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JP2008537887A - アスコルベート結合ペプチド - Google Patents

アスコルベート結合ペプチド Download PDF

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seq
peptide
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ascorbate
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ロバート、エス．ルート‐バーンスタイン
パトリック、エフ．ディロン
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Michigan State University MSU
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Abstract

本発明は、生体アミンＧＰＣＲ活性化を調節することができる化合物を同定するのに有用な結合ペプチド、ペプチドをコードする単離された核酸配列、ペプチドの類似体およびペプチドに対する抗体、ペプチドを用いて生体アミンＧＰＣＲ活性化を調節することができる化合物を同定する方法、この方法を用いてスクリーニングされる有用な典型的な試験化合物、生体アミンＧＰＣＲ活性化を調節する方法、およびリガンド結合を調節する方法を提供する。また、生体アミンＧＰＣＲまたはＧＰＣＲの結合部分のアミノ酸配列を有するペプチド、または試験化合物、または両方、および生体アミンＧＰＣＲ活性化モジュレーターの同定または生体アミンＧＰＣＲ活性化の調節に使用する説明書を含んでなるキットも提供される。方法は、アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を伝達する化合物の同定を含んでおり、アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を行う化合物の製造方法も提供される。

Description

発明の背景
関連出願の参照
本出願は、米国特許法第１１９条に基づいて、２００５年４月１５日に出願された米国仮出願第６０／６７２，２２４号、および２００５年８月５日に出願された米国仮出願第６０／７０６，２４９号、および２００５年１１月１８日に出願された米国仮出願第６０／７３８，２９４号の優先権を主張するものである。これら出願の開示内容は、引用することにより本願の開示の一部とされる。
配列リスト
配列リストは、コンパクトディスクに示される。４枚のコピー用コンパクトディスクが提出されており、これらはそれぞれコピー１、コピー２、コピー３およびコピー４の標識がされている。これら４枚のコンパクトディスクのそれぞれは同一配列リストを含み、「Ascorbate Binding Peptides.ST25.txt」と標題が付けられ２００６年４月１４日に作製された１４０ＫＢのファイルに２０７の配列を含んでなる。これらのコンパクトディスクに記録されている材料は、引用することにより本願の開示の一部とされる。
技術分野
本発明の開示内容は、アドレナリン作動性および他の生体アミン受容体のペプチド断片などのＧタンパク質にカップリングした生体アミン受容体アスコルベート結合ペプチドのようなアスコルベート結合ペプチド、およびその使用に関する。
技術背景
この節の記載は、単に本発明の開示内容に関する背景情報を提供するものであり、従来技術を構成しないことがある。 Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、それらのポリペプチド鎖の共通三次構造を共有する細胞表面受容体タンパク質のスーパーファミリーであり、すなわち、６個のループである３個の細胞外ループ（ＥＬ１−ＥＬ３またはＥ１−Ｅ３）および３個の細胞内ループ（ＩＬ−１−ＩＬ３）によって連結された７個の膜貫通へリックス（ＴＭ１−ＴＭ７）のモティーフである。これらのドメインは、細胞外アミノ末端→ＴＭｌ−ＩＬｌ−ＴＭ２−ＥＬｌ−ＴＭ３−ＩＬ２−ＴＭ４−ＥＬ２−ＴＭ５−ＩＬ３−ＴＭ６−ＥＬ３−ＴＭ７→細胞内カルボキシ末端として配置される。ＧＰＣＲスーパーファミリーは多数の受容体クラス、とりわけ、ＧＰＣＲのクラスＡとも呼ばれているロドプシン受容体クラスを含む。生体アミン受容体はロドプシン様受容体クラスを形成し、このファミリーは更に７個のサブファミリーに組織化される。
７個の認識された生体アミン受容体サブファミリーが下記に示されており、典型的な受容体タイプが括弧内に示されている。
・アドレナリン受容体（例えば、αおよびβアドレナリン受容体）、
・ドパミン受容体（例えば、１−４型ドパミン受容体）、
・ヒスタミン受容体（例えば、１−４型ヒスタミン受容体）、
・ムスカリン受容体（例えば、１−５型ムスカリンアセチルコリン受容体）、
・オクトパミン受容体（例えば、１および２型オクトパミン受容体）、
・セロトニン受容体（例えば、１−７型セロトニン受容体）、および
微量アミン受容体（例えば、β−フェニルエチルアミン受容体、チラミン受容体)。
それぞれのアミン結合機能および共有三次構造に加えて、ＧＰＣＲ生体アミン受容体はヒトおよび動物の間で重要なアミノ酸配列相同性を共有している。様々な脊椎動物および無脊椎動物アミン受容体ＧＰＣＲのアミノ酸配列および配列アラインメントは、http://www.gpcr.org/にあるGタンパク質共役受容体データーベースで容易に見ることができる。ＧＰＣＲのアミノ酸配列およびそれらの核酸コード配列は、BLASTおよび例えば、http://www.ncbi.nhn.nih.gov/で利用できるNCBI Entrezによってアクセスし、照会することができるGenBankなど他の様々な一般に利用可能な生命情報科学データーベースの検索手段から検索することもできる。
ＧＰＣＲ生体アミン受容体は、広汎に分布しており、ヒトおよび主要な動物群、例えば、環形動物(例えば、Theromyzon spp.)、昆虫(例えば、Apis spp.、Drosophila spp.、およびCyrtacanthacridinae)、甲殻類(例えば、Balanus spp.)などの節足動物、軟体動物(例えば、Aplysia spp.、Crassostrea spp.、およびLymnaea spp.)、扁虫(例えば、Dugesia spp.)、回虫(例えば、Caenorhabditis spp.)、および脊索動物(例えば、頭索動物、原索動物、および哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、および両生類などの脊椎動物)などで確認されている。
これらの様々なアミン受容体は広く見出されているが、あらゆるタイプの受容体が総ての門に存在するものではない。ヒトおよび動物に見られるＧＰＣＲアミン受容体のサブファミリーは、一般にアドレナリン作動性、ドパミン、ムスカリンアセチルコリン、セロトニン、および微量アミン受容体である。対照的に、オクトパミン特異的ＧＰＣＲはこれまでは無脊椎動物にしか見出されておらず、ヒトや脊索動物(例えば、脊椎動物)には見出されていないが、オクトパミンは検出されており、そこで微量アミン受容体と相互作用する微量アミンとしてのみ機能している可能性がある。同様に、ヒスタミン特異的ＧＰＣＲは脊索動物にのみ見出されており、無脊椎動物には見出されていないが、ヒスタミンは検出されており、異なる受容体との相互作用によってそこで機能している可能性がある。
アドレナリン受容体またはアドレナリン受容体は、生体アミン受容体の実例である。アドレナリン受容体は、ヒトまたは動物体中の組織に見出されている。アドレナリン受容体によって伝達される機能が多様であることにより、その活性に作用しまたは拮抗する作用物質を例えば高血圧、ショック、心不整脈、喘息、アレルギー、心不全およびアナフィラキシーなど様々な疾患の治療に有用となる。
アドレナリン受容体とアドレナリン作動薬は、(1)皮膚および粘膜を供給する血管における平滑筋などのある種の平滑筋および唾液および汗腺のような腺細胞に対する末梢興奮作用、(2)腸壁、気管支分岐、および骨格筋を供給する血管における他のある種の平滑筋に対する末梢抑制作用、(3)心拍数および収縮力の増加を招く心臓興奮作用、(4)肝臓や筋肉における糖原病の発生率の増加、および脂肪組織から遊離脂肪酸の遊離のような代謝作用、(5)インスリン、レニン、および下垂体ホルモンの分泌の調節のような内分泌作用、(6)幾つかのアドレナリン作動薬による呼吸刺激、覚醒状態、精神運動活性の増加、および食欲の減退などのCNS作用、および(7)ノルエピネフリンおよびアセチルコリンのような神経伝達物質の放出を抑制または促進するシナプス前作用のような全身作用を制御する。Goodman and Gilman著、「治療薬の薬理学的基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)」、第8版(1990年)を参照されたい。
アドレナリン受容体の用途が広範囲であるにも拘わらず、アドレナリン受容体および介在については未だに化学的知識が欠けたままである。.アドレナリン受容体および薬剤について知られている情報の多くは、構造比較および機能上の類似性によって類似した詳細に特性決定された分子であるロドプシンの研究を介して知られている。アドレナリン受容体の特定の機能、結合、活性化、および不活性化の知識なしには、アドレナリン作動性化合物の投与は幾つかの異なる身体機能に影響を及ぼすので、その臨床使用は複雑になる可能性がある。更に、アドレナリン作動性化合物に対する身体組織の応答は、化合物の直接的情動によってのみならず生体のホメオスタシス応答によっても決定される。副作用は稀なものではないので、用いようとする特定のアドレナリン作動性化合物と投与を行おうとする投与レベルは慎重に選択しなければならない。例えば、非選択的プロプラノロールのようなβ遮断薬は、β2受容体を遮断することによって気管支収縮を引き起こすので喘息患者にとって危険なものとなる可能性がある。
アドレナリン受容体と同様に、他の主要な生体アミン受容体ファミリー(ドパミン、ヒスタミン、ムスカリンアセチルコリン、およびセロトニン受容体)は、大まかには様々な疾病、疾患、および病気に関与している。これらの例としては、パーキンソン病および運動障害(例えば、運動異常症)、発作または嘔吐障害、双極性疾患、統合失調症および他の精神病、他のCNS疾患および障害、鬱病および恐慌性障害、強迫性障害、過食症および大食障害、嗜癖、肥満、学習、記憶、および認識機能不全、神経血管障害および偏頭痛、急性および慢性痛、ホルモンおよび神経伝達物質放出障害、涙液、唾液および胃液分泌障害、喘息、アレルギーおよび炎症、および副交感神経作動障害、例えば、腸、膀胱および他の平滑筋収縮に関するものが特に挙げられる。これらの受容体は、同様にそのための治療を伝達するのに利用することもでき、アドレナリン受容体によって影響される治療について上記したのと同様の問題も同様にこれらの受容体ファミリーについて存在する。
アドレナリン作動性および他の生体アミン受容体機能、結合および活性化の理解を高めることが望ましい。受容体活性を伝達しまたは調節する化合物の検出に有用なキットおよび方法を提供することも望ましい。生体アミン受容体構造、デザインおよび機構の高められた知識を用いて、受容体の活性および受容体のリガンドの結合を伝達または調節することが更に望ましい。これらの進歩は、現在利用可能なアドレナリン作動性および他のＧＰＣＲ依存性薬剤の有効性を高め、既成薬剤治療の副作用を減らし、新たな療法をデザインするのに望ましい。
発明の概要
本発明は、生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合断片を含むアスコルベート結合ペプチドおよびアスコルビン酸輸送タンパク質を提供する。態様としては、残基2.49-3.41の配列、または好ましくは脊椎動物または哺乳類の生体アミンＧＰＣＲ、または残基3.18-3.25、3.25-3.32または3.18-3.32のようなそのアスコルベート、モルフィンまたはEDTA結合断片、またはW3.18およびC3.25、C3.25およびD3.32、または3個総ての保存残基を保持する保存的に置換されたその変異体を含んでなるペプチドが挙げられる。本発明は、更にヒトSVCT1残基400-439 (配列番号11)またはヒトSVCT2残基459-498 (配列番号12)およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片のまたはを包含するアスコルベート結合ペプチドを提供する。
本発明は、アミノ酸配列が配列番号1-10または14-207のいずれか1つであるかまたはそれらから誘導されたものであるペプチドも提供する。本発明は、これらのペプチド、断片または変異体のいずれか1個の側鎖配列を有しこれらのペプチド、断片、変異体または類似体に対する抗体を提供するペプチド類似体を提供する。これらのペプチド、断片および変異体をコードするDNA、およびそれらに相補性のDNAなどの上記ペプチドをコードする核酸、対応する(複数の)配列を有するRNA、およびそれらの核酸類似体であって、塩基配列が天然または合成によるものであることができるものも提供する。
本発明は、少なくとも1個の他の部分に結合した上記ペプチドまたは抗体(または抗アロタイプまたはイディオタイプ抗体)またはその類似体を含んでなる単離または組換え化合物、およびこのようなペプチド、抗体または類似体と少なくとも1種類の他成分を含んでなる組成物、これらのペプチド、抗体、類似体、または化合物が表面上に固定されている組成物、これらの固定された形態を含む生体分子型アレイ、およびそれらを提示する細胞および他の生物学的存在を提供する。本発明は、これらのペプチド、抗体、類似体、化合物および組成物のライブラリーを提供する。
ペプチド、抗体、類似体、化合物、組成物およびライブラリーのスクリーニング使用を提供し、候補物質をスクリーニングしてそれが生体アミンＧＰＣＲのE1ループに結合することができるかどうかを決定するスクリーニング方法であって、(A) (1)そのようなペプチド、類似体、化合物、組成物、ライブラリー、またはアレイであるまたはを含む少なくとも1種類のスクリーニング要素と(2)少なくとも1種類の候補物質を提供し、(B) 候補物質がスクリーニング要素に結合することができる条件下で上記スクリーニング要素を上記候補物質と接触させ、(C) ペプチドまたは化合物、(複数の)ライブラリーメンバー、またはアレイペプチドへの候補物質の結合の特異性、速度、アフィニティーまたは期間の少なくとも1つを決定する段階を含んでなる方法を提供する。
生体アミンＧＰＣＲまたはアスコルベート結合部分のアミノ酸配列を有するペプチドに結合し、これによってＧＰＣＲ活性化を調節することができる化合物を同定する方法を提供する。アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を伝達する補体化合物を同定する方法であって、
(a) アスコルベート結合ドメインを含んでなるアドレナリン受容体またはその断片へのアドレナリン作動性化合物の第一の結合アフィニティーを測定し、
(b) 補体化合物の存在下における上記アドレナリン作動性化合物の上記アドレナリン受容体またはその断片への第二の結合アフィニティーを測定し、
(c) 第一の結合アフィニティーを第二の結合アフィニティーと比較する
ことを含んでなり、第二の結合アフィニティーが第一の結合アフィニティーからかなり異なるときには、補体化合物がアドレナリン作動性結合を伝達する、方法を提供する。
本発明は、例えば、生体アミンＧＰＣＲおよびアスコルベート結合ペプチドを含むその断片などのアスコルベート結合ペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなるイン・ビボまたはイン・ビトロ分析法を用いるアドレナリン作動性アゴニスト活性を強化した化合物を同定する方法、およびアドレナリン作動性アンタゴニスト活性を強化した化合物を同定する方法も提供する。本発明は、例えば、生体アミンＧＰＣＲおよびアスコルベート結合ペプチドを含むその断片などのアスコルベート結合ペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなるイン・ビボまたはイン・ビトロ分析法を用いるアスコルベート結合ペプチド結合剤による調節に対する抵抗または感受性を強化した化合物を同定する方法も提供し、アスコルベート結合ペプチド結合剤は異なる化合物であることができ、またはこれは試験化合物の一部である残基であることができる。
本発明は、核酸または核酸類似体のストリンジェントハイブリダイゼーションにより更なるアスコルベート結合ペプチドコード配列を同定するプロービング法も提供する。本発明は、抗アスコルベート結合ペプチド抗体、抗体断片およびアプタマー(aptamer)の特異的結合により更なるアスコルベート結合ペプチドを同定する方法も提供する。
また、(A) そのようなペプチド、類似体、化合物、組成物、ライブラリーまたはアレイであるまたはを含む少なくとも1種類のスクリーニング要素、および(B) スクリーニング要素のペプチドまたはペプチジル残基に結合する候補物質をスクリーニングする目的で用いる使用説明書、および場合によっては、(1) 候補物質または試験化合物が添加されたアスコルベート型物質の存在下にて生体アミンＧＰＣＲへ強く結合することができるまたはできると思われるかどうか、(2) アスコルベート型物質と結合せずかつこれと混合されていない試験化合物の結合と比較して、候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲへの結合が減少しまたは減少すると思われるかどうか、(3) これによってスクリーニングされる複数の候補物質のそれぞれの結合特性の差、(4) 生体アミンＧＰＣＲと接触したときに候補物質または試験化合物が望ましくない毒性効果を示す可能性、(5) 候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲのアゴニストとして機能する可能性、(6) 候補物質または試験物質が生体アミンＧＰＣＲのアンタゴニストとして機能する可能性の1つ以上を決定する目的で使用する使用説明書を含んでなる、スクリーニングキットを提供する。
本発明の組成物および方法は、受容体構造、機能および機構の増加した知識、増加しかつ標的設定された受容体介在および活性化、および改良された試験およびドラッグデザインの方法の1以上を含む当該技術分野で知られているアドレナリン作動性療法に関する利点を提供することが明らかになった。応用可能な他の分野は、本明細書で提供される説明から明らかになるであろう。説明および具体例は例示のみを目的とし、本発明の開示内容の範囲を制限しようとするものではないことを理解すべきである。
本明細書に記載の図面は例示目的のみのためのものであり、本発明の開示内容の範囲を制限しようとするものではない。本発明は、詳細な説明および添付の素面から一層完全に理解されるであろう。
例えば、図4-11に記載のプロットは、本明細書の態様を説明する目的で本発明の治療および受容体効果の一般的特性を示そうとするものであることに留意すべきである。これらのプロットは任意の所定の態様の特性を正確に反映していないことがあり、必ずしも本発明の範囲内の具体的態様を画定しまたは制限しようとするものではない。
発明の具体的説明
下記の説明は単なる例示的な性質のものであり、本発明の開示内容、応用または使用を制限しようとするものではない。下記の定義および非制限的指針は、本明細書に記載の本発明の説明の概説において考慮されねばならない。本明細書で用いられる見出し(「緒言」および「概要」など)および小見出し(「方法」など)は、発明の開示内容の範囲内の主題を単に一般的に構成しようとするものであり、本発明の開示内容またはその任意の側面を制限しようとするものではない。特に、「緒言」に開示されている主題は本発明の範囲内の技術の側面を包含していることがあり、従来技術を詳細に説明しないことがある。「概要」に開示されている主題は、本発明の全範囲またはその任意の態様の徹底的または完全に開示しているものではない。特定の有用性を有するものとしての本明細書の一節における材料は便宜的に分類または解説するが、この材料が任意の所定の組成物に用いられるときにはそれが本明細書に記載の分類に準じて必ず機能しなければならないと推断すべきではない。更に、本発明を任意の特定の種類の生体アミンＧＰＣＲ、例えば、(複数の)アドレナリン受容体または(複数の)ドパミン受容体を参照することによって記載しまたは例示することがあるが、そのような特定の記載は例示的なものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書における文献の引用は、それらの文献が従来技術でありまたは本明細書に開示される本発明の特許要件に何らかの関連性を有することを容認するものではない。「緒言」に引用された文献の内容についてのあらゆる解説は、単に文献の著者によって行われた主張の総括的概要を提供しようとするものであり、これらの文献の内容の正確さについて容認しているものではない。本明細書の説明の節に引用される総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
説明および具体例は、本発明の態様を示しているが、例示のみを目的としようとするものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではない。更に、特徴を述べている複数の態様を列挙することは、追加の特徴を有する他の態様または特徴を述べている様々な組合せを組込んでいる他の態様を除外しようとするものではない。具体例は本発明の組成物および方法の製造および使用方法を例示する目的で提供されるのであり、明確に断らない限り、本発明の所定の態様が製造または試験されたかどうかを表そうとするものではない。
本明細書で用いられる「好ましい」および「好ましくは」という単語は、一定の状況では一定の利益を付与する本発明の態様を表す。しかしながら、他の態様もあるまたは他の状況では好ましいことがある。更に、1以上の好ましい態様の列挙は、他の態様が有用ではないことを意味するものではなく、かつ本発明の範囲から他の態様を除外しようとするものではない。
本明細書で用いられる「包含する」という単語およびその変異体は、非制限的であることを意図し、リストの細目を列挙することは本発明の材料、組成物、装置、および方法においても有用なことがある他の類似細目を除外するものではない。
本明細書で言及される総ての組成物百分率は、特に断らない限り、総組成物の重量によるものである。
本明細書で用いられるウイルスという用語は、任意の形態のキャプシド化ウイルスを表し、キャプシド化ヒト、動物および植物ウイルス、並びに、例えば「ヘルパー」ウイルス、ファージおよびサテライトウイルスを包含し、また本明細書で用いられる「ウイルス様粒子」という用語は任意の形態の任意の他のキャプシド化したものであって、キャプシドがポリペプチドから構成されるものを包含する。
本明細書で用いられる「ペプチド」という用語は、α-アミノと1-カルボキシ基との縮合によって得ることができるアミド結合によってモノマー同士が結合しているポリアミノアシルポリアミドを表す。これらのモノマーは、独立してD-またはL-コンホメーションでありかつ当該技術分野で知られている任意の(複数の)側鎖修飾を示す20を上回る普通のαアミノ酸(CitおよびOrnなど)のいずれであることもできる。「ペプチド」は、当該技術分野で知られている任意の形態、例えば線状、主鎖アミド、側鎖-側鎖または側鎖-(複数の)末端結合を介する環状、 二次構造によってコンホメーション的に強制された、ペプチドに結合した他の化学残基または残基類の存在によってコンホメーション的に強制された(環状など)形態で提供することができ、および/または所望により1以上の他の構造に結合することができる。
本明細書で用いられる「ペプチド類似体」という用語は、所定のペプチドで提供されるアミノ酸残基側鎖の配列と同じ化学残基の配列(好ましくは、本来の長さまたは伸張した長さのアミノ酸残基側鎖の配列)であって、これらの残基はアミノ酸残基のペプチド配列とほぼ同じ間隔で間隔が置かれているものを含む分子であって、ペプチドと少なくとも実質的に同じ方法または程度でペプチドに結合する物質に結合することができる分子を表す。従って、「ペプチド類似体」の例としては、擬似ペプチド、主鎖修飾類似体、例えば、-CH(R)C(=O)NH-アミド構造の代わりに-CH(R)CH2NH-を有するアミン主鎖類似体、他のアミド置換主鎖類似体であって、アミド構造が例えば、-CH(R)C(=S)NH-、-CH(R)CH2S(=O)-、-CH(R)CH2S(=O)2-または-CH(R)CH2S-によって置換されているもの、およびペプトイド、すなわちα-N-結合側鎖を有するポリグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「薬学上許容可能な」という用語は、正しい医学的判断において重要であると考えられ得るように(複数の)患者の生存能力および他の(複数の)健康因子に関して評価される合理的利益/危険比に対応する過度の有害な副作用(例えば、毒性、刺激およびアレルギー反応)のないヒトおよび/または動物患者または(複数の)組織中、上でまたはと共に用いるのに適していることを意味する。ここで、「薬学的」とは、例えば、予防、治療、待機的、栄養、化粧(例えば、生体化粧、神経化粧)または診断目的の任意の1以上について直接的または間接的に有用性を提供する材料および方法を表す。間接的薬学的有用性を示す例としては、別の治療の付加物として用いられる材料および方法、例えば、外科治療に関連して用いられる麻酔または筋肉麻痺誘発剤、または放射線で標的とされる集団の場所を突き止めまたは可視化するのに用いられる検出剤、または治療法に従うコンプライアンスを実証するための投与した処方物に含まれる標識またはトレーサーが挙げられるが、これらに限定されない。「薬学上許容可能な」賦形剤 (例えば、キャリヤーおよび他の添加剤)は更に、本発明による医薬処方物のような混合物の(複数の)活性成分の生物学的活性の有効性を干渉しない材料となる。
「機能上許容可能な」という用語は、所望な機能、すなわち所望な目的に対する所定の方法または材料の許容可能性を表す。この用語は、「薬学上許容可能な」並びに他の(例えば、薬学上許容不可能な)クラスの方法および材料より広義でありかつこれらを包含する。このような他の「機能上許容可能な」クラスとしては、
殺生物的に許容可能な(例えば、動物/昆虫またはヒト殺生物性および/または毒性誘発目的の)、
生物静力学的に許容可能な(例えば、動物/昆虫またはヒトの幼若化、生殖不能生成および/または避妊目的の)、
抑止的に許容可能な(例えば、動物/昆虫またはヒトの忌避、刺激、前炎症および/または前疼痛目的に関する)、および
鎮静的または固定的に許容可能な(例えば、鎮静催眠剤、抗不安薬、麻酔薬、オピオイド鎮痛薬、骨格筋弛緩薬、麻痺薬、および鎮静、弛緩または固定化を誘発することができる他の薬剤の1種類以上を用いるものなどの動物/昆虫またはヒト中枢神経系の機能低下が所望な医学以外の目的に関する).
