参照値もしくは既知ブラークステージを表す参照値と同様もしくは同一であるか否かを分析し；
−神経変性疾患、特にＡＤを診断もしくは予後診断し又は前記対象が前記疾患を発症する性向もしくは素因の有無を判定し、前記転写産物及び／又は前記翻訳産物のレベル、発現もしくは活性、又は前記レベル及び前記活性の両者が既知健常状態（対照）を表す参照値に比較して変動もしくは変化しているか、及び／又は前記転写産物及び／又は前記翻訳産物のレベル、発現もしくは活性、又は前記レベル及び前記活性の両者が既知疾患状態（患者）、好ましくはＡＤの疾患状態（ＡＤ患者）を表す参照値及び／又は既知ブラークステージを表す参照値と同様もしくは同一であるならば、神経変性疾患、特にＡＤであると診断もしくは予後診断する、前記疾患を発症する性向もしくは素因が増加しており、ＡＤの徴候及び症状を発症する危険が高いと判定することにより、神経変性疾患、特にＡＤを診断もしくは予後診断する、又は対象が前記疾患を発症する性向もしくは素因の有無を判定する、又は治療効果をモニターするための説明書を含む。本発明のキットは神経変性疾患、特にＡＤを発症する危険のある個体の識別に特に有用であると思われる。

ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物及び／又は翻訳産物を選択的に検出する試薬は各種長さの配列、配列フラグメント、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びリボザイムとすることができる。

別の１側面では、本発明は対象における神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断及び予後診断する方法、対象が前記疾患を発症する性向もしくは素因の有無を判定する方法および神経変性疾患、特にＡＤをもつ対象に投与した治療薬の効果をモニターする方法におけるキットの使用に関する。

従って、本発明のキットは疾患の過程で不可逆的損傷を受ける前に発症前の初期予防対策又は治療介入のために特定個体を標的とする手段として利用することができる。更に、好ましい態様では、本発明のキットは対象における神経変性疾患、特にＡＤの進行をモニターすると共に、前記対象の前記疾患の治療処置の成否をモニターするために有用である。

別の側面では、本発明は対象における神経変性疾患、特にＡＤの治療又は予防方法として、前記治療を必要とする前記対象に、（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベルもしくは活性又は前記レベル及び前記活性の両者に直接又は間接的に作用する１種以上の作用剤、モジュレーター、選択的アンタゴニストもしくはアゴニスト又は抗体を治療又は予防のために有効な量及び処方で投与する段階を含む方法に関する。前記作用剤は小分子でもよいし、ペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドでもよい。前記ペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドとしてはＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体が挙げられる。本発明による神経変性疾患、特にＡＤの治療又は予防剤はヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドから構成されるものでもよい。前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドはＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列をセンス方向又はアンチセンス方向のどちらに含むものでもよい。

好ましい態様では、前記方法は前記１種以上の作用剤を投与するために遺伝子療法及び／又はアンチセンス核酸技術のそれ自体公知の手法の適用を含む。一般に、遺伝子療法には突然変異遺伝子の分子置換、新規遺伝子の付加による治療蛋白質の合成、及び組換え発現法又は薬剤による内在細胞遺伝子発現の調節等の数種のアプローチがある。遺伝子導入技術は詳細に記載されており（例えばＢｅｈｒ，Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １９９３，２６：２７４−２７８及びＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０：９２６−９３１参照）、細胞へのＤＮＡの機械的マイクロインジェクション等の直接遺伝子導入技術に加え、生物ベクター（例えば組換えウイルス、特にレトロウイルス）又はモデルリポソームを利用する間接技術、あるいはポリカチオンとのＤＮＡ共沈によるトランスフェクション、化学的（溶剤、界面活性剤、ポリマー、酵素）又は物理的手段（機械的、浸透圧、熱、電気ショック）による細胞膜刺激に基づく技術等が挙げられる。中枢神経系への出生後遺伝子導入は詳細に記載されている（例えばＷｏｌｆｆ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９３，３：７４３−７４８参照）。

特に、本発明はアンチセンス核酸療法、即ちアンチセンス核酸又はその誘導体を所定の病態細胞に導入することにより不適切発現又は欠損遺伝子を発現を低下させることにより神経変性疾患を治療又は予防する方法に関する（例えばＧｉｌｌｅｓｐｉｅ，ＤＮ＆Ｐ １９９２，５：３８９−３９５；Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ａｋｈｔａｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９５，１３：１９７−１９９；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０：８８２−６参照）。ハイブリド形成ストラテジー以外に、リボザイム（即ち酵素として作用するＲＮＡ分子）の利用により、疾患メッセージをもつＲＮＡを破壊することも記載されている（例えばＢａｒｉｎａｇａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６２：１５１２−１５１４参照）。好ましい態様では、治療する対象はヒトであり、治療用アンチセンス核酸又はその誘導体はＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物に対する。対象の中枢神経系、好ましくは脳の細胞をこのように治療することが好ましい。細胞導入はアンチセンス核酸及びその誘導体をキャリヤー粒子に結合する方法や、上記技術等の公知ストラテジーにより実施することができる。標的治療用オリゴデオキシヌクレオチドを投与するためのストラテジーは当業者に公知である（例えばＷｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９２，１０：２８１−２８７参照）。場合により、単なる局所投与により送達を実施することができる。アンチセンスＲＮＡの細胞内発現を目的とする他のアプローチもある。このストラテジーでは、ターゲット核酸の１領域に相補的なＲＮＡの合成を誘導する組換え遺伝子で細胞をｅｘ ｖｉｖｏ形質転換する。細胞内で発現されるアンチセンスＲＮＡの治療使用は手法的には遺伝子療法と同様である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として広く知られる２本鎖ＲＮＡの使用により遺伝子の細胞内発現を調節する方法が最近開発されたが、この方法も核酸治療に有効なアプローチであると思われる（Ｈａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１８：２４４−２５１）。

他の好ましい態様では、前記方法は前記対象の中枢神経系、好ましくは脳にドナー細胞を移植する段階を含み、ドナー細胞は移植拒絶反応を最小限にするか又は低減するように処理することが好ましく、前記ドナー細胞は前記１種以上の作用剤をコードする少なくとも１個のトランスジーンの挿入により遺伝子改変されている。前記トランスジーンはウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに担持させる。トランスジーンはトランスジーンをコードするＤＮＡの非ウイルス物理的トランスフェクション、特にマイクロインジェクションによりドナー細胞に挿入することができる。トランスジーンの挿入はエレクトロポレーション、化学的トランスフェクション、特にリン酸カルシウムトランスフェクション又はリポソームトランスフェクションにより実施することができる（Ｍｃ Ｃｅｌｌａｎｄ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，１９９９参照）。

好ましい態様では、神経変性疾患、特にＡＤの前記治療及び予防剤は該当細胞を前記対象に導入する段階を含む方法により前記対象、特にヒトに投与することが可能な治療用蛋白質であり、前記該当細胞は前記治療用蛋白質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにｉｎ ｖｉｔｒｏ処理されており、前記該当細胞は治療有効量の前記治療用蛋白質を前記対象でｉｎ ｖｉｖｏ発現する。前記ＤＮＡセグメントはウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターにより前記細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ挿入することができる。

本発明の治療方法は、胚性幹細胞又は胚性生殖細胞と成人神経幹細胞を従来記載されている細胞及び遺伝子治療法の任意のものと併用する治療クローニング、移植及び幹細胞療法の適用を含む。幹細胞は全能性でも多能性でもよい。更に臓器特異的でもよい。疾患及び／又は損傷脳細胞又は組織の修復ストラテジーは、（ｉ）ドナー細胞を成人組織から採取する段階を含む。遺伝材料を除去した未受精卵にドナー細胞の核を移植する。体細胞核導入後の細胞の胚盤胞期から胚性幹細胞を単離する。次に、分化因子を使用して特定細胞型、好ましくは神経細胞に特異的に幹細胞を発生させる（Ｌａｎｚａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９，９：９７５−９７７）。あるいは、前記ストラテジーは、（ｉｉ）中枢神経系又は骨髄（間葉系幹細胞）から単離した成人幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖とその後のグラフト及び移植のために精製する段階、あるいは、（ｉｉｉ）内在神経幹細胞を機能的ニューロンに増殖、移動及び分化させるように直接誘導する段階を含む（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＤＡ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，２：３４−４２）。成人脳の胚中心はニューロン損傷又は異常を受けないので、損傷又は疾患脳組織の修復には成人神経幹細胞が非常に有望である（Ｃｏｌｍａｎ Ａ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ２００１，７：６６−７１）。

