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JP2008513027A - フェニルアラニンアンモニアーリアーゼの改変体および化学的に修飾された改変体 - Google Patents

フェニルアラニンアンモニアーリアーゼの改変体および化学的に修飾された改変体 Download PDF

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ロバート ヘフト，
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バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド
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Abstract

本発明は、ヒトまたは動物の身体においてフェニルアラニンのアンバランスに関連する疾患を予防または治療するための蛋白質フェニルアラニンアンモニアーリアーゼ、ならびに該蛋白質の生物学的に活性な誘導体の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、イン・ビボでフェニルアラニンのアンバランスを予防または治療するための前記分子の治療的使用に関する。また、本発明は、前記治療分子の医薬上活性な量を含む治療組成物、ならびに該治療組成物を用いる治療方法に関する。最後に、本発明は、該蛋白質のより治療上有効な改変体を選択する方法、ならびに選択された改変体それ自体に関する。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、その全てをここに引用してその全体を援用する、２００４年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／６１０，７７０号、および２００５年２月９日に出願された第６０／６５１，９５０号の利益を主張する。
（発明の技術分野）
本発明は、フェニルアラニンアンモニアーリアーゼ（ＰＡＬ）、ＰＡＬアナログ、その組成物に対するＸ線結晶データ、およびＰＡＬ安定性を増強し、およびＰＡＬの免疫原性および／または蛋白質分解感度を低下させるそのような組成物の最適化に関する。本発明は、さらに、治療および産業目的でのＰＡＬのそのような最適な組成物の使用に関する。また、本発明は、ヒスチジンアンモニア−リアーゼ（ＨＡＬ）アナログ、そのようなアナログを含有する組成物、および関連組成物に関する。
ＰＡＬは植物（非特許文献１；非特許文献２；Ｐｏｐｐｅら、（２００３）ｉｂｉｄ．）、いくつかの真菌（非特許文献３）および酵母（非特許文献４）に広く分布した非−哺乳動物酵素であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて組換えにより生産することもできる。
ＰＡＬの代表的なリストは：Ｑ９ＡＴＮ７ Ａｇａｓｔａｃｈｅ ｒｕｇｏｓａ；Ｏ９３９６７ Ａｍａｎｉｔａ ｍｕｓｃａｒｉａ（ベニテングダケ）；Ｐ３５５１０，Ｐ４５７２４，Ｐ４５７２５，Ｑ９ＳＳ４５，Ｑ８ＲＷＰ４ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）；Ｑ６ＳＴ２３ Ｂａｍｂｕｓａ ｏｌｄｈａｍｉｉ（巨大樹木竹）；Ｑ４２６０９ Ｂｒｏｍｈｅａｄｉａ ｆｉｎｌａｙｓｏｎｉａｎａ（ラン）；Ｐ４５７２６ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）；Ｑ９ＭＡＸ１Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ（ニチニチソウ）（マダガスカルニチニチソウ）；Ｑ９ＳＭＫ９ Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（ヒヨコマメ）；Ｑ９ＸＦＸ５，Ｑ９ＸＦＸ６ Ｃｉｔｒｕｓ ｃｌｅｍｅｎｔｉａ ｘ Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ；Ｑ４２２６７ Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ（レモン）；Ｑ８Ｈ６Ｖ９，Ｑ８Ｈ６Ｗ０ Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（ロバスタコーヒーノキ）；Ｑ８５２Ｓ１ Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ（ニンジン）；Ｏ２３９２４）Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ（キツネノテブクロ）；Ｏ２３８６５）Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ（ニンジン）；Ｐ２７９９１）Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（大豆）；Ｏ０４０５８）Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）；Ｐ１４１６６（Ｑ４２８５８）Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ（カンショ）；Ｑ８ＧＺＲ８，Ｑ８Ｗ２Ｅ４ Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ（ガーデンレタス）；Ｏ４９８３５，Ｏ４９８３６ Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ；Ｐ３５５１１，Ｐ２６６００ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）；Ｐ３５５１２ Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（リンゴ）（Ｍａｌｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）；Ｑ９４Ｃ４５，Ｑ９４Ｆ８９ Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ）（Ｍａｎｉｏｃ）；Ｐ２７９９０ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）；Ｐ２５８７２，Ｐ３５５１３，Ｐ４５７３３ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）；Ｑ６Ｔ１Ｃ９ Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｕｂｅｒ（コルクガシ）；Ｐ１４７１７，Ｐ５３４４３，Ｑ７Ｍ１Ｑ５，Ｑ８４ＶＥ０，Ｑ８４ＶＥ０ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（稲）；Ｐ４５７２７ Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（アボカド）；Ｑ９ＡＸＩ５ Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ ｎｉｌ（紫）（アサガオ）；Ｐ５２７７７ Ｐｒｉｎｕｓ ｔａｅｄａ（タエダマツ）；Ｑ０１８６１，Ｑ０４５９３ Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ガーデンピー）；Ｐ２４４８１，Ｐ４５７２８，Ｐ４５７２９ Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ（パセリ）（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｈｏｒｔｅｎｓｅ）；Ｑ８４Ｌ１２ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｘ Ｄｏｒｉｔａｅｎｏｐｓｉｓ ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ；Ｐ０７２１８，Ｐ１９１４２，Ｐ１９１４３ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ（インゲンマメ）（Ｆｒｅｎｃｈ ｂｅａｎ）；Ｑ７ＸＪＣ３，Ｑ７ＸＪＣ４ Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎａｓｔｅｒ（カイガンショウ）；Ｑ６ＵＤ６５ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ ｓｕｂｓｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ；Ｐ４５７３１，Ｑ４３０５２，Ｏ２４２６６ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ（ヤマナラシ）；Ｑ８Ｈ６Ｖ５，Ｑ８Ｈ６Ｖ６ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（ヤマナラシ）；Ｐ４５７３０ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（西洋アメリカポプラ）；Ｏ６４９６３ Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ（チェリー）；Ｑ９４ＥＮ０ Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ；Ｐ１１５４４ Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｒｕｌｏｉｄｅｓ（酵母）（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）；Ｐ１０２４８ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ（酵母）（Ｒｈｏｄｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）；Ｑ９Ｍ５６８，Ｑ９Ｍ５６７ Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ（キイチゴ）；Ｐ３１４２５，Ｐ３１４２６ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）；Ｑ６ＳＰＥ８ Ｓｔｅｌｌａｒｉａ ｌｏｎｇｉｐｅｓ（長茎ハコベ（Ｌｏｎｇｓｔａｌｋ Ｓｔａｒｗｏｒｔ））；Ｐ４５７３２ Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ ｈｕｍｉｌｉｓ（タウンズビレスタイロ（Ｔｏｗｎｓｖｉｌｌｅ ｓｔｙｌｏ））；Ｐ４５７３４ Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ（ジモグリツメクサ）；Ｑ４３２１０，Ｑ４３６６４ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（小麦）；Ｑ９６Ｖ７７ Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ（スマット菌）；Ｐ４５７３５ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）；およびＱ８ＶＸＧ７ Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）を含む。