が挙げられるが、これらに限定されない。
このような目的の特定の例としては、例えば、犯罪抑止または固定、群衆制御、野生動物および昆虫制御(例えば、抑止、防虫)、および動物/昆虫個体数の成長制御が挙げられる。幾つかの場合には、材料または方法は複数の目的に許容可能であることがあり、例えば生物静力学的に許容可能な薬剤は薬学上許容可能であることもある。
生体アミンＧＰＣＲモジュレーター結合ペプチド
本発明以前には、ＧＰＣＲ膜貫通ドメインとは異なり、かなりのアミノ酸相同性が膜貫通ドメインを連結しているループ間で共有されないことが一般に認められていた。例えば、J Ballesteros & K Palczewski, 「Gタンパク質共役受容体薬の発見:ロドプシンの結晶構造からの推定(Gタンパク質-coupled 受容体 drug discovery: implications from the crystal structure of ロドプシン)」, Curr. Opin. Drug Discov. & Dev. 4(5):561-574 (Sep 2001)を参照されたい。部分的には、これは、ループアミノ酸配列と異なり、総ての膜貫通ドメインアミノ酸配列がαへリックスを形成する可能性を共有しているからであり、かつ少なくとも生体アミンＧＰＣＲの場合には、リガンドが結合クレフト内深くの一定の保存残基上のＧＰＣＲ膜貫通へリックスとの相互作用によってそれらの受容体に結合するからである。U Gether, 「Gタンパク質共役受容体の活性化に伴う分子機構の解明(Uncovering molecular mechanisms involved in activation of Gタンパク質-coupled 受容体s)」, Endocr. Rev. 21(l):90-113 (2000)。これらの膜貫通ドメインの保存された構造および機能上の特徴とは対照的に、細胞外ループは、(単一の保存されたEL2 Cys残基とは異なる)保存された二次構造を欠いておりかつ膜貫通ドメインを一緒に物理的にテザードして(tether)それらが会合して特徴的な「多重螺旋束(multi-helical bundle)」三次構造になるのを促進する働きをする可撓性の紐(floppy strings)と一般に見られている。
対照的に、意外なことにはこの受け容れられている見方とは対照的に、本明細書に記載の数百のヒトおよび動物生体アミンＧＰＣＲのE1ループは1個の不変Trp残基および類似度を共有する他の残基(すなわち、保存または半保存残基として)を包含する保存アミノ酸配列相同性を含むことも見出した。従って、これらのループは、アスコルベート、モルフィン/オピオイド、およびポリカルボン酸キレート化剤、例えば、EDTAおよびその類似体のようなそれらの類似体および模倣物に結合アフィニティーを示すアミノ酸配列を含んでなる。ＧＰＣＲ生体アミン受容体のE1ループへのそのような化合物の結合は、更にアゴニスト、アンタゴニスト、または他の結合部位リガンドによる結合に対するＧＰＣＲの応答をアロステリック調節する、例えばアロステリックに増強または抑制/減衰することができることも見出されている。E1ループへ結合することによってこのような調節を行う化合物は、本明細書では「ＧＰＣＲのアロステリックモジュレーター」と呼ばれる。
同様に、このような調節を行うことなしにE1ループに結合するがアロステリックモジュレーターによりE1ループ結合を阻害する化合物は、本明細書では「アロステリック調節阻害剤」と呼ばれる。
ＧＰＣＲE1ドメインの化合物に結合する能力を幾つかの場合に利用して、少なくとも2個の残基を含み、少なくとも1個の第一の残基がE1ループ結合成分、例えばアスコルベートまたはオピオイド/モルフィン類似体または模倣物であって、第一の残基がE1ループに結合することによって受容体結合部位への接近を立体的に遮断する第二の残基に結合したものを含む化合物を投与することによってＧＰＣＲへのリガンド結合を阻害することができる。E1ループへ結合することによってＧＰＣＲリガンド結合部位への接近を(部分的または完全に、または安定的、一過的または断続的に)立体的に遮断する化合物は、本明細書ではＧＰＣＲの「立体モジュレーター」と呼ばれており、好ましい態様では、立体モジュレーターは、安定的に、すなわちE1ループへ結合している全時間中結合部位への接近を遮断することができる。
幾つかの場合には、E1ループが化合物を結合する能力を用いて、ＧＰＣＲ連結分子にそれが結合しているＧＰＣＲの応答を調節させることができる。そのような態様では、少なくとも2個の残基を含む化合物は、ＧＰＣＲ受容体結合部位のリガンド(直接的アンタゴニストまたはアゴニスト)である第二の残基に結合した少なくとも1種類のE1ループに結合しているアロステリックモジュレーター残基を有することができる。このような化合物は、本明細書では「自動調節リガンド」と呼ばれる。このような化合物は、例えば、アスコルベート、モルフィン、EDTA、または類似体をアミン作動性化合物へ直接またはテザード化合物(tethered compound)を作製する目的でリンカーを用いて共有結合することによって調製することができる。多数の有用なホモおよびヘテロ炭化水素テザー(tethers)、例えばポリエーテル(例えば、1-12個のモノマー主鎖原子を有するポリアルキレンジオール、例えばPOM、PEGなど)、ポリアミドまたはポリアクリレート、好ましくは約10-16個、または少なくとも12個の主鎖原子を有するポリマー)を用いることができ、任意の当該技術分野で知られている多種多様な有用な化合物を用いることできる。
同様に、少なくとも2個の残基を含む化合物は、ＧＰＣＲ (すなわち、アロステリック調節阻害剤として機能する)を調節することなくE1ループに結合するまたはE1ループアロステリック調節結合部位への接近を(部分的または完全に、または安定的、一過的または断続的に)立体的に遮断する第二の残基に結合したＧＰＣＲ受容体結合部位のリガンド(直接的アンタゴニストまたはアゴニスト)である少なくとも1種類の残基を有することができる。このような化合物は、本明細書では「調節耐性リガンド」と呼ばれ、E1結合調節耐性リガンドおよびE1遮断調節耐性リガンドが挙げられる。これらは、上記と同じテザーおよび結合性化合物(linking chemistries)を用いて調製することができる。
本明細書に記載されているように、本発明によるペプチドを用いてE1ペプチド (すなわち、生体アミンＧＰＣＲE1ループ、TM3ドメイン、またはE1-TM3部分のアミノ酸配列を有するアスコルベート結合ペプチド)に結合する化合物をスクリーニングすることができる。これらは、アロステリックモジュレーター、アロステリック調節阻害剤、立体モジュレーター、自動調節リガンド、またはE1結合調節耐性リガンドであることができる。アスコルベート、モルフィン、およびそれらの類似体および模倣物のようなアロステリックモジュレーターを結合部位としてE1ペプチドを同定することにより、本発明によるE1 型ペプチドを含むポリペプチドを十分な追加的な活性ＧＰＣＲ構造と共に用いてリガンド結合部位を構成するようにして、E1遮断調節耐性リガンドを同定することができる。
立体モジュレーター、自動調節リガンドまたは調節耐性リガンドの同定に有用なポリペプチドの好ましい態様では、このポリペプチドは少なくとも生体アミンＧＰＣＲのTM2-TM7部分を含むことができる。このようなポリペプチドを用いて、アロステリックモジュレーターまたはアロステリック調節阻害剤をスクリーニングすることもできる。一態様では、立体モジュレーター、自動調節リガンドまたはアロステリックモジュレーターのスクリーニングは、候補化合物を活性ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列全体未満、好ましくは活性ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列のTM2-TM3部分以下、好ましくはE1ペプチドのみを含むポリペプチドと接触させることを含むことができる。一態様では、このようなスクリーニングは、活性ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列全体未満を含むポリペプチドを用いる第一のスクリーニングに続いて、より大きな部分を用いることによって、例えばTM2-TM7部分、好ましくはＧＰＣＲ全体に結合した化合物を特性決定する更なるスクリーニング段階を含むことができる。
更に、このようなE1ループのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを用いるスクリーニングは、E1ループ結合またはE1ループ結合阻害活性を示し、従ってイン・ビボ(または細胞中)でアロステリックモジュレーター、アロステリック調節阻害剤、立体モジュレーター、自動調節リガンドまたは調節耐性リガンド活性を示すことができまたは少なくともできると思われる化合物の同定に有用である。
好ましい態様では、E1アミノ酸配列に結合する能力について化合物のスクリーニングに用いられるポリペプチドは、活性生体アミンＧＰＣＲE1ループのアミノ酸配列、またはその不変トリプトファン(ＧＰＣＲDBナンバリングシステムによればTrp118、または典型的なBallesteros-WeinsteinナンバリングシステムによればTrp2.30またはTrp3.18)残基を保持する保存的に置換された変異体を含むことができる。好ましい態様では、ポリペプチドは、この本来型配列セグメントの一部として、隣接膜貫通ドメインに属するとして分類される1以上のフランキングアミノ酸残基(TM2およびTM3)またはその保存的に置換された変異体を含むこともできる。そのような「フランキングTM残基」ペプチドがTM3の3個以上のE1隣接残基を含む場合には、本来型配列セグメントはその不変システイン(ＧＰＣＲDBナンバリングシステムによればCys125または典型的なBallesteros-WeinsteinナンバリングシステムによればCys3.25)残基を含むことができる。ＧＰＣＲDBナンバリングシステムはＧＰＣＲデーターベースで用いられるものであり、www.gpcr.org/7tm/でインターネット上で入手可能である。Ballesteros-Weinstein(BW)ナンバリングシステムは、JA Ballesteros & H Weinstein, Methods Neurosci. 25:366-428 (1995)に記載されている。
このような「フランキングTM残基」ペプチドがTM3の10個以上のE1隣接残基を含む場合には、本来型配列セグメントはその不変アスパラギン酸(ＧＰＣＲDBナンバリングシステムによればAsp132またはBWナンバリングシステムによればAsp3.32)残基を含むことができる。幾つかの好ましい態様では、本発明による方法または組成物に用いられるペプチドは、そのＧＰＣＲセグメントとしてTM3不変Cys125およびAsp132残基を保持するＧＰＣＲのE1隣接または近位下流部分のアミノ酸配列(すなわち、ＧＰＣＲDBナンバリングにおけるC125-D132のアミノ酸配列またはBW Cys3.25-Asp3.32)のみを含むことができる。保存されたTrp118、Cys125およびAsp132は配列番号14-207ではTrp22、Cys29およびAsp36として提示され、本明細書においてこれらのTrp22、Cys29およびAsp36残基の列挙にも含まれている変異体配置は、配列番号33、75、77、94、203および205ではTrp23、Cys30およびAsp37 (これらの列挙も、配列番号29、30、71、72、114、140、141および199におけるXaa19の欠失または配列番号40、81、148および176におけるXaa27の欠失のような単一残基欠失および単一残基挿入突然変異体のように配置が変化する場合であっても、これらの保存残基に対する参照を含む)である。このような本明細書における保存されたTrp22、Cys29およびAsp36残基は、典型的なBWナンバリング法によればそれぞれW2.30またはW3.18 (本明細書では同等として用いられる代替物)、C3.25およびD3.32の列挙を表しかつこれと同義であるとも考えられる。
本発明による生体アミンＧＰＣＲペプチドは、ＧＰＣＲE1ループ、またはその少なくとも一部分および隣接TMドメイン、すなわちTM2またはTM3ドメイン、または両方の少なくとも一部分のアスコルベート、モルフィンまたはEDTAに結合している連続的アミノ酸配列を含むことができる(すなわち、組み合わせたTM2-E1領域、E1-TM3領域またはTM2-E1-TM3領域に見られる配列)。
好ましい態様では、ポリペプチドはE1ループ残基の他にTM2およびTM3のE1隣接残基の総てまたはほとんど総てを含んでなることができ、すなわちTM2-E1-TM3ポリペプチドの少なくともほとんど総てまたは不変Trp118および/またはCys125および/またはAsp132 (ＧＰＣＲDBナンバリング)を保持する保存的に置換されたその変異体を含んでなることができる。他の高度に保存されたTM2およびTM3残基、例えばL94/L2.46、A95/A2.47、D98/D2.50、L143/L3.43、E149/E3.49、R150/R3.50、Y151/Y3.51および/またはV154/3.54 (ＧＰＣＲDB/BWナンバリングで示す)も、TM2およびTM3配列に保持することができ、好ましくは保持されるであろう。
好ましい態様では、ポリペプチドは、標準化ＧＰＣＲDBナンバリングに準じて番号を付けたところ、E1ループの総てまたは少なくともかなりの部分を含む生体アミンＧＰＣＲE1断片、例えばこのループのN末端-近位の半分(例えば、残基115-120)または3分の1(例えば、残基115-118)を含む断片を含んでなることができる。これは、その上流に隣接するTM2ドメインからの連続的残基を更に含むペプチドに含まれることができる。従って、幾つかの態様では、E1を含むペプチドは、標準化ＧＰＣＲDBナンバリングに準じて番号を付けたところ、例えば、生体アミンＧＰＣＲの残基108-132、108-126、108-125、108-120または108-118、または115-132、115-126、115-125、115-120または115-118から得られる生体アミンＧＰＣＲアミノ酸配列を含んでなることができる。様々な態様では、このようなアミノ酸配列を含んでなるペプチドは、約10アミノ酸残基以上の長さを有することができる。例えば、ヒトβアドレナリン作動性ペプチドB2AR 89-99は、標準化ＧＰＣＲDBナンバリングに準じた残基108-118(すなわち、配列番号27の残基12-22)を含んでなり、これはE1ループ配列に隣接するTM2の一部のアミノ酸配列を包含する。
好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号1-10のいずれか1つまたはTrp5およびCys12を保持しているその保存的変異体のアミノ酸配列を含んでなることができ、これらは上記の不変TrpCys残基である。好ましい態様では、ポリペプチドは、配列リストに記載してあるように配列番号1-10のいずれか1つの置換変異体を含むことができる。配列番号1-10のいずれか1つの変異体または保存的変異体の好ましい態様では、置換の数は好ましくは12以下であることができ、一態様では、それらは10以下であることができ、一態様では、それらは8以下であることができ、一態様では、それらは6以下であることができ、一態様では、それらは少なくとも2または少なくとも3または少なくとも4であることができ、一態様では、それらは2-12または3-10または4-8であることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、W-XXXXX-CまたはW-XXXXXX-Cのアミノ酸配列であって、WおよびCがそれぞれ保存されたE1-TM3残基Trp3.18(BW)/Trp118(ＧＰＣＲDB)およびCys3.25(BW)/Cys125(ＧＰＣＲDB)を表し、それぞれの残基Xは独立して任意の活性生体アミンＧＰＣＲ、好ましくは脊椎動物または哺乳類ＧＰＣＲにおけるその残基の対応位置にあるアミノ酸のいずれかから選択されるアミノ酸であり、好ましくは上記WおよびC残基の間にあるXは、集合的に任意の上記した活性生体アミンＧＰＣＲの対応位置にあるアミノ酸配列であるものを含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、C-XXXXXX-Dのアミノ酸配列であって、CおよびDはそれぞれ保存されたTM3残基Cys3.25(BW)/Cys125(ＧＰＣＲDB)およびAsp3.32(BW)/Asp132(ＧＰＣＲDB)を表し、それぞれの残基Xは独立して任意の活性生体アミンＧＰＣＲ、好ましくは脊椎動物または哺乳類ＧＰＣＲのその残基の対応位置にあるアミノ酸のいずれかから選択されるアミノ酸であり、好ましくは上記のCとD残基の間にあるXは集合的に任意の活性生体アミンＧＰＣＲの対応位置にあるアミノ酸配列であるものを含んでなることができる。
上記の式は、XXXX-W-XXXXXX-C-XXXまたはXXXX-W-XXXXX-C-XXX、およびW-XXXXXX-C-XXXXXX-DまたはW-XXXXX-C-XXXXXX-D、およびXXXX-W-XXXXXX-C-XXXXXX-DまたはXXXX-W-XXXXX-C-XXXXXX-Dのような一層大きな定義された式の一部であることができる。このような一層大きな式では、指示した残基に対して同じ定義が当てはまる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号14-207のいずれか1つまたはそのTrp22、Cys29およびAsp36を保持しているその保存的変異体のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基97-141 (BW残基2.49-3.41)のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号14-207のいずれか1つの残基1-44のアミノ酸配列(すなわち、配列番号33、75、77、94、203および205の残基1-45の配列のいずれか1つであることができる)を含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基108-129 (BW残基2.60-3.29)のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号14-207のいずれか1つの残基12-33のアミノ酸配列を含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基114-128 (BW残基2.66-3.28)のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号14-207のいずれか1つの残基18-32のアミノ酸配列を含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基115-126 (BW残基2.67-3.26)のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号14-207のいずれか1つの残基19-30のアミノ酸配列を含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基118-125 (BW残基3.18-3.25) のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号14-207のいずれか1つの残基22-29のアミノ酸配列を含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基114-132 (BW残基2.66-3.32)のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号14-207のいずれか1つの残基18-36のアミノ酸配列を含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基125-132 (BW残基3.25-3.32)のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号14-207のいずれか1つの残基29-36のアミノ酸配列を含んでなることができる。
好ましい態様では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲDB残基118-132 (BW残基3.18-3.32)のアミノ酸配列を含んでなることができる。好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号14-207のいずれか1つの残基22-36のアミノ酸配列を含んでなることができる。
このようなE1、TM3およびE1-TM3ペプチドは、そのようなアスコルベート、モルフィンまたはEDTA結合配列のみからなることができ、またはその生体アミン配列はそのような結合配列(またはそのような配列のコンカテマー(類))に限定することができる。好ましい態様では、本発明の方法に用いるペプチドとしては、そのような結合配列と生体アミンＧＰＣＲにおいて隣接することが見出されている追加のE1、TM3および/またはTM2配列との両方を挙げることができる。好ましい態様では、ペプチドは、生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的にTM2-TM3配列部分全体を含んでなることができる。好ましい態様では、ペプチドは生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的にTM2-TM7配列部分全体を含んでなることができる。好ましい態様では、ペプチドは、少なくとも実質的に生体アミンＧＰＣＲの全配列を含んでなることができる。
ペプチドは、溶液または懸濁液で提供することができる。あるいは、好ましくは、ペプチドは、直接またはリンカーを介する共有または非共有結合によって支持体材料中または上に提示することができる。好ましい態様では、支持体材料は、合成ポリマーまたはゲルビーズまたはアレイ部材 (例えば、ミクロアレイスポット)のような非タンパク質性固形または半固形材料であることができる。一態様では、支持体材料は、微生物細胞によってまたはウイルスまたはVLP核酸の発現宿主細胞によって合成される表面結合分子としてのペプチドを提示する微生物細胞、ウイルス、またはウイルス様粒子(VLP)であることができる。
好ましい態様では、支持体材料は、有機-水性流体界面であることができる。一態様では、ペプチドは、親油性相-親水性相界面の表面に提示することができる。一態様では、ペプチドは脂質膜上に提示することができる。一態様では、ペプチドは、ミセルまたはリポソーム表面に提示することができる。一態様では、ペプチドは、それが合成される脊椎動物または哺乳類細胞の表面に提示することができる。親油性-親水性相界面または膜への結合は、ペプチドを膜の一成分または界面領域にある分子に結合させることによって行うことができる。あるいは、ペプチドは、膜貫通ドメインまたは(複数の)界面領域中またはを介して界面活性剤残基を挿入することによってペプチドを膜または界面に結合させることができる界面活性剤残基などに結合させることができまたはを含んでなることができる。当該技術分野で一般に知られている任意の方法を、この目的に用いることができる。好ましい態様では、ペプチドは、生体アミンＧＰＣＲ TM2-TM7領域の少なくとも実質的に完全な配列を含むことができ、脊椎動物または哺乳類細胞、好ましくはそれが合成される細胞の表面に提示することができる。好ましい態様では、ペプチドは、全生体アミンＧＰＣＲ配列を含んでなることができる。
(本発明のE1、TM3および/またはE1-TM3配列ペプチドのいずれかを結合する化合物など)「E1」結合化合物を同定する方法に有用なペプチドは、この方法で有用な検出可能な標識に結合させることもできる。検出可能な標識は、着色した、蛍光性またはルミネッセンス性であるか、または当該技術分野で周知の処置により着色、蛍光性またはルミネッセンス性とすることができる。
部分アミノ酸配列のみが利用可能である配列リストにおける配列、すなわち配列番号123、124および204の場合には、上記説明のいずれか1つ(すなわち、配列番号124)に定義されている配列を提供するその(複数の)部分が用いられる。上記で定義した配列を提供するのに不十分なものを用いて、その総てが記載されている対応するコード配列についてGenbankを検索することができ、このコード配列を用いて、通常のDNA合成法によって構築し通常のハイブリダイゼーションプロービング法、 例えばcDNAハイブリダイゼーションに増幅生成物の標準的PCRおよびDNAシークエンシングと共に用いることができるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を提供し、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする更に長いまたは完全な長さの(複数の)コード配列、従って、上記配列を提供するのに十分なアミノ酸配列を得ることができる。
抗体
本発明は、更にアスコルベート結合ペプチドに対する抗体を提供する。本明細書で用いられる「抗体」という用語としては、生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合ペプチドに結合アフィニティーを有する任意のクラスの免疫グロブリン、並びにこのようなアスコルベート結合ペプチド抗体に対する抗イディオタイプおよび抗アロタイプ抗体が挙げられ、抗体は一本鎖抗体も包含する。本明細書で用いられる抗体断片は、本発明の抗体の結合ドメイン(すなわち、CDR)から得られるアミノ酸配列を有し、親抗体によって特異的結合されたターゲット抗原に特異的に結合する能力を保持している任意の単一または複数のポリペプチド構造体である。これには、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2のような標準的抗体断片、並びに一本鎖Fvのようなこれらの断片に近似している一本鎖構造体、および他の組換え構造体、例えば、ドメイン欠失抗体が挙げられる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体などの抗体は、本発明によるアスコルベート結合ペプチドから当該技術分野で一般に知られている方法によって調製することができる。
ペプチドおよび典型的な試験化合物のスクリーニング使用
本発明によるアスコルベート、モルフィンおよび／またはＥＤＴＡ結合ペプチド（すなわち、Ｅ１、ＴＭ３およびＥ１−ＴＭ３アスコルベート結合ペプチドなど）を用いて、どのアスコルベート様、モルフィン様、ＥＤＴＡ様および他の化合物がこれに結合することができるかを確認し、または比較的大きなアフィニティーでそれに結合するものを確認することができる。このような結合化合物を同定することによって、例えば、（複数の）生体アミンＧＰＣＲのイン・ビボ結合に基づく調節を示すと思われる化合物を効率的に選択することができる。これらのペプチドを用いて上記化合物を同定するためのスクリーニング法において、スクリーニングされる化合物を「候補結合化合物」と呼ぶことができる。一態様では、候補結合化合物は三水素相互作用(THI)化合物であることができる。
ＴＨＩ化合物。本明細書で用いられるように、（１）一態様では、「ＴＨＩ」化合物という用語は、水素相互作用を行うことができる少なくとも３個の表面に接近可能な基を有する化合物を表し、上記基の少なくとも３個は、順に水素供与体、水素受容体および水素受容体および水素受容体であり、３個の基は好ましくは非水素供与／受容基（例えば、芳香族または脂肪族メチレンまたはメチリデン基）の１−約５個の連続的な分子内原子によって離れており、従って、一連の三水素相互作用基を形成し、３個の基は独立して化合物の三次元コンホメーションでの平均的相対位置において約１−約１０オングストローム互いに間隔が空けられており、その中でこれらの三水素相互作用基は実質的に線状から約２４０°の角度までの配置を形成する。
（２） もう一つの態様では、「ＴＨＩ」化合物という用語は、水素相互作用を行うことができる少なくとも３個の表面に接近可能な基を有する化合物を表し、上記基の少なくとも３個は、順に水素受容体、水素供与体および水素供与体であり、３個の基は好ましくは非水素供与／受容基（例えば、芳香族または脂肪族メチレンまたはメチリデン基）の１−約５個の連続的な分子内原子によって離れており、従って、一連の三水素相互作用基を形成し、３個の基は独立して化合物の三次元コンホメーションでの平均的相対位置において約１−約１０オングストローム互いに間隔が空けられており、その中でこれらの三水素相互作用基は実質的に線状から約２４０°の角度までの配置を形成する。
一態様では、ＴＨＩ化合物の３個の連続する水素相互作用基は、独立して化合物の三次元コンホメーションでの平均的相対位置において約１−約８オングストローム互いに間隔を置くことができ、またはそれらは独立して約２−約６オングストローム互いに間隔を置くことができ、またはそれらは独立して約２−約５オングストローム互いに間隔を置くことができる。
「水素相互作用」および「水素相互作用する」とは、本明細書では基、好ましくは分子間基の間に形成される結合の意味で用いられ、これらの結合は水素の共有または移動を伴いかつイオンおよび／または水素結合相互作用によって形成される。これに関連して用いられる「水素受容体」および「水素供与体」という用語は、それぞれイオンまたは水素結合の形成において水素を受け取ることができるものおよびイオンまたは水素結合の形成において水素を供与することができるものである基を示している。
水素供与基の実例は、ヒドロキシル、セレノールおよびテルロール基、一および二置換アミノ(例えば、アミド、イミド、イミノ)基、および同族有機-リン、-ヒ素、-アンチモンおよび-ビスマス基、例えばホスフィン、アルシン、スチビンおよびビスムチン基 (X(III)に対してRXH2、R2XH、RX(R')HまたはR=XHであり、X=P、As、SbまたはBiであり、RおよびR'は有機残基である)、およびスルフヒドリル(チオールなど)基である。水素受容基の実例は、オキソ(例えば、カルボニル、ホスホキシなど)、オキサ、オキシド基および同族セレンおよびテルル基、例えばセロン (R=Se)、セレニド (R-Se-R)、およびテルリド (R-Te-R)基、アミノ基 (例えば、アミド、イミド、イミノなど)基、および同族ホスフィン、アルシン、スチビンおよびビスムチン基、およびチオ (例えば、チオカルボニル、チオンなど)、チア、スルフィド基である。
一態様では、THI化合物は、約2000ダルトン以下、または約1500ダルトン以下、または約1000ダルトン以下、または約750ダルトン以下の平均分子量を有することができる。一態様では、THI化合物は、約75ダルトン以上、または約100ダルトン以上、または約150ダルトン以上、または約200ダルトン以上の平均分子量を有することができる。