好ましい態様では、本発明の治療又は予防対象はヒト又は非ヒト実験動物（例えばマウス又はラット）、家畜又は非ヒト霊長類とすることができる。実験動物は神経変性障害の動物モデル（例えばＡＤ型神経病理をもつトランスジェニックマウス及び／又はノックアウトマウス）とすることができる。

別の好ましい１態様では、ＫＣＮＮ３サブユニットにより形成されるカリウムチャネルあるいはＫＣＮＮ３及び／又はＫＣＮＮ１及び／又はＫＣＮＮ２及び／又はＫＣＮＮ４サブユニットにより形成されるヘテロメリックカリウムチャネルに及ぼす化合物及び／又は作用剤及び／又はモジュレーターの効果を調査するための方法が提供される。この方法によると、適切な細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＯＳ−７細胞又はＨＥＫ２９３細胞）又は神経細胞株で単独で発現されるあるいはＫＣＮＮ１及び／又はＫＣＮＮ２及び／又はＫＣＮＮ４カリウムチャネルサブユニットと同時発現されるＫＣＮＮ３サブユニットにより媒介されるカリウム電流に及ぼす化合物及び／又は作用剤の電気生理的効果を試験する。前記試験を実施するためには、ヒト遺伝子産物ＫＣＮＮ３をコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングする。ＫＣＮＮ３及び／又はＫＣＮＮ１及び／又はＫＣＮＮ２及び／又はＫＣＮＮ４をコードするｃＤＮＡを別の適切な発現ベクターにクローニングする。好ましくはＤＭＲＩＥ−Ｃ（カチオン脂質１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド−コレステロールのリポソーム製剤）等の試薬を使用して上記のような適切な細胞に前記プラスミドをトランスフェクトする。電圧クランプモードでパッチクランプ実験（Ｈａｍｉｌｌら，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．１９８１，３９１：８５−１００）を実施することができ、全細胞電流を記録し、得られたシグナルを増幅し、ディジタル化し、保存し、適切なソフトウェア、例えばＰｕｌｓｅ／Ｐｕｌｓｅｆｉｔ（ＨＥＫＡ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析する。電流「ランダウン」又は「ランアップ」（Ｖａｒｎｕｍら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３，９０：１１５２８−１１５３２）が化合物及び／又は作用剤効果評価にはまだ強過ぎる場合には、穿孔パッチクランプ法を使用して前記カリウムチャネルの媒介電流の調査を実施し、不特定電流振幅変化を防ぐことができる（Ｄａｒｔら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５，４８３：２９−３９；Ｄｉｎｅｓｈ ＆ Ｈａｂｌｉｔｚ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９０，５３５：３１８−３２２）。単独で発現されるかあるいはＫＣＮＮ１及び／又はＫＣＮＮ２及び／又はＫＣＮＮ４と同時発現されるＫＣＮＮ３に及ぼす試験化合物の効果及び可逆性の調査の刺激プロトコールの１例を以下に記載する。例えば−６０ｍＶの保持電圧で細胞をクランプする。パルスサイクル時間は１５秒間とすることができる。化合物及び／又は作用剤試験では、安定にトランスフェクトした細胞を例えば−５０ｍＶの保持電位から例えば−１０又は−２０ｍＶずつ−１６０ｍＶまで例えば１００ｍ秒間又は２５０ｍ秒間又は５００ｍ秒間過分極した後に、例えば＋９０ｍＶまで１秒間脱分極することができる。＋９０ｍＶまでの試験パルスの終点の電流振幅を分析に使用する。この方法は単独で発現されるあるいはＫＣＮＮ１及び／又はＫＣＮＮ２及び／又はＫＣＮＮ４と同時に発現されるＫＣＮＮ３を開閉、活性化、不活化又はその生物物理学的特性を調節することが可能な化合物及び／又は作用剤を同定及び試験するのにも適している。高スループットスクリーニング技術（Ｎｅｔｚｅｒら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ２００３，４：４６２−４６９）で細胞株を使用することもできる。こうして同定及び試験したカリウムチャネル、特に小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルのモジュレーターは学習及び記憶機能に潜在的に影響を与えるので、例えば神経変性疾患及びアルツハイマー病の治療アプローチに使用することができる。

別の１側面では、本発明は（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体から構成される群から選択される少なくとも１種の物質の活性もしくはレベル又は前記活性及び前記レベルの両者、及び／又は発現の作用剤、選択的アンタゴニストもしくはアゴニスト又はモジュレーターに関し、前記作用剤、選択的アンタゴニストもしくはアゴニスト又はモジュレーターは神経変性疾患、特にＡＤの治療に潜在的活性をもつ。

別の側面では、本発明は神経変性疾患、特にＡＤの治療又は予防用医薬の製造における、（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体から構成される群から選択される少なくとも１種の物質の活性もしくはレベル又は前記活性及び前記レベルの両者、及び／又は発現の作用剤、抗体、選択的アンタゴニストもしくはアゴニスト又はモジュレーターの使用を提供する。前記抗体は特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である免疫原に対して特異的に免疫反応性のものとすることができる。

別の側面では、本発明は前記作用剤、抗体、選択的アンタゴニストもしくはアゴニスト又はモジュレーターと、好ましくは医薬キャリヤーを含有する医薬組成物に関する。前記キャリヤーとはモジュレーターと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを意味する。

１側面では、本発明は治療又は予防有効量の前記医薬組成物を充填した１個以上の容器を含むキットも提供する。

別の１側面では、本発明は天然ＫＣＮＮ３遺伝子転写制御因子以外の転写因子の制御下に特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする非天然遺伝子配列又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体を含む組換え遺伝子改変非ヒト動物に関する。前記組換え非ヒト動物の作製は、（ｉ）前記遺伝子配列と選択マーカー配列を含む遺伝子ターゲティング構築物を提供する段階と、（ｉｉ）前記ターゲティング構築物を非ヒト動物の幹細胞に導入する段階と、（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚に導入する段階と、（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物に移植する段階と、（ｖ）前記胚を満期まで発生させる段階と、（ｖｉ）ゲノムの両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の変異を含む遺伝子改変非ヒト動物を同定する段階と、（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子改変非ヒト動物を育種し、ゲノムに前記遺伝子配列の変異を含む遺伝子改変非ヒト動物を得る段階を含み、前記遺伝子の発現、異所発現、過少発現、非発現又は過剰発現、及び前記遺伝子配列の破壊又は改変の結果として、神経変性疾患、特にＡＤの徴候及び症状を発症する素因を示す前記非ヒト動物が得られる。このような動物を作製及び構築するためのストラテジー及び技術は当業者に公知である（例えばＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４４：１２８８−１２９２及びＨｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ａｂｂｏｔｔ，Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９参照）。

神経変性疾患、特にアルツハイマー病を研究するための動物モデル、試験動物又は対照動物としてこのような遺伝子改変組換え非ヒト動物を利用することが好ましい。このような動物は神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬及び治療薬の開発において化合物、作用剤及びモジュレーターをスクリーニング、試験及び検証するために有用であると思われる。本発明ではスクリーニング法におけるこのような遺伝子改変動物の使用を開示する。

別の１側面では、本発明は神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬及び治療薬の開発において化合物、作用剤及びモジュレーターをスクリーニング、試験及び検証するために、特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子配列又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体を異所発現、過少発現、非発現もしくは過剰発現又は破壊又は別の方法で改変させた細胞を利用する。本発明ではスクリーニング法におけるこのような細胞の使用を開示する。

別の側面では、本発明は神経変性疾患、特にＡＤ、又は関連疾患及び障害の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストに関し、前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストは（ｉ）特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体から構成される群から選択される１種以上の物質の発現及び／又はレベル及び／又は活性を変化させることができる。このスクリーニング方法は、（ａ）細胞を試験化合物と接触させる段階と、（ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種以上の物質の活性及び／又はレベル、又は活性とレベルの両者、及び／又は発現を測定する段階と、（ｃ）前記試験化合物と接触させていない対照細胞における前記物質の活性及び／又はレベル、又は活性とレベルの両者、及び／又は発現を測定する段階と、（ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）の細胞における物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現を比較し、接触させた細胞における前記物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現が変化しているならば、試験化合物は神経変性疾患及び障害の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストであると判定する段階を含む。

