JP2008538280A

JP2008538280A - 脂質二分子膜の製造方法

Info

Publication number: JP2008538280A
Application number: JP2008504448A
Authority: JP
Inventors: チョー、ナムジュン; カーチス、フランク・ダブリュー
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2006-03-29
Publication date: 2008-10-23
Also published as: US20090263670A1; US8211712B2; WO2006110350A2; WO2006110350A3

Abstract

【課題】基板上に支持ニ分子膜を形成するための方法を提供する。
【解決手段】本発明は、固体担体上に平面状脂質ニ分子膜を製造する方法である。最初に脂質小胞溶液が固体担体上に堆積させ、次に両親媒性ペプチド溶液を脂質小胞溶液に加えることによって、脂質小胞を不安定化させ、固体担体上に平面状脂質ニ分子膜を製造する。また、本発明は、平面状脂質ニ分子膜が天然脂質により形成され、固体担体が未修飾金または酸化チタンにより作成された平面状支持脂質二分子膜を提供する。好ましくは、平面状支持二分子膜は連続している。平面状脂質二分子膜は、天然脂質、または限定するわけではないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、およびスフィンゴミエリンのような脂質の混合物であってもよい。
【選択図】図１

Description

本発明は、脂質膜に関し、より詳細には、固体担体上に脂質ニ分子膜を製造する方法に関する。

シリコン酸化物または有機物層が修飾された表面上で、微小な単一層の小胞を融合させることによって形成された支持脂質二分子膜は、半導体、金被膜表面、光電子装置およびラボオンチップ（lab-on-a-chip）装置のような無機固体を生体機能化することができる。これらの脂質二分子膜は、タンパク質が結合された膜や、細胞過程、タンパク質−脂質相互作用、および生体情報の伝達を媒介する膜の特性や挙動に対する研究から、高い価値を有することが証明されている。生体膜は複雑であるため、研究対象となる１または数個の膜要素を分離したモデル膜システムを作り上げることが必要である。また、固体表面上にモデル膜を支持することによって、自然な状態の生体システムを効果的に研究するために、様々な表面分析技術を使用することができる。固体表面上に支持された膜は、生体センサ、プログラムドラッグデリバリ（programmed drug delivery）、医療用インプラントの適合性の促進や改善、および界面触媒の製造を含む応用を潜在的に有している。

天然の生体システムを擬似するために、研究者は、ガラス、マイカ、自己集積化単分子膜、および石英のような基板に支持ニ分子膜を形成する小胞融合法を用いてきた。しかし、この方法は、金やＴｉＯ_２のような好ましい固体に平面状の脂質二分子膜を形成する場合に、問題があることがわかっている。例えば、科学者は、特殊な合成を必要とする自己組織化単文子膜（ＳＡＭｓ）を使用して金表面を修飾しようとしてきたが、形成されたＳＡＭｓの構造は明確でないかもしれない。従って、好ましい基板上に支持ニ分子膜を形成するための新しい方法を作り出すことが必要とされている。

本発明は、固体担体上に平面状脂質ニ分子膜を製造する方法である。この製造方法では、最初に、脂質小胞溶液が固体担体上に堆積させられる。次に、両親媒性ペプチド溶液を脂質小胞溶液に加えることによって、脂質小胞が不安定化される。この不安定化により、固体担体上に平面状の脂質ニ分子膜が製造される。好ましくは、両親媒性ペプチドは、α−ヘリックスペプチドである。より好ましくは、α−ヘリックスペプチドは、配列SEQ ID NO: 1の一部または全てを有するポリペプチドである。

また、本発明は、平面状脂質ニ分子膜が天然脂質により作られ、固体担体が未修飾金または酸化チタンにより作成された平面状支持脂質二分子膜を提供する。好ましくは、平面状支持二分子膜は連続している。平面状脂質二分子膜は、天然脂質、または限定するわけではないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、およびスフィンゴミエリンのような脂質の混合物であってもよい。