一態様では、THI化合物はアスコルベート類似体であることができる。アスコルビン酸は1,2-ジヒドロキシエチル置換した2,5-ジヒドロ-3,4-ジヒドロキシ-フラン-2-オンであり、すなわち、アスコルビン酸は5H-3,4-ジヒドロキシ-フラン-2-オンに基づいている (単一分子を記載するのに本明細書で用いられるように、「n-オキソ」または「n-オン」と組み合わせた「n-ヒドロまたは「nH」(但し、「n」は同一数である)のような用語の使用は、不飽和ケトン化合物における二重結合の配置を特定する目的で用いられ、必ずしも水素原子がオキソ基を有する炭素原子に結合していることを意味しない)。アスコルビン酸は、特に5-(1,2-ジヒドロキシエチル)-3,4-ジヒドロキシ-5H-フラン-2-オンまたは2-(1,2-ジヒドロキシエチル)-4,5-ジヒドロキシ-フラン-3-オンとも呼ばれる。本発明によるペプチドへのアスコルベートによる結合の少なくとも1種類の様式は、アスコルビン酸異性体および誘導体である多数のアスコルベート類似体並びに by多数のアスコルベート類似のフランオン、ピラノンおよびベンゾピラノン誘導体によっても共有されていると思われる。従って、これらは本明細書で用いられる用語である「アスコルベート類似体」に包含され、その代表例としてはアスコルベート類似体群I:
2,5-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-フラン-2-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体、好ましくは4-OH、4-ORまたは4-Rを含み、アスコルベート以外のものであり、その例としてエリスロベートが挙げられるもの、
4,5-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-フラン-4-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは2-OH、2-ORまたは2-Rを含むもの、
3-ヒドロキシ-4H-ピラン-4-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは2-OH、2-ORまたは2-Rを含むもの、
5,6-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4H-ピラン-4-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは2-OH、2-ORまたは2-Rを含むもの、
5,6-ジヒドロ-4-ヒドロキシ-2H-ピラン-5-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは3-OH、3-ORまたは3-Rを含むもの、
3-ヒドロキシ-2H-ピラン-2-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは4-OH、4-ORまたは4-Rを含むもの、
5,6-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-2H-ピラン-2-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは4-OH、4-ORまたは4-Rを含むもの、
5-ヒドロキシ-4H-1,3-ジオキセン-4-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは6-OH、6-ORまたは6-Rを含むもの、
3-ヒドロキシ-2H-1-ベンゾピラン-2-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは4-OH、-ORまたは4-Rを含むもの、
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(4a、5、6、7、8、8a位の隣接する対または複数の対)-3-ヒドロキシ-2H-1-ベンゾピラン-2-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは4-OH、4-ORまたは4-Rを含むもの、
3-ヒドロキシ-4H-1-ベンゾピラン-4-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは2-OH、2-ORまたは2-Rを含むもの、および
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(4a、5、6、7、8、8a位の隣接する対または複数の対)-3-ヒドロキシ-4H-1-ベンゾピラン-4-オンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体であって、好ましくは2-OH、2-ORまたは2-Rを含むもの、およびフラボノールを含むそれらの誘導体
が挙げられ、その代表的な有用な生合成例としては、表1に挙げたものが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2008537887
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(4a、5、6、7、8、8a位の隣接する対または複数の対)として記載される上記ベンゾピラノン型アスコルベート類似体の中で、一態様では、4a,8a-ジヒドロであるものが好ましい。
2-、3-、4-または6-OH、-ORまたは-Rとして記載される上記アスコルベート類似体の中で、一態様では、それぞれ2-、3-、4-または6-OHまたは-ORであるものが好ましく、一態様では、それぞれ 2-、3-、4-または6-OHであるものが好ましい。
上記アスコルベート類似体に関して、一態様では、上記R基の好ましい例としては、C1-C8アリファチル(アリファチル)、C1-C8ヒドロキシアリファチル、飽和、不飽和または芳香族シクロペンチルおよびシクロヘキシル(およびそれらの置換誘導体)、および飽和、不飽和または芳香族ヒドロキシシクロペンチルおよびヒドロキシシクロヘキシル(およびそれらの置換誘導体)が挙げられる。「ヒドロキシアリファチル」のようなヒドロキシル含有基である有機R基では、ヒドロキシ基の数は好ましくは1-4であり、好ましくは1-3であり、好ましくは1または2である。上記に示されるOR基は、任意の薬学上許容可能な有機または無機エステル基であることもでき、その実例としては、それぞれ1) C1-C18オキソ酸エステル基、好ましくはC1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-10、C1-C8、C1-C6またはC1-C4オキソ酸エステル基およびそれらのチオ酸同等物、および 2) ホスホキソおよびスルホキソエステル基、好ましくはホスフェート、ホスホネートおよびスルホネートエステル基が挙げられる。上記環構造および置換基としては、少数の環炭素原子の代わりに(複数の)ヘテロ原子、例えば単または二重結合したアザ、ボラ、またはホスファ置換基が挙げられ、ヘテロ原子置換態様では、(複数の)置換基はアザであることができる。アスコルベート類似体群Iとしては、上記基のいずれかのイン・ビボで転換可能な前駆体、 例えばデヒドロアスコルビン酸、および例えば上記化合物のいずれかのイン・ビボで加水分解可能な薬学上許容可能なエーテルおよびエステルも挙げられる。上記のもののいずれかの薬学上許容可能な塩も、この群に包含される。
アスコルベート類似体としては、アスコルベート類似体群IIのものも挙げられ、これは任意の1以上の上記アスコルベート類似体群I環構造 (および/またはアスコルベート環構造)であって、上記環の炭素 (および/またはアザ、ボラ、またはホスファ)原子の対または複数対を介して融合した、ジイルまたはイルイリデン残基によって架橋した、1または2個の単結合によってまたは二重結合によって直接結合したものを含む一層大きな環状化合物からなっている。
一態様では、2,5-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-フラン-2-オンアスコルベート類似体は、5-置換-3,4-ジヒドロキシ-5H-フラン-2-オンであることができる。このような態様の置換基の好ましい例としては、アルコールおよびポリオール置換基が挙げられる。一態様では、アスコルベート類似体は、5-(カルカノリル)-3,4-ジヒドロキシ-5H-フラン-2-オンのいずれであることもでき、アルカノール置換基は好ましくはヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルまたはヒドロキシブチル基のようなC1-C8、C1-C6またはC1-C4アルコールであり、その好ましい態様は5-(ヒドロキシメチル)-3,4-ジヒドロキシ-5H-フラン-2-オン、すなわちエリスロアスコルビン酸である。
一態様では、アスコルベート類似体はアスコルベート以外の5-(ポリオールイル)-3,4-ジヒドロキシ-5H-フラン-2-オンであって、ポリオール置換基は任意のポリオール、すなわちポリオールという用語はジオール、例えばグリコール、およびトリオール、例えばグリセロールを包含するもののいずれであることもできる。ポリオール置換基は、好ましくは少なくとも2個のヒドロキシル基を有しかつ好ましくはヒドロキシル基数対炭素原子数の比が約1:4以上であり、好ましくは約1:3以上であり、または約1:2以上であるC1-C18、C1-C16、C1-C14、C1-C12、C1-C10、C1-C8、C1-C6またはC1-C4ポリオールであることができる。好ましい態様では、ポリオールは末端ヒドロキシル基を有することができる。好ましい態様では、ポリオールヒドロキシル基-炭素原子比が約1:1であることができる。ポリオール置換基の好ましい例としては、ジヒドロキシエチル、ジ-およびトリ-ヒドロキシプロピル、ジ-、トリ-およびテトラ-ヒドロキシブチル基を挙げることができる。ジヒドロキシエチル-置換化合物の好ましい一例は、5-(1,2-ジヒドロキシエチル)- 3,4-ジヒドロキシ-5H-フラン-2-オン、すなわちエリソルビン酸である。
1:1のヒドロキシル基対炭素原子比を有する上記ポリオール-置換アスコルベート類似体の一態様では、ポリオール基はポリ(ヒドロキシメチレン)基であることができる。一態様では、ポリオール置換基として用いられるポリ(ヒドロキシメチレン)基は2-約8ヒドロキシメチレン単位、または2-約6、または2-約4の上記単位を有することができる。好ましい態様では、ポリ(ヒドロキシメチレン)基は、n-ポリ(ヒドロキシメチレン)基であることができる。一態様では、ポリオールはグリシトール、すなわちそれぞれアルドースまたはケトースのアルディトールまたはケトール同族体であることができる。グリシトール類の例としては、テトリトール、ペンチトール、ヘキシトール、へプチトールおよびオクチトールが挙げられる。グリシトールの好ましい例としては、エリトリトール、スレイトール、アラビニトール、リキシトール、リビトール、キシリトール、アリトール、アルトリトール、ガラクチトール、グリシトール(ソルビトール)、グリトール、イジトール、マンニトール、タガトールおよびタリトールが挙げられる。一態様では、アスコルベート類似体は、上記のいずれかの5-(アルコリルまたはポリオリル-3,4-ジヒドロキシ-5H-チオフラン-2-オン変異体であることができる。
一態様では、アスコルベート類似体4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-3-オンのいずれかであることができ、例えば、クロコン酸、すなわち4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-l,2,3-トリオン、4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-[(l,3)または(2,3)]-ジオン、4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-1-(モノ-またはポリ-ヒドロキシアルキル)-2,3-ジオン、および4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-1-(モノ-またはポリ-ヒドロキシアルキル)-3-オンが挙げられる。このようなアスコルベート類似体の好ましい態様では、類似体は4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-1-(モノ-またはポリ-ヒドロキシアルキル)-2,3-ジオンまたは4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-1-(モノ-またはポリ-ヒドロキシアルキル)-3-オンであり、好ましくは(複数の)モノ-またはポリ-ヒドロキシアルキル置換基がそれぞれ前節に記載のヒドロキシアルキルまたはポリオール基であることができ、好ましくはこのような4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-1-(モノ-またはポリ-ヒドロキシアルキル)-3-オンであることができる。
本明細書で用いることができる他の類似体としては、例えば、任意の環状の1-オキサ-2-オキソ-3,4-ジヒドロキシ-3-エンのようなこれらの4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-3-オンの同族体(これらのものは互いに関連している)、好ましくは上記の環状の1-オキサ-2-オキソ-3,4-ジヒドロキシ-5-(モノ-またはポリ-ヒドロキシ アルキル)-3-エンが挙げられる。上記のクロコン酸およびその関連構造体の同族体を用いることができ、これらの例としてはデルト(deltic)、スクワル(squaric)およびロージゾ(rhodizonic)酸およびそれらの関連した1-オキソ-2,3-ジヒドロキシ-2-シクロブテン、1-オキサ-2-オキソ-3,4-ジヒドロキシ-3-シクロブテン-1-オキソ-2,3-ジヒドロキシ-2-シクロヘキセンおよび1-オキサ-2-オキソ-3,4,-ジヒドロキシ-3-シクロヘキセン構造体、例えば、2,3-ジ-および2,3,5,6-テトラ-ヒドロキシキノンが挙げられる。
これらの好ましいアスコルベート類似体構造の総ては、レダクトン(reductone)基、すなわちシス-1,2-エンジオール基のビシナル(隣接して結合した)カルボニル基を含む少なくとも1個の環を有し、これらの構造体の好ましい態様の例は、カルボニルが同じ環の環オキサ原子にビシナルであるものである。従って、好ましい態様では、類似体はレダクトンであることができる。レダクトンの好ましい例としては、サッカリドレダクトンが挙げられ、その中で好ましいものはモノサッカリドレダクトン、例えばテトロース、テトルロース、ペントース、ペンチュロース、ヘキソース、ヘクスロース、ヘプトースおよびヘプチュロースレダクトンである。
一態様では、アスコルベート類似体は、上記のもののいずれかの2-チオ-4,5-ジヒドロキシ-4-シクロペンテン-3-オン変異体であることができる。本明細書に記載の他のアスコルベート類似体も、同様に例えば、ピランまたはフラン環酸素原子または環エポキシ基酸素原子のような環酸素原子のチオ置換基を含むこともできる。アスコルベート類似体は、1単位を上回る量のアスコルベート類似体をもう一つのアスコルベート類似体 (同一または異なる)またはアスコルベートと共に含む化合物、複合体および塩、例えば、ビス-アスコルベート化合物またはジ-アスコルベート塩の同族体 (例えば、バナジウムジアスコルベート)を包含し、下記のモルフィンおよびキレート化剤 (例えば、EDTA)類似体も同様に1を上回る量の上記単位を含むこともできる。
モルフィンは、N-メチル-5、6、9、10、13、14-ヘキサヒドロ-3,6-ジヒドロキシ-4,5-エポキシ-9,13-イミノエタノ-フェナントレン(標準的モルフィンナンバリング法による)であり、これはN-メチル-3,4,9,10,4a,10a-ヘキサヒドロ-3,6-ジヒドロキシ-4,5-エポキシ-4a,10-イミノエタノ-フェナントレンとも代替的に記載される。本発明によるペプチドへのモルフィンの結合の少なくとも1つの様式は、多数のモルフィン異性体および誘導体、並びに多数のモルフィンに類似したフェナントレン、フルオレンおよびインダセン誘導体によっても共有されていると思われる。従って、これらは本明細書で用いられる用語としての「モルフィン類似体」に包含され、その代表例としては、モルフィン類似体群I:
モルフィン異性体および誘導体であって、その例としては、ノルモルフィン、ジヒドロモルフィン、ヒドロモルフォン、モルフォン、ナロキソン、ナルトレキソン、ノルオキシモルフォン、オキシモルフォンが挙げられるが、これらに限定されないもの、
3,6-ジヒドロキシ-4,5-エポキシ-フェナントレンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体、
ジ-、テトラ-、ヘキサ-またはオクタ-ヒドロ-(5、6、7、8、9、10、13、14位の任意の隣接した対または複数の対)-3,6-ジヒドロキシ-4,5-エポキシ-フェナントレンおよびそれらのモノおよびポリ-置換誘導体、
ジ-、テトラ-、ヘキサ-またはオクタ-ヒドロ-(5、6、7、8、9、10、13、14位の任意の隣接した対または複数の対)-[5,6-または6,7-ジヒドロ]-3-ヒドロキシ-6-オキソ-4,5-エポキシ-フェナントレン、
1,8-ジヒドロキシ-9-オキサ-9H-フルオレンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体、
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(4b、5、6、7、8、8a位の任意の隣接した対または複数の対)-1,8-ジヒドロキシ-9-オキサ-9H-フルオレンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体、
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(4b、5、6、7、8、8a位の任意の隣接した対または複数の対)-[7,8-または8,8a-ジヒドロ]-1-ヒドロキシ-8-オキソ-9-オキサ-9H-フルオレンおよびそれらのモノおよびポリ-置換誘導体、
1,7-ジヒドロキシ-8-オキサ-7H,8H-(s)-インダセンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体、
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(3a、4、4a、5、6、7a位の任意の隣接した対または複数の対)-1,7-ジヒドロキシ-8-オキサ-7H,8H-(s)-インダセンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体、
1-ヒドロキシ-7-オキソ-8-オキサ-7H,8H-(s)-インダセンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体、および
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(3a、4、4a、5、6、7a位の任意の隣接した対または複数の対)-1-ヒドロキシ-7-オキソ-8-オキサ-7H,8H-(s)-インダセンおよびそれらのモノおよびポリ置換誘導体
のものが挙げられる。
ジ-、テトラ-,ヘキサ-、またはオクタ-ヒドロ-(5、6、7、8、9、10、13、14位の任意の隣接した対または複数の対)として定義される上記フェナントレン型モルフィン類似体の中では、一態様では、5、6、9、10、13、14位の任意の隣接した対または複数の対でのジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロであるものが好ましく、またもう一つの態様では、5、6、13、14位の任意の隣接した対または複数の対でのジ-またはテトラ-ヒドロが好ましい。
ジ-、テトラ-またはヘキサ-ヒドロ-(4b、5、6、7、8、8a位の任意の隣接した対または複数の対)として定義される上記フルオレン型モルフィン類似体の中では、一態様では、4b、5、8、8a位の任意の隣接した対または複数の対でのジ-またはテトラ-ヒドロが好ましい。
ジ-、テトラ-、またはヘキサ-ヒドロ-(3a、4、4a、5、6、7a位の任意の隣接した対または複数の対)として定義される上記インダセン型モルフィン類似体の中では、一態様では、3a、4、4a、7a位の任意の隣接した対または複数の対でのジ-またはテトラ-ヒドロが好ましく、もう一つの態様では、4a,7a-ジヒドロが好ましい。
上記環構造および置換基としては、少数の環炭素原子の代わりに(複数の)ヘテロ原子、例えば単または二重結合したアザ、ボラ、またはホスファ置換基を挙げることができ、ヘテロ原子置換態様では、(複数の)置換基はアザであることができる。モルフィン類似体群Iには、イン・ビボで加水分解可能な薬学上許容可能なエーテルおよびエステルなどの上記基のいずれかのイン・ビボで転換可能な前駆体も包含され、これらの前駆体の例としては、ヘロイン、すなわち3-O,6-O-ジアセチルモルフィン、モルフィン-6-O-ホスフェート、およびモルフォン-3-O-スルフェートが挙げられる。モルフィン類似体としては、モルフィン類似体群IIのものも挙げられ、これは任意の1以上の上記モルフィン類似体群I環構造 (および/またはモルフィン環構造)であって、上記環の炭素 (および/またはアザ、ボラ、またはホスファ)原子の対または複数対を介して融合した、ジイルまたはイルイリデン残基によって架橋した、1または2個の単結合によってまたは二重結合によって直接結合したものを含む一層大きな環状化合物からなっている。
E1結合化合物は、本発明によるE1ペプチドに結合する任意のもの(E1、TM3およびE1-TM3結合ペプチドなど)であり、それらの例としては、アスコルベート、モルフィンおよびEDTA、および上記のようなアスコルベート、モルフィンおよびEDTA類似体が挙げられる。好ましいアスコルベート、モルフィンおよびEDTA類似体は、約4以下、好ましくは約1-約4の正のlogP値を有することができる。E1結合化合物は、1種類以上のアミン作動性化合物、 すなわち天然または合成であり、または直接的または間接的に作用するとしないとに関わらず、1種類以上の生体アミン受容体アゴニストまたはアンタゴニストと共に同時投与することができる。例えば、アドレナリン受容体の場合には、E1結合化合物は、治療中、またはＧＰＣＲ調節、連結、または調節または連結阻害活性について化合物の試験中にアドレナリン作動性化合物と同時投与することができる。
アミン作動性化合物
本明細書で有用なアミン作動性化合物は、生体アミン受容体に直接的または間接的に作用しまたは拮抗する薬学上許容可能な化合物である。一態様では、アミン作動性化合物は受容体結合部位リガンド、すなわち直接的アゴニストまたはアンタゴニストであることができる。多種多様なアミン作動性化合物が当該技術分野で知られており、アミン作動性化合物の実例は、アドレナリン作動性、ドパミン作動性、ヒスタミン作動性、ムスカリン作動性およびセロトニン作動性化合物の主要クラスについて下記に提供する。本発明によるアミン作動性化合物は、薬学上許容可能なその塩およびエステルおよびその混合物、並びにそれへイン・ビボ転換することができるそれらの前駆体を包含する。
アドレナリン作動性化合物
本明細書で用いられるアドレナリン作動性化合物は、αまたはβアドレナリン受容体に直接的または間接的に作用しまたは拮抗し、交感神経興奮性応答を誘発する薬学上許容可能な化合物である。一態様では、アドレナリン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち直接的アゴニストまたはアンタゴニストであることができる。多くのアドレナリン作動性化合物が当該技術分野で知られており、Goodman and Gillman著「治療薬の薬理学的基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)」, 第8版 (1990年)(その内容は、その開示の一部として本明細書に引用)に記載のものが挙げられる。本明細書で用いられるアドレナリン作動性化合物としては、アルブテロール、アマンタジン、アンフェタミン、アチパメゾール、ベンゼフェタミン、ビトルテロール、クロルプロマジン、クロニジン、コルテロール、デキストロアンフェタミン、ジエチルプロピオン、ドブタミン、ドパミン、エフェドリン、エピネフリン、エチルノルエピネフリン、フェンフルラミン、フェノテロール、ガナベンズ、ガンファシン、ヒドロキシアンフェタミン、イソエタリン、イソプロテレノール、レボドーパ、メフェンキセルミン、メタプロテレノール、メタラニノール、メタンフェタミン、メトキサミン、 メチルドーパ、 メチルフェンデート、ノルエピネフリン、オキシメタゾリン、ペモリン、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンテルミン、フェニレフリン、フェニルエチルアミン、フェニルプロパノールアミン、ピルブテロール、プレナルテロール、プロクロルペラジン、プロピルヘキセドリン、シュドエフェドリン、リトドリン、テルブタリン、テオフィリン、チラミン、ヨヒンビン、およびそれらの誘導体、薬学上許容可能なその塩およびエステル、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものが挙げられる。
ドパミン作動性化合物
本明細書で用いられるドパミン作動性化合物は、ドパミン受容体に直接的または間接的に作用しまたは拮抗する薬学上許容可能な化合物である。一態様では、ドパミン作動性化合物は受容体結合部位リガンド、すなわち直接的アゴニストまたはアンタゴニストであることができる。当該技術分野で知られている多くのドパミン作動性化合物としては、例えば置換ドパミン誘導体、キンピロール、2-アミノ-5,6-ジヒドロキシ- 1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン、ペルゴリド、アポモルフィン、ハロペリドール、ドムペリドン、メタクロプラミド、フルフェナジン、フルペンチキソール、スルピリド、フェノチアジン(例えば、チオリダジン)、ナロキソンおよびブロモクリプチンがある。ドパミン作動性化合物の前駆体の一例は、L-ドーパ(L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン)である。
ヒスタミン作動性化合物
本明細書で用いられるヒスタミン作動性化合物は、ヒスタミン受容体に直接的または間接的に作用しまたは拮抗する薬学上許容可能な化合物である。一態様では、ヒスタミン作動性化合物は受容体結合部位リガンド、すなわち直接的アゴニストまたはアンタゴニストであることができる。当該技術分野で知られている多くのヒスタミン作動性化合物には、例えば置換ヒスタミン誘導体、例えば4-メチルヒスタミン、N-α-メチルヒスタミン、R-α-メチルヒスタミン、2-フェニルヒスタミン(例えば、2-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]ヒスタミン、N-α-メチル-2-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]ヒスタミン)、2-(2-ピリジル)エチルアミン、ヒスタプロジフェン (2-[2-(3,3-ジフェニルプロピル)-1H-イミダゾール-4-イル]エチルアミン)、N-メチル-ヒスタプロジフェン、N-α-2-[(1H-イミダゾール-4-イル)エチル]ヒスタプロジフェン、(6-[2-(4-イミダゾリル)エチルアミノ]-N-(4-トリフルオロメチルフェニル)ヘプタンカルボキサミド)、デクスクロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、アンタミン、クロザピン、クロベンプロピット、ジマプリット、イメタイト、イメピップ、インプロミジン、(+)-クロルフェニラミン、シメチジン、シプロキシファン、クロベンプロピット、ピリラミン/メピラミン、ラニチジン、チオペラミド、チオチジンおよびトリプロリジンがある。
ムスカリン作動性化合物
本明細書で用いられるムスカリン作動性化合物は、ムスカリンアセチルコリン受容体に直接的または間接的に作用しまたは拮抗する薬学上許容可能な化合物である。一態様では、ムスカリン作動性化合物は受容体結合部位リガンド、すなわち直接的アゴニストまたはアンタゴニストであることができる。当該技術分野で知られている多くのムスカリン作動性化合物には、例えば置換アセチルコリン誘導体、アセクリジン、アレコリン、アトロピン、ベンズヘキソール、ベンズトロピン、セビメリン、2-エチル-8-メチル-2,8-ジアザスピロ(4.5)デカン-1,3-ジオン、R-(Z)-(+)-α-(メトキシイミノ)-1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン-3-アセトニトリル、ミラメリン、オキソトレモリン、ピロカルピン、ピレンゼピン、スコポラミン、タルサクリジン、テレンゼピン、トリヘキシフェニジルおよびキサノメリンがある。
セロトニン作動性化合物
本明細書で用いられるセロトニン作動性化合物は、セロトニン受容体に直接的または間接的に作用しまたは拮抗する薬学上許容可能な化合物である。一態様では、セロトニン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち直接的アゴニストまたはアンタゴニストであることができる。当該技術分野で知られている多くのセロトニン作動性化合物には、例えば、置換5-ヒドロキシ-トリプタミン誘導体、例えば5-メトキシトリプタミン、a-メチル-5-ヒドロキシトリプタミン、5-カルボキサミドトリプタミン、2-エチル-5-メトキシ-N,N-ジメチルトリプタミン、アンフェタミン、例えば、2,5-ジメトキシ-4-ハロアンフェタミン、2,5-ジメトキシ-4-メタンフェタミン、エルゴタミンおよびリセルゲート誘導体、例えば、リセルギン酸ジエチルアミド、ジヒドロエルゴタミン、アルモトリプタン、ブスピロン、クロルプロマジン、クロザピン、シサプリド、シアノピンドロール、シプロヘプタジン、デクスフェンフルラミン、デクストロメトロファン、ドラセトロン、ドニトリプタン、エレトリプタン、エルトプラジン、フェンフルラミン、フルオキセチン、フルボキサミン、ゲピロン、グラニセトロン、ケタンセリン、ロキサピン、メペリジン、メスレルジン、メチオテピン、メテルゴリン、メチセルジド、メトクロプラミド、ミアンセリン、ナラトリプタン、1-ナフチルピペラジン、ネファゾドン、オランザピン、オンダンセトロン、パロキセチン、ピンドロール、プロプラノロール、リスペリドン、リタンセリン、リザトリプタン、スピペロン、セルトラリン、スマトリプタン、トロピセトロン、ゾルミトリプタン、8-ヒドロキシ-ジプロピルアミノテトラリンおよび2-(2-メチル-4-クロロフェノキシ)プロパン酸がある。
スクリーニング試験形式
ＧＰＣＲE1結合剤は、本発明によるペプチドを用いて同定することができる。本明細書で用いられるＧＰＣＲE1結合剤は、本明細書に記載の生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合ペプチドに結合する任意の化合物であり、アスコルベート結合E1ペプチド、TM3ペプチドおよびE1-TM3ペプチドのいずれか1つを包含している。ＧＰＣＲE1結合剤は、「E1結合剤」とも呼ばれる。スクリーニング試験を用いて、イン・ビボでE1アロステリックモジュレーター、E1アロステリック調節阻害剤、E1立体モジュレーター、E1自動調節リガンド、またはE1調節耐性リガンドとして機能するまたは機能すると思われる化合物を同定することができる。