別の１側面では、本発明は神経変性疾患、特にＡＤ、又は関連疾患及び障害の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストのスクリーニング方法に関し、前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストは（ｉ）特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体から構成される群から選択される１種以上の物質の発現及び／又はレベル及び／又は活性を変化させることができ、前記方法は、（ａ）神経変性疾患又は関連疾患もしくは障害の徴候及び症状を発症する素因をもつか又は既に発症している非ヒト試験動物（前記動物は本発明に開示するような動物モデルとすることができる）に試験化合物を投与する段階と、（ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する段階と、（ｃ）同様に神経変性疾患又は関連疾患もしくは障害の徴候及び症状を発症する素因をもつか又は既に発症しており、前記試験化合物を投与していない非ヒト対照動物における前記物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する段階と、（ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）の動物における物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現を比較し、非ヒト試験動物における物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現が変化しているならば、試験化合物は神経変性疾患及び障害の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストであると判定する段階を含む。

別の態様では、本発明は（ｉ）上記スクリーニングアッセイの方法により神経変性疾患の作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストを同定する段階と、（ｉｉ）前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストを医薬キャリヤーと混合する段階を含む医薬の製造方法を提供する。但し、前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストは他の型のスクリーニング方法及びアッセイにより同定可能な場合もある。

別の側面では、本発明は、リガンドと特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の結合阻害度又は結合増加度を測定するために及び／又は特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体に対する前記化合物の結合度を測定するために、１種以上の化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物を高スループットフォーマットでスクリーニングするためのアッセイを提供する。リガンドとＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の結合阻害度を測定するために、前記スクリーニングアッセイは、（ｉ）前記ＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の懸濁液を複数の容器に加える段階と、（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングしようとする化合物又は複数の化合物を前記複数の容器に加える段階と、（ｉｉｉ）検出可能なリガンド、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に加える段階と、（ｉｖ）前記ＫＣＮＮ３蛋白質又は前記そのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体と、前記化合物又は複数化合物と、前記検出可能なリガンド、好ましくは蛍光標識リガンドを温置する段階と、（ｖ）前記ＫＣＮＮ３蛋白質又は前記そのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体と結合した好ましくは蛍光の量を測定する段階と、（ｖｉ）前記化合物の１種以上による前記ＫＣＮＮ３蛋白質又は前記そのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体と前記リガンドの結合阻害度を測定する段階を含む。前記ＫＣＮＮ３翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体を人工リポソームに再構成し、対応するプロテオリポソームを作製し、リガンドと前記ＫＣＮＮ３翻訳産物の結合阻害度を測定することが好ましいと思われる。ＫＣＮＮ３翻訳産物を界面活性剤からリポソームに再構成する方法は詳細に記載されている（Ｓｃｈｗａｒｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８：９４５６−９４６４；Ｋｒｉｖｏｓｈｅｅｖ ａｎｄ Ｕｓａｎｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｍｏｓｃｏｗ １９９７，６２：１０６４−１０７３）。蛍光標識リガンドを使用する代わりに、所定側面では当業者に公知の他の任意の検出可能なラベル（例えば放射性ラベル）を使用し、相応に検出すると有利な場合がある。前記方法は新規化合物の同定に有用であることに加え、ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の遺伝子産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体とリガンドの結合を阻害する能力が改善又は他の方法で最適化されている化合物を評価するためにも有用であろう。蛍光結合アッセイの１例として、キャリヤー粒子の使用に基づくアッセイが特許出願ＷＯ００／５２４５１に開示及び記載されている。別の例は特許ＷＯ０２／０１２２６に記載されている競合アッセイ法である。本発明のスクリーニングアッセイに好ましいシグナル検出方法は以下の特許出願：ＷＯ９６／１３７４４、ＷＯ９８／１６８１４、ＷＯ９８／２３９４２、ＷＯ９９／１７０８６、ＷＯ９９／３４１９５、ＷＯ００／６６９８５、ＷＯ０１／５９４３６、ＷＯ０１／５９４１６に記載されている。

別の１態様では、本発明は（ｉ）上記阻害結合アッセイによりリガンドとＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の遺伝子産物の結合の阻害剤として化合物を同定する段階と、（ｉｉ）前記化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む医薬の製造方法を提供する。但し、前記化合物は他の型のスクリーニングアッセイにより同定可能な場合もある。

特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体に対する化合物の結合度を測定するために、１種以上の化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物を高スループットフォーマットでスクリーニングするためのアッセイも提供され、前記スクリーニングアッセイは、（ｉ）前記ＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の懸濁液を複数の容器に加える段階と、（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングしようとする検出可能な化合物、好ましくは蛍光標識化合物又は複数の検出可能な化合物、好ましくは蛍光標識化合物を前記複数の容器に加える段階と、（ｉｉｉ）前記ＫＣＮＮ３蛋白質又は前記そのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体と、前記検出可能な化合物、好ましくは蛍光標識化合物又は複数の検出可能な化合物、好ましくは蛍光標識化合物を温置する段階と、（ｉｖ）前記ＫＣＮＮ３蛋白質又は前記そのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体と結合した好ましくは蛍光の量を測定する段階と、（ｖ）前記ＫＣＮＮ３蛋白質又は前記そのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体に対する前記化合物の１種以上の結合度を測定する段階を含む。この型のアッセイでは、蛍光ラベルを使用することが好ましいと思われる。但し、他の任意の型の検出可能なラベルも使用できる。更にこの型のアッセイでは、ＫＣＮＮ３翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体を本発明に記載するような人工リポソームに再構成することが好ましいと思われる。前記アッセイ方法は新規化合物の同定に有用であることに加え、ＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体との結合能が改善又は他の方法で最適化されている化合物を評価するためにも有用であろう。

別の１態様では、本発明は（ｉ）上記結合アッセイによりＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の遺伝子産物との結合剤としての化合物を同定する段階と、（ｉｉ）前記化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む医薬の製造方法を提供する。但し、前記化合物は他の型のスクリーニングアッセイにより同定可能な場合もある。

別の態様では、本発明は本発明のスクリーニングアッセイの方法のいずれかにより獲得可能な医薬を提供する。別の１態様では、本発明は本発明のスクリーニングアッセイの方法のいずれかにより得られた医薬を提供する。

本発明の別の側面はＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である蛋白分子に関し、および、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の検出用診断ターゲットとしての特に配列番号１をもつ前記蛋白分子の使用に関する。

本発明は更に、ＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である蛋白分子に関し、および、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を予防又は治療又は改善する作用剤、モジュレーター、選択的アンダコニスト、アゴニスト、試薬又は化合物のスクリーニングターゲットとしての特に配列番号１をもつ前記蛋白分子の使用に関する。

本発明は免疫原に対して特異的に免疫反応性の抗体に関し、前記免疫原は特に配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードするＫＣＮＮ３遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である。この免疫原は前記遺伝子の翻訳産物の免疫原性又は抗原性エピトープ又は部分とすることができ、翻訳産物の前記免疫原性又は抗原性部分はポリペプチドであり、前記ポリペプチドは動物に抗体応答を誘発し、前記ポリペプチドは前記抗体と免疫特異的に結合する。抗体作製方法は当分野で周知である（Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８参照）。本発明で使用する「抗体」なる用語は当分野で公知の全形態の抗体を包含し、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体又は１本鎖抗体とそのフラグメントが挙げられる（Ｄｕｂｅｌ ａｎｄ Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９参照）。本発明の抗体は例えば酵素イムノアッセイ（例えば酵素抗体法，ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈降法及び抗体マイクロアレー等の最先端技術（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９及びＥｄｗａｒｄｓ Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９参照）による各種診断及び治療法で有用である。これらの方法はＫＣＮＮ３遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の検出に利用される。

本発明の好ましい１態様では、対象から得られたサンプル中の細胞の病理状態を検出するために前記抗体を使用することができ、前記細胞を前記抗体で免疫細胞化学的に染色し、既知健常状態を示す細胞に比較して前記細胞中の染色度が変化しているか又は染色パターンが変化しているならば、前記細胞は病理状態にあると判定する。病理状態は神経変性疾患、特にＡＤに関連することが好ましい。細胞の免疫細胞化学的染色は当業者に周知の多数の各種実験方法により実施することができる。しかし、自動抗体結合検出法を適用し、ＵＳ６１５０１７３に記載の方法に従って細胞の染色度の測定、又は細胞の細胞染色パターンもしくは亜細胞染色パターンの測定、又は細胞表面上もしくは細胞内のオルガネラ及び他の亜細胞構造間の抗原の位置分布測定を実施することが好ましいと思われる。