図１は、本発明に係る方法の概略図を示している。図１Ａは固体基板１２０の上に堆積させられた脂質小胞１１０を示している。小胞は、固体基板１２０に吸着される。円１３０で示される大量の水が、固体基板１２０の表面に吸着されている小胞間と同様に、原型（intact）の小胞の内部に取り込まれている。両親媒性ペプチド（ＡＰ）溶液の付加の後に（図１Ｂ参照）、小胞は不安的化されて破壊され、破壊された小胞は溶解し、平面状の二分子膜を形成する。平面状二分子膜１１２が形成されるとき、小胞１１０内に取り込まれていた水は分散し、水層１３２を形成する。

両新媒性ペプチドは、好ましくはα−ヘリックスペプチドである。より好ましくは、両親媒性ペプチドは、ＨＣＶ非構造性タンパク質ＮＳ５ＡのＡＨペプチドである。このタンパク質は、ＨＣＶ分離株に保持されており、配列SEQ ID NO:1を有する。ペプチドの全体、ペプチド（ＡＨ＿Ｓ１）の１〜１６残基のアミノ酸、またはペプチド（ＡＨ＿Ｓ２）の１７−３１残基のアミノ酸のいずれかが、脂質小胞を不安定化するために使用されてもよい。或いは、両親媒性α−ヘリックス構造が保たれている限り、ペプチドは完全な配列の配列SEQ ID NO: 1を有していなくてもよい。例えば、円偏光二色性によって示したとき、ペプチドはα−ヘリックス構造を維持しつつ、配列SEQ ID NO: 1と少なくとも約８０％以上一致する配列を有しているかもしれない。ペプチド溶液の両親媒性ペプチドの濃度は、０．０５μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌであることが好ましい。両親媒性ペプチドは、生理的緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、およびＨＥＰＥＳ緩衝液）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む様々な溶媒に含むことができる。

本発明に適した脂質小胞は、好ましくは、直径が約２５ｎｍ〜約８０ｎｍである。小胞は、限定するわけではないが、抽出法を含む公知技術を用いて調整することができる。小胞は、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度を有するＴｒｉｓ、ＰＢＳ、およびＨＥＰＥＳ緩衝液といった生理的緩衝液中で、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度であることが好ましい。脂質または脂質の混合物のが、限定する趣旨ではなく、リン脂質を含む脂質小胞を形成するために使用され得る。脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、およびスフィンゴミエリンであることが好ましい。

多くの固体担体が、本発明に使用され得る。例えば、限定する趣旨ではなく、材料にはシリコンを含む材料、金、白金、および酸化チタンが含まれる。

また、本発明は、本発明の方法を用いて製造された平面状支持脂質二分子膜を提供する。好ましくは、脂質二分子膜は天然脂質から形成され、固体担体は未修飾金または酸化チタンから作成されている。リン脂質のような、いずれの天然脂質も二分子膜に用いることができる。好ましい脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、およびスフィンゴミエリンである。好ましくは、本発明に係る平面状脂質二分子膜は、連続的であり、例えば層内に隙間はない。

＜実施例＞
＜金基板上での平面状脂質二分子膜の形成＞
原型の小胞からの二分子膜の形成は、水晶振動子マイクロバランス装置（ＱＣＭ−Ｄ）によって明らかにすることができる。ＱＣＭ−Ｄの結果を解釈するために、ソルベリー（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ）の式から算出されるΔｆと吸着質量（Δｍ）との間の直線関係が用いられる。

ここで、Ｃは質量感度定数であり、５ＭＨｚのＱＣＭ−Ｄでは１７．７ｎｇｃｍ^−２Ｈｚ^−１である。ｎは、倍音数である（基本的にはｎ＝１であり、倍音では３，５，７である）。ＱＣＭ−Ｄは、小胞融合過程の様々な研究に用いられており、固い脂質二分子膜および単分子膜と、柔軟で変形可能な小胞とを識別するために減衰（dissipation）が用いられている（例えば、非特許文献１参照）。
ケラー（Keller）、カセモ（Kasemo）著、「水晶マイクロバランス法による脂質小胞吸着の表面動力学（Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance）」、「バイオフィジカルジャーナル（Biophys J.）」、1988年9月、75(3)巻、p.1397-1402