ヒスチジンアンモニア−リアーゼ（ＨＡＬ，Ｅ．Ｃ．４．３．１．３）は哺乳動物ならびに細菌源（非特許文献５；非特許文献６）で見出され、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａからのヒスチダーゼの結晶構造は知られている（非特許文献７）。ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅからのＨＡＬは、ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＨＳＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、および癌のようなヒスチジン−および／またはヒスタミン−依存性病理を治療するためにＬ−ヒスチジノールとの組合せ療法で用いることが提案されている（特許文献１）。
ＨＡＬの代表的なリストはＱ９ＫＷＥ４（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ），Ｑ８Ｕ８Ｚ７（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ），Ｑ６ＫＰＫ９，Ｑ８ＩＹ４５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ），Ｑ７３３Ｈ８，Ｑ８１ＡＣ６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ），Ｑ９ＫＢＥ６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ），Ｐ１０９４４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），Ｑ８Ａ４Ｂ３（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ），Ｑ８Ｇ４Ｘ５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ），Ｑ８９ＧＶ３（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ），Ｑ８ＹＤ１０（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ），Ｑ８ＦＶＢ４（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ），Ｑ２０５０２（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ），Ｐ５８０８２（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ），Ｑ７ＰＩ８８（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）Ｑ８９１Ｑ１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ），Ｑ９ＲＺ０６（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ），Ｑ８ＲＦＣ２，Ｑ８ＲＤＵ４，Ｑ７Ｐ５Ｎ４（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ），Ｑ７ＮＣＢ３（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ），Ｑ９ＨＱＤ５（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．），Ｐ４２３５７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）），Ｐ３５４９２（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｍｏｕｓｅ）），Ｑ７Ｎ２９６（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ），Ｑ６Ｌ２Ｖ９（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ），Ｑ７ＭＸ８６（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ），Ｑ９ＨＵ８５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ），Ｑ９ＨＵ９０（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ／ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ），Ｑ８ＶＭＲ３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ），Ｑ８８ＣＺ７，Ｐ２１３１０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ），Ｑ８７ＵＭ１，Ｑ８７ＵＭ２，Ｑ８７Ｖ４２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ），Ｑ８ＸＷ２９（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ），Ｐ２１２１３（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｃｇｉｃｕｓ（Ｒａｔ），Ｑ９８３１０，Ｑ９８７Ｂ４，Ｑ９８ＪＹ１，Ｑ９８ＮＧ３（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ，Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ），Ｏ３１１９７ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ），Ｑ８Ｚ８９６（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ），Ｑ８ＺＱＱ９（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ），Ｑ８Ｅ９Ｂ０，Ｑ８ＥＫＪ４（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ），Ｑ９９ＸＧ３，Ｑ８ＮＹＹ３（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ），Ｑ９３ＴＸ３（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）Ｑ９ＥＷＷ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ｐ２４２２１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ），Ｑ８Ｋ５Ｌ，Ｑ８ＮＺ４６，Ｐ５８０８３（Ｓｔｒｅｐｔｐｃｐｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｓ），Ｑ９ＨＬＩ６（Ｔｈｅｒｍｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ），Ｑ８ＲＢＨ４（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ），Ｑ９７８Ｎ８（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ），Ｑ７３Ｑ５６（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ），Ｑ９ＫＳＱ４（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ），Ｑ８７Ｑ７７（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）Ｑ８ＤＡ２１，Ｑ７ＭＫ５８，Ｑ７ＭＭＪ６，Ｑ８ＤＦＺ８（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ），Ｑ８ＰＬＺ８（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ），Ｑ８ＰＡＡ７（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ），Ｑ８ＺＡＩ０（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）を含む。
（ＰＫＵ治療のための酵素置換療法）
多数の研究は、ＰＫＵの酵素置換治療のための酵素フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ，ＥＣ ４．３．１．５）の適用に焦点を当ててきた（非特許文献８；非特許文献９）；Ｈｏｓｋｉｎｓら、（１９８２）ｉｂｉｄ．；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、（１９９９）ｉｂｉｄ．；非特許文献１０；非特許文献１１；Ｇａｍｅｚ，Ｉｎ ｐｒｅｓｓ；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；特許文献２）。
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、フェニルアラニンの代謝を担う酵素である肝臓フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の損なわれた活性に由来するアミノ酸代謝の先天的なエラーである。ＰＫＵおよび過剰フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）に導くＰＡＨ突然変異を持つ患者は、損なわれた神経生理学機能および低下した認識発生を呈する。重篤なＰＫＵを有する患者では、フェニルアラニンが食事制限を用いて低レベルで制御されるのでなければ、不可逆的な精神的遅延についての可能性がある。ＰＡＬはフェニルアラニンを、無害な代謝産物であるアンモニアおよびトランス−桂皮酸に変換し、これは、さらに代謝され、ヒププレートとして尿中に排出される（非特許文献８；非特許文献２６）。
ＰＫＵについての現在の治療は、蛋白質およびアミノ酸フェニルアラニンが低い生活の制限された食事への固執を含む（非特許文献２７）。この食事療法は維持するのが困難で（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０）、上昇したフェニルアラニンレベルによって引き起こされかねない損傷神経学的効果を常に排除せず（非特許文献３１）；妊娠中の理想的よりも低い食事制御は出生障害に導きかねない（非特許文献２７）。加えて、ＰＫＵ／ＨＰＡ患者が制限された食事に従いつつ普通の生活を送るのは非常に困難であり、食事療法は、そのいくつかは脳の発達に有害である、いくつかの栄養素の欠乏に関連し得る（非特許文献２７）。最も低いフェニルアラニン食産物は、この治療でのコンプライアンスは妥協される十分に不満足な官能的特性を有する（非特許文献２７）。従って、治療的処置の開発は現在の食事処置を助け、特に、該疾患の最も重篤な形態を有する患者につき、ＰＫＵを持つ個体に降りかかった神経学的損傷を妨げるであろう。