本発明の他の特徴及び利点は図面と実施例に関する以下の記載から自明である。これらの図面及び実施例は単なる例示であり、他の開示を限定するものではない。

（図面）
図１はＧｅｎｅＣｈｉｐ分析により測定し比較した各種ブラークステージに対応する個体からのヒト脳組織サンプル中のＫＣＮＮ３遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルの差異の識別を示す。各ｍＲＮＡ種のレベルはＡＤ進行と定量的に相関するので、Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋによる脳組織サンプルの神経病理段階分類（ブラークステージ分類）により測定する場合にＡＤの指標となることが明らかである。ブラークステージ０の５人の異なるドナー（Ｃ０１１，Ｃ０１２，Ｃ０２６，Ｃ０２７及びＣ０３２）、ブラークステージ１の７人の異なるドナー（Ｃ０１４，Ｃ０２８，Ｃ０２９，Ｃ０３０，Ｃ０３６，Ｃ０３８及びＣ０３９）、ブラークステージ２の５人の異なるドナー（Ｃ００８，Ｃ０３１，Ｃ０３３，Ｃ０３４及びＤＥ０３）、ブラークステージ３の４人の異なるドナー（Ｃ０２５，ＤＥ０７，ＤＥ１１及びＣ０５７）及びブラークステージ４の４人の異なるドナー（Ｐ０１２，Ｐ０４６，Ｐ０４７及びＰ０６８）の各々の前頭葉皮質と下側頭葉皮質のｃＲＮＡプローブを夫々Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ １３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙの分析に付した。主に下側頭葉組織でブラークステージと共に漸進的に進行するＫＣＮＮ３遺伝子の発現上昇を反映する明白な差異が認められる。

図２は定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定したＡＤの指標となる各種ブラークステージに対応する個体からのヒト脳組織サンプル中のＫＣＮＮ３遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルの差異を確認するためのデータを示す。ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析で使用したと同一ドナーの前頭葉皮質（Ｆｒｏｎｔａｌ）と下側頭葉皮質（Ｔｅｍｐｏｒａｌ）のｃＤＮＡを利用し、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ高速熱サイクル技術を使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。データはその遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった標準遺伝子であるシクロフィリンＢの値に正規化した。最低レベルのブラークステージ０のサンプルと高レベルブラークステージ４に相当するサンプルを比較すると、ＫＣＮＮ３の遺伝子発現レベルの実質的な差異が明白に認められる。

図３は定量的ＲＴ−ＰＣＲと９８％信頼性レベルの中央値の統計法を使用して測定したＡＤの指標となる各種ブラークステージに対応する個体からのヒト脳組織サンプル中のＫＣＮＮ３遺伝子由来ｍＲＮＡの絶対レベルの分析を示す（Ｓａｃｈｓ Ｌ（１９８８）Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ：Ｐｌａｎｕｎｇ ｕｎｄ Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．６０）。ブラークステージ０〜２の対象を含む対照群を規定することによりデータを計算し、ブラークステージ３〜４を含む進行ＡＤ病理をもつ規定群について計算したデータと比較する。前頭葉皮質と下側頭葉皮質に発現上昇を反映する明白な差異が認められ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析結果が確証される。ブラークステージ０〜２とブラークステージ３〜４の下側頭葉皮質（Ｔ）を比較した場合に最も顕著な差異が明白に認められる。この差異は対照ヒトの下側頭葉皮質及び前頭葉皮質に対する進行ＡＤ病理をもつ個体の下側頭葉皮質及び前頭葉皮質におけるＫＣＮＮ３の発現上昇と、進行ＡＤ病理をもつ個体の前頭葉皮質に対する下側頭葉皮質におけるＫＣＮＮ３の発現上昇を反映している。

図４ＡはヒトＫＣＮＮ３蛋白質（スプライス変異体１，ｓｖ１）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９ＵＧＩ６）のアミノ酸配列である配列番号１を開示する。このＫＣＮＮ３蛋白質は７３６アミノ酸を含む。

図４ＢはヒトＫＣＮＮ３蛋白質（スプライス変異体２，ｓｖ２）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ５ＶＴ７４）のアミノ酸配列である配列番号２を開示する。このＫＣＮＮ３蛋白質は７３１アミノ酸を含む。

図４ＣはヒトＫＣＮＮ３蛋白質（スプライス変異体３，ｓｖ３）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ８ＷＸＧ７）のアミノ酸配列である配列番号３を開示する。このＫＣＮＮ３蛋白質は４２６アミノ酸を含む。

図４ＤはヒトＫＣＮＮ３蛋白質（スプライス変異体４，ｓｖ４）（ＵｎｉＰｒｏｔ ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ８６ＶＦ９）のアミノ酸配列である配列番号４を開示する。このＫＣＮＮ３蛋白質は４１８アミノ酸を含む。

図５ＡはＫＣＮＮ３ ｓｖ１蛋白質をコードする３０９５ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡ（スプライス変異体１，ｓｖ１）（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＪ２５１０１６）のヌクレオチド配列である配列番号５を示す。

図５ＢはＫＣＮＮ３ ｓｖ２蛋白質をコードする２９６２ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡ（スプライス変異体２，ｓｖ２）（Ｅｎｓｅｍｂｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ ｎｕｍｂｅｒ ＥＮＳＴ０００００３６８４６９）のヌクレオチド配列である配列番号６を示す。

図５ＣはＫＣＮＮ３ ｓｖ３蛋白質をコードする１９６６ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡ（スプライス変異体３，ｓｖ３）（Ｅｎｓｅｍｂｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ ｎｕｍｂｅｒ ＥＮＳＴ０００００３６１１４７）のヌクレオチド配列である配列番号７を示す。

図５ＤはＫＣＮＮ３ ｓｖ４蛋白質をコードする１６５８ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡ（スプライス変異体４，ｓｖ４）（Ｅｎｓｅｍｂｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤ ｎｕｍｂｅｒ ＥＮＳＴ０００００３５８５０５）のヌクレオチド配列である配列番号８を示す。

図６Ａは配列番号５のヌクレオチド３３４〜２５４４からなる２２１１ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｓｖ１のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号９を示す。

図６Ｂは配列番号６のヌクレオチド３１７〜２５１２からなる２１９６ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｓｖ２のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号１０を示す。

図６Ｃは配列番号７のヌクレオチド１５１〜１４３１からなる１２８１ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｓｖ３のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号１１を示す。

図６Ｄは配列番号８のヌクレオチド３７８〜１６３４からなる１２５７ヌクレオチドのヒトＫＣＮＮ３ ｓｖ４のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号１２を示す。

図７は定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＫＣＮＮ３転写レベルプロファイリングに使用したプライマー（プライマーＡ，配列番号１３及びプライマーＢ，配列番号１４）と、配列番号５，ＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡの対応するクリッピングの配列アラインメントを示す。

図８はＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡ配列（配列番号５）、コーディング配列（配列番号９）及びＫＣＮＮ３転写レベルプロファイリングに使用した両者のプライマー配列（プライマーＡ，配列番号１３及びプライマーＢ，配列番号１４）のアラインメントを模式的に示す。配列位置を右側に示す。

図９はＡＤ患者（ブラークステージ３から開始）からのヒト脳検体で観察されたＫＣＮＮ３蛋白質と皮質βアミロイド斑の同時沈着を例示する。これに対して、ＡＤ徴候及び症状をもつと診断されず、神経病理学的にブラークステージ０〜２に分類された年齢一致対照からの脳検体にこのようなＫＣＮＮ３蛋白質の沈着は観察されない。この典型例は、ＡＤ患者ではＫＣＮＮ３蛋白質がアミロイド斑と同時沈着する（例えば矢印）が、対照では観察されないという一般知見を実証している。ブラークステージ０〜４のＡＤ患者及び年齢一致対照からの新鮮凍結死後ヒト脳前頭葉（Ｆ，上段）及び下側頭葉（Ｔ，下段）皮質検体のアセトン固定クリオスタット切片の二重免疫蛍光顕微鏡写真（原倍率１０倍）を示す。緑色シグナルはアフィニティー精製ポリクローナルウサギ抗ＫＣＮＮ３抗血清（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）と反応させ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出したＫＣＮＮ３特異的免疫反応性を表す。赤色シグナルはマウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と反応させた後にＣｙ３標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ）で検出したニューロン特異的体細胞マーカー蛋白質ＮｅｕＮを示す。核はＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）により青色染色される。神経網の拡散緑色バックグラウンド染色を示す領域は皮質灰白質に相当し、白質は標識しないので、暗色で出現する。