ＡＨペプチドの小胞破壊能力を測定するために、３０ｎｍのポリカーボネート照射エッチング膜（ＰＥＣ）を通過させた１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）の単層小胞を金表面上でＡＨペプチドが存在しない状態で試験し、その後ペプチドを加えて二分子膜を形成させた。小胞が吸着しているとき、表面上に吸着した小胞間と同様に、原型の小胞内に取り込まれた大量の水が存在している。この取り込まれた水は、二分子膜の上面に存在する水と異なり、エネルギーを大きく減衰させる。このエネルギーの減衰における変化により、原型の小胞から二分子膜への変化を追跡することができる。

図２では、Δｆ（ｔ）（図中の三角形）とΔＤ（ｔ）（図中の円形）とが、周波数変化と減衰（dissipation）変化を表している。図２Ａは、酸化金上への小胞の吸着を示している。周波数信号が安定した１０分後（矢印１）に、ＰＯＰＣ小胞溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、φ_{３０ｎｍＰＥＣ}＝５９ｎｍ±０．２ｎｍ）が溶液セルに注入されている。５０および５５分後（矢印２および３）に、小胞を希釈するために使用したものと同じ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡを含む１８．２ＭΩ−ｃｍミリＱ水（ＭｉｌｌｉＱ）（ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ、オレゴン州、アメリカ合衆国）の溶液）で基板を２度洗浄し、これにより金表面上に存在する原型の小胞の安定性が確認された。図２Ｂに示すように、６０分後（矢印４）には、両親媒性のヘリックスペプチド（ＡＨペプチド）溶液（０．０５μｇ／ｍｌ）が金表面上の原型の小胞（φ_{３０ｎｍＰＥＣ}＝５９ｎｍ±０．２ｎｍ）に加えられている。ペプチドは、小胞を不安定化し、破壊して完全な二分子膜を形成する。これは、２５．５Ｈｚ±０．５の周波数の減少として現れ、最大で約０．０８×１０^−６の減衰の減少が確認された。１２０および１４０分後（矢印５および６）には、小胞緩衝液で基板を２度洗浄し、これにより金表面上の二分子膜の安定性が確認された。二分子膜の膜厚を算出することができるソルベリーの式によれば、ＱＣＭ−Ｄのパラメータは、小胞から薄く固い二分子膜への変化を示している。

図２Ｃでは、非両親媒性の非ヘリックスペプチド（ＮＨペプチド）の効果を試験している。ＮＨペプチドは、ＡＨペプチドとは異なり、予測されるＮ末端ヘリックスに沿って、間隔をおいて配置されている３つの荷電アミノ酸を有しており、連続した疎水性パッチは残されていない。ＮＨペプチドは、配列SEQ ID NO: 1の残基８にバリン（Ｖａｌ）の代わりにアスパラギン酸（Ａｓｐ）、残基１２にイソロイシン（Ｉｌｅ）の代わりにグルタミン酸（Ｇｌｕ）、残基１９にフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の代わりにアスパラギン酸（Ａｓｐ）を有している。図２Ｃでは、周波数信号が安定した１０分後（矢印１）に、ＰＯＰＣ小胞溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、φ_{３０ｎｍＰＥＣ}＝５９ｎｍ±０．２ｎｍ）が溶液セルに加えられている。６０および７０分後（矢印２および３）に、小胞緩衝液により基板を２度洗浄し、これにより金表面上に存在する原型の小胞の安定性が確認された。８５分後（矢印４）には、ＮＨペプチド溶液（０．０５μｇ／ｍｌ）が金表面上の原型の小胞に加えられている。ＮＨペプチドは、小胞を不安定化および破壊した証拠を示さなかった。１６０分後（矢印５）には、小胞緩衝液により基板を２度洗浄し、これにより金表面上に存在する原型の小胞の安定性が確認された。