本発明によるスクリーニングの方法において、化合物-ペプチド結合を検出する試験形式は、アスコルベート結合ペプチドに結合する(すなわち、E1、TM3またはE1-TM3の配列を有する)化合物の直接的または間接的試験であることができる。直接的試験形式の例としては、例えば、化合物に結合したペプチドを検出するものであって、ペプチドはそのＧＰＣＲ部分としてＧＰＣＲアスコルベート結合配列のみを含むもの、または化合物に結合したペプチドを検出しかつ結合の位置がアスコルベート結合部分(E1、TM3またはE1-TM3配列)上にあることを示すものであって、後者の形式は、ペプチドがＧＰＣＲアスコルベート結合部分より多くのＧＰＣＲ配列を含む態様で好ましい。間接的試験形式の一例は、例えば、結合試験反応媒質中に試験化合物と共に存在する既知のアスコルベート結合-ペプチドを結合する化合物 (例えば、アスコルベート、モルフィンまたはEDTA)の結合の減少を検出するものである。
本発明によるスクリーニング法は、イン・ビトロ、イン・ビボ、または細胞中で行うことができる。好ましい態様では、第一のまたは初期のスクリーニングはイン・ビトロで行うことができ、イン・ビトロアッセイの一態様では、用いられる結合ペプチドは約8残基の長さ、または約15残基の長さ、または約20、30または40残基の長さであることができ、イン・ビトロアッセイの一態様では、用いられる結合ペプチドは少なくともＧＰＣＲの実質的に全TM2-E1-TM3部分であることができ、またはそのＧＰＣＲ配列部分のようなアミノ酸配列を有することができ、ペプチドは細胞膜の表面に提示することができる。第一のまたは初期のスクリーニングをイン・ビトロで行い、アスコルベート結合ペプチドに結合する化合物を同定する場合には、好ましくは更なる化合物のスクリーニングを生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的に完全なTM2-TM7部分または全ＧＰＣＲ配列を含む一層大きなペプチドを用いて行うことができる。第二のスクリーニングは、好ましくは細胞中またはイン・ビボで行われる。生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的に完全なTM2-TM7部分または全ＧＰＣＲ配列を有するペプチドを用いる細胞中またはイン・ビボ試験の好ましい態様では、試験は細胞のGタンパク質共役応答の測定を含むことができる。
本明細書に記載されているように、E1アロステリックモジュレーターは、生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合部分に結合することによってリガンド結合または既に結合したリガンドに対するＧＰＣＲ応答を調節する化合物であり、E1アロステリック調節阻害剤は、ＧＰＣＲの調節を行うことなく同様に結合することによってモジュレーターによる結合を阻害する化合物である。E1立体モジュレーターは同様に結合するが、ＧＰＣＲリガンドによるリガンド部位の接近を阻害するもう一つの残基を含んでいる。E1自動調節リガンドは同様に結合するが、リガンド結合部位に結合することによってＧＰＣＲ応答を活性化しかつ調節するもう一つの残基を含んでおり、E1調節耐性リガンドはリガンド結合部位に結合するが、E1アロステリックモジュレーターおよび/またはE1アロステリック調節阻害剤によって(ＧＰＣＲの調節を行うことなしにE1ループに接近しまたは結合することによってこの残基によって)アスコルベート結合部位への結合を阻害するもう一つの残基を含んでいる。
既知のアスコルベート結合-ペプチド結合化合物が本発明によるスクリーニングアッセイに用いられる場合には、アスコルベート、モルフィンまたはEDTAが好ましい。既知の生体アミンＧＰＣＲリガンド(アゴニストまたはアンタゴニスト)が本発明によるスクリーニングアッセイに用いられる場合には、アミン作動性化合物が好ましい。典型的なアミン作動性化合物を、以下に示す。本発明によるスクリーニングアッセイの好ましい態様では、試験化合物は下記のアスコルベート、モルフィンまたはEDTA類似体のいずれであることもできる。好ましい態様では、アスコルベート、モルフィンまたはEDTA、またはアスコルベート、モルフィンまたはEDTA類似体がアミン作動性化合物に共有結合している試験化合物を提供することができ、このような「二残基」試験化合物の好ましい態様では、化合物の一方は「既知の」アスコルベート結合-ペプチド結合化合物または「既知の」ＧＰＣＲリガンドであることができる。
アドレナリン作動性化合物補体
本発明の組成物および方法のアドレナリン作動性化合物補体は、アドレナリン作動性化合物に対する補体である化合物を含んでなる。好ましい「補体」は、所定の組成物または方法では、上記組成物または方法に用いられるアドレナリン作動性化合物に結合する化合物である。このような「結合」は、共有結合以外の手段により補体とアドレナリン作動性化合物との物理化学的相互作用による複合体の形成である。このような結合は、開示の一部として本明細書に引用されている下記の文献に記載されている。Root-Bernstein and Dillon, 「分子相補性I: 生命の起源および進化の相補性理論(Molecular Complementarity I: The Complementarity Theory of the Origin and Evolution of Life)」, J Theoretical Biology 188: 447-449 (1997)、および Root-Bernstein, 「カテコールアミンはエンケファリン、モルフィセチンおよびモルフィンに結合する(Catecholamines Bind to Enkephalins, Morphiceptin, and Morphine) 」, Brain Research Bulletin 18: 509-532 (1987) 、および Root-Bernstein and Dillon, 「ベンチャーリサーチの促進: アスコルベートはアドレナリン作動薬活性を高めるという発見のケーススターディ(Fostering Venture Research: A Case Study of the Discovery that ascorbate Enhances Drug Activity)」, Drug Research Development 57:58-74 (2002)。本明細書で用いられるこのような結合および補体は、2002年4月4日に公表されたPCT特許公表WO 02/26233号明細書, Root-Bernstein et al.に記載されている。
好ましい補体としては、アスコルベート、その誘導体、薬学上許容可能なそれらの塩およびエステル、およびそれらの混合物が挙げられる。「薬学上許容可能な塩」は、任意の酸性(例えば、カルボニル)基で形成したカチオン性塩、または任意の塩基性(例えば、アミノ)基で形成したアニオン性塩である。多くのこのような塩が当該技術分野で知られており、例えば、1987年9月11日に公表された世界特許公表第87/05297号明細書, Johnston et al.にも記載されている(その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている)。好ましいカチオン性塩としては、アルカリ金属塩 (例えば、ナトリウムおよびカリウム)、およびアルカリ土類金属塩 (例えば、マグネシウムおよびカルシウム)が挙げられる。好ましいアニオン性塩としては、ハロゲン化物 (例えば、塩化物塩)が挙げられる。「薬学上許容可能なエステル」は、本明細書で用いられる化合物の活性を本質的に妨げないまたはヒトまたは下等動物患者によって容易に代謝されて活性化合物を生成するエステルである。
アスコルベートとしては、アスコルビン酸、およびその薬学誘導体および代謝物が挙げられる。好ましいアスコルベートとしては、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、L-アスコルビン酸、L-アスコルベート、デヒドロアスコルビン酸、デヒドロソアスコルベート、 2-メチル-アスコルビン酸、 2-メチル-アスコルベート、アスコルビン酸2-リン酸塩、アスコルビン酸2-硫酸塩、L-アスコルビン酸カルシウム二水和物、L-アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビルエステル、およびそれらの混合物が挙げられる。アスコルビン酸は、特に好ましいアスコルベートである。
他の適当な補体としては、オピオイドおよびポリカルボン酸キレート化剤が挙げられる。オピオイドとしては、オピエートおよびその合成誘導体が挙げられる。好ましいオピオイドとしては、モルフィン、アポモルフィン、コデイン、モルフィセチン、ディノルフィン、ナロキソン、キョトルフィン、メタドン、ナルトレキソン、フェンタニル、ペンタゾクリン、ブトルファノール、レボルファノール、レバロルファン、マルブフィン、ブプレノルフィン、ナロルフィン、ベンゾモルファン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、ヒドロコドン、オキシコドン、ナルメフェン、ナルブフィン、エンケファリン、エンドルフィン (例えば、Met-エンケファリンおよびLeu-エンケファリン)、およびそれらの混合物が挙げられる。ポリカルボン酸キレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸、それらの薬学上許容可能な塩およびそれらの混合物が挙げられる。L-リボースおよびアデノシン誘導体としては、L-リボース、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、サイクリックアデノシン一リン酸、およびそれらの混合物が挙げられる。
Ｇタンパク質共役受容体
Ｇタンパク質共役受容体 (ＧＰＣＲ)は、細胞内ヘテロ三量体性Gタンパク質の活性の補充および調節を行う。Gタンパク質共役受容体は多様であり、光、臭気および味のような外因性刺激と共に、生体アミン、ペプチド、糖タンパク質、脂質、ヌクレオチド、イオンおよびプロテーゼなどの一連の内因性リガンドと相互作用することができる。図1に示されているように、総てのＧＰＣＲは、交代する細胞内ループ14 (il、i2およびi3)および細胞外ループ16 (e1、e2およびe3)によって接続され、アミノ末端18は細胞外側20にありかつカルボキシ末端22細胞内側24にある7個の膜貫通α螺旋状セグメント12 (TMI、TMII、TMIII、TMIV、TMV、TMVIおよびTMVII)の構造的特徴を共有している。1つがe1にありかつ1つがe2にある2個のシステイン残基はほとんどのＧＰＣＲで保存され、7個の膜貫通へリックスの多数のコンホメーションのパッキングおよび安定化に重要なジスルフィド結合を形成することができる。(Bockaert, J. and Pin, J.P., Gタンパク質共役受容体の分子修理: 進化と成功(Molecular Tinkering of G Protein-Coupled Receptors: An Evolutionary Success), European Molecular Biology Organization Journal, 18 no. 7 (1999) 1723-1729、および Gether, U., Gタンパク質共役受容体の活性化に関与する分子機構の発見(Uncovering Molecular Mechanisms Involved in活性化 of G Protein Coupled Receptors), Endocrine Reviews, 21 no. 1 (2000) 90-113を参照されたい)。
アドレナリン受容体
アドレナリン受容体(AR)またはアドレナリン受容体は、内因性カテコールアミンであるエピネフリンおよびノルエピネフリンと結合するGタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)である。本明細書で用いられる「カテコールアミン」は、ホルモンまたは神経伝達物質として作用するチロシン由来の化合物である。カテコールアミンとしては、アルブテロール、ドパミン、エフェドリン、レバドーパ、ノルエピネフリン、オキシメタゾリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、シュドエフリン、テオフィリン、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
アドレナリン受容体はファミリーAまたはクラスAのロドプシン様受容体に属しており、これはαアドレナリン受容体 (α-1およびα-2)およびβアドレナリン受容体を包含する。この受容体は更に9個のサブタイプ:α-1-A/D、α-1-B、α-1-C、α-2A、α-2B、α-2C、β1、β2およびβ3に分類される。この9個のサブタイプにはかなりの異種性が存在し、それぞれ異なる遺伝子によってコードされ、特異的な薬剤相互作用および制御特性を示す。
ある種のアドレナリン受容体を本明細書に例示することができるが、患者の病気または状態によって、本発明の態様を修飾して、アドレナリン受容体の型および活性のいずれかに当てはめることができる。態様の選択で考慮するものとしては、受容体の位置および作用が挙げられ、例えば、α-1受容体は皮膚および消化管系に存在し、主として血管で作用して血管収縮を引き起こし、α-2受容体シナプス前神経末端にあり、β1受容体は心臓組織にあって心拍数を増加させ、β2受容体は骨格筋の血管にあって血管拡張を引き起こし、筋肉への血流を増加しかつ全末梢抵抗を減少させ、およびβ3受容体は脂肪組織にあって代謝調節の役割を有している。
様々な態様では、アドレナリン受容体は活性コンホメーション状態を有するのが好ましい。活性コンホメーション状態としては、二次および三次構造が挙げられ、その構造の折り畳みは非共有的相互作用によって安定化される。遺伝子工学処理を施したアドレナリン受容体を用いる態様では、受容体を適当な非共有的相互作用を有するように工学処理を行い、工学処理した分子の三次構造がその分子の天然に存在するものの活性コンホメーションと同一であるようにすることができる。
アドレナリン受容体の結合ポケット
ＧＰＣＲ、ロドプシンと同様に、膜貫通タンパク質ドメインの幾つかはアドレナリン作動性および他の生体アミン受容体の活性化に用いられる。2個のＧＰＣＲ保存されたシステイン残基であって、elの1つおよびe2の1つは分子コンホメーションのパッキングおよび安定化に重要なジスルフィド結合を形成する。ロドプシンでは、 Cys110およびCys187は他の遊離スルフヒドリル基と共にロドプシン活性化およびリガンド結合に不可欠である。β2アドレナリン作動性および他の生体アミンＧＰＣＲでは、配列番号1-10のCys 12または配列番号14-207のCys 29(配列番号14-207に示した挿入変異体では、Cys 30とナンバリング)として示されるe1 Cys残基などのCys残基の同等な対も同様に重要である。幾つかの生体アミンＧＰＣＲでは、もう一つのCys残基も受容体活性化およびリガンド結合に重要であると考えられており、このCysは、例えば、列挙された微量アミン受容体配列またはラットの生体アミンＧＰＣＲコンセンサス配列に示されるように、配列番号1-10の残基位置4または配列番号14-207の21位を占めている。Rubenstein, L.A. and Lanzara, R.G., Gタンパク質共役受容体の活性化にはアゴニスト結合のシステイン調節を伴う(Activation of G Protein Coupled Receptors Entails Cysteine Modulation of Agonist Binding), Journal of Molecular Structure (Theochem) 430 (1998) 57-71、および Piascik, M.T. and Perez, D.M., α1-アドレナリン受容体: 新たな見通しと方向(α1-Adrenergic Receptors: New Insights and Directions), The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 298 no. 2 (2001) 403-410を参照されたい。
クラスA ＧＰＣＲリガンドは、TM-III、TMIV3 TMV、TMVIおよびTMVIIによって形成されたキャビティーで結合する。α-1受容体へのアゴニストの結合に関与する残基としては、TMs III、IV、V、VIおよびVIIが挙げられる。残基involved in結合 ofs to theβ2アドレナリン受容体へのアゴニストおよびアンタゴニストの結合に関与する残基は、TMs III、V、VIおよびVIIに見られる。
アドレナリン受容体のサブタイプのそれぞれでは、幾つかの非システイン残基も受容体活性化および結合部位の動力学に影響を与える。例えば、α-1アドレナリン受容体では、4個の膜貫通領域の8個の残基、Asp106(TMIII)、Phe163(TMIV)、Ser192 (TMV)、Ser188 (TMV)、Phe187 (TMV)、Val185 (TMV)、Phe288 (TMVI)、およびMet292 (TMVI)が、アゴニスト結合で同定されている。β2アドレナリン受容体では、TMVIIのアスパラギンがある種のアンタゴニストと特異的に相互作用することが示されている。β2アドレナリン作動性ポケットの重要な要素は、第二の細胞外ループをポケットに折り畳んで高アフィニティー結合部位を形成することによって形成される(Shi L、Javitch JA. Annual Rev Pharmacol Toxicol 42, 437-467 (2002))。更にもう一つの例は、TMIIIにおけるアスパラギン酸であり、アドレナリン作動性アゴニストおよびアンタゴニストの両方に対する共通相互作用点として働く。
ＳＶＣＴとの生体アミン受容体の相同性
図2に示されるように、α1Aアドレナリン受容体におけるCys99とAsp107の領域およびβ2アドレナリン受容体におけるCys106とAsp113の領域は、両方とも高度に保存されている。また、配列表1に示されるように、同族体CysとAsp残基および領域に介在する同族体は、一般的に脊椎動物または少なくとも哺乳類の生体アミン受容体では高度に保存される。同様なシステインおよびアスパラギン酸残基は、ナトリウム依存性ビタミンC輸送体SVCT1およびSVCT2へのリガンド結合においても高度に保存される。
SVCT1およびSVCT2に対する追加の相同性は、E1ループおよびE1ループ-近位TM3配列中にも存在する。例えば、α1Aおよびβ2アドレナリン受容体の配列構造はSVCT1およびSVCT2と高水準の相同性を示し、修飾または置換はごく僅かであり、多くの置換基は同一カテゴリーの残基(すなわち、親水性、酸性; 親水性、塩基性; 極性、無帯電;または疎水性)にある。図3に示されるように、ヒトαおよびβアドレナリン受容体(AR)、並びにヒトドパミンD1AおよびD1B (DR)およびヒスタミンH1受容体 (HR)は、輸送体および受容体の両方で高度に保存された領域においてナトリウム依存性アスコルベート輸送体SVCT1およびSVCT2 (それぞれSVC1およびSVC2と記載)に高度の相同性を示す。縦または斜の実線は同一アミノ酸を表し、点線は保存された置換を表し、データーは2004年2月27日にwww.expasy.chからアクセスしたSwissProtデーターベースにおける相同性を検索するためのLALIGNを用いて得た。ARでは、太い下線を付けたシステイン(C)およびアスパラギン酸(D)残基はリガンド結合および受容体活性化に関与し、この領域に隣接するアスコルベート結合の作製はAR活性化の調節を意味すると思われる。また、配列番号15-207の生体アミンＧＰＣＲ配列の比較によって、ヒトおよび脊椎動物動物において一般的にこれらの受容体では実質的なE1およびE1-近位TM3配列相同性 (同一残基および類似または保存的に置換された残基の配列) が明らかにされる。
例えば、図2の幅広棒線に隣接した示された配列の中心セグメントとして示されるβ2アドレナリン受容体の第一の細胞外ループ全体は、SVCT1およびSVCT2に相同性である。生体アミン受容体とSVC輸送体の間の緊密な関係および類似性から、E1結合化合物に対する可能な結合機構の見通しが提供される。E1ループにおける類似の特徴を共有することに加えて、パーキンソン病および様々な心疾患に重要なドパミン受容体は、ドパミンＧＰＣＲ第二の細胞外ループ(E2)上の2つのナトリウム依存性ビタミンC輸送体に高度の類似性を有する第二の領域を有すると思われる。SVCTに相同なE1ループは、生体アミン受容体のアミン作動性結合部位に直ぐ隣接し、および/または重複している可能性がある。
アドレナリン受容体活性化およびＳＶＣＴ
アミン作動性化合物のようなアドレナリン作動性リガンドが認識されると、受容体はコンホメーションを変化させてGタンパク質を活性化し、これは受容体から脱離する。1つのコンホメーション変化モデルでは、ＧＰＣＲ受容体は、不活性コンホメーション(R)と活性コンホメーション(R*)の間を平衡を保ちながら移動する。アゴニストがない場合には、ＧＰＣＲは不活性コンホメーションである。それにも拘わらず、不活性コンホメーションと活性コンホメーションの間のエネルギーバリヤーが低いため、幾つかの受容体は自発的に活性コンホメーションを採る。アゴニストは活性コンホメーションに高いアフィニティーを有し、これにより平衡を移動する。インバースアゴニストまたはアゴニスト依存性受容体活性を阻害する能力を有する化合物は、不活性状態を安定化しR*から平衡を移動させる。中性アンタゴニストは、活性および不活性状態のいずれでも同じアフィニティーで結合し、平衡を中断しない化合物である。
もう一つのコンホメーション変化モデルでは、複数のコンホメーション状態は、リガンドに対する生物学的応答によって決定され、これは、リガンドが最高のアフィニティーで結合するコンホメーションによって決定される。例えば、好ましいコンホメーションが活性であると認識されると、化合物またはリガンドはアゴニストのように機能する。好ましいコンホメーションが不活性であれば、リガンドはインバースアゴニストのように機能する。アゴニストとアンタゴニストは、アゴニストとアンタゴニストが相互に排他的に結合する別個の受容体コンホメーションを安定化する。
いかなる機構やモデルによって限定しようとするものではないが、アスコルベートはそのアゴニストに対してアドレナリン受容体に結合してその感受性を増加させると思われ、この受容体はアスコルベートを還元状態および更なる酸化防止剤活性について利用可能に保持する。隣接アミノ酸残基の分極によるCys106残基によって、β2アドレナリン受容体が高アフィニティー状態になった。重要なジスルフィド結合に直ぐ隣接しまたは重複している第一の細胞外ループへアスコルベートが結合することによって、アドレナリン受容体が高アフィニティー状態保持される。これらのシステインはpH感受性が極めて高く、受容体自身の観察されたpHを伝達する(L.A. Rubenstein, R. G. Lanzara, J. Molec. Struc. 430, 57-71 (1998))。更に、Met-およびCys含有ペプチドとアドレナリン受容体自身がアスコルベートを還元するという事実は、もう一つの Cys含有ペプチドであるグルタチオンによりアスコルベートの詳細に特性決定された参加-還元サイクルに類似のアスコルベートと第一の細胞外ループとの間の酸化-還元サイクルを示唆している。このジスルフィド結合に直ぐ隣接しかつ重複している可能性のあるアスコルベート結合部位の存在は、受容体活性の伝達の新規な機構を表している。
第一の細胞外ループは、アスコルベートがアドレナリン受容体活性を高める妥当と思われる機構を示唆している。アドレナリン受容体へのエピネフリン結合は、His79、Asp113、Ser203、Ser204およびSer207を含む一連の特異的アミノ酸相互作用によって伝達される。(Shi L、Javitch JA. Annual Rev Pharmacol Toxicol 42, 437-467 (2002)、および L.A. Rubenstein, R. G. Lanzara, J. Molec. Struc. 430, 57-71 (1998))。これらのアミノ酸を適当に配置してエピネフリンを結合させるには、第二の細胞外ループを膜貫通領域に折り畳み、Cys170(第二のループ)とCys106(第一のループ)の間にジスルフィド結合を形成する必要がある。
単離核酸
本発明の態様としては、任意の生体アミンＧＰＣＲE1-アミノ酸配列またはアスコルベート輸送タンパク質(例えば、SVCT1またはSVCT2)の任意のアスコルベート結合部分のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする様々な種類の単離された核酸が挙げられる。本明細書で用いられる核酸は、デオキシリボース核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドである。「核酸」としては、ヌクレオチド類似体から作製されるRNAおよびDNAの同等物、誘導体および変異体、および記載されている態様に応用可能な一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖のポリヌクレオチドが挙げられる。DNAまたはRNAのような本明細書で用いられる「単離」核酸は、他のDNAまたはRNA分子から離れてた分子であって、高分子の天然供給源に存在するものを表す。単離したという用語も、組換えDNA技術によって産生したときに細胞材料、ウイルス材料または培養基を実質的に含まない核酸またはペプチドを表す。単離した核酸としては、更に自然状態では見出されない核酸断片が挙げられる。「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、遺伝子発現生成物を表し、互換的に用いられる。「組換えタンパク質」とは、組換えDNA技術によって産生されるポリペプチドを表し、一般に、ポリペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入される。
幾つかの態様では、天然または生きている供給源由来の核酸を有するのが望ましい。好ましいDNAおよび核酸の天然供給源は、哺乳類、ヒトおよびヒト以外の下等動物である。「ヒト以外の下等」動物としては、齧歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類または爬虫類が挙げられる。好ましいヒト以外の動物としては、ヒツジおよびウマが挙げられる。
本発明の態様の核酸断片は、当該技術分野で周知でありかつ例えば、Sambrook, J. Fritsch, E. F.およびManiatis, T. (1989) 分子クローニング: 実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載の方法に準じて調製することができる。別々の断片を、制限酵素を用いて調製し、クローニングすることができる。あるいは、別々の断片を、例えば生体アミンＧＰＣＲまたは生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合セグメントを含むその断片（すなわち、Ｅ１ループ、ＴＭ３ドメインまたは組合せＥ１−ＴＭ３セグメントからのもの）のコード配列に隣接する長さが薬８ヌクレオチド以上の活性ＧＰＣＲ配列と同一または相補性の核酸塩基配列のような適当な配列を有するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて調製することができる。ＰＣＲを同様に、少なくともアスコルベート輸送タンパク質のアスコルベート結合セグメントに隣接する鋳型核酸の領域に相補性となるように配列を選択するプライマーと共に用いることができる。更に、これらのペプチドの保存的置換変異体をコードする核酸、並びに上記のいずれかに同一または相補性の核酸塩基配列を有する核酸類似体は、本発明の態様の範囲内にある。
本発明による核酸を用いて、アスコルベート結合ペプチドアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを生合成することができる。例えば、配列番号13は、組合せE1-TM3アスコルベート結合ペプチド配列セグメントを包含する脊椎動物生体アミンＧＰＣＲコンセンサス配列を含むポリペプチドの合成に用いられる典型的DNA配列である。
本発明によるポリペプチドを発現するために、所定の細胞または細胞溶解生成物が本発明による生体アミンＧＰＣＲアスコルベート結合ペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現することができる任意の（複数の）ポリペプチドを用いることができる。従って、生体アミンＧＰＣＲのアミノ酸配列の一部または少なくとも一部を有するポリペプチドをコードする任意の組換えまたは単離された核酸を用いることができ、上記の一部はＧＰＣＲＥ１、ＴＭ３、またはＥ１−ＴＭ３アスコルベート結合ペプチドのアミノ酸配列を包含する。そのためのコード配列の好ましい一態様では、核酸は配列番号１３のヌクレオチド１−１３２を含んでなることができ、好ましい一態様では、配列番号１３のヌクレオチド３４−９９の配列、好ましくは配列番号１３のヌクレオチド５２−９６または５５−９０または６４−８７または５２−１０８または８５−１０８または６４−１０８、またはそのコード−縮重コドン−置換変異体、またはそれらに少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含んでなることができる。
本発明によるポリペプチドを発現するため、生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を、このコード配列を発現するのに選択された発現宿主細胞が用いることができる転写および翻訳調節要素に操作結合させることができる。コード配列のクローニング、操作結合および発現に用いられる典型的手法およびポリヌクレオチド調節要素は、当該技術分野で周知であり、例えば、FM Ausubel et al., 分子生物学要説(Short Protocols in Molecular Biology) (1999) (第4版; John Wiley & Sons); T Maniatis et al., 分子クローニング: 実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (1989) (第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press); CR Newton & A Graham, PCR (1997) (第2版; 入門バイオテクノロジーシリーズ(Introduction to Biotechniques Series); Springer Verlag); W Ream & K Field, (1998) 分子生物学の手法: 集中実験室コース(Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course) (1998) (Academic Press)を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