図１０はＡＤ患者（ブラークステージ４）からのヒト脳検体におけるＫＣＮＮ３蛋白質と皮質βアミロイド斑の同時沈着を拡大図で例示する。これに対して、ＡＤ徴候及び症状をもつと診断されず、神経病理学的にブラークステージ０〜２に分類された年齢一致対照からの脳検体にこのようなＫＣＮＮ３蛋白質の沈着は観察されない。これらの特徴的画像はＫＣＮＮ３蛋白質が患者ではアミロイド斑と同時沈着するが、対照では同時沈着しないことを実証している。夫々ブラークステージ４及び０のＡＤ患者及び年齢一致対照からの新鮮凍結死後ヒト脳前頭葉（Ｆ）及び下側頭葉（Ｔ）皮質検体のアセトン固定クリオスタット切片の二重免疫蛍光顕微鏡写真の高倍率拡大図（原倍率４０倍）を示す。緑色シグナルはアフィニティー精製ポリクローナルウサギ抗ＫＣＮＮ３抗血清（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）と反応させ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出した特異的ＫＣＮＮ３免疫反応性を表す。赤色シグナルはマウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と反応させた後にＣｙ３標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ）で検出したニューロン特異的体細胞マーカー蛋白質ＮｅｕＮを示す。核はＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）により青色染色される。

図１１はＡＤ患者（ブラークステージ４）の皮質の反応性星状細胞が高レベルのＫＣＮＮ３蛋白質を含有することを例示する。これに対して、ＡＤ徴候及び症状をもつと診断されず、神経病理学的にブラークステージ０に分類された年齢一致対照の皮質の星状細胞ではＰＲＫＸ蛋白質を検出することができない。更に、この図もＫＣＮＮ３蛋白質含有斑沈着がＡＤ患者サンプルのみに存在し、対照には存在しないことを実証している。夫々ブラークステージ４及び０のＡＤ患者及び年齢一致対照からの新鮮凍結死後ヒト脳前頭葉皮質検体のアセトン固定クリオスタット切片の二重免疫蛍光顕微鏡写真の高倍率拡大図（原倍率４０倍）を示す。特異的ＫＣＮＮ３免疫反応性はアフィニティー精製ポリクローナルウサギ抗ＫＣＮＮ３抗血清（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）と反応させた後にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出し、グレースケール画像（各パネルの右上図）又は合併画像の緑色シグナル（各パネルの左下図）として可視化した。星状細胞特異的マーカー蛋白質ＧＦＡＰはマウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ抗体（Ａｂｅａｍ）と反応させた後にＣｙ３標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ）で検出し、グレースケール画像（各パネルの左上図）又は合併画像の赤色シグナル（各パネルの左下図）として可視化した。核はＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）により青色染色される。右下図は対応する相コントラスト画像を示す。

図１２はＣＨＯ細胞におけるＫＣＮＮ３蛋白質産生のウェスタンブロット分析を示す。ＫＣＮＮ３のＣ末端にｍｙｃタグを付けて組織培養細胞に導入した。ＣＭＶプロモーターによりＫＣＮＮ３の発現を誘導した。細胞を回収し、溶解させ、ｍｙｃエピトープに対する抗体を３０００倍の希釈倍率で使用してウェスタンブロット分析した。レーンＡには約８０ｋＤａで泳動する強いバンドが出現する。対照ＣＨＯ野生型細胞株では、同一分子量で泳動する対応するバンドは認められない（レーンＢ）。

図１３はＣＨＯ細胞におけるＫＣＮＮ３発現の免疫蛍光分析を示す。ＫＣＮＮ３のＣ末端にｍｙｃタグを付けて組織培養細胞に導入した。ＣＭＶプロモーターの制御下でＫＣＮＮ３を発現させた。ＫＣＮＮ３発現細胞をガラスカバーストリップに播種し、２４時間温置後に細胞を免疫蛍光分析用にメタノールで固定した。ｍｙｃエピトープに対する抗体を３０００倍の希釈倍率で加えた後に抗ｍｙｃ抗体に対する蛍光標識抗体（１０００倍）を加えて温置することによりＫＣＮＮ３の発現を検出した。次に、細胞を顕微鏡スライドに載せ、蛍光顕微鏡で分析した。左図と中央図では細胞の細胞質と原形質膜にＫＣＮＮ３の発現が認められる（膜局在を示す細胞の境界における発現を指す矢頭参照）。比較のために、蛍光を検出できないか又は有意低レベルでしか検出できず、従ってＫＣＮＮ３が全く又は非常に低レベルでしか発現されない領域である細胞の核も矢印で示す（左右図）。左右図の青色はＤＡＰＩ（１０００倍）により染色された細胞の核を示す。

図１４は細胞系におけるＫＣＮＮ３イオンチャネル調節化合物のスクリーニングのためのアッセイ開発を要約する。ＣＭＶプロモーター下にＫＣＮＮ３（ＣＨＯ／ＫＣＮＮ３）を安定的に発現するＣＨＯ細胞をアパミン及びトリフルオロペラチンと共に３０分間温置した後、イオンチャネルを活性化するイオノマイシン（１μＭ終濃度）を加えた。カルシウムが細胞に侵入すると、カリウムチャネルが活性化されるので、細胞の静止膜電位に作用し、蛍光色素により検出される。その後５分間に測定された最小蛍光値を実験開始時に記録された最大シグナルから差し引き、細胞と共に温置した基質の濃度に対してプロットした。基質の不在下及び最低濃度で得られた値は膜電位過分極を生じる完全活性カリウムチャネルを表す。同図はイオノマイシンの添加（赤矢印）後に蛍光が低下し、ＫＣＮＮ３が開いたことも示している。

図１５はＫＣＮＮ３アンタゴニストであるアパミン及びトリフルオロペラチンのＩＣ５０の決定を示す。アパミン及びトリフルオロペラチンを細胞と共に３０分間温置した後、イオノマイシン（１μＭ終濃度）を加えた。その後の５分間の測定時間中の最小蛍光値を実験開始時に記録された最大シグナルから差し引き、基質の濃度に対してプロットした。ＩＣ５０計算値はアパミン１６ｎＭ、トリフルオロペラチン１８μＭであり、Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎら（Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０，２００１：７７２−７８３）で報告されているＩＣ_５０値に合致する。ＣＨＯ野生型細胞（ＣＨＯ／−）の場合には、夫々イオノマイシンとアパミンを添加しても効果を認めることができなかった。

図１６は細胞ＫＣＮＮ３スクリーニングアッセイのＺ’値評価を示す。イオノマイシン添加前と細胞をフルオキセチンと共に１２０秒間温置した後の蛍光強度の差を測定した。イオノマイシンによるカルシウム流入によりチャネルが開いた後、細胞の静止膜電位の過分極が生じる。他方、フルオキセチンの存在下では、イオンチャネルは遮断され、細胞へのカルシウム流入は蛍光強度の比較的小さい変化しか生じず、従って、静止膜電位の変化も小さい。上記実験でイオノマイシンとフルオキセチンの共存下における蛍光差の平均値は１５９１２ｒｆｕ（標準偏差３６３６ｒｆｕ）であり、イオノマイシン単独の存在下における細胞蛍光の平均値は１２４０８６ｒｆｕ（標準偏差１２６１５ｒｆｕ）である。Ｚ’値を計算すると、０．５５である。２回目の実験のＺ’値は０．５９であった。

ヒト脳組織サンプルにおける差異的に発現されるアルツハイマー病関連遺伝子の同定及び確認
ＡＤに関連する遺伝子の発現における特異的差異を識別するために、臨床的及び神経病理学的に十分に特性決定された個体からのヒト脳組織検体に由来する各種ｃＲＮＡプローブを使用してＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）分析を実施した。この技術は複数遺伝子の発現プロファイルを作成し、異なる組織サンプルに存在するｍＲＮＡ集団を比較するために広く使用されている。本発明では、選択された死後脳組織検体（前頭葉及び下側頭葉皮質）に存在するｍＲＮＡ集団を分析した。組織サンプルは健常対照個体（ブラーク０）からＡＤ徴候及び症状をもつ個体（ブラーク４）までの全範囲を反映する各種ブラークステージに分類することができる個体に由来するものとした。遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用するリアルタイム定量的ＰＣＲを利用して各遺伝子の差異的発現の確認を実施した。更に、免疫組織化学分析のために遺伝子産物特異的抗体を使用して蛋白質レベルで健常ステージと疾患ステージの特異的差異を分析した。これらの方法は疾患過程の初期に生じる病理イベントの指標である初期ブラークステージの発現レベルの差異を特異的に検出するように設計した。従って、差異的であると識別される前記遺伝子は事実上ＡＤの発症に関与している。

（ｉ）ＡＤ患者からの脳組織切除：
ＡＤ患者と年齢一致対照対象からの脳組織サンプルを採取した。死後６時間以内にサンプルをドライアイスで迅速に凍結させた。各組織からのサンプル切片をパラホルムアルデヒドで固定し、Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋによる神経原線維病理の各種段階でブラークステージ（０〜４）に神経病理学的に分類した。差異的発現分析用脳領域を同定し、ＲＮＡ抽出を実施するまで−８０℃で保存した。

（ｉｉ）全ｍＲＮＡの単離：
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用することにより全ＲＮＡを凍結死後脳組織から抽出した。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することによりＥｕｋａｒｙｏｔｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐシステムを利用して正確なＲＮＡ濃度とＲＮＡ品質を測定した。調製したＲＮＡを更に品質試験するため、即ち部分分解の排除とＤＮＡ汚染を試験するために、特別に設計したイントロンＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドと参照対照としてのゲノムＤＮＡを使用し、製造業者により添付プロトコールに記載されているようにＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術（Ｒｏｃｈｅ）で融解曲線を作成した。

（ｉｉｉ）プローブ合成：
ここでは、上記（ｉｉ）に記載したように抽出しておいた全ＲＮＡを出発材料として使用した。ｃＤＮＡを作製するために、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者のプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）に従って実施した。インビトロ転写Ｔ７−Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ−Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者のプロトコールに従って利用してｃＤＮＡサンプルをｃＲＮＡに転写させ、ビオチン標識した。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するｍＲＮＡ Ｓｍｅａｒ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐシステムを利用してｃＲＮＡ品質を測定した。光度分析（ＯＤ_{２６０／２８０ｎｍ}）により正確なｃＲＮＡ濃度を測定した。

（ｉｖ）ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーション：
精製断片化ビオチン標識ｃＲＮＡを市販スパイク対照（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ｂｉｏＢ（１．５ｐＭ）、ｂｉｏＣ（５ｐＭ）、ｂｉｏＤ（２５ｐＭ）及びｃｒｅ（１００ｐＭ）と共に各々６０ｎｇ／μｌの濃度でハイブリダイゼーションバッファー（０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ，０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ，１×ＭＥＳ）に再懸濁した後、５分間９９℃で変性させた。次に、事前にハイブリド形成させておいた（１×ＭＥＳ）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にプローブを１個ずつ適用した。４５℃で６０ｒｐｍ下に一晩アレーハイブリダイゼーションを実施した。次に、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＣＯＳ）１．２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）による制御下に命令ＥｕｋＧｅ＿ＷＳ２ｖ４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従ってマイクロアレーの洗浄と染色を実施した。

（ｖ）ＧｅｎｅＣｈｉｐデータ分析：
ＧＣＯＳ １．２ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）による制御下にＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して蛍光生データを取得した。ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ ８．０ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を使用して以下のようにデータ分析を実施した。即ちＧＣＯＳ １．２ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）により「ｐｒｅｓｅｎｔ」のフラグを付けられたデータに生データを限定し；百分率値により生データの正規化を行い；Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアのプロファイル検索ツールを使用して差異的ｍＲＮＡ発現プロファイルの検出を実施した。ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子のこのようなＧｅｎｅＣｈｉｐデータ分析の結果を図１に示す。

（ｖｉ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術（Ｒｏｃｈｅ）を使用して差異的ＫＣＮＮ３遺伝子発現の積極的な確証を実施した。この技術はポリメラーゼ連鎖反応の高速熱サイクルと増幅中の蛍光シグナルのリアルタイム測定を特徴とするため、終点ではなく、動的な読取りを使用することによりＲＴ−ＰＣＲ産物の非常に正確な定量が可能になる。夫々ＡＤ患者及び年齢一致対照個体の前頭葉及び下側頭葉皮質に由来するＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡの相対量をブラークステージ毎に４〜９種の多数の組織で測定した。

まず、標準曲線を作成し、ＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の特異的プライマーであるプライマーＡ，配列番号１３，５’−ＧＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号２のヌクレオチド２８１３−２８３３）及びプライマーＢ，配列番号１４，３’−ＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＧＴＣ−５’（配列番号５の２８９５−２９１５）によるＰＣＲの効率を測定した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｍｉｘ（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むｄＮＴＰミックス、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素、及び１ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有；Ｒｏｃｈｅ）、０．５μＭプライマー、ｃＤＮＡ希釈系列（終濃度４０、２０、１０、５、１及び０．５ｎｇヒト脳全ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）２μｌに更に３ｍＭ ＭｇＣｌ_２を加えて容量２０μｌとし、ＰＣＲ増幅（９５℃で１秒，５６℃で５秒，及び７２℃で５秒）を実施した。融解曲線分析の結果、約８６℃に単一ピークが検出され、プライマーダイマーは認められなかった。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮＡ ５００ ＬａｂＣｈｉｐシステムによりｑＰＣＲ産物の品質とサイズを測定した。サンプルの電気泳動図にはＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の予想寸法１０３ｂｐの単一ピークが観測された。

ＭｇＣｌ_２（３ｍＭでなく１ｍＭ追加）以外は同様にｑＰＣＲプロトコールを適用し、特異的プライマー：配列番号１５，５’−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３’及び配列番号１６，５’−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３’を使用してシクロフィリンＢのＰＣＲ効率を測定した。融解曲線分析の結果、約８７℃に単一ピークが検出され、プライマーダイマーは認められなかった。ＰＣＲ産物のバイオアナライザー分析によると、予想寸法（６２ｂｐ）の単一ピークが判明した。

標準値を計算するために、まず使用したｃＤＮＡ濃度の対数を夫々ＫＣＮＮ３とシクロフィリンＢの閾値サイクル値Ｃ_ｔに対してプロットした。標準曲線（即ち線形回帰）の傾きと切片を計算した。第２段階では、対照とＡＤ患者の前頭葉及び下側頭葉皮質からのｍＲＮＡ発現を平行分析した。Ｃ_ｔ値を測定し、対応する標準曲線：
１０^∧（Ｃ_ｔ値−切片）／傾き［ｎｇ脳全ｃＤＮＡ］
を使用してｎｇ脳全ｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ濃度計算値を各試験組織プローブについて平行分析したシクロフィリンＢに正規化し、こうして得られた値を任意相対発現レベルとして定義する。ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子のこのような定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図２に示す。

（ｖｉｉ）各種ブラークステージのドナーグループを比較するｍＲＮＡ発現の統計分析
この分析のために、異なる時点における異なる実験間のリアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ法）の絶対値はキャリブレーターを使用せずに定量的比較に使用するために十分に一貫していることを証明した。１００個を上回る組織のｑＰＣＲ実験で正規化標準としてシクロフィリンを使用した。特に、シクロフィリンは正規化実験で最も一貫して発現されるハウスキーピング遺伝子であることが分かった。従って、シクロフィリンについて計算した値を使用することにより概念実証を実施した。

第１の分析は３人の異なるドナーに由来する前頭葉皮質及び下側頭葉皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を使用した。全分析実験で各組織からの同一ｃＤＮＡ調製物を実施した。データ数が少ないため、この分析内では値の正規分布は得られなかった。従って、中央値とその９８％信頼性レベルの方法を適用した。この分析の結果、絶対値の比較で中央値から８．７％の中央偏差と、相対比較で中央値から６．６％の中央偏差が判明した。

第２の分析は２人の異なるドナーに各々由来する前頭葉皮質及び下側頭葉皮質組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を使用したが、この場合には異なる時点からの異なるｃＤＮＡ調製物を使用した。この分析の結果、絶対値の比較で中央値から２９．２％の中央偏差と、相対比較で中央値から１７．６％の中央偏差が判明した。この分析から、ｑＰＣＲ実験からの絶対値を使用できるが、中央値からの中央偏差を更に考慮すべきであるという結論に至った。

ＫＣＮＮ３の絶対値の詳細な分析を実施した。従って、シクロフィリンによる相対正規化後にＫＣＮＮ３の絶対値を使用した。低レベルブラークステージ（ブラーク０〜ブラーク２）から構成されるグループと、高レベルブラークステージ（ブラーク３〜ブラーク４）から構成される別のグループについて中央値と９８％信頼性レベルを計算した。この分析の目的はＡＤ病の過程内でｍＲＮＡ発現差の初期兆候を識別することであった。上記分析を図３に示す。