＜ＴｉＯ_２基板上での平面状脂質二分子膜の形成＞
ＡＨペプチドのＴｉＯ_２表面上の小胞破壊能力を測定するために、３０ｎｍのＰＥＣ膜を通過させたＰＯＰＣの単層小胞を金表面上でＡＨペプチドが存在しない状態で試験し、その後ペプチドを加えて二分子膜を形成させた（図３）。図３では、Δｆ（ｔ）（図中の三角形）とΔＤ（ｔ）（図中の円形）とが、周波数変化と減衰変化を表している。図３Ａは、ＴｉＯ_２上への小胞の吸着を示している。周波数信号が安定した１０分後（矢印１）に、ＰＯＰＣ小胞溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、φ_{３０ｎｍＰＥＣ}＝５９ｎｍ±０．２ｎｍ）が溶液セルに注入されている。６０および６５分後（矢印２および３）に、小胞を希釈するために使用したものと同じ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡを含む１８．２ＭΩ−ｃｍミリＱ水（ＭｉｌｉＱ）（ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ、オレゴン州、アメリカ合衆国）の溶液）で基板を２度洗浄し、これによりＴｉＯ_２表面上に存在する原型の小胞の安定性が確認された。図３Ｂに示すように、７０分後（矢印４）には、ＡＨペプチド溶液（０．０５μｇ／ｍｌ）がＴｉＯ_２表面上の原型の小胞（φ_{３０ｎｍＰＥＣ}＝５９ｎｍ±０．２ｎｍ）に加えられている（図３Ｂ）。ペプチドは、小胞を不安定化し、破壊して完全な二分子膜を形成する。２７０分後（矢印５）には、小胞緩衝液で基板を２度洗浄し、これにより金表面上の二分子膜の安定性が確認された。

図３Ｃでは、ＮＨペプチドの効果を試験している。図３Ｃでは、周波数信号が安定した１０分後（矢印１）に、ＰＯＰＣ小胞溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、φ_{３０ｎｍＰＥＣ}＝５９ｎｍ±０．２ｎｍ）が溶液セルに加えられている。４０および５０分後（矢印２および３）に、小胞緩衝液により基板を２度洗浄し、これによりＴｉＯ_２表面上に存在する原型の小胞の安定性が確認された。６０分後（矢印４）には、ＮＨペプチド溶液（０．０５μｇ／ｍｌ）がＴｉＯ_２表面上の原型の小胞に加えられている。ＮＨペプチドは、小胞を不安定化し、破壊した証拠を示さなかった。２７０分後（矢印５）には、小胞緩衝液により基板を２度洗浄し、これによりＴｉＯ_２表面上に存在する原型の小胞の安定性が確認された。

＜本発明に係る脂質二分子膜の形成のＡＦＭ分析＞
不安定化剤であるＡＨペプチドによる小胞の破壊と二分子膜の形成とを、直接的に表示し、確認するために、ＡＦＭを利用した。図４に分析の結果を示す。それぞれの列で、上段の像は二次元の平面図であり、中段の像は三次元の上方視点の図であり、グラフは上段の像に示された黒線に沿って行われた測定結果を示している。像は、高さモードにより与えられている。走査は図４Ａ（上段図）の白色矢印によって示される方向に行われた。

図４Ａでは、ＡＦＭ測定は、Ｔｒｉｓ緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ）中の未修飾（裸）のＴｉＯ_２基板表面に対して行われた。未修飾のＴｉＯ_２表面の二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）の平均は、１．６３±０．１２ｎｍ（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝１５）である。直径が５９ｎｍ±０．２ｎｍであるＰＯＰＣ小胞（０．１ｍｇ／ｍｌ）は、注入システムを通して注意深く加えられ、３０分間インキュベートされた後に、Ｔｒｉｓ緩衝液で３回、完全に洗い流された。図４Ｂに示すように、小胞４１０のような原型の小胞は、ＡＦＭで明瞭に確認され、平均Ｒｑは２．７０±０．１５ｎｍ（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝１５）に増加した。小胞を識別し、計数するために、粒度分析を行った。小胞以外の粒子の影響を最小化するため、直径５０〜１００ｎｍの双曲線形状の物体のみ計数した。図４Ｂに示すＡＦＭの図と、粒度分析により、１３個の小胞が識別された。小胞の平均直径は７４．５７±４．０７ｎｍ（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝１３）であり、平均体積は３．３２×１０^−５μｍ^３±６．１６×１０^−６μｍ^３（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝１３）であった。断面分析は、小胞の高さが約１５ｎｍであることを表している。