１９９９年、Ｓｃｒｉｖｅｒらは、ＰＫＵ酵素置換適用のためのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ，Ｃ．Ｎ．ら、１９９９ ｉｂｉｄ．）からの酵素ＰＡＬの使用についての彼らの最初の研究を報告した。マウスＰＫＵおよびＨＰＡモデルの研究は、（アプロチニンプロテアーゼ阻害剤と組み合わせたＰＡＬまたはＥ．ｃｏｌｉ細胞内部で組換えにより発現され、そこに存在するＰＡＬいずれかを用いる腹腔内注射によるまたは経口による）ＰＡＬ投与は、血漿フェニルアラニンレベルを首尾よく降下させることができたことを示した。加えて、ＰＫＵ患者でのＰＡＬの使用を記載する予備的研究は、腸溶被覆ゼラチンカプセルで投与されるＰＡＬを用いる（非特許文献８）、または体外酵素工場を用いる（非特許文献２５）フェニルアラニンレベルの低下を示した。しかしながら、プロテアーゼ不活化に対するＰＡＬの感度（プロテアーゼ分解による胃の条件での低い活性）、および（免疫応答の解明による）反復されたイン・ビボ注射後に見出された低下した半減期は、臨床的治療剤としての天然ＰＡＬ蛋白質のさらなる開発を制限する。
（他の治療剤の使用）
癌治療用のＰＡＬの使用もまた、癌細胞へのフェニルアラニンの栄養供給を制限し、それにより、新生物成長を阻害するその能力に基づいて提案されている（非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６）。しかしながら、静脈内注射されたＰＥＧ化ＰＡＬは１３回目の注射後に循環血液から迅速に除去された。加えて、フェニルアラニンのＰＡＬ−媒介低下は、ネズミ白血病および転移性メラノーマの増殖を妨げた（非特許文献３７、非特許文献３３、非特許文献３４）。
ＰＡＬはチロシン血病でも用いられてきた（非特許文献１８）。ヒスチジンアンモニア−リアーゼ（ＨＡＬ）は、ヒスチジン血症治療用の酵素置換療法で用いられてきた。ヒスチジンは、欠陥のあるＨＡＬによるヒスチジン代謝の常染色体劣性障害であり、伝統的には、良性の疾患である（非特許文献５）。
（ＰＡＬのさらなる使用）
ＰＡＬは、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（アスパルテーム生産用（非特許文献３８；非特許文献３９）、および医薬前駆体として用いられる他の置換されたＬ−フェニルアラニン誘導体（特許文献３）の合成での重要な産業的用途を有する。
また、ＰＡＬは農業的重要性も有し、植物、真菌および細菌においてリグニン、クマリンおよびフラバノイドを生産するフェニルプロパノイドに導く最初の酵素的プロセスである。全てのフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ，ＥＣ ４．３．１．５）は、植物におけるリグニン、フラボノイドおよびクマリンの前駆体である桂皮酸を生産する（非特許文献４０）。よって、ＰＡＬ活性の変調は、果実の茶色化のような多数の農業的現象に影響し得る。加えて、活性部位ＰＡＬ阻害剤の構造ベースのドラッグデザインは、効果的な除草剤に導き得る（Ｐｏｐｐｅ，Ｌ．ら、ｉｂｉｄ．）。
ＰＡＬは種々の産業的および治療的適用を潜在的に有するが、ＰＡＬの使用は低下した比活性および蛋白質分解不安定性によって制限され得る。他の治療蛋白質と同様に、酵素療法としてのＰＡＬの使用は、免疫原性および蛋白質分化感度のようないくつかの不利によって達成される。さらに、デリケートなバランスが、過剰フェニルアラニン血症によって特徴付けられる障害における、正常な幾分狭い範囲内で血漿フェニルアラニンレベルの制御を達成しかつ維持するのに、基質親和性および酵素活性の間で必要である。今までのところ、これらのパラメーターの改良に向けての協調された努力は、この蛋白質についての構造的および生化学的知識の不足のため試されてこなかった。
（治療的利点のための蛋白質治療剤および効果的な再設計）
多数の蛋白質が、遺伝的障害によって引き起こされる代謝不全を緩和するのに治療的に用いられている。最も注目すべき例の中には、糖尿病の治療のための非経口投与されるインスリン、ポンペ病における酵素置換療法のためのアルファ−グルコシダーゼ（および他のリソソーム貯蔵病で用いられる他の酵素（非特許文献４１）、Ｃ型肝炎または癌治療のためのインターフェロン−アルファ、および重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）療法のためのアデノシンデアミナーゼ（非特許文献４２）がある。生憎と、これらの注射された外来性蛋白質の寿命は、急性アレルギー反応および血流からの迅速なクリアランスのために通常は減少する。
蛋白質治療剤の効果は、合理的設計、指向性進化、化学的修飾、およびコンビナトーリアル最適化戦略を含めた蛋白質工学方法で改良することができる。合理的設計は、三次元構造情報の取得可能性、および特異的二次構造を形成するための、側鎖疎水性、極性、電荷、電子的寄与、および性質のような遺伝的特性と組み合わせた、構造の関係での側鎖の向きおよび運動性の考慮を必要とする。合理的蛋白質修飾方法の中では、最も有望な解決は、構造ベースの蛋白質工学を用いて改変体を生産することを含む。