（ｖｉｉｉ）免疫組織化学分析による蛋白質レベルでのＫＣＮＮ３遺伝子の差異的発現及びＡＤとの関連の確認
ヒト脳におけるＫＣＮＮ３を免疫蛍光染色し、ＡＤ組織を対照組織と比較するために、臨床的に診断され、Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋによる神経原線維病理の各種ステージ（本明細書では上記及び下記において簡単に「ブラークステージ」と言う）でＡＤであると神経病理学的に確認された患者と、臨床的にも神経病理学的にもＡＤの徴候を示さない年齢一致対照を含むドナーに由来する死後新鮮凍結前頭葉及び下側頭葉前脳検体をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓ）で１４μｍ厚に切断した。組織切片を室温で風乾し、１０分間アセトンで固定し、再び風乾した。ＰＢＳで洗浄後、切片をブロッキングバッファー（ＰＢＳ中１０％正常ウマ血清，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）と共に３０分間プレインキュベートした後、ブロッキングバッファーの２０倍希釈液中でアフィニティー精製抗ＫＣＮＮ３ウサギポリクローナル抗体（ＡＰＣ−０２５，Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）と共に４℃で一晩温置した。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳで３回リンスした後、切片を１％ ＢＳＡ／ＰＢＳの１５００倍希釈液中でＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に室温で２時間温置した後、再びＰＢＳで洗浄した。夫々（ｉ）ニューロン特異的体細胞マーカー蛋白質ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ；３５０倍希釈液）又は（ｉｉ）星状細胞特異的マーカー蛋白質グリア繊維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ，Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；２５０倍希釈液）に対する別のマウスモノクローナル抗体と反応させた後にどちらの場合も二次Ｃｙ３標識ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ；８００倍希釈液）を使用して上記のように（ｉ）ニューロン細胞体又は（ｉｉ）星状細胞の同時染色を実施した。切片をＰＢＳ中５μＭ ＤＡＰＩと共に３分間温置することにより核の染色を実施した。リポフスチン自家蛍光を阻止するために、切片を７０％エタノール中、親油性黒色色素Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ Ｂ（１％ｗ／ｖ）で５分間室温にて処理した後、７０％エタノール、蒸留水及びＰＢＳに順次浸した。ＰｒｏＬｏｎｇ−Ｇｏｌｄ退色防止マウント剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して切片をカバースリップで覆った。水銀アークランプ付き正立顕微鏡（ＢＸ５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してエピ蛍光又は位相差照明条件下で顕微鏡画像を得た。適切なダイクロイックフィルター／ミラーセット（以下、「チャネル」と言う）を使用していずれかの蛍光色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８，Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）の特異的励起と前記抗体又は核ＤＡＰＩ染色による特異的標識に起因する発光蛍光の読取りを実施した。電荷結合ディスプレイカメラと適切な画像獲得及び処理ソフトウェア（ＣｏｌｏｒＶｉｅｗ−ＩＩ ａｎｄ ＡｎａｌｙＳＩＳ，Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して顕微鏡画像をディジタルキャプチャーした。例えば３個までの異なるチャネルからのシグナルの同時局在を分析するために、異なるチャネルから得られた蛍光顕微鏡写真をオーバーレイし、ＲＧＢモードで上記免疫標識及び核（ＤＡＰＩ）の同時画像を作成した。

培養系を使用したＡＤにおけるＫＣＮＮ３機能の分析
（ｉ）ＫＣＮＮ３を安定に産生する細胞株の作製：
標準発現プラスミドを使用してＣＭＶプロモーターの制御下のＫＣＮＮ３遺伝子をクローニングし、ＣＨＯ細胞に導入し、原則的に製造業者のプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１７５６１）に従って抗生物質Ｇ４１８を添加後にクローン細胞株を単離した。間接免疫蛍光顕微鏡測定（図１３）により各種細胞株におけるＫＣＮＮ３蛋白質の産生とその局在を分析し、安定な産生を示す細胞株を選択した。次にこのＣＨＯ細胞株を使用し、天然細胞環境でイオンチャネルの活性を調査するためのアッセイを確立した。

（ｉｉ）ＫＣＮＮ３モジュレーターの同定用細胞アッセイの開発：
基本的に、アッセイプロトコールはＴｅｒｓｔａｐｐｅｎら（Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：７７２−７８３，２００１）により文献に要約されているように開発されている。このアッセイは膜電位感受性蛍光色素と、イオノマイシンの添加によるカルシウム感受性ＫＣＮＮ３−カリウムチャネルの活性化を利用する。カルシウムが細胞に侵入すると、ＫＣＮＮ３が活性化されるので、細胞の静止膜電位に作用し、蛍光色素により検出される。更に詳細に説明すると、ＫＣＮＮ３を発現するＣＨＯ細胞を透明底黒色３８４ウェルプレートに１．５×１０^４の密度で播種し、３７℃の加湿インキュベーターで２４時間培養する。５μＭ ＤｉＢＡＣ４（３）を加えたアッセイバッファー（１ｍＭ ＫＣｌ，２．３ｍＭ ＣａＣｌ２，５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，１５４ｍＭ ＮａＣｌ，５．５ｍＭ ｄ（＋）−グルコース，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）に細胞培養培地を交換する。３０分間３７℃で色素を細胞に負荷した後に、蛍光プレートリーダー（Ｆｌｅｘ−ｓｔａｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して蛍光（励起４８８ｎｍ，発光５３８ｎｍ）を読取る。終濃度１μＭのイオノマイシンの添加によりＫＣＮＮ３の活性化を行う（図１４及び１５）。イオノマイシン添加の３０分前に、標準遮断薬としてハチ毒アパミンとトリフルオロペラチンを細胞に添加しておく。５分間蛍光をモニターする。

（ｉｉｉ）細胞ＫＣＮＮ３スクリーニングアッセイの最適化
スクリーニング目的でＫＣＮＮ３アッセイを最適化するために、Ｚ’値を評価した（図１６）。２４時間温置後に、ＣＨＯ−ＫＣＮＮ３細胞を増殖させた３８４ウェルプレートから培地を除去した。アッセイバッファー中の色素溶液２０μｌを細胞にピペッティングした後、更にアッセイバッファー２０μｌ単独又はアッセイバッファー２０μｌ＋フルオロキセチン１００μＭを加えた。３７℃で３０分間温置後にプレートを自動ピペッティング装置／蛍光リーダー（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に移し、イオノマイシン１０μｌを終濃度５００ｎＭで加えた。次に蛍光を１０秒おきに１２０秒間測定した。励起波長は４８５ｎｍとし、発光波長は５３８ｎｍとした（５３０ｎｍカットオフフィルター）。

ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析により測定比較した各種ブラークステージに対応する個体からのヒト脳組織サンプル中のＫＣＮＮ３遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルの差異の識別を開示する。各ｍＲＮＡ種のレベルはＡＤ進行と定量的に相関するので、Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋによる脳組織サンプルの神経病理段階分類（ブラークステージ分類）により測定する場合にＡＤの指標となることが明らかである。 定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定したＡＤの指標となる各種ブラークステージに対応する個体からのヒト脳組織サンプル中のＫＣＮＮ３遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルの差異を確認するためのデータを示す。 定量的ＲＴ−ＰＣＲと９８％信頼性レベルの中央値の統計法を使用して測定したＡＤの指標となる各種ブラークステージに対応する個体からのヒト脳組織サンプル中のＫＣＮＮ３遺伝子由来ｍＲＮＡの絶対レベルの分析を示す。 図４ＡはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体１蛋白質のアミノ酸配列である配列番号１を開示する。 図４ＢはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体２蛋白質のアミノ酸配列である配列番号２を開示する。 図４ＣはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体３蛋白質のアミノ酸配列である配列番号３を開示する。 図４ＤはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体４蛋白質のアミノ酸配列である配列番号４を開示する。 図５ＡはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号５を示す。 図５ＡはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号５を示す。 図５ＢはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号６を示す。 図５ＢはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号６を示す。 図５ＣはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号７を示す。 図５ＤはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号８を示す。 図６ＡはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体１のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号９を示す。 図６ＡはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体１のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号９を示す。 図６ＢはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体２のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号１０を示す。 図６ＣはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体３のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号１１を示す。 図６ＤはヒトＫＣＮＮ３スプライス変異体４のコーディング配列（ｃｄｓ）である配列番号１２を示す。 定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＫＣＮＮ３遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルを測定するために使用したプライマーと、ＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡの対応するクリッピングの配列アラインメントを示す。 ＫＣＮＮ３ ｃＤＮＡ配列、コーディング配列及びＫＣＮＮ３転写レベルプロファイリングに使用した両者プライマー配列のアラインメントを模式的に示す。 ＡＤ患者からのヒト脳検体におけるＫＣＮＮ３蛋白質と皮質βアミロイド斑の同時沈着を例示する。これに対して、ＡＤ徴候及び症状をもつと診断されなかった年齢一致対照からの脳検体にこのようなＫＣＮＮ３蛋白質の沈着は観察されない。 ＡＤ患者からのヒト脳検体で観察されたＫＣＮＮ３蛋白質と皮質βアミロイド斑の同時沈着を拡大図で例示する。 ＡＤ患者の皮質の反応性星状細胞が高レベルのＫＣＮＮ３蛋白質を含有することを例示する。これに対して、ＡＤ徴候及び症状をもつと診断されなかった年齢一致対照の皮質の星状細胞ではＫＣＮＮ３蛋白質を検出することができない。 ＫＮＮ３発現プラスミドを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株におけるＫＣＮＮ３蛋白質産生のウェスタンブロット分析を示す。 アッセイ開発と化合物スクリーニングに使用した安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株におけるＫＣＮＮ３過剰産生と細胞内局在の免疫蛍光分析を示す。 ＫＣＮＮ３イオンチャネル調節化合物の同定用細胞スクリーニングアッセイの開発を示す。 ＫＣＮＮ３アンタゴニストであるアパミン及びトリフルオロペラチンのＩＣ５０決定による細胞ＫＣＮＮ３スクリーニングアッセイの検証を示す。 ＡＤ用イオンチャネルモジュレーターの同定用細胞システムの使用を実証する細胞ＫＣＮＮ３スクリーニングアッセイのＺ’値評価を示す。