図４Ｃに示すＡＦＭの像は、ペプチド（０．０５μｇ／ｍｌ）を注入し、像を走査する前に溶液を２時間インキュベートとした後の像であって、不安定化剤としてのＡＨペプチドの小胞に対する効果を示している。濃度０．０５μｇ／ｍｌのＡＨペプチドで１２０分間処理することによって小胞が破壊されたことを示すＱＣＭ−Ｄ測定の結果を、これらの像は明確に裏付けている。平均Ｒｑが１．６７±０．１２ｎｍ（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝１５）であることは、粗さが未修飾ＴｉＯ_２表面と同等になったことを示している。粒度分析は、小胞状の構造を識別することができず、ＡＨペプチドが小胞を破壊し二分子膜を形成したことを示している（Ｐ≦０．００１）。この結果は、ＱＣＭ−Ｄの動力学データと一致する。

当業者であれば理解できるように、様々な修正、置換、および変更を、本発明の趣旨から逸脱することなく実施することができる。本発明の範囲は、特許請求の範囲およびその均等の範囲によって決定されるべきである。

本発明に係る平面状脂質ニ分子膜を製造する方法を示す概略図である。本発明に係る、金基板上の平面状脂質二分子膜の形成を水晶マイクロバランス法（ＱＣＭ−Ｄ）で測定した結果を示すグラフである。本発明に係る、ＴｉＯ_２基板上の平面状脂質二分子膜の形成を水晶マイクロバランス法（ＱＣＭ−Ｄ）で測定した結果を示すグラフである。本発明に係る、ＴｉＯ_２基板上の平面状脂質二分子膜の形成を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で測定した結果を示す図である。

Claims

固体担体上に平面状脂質二分子膜を製造する方法であって、
ａ）前記固体担体上に脂質小胞溶液を堆積させ、
ｂ）両親媒性ペプチド溶液を前記脂質小胞溶液に加えることによって、前記脂質小胞を不安定化し、
前記不安定化によって、前記固体担体上に前記平面状脂質二分子膜が製造されることを特徴とする平面状脂質二分子膜を製造する方法。
前記両親媒性ペプチドはα−ヘリックスペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記両親媒性ペプチドは、配列SEQ ID NO: 1の１〜３１、１〜１６または１７〜３１のアミノ酸配列のいずれかを有するポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記両親媒性ペプチドは、配列SEQ ID NO: 1と少なくとも約８０％以上一致するアミノ酸配列をするポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記脂質小胞は、リン脂質を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記脂質小胞は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、およびスフィンゴミエリンからなる群から選ばれる少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記固体担体は、シリコンを含む材料、金、白金、および酸化チタンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記脂質小胞は、直径が約２５ｎｍ〜約８０ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記脂質小胞溶液の前記脂質小胞の濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記両親媒性ペプチド溶液の前記両親媒性ペプチドの濃度は、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法によって製造された固体担体上の平面状二分子膜。
平面状支持脂質二分子膜であって、
ａ）天然脂質を含む平面状脂質二分子膜と、
ｂ）未修飾金または酸化チタンを含む固体担体と
を有し、
前記脂質二分子膜は、前記固体担体に支持されていることを特徴とする平面状支持脂質二分子膜。
前記脂質は、リン脂質であることを特徴とする、請求項１２に記載の平面状支持脂質二分子膜。
前記脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロール、およびスフィンゴミエリンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の平面状支持脂質二分子膜。
前記平面状脂質二分子膜は、連続的であることを特徴とする、請求項１２に記載の平面状支持脂質二分子膜。