ポリペプチドの発現に用いられる細胞、またはその発現に用いられる溶解生成物を提供する細胞は、当該技術分野で知られている任意の発現宿主細胞であることができる。この細胞としては、単細胞生物、培養細胞、および組織または多細胞生物の一部である細胞が挙げられる。好ましい種類の細胞としては、植物細胞(例えば、双子葉植物、単子葉植物、苔)、動物細胞 (例えば、昆虫、哺乳類)、および微生物細胞、例えば、原生生物 (例えば、藻類)、真菌(Aspergillus、Chrysosporium、Fusarium、Neurospora、Trichoderma)、酵母 (例えば、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia)および細菌 (例えば、Bacillus、Escherichia、Pseudomonas、Ralstonia、Rhizobium、Streptomyces、Xanthomonas)細胞が挙げられる。細胞溶解生成物発現系の例としては、核酸がアスコルベート結合ペプチドアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのコード配列を含んでなるmRNAであるものが挙げられ、一般的例としては、ウサギ網状赤血球溶解生成物および小麦麦芽無細胞発現系が挙げられる。壁細胞を選択する場合には、原形質またはスフェロプラストの形態で提供することができる。
ポリペプチドが、例えば、生体アミンＧＰＣＲの少なくともTM2-TM7部分であって、その部分がシグナル伝達ＧＰＣＲとして機能する本発明によるアッセイを選択し、そのアッセイがこのようなシグナル伝達活性の検出を伴う場合には、好ましくは、(複数の)細胞は(複数の)真核細胞、好ましくは植物、原生生物、動物、真菌、酵母、またはヒト細胞であり、好ましくは動物様原生生物、真菌様原生生物、動物、酵母、またはヒト細胞、好ましくは脊椎動物動物またはヒト細胞、好ましくは哺乳類動物またはヒト細胞であることができる。この種のアッセイの好ましい態様では、発現宿主細胞をアッセイ自身に用いることができ、または細胞質体、小胞、または膜埋設されたポリペプチドを含むそれらの他の細胞断片をアッセイに用いることができる。
生体アミンＧＰＣＲアスコルベート結合ペプチドアミノ酸配列を含んでなる本発明によるポリペプチドは、当該技術分野で知られている任意の所望な形式で発現させることができる。例えば、一態様では、ペプチドを、発現宿主細胞、任意の形態のウイルスキャプシド、任意の種類のウイルス様粒子、または選択された宿主細胞によって産生することができる任意のマルチ-ポリペプチド集合体の表面に提示して発現させることができる。一態様では、ペプチドをアスコルベート結合ペプチド配列の合成コンカテマーとして発現させることができ、そのようなコンカテマー内の総てのアスコルベート結合ペプチド配列は同一であることができ、またはそれらは変化することができる。このようなコンカテマーを本発明のアッセイに用いることができ、またはそれを最初に異なるアスコルベート結合ペプチド部分に切断し、それぞれの部分が 以上のアスコルベート結合ペプチド配列を含むようにすることができる。一態様では、ポリペプチドは、合成後には吸収により、吸着により、または共有的または非共有的テザーリング(tethering)によって固体表面または界面領域、例えば親油性-親油性界面、膜-水性界面に固定することができる。免疫-固定または免疫-沈澱を用いることができる。(複数の)ペプチドを、例えばリポソーム、デンドリマー(dendrimers)、ナノ粒子、ビーズ、ゲル、スライド、プレート、または容器壁 (例えば、容器最上部と底部を含む側部、上部および下部壁)に結合させることができる。
本発明による核酸および核酸類似体は、ＧＰＣＲ関連以外であっても少なくとも可能性のあるアスコルベート結合ペプチドコード配列DNAおよびRNAを更に同定するための方法で用いることもできる。このような方法はハイブリダイゼーションプロービングを伴い、用いられるプローブ核酸または類似体を検出可能な標識に結合して提供することができる。任意の核酸塩基含有ポリマーであって、塩基が少なくとも活性核酸の塩基と近似的に同じ間隔を示すものを核酸類似体として用いることができる。核酸類似体の例としては、Gustafsson et al.に対する米国特許公開第２００４／０２５３７２８号明細書（２００４年１２月１６日）に記載のペプチド核酸および核酸類似体が挙げられる。
従って、本発明による他の少なくとも可能性のあるアスコルベート結合ペプチドコード配列を同定する方法は、アスコルベート結合ペプチドコード配列と同一または相補性の塩基配列を有する核酸または核酸類似体を、ハイブリダイゼーションが起こり得るストリンジェンシーの条件下で少なくとも1種類の試験ポリヌクレオチドと接触させることによって、結合対を形成し、それによって形成した(複数の)結合対の存在を検出し、試験ポリヌクレオチドの同一性が知られていない場合には、試験ポリヌクレオチドを更に特性決定してそれを同定することを含んでなる。ストリンジェントハイブリダイゼーションの条件は当該技術分野で周知であり、例えば、Giver et al.に対する米国特許第６，８５８，４２２号明細書（２００５年２月２２日）に記載のものが挙げられる。
あるいは、アスコルベート結合ペプチドアミノ酸配列またはそのコード配列の知識を用いて、生物情報科学的方法、例えば視覚による検査またはコンピューターによって実行される生体分子比較法を用いて、少なくとも潜在的にアスコルベート結合ペプチドをコードするまたはである核酸またはアミノ酸配列を更に同定することができる。
本明細書で用いられる核酸によってコードすることができるアミノ酸配列の例をも提供する本発明で用いられるペプチドの幾つかの典型例としては、ヒトSVCT1残基400-439 (配列番号11)、ヒトSVCT2残基459-498 (配列番号12)、ヒトアドレナリン受容体α1A残基71-115 (配列番号20)、およびヒトアドレナリン受容体β2残基78-122 (配列番号27)、および下記のそれらのペプチド断片が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様では、関連の結合化合物を同定するための結合試験に用いられるペプチド断片は、ヒトSVCT1残基: 400-425 (配列番号11残基1-26); 405-439 (配列番号11の残基6-40); 403-425 (配列番号11の残基4-26); 403-412 (配列番号11の残基4-13); 410-419 (配列番号11の残基11-20); 415-439 (配列番号11の残基16-40); 415-425 (配列番号11の残基16-26)、または 423-433 (配列番号11の残基24-34)のアミノ酸配列の任意の1つを有するアスコルビン酸輸送体ペプチドであることができる。
一態様では、関連の結合化合物を同定するための結合試験に用いられるペプチド断片は、ヒトSVCT2残基: 459-484 (配列番号12の残基1-26); 464-498 (配列番号12の残基6-40); 461-483 (配列番号12の残基3-25); 461-470 (配列番号12の残基3-12); 468-477 (配列番号12の残基10-19); 474-498 (配列番号12の残基16-40); 474-485 (配列番号12の残基16-27)、または 483-493 (配列番号12の残基25-35)のアミノ酸配列の任意の1つを有するアスコルビン酸輸送体ペプチドであることができる。
一態様では、関連の結合化合物を同定するための結合試験に用いられるペプチド断片は、ヒトα1Aアドレナリン受容体残基: 81-105 (配列番号20の残基11-35); 81-91 (配列番号20の残基11-21)、または 89-98 (配列番号20の残基19-28)のアミノ酸配列の任意の1つを有するアミン作動性ＧＰＣＲペプチドであることができる。一態様では、 関連の結合化合物を同定するための結合試験に用いられるペプチドは、ヒトβ2アドレナリン受容体残基: 89-113 (配列番号27の残基12-36); 89-99 (配列番号27の残基12-22)、または 97-106 (配列番号27の残基20-29)のアミノ酸配列の任意の1つを有するアミン作動性ＧＰＣＲペプチドであることができる。
アッセイキット
本発明のもう一つの態様は、アドレナリン受容体と共に用いられるアッセイに関する。様々な態様では、キットは、
(a)少なくとも1種類のアドレナリン受容体、
(b)試験化合物、および
(c) i. 受容体を試験化合物と接触させ、
ii. 結合アフィニティーを測定する
ことを含んでなるアドレナリン作動性化合物の使用説明書
を含んでなる。
このキットの成分は、異なる容器に包装し、一まとめにすることができる。アドレナリン受容体は、α−１−アドレナリン受容体（α−１−Ａ／Ｄ、α−１−Ｂおよびα−１−Ｃ）、α−２アドレナリン受容体（α−２Ａ、α−２Ｂおよびα−２Ｃ）、またはβアドレナリン受容体（β−１、β２およびβ３）を含むことができる。１種類のアドレナリン受容体または９つのサブタイプ総てを含むがこれらに限定されないアドレナリン受容体の任意の組合せを、１つのキットに一緒に包装することができる。例えば、１つのキットは、α−１Ｂおよびα−２Ｂアドレナリン受容体を含むことができ、もう一つのキット態様はβ−１、α−２Ａおよびα１Ｃアドレナリン受容体を含む。好ましい態様では、キットは更にアスコルベートを包含する。
アドレナリン受容体は活性コンホメーション状態にあることが好ましいが、キットは様々な供給源からの核酸を高度に精製しておよび最小限または無精製で包含することができる。断片または全アドレナリン受容体は、適当な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞で発現させることができる。断片は、単独でまたは他のタンパク質と融合して発現させることができる。
発現ベクターは、適当な宿主細胞で認識される適当な遺伝子制御要素に通常は操作結合した所望な抗原遺伝子またはその断片を含む自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構造体である。これらの制御要素は、適当な宿主中で発現することができる。発現を行うのに必要な特異的種類の制御要素は、用いられる最後の宿主細胞によって変化する。一般に、遺伝子制御要素は、原核プロモーター系または真核プロモーター発現制御システムを包含することができ、典型的には、転写プロモーター、転写の開始を制御するためのオプションオペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを高めるための転写エンハンサー、適当なリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終結する配列を包含することができる。発現ベクターは、通常は宿主細胞から独立してベクターを複製する複製起源をも含む。
本明細書で用いられるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片および他のＤＮＡ断片を宿主のゲノムに組込むことができる他のビヒクルを含んでなる。発現ベクターは、操作連結した遺伝子の発現を行う遺伝子制御要素を含む。プラスミドは最も一般に用いられるベクターの形態であるが、同等な機能を行いかつ当該技術分野で知られているまたは知られるようになるベクターの他の総ての形態は、本発明で用いるのに適している。例えば、Pouwels et al. (1985年および補遺) クローニングベクター: 実験室便覧(Cloning Vectors: A Laboratory Manual), E1sevier, N.Y.、およびRodriquez et al. (1988)(eds.)ベクター: 分子クローニングベクター概説およびその使用(Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses), Buttersworth, Boston, Mass.を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
形質転換細胞としては、細胞、好ましくは哺乳類細胞であって、アドレナリン受容体、典型的には組換えDNA技術を用いて構築したものを含むベクターで形質転換またはトランスフェクションしたものが挙げられる。
一般に、試験化合物は、アドレナリン受容体またはアドレナリン受容体結合部位に隣接する領域と相互作用する可能性を有する任意化合物である。本明細書で用いられる「相互作用」とは、分子間、例えば現存しているタンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−小分子、小分子−核酸、タンパク質−大分子および大分子−核酸の検出可能な相互作用を包含することを意味する。本明細書で用いられる 「小分子」は、分子量が約５ｋＤ未満の組成物である。小分子としては、核酸、ペプチド、ポリペプチド、擬似ペプチド、炭水化物、脂質、または他の有機または無機分子またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。小分子としては、真菌、細菌、または藻類抽出物の単一または生物学的混合物を挙げることもできる。本明細書で用いられる「大分子」としては、分子量が約５ｋＤより大きな分子が挙げられ、核酸、ペプチド、ポリペプチド、擬似ペプチド、炭水化物、脂質、または他の有機または無機分子、またはそれらの混合物が挙げられる。大分子はまた、真菌、細菌、または藻類抽出物、プラスミド、ベクター、または５ｋＤより大きな他の細胞の単一または生物学的混合物を包含することができる。
１を上回る任意成分を包装で提供する態様では、成分を変えることは本発明の範囲外ではない。１を上回るアドレナリン受容体または試験化合物を提供する態様では、幾つかの受容体または試験化合物をそれぞれ一緒に包装することができ、または一連の異なる容器に包装することができる。化合物の使用説明書は、受容体を試験化合物と接触させ、結合アフィニティー測定することを包含している。
方法
本発明の態様は、アドレナリン受容体の様々な方法および使用を包含している。一態様では、アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を伝達する化合物を同定する方法が提供される。本明細書で用いられる「調節する」または「伝達する」、およびそれらの変異体は、例えばアゴナイジングによるアップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激）、および例えば、生物活性のアンタゴナイジング（例えば、遺伝子の発現）によるダウンレギュレーション（すなわち、阻害または抑制）を表す。このような態様は、一般にアドレナリン受容体の結合ドメインを含んでなるポリペプチドを提供する。様々な態様は、好ましくは上記細胞外ループ１および／または２結合ドメインを包含することができる。
好ましくは、アドレナリン受容体はαアドレナリン受容体である。αアドレナリン受容体を用いる態様では、アドレナリン受容体は全受容体領域 および/または受容体領域のE1ループ含有断片を包含することができる。αアドレナリン受容体の残基71-115が、任意の断片または試料に包含されることが好ましく、更に好ましくは、残基88-99が包含される。
もう一つの好ましい態様では、アドレナリン受容体はβ2Aアドレナリン受容体である。β2Aアドレナリン受容体を用いる態様では、受容体は、全受容体領域および/または受容体領域の断片を包含することができる。β2Aアドレナリン受容体の残基78-122が任意の断片または試料に包含されるのが好ましく、更に好ましくは残基97-106が包含される。
ポリペプチドを、アドレナリン作動性化合物および試験化合物と接触させる。ポリペプチドをアドレナリン作動性化合物および試験化合物と接触させることにより、化合物の相互作用が生じる。上記のように、相互作用は、例えばタンパク質-タンパク質、タンパク質-核酸、タンパク質-小分子、小分子-核酸、タンパク質-大分子および大分子-核酸のような現存する分子間の検出可能な相互作用を包含する。
試験化合物は単独でアドレナリン受容体に関係している必要はなく、多様な範囲の化合物は教育、研究または薬剤開発の目的での試験に適していることが理解される。本発明の態様に準じる試験方法に適当な少数の例化合物としては、創傷治癒薬、抗生物質、感染防止薬、酸化防止薬、化学療法薬、抗癌薬、抗炎症薬、および増殖防止薬、堕胎薬、ace-阻害薬、αアドレナリン作動性アゴニスト、βアドレナリン作動性アゴニスト、α-アドレナリン作動性遮断薬、βアドレナリン作動性遮断薬、副腎皮質ステロイド、副腎皮質抑制薬、副腎皮質刺激ホルモン、アルコール抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤、アルドステロンアンタゴニスト、5-αレダクターゼ阻害剤、タンパク質同化薬、鎮痛薬、鎮痛薬、鎮痛薬、アンドロゲン、麻酔薬、麻酔薬、アンギオテンシン転換酵素阻害剤、食欲抑制薬、制酸薬、駆虫薬、アクネ防止薬、抗アレルギー薬、抗脱毛薬、抗アメーバ薬、抗アンドロゲン薬、抗狭心症薬、抗不整脈薬、抗動脈硬化薬、抗関節炎/抗リウマチ薬、抗喘息薬、抗菌薬、アミノグリコシド、アンフェニコール、アンサマイシン、βラクタム、リンコサミド、マクロライド、ポリペプチド、テトラサイクリン、抗菌薬、2,4-ジアミノピリミジン、ニトロフラン、キノロンおよび類似体、スルホンアミド、スルホン、抗生物質、胆石形成防止薬、抗コレステロール血症薬、抗コリン作動薬、抗血液凝固薬、抗痙攣薬、抗鬱薬、ヒドラジド/ヒドラジン、ピロリドン、テトラサイクリン、抗糖尿病薬、ビグアニド、ホルモン、スルホニル尿素誘導体、抗下痢薬、抗利尿薬、解毒薬、解毒薬、解毒薬、解毒薬、解毒薬、抗ジスキネア薬、抗湿疹薬、抗嘔吐薬、抗癲癇薬、抗エストロゲン薬、抗繊維症薬、抗膨満薬、抗真菌薬、ポリエン、アリルアミン、イミダゾール、トリアゾールおよび抗緑内障薬が挙げられるが、これらに限定されない。
他の適当な試験化合物としては、抗ウイルス薬、抗フソゲニック薬(anti-fusogenic agents)、血液脳関門ペプチド(BBBペプチド)、RGDペプチド、グルカゴン様ペプチド、抗ゴナドトロピン、抗痛風、抗出血および抗ヒスタミン薬、アルキルアミン誘導体、アミノアルキルエーテル、エチレンジアミン誘導体、ピペラジンおよび三環系、抗高コレステロール血症、抗高脂血症および抗高リポタンパク質血症薬、アリールオキシアルカン酸誘導体、胆汁酸金属イオン封鎖薬、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)レダクターゼ阻害剤、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモン/類似体、抗リン酸過剰血症、抗高血圧薬、アリールエタノールアミン誘導体アリールオキシプロパノールアミン誘導体、ベンゾチアジアジン誘導体、n-カルボキシアルキル誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン/フタラジン、イミダゾール誘導体、第四アンモニウム化合物、キナゾリニルピペラジン誘導体、レセルピン誘導体、スルホンアミド誘導体、抗甲状腺機能亢進薬、抗低血圧薬、抗甲状腺機能低下薬、感染防止薬、抗炎症薬、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体およびアリールカルボン酸が挙げられる。
更に一層適当な試験化合物としては、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、抗癩、抗白血病、抗脂肪血症、抗脂肪血症、抗マラリア、抗躁病、抗メトヘモグロビン血症、抗偏頭痛、抗真菌、制吐、抗腫瘍およびアルキル化薬、代謝拮抗薬、酵素、アンドロゲン、抗副腎薬、抗アンドロゲン薬、抗エストロゲン薬、(黄体形成ホルモン放出ホルモン)LR-RH類似体、プロゲストゲン、追加葉酸補給薬、尿道保護および抗骨粗鬆症薬が挙げられる。
他の可能性のある試験化合物としては、抗バジェット病、抗パーキンソン病、抗蠕動、抗褐色細胞腫、抗ニューモシスティス、抗前立腺肥大、抗原生動物、抗掻痒、抗乾癬および抗精神病薬、ブチロフェン、フェノチアジン、チオキサンテン、解熱、抗リウマチ、抗リケッチア、抗脂漏および防腐/消毒薬、アルコール、アルデヒド、染料、グアニジン、ハロゲン/ハロゲン化合物、水銀化合物、ニトロフラン、過酸化物/過マンガン酸塩、フェノール、キノリン、銀化合物、他のもの、抗痙攣、抗梅毒、抗血栓症、抗結核、抗腫瘍、鎮咳、抗潰瘍、抗尿結石、抗ベニン、抗眩暈および抗ウイルス薬、プリン/ピリミジン、抗不安薬、アリールピペラジン、ベンゾジアゼピン誘導体、カルバメート、収斂剤、ベンゾジアゼピンアンタゴニスト、β遮断薬、気管支拡張薬、エフェドリン誘導体、カルシウムチャンネル遮断薬、アリールアルキルアミン、ジヒドロピリジン誘導体、ピペラジン誘導体、カルシウム調節薬、カルシウム補助栄養食品、癌化学療法薬、毛細管保護薬、炭酸脱水酵素阻害薬、心臓抑制薬、強心薬、下剤、カチオン交換樹脂、コレシストキニン(CCK)アンタゴニスト、中枢神経系刺激薬、大脳血管拡張薬、キレート化剤、コレシストキニンアゴニスト、胆石溶解薬、胆汁分泌薬、コリン作動薬、コリンエステラーゼ阻害薬、コリンエステラーゼ再活性化剤、認識活性剤、避妊薬、眼内圧調節剤、転換酵素阻害薬、冠動脈拡張薬、細胞保護薬、デブリディング薬(debriding agents)、鬱血除去薬、脱色剤、ヘルペス状皮膚炎抑制薬、診断補助薬、消化補助薬、利尿薬、ベンゾチアジアジン誘導体、有機水銀、プテリジン、プリン、ステロイド、スルホンアミド誘導体、ウラシル、他のもの、ドパミンおよび受容体アゴニストが挙げられる。
試験化合物としては、ドパミン受容体アンタゴニスト、外部寄生生物撲滅薬、電解質補充薬、催吐薬、酵素、消化薬、ムコ多糖類加水分解薬、ペニシリン不活性化薬、タンパク質分解薬、酵素誘発薬、エストロゲンアンタゴニスト、去痰性胃および膵臓分泌刺激薬、胃プロトンポンプ阻害薬、胃液分泌阻害薬、糖質コルチコイド、α-グルコシダーゼ阻害薬、性腺刺激成分、性腺刺激ホルモン、痛風抑制薬、成長ホルモン阻害薬、成長ホルモン放出因子、成長刺激薬、造血薬、溶血薬、止血薬、ヘパリンアンタゴニスト、止血薬、ヒスタミンH1-受容体アンタゴニスト、ヒスタミンH2-受容体アンタゴニスト、催眠薬、低コレステロール血症薬および低脂血症薬も挙げられる。
試験化合物としては、低血圧薬、免疫調節薬、免疫抑制薬、強心薬、角質溶解剤、乳汁刺激ホルモン、緩下剤/下剤、LH-RHアゴニスト、脂肪増加症薬、局部麻酔薬、エリテマトーデス抑制薬、強力精神安定薬、鉱質コルチコイド、緩和精神安定薬、縮瞳薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、粘液溶解薬、筋肉弛緩薬、散瞳薬、麻酔薬、鎮痛薬、麻酔アンタゴニスト、鼻鬱血除去薬、神経弛緩薬、神経筋遮断薬、神経保護薬、NMDAアンタゴニスト、ヌートリピック薬(nootropic agents)、NSAID薬、オピオイド鎮痛薬、経口避妊薬および卵巣ホルモンが挙げられる。
試験化合物としては、分娩促進薬、血液脳関門タンパク質、GP-41ペプチド、向インスリン性ペプチド、副交感神経作動薬、殺シラミ薬、ペプシン阻害薬、末梢血管拡張薬、蠕動刺激薬、着色薬、血漿容積増量剤、カリウムチャンネル活性剤/開放薬、昇圧薬、プロゲステロン、プロラクチン阻害薬、プロスタグランジン/プロスタグランジン類似体、プロテアーゼ阻害薬、プロトンポンプ阻害薬、5α-レダクターゼ阻害薬、補給剤/補助栄養食品、呼吸刺激薬、逆転写酵素阻害薬、殺疥癬虫薬、硬化薬、鎮静/催眠薬、非環状ウレイド、アルコール、アミド、バルビツール酸誘導体、ベンゾジアゼピン誘導体、臭化物、カルバメート、クロラール誘導体、キナゾロン誘導体およびピペリジンジオンも挙げられる。
試験化合物としては、セロトニン受容体アゴニスト、セロトニン受容体アンタゴニスト、セロトニン摂取阻害薬、骨格筋弛緩薬、ソマトスタチン類似体、鎮痙薬、便通軟化剤、スクシニルコリン相乗剤、交感神経興奮薬、血栓溶解薬、甲状腺ホルモン、甲状腺阻害薬、甲状腺刺激ホルモン、早産防止薬、局部保護薬、尿酸排泄薬、血管拡張薬、血管収縮薬、血管保護薬、ビタミン/ビタミン供給源、抗キチン薬、抗壊血病薬および抗眼球乾燥薬、酵素補助因子、造血薬、血栓防止薬およびキサンテンオキシダーゼ阻害剤も挙げられる。
結合アフィニティー測定
次いで、アドレナリン作動性化合物の結合アフィニティーを、試験化合物の存在下にて測定する。アドレナリン作動性化合物結合の減少は、試験化合物がアドレナリン作動性化合物の受容体への結合を阻害することを示している。結合の増加は、試験化合物がアドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を促進または高めることを示している。上記のように、アドレナリン受容体へのアスコルベート結合は、第一の細胞外ループおよびその直接的膜貫通領域由来のペプチドに特異的に起こる。このような結合は、アドレナリン受容体上のアスコルベート結合領域を活性化する(高める)または失活する(遮断する)可能性について薬剤候補をスクリーニングする手段を提供する。
スクリーニングは、アドレナリン受容体自身で、必要ならば、隣接する膜貫通領域を含む細胞外ループの構造体、ループ由来のアスコルベート結合ペプチド、またはアスコルベート結合を保存しまたは高めるいずれかの誘導体または修飾物で行うことができる。このようなスクリーニングは、任意の形態のアフィニティー精製、アフィニティー捕捉、または結合手法(カラム、ピン、ゲル、ビオチン化など)、任意の束一的特性 (浸透圧、蒸気圧、電気分解伝導度など)の測定、任意の分離手法 (ペーパー、ゲルおよび毛細管電気泳動; ペーパー、ゲル、シリカまたは高圧液体クロマトグラフィー; タンデムマススペクトル分析法など);任意の分光光度法 (紫外、赤外、可視光線、円偏光二色性、核磁気共鳴、光散乱など);任意の免疫学的手法 (例えば、アスコルベート結合ペプチド、アドレナリン受容体領域などへの抗体結合を干渉)など当該技術分野で知られている任意の手法によって行うことができるが、これらに限定されない。結合アフィニティーの測定に適当な方法は、2001年6月5日発行のFreire, et al.の米国特許第6,242,190号明細書、2000年9月12日発行のNeri, et al.の米国特許第6,117,976号明細書、および1994年6月28日発行のFodor et al.の米国特許第5,324,633号明細書に引用されている。
更に、アスコルベート結合ペプチドについて結合特異性を示す本発明による抗体または抗体断片、またはもう一つの同様に特異的結合する分子、例えばこのような特異的結合を示すアプタマーを用いて、ＧＰＣＲ.の関連外であっても、少なくとも可能性のあるアスコルベート結合ペプチドを更に同定することができる。従って、本発明による少なくとも可能性のあるアスコルベート結合ペプチドを更に同定する方法は、抗アスコルベート結合ペプチド抗体、抗体断片、またはアプタマーを少なくとも1種類の試験ポリペプチドと特異的結合がそれらの間に起こる条件下で接触させることによって結合対を形成し、それによって形成した(複数の)結合対の存在を検出し、試験ポリヌクレオチドの同一性が知られていない場合には、試験ポリヌクレオチドを更に特性決定してそれを同定することを含んでなる。
本発明の様々な方法は、アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を阻害しまたは高める化合物の製造方法を包含している。アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を調節する化合物を上記の手段または他の適当な手段によって同定した後、同定した化合物を製造する。化合物の製造は、研究および調査目的の一般的な実験室合成、または大量のまたは限定された量での商業的製造を含むことができる。
他の新規薬剤は、Computer Aided Drug Design (CADD)またはComputer Assisted Molecular Modeling (CAMM)プログラムのようなコンピューターソフトウェアを用いてデ・ノボでデザインすることができる。適当なプログラムとしては、 Accelrys製のCerius2、Cambridge Soft製のChem3D Pro、Schroedinger, Inc.製のMacroModel、Tripos製のSybyl、またはAccelrys製のTSARが挙げられる。または、これらの新規薬剤は、受容体上で隣接結合部位に結合することができる化合物を活性化(または失活)する共有結合したアドレナリン作動性アスコルベートに基づくことができる。
医薬組成物
本発明は、アドレナリン作動性化合物をヒトまたは他の動物患者に投与するためのある新規な組成物および方法のデザインを包含する。従って、本発明で用いられる特異的化合物および組成物は、薬学上許容可能なものでなければならない。
本発明の組成物および方法は、好ましくは「相乗的」レベルでのアドレナリン作動性化合物とアスコルベートの投与を含んでなる。従って、アドレナリン作動性化合物と補体の組合せを投与することの治療効果は、アドレナリン作動性化合物と補体を個別的に投与することの追加的効果より大きい。このような効果としては、アドレナリン作動性化合物の効果の増加、アドレナリン作動性化合物の効果の期間の増加、およびその投与水準以外では効果が見られなくなるような組成物の投与水準で受容体に対してアミン作動性化合物を有効にすることの1以上を包含する。
本発明の組成物は、好ましくは単位投薬形態で提供される。本明細書で用いられる「単位投薬形態」は、ある量のアドレナリン作動性化合物と、良好な医学的実施に準じて単一用量でヒトまたは下等動物患者に投与するのに適する補体化合物を含む本発明の組成物である。
アドレナリン作動性化合物の投薬量
本発明の方法で有用な組成物は、アドレナリン作動性化合物の安全かつ有効量と、このアドレナリン作動性化合物の補体である化合物の安全かつ有効量とを含んでなる。好ましい補体はアスコルベートであり、アスコルビン酸が極めて好ましい。一態様では、本発明の好ましい組成物は、亜有効量(subefficacious amount)のアドレナリン作動性化合物を含んでなる。所定のアドレナリン作動性化合物の「亜有効量(subefficacious amount)」は、本発明の組成物または方法でヒトまたは他の動物患者に投与したときに安全かつ有効であるが、上記アドレナリン作動性化合物に対する補体なしで投与すると臨床的に無意味な効果を生じる量である。アドレナリン作動性化合物の「安全かつ有効」量は、ヒトまたは下等動物患者で過度の有害な副作用(毒性、刺激、またはアレルギー反応など)がなく所望な治療効果を有するのに十分な量であり、本発明のやり方で用いるときに合理的な利益/危険比と釣り合っている。アドレナリン作動性化合物の具体的安全かつ有効量は、治療を行う特定の疾患、患者の肉体条件、併用療法(もしあれば)の性質、用いる特異的アドレナリン作動性化合物、具体的投与経路および投薬形態、用いるキャリヤーおよび所望な投薬法のような要因によって変化する可能性がある。.