Claims (24)

1. 対象におけるアルツハイマー病を診断もしくは予後診断する、対象がアルツハイマー病を発症する素因をもつか否かを判定する又はアルツハイマー病をもつ対象に投与した治療薬の効果をモニターする方法であって、
   （ａ）前記対象から得られたサンプル中の（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物の及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物の及び／又は（ｉｉｉ）前記転写産物もしくは翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体のレベル及び／又は活性を測定する段階と、
   （ｂ）既知疾患状態を表す参照値及び／又は既知健常状態を表す参照値及び／又は既知ブラークステージを表す参照値と前記転写産物及び／又は前記翻訳産物の前記レベル及び／又は前記活性とを比較する段階と、
   （ｃ）前記レベル及び／又は前記活性が既知健常状態を表す参照値に比較して変化しているか否か、及び／又は既知疾患状態を表す参照値と同様もしくは同一であるか否か、あるいは前記対象がアルツハイマー病をもつこともしくは前記対象がアルツハイマー病を発症する危険が増加していることの指標である既知ブラークステージを表す参照値と同様もしくは同一であるか否かを分析する段階と
   を含む前記方法。
2. ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする前記遺伝子が配列番号１をもつＫＣＮＮ３をコードする遺伝子であり、ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の前記翻訳産物が配列番号１をもつＫＣＮＮ３蛋白質である請求項１に記載の方法。
3. 請求項１に記載の方法により対象におけるアルツハイマー病を診断もしくは予後診断する、対象がアルツハイマー病を発症する素因をもつか否かを判定する又はアルツハイマー病をもつ対象に投与した治療薬の効果をモニターするためのキットの使用であって、
   前記キットは（ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物及び／又は（ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物及び／又は（ｉｉｉ）前記転写産物もしくは翻訳産物のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体から構成される群から選択される少なくとも１種の試薬を含む
   前記使用。
4. ＫＣＮＮ３蛋白質が配列番号１をもつ請求項３に記載の使用。
5. 天然ＫＣＮＮ３遺伝子転写制御因子以外の転写因子の制御下に配列番号１のアミノ酸配列をもつＫＣＮＮ３蛋白質をコードする非天然遺伝子配列又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、
   前記遺伝子配列の発現、破壊又は改変は、アルツハイマー病に関連する神経変性疾患の徴候を発症する素因を示す前記非ヒト動物をもたらす
   前記遺伝子改変非ヒト動物。
6. アルツハイマー病の治療に有用な診断薬及び治療薬の開発において化合物、作用剤及びモジュレーターをスクリーニング、試験及び検証するための非ヒト試験動物及び／又は対照動物としての請求項５に記載の遺伝子改変非ヒト動物の使用。
7. ＫＣＮＮ３蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項５又は６に記載の使用。
8. アルツハイマー病の治療に有用な診断薬及び治療薬の開発において化合物、作用剤及びモジュレーターをスクリーニング、試験及び検証するための、ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子配列又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体が発現されている又は破壊されている細胞の使用。
9. ＫＣＮＮ３蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項８に記載の使用。
10. アルツハイマー病又は関連疾患の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、
    前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストは、
    （ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は
    （ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
    （ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体
    から構成される群から選択される１種以上の物質の発現又はレベル又は活性を変化させることができ、
    前記方法は、
    （ａ）細胞を試験化合物と接触させる段階と；
    （ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する段階と；
    （ｃ）前記試験化合物と接触させていない対照細胞における（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する段階と；
    （ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）の細胞における物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現を比較し、接触させた細胞における物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現が変化しているならば、試験化合物はアルツハイマー病又は関連疾患の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストであると判定する段階と
    を含む前記方法。
11. ＫＣＮＮ３蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項１０に記載の方法。
12. アルツハイマー病又は関連疾患の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、
    前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストは、
    （ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は
    （ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
    （ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体
    から構成される群から選択される１種以上の物質の発現又はレベル又は活性を変化させることができ、
    前記方法は、
    （ａ）神経変性疾患又は関連疾患もしくは障害の徴候及び症状を発症する素因をもつ又は既に発症している非ヒト試験動物に試験化合物を投与する段階と；
    （ｂ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する段階と；
    （ｃ）神経変性疾患又は関連疾患もしくは障害の徴候及び症状を発症する素因をもつ又は既に発症している、前記試験化合物を投与していない非ヒト対照動物における（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の１種以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する段階と；
    （ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）の動物における物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現を比較し、非ヒト試験動物における物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現が変化しているならば、試験化合物はアルツハイマー病又は関連疾患の治療用作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストであると判定する段階と
    を含む前記方法。
13. ＫＣＮＮ３蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項１２に記載の方法。
14. リガンドとＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体の結合阻害度又は結合増加度を測定し及び／又はＫＣＮＮ３蛋白質又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体に対する前記化合物の結合度を測定するために、１つ又は複数の化合物を試験するための又は複数の化合物を高スループットフォーマットでスクリーニングするためのアッセイ。
15. ＫＣＮＮ３蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項１４に記載の方法。
16. （ｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子、及び／又は
    （ｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＮ３蛋白質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
    （ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体
    から構成される群から選択される１種以上の物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現の作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストであり、
    前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストはアルツハイマー病の治療の潜在活性を有する
    前記作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニスト。
17. ＫＣＮＮ３蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項１６に記載の作用剤。
18. アルツハイマー病の治療用医薬の製造における、請求項１６又は１７に記載の作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニストの使用、及び／又はＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である免疫原に対して特異的に免疫反応性の抗体の使用。
19. 治療を必要とする対象に、請求項１６又は１７に記載の作用剤、モジュレーター又は選択的アンタゴニストもしくはアゴニスト又は抗体を、治療又は予防のために有効な量及び処方で投与する段階を含むアルツハイマー病の治療又は予防方法。
20. アルツハイマー病の検出用診断ターゲットとしての、ＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である蛋白分子。
21. アルツハイマー病を予防又は治療又は改善するモジュレーター、作用剤又は化合物のスクリーニングターゲットとしての、ＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である蛋白分子。
22. 配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項２０又は２１に記載の蛋白分子。
23. 対象から得られたサンプル中の細胞の病理状態を検出するための、ＫＣＮＮ３をコードする遺伝子の翻訳産物又はそのフラグメントもしくは誘導体もしくは変異体である免疫原に対して特異的に免疫反応性の抗体の使用であって、
    前記細胞を前記抗体で免疫細胞化学的に染色し、既知健常状態を示す細胞に比較して前記細胞中の染色度が変化又は染色パターンが変化した場合には、前記細胞はアルツハイマー病に関連する病理状態であると判定する
    前記使用。
24. ＫＣＮＮ３が配列番号１のアミノ酸配列をもつ請求項２３に記載の使用。

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