投薬形態および随意材料
本発明の組成物は、(例えば)経口、直腸、局所または非経口投与に適当な様々な形態のいずれかであることができる。所望な特定の投与経路によっては、様々な当該技術分野で知られている薬学上許容可能なキャリヤーを用いることができる。これらは、固形または液状充填剤、希釈剤、ヒドロトロープ剤、表面活性剤およびカプセル化物質を包含する。任意の医薬活性材料であって、アドレナリン作動性化合物の活性を実質的に妨げないものを包含することができる。アドレナリン作動性と補体化合物と共に用いられるキャリヤーの量は、単位用量当たりの投与について材料の実際量を提供するのに十分である。本発明の方法で有用な投薬形態を作製するための手法および組成物は、下記の文献に記載されており、それらの文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている: 7 最新の医薬(7 Modern Pharmaceutics). 第9および10章 (Banker & Rhodes, 編集, 1979); Lieberman et al., 医薬品の投薬形態: 錠剤(Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets) (1981)、および Anse1, 医薬品投薬形態入門(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms), 第2版 (1976)、および米国特許第5,646,139号明細書, White et al., 1997年7月8日発行。
特に、全身投与用の薬学上許容可能なキャリヤーとしては、砂糖、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水およびパイロジェン不含水が挙げられる。非経口投与用の好ましいキャリヤーとしては、プロピルエングリコール、オレイン酸エチル、ピロリドン、エタノールおよびゴマ油が挙げられる。好ましくは、非経口投与用の組成物における薬学上許容可能なキャリヤーは、総組成物の少なくとも約90重量%を含んでなる。
錠剤、カプセル、顆粒および散剤のような固形形態などの様々な経口投薬形態を用いることができる。錠剤は、圧縮し、錠剤を粉砕し、腸溶性コーティングを施し、糖コーティングを施し、フィルムコーティングを行い、または複数回圧縮することができ、適当な結合剤、滑沢剤、希釈剤、崩壊剤、着色料、フレーバー剤、流れ誘発剤および融解剤を含んでいる。液状経口投薬形態としては、水溶液、エマルション、懸濁液、非発泡性顆粒から再構成した溶液および/または懸濁液、および 発泡性顆粒から再構成した発泡性製剤が挙げられ、適当な溶媒、防腐剤、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、融解剤、着色料およびフレーバー剤を含んでいる。経口投与用の好ましいキャリヤーとしては、ゼラチン、プロピルエングリコール、綿実油およびゴマ油が挙げられる。
本発明の組成物は、患者の表皮または上皮組織に組成物を直接塗布しまたは塗り広げることによって、患者に局所投与することもできる。このような組成物としては、例えばローション、クリーム、溶液、ゲルおよび固形物が挙げられ、例えば、経皮的にまたは鼻内、肺 (例えば、気管支内吸入による)、目、または他の粘膜送達によって局部または全身投与することができる。皮膚での局所投与用の適当なキャリヤーは、好ましくは皮膚上の定位置に連続フィルムとして留まり、発汗または水への浸漬による除去に抵抗する。一般に、キャリヤーは有機性の性質のものであり、アドレナリン作動性および補体化合物を分散または溶解させることができる。キャリヤーは、薬学上許容可能な皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤および溶媒を含むことができる。
本発明のある態様のための薬学的キャリヤーは、吸入による投与のために操作可能である。吸入により粘膜投与に適当な処方物は、当該技術分野で知られている吸入装置によって分散させることができる形態でアドレナリン作動性および補体化合物の組成物を包含している。このような処方物は、好ましくは噴霧および気管支中での使用に適する液状または粉末状組成物、または計量した用量を投薬するエアゾールユニットを介して投与されるエアゾール組成物を含んでなる。適当な液状組成物は、水性の薬学上許容可能な吸乳剤溶媒, 例えば、等張食塩水または静菌水中の活性成分を含んでなる。溶液は、ポンプまたは圧搾によって始動した噴霧スプレーディスペンサーによって、または液状組成物の必要投薬量を肺に吸入させまたは吸入を可能とする任意の他の通常手段によって投与される。医薬組成物を送達するのに用いられる装置としては、噴霧器、明日ビレーター、吸入器、および鼻スプレーが挙げられるが、これらに限定されない。
噴霧器は、エアゾールを形成することによってまたはバルク液体を呼吸に適したガス中に懸濁した小滴に転換することによって作動する。特に、本発明で用いる噴霧器は、本発明によって提供される組成物の液状処方物を噴霧する。噴霧器は、空気、超音波、または振動などこれらに限定されない当該技術分野で知られている任意の方法によって噴霧されるミストを生成することができる。噴霧器は、更に内部バッフルを有することができる。この内部バッフルは、噴霧器のハウジングと一緒になってインパクション(impaction)によってミストから大きな液滴を選択的に除去し、これらの液滴をリザーバーに戻す。このようにして生成した細かいエアゾール小滴は吸入空気/酸素によって肺に運ばれる( 米国特許第6,667,344号明細書, Banerjee, et al., 2003年12月23日発行; 米国特許第6,340,023号明細書,E1kins, 2002年1月22日発行; 米国特許第5,586,561号明細書, Hillard, 1996年12月24日発行; 米国特許第5,355,872号明細書, Riggs, et al., 1994年10月18日発行; 米国特許第5,186,166号明細書, Riggs, et al., 1993年2月16日発行、および米国特許第4,865,027号明細書, Laanel et al., 1989年9月12日発行を参照されたい)。
典型的な吸入器としては、計量用量吸入器および乾燥粉末化吸入器が挙げられる。計量用量吸入器またはMDIは、液化噴射剤に溶解された医薬組成物または液化噴射剤に懸濁した微粉化粒子などの生成物を満たした耐圧キャニスターまたは容器である。医薬組成物の正確な投薬量が、患者の口腔咽頭部に送られる(米国特許第5,544,647号明細書, Jewett et al., 1996年8月13日発行)。
乾燥粉末吸入器は、加圧空気の供給源を用いて操作して医薬組成物の乾燥粉末粒子を生成させ、これを極めて小さな容積に圧縮する装置である。吸入のため、この装置は複数の室またはブリスターを有しており、それぞれに医薬組成物の1回用量および1回用量を放出するための選ばれた要素が入っている。(米国特許第6,642,275号明細書, Alfonso, et al. 2003年11月4日発行; 米国特許第6,626,173号明細書, Genova, et al., 2003年9月30日発行; 米国特許第5,694,920号明細書, Abrams, et al., 1997年12月9日発行; 米国特許第5,033,463号明細書, Cocozza, 1991年7月23日発行を参照されたい)。
適当な粉末組成物としては、例えばラクトースとまたは気管支内投与に許容可能な他の不活性粉末で十分に混合した活性成分の粉末状製剤が挙げられる。粉末組成物はエアゾールディスペンサーによって投与しまたは破ることができるカプセルに入れ、このカプセルは患者が装置に挿入して、カプセルに穴を空けて、吸入に適する一定気流で粉末を吹き出すことによって投与することができる。
組成物は、噴射剤、界面活性剤および補助溶媒を含むことができ、適当な計量弁によって閉じられる通常のエアゾール容器に充填することができる。
鼻スプレーも、本発明の態様に適している。好ましい鼻スプレーは、組成物成分の特性によって水溶液または懸濁液、油溶液または懸濁液、またはエマルションのような液状形態である。任意成分によって、刺激が最小限になり、適正な噴霧組成物および適当な送達が確保される。クエン酸塩、リン酸塩、およびグリシンのような緩衝剤により、鼻スプレーのpHを調整し、鼻への刺激を防止する。プロピレングリコールおよびグリセリンのような加湿剤も、鼻スプレーで有用である。ポリホスホエステル、ポリエチレングリコール、高分子量ポリ乳酸、微小球カプセル化剤、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、キトサンおよびポリスチレンスルホネートのような他の任意成分は、組成物の保持時間を高める。鼻スプレーは非加圧ディスペンサーに送られて、アドレナリン作動性補体の計量用量を提供する。
例１
表２に示される成分を有する本発明の態様の組成物を作製する。
Figure 2008537887
例２
例１の処方物１、２および３は気体状態であり、１０−２０分間の吸入によって投与する。
例３
キットは、1)少なくとも1種類の (A) 精製した生体アミンＧＰＣＲアスコルベート結合ペプチド、例えば、アミノ酸配列がヒトα1Aアドレナリン受容体残基89-114 (配列番号20の残基19-44)であるポリペプチド、または (B) 精製した生体アミンＧＰＣＲ、例えば、配列番号20の残基19-44を含んでなる精製したヒトα1Aアドレナリン受容体、または (C) 生体アミンＧＰＣＲ、例えば、β2アドレナリン受容体を有する平滑筋細胞を有する単離または培養細胞、または (D) 生体アミンＧＰＣＲを有する細胞、例えば、アドレナリン受容体を有する気管、心臓、または大動脈組織を含んでなる組織、および 2)1種類以上の既知のＧＰＣＲアスコルベート結合ペプチド結合化合物、例えば、アスコルビン酸 (例えば、15 mg/mlアスコルベート溶液)、および場合によっては、3)1種類以上の既知のアミン作動性化合物 (例えば、アルブテロールのようなアドレナリン作動性化合物、および/またはカルバコールのようなムスカリン作動性化合物)を備えている。キットは、更に生体アミンＧＰＣＲ結合効果、生体アミンＧＰＣＲアスコルベート結合ペプチド結合効果、または両方について任意の所望な化合物を試験するための使用説明書を含んでなる。
例４
Ascaris suum抗原に対する文書で照明された気道過敏症の全部で6頭のヒツジ (31-43 kg)を用いる。ヒツジは意識があり、改良型ショッピングカートに平伏位置で拘束されており、頭は固定されている。鼻通路を局所2%リドカインで麻酔し、バルーンカテーテルを一方の外鼻孔を通って下部食道へ押し込む。動物に、他の外鼻孔を通してカフ付気管内チューブを挿管する。平均肺気流抵抗 (RL)の呼吸測定によって呼吸を食道バルーン法を用いて測定する。人工物の燕下のない少なくとも5回の呼吸の平均を用いて、RLをcmH2O x L-1 x 秒の単位で得る。総てのエアゾールは、使い捨て可能な医学的噴霧器 (Raindrop(登録商標) Nelcor-Puritan Bennett, Carlsbad, CA、USA)を用いて生成させる。エアゾールは、500 mlの１回換気量および20回の呼吸/分の速度で送られる。RLを、ベースラインおよび2.0% w/v カルバコールの10回呼吸の直後に測定した。次に、ヒツジに、エアゾールアルブテロールまたはエアゾールアスコルベート-アルブテロール混合物の指定呼吸回数を、カルバコール投与の15分、30分、1時間および 2時間後に投与する。RLを、それぞれの治療の直後に測定する。対照試験は、カルバコール投与後に、アスコルベートのみ (15 mg/mlアスコルベート溶液10回換気)をそれぞれの時点で投与することを除き、同じ方法で行う。結果を図4に示す。
カルバコールのみ、カルバコールの後にアルブテロール1回換気、カルバコールの後にアルブテロール10回換気、およびカルバコールの後にアルブテロール+アスコルベート1回換気で治療した後のRLの経時変化を測定する。15、30および 60分後では、1回の呼吸にアスコルベートが含まれていると、10回の呼吸アルブテロール治療を含む他の3つの処理のいずれと比較しても、気流抵抗がかなり低くなる。アルブテロールを含まないAscの対照試験では、気流抵抗はいずれの時点においてもカルバコールのみを投与したものと余り変わらない。
例５
アスコルベートの効果を、以前は慢性閉塞性肺疾患として知られていた喘息様の炎症性閉塞性気道疾患である肺気腫のウマで試験する。肺気腫における気道閉塞の主因は、干し草を与えることによって誘発され、干し草からの埃によって炎症と気道閉塞が始まるコリン作動により伝達される気管支痙攣である。圧力変換器とフィジオグラフ(physiograph)に接続した食道バルーンにより、胸膜腔の圧を反映する食道圧を測定する。閉塞の重篤度を1回呼吸中の最高胸腔内圧の変化 (ΔPplmax)から評価し、ΔPplmaxが20 cmH2Oを上回るときには、鎮静剤を投与していないウマで実験を行う。超音波噴霧器によって発生したアスコルベートまたはビヒクルのエアゾールは、非再呼吸弁と顔マスクによってウマに送られる。アルブテロールは、ウマ用にデザインされた市販の吸入器(Torpex, Boehringer-Ingelheim Animal Health, St. Joseph, MO)によって目盛付き用量キャニスターから投与される。
無作為交叉実験では、6頭の肺気腫に罹ったウマに、ビヒクルまたはアスコルベート(15 mg/ml Asc溶液を噴霧器によって1 ml/分、4分間)を投与した後、アルブテロール (120、240、360および720μg)を投与した。ΔPplmaxを、ベースライン、ビヒクル/アスコルベート投与の15分後、およびそれぞれの用量のアルブテロールを投与の 15分後に測定し、データーをPplratio、すなわち薬剤投与後のΔPplmaxとベースラインにおけるΔPplmaxの比として表す。結果を図5に示す。ベースラインΔPplmaxは、ビヒクルまたはAsc投与前は変わらない(平均値 + SE、49.4 + 7.9 cmH2O)。ビヒクルの吸入後には、アルブテロールはPplratioを用量依存的に減少させ、最大効果は360μgの用量で達成される。アスコルベートで前処理すると、120および240μgアルブテロールに対する応答がかなり増強される。累積的用量応答対照試験では、Asc (0、5、10および15 mg/ml)は、ΔPplmaxに対してかなりの効果を示す。アスコルベートの後にアトロピン(0.02mg/kg IV)を投与すると、ΔPplmaxtが15分以内に20.3 ± 4.3 cmH2Oへ減少し、ウマは可逆的気管支痙攣に罹っていることを示している。結果を図6に示す。
例６
β 2アドレナリン受容体 (Sigma) が入手可能であるため、受容体に対するAscの効果を直接実験することができる。アドレナリン受容体は、50 mM Tris, 10%グリセロールおよび1% BSA, pH 7.4の溶液に31.4μM含まれている。アスコルベートを、20 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.4で500μM保存溶液として調製する。0、10、30および100μM Asc ± 1.26μM受容体を含む250μlの試料を3個ずつ調製する。アドレナリン受容体緩衝液とリン酸緩衝液の量は、総ての試料で一定である。それぞれの試料200μlを96穴プレートに加え、スペクトルをSpectramax分光光度計で2時間にわたり一連の反復読み中に190-310 nmまで1 nmの増加で集める。受容体の存在および非存在下における様々なアスコルベート濃度の溶液の蓄積したスペクトルおよび差スペクトル(AscとARを合せたものから個々のAscおよびAR溶液を差し引いたもの)を測定する。差スペクトルを用いて、分子の結合を定量的に検討することができる。分光光度計でUV光線に繰り返し暴露すると、UV光線への暴露がない場合の酸化速度と比較してアスコルベート酸化速度が著しく増加する。これにより、アスコルベート酸化に対するアドレナリン受容体の存在の効果を測定できる。アスコルビン酸の可逆酸化の受け容れられている反応経路によれば、アスコルベートアニオンは、モノ-または半-デヒドロアスコルベートとしても知られているアスコルベートフリーラジカルに可逆的に転換され、これはまた、デヒドロアスコルビン酸に可逆的に変換される。
結果を図7に示す。図7A-7Cのそれぞれは、試料を調製した後118、141、155、188、199および228分に集めた6個のスペクトルを重ねて記録したものを示している。AR + Asc試料 (AR + 10μM、30μMまたは100μM Asc) は互いに識別することができず、経時的に変化せず、Ascのみの試料(10μM、30μM、or 100μM Asc)のそれぞれの6個のスペクトルはアスコルベート酸化を示し、270 nm領域の吸収が減少する。図7D-7Fのそれぞれは、6個のAR+Ascスペクトルと対応するAscのみのスペクトルの差を示す。.これらの差スペクトルは、190-210 nmではアスコルベート濃度依存性増加を示し、10μMアスコルベートでは220-230 nmで、またARを含まないアスコルベート溶液溶液とARを含む非酸化性アスコルベートの差は260-270 nmの範囲で吸光度が減少する。
未処理スペクトルでは、1時間を上回る時間にわたって6個の連続的スペクトルがAR + 100 Asc、AR + 30 AscおよびAR + 10 Ascラインとして重ねられる。スペクトルは非常に一致しており、個々のスペクトルは識別できない。100 Asc (および30 Ascでは、少ない程度で)シリーズのラインでは、重なり合ったスペクトルは識別可能であり、Asc吸光度は265 nmに中心があり、経時的に消滅する。第二の差スペクトルは、3個の明確な領域を示している。265 nmでは、AR + Ascを含む6個の差スペクトルが再度重なり合い、それぞれのシリーズで上部ラインが厚くなる。下部のラインでは、100 Ascシリーズで極めて明確に見えた下部ライン、ARの非存在下でアスコルベートが酸化されるときに生成する。
10μM Ascシリーズでは、220-230 nmで吸光度が減少し、この半生理学的濃度ではアドレナリン受容体へのアスコルベートの結合が示唆されている。205 nmに中心がある領域では、吸光度はAsc濃度依存的に増加し、Ascの第二の結合であって、この結合は生理学的Asc濃度範囲にあることを示している。30および100μM Ascでは、1.26μM ARの存在によりAscの酸化を実質的に停止することができる。濃度差のため、この妨害は長時間の結合によるものではない。代わりに、ARは酸化したAscに結合してそれを還元し、追加の酸化したAscを用いてこの方法を繰り返す前に、それを放出することができる。異なる実験では、ヒトα 2アドレナリン受容体による極めて類似したアスコルベート酸化防止 も見出した(データーは示さず)。理論によってテザードされるものではないが、受容体自身をイン・ビトロ系の別の成分、例えば周囲の緩衝液および/またはUV光線、によって還元し、これによって受容体が酸化的保護のこの方法を繰り返すことができる。イン・ビボ/シン・シト系のこれらまたは他の成分は、同様な循環機能を行うことができる。
例７
例6のヒトアドレナリン受容体 (AR) の一連の重複しているペプチドを、そこに記載のUV分光光度法を用いてアスコルベート結合について試験する。E1ループにまたがっている3個のARペプチドの2個は、有意なアスコルベートアフィニティーを示す (Kd <50μM)。図8を参照されたい。対照的に、インスリン受容体の細胞外領域からのペプチド有意なアスコルベートアフィニティーを示さない (Kd >1 mM) (データーは示さず)。いずれのアスコルベート結合ペプチドも、全受容体として、ほぼ同じレベルのアスコルベート酸化の防止を示す。
例８
処方箋なしの目の刺激治療、緑内障薬および目の拡大に用いられる薬剤は、アドレナリン作動性化合物である。これらの化合物の効力は、アスコルベートを用いることによって、または効力を降下させるのに必要な用量を用いることによって増加する。
例９
鬱血性心疾患、変形性心疾患などは、ドブタミンおよびイソプロテレノールのようなアドレナリン作動性アゴニストで治療される。高用量のアスコルベートと組み合わせることによって、一層大きな効果が得られる。
例１０
トラウマ状況(病院および戦場のいずれでも)では、アドレナリン作動性化合物およびエピネフリン自身の主要な用途の一つは、出血を止めまたは減少させることである。エピネフリンをスプレーまたは溶液により開放創傷へ直接投与すると、動脈および小動脈が収縮し、これによって出血が制限される。このような緊急状況についてのエピネフリン-アスコルベート創傷ドレッシングまたはスプレーは、出血を制限するのに有益であり、軍隊並びにトラウマ中心および第一の応答に対して特別な用途を有する。
例１１
ショック時には血圧が急激に低下し、速やかに臓器機能不全を生じる。エピネフリン、ドパミンなど標準的ショック治療に伴うアスコルベートの静注は、血圧増加並びに臓器の酸化防止的保護を行う。
例１２
ドパミンに関連したカテコールアミンは、パーキンソン病の主要な治療薬である。アスコルベートはL-DOPA活性活性を増加する。しかしながら、アスコルベートは血液脳関門を通過せず、ほとんどの投与用式では、血液脳関門を通過でする形態のアスコルベート、例えばデヒドロアスコルベートのようなアスコルベートまたは類似前駆体の形態で、脳組織または脳脊髄液ではアスコルベートまたは活性類似体に転換することができるものを提供することが望ましい。
例１３
エピネフリンは、局所および注入麻酔薬に加えられ、その部分の血管を収縮させることによって麻酔薬の循環への損失を減少させることが多い。これらの麻酔薬におけるエピネフリンは、血圧および心拍数の増加、心悸亢進、神経質などを引き起こすのに十分である。これらの副作用は、エピネフリン濃度を低下させかつアスコルベートを添加することによって減少し、エピネフリン作用を強化する。長時間作用性麻酔薬は、エピネフリンの現行の用量にアスコルベートを添加することによって作製される。
例１４
ヒトH1ヒスタミン受容体 (Jena Bioscience, Jena, Germany) が入手可能であることから、受容体に対するAscの効果を直接実験することができる。市販のH1ヒスタミン受容体 (HR) 500μlを20 mMリン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.4を用いて、超音波処理、遠心分離、および再懸濁を用いて洗浄する。HRは、このようにしてリン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.4の14.3μM HR懸濁液として存在する。アスコルベートは、20 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.4の10 mM保存液として調製される。
392 ± 1.7μM Asc (94.1μg/ml) and 0.56μM (31.4μg/ml), 0.17μM (9.4μg/ml)、または 56 nM (3.1μg/ml) HR受容体を含む3個ずつの試料255μlを調製する。H1ヒスタミン受容体の分子量は、55.8 kDalである。それぞれの試料200μlを96穴プレートに加え、スペクトルをSpectramax分光光度計で1時間にわたり一連の反復読み中に190-310 nmまで1 nmの増加で集める。差スペクトル(AscまたはHRのみについての吸光度の読みに対する)を上記と同様に用いて、アスコルベートの結合を定量的に検討した。これにより、アスコルベート酸化に対するHRの存在の効果を測定できる。アスコルベート酸化速度に対するHRの効果は、267nmにピークを有するアスコルベート共鳴の消失によって測定できる。アスコルベート酸化速度はアスコルベートの対数を時間に対してプロットすることによって測定され、速度定数は傾きの計算値から決定される。実験は、HR濃度が170nMを超過すると、アスコルベート酸化が実質的に停止されることを示している。HRによる酸化されたアスコルベートの還元は、アスコルベート単独の酸化速度とHRの存在下でのアスコルベートの酸化速度の差として計算される。モルAsc還元/モルHR は、Asc還元のこの濃度が飽和するHR濃度よりずっと低い最低HR濃度56nMを用いて、計算される。結果を図9および10に示す。
図9は、イン・ビトロ懸濁液におけるアスコルベートのヒトH1ヒスタミン受容体 (HR)への結合を示すスペクトルを示している。この図では、黒塗り記号はアスコルベートを含まないHR受容体の様々な濃度のスペクトルであり、白塗り記号は、HR+392μMの初期アスコルベートのスペクトルであり、いずれもアスコルベートの添加から20分後に測定している。267nmに中心がある大きなピークは、未酸化アスコルベートを表す。アスコルベートが酸化されると、その吸光度は消失する。しかしながら、これらのデーターは、例えば、酸化されたアスコルベートを還元することによってHRがアニオン形態でアスコルベートを保持する補助をすることを示している。アスコルベート酸化のバックグラウンドレベルを表しているHRを含まない緩衝液でのアスコルベートについて生成した対照スペクトルを差し引くと、190-205 nmの範囲の吸光度の読みが減少するが、HRを含む試料の3つ総てについて267nmに中心がある有意なピークは残る(データーは示さないが、上部の3個のスペクトルを、HRを含まないAscを表している第四の最高のスペクトルと比較されたい)。
アスコルベート酸化速度に対するH1ヒスタミン受容体 (HR)の効果についてのデーターを、図10に示す。図10Aは267 nmのアスコルベート吸光度を表し、すなわち最高のスペクトルピークのピーク高さであり、267 nmは最強のAsc吸光度の波長である。データーを、図7に示すような吸光度差スペクトルとして様々なHR濃度について経時的に測定する。最も急激な降下曲線は、HRの非存在下でのアスコルベートの酸化を示す。上部の2つの曲線は実質的に平坦であり、この量のHRの存在下ではアスコルベートはほとんどまたは全く酸化されないことを示している。プロットしたデーターから、速度定数を計算した。実験結果は、1.7μM HRは、560 nM HRの場合と同様にアスコルベート酸化を防止することを示している(データーは示さず)。図10Bでは、様々なHR濃度でのアスコルベート酸化定数を、HRモル数対アスコルベートのモル数の関数としてプロットしている。比が0.0004のHRモル/アスコルベートモルを上回るときには、この時間中にはアスコルベートの有意な真の酸化はない。このような低い比での酸化の防止は、酸化保護が単に直接的HR-アスコルベート結合によるものでないことを示している。図10Cは、アスコルベートのみの酸化速度と所定濃度のHRの存在下での速度との差として計算される酸化されたアスコルベートのHR還元の速度を示している。初期の傾きは、これらの実験で測定されたアスコルベートのHR還元の最高速度を示している。この値は、HR 1μM当たりAsc還元の71μM/分として計算された。
例１５
本発明の態様による多種多様な化合物に応用可能なテザード化合物を調製する第一の方法を、下記に示す。1-4単位の酸化エチレンテザーを有するアスコルベート-アミン作動連結した化合物の調製は、アスコルベートとノルエピネフリンの場合にはテザーを最初に に結合することによって下記のように行われる。アスコルベート (0.18g)を、炭酸水素ナトリウム2モル当量を含む2:1の比のメタノール:水10ml中で適当なユニ-またはポリ-エチレングリコールジトシレート(0.5 g)と共に室温で12時間攪拌する。次に、ノルエピネフリン(0.18g)を加え、混合物を更に12時間攪拌する。これを次に、混合床イオン交換樹脂を通過させた後、Biogel P2カラム(Bio-Rad; Hercules, CA、USA) を通過させ、画分がUV評価によって測定されるように、第一の溶出画分を回収する。水で平衡にしたカラムを用いてC-18逆相クロマトグラフィーによって、更に精製を行う。これを、水 4 x 10 ml、水とメタノールの4:1混合物4 x 10 ml、および水とメタノールの2:1混合物 4 x 10 mlで溶出する。様々な画分を濃縮し、その内容物をNMR分光分析法によって評価する。テザード化合物は、#2-5および4 ユニットテザー(4UT、下記に示す)と呼ぶ。
Figure 2008537887
生物学的試験は、逆相カラムを通過させなかった材料上で行う。
例１６
本発明の態様による多種多様な化合物に応用可能なテザード化合物を調製する第二の方法は、下記の通りである。上記の例15で用いた条件を用いる。この方法では、ほぼ等モル濃度のアスコルベートとノルエピネフリン(または他の化合物、例えばアスコルベートとアミン作動性化合物をそれぞれ0.5 g)をいずれも蒸留水に溶解する。ポリエチレングリコールジトシレート(例えば、1-4-エチレン-オキシド-ユニットPEG) を次に加え、反応を12時間進行させる。精製は、カラム、逆相クロマトグラフィーおよび他の適当な当該技術分野で知られている方法を用いて行う。適当な生成物を、マススペクトル分光法および/またはNMR法を用いて同定する。
例１７
本発明の態様による多種多様な化合物に応用可能なテザード化合物を調製する別の方法は、下記の通りであり、それぞれの末端に異なる反応性基を有するリンカー(テザー)の使用を伴う。例は、スクシンイミジル-3-(ブロモアセタミド)プロピオネート、N-(マレイミドウンデカン酸)ヒドラジドおよびエチルエングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)である。.これらのリンカーは、アミン作動性化合物によって提示することができるアミノ基に特異的な1個の官能基を有し、もう一つはアスコルベート、THI化合物、または類似体によって提示することができる硫黄またはヒドロキシル基に特異的なものである。アミン作動性(ノルエピネフリン、ヒスタミン、または他のアミン作動性薬)を、適当な条件および試薬を用いて、リンカーと反応させる。生成物はこの時点で精製することができ、または混合物を次の段階で用い、そのリンカーに対する適当な条件および試薬を用いて、アスコルベート(または他のエンハンサー)をリンカーの他の末端に添加することを含んでいる。反応は、逆順(エンハンサーを最初に、次にアミン)に行うこともできる。生成物を、適当なカラムおよび逆相クロマトグラフィーを用いて精製し、適当な材料はマススペクトル分光法および/またはNMRによって同定した。
例１８
4UTテザード化合物のヒトβアドレナリン受容体E1ペプチドアスコルベート結合部位への結合を、下記のようにして分析した。上記テザード化合物、 4UTのpH 7.4リン酸緩衝液中の10-4 M保存溶液を pH 7.4リン酸緩衝液中で10-5 Mに希釈し、0.1 mlを様々な濃度のヒトβアドレナリン受容体ペプチド溶液に加える。βアドレナリン受容体ペプチド 89-99 (MW, 約1300) を2.0 mlリン酸緩衝液, pH 7.4に溶解して、10-3 M保存溶液を得る。次に、この89-99ペプチド保存溶液を用いて、3回目まで連続希釈を行う。様々な希釈液0.1 mlを4UT溶液 (10-5 M) 0.1 mlと混合し、または結晶96穴プレート中のリン酸緩衝液 0.1 mlと混合し、4UT溶液を含む3個のウェルの組も対照として0.1 ml緩衝液と混合する。それぞれの結合を3個ずつ作製する。紫外スペクトルを総ての組合せおよび対照について、190-300 nmまで1nmの増加で混合物を作製した後30分間にわたってSpectraMax Plus分光光度計およびSoftMax Proソフトウェア (いずれもMolecular Devices Corp.; Sunnyvale, CA、USA)を用いて集める。データーを、SigmaPlotソフトウェア (SYSTAT Software Inc.; Point Richmond, CA、USA)を用いて、分析し、プロットする。結果を図11に示す。
得られたデーターは、4UTがβアドレナリン受容体ペプチド 89-99 に約6 x 10-5 Mの結合定数で結合することを示している。アスコルベートのこのペプチドへの結合に対する結合定数に極めて近似している(例えば、図8を図11と比較されたい)。他のデーターと協同して(図示せず)、これは、4UTがβアドレナリン受容体を活性化し、その効果は更にアスコルベートを添加しても高められないことを示しており、従って、これらの結合データーは、4UTがβアドレナリン受容体のアスコルベート結合領域に結合することを更に立証している。これらのデーターはまた、βアドレナリン受容体へのアスコルベート様結合をスクリーニングする手段としてこの結合領域からのペプチドの使用を実証している。
Ｇタンパク質共役受容体。 ヒトβ２アドレナリン受容体の第一の５個の膜貫通領域の二次構造、およびアスコルベート分子が接触できる表面に接近可能なTM2、E1ループおよびTM3残基の近似的伸張部(中央の黒棒線を参照)。 ナトリウム依存性アスコルベート輸送体SVCT1およびSVCT2と比較したヒトα1Aおよびβ2アドレナリン作動性、ドパミンD1AおよびD1BおよびヒスタミンH1受容体の保存領域。 カルバコールを投与してアルブテロールまたはアスコルベートを補足したアルブテロールで治療した回虫抗原過敏ヒツジの気流抵抗対時間のグラフ: ○= アスコルベートを含まないアルブテロール(ベースライン)、□=アスコルベートを含むアルブテロール(ベースライン)、●=アスコルベートを含まないカルバコール+アルブテロール、黒四角=アスコルベートを含むカルバコール+アルブテロール。 アスコルベートを前投与した後アルブテロールを投与した肺気腫に罹ったウマの胸腔内圧比: 黒四角=ビヒクル、●=アスコルベート。 アスコルベートを前投与した後アルブテロールを投与した肺気腫に罹ったウマの最高胸腔内圧の変化を示す棒グラフ(cmH2Oとして測定したΔPplmax)、様々な用量のアスコルベート(0、0.15、1.5および15 mg/ml)を投与した後、異なる時間(10および20分)を置き、「Veh」はビヒクルのみ、すなわち0アスコルベートを示し、アトロピン投与の結果も示している。 イン・ビトロ懸濁液でのヒトβ2アドレナリン受容体(AR)へのアスコルベートの結合を示すスペクトル。 ヒトβアドレナリン受容体ペプチド領域におけるアスコルビン酸濃度対吸光度差の典型的プロット: ●=ヒトβアドレナリン作動性ペプチド89-99、すなわち配列番号27の残基12-22であって、標準化ＧＰＣＲDBナンバリングに準じるＧＰＣＲ残基108-118; ○=ヒトβアドレナリン作動性ペプチド97-106、すなわち配列番号27の残基20-29であって、標準化ＧＰＣＲDBナンバリングに準じるＧＰＣＲ残基116-125。 イン・ビトロ懸濁液でのヒトH1ヒスタミン受容体(HR)へのアスコルベートの結合を示すスペクトル: ●= 0μg/ml HR(アスコルベートなし), ○= 0μg/ml HR(アスコルベートあり), 黒四角= 3.1μg/ml HR(アスコルベートなし), □= 3.1μg/ml HR(アスコルベートあり), ▲= 9.4μg/ml HR(アスコルベートなし), Δ= 9.4μg/ml HR (アスコルベートあり), ◆= 31.4μg/ml HR (アスコルベートなし), ◇= 31.4μg/ml HR (アスコルベートあり)。 Ascの酸化および還元の速度に対する絶対および相対ヒトH1ヒスタミン受容体(HR)濃度の効果を示すグラフ; 図10Aでは、●= 0 nM HR、▲= 56 nm HR、黒四角= 170 nm HR、◆= 560 nm HR。 ノルエピネフリンがリンカーによってアスコルベートに結合しているテザード化合物(tethered compound)「4UT」によるヒトβアドレナリン受容体ペプチド89-88への結合のための吸光度対ペプチドの溶液濃度の変化のグラフ。
動物Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Ala、His、Ile、Leu、Met、PheおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Gln、Glu、Ile、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Lys、Phe、Ser、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Ser、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Ser、Thr、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ile、Leu、Met、SerおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Glu、Lys、Pro、SerおよびTrpは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Cys、Gly、His、Ile、Leu、Pro、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Pro、SerおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Cys、Gly、Leu、Met、Phe、Ser、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、His、Leu、PheおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
ヒト（ホモ・サピエンス(Homo sapiens)）Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Ala、Ile、LeuおよびMetは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Glu、Gln、Ile、Leu、Lys、Phe、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、His、Lys、Phe、SerおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Cys、Glu、His、Ile、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Pro、Ser、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Leu、MetおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、ProおよびSerは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Pro、Ser、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Cys、Gly、His、Ile、Leu、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、Leu、Lys、Pro ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Ile、PheおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、His、Leu、PheおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
ラット(Rattus norvegicus)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Ile、Leu、MetおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Gln、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Phe、Ser、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、Asn、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
LeuおよびMetは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Pro、SerおよびTrpは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Pro、SerおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Gly、His、Ile、Leu、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Pro、SerおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Ile、Phe、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、His、Leu、PheおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
アカゲザル(Macaca mulatta)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Ala、IleおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Glu、Thr、TrpおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
His、LysおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Cys、His、MetおよびPheは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Gly、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
LeuおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Proは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、GluおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Gly、Leu、Lys、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Gly、PheおよびTipは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、AspおよびLysは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ile、PheおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Hisは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
ネコ(Felis catus)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Metは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
ArgおよびMetは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Lysは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
HisおよびMetは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
GluおよびSerは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
LeuおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
AlaおよびAsnは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Thrは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
GlyおよびPheは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Pheは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
ウマ(Equus caballus)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Gln、GlyおよびMetは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Asp、LysおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、IleおよびLysは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ile、ProおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
LeuおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
ArgおよびProは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Asn、GluおよびSerは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Lys、MetおよびPheは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
LeuおよびPheは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
AlaおよびLeuは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
IleおよびPheは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
ArgおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
マウス(Mus musculus)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Ile、Met、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Gln、Glu、Ile、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Lys、Phe、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、Asn、Cys、Glu、His、Ile、Lys、Met、Phe、Ser、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Ser、Thr、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Leu、MetおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Pro、SerおよびTrpは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Pro、SerおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Cys、Gly、His、Ile、Leu、Thr、TrpおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、MetおよびProは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Leu、Phe、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、His、Leu、PheおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
ウサギ(Oryctolagus cuniculus)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Valは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Thrは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Hisは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Arg、PheおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
AsnおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Leuは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Glnは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Alaは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
LeuおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Asnは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Leuは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
モルモット(Cavia porcellus)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
His、Ile、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、Gln、Ile、Leu、SerおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、SerおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Ile、Lys、Met、SerおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Asn、Ile、Ser、TyrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Leu、Met、SerおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
SerおよびTrpは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Asn、Gln、Glu、His、LysおよびSerは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、ProおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Ala、PheおよびTrpは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Asn、Glu、Gly、Leu、LysおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Leu、PheおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、PheおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
イヌ(Canis familiaris)Gタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列
Leu、MetおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、Met、Ser、ThrおよびValは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Arg、Asn、CysおよびLysは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Glu、Lys、MetおよびThrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Glu、Lys、ProおよびSerは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
LeuおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Serは、この位置で置換され得るもう１つの天然に存在する変異体残基である。
Ala、Arg、Asn、LysおよびSerは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Phe、ThrおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Gly、His、Leu、PheおよびTrpは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
AsnおよびGluは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
IleおよびPheは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
TrpおよびTyrは、この位置で置換され得る他の天然に存在する変異体残基である。
Asp26およびCys34として示される保存されたAsp425およびCys433を有する、NCBI Entrez受託番号Q9UHI7、残基400〜439に由来する、アスコルビン酸結合に関与するSVCT1の断片
Asp26およびCys34として示される保存されたAsp484およびCys492を有する、NCBI Entrez受託番号Q9UGH3、残基459〜498に由来する、アスコルビン酸結合に関与するSVCT2の断片
例としての推定コンセンサス配列
例としての動物およびヒトGタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列のコード配列例
動物およびヒトGタンパク質共役型ロドプシン様生体アミン受容体アスコルビン酸結合ドメインコンセンサス配列例
ヒトムスカリン様アセチルコリン受容体M1由来のE1ループ領域
ヒトムスカリン様アセチルコリン受容体M2由来のE1ループ領域
ヒトムスカリン様アセチルコリン受容体M3由来のE1ループ領域
ヒトムスカリン様アセチルコリン受容体M4由来のE1ループ領域
ヒトムスカリン様アセチルコリン受容体M5由来のE1ループ領域
ヒトαアドレナリン受容体1A由来のE1ループ領域
ヒトαアドレナリン受容体1B由来のE1ループ領域
ヒトαアドレナリン受容体1D由来のE1ループ領域
ヒトαアドレナリン受容体2A由来のE1ループ領域
ヒトαアドレナリン受容体2B由来のE1ループ領域
ヒトαアドレナリン受容体2C由来のE1ループ領域
ヒトβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
ヒトβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
ヒトβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域
ヒトドーパミン受容体D1A由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
ヒトドーパミン受容体D1B由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
ヒトドーパミン受容体D2由来のE1ループ領域
ヒトドーパミン受容体D3由来のE1ループ領域
ヒトドーパミン受容体D3変異体（Genbank受託番号U32499）由来のE1ループ領域
ヒトドーパミン受容体D4由来のE1ループ領域
ヒトGタンパク質共役型受容体GPCR-57由来のE1ループ領域
ヒトGタンパク質共役型受容体GPCR-58由来のE1ループ領域
ヒトヒスタミン受容体H1由来のE1ループ領域
ヒトヒスタミン受容体H2由来のE1ループ領域
ヒトヒスタミン受容体H3由来のE1ループ領域
ヒトヒスタミン受容体H4由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1A由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1B由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1D由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1E由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1F由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2A由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2B由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2C由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体4由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体5A由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体6由来のE1ループ領域
ヒト5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体7由来のE1ループ領域
ヒト微量アミン受容体1由来のE1ループ領域
ヒト微量アミン受容体3由来のE1ループ領域
ヒト微量アミン受容体4由来のE1ループ領域
ヒト微量アミン受容体5由来のE1ループ領域
ラットムスカリン様アセチルコリン受容体M1由来のE1ループ領域
ラットムスカリン様アセチルコリン受容体M2由来のE1ループ領域
ラットムスカリン様アセチルコリン受容体M3由来のE1ループ領域
ラットムスカリン様アセチルコリン受容体M4由来のE1ループ領域
ラットムスカリン様アセチルコリン受容体M5由来のE1ループ領域
ラットαアドレナリン受容体1A由来のE1ループ領域
ラットαアドレナリン受容体1B由来のE1ループ領域
ラットαアドレナリン受容体1D由来のE1ループ領域
ラットαアドレナリン受容体2A由来のE1ループ領域
ラットαアドレナリン受容体2B由来のE1ループ領域
ラットαアドレナリン受容体2C由来のE1ループ領域
ラットβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
ラットβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
ラットβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域
ラットドーパミン受容体D1A由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
ラットドーパミン受容体D1B由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
ラットドーパミン受容体D2由来のE1ループ領域
ラットドーパミン受容体D3由来のE1ループ領域
ラットドーパミン受容体D3変異体（Genbank受託番号X53944）由来のE1ループ領域
ラットドーパミン受容体D4由来のE1ループ領域
ラットドーパミン受容体D4変異体（Genbank受託番号U03551）由来のE1ループ領域
ラットヒスタミン受容体H1由来のE1ループ領域
ラットヒスタミン受容体H2由来のE1ループ領域
ラットヒスタミン受容体H3由来のE1ループ領域
ラットヒスタミン受容体H4由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1A由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1B由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1D由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1F由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2A由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2B由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2C由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体4由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体5A由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体5B由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体6由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体7由来のE1ループ領域
ラット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体7変異体（Genbank受託番号U68490）由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体1由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体2由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体3由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体4由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体6由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体7由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体8由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体9由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体10由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体11由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体12由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体13由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体14由来のE1ループ領域
ラット微量アミン受容体15由来のE1ループ領域
アカゲザルムスカリン様アセチルコリン受容体M1由来のE1ループ領域
アカゲザルムスカリン様アセチルコリン受容体M5由来のE1ループ領域
アカゲザルβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
アカゲザルβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
アカゲザルβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域
アカゲザルドーパミン受容体D1A由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
アカゲザルヒスタミン受容体H3由来のE1ループ領域
アカゲザルム5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2A由来のE1ループ領域
アカゲザル微量アミン受容体1由来のE1ループ領域
ネコβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
ネコβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
ネコβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域
ウマαアドレナリン受容体1B由来のE1ループ領域
ウマβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
ウマドーパミン受容体D2由来のE1ループ領域のアミノ末端遠位断片
ウマ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体由来のE1ループ領域のアミノ末端遠位断片
ウマ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体4D由来のE1ループ領域
マウススカリン様アセチルコリン受容体M1由来のE1ループ領域
マウススカリン様アセチルコリン受容体M2由来のE1ループ領域
マウススカリン様アセチルコリン受容体M3由来のE1ループ領域
マウススカリン様アセチルコリン受容体M4由来のE1ループ領域
マウススカリン様アセチルコリン受容体M5由来のE1ループ領域
マウスαアドレナリン受容体1A由来のE1ループ領域
マウスαアドレナリン受容体1B由来のE1ループ領域
マウスαアドレナリン受容体1D由来のE1ループ領域
マウスαアドレナリン受容体2A由来のE1ループ領域
マウスαアドレナリン受容体2B由来のE1ループ領域
マウスαアドレナリン受容体2C由来のE1ループ領域
マウスβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
マウスβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
マウスβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域
マウスドーパミン受容体D1A由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
マウスドーパミン受容体D1B由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
マウスドーパミン受容体D2由来のE1ループ領域
マウスドーパミン受容体D3由来のE1ループ領域
マウスドーパミン受容体D4由来のE1ループ領域
マウスヒスタミン受容体H1由来のE1ループ領域
マウスヒスタミン受容体H2由来のE1ループ領域
マウスヒスタミン受容体H3由来のE1ループ領域
マウスヒスタミン受容体H4由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1A由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1B由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1D由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1F由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2A由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2B由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2C由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体4由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体5A由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体5B由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体6由来のE1ループ領域
マウス5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体7由来のE1ループ領域
マウス微量アミン受容体1由来のE1ループ領域
ウサギαアドレナリン受容体1A由来のE1ループ領域
ウサギαアドレナリン受容体1D由来のE1ループ領域
ウサギ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1B由来のE1ループ領域
ウサギ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1D由来のE1ループ領域
モルモットムスカリン様アセチルコリン受容体M3由来のE1ループ領域
モルモットムスカリン様アセチルコリン受容体M5由来のE1ループ領域
モルモットαアドレナリン受容体1A由来のE1ループ領域
モルモットαアドレナリン受容体2A由来のE1ループ領域
モルモットαアドレナリン受容体2B由来のE1ループ領域
モルモットαアドレナリン受容体2C由来のE1ループ領域
モルモットβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
モルモットヒスタミン受容体H1由来のE1ループ領域
モルモットヒスタミン受容体H2由来のE1ループ領域
モルモットヒスタミン受容体H3由来のE1ループ領域
モルモットヒスタミン受容体H4由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
モルモット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1B由来のE1ループ領域
モルモット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1D由来のE1ループ領域
モルモット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1F由来のE1ループ領域
モルモット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体4由来のE1ループ領域
モルモット5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体7由来のE1ループ領域
イヌβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
イヌβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
イヌβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域
イヌドーパミン受容体D2由来のE1ループ領域
イヌヒスタミン受容体H2由来のE1ループ領域
イヌ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1A由来のE1ループ領域
イヌ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1D由来のE1ループ領域
ブタムスカリン様アセチルコリン受容体M1由来のE1ループ領域
ブタムスカリン様アセチルコリン受容体M2由来のE1ループ領域
ブタムスカリン様アセチルコリン受容体M3由来のE1ループ領域
ブタαアドレナリン受容体1A由来のE1ループ領域
ブタαアドレナリン受容体1B由来のE1ループ領域
ブタαアドレナリン受容体1D由来のE1ループ領域
ブタαアドレナリン受容体2A由来のE1ループ領域
ブタβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
ブタβアドレナリン受容体2由来のE1ループ領域
ブタβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域
ブタドーパミン受容体D1A由来のE1ループ領域
Xaaは任意の天然アミノ酸残基であるか、または残基の不在であり得、この位置のアミノ酸残基は例えば、脊椎動物または哺乳類生体アミンGPCRなどの生体アミンGPCRにおける対応する位置に見られるいずれの残基であってもよい。
ブタ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1D由来のE1ループ領域
ブタ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1E由来のE1ループ領域
ブタ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2A由来のE1ループ領域
ブタ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2A変異体（Genbank受託番号S78208）由来のE1ループ領域
ブタ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2B由来のE1ループ領域のアミノ末端遠位断片
ブタ5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体7A由来のE1ループ領域
ヒツジβアドレナリン受容体1由来のE1ループ領域
ヒツジβアドレナリン受容体3由来のE1ループ領域

Claims (113)

  1. 生体アミンＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アスコルベート結合ペプチドのアミノ酸配列を含んでなる、単離または組換えペプチド。
  2. アスコルベート結合ペプチドが、保存されたＷ３．１８およびＣ３．２５を含むＧＰＣＲの残基３．１８−３．２５、保存されたＣ３．２５およびＤ３．３２を含むＧＰＣＲの残基３．２５−３．３２、または、保存された残基のそれぞれの対を保持する上記残基のいずれかの保存的に置換された変異体、と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
  3. 上記アスコルベート結合ペプチドが、保存されたＷ３．１８、Ｃ３．２５およびＤ３．３２を含むＧＰＣＲの残基３．１８−３．３２、または、保存された残基Ｗ３．１８、Ｃ３．２５およびＤ３．３２を保持する保存的に置換された変異体、と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
  4. アスコルベート結合ペプチドが、保存されたＷ３．１８、Ｃ３．２５およびＤ３．３２を含むＧＰＣＲの残基２．４９−３．４１、または、保存された残基Ｗ３．１８、Ｃ３．２５およびＤ３．３２を保持する保存的に置換された変異体、と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
  5. ペプチドが、上記ＧＰＣＲアミン受容体の少なくとも実質的に完全な膜貫通ドメイン２−細胞外ループ１−膜貫通ドメイン３（ＴＭ２−Ｅ１−ＴＭ３）断片のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のペプチド。
  6. ペプチドが、上記ＧＰＣＲアミン受容体の少なくとも実質的に完全な膜貫通ドメイン２−膜貫通ドメイン７（ＴＭ２−ＴＭ７）断片のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のペプチド。
  7. ペプチドが、少なくとも実質的に完全なＧＰＣＲのアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のペプチド。
  8. ＧＰＣＲがヒトまたは脊椎動物ＧＰＣＲのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
  9. ＧＰＣＲがヒトまたは哺乳類ＧＰＣＲのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
  10. 哺乳類ＧＰＣＲが、食肉類、セルタルティオダクティラ（Certartiodactyla）、兎類、奇蹄類、霊長類、または齧歯類のいずれか１種類の哺乳類から得られる、請求項９に記載のペプチド。
  11. 哺乳類が、イヌ、モルモット、ウマ、ネコ、ニホンザル、ハツカネズミ、カイウサギ、ヒツジ、クマネズミ、またはイノシシ属のいずれか１種類の一員である、請求項１０に記載のペプチド。
  12. 配列番号１−１０のいずれか１つに記載のコンセンサスまたは変異体アミノ酸配列、またはＣｙｓ５およびＴｒｐ１２を保持する保存的に置換されたその変異体を含んでなる、単離または組換えペプチド。
  13. アスコルベート結合配列が、長さが少なくとも８残基であり、かつＷ−ＸＸＸＸＸ−ＣまたはＷ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｃ配列もしくはＣ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｄ配列の少なくとも一方または両方を含むアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のペプチド。
  14. 上記アミノ酸配列が配列番号１４−２０７のいずれか１つから得られる、請求項１３に記載のペプチド。
  15. ペプチドが、
    Ａ） 生体アミン受容体のＥ１−ＴＭ３ドメインのＸＸＸＸ−Ｗ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸまたはＸＸＸＸ−Ｗ−ＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸ配列、
    Ｂ） ２個までの残基欠失、２個までの残基挿入、または両方を含む残基欠失−挿入配列変異体であって、但し、生成する配列変異体がＷ−ＸＸＸＸＸＸ−ＣまたはＷ−ＸＸＸＸＸ−Ｃ下位配列をその中に保持しているもの、または
    Ｃ） 上記のいずれかの保存的に置換された変異体であって、但し、生成する置換変異体がＷ−ＸＸＸＸＸＸ−ＣまたはＷ−ＸＸＸＸＸ−Ｃ下位配列をその中に保持しているもの
    を含み、
    Ｘが上記Ｅ１−ＴＭ３ドメインに見られるような任意のアミノ酸残基またはその保存的置換を表す、請求項１３に記載のペプチド。
  16. 上記配列が、下記式（１）、（２）または（３）のいずれか１つに記載の配列である、請求項１５に記載の単離または組換えペプチド：
    Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｗ−Ｚ５−Ｚ６−Ｚ７−Ｚ８−Ｚ９−Ｚ１０−Ｃ−Ｚ１１−Ｚ１２−Ｚ１３ （１）、
    Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｗ−Ｚ５−Ｚ６−Ｚ７−（Ｚ８またはＺ９）−Ｚ１０−Ｃ−Ｚ１１−Ｚ１２−Ｚ１３ （２）、または
    Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−（Ｚ３またはＺ４）−Ｚ４−Ｗ−Ｚ５−Ｚ６−Ｚ７−（Ｚ８またはＺ９）−Ｚ１０−Ｃ−Ｚ１ １−Ｚ１２−Ｚ１３ （３）
    （式中、
    Ｚ１はＡ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、ＴまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ２はＡ、Ｒ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ３は独立してＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、ＴまたはＹ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ４は独立してＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＹまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ５はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＹまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ６はＩ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、ＳまたはＹ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ７はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、ＳまたはＷ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ８はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶのいずれか１つを表し、
    Ｚ９はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、またはＶのいずれか１つを表し、
    Ｚ１０はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、Ｗ、ＹまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ１１はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｐ、ＳまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ１２はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、ＴまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ１３はＲ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、ＷまたはＹ、またはその保存的置換のいずれか１つを表す）。
  17. Ｚ１がＩ、Ｌ、ＭまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ２がＡ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、ＹまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ３が独立してＡ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、ＳまたはＹ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ４が独立してＲ、Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、ＹまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ５がＡ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、ＴまたはＹ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ６がＬ、Ｍ、ＦまたはＹ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ７がＡ、Ｒ、Ｇ、ＰまたはＳ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ８がＲ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＫまたはＳ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ９がＡ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＴまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ１０がＡ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｔ、ＷまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ１１がＡ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、ＫまたはＰ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、
    Ｚ１２がＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦまたはＶ、またはその保存的置換のいずれか１つを表し、かつ
    Ｚ１３がＦ、ＷまたはＹ、またはその保存的置換のいずれか１つを表す、
    請求項１６に記載の単離または組換えペプチド。
  18. 配列番号１１−１２のいずれか１つの少なくともＡｓｐ２６−Ｃｙｓ３４部分のアミノ酸配列、またはＡｓｐ２６およびＣｙｓ３４を保持している保存的に置換されたその変異体を含んでなる、単離または組換えペプチド。
  19. アミノ酸配列がそこに画定された１２個以下のアミノ酸残基置換を含む、請求項１−１８のいずれか一項に記載の変異体または置換配列を有するペプチド。
  20. アミノ酸配列が１０個以下の上記残基置換を含む、請求項１９に記載のペプチド。
  21. アミノ酸配列が８個以下の上記残基置換を含む、請求項１９に記載のペプチド。
  22. 請求項１−２１のいずれか一項に記載の側鎖配列を有するペプチド類似体。
  23. 少なくとも１個の他の部分に結合した請求項１−２２のいずれか一項に記載のペプチドまたは類似体を含んでなる、単離または組換え化合物。
  24. 上記ペプチドが少なくとも１個の他のアミノアシル残基に融合している融合タンパク質である、請求項２３に記載の化合物。
  25. 請求項１−２２のいずれか一項に記載のペプチドまたは類似体、または少なくとも１個の他の成分と組み合わされた請求項２３または２４に記載の化合物を含んでなる、組成物。
  26. 請求項１−２２のいずれか一項に記載のペプチドまたは類似体、または固体表面、生物学的膜、または界面層に固定された請求項２３または２４に記載の化合物を含んでなる、組成物。
  27. 少なくとも１個の表面に上記ペプチドを提示する細胞、細胞断片または細胞小器官、ウイルス、ウイルス様粒子、ミセル、油体、またはリポソームを含んでなる、請求項２６に記載の組成物。
  28. 生体分子アレイを含んでなる、請求項２６に記載の組成物。
  29. マクロ−、ミクロ−またはナノ−粒子を含んでなる、請求項２６に記載の組成物。
  30. 請求項１−２２のいずれか一項に記載のペプチドまたは類似体の独立したライブラリー。
  31. 請求項２３または２４のいずれか一項に記載の化合物の独立したライブラリー。
  32. ２５−２９のいずれか一項に記載の組成物の独立したライブラリー。
  33. 複数のゾーンを含んでなり、その少なくとも２つのゾーンが第一のゾーンと第二のゾーンであり、上記第一と第二のゾーンがそれぞれ一つのゾーン内では同一配列であるがゾーン間では異なるペプチドの個体群を含み、第一のゾーンのペプチドと第二のゾーンのペプチドは独立して請求項１−２２のいずれか一項に記載の異なるペプチドまたは類似体であることを特徴とする、生体分子アレイ。
  34. 生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合ペプチドに対する結合剤を同定するための、Ｅ１−ＴＭ３ドメインにある生体アミンＧＰＣＲアスコルベート結合部位アミノ酸配列を有するペプチドの使用。
  35. 生体アミンＧＰＣＲのアスコルベート結合ペプチドに結合することができるかどうかを決定するための少なくとも１種類の候補物質をスクリーニングする方法における、請求項１−２２のいずれか一項に記載のペプチドまたは類似体請求項２３および２４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項２５−２９のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０−３２のいずれか一項に記載のライブラリー、または請求項３３に記載のアレイの使用。
  36. 上記スクリーニングが、上記ペプチドまたは化合物、または上記組成物またはアレイのペプチド部分への結合の特異性、速度、アフィニティーまたは期間の少なくとも１つを決定することを含む、請求項３５に記載の使用。
  37. 上記候補物質が、アスコルビン酸、エリソルビン酸、モノデヒドロアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸、それらの無機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０酸またはアルコールとの反応によって形成されたその有機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０炭化水素基を有する上記のもののいずれかとのエーテル、上記のもののいずれかのデオキシ誘導体、上記のもののいずれかのハロ置換誘導体、上記のもののいずれかのラジカル、上記のもののいずれかの塩またはイオン、または上記のもののいずれかの合成類似体の１種類以上である少なくとも１種類のアスコルベート型物質に試験化合物またはそのラジカルが共有または非共有的に結合している構造を有する化合物、塩、または複合体を含んでなる、請求項３５または３６のいずれか一項に記載の使用。
  38. 上記候補物質が、試験化合物と、アスコルビン酸、エリソルビン酸、モノデヒドロアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸、それらの無機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０酸またはアルコールとの反応によって形成されたその有機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０炭化水素基を有する上記のもののいずれかのエーテル、上記のもののいずれかのデオキシ誘導体、上記のもののいずれかのハロ置換誘導体、上記のもののいずれかの塩またはイオン、または上記のもののいずれかの合成類似体の１個以上である少なくとも１種類のアスコルベート型物質との混合物を含んでなる、請求項３５および３６のいずれか一項に記載の使用。
  39. 上記スクリーニングの方法が、アスコルベート型物質と結合せずかつこれと混合されていない試験化合物の結合と比較して、生体アミンＧＰＣＲへ強く結合しまたは結合すると思われる候補物質を同定する方法である、請求項３７および３８のいずれか一項に記載の使用。
  40. 上記スクリーニングの方法が、添加されたアスコルベート型物質の存在下にて生体アミンＧＰＣＲへ強く結合することができるまたはできると思われる候補物質または試験化合物を同定する方法である、請求項３７および３８のいずれか一項に記載の使用。
  41. 上記スクリーニングの方法が、アスコルベート型物質に結合せずかつこれと混合しない試験化合物の結合と比較して生体アミンＧＰＣＲへの結合が減少しまたは減少すると思われる候補物質または試験化合物を同定する方法である、請求項３７および３８のいずれか一項に記載の使用。
  42. 複数の候補物質をスクリーニングして、候補物質のそれぞれの結合特性における差を評価する、請求項３５−３８のいずれか一項に記載の使用。
  43. 上記方法を用いて候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲと接触したときに望ましくない毒性効果を示す可能性を評価する、請求項３５−３８のいずれか一項に記載の使用。
  44. 上記方法を用いて候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する可能性を評価する、請求項３５−３８のいずれか一項に記載の使用。
  45. 上記方法を用いて候補物質または試験物質が生体アミンＧＰＣＲのアロステリックまたは立体モジュレーターとして機能する可能性を評価する、請求項３５−３８のいずれか一項に記載の使用。
  46. 少なくとも１種類の候補物質をスクリーニングしてそれが生体アミンＧＰＣＲのＥ１ループに結合することができるかどうかを決定する方法であって、
    （Ａ）（１） 請求項１−２２のいずれか一項に記載のペプチドまたは類似体、請求項２３および２４のいずれか一項に記載の化合物、請求項２５−２９のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０−３２のいずれか一項に記載のライブラリー、または請求項３３に記載のアレイであるまたはを含む少なくとも１種類のスクリーニング要素、および
    （２） 少なくとも１種類の候補物質
    を提供し、
    （Ｂ） 上記候補物質が上記スクリーニング要素に結合することができる条件下で上記スクリーニング要素を上記候補物質と接触させ、
    （Ｃ） 上記候補物質が上記ペプチドまたは化合物、上記ライブラリーの一員、または上記組成物またはアレイのペプチド部分に結合する特異性、速度、アフィニティーまたは期間の少なくとも１つを決定する
    ことを含んでなる、方法。
  47. 上記候補物質がアスコルベート、オピオイド、またはポリカルボン酸キレート化剤のいずれか１つを含んでなる、請求項４６に記載の方法。
  48. 上記候補物質がアスコルベート、モルフィン、ＥＤＴＡ、アスコルベート類似体、モルフィン類似体、およびＥＤＴＡ類似体のいずれか１つを含んでなる、請求項４６に記載の方法。
  49. 上記候補物質がアスコルベート類似体群Ｉおよびモルフィン類似体群Ｉのいずれか１つ由来の化合物を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
  50. 上記候補物質が三水素相互作用（ＴＨＩ）化合物である、請求項４６に記載の方法。
  51. 上記候補物質が、アスコルビン酸、エリソルビン酸、モノデヒドロアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸、それらの無機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０酸またはアルコールとの反応によって形成されたその有機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０炭化水素基を有する上記のもののいずれかとのエーテル、上記のもののいずれかのデオキシ誘導体、上記のもののいずれかのハロ置換誘導体、上記のもののいずれかのラジカル、上記のもののいずれかの塩またはイオン、または上記のもののいずれかの合成類似体の１種類以上である少なくとも１種類のアスコルベート型物質に試験化合物またはそのラジカルが共有または非共有的に結合している構造を有する化合物、塩、または複合体を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
  52. 上記候補物質が、試験化合物と、アスコルビン酸、エリソルビン酸、モノデヒドロアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸、それらの無機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０酸またはアルコールとの反応によって形成されたその有機エステル、少なくとも１種類のＣ１−Ｃ２０炭化水素基を有する上記のもののいずれかのエーテル、上記のもののいずれかのデオキシ誘導体、上記のもののいずれかのハロ置換誘導体、上記のもののいずれかの塩またはイオン、または上記のもののいずれかの合成類似体の１個以上である少なくとも１種類のアスコルベート型物質との混合物を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
  53. アスコルベート型物質と結合せずかつこれと混合されていない試験化合物の結合と比較して、生体アミンＧＰＣＲへ強く結合しまたは結合すると思われる候補物質を決定するもう一つの段階を含んでなる、請求項５１および５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 添加されたアスコルベート型物質の存在下にて候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲへ強く結合することができるまたはできると思われるかどうかを決定するもう一つの段階を含んでなる、請求項５１および５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. アスコルベート型物質と結合せずかつこれと混合されていない試験化合物の結合と比較して、候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲへの結合が減少しまたは減少すると思われるかどうかを決定するもう一つの段階を含んでなる、請求項５１および５２のいずれか一項に記載の方法。
  56. スクリーニングされる複数の候補物質のそれぞれの結合特性の差を測定するもう一つの段階を含んでなる、請求項４６−５１のいずれか一項に記載の方法。
  57. 生体アミンＧＰＣＲと接触したときにしたときに候補物質または試験化合物が望ましくない毒性効果を示す可能性を評価する、請求項４６−５１のいずれか一項に記載の方法。
  58. 候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する可能性を測定するもう一つの段階を含んでなる、請求項４６−５１のいずれか一項に記載の方法。
  59. 上記方法が、候補物質または試験物質が生体アミンＧＰＣＲのアロステリックまたは立体モジュレーターとして機能する可能性測定するもう一つの段階を含んでなる、請求項４６−５１のいずれか一項に記載の方法。
  60. （Ａ） 請求項１−２２のいずれか一項に記載のペプチドまたは類似体、請求項２３および２４のいずれか一項に記載の化合物、請求項２５−２９のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０−３２のいずれか一項に記載のライブラリー、または請求項３３に記載のアレイであるかまたはを含む少なくとも１種類のスクリーニング要素、および
    （Ｂ） スクリーニング要素のペプチドまたはペプチジル残基に結合する候補物質をスクリーニングする目的で用いる使用説明書、および場合によっては
    （１） 候補物質または試験化合物が添加されたアスコルベート型物質の存在下にて生体アミンＧＰＣＲへ強く結合することができるまたはできると思われるかどうか、
    （２） アスコルベート型物質と結合せずかつこれと混合されていない試験化合物の結合と比較して、候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲへの結合が減少しまたは減少すると思われるかどうか、
    （３） スクリーニングされる複数の候補物質のそれぞれの結合特性の差、
    （４） 生体アミンＧＰＣＲと接触したときに候補物質または試験化合物が望ましくない毒性効果を示す可能性、
    （５） 候補物質または試験化合物が生体アミンＧＰＣＲのアゴニストとして機能する可能性、
    （６） 候補物質または試験物質が生体アミンＧＰＣＲのアンタゴニストとして機能する可能性、
    の１つ以上を決定する目的で使用する使用説明書
    を含んでなる、スクリーニングキット。
  61. 請求項１−２１のいずれか一項に記載のペプチドに特異性を有する組換えまたは単離抗体、またはそれに対する抗アロタイプまたは抗イディオタイプ抗体、またはその抗体断片。
  62. ヒトＳＶＣＴ１残基４００−４３９（配列番号１１）、ヒトＳＶＣＴ２残基４５９−４９８（配列番号１２）、ヒトアドレナリン受容体α１Ａ残基７１−１１５（配列番号２０）、およびヒトアドレナリン受容体β２残基７８−１２２（配列番号２７）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるペプチド。
  63. ヒトアドレナリン受容体α１Ａ残基７１−１１５（配列番号２０）、およびヒトアドレナリン受容体β２残基７８−１２２（配列番号２７）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項６２に記載のペプチド。
  64. ヒトα１Ａアドレナリン受容体残基８１−１０５（配列番号２０の残基１１−３５）からなる群から選択される、請求項６３に記載のペプチド。
  65. ヒトα１Ａアドレナリン受容体残基８１−９１（配列番号２０の残基１１−２１）、８９−９８（配列番号２０の残基１９−２８）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項６４に記載のペプチド。
  66. ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−１１３（配列番号２７の残基１２−３６）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項６３に記載のペプチド。
  67. ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−９９（配列番号２７の残基１２−２２）、９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２９）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項６６に記載のペプチド。
  68. ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−９９（配列番号２７の残基１２−２２）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項６７に記載のペプチド。
  69. ヒトβ２アドレナリン受容体残基９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２９）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項６８に記載のペプチド。
  70. ヒトＳＶＣＴ１残基４００−４３９（配列番号１１）、ヒトＳＶＣＴ２残基４５９−４９８（配列番号１２）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項６２に記載のペプチド。
  71. ヒトＳＶＣＴ１残基４００−４２５（配列番号１１の残基１−２６）、４０５−４３９（配列番号１１の残基６−４０）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７０に記載のペプチド。
  72. ヒトＳＶＣＴ１残基４０３−４２５（配列番号１１の残基４−２６）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７１に記載のペプチド。
  73. ヒトＳＶＣＴ１残基４０３−４１２（配列番号１１の残基４−１３）、４１０−４１９（配列番号１１の残基１１−２０）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７２に記載のペプチド。
  74. ヒトＳＶＣＴ１残基４１５−４３９（配列番号１１の残基１６−４０）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７１に記載のペプチド。
  75. ヒトＳＶＣＴ１残基４１５−４２５（配列番号１１の残基１６−２６）、４２３−４３３（配列番号１１の残基２４−３４）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７４に記載のペプチド。
  76. ヒトＳＶＣＴ２残基４５９−４８４（配列番号１２の残基１−２６）、４６４−４９８（配列番号１２の残基６−４０）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７０に記載のペプチド。
  77. ヒトＳＶＣＴ２残基４６１−４８３（配列番号１２の残基３−２５）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７６に記載のペプチド。
  78. ヒトＳＶＣＴ２残基４６１−４７０（配列番号１２の残基３−１２）、４６８−４７７（配列番号１２の残基１０−１９）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７７に記載のペプチド。
  79. ヒトＳＶＣＴ２残基４７４−４９８（配列番号１２の残基１６−４０）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７６に記載のペプチド。
  80. ヒトＳＶＣＴ２残基４７４−４８５（配列番号１２の残基１６−２７）、４８３−４９３（配列番号１２の残基２５−３５）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択される、請求項７９に記載のペプチド。
  81. ヒトα１Ａアドレナリン受容体残基８１−１０５（配列番号２０の残基１１−３５）、８１−９１（配列番号２０の残基１１−２１）および８９−９８（配列番号２０の残基１９−２８）、ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−１１３（配列番号２７の残基１２−３６）、８９−９９（配列番号２７の残基１２−２２）および９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２９）、ヒトＳＶＣＴ１残基４００−４２５（配列番号１１の残基１−２６）、４０５−４３９（配列番号１１の残基６−４０）、４０３−４２５（配列番号１１の残基４−２６）、４０３−４１２（配列番号１１の残基４−１３）、４１０−４１９（配列番号１１の残基１１−２０）、４１５−４３９（配列番号１１の残基１６−４０）、４１５−４２５（配列番号１１の残基１６−２６）および４２３−４３３（配列番号１１の残基２４−３４）、およびヒトＳＶＣＴ２残基４５９−４８４（配列番号１２の残基１−２６）、４６４−４９８（配列番号１２の残基６−４０）、４６１−４８３（配列番号１２の残基３−２５）、４６１−４７０（配列番号１２の残基３−１２）、４６８−４７７（配列番号１２の残基１０−１９）、４７４−４９８（配列番号１２の残基１６−４０）、４７４−４８５（配列番号１２の残基１６−２７）および４８３−４９３（配列番号１２の残基２５−３５）、およびそれらの同族体からなる群から選択される、請求項６２に記載のペプチド。
  82. アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を伝達する補体化合物を同定する方法であって、
    （ａ） アスコルベート結合ドメインを含んでなるアドレナリン受容体またはその断片へのアドレナリン作動性化合物の第一の結合アフィニティーを測定し、
    （ｂ） 補体化合物の存在下における上記アドレナリン作動性化合物の上記アドレナリン受容体またはその断片への第二の結合アフィニティーを測定し、
    （ｃ） 第一の結合アフィニティーを第二の結合アフィニティーと比較する
    ことを含んでなり、
    第二の結合アフィニティーが第一の結合アフィニティーからかなり異なるときには、補体化合物がアドレナリン作動性結合を伝達する、方法。
  83. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトアドレナリン受容体α１Ａ残基７１−１１５（配列番号２０）、およびヒトアドレナリン受容体β２残基７８−１２２（配列番号２７）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８２に記載の方法。
  84. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトα１Ａアドレナリン受容体残基８１−１０５（配列番号２０の残基１１−３５）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８３に記載の方法。
  85. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトα１Ａアドレナリン受容体残基８１−９１（配列番号２０の残基１１−２１）、８９−９８（配列番号２０の残基１９−２８）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８４に記載の方法。
  86. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−１１３（配列番号２７の残基１２−３６）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８３に記載の方法。
  87. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−９９（配列番号２７の残基１２−２２）、９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２９）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８６に記載の方法。
  88. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−９９（配列番号２７の残基１２−２２）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８７に記載の方法。
  89. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトβ２アドレナリン受容体残基９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２９）、およびそれらの同族体、およびそれらの活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８７に記載の方法。
  90. 上記アドレナリン受容体またはその断片が、ヒトα１Ａアドレナリン受容体残基８１−１０５（配列番号２０の残基１１−３５）、８１−９１（配列番号２０の残基１１−２１）および８９−９８（配列番号２０の残基１９−２８）、ヒトβ２アドレナリン受容体残基８９−１１３（配列番号２７の残基１２−３６）、８９−９９（配列番号２７の残基１２−２２）、および９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２９）、およびそれらの同族体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項８２に記載の方法。
  91. ａ． 少なくとも１種類のアドレナリン受容体、
    ｂ． 試験化合物、および
    ｃ．１． 上記受容体を上記試験化合物と接触させ、
    ２． アドレナリン受容体と試験化合物との間の結合アフィニティーを測定する
    ことを含んでなる上記アドレナリン作動性化合物の使用説明書
    を含んでなる、キット。
  92. アドレナリン作動性補体をも含んでなる、請求項９１に記載のキット。
  93. 上記アドレナリン作動性補体が、アスコルベート、オピオイド、およびポリカルボン酸キレート化剤を含んでなる群から選択される、請求項９２に記載のキット。
  94. 上記アドレナリン作動性補体がアスコルベートである、請求項９３に記載のキット。
  95. 上記アスコルベートが、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルベート、デヒドロソアスコルビン酸、デヒドロソアスコルベート、２−メチル−アスコルビン酸、２−メチル−アスコルベート、アスコルビン酸２−リン酸塩、アスコルビン酸２−硫酸塩、無水Ｌ−アスコルビン酸カルシウム、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビルエステル、アスコルビルエーテル、エリソルベート、およびそれらの混合物を含んでなる群から選択される、請求項９４に記載のキット。
  96. 上記アドレナリン受容体が天然のコンホメーション状態である、請求項９１に記載のキット。
  97. 上記アドレナリン受容体がヒトα１ａアドレナリン受容体である、請求項９１に記載のキット。
  98. 上記α１ａアドレナリン受容体が残基８９−１１５（配列番号２０の残基１９−４５）を含んでなる、請求項９７に記載のキット。
  99. 上記アドレナリン受容体がヒトβ２アドレナリン受容体である、請求項９１に記載のキット。
  100. 上記β２ａアドレナリン受容体が残基９７−１２１（配列番号２７の残基２０−４４）を含んでなる、請求項９９に記載のキット。
  101. アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を伝達する化合物を同定する方法であって、
    上記アドレナリン受容体の結合ドメインを含んでなるポリペプチドを提供し、
    上記ポリペプチドを上記アドレナリン作動性化合物および試験化合物と接触させ、
    上記アドレナリン作動性化合物の上記ポリペプチドへの結合が上記試験化合物の存在下で減少し、この結合の減少が、上記アドレナリン作動性化合物の上記アドレナリン受容体への結合を上記試験化合物が阻害する指標となるかどうかを決定し、または
    上記アドレナリン作動性化合物の上記ポリペプチドへの結合が上記試験化合物の存在下で増加し、この結合の増加が、上記アドレナリン作動性化合物の上記アドレナリン受容体への結合を上記試験化合物が促進する指標となるかどうかを決定する
    ことを含んでなる、方法。
  102. 上記アドレナリン受容体がヒトα１ａアドレナリン受容体である、請求項１０１に記載の方法。
  103. 上記結合ドメインがヒトα１ａアドレナリン受容体残基８９−９８（配列番号２０の残基１９−２８）のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０２に記載の方法。
  104. 上記結合ドメインがヒトα１ａアドレナリン受容体残基９８−１０５（配列番号２０の残基２８−３５）のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０２に記載の方法。
  105. 上記アドレナリン受容体がヒトβ ２アドレナリン受容体である、請求項１０１に記載の方法。
  106. 上記結合ドメインがヒトβ２アドレナリン受容体残基残基７８−１２２（配列番号２７）のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０５に記載の方法。
  107. 上記結合ドメインがヒトβ２アドレナリン受容体残基残基９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２８）のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０５に記載の方法。
  108. 更に、上記化合物の製造を含んでなる、請求項１０１に記載の方法。
  109. 上記化合物がアドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を阻害する、請求項１０８に記載の方法。
  110. 上記化合物がアドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体への結合を増加する、請求項１０８に記載の方法。
  111. 更に、製造した化合物を用いる患者の治療を含んでなる、請求項１０８に記載の方法。
  112. 上記患者が呼吸閉塞、鬱血、目の刺激、心疾患、止血、ショック、パーキンソン病を発現し、麻酔を用いる治療を必要とする、請求項１１０に記載の方法。
  113. 生体アミンＧＰＣＲのアミノ酸配列の一部を有するポリペプチドをコードし、上記一部がＧＰＣＲＥ１、ＴＭ３またはＥ１−ＴＭ３アスコルベート結合ペプチドのアミノ酸配列を含む、組換えまたは単離核酸。
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