構造ベースの蛋白質工学の多数の例が存在し、そこでは、構造ベースの設計技術を用いて改良された特性が蛋白質に設計されてきた（非特許文献４３；非特許文献４４）。蛋白質の部位特異的突然変異誘発を用いて、切形、挿入および／または点突然変異を含む蛋白質改変体を創製することができ、改良された安定性、活性および／または改変された活性に導く（非特許文献４５）。キメラ、または２つの蛋白質の組合せが、多数の治療抗体および蛋白質の例のために首尾よく開発されてきた。さらなる効果的な蛋白質工学アプローチは、特異的蛋白質ループ再−エンジニアリング（非特許文献４６）、ループスワッピング（非特許文献４７；非特許文献４８）、およびサブドメインシャッフリング（非特許文献４９）アプローチを用いてきた。
（蛋白質治療剤のための免疫学的応答の低下）
多数の戦略が、治療的に投与された蛋白質の免疫応答を最小化するために工夫されてきた（非特許文献５０；特許文献４および特許文献５）。抗体のようないくつかの蛋白質クラスでは、増大するヒト配列含有量（キメラおよび／または「ヒト化」）は免疫反応性を低下させ、他方、蛋白質溶液特性を改良して（例えば、凝集性質を低下させる）別の効果的な戦略もまた低下した免疫応答に導いた。多数の蛋白質は抗体のエピトープおよびアグレトープを、極性中性残基、アラニン、またはコンピュータにより選択された残基での疎水性かつ荷電した残基の置き換えを含めた反復部位特異的突然変異誘発を用いて除去して、免疫反応性が低い蛋白質改変体を生じた。１つの例において、ストレプトアビジンの部位特異的突然変異誘発を用いて、免疫原性を低下させた（非特許文献５１）。この場合、表面「べニアリング」を用いて、高エネルギーイオンまたは疎水性相互作用を形成して、そのような潜在的相互作用部位を除去することができる表面残基を突然変異させた。次いで、活性なテトラマー蛋白質の高い収率を生じる突然変異体を、マウスおよびヒトにおける低下した抗体認識、およびウサギにおける突然変異体注射に対する最小化された抗体応答についてテストした。一般に、荷電した、芳香族の、または大きな疎水性表面残基に代えてのより小さな中性残基での置換は、ウサギにおいて免疫応答を誘導する能力を低下させた。
部位特異的突然変異誘発は、免疫反応性を軽減するのに点突然変異誘発で成功して用いられた。例えば、抗原決定基の部位特異的合理的修飾を用いて、ＣＤ８（＋）およびＣＤ４（＋）Ｔリンパ球応答をダウンレギュレートさせた（非特許文献５２）。別の免疫反応性低下経路は、アグレトープの除去、抗原−処理細胞認識または結合に対して感受性が低い改変体の創製、またはＭＨＣ結合能力の低下または除去を含む。異なるアプローチは、（よりヒトの配列含有量を持つ蛋白質改変体を作成する）ヒト化、（免疫反応性が低い表面特徴を作成する）表面ベニアリング、および特異的突然変異がなされ、次いで、小さくなった免疫反応性についてスクリーニングされる他の同様な方法に頼ってきた。例えば、「イムノステアルス」方法は、イン・シリコ配列分析方法および高−スループットイン・ビトロ生化学スクリーニングアッセイの組合せを用いて、ＨＴＬエピトープを同定し、続いて、それらのＨＴＬ結合能力を改変するための合理的修飾を行い、その結果、免疫系によって認識できない蛋白質改変体がもたらされる（非特許文献５３）。加えて、構造ベースの蛋白質エンジニアリングの方法を、スクリーニングおよび／または選択を用いて、より好都合な蛋白質改変体を開発することができる、指向性進化のようなより「ランダムな」蛋白質修飾方法と組み合わせることができる。
別のアプローチにおいて、注目する蛋白質への、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような水溶性ポリマーの化学的コンジュゲーションは、イン・ビボにて蛋白質の半減期を延長するのにしばしば用いられる通常のアプローチである。一般に、ポリエチレングリコール分子を、蛋白質上で見出される反応性基を介して蛋白質に連結させる。リシン残基上の、またはＮ−末端におけるもののようなアミノ基はそのような付着で便宜である。注目する蛋白質への活性化されたＰＥＧ分子の共有結合カップリング（ＰＥＧ化）は、循環半減期を増大させ、免疫原性および抗原性を低下させ、生物活性の保持を行うことが示されている（非特許文献５４；非特許文献５５；非特許文献５６；非特許文献５７；非特許文献５８）。
現在、多数のＰＥＧ化蛋白質治療剤やＦＤＡの認可を受けており、ＰＥＧ−ＩｎｔｒｏｎＴＭ（ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ２ｂ［非特許文献５９］）またはＰｅｇａｓｙｓＴＭ（ＰＥＧ化インターフェロン−アルファ２ａ［非特許文献６０］）を用いてＣ型肝炎および転移性腎臓細胞癌腫；ＯｎｃａｓｐａｒＴＭ（ＰｅｇａｓｐａｒｇａｓｅＴＭまたはＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼを用いて急性リンパ芽細胞腫白血病［非特許文献６１］）；ＡｄａｇｅｎＴＭ（ウシＰｅｇａｄｅｍａｓｅＴＭまたはＰＥＧ化アデノシンデアミナーゼ［非特許文献６２］を用いて重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）；およびＳｏｍａｖｅｒｔＴＭ（ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭまたはＰＥＧ化ヒト成長ホルモンアンタゴニスト［非特許文献６３］）を用いて先端巨大症のような多数の疾患を治療するのに非経口的に用いられている。
（ＰＥＧ化蛋白質）
天然蛋白質のＰＥＧ化に加えて、蛋白質の部位特異的ＰＥＧ化もまた行われてきた。部位特異的ＰＥＧ化の例はＣｙｓ−ＰＥＧ化ＩＬ−３（特許文献６および特許文献７）およびＣｙｓ−ＰＥＧ化ＩＬ−２（特許文献８）ならびにＬｙｓ−ＰＥＧ化プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（非特許文献６４）、Ｎ−末端選択的ＰＥＧ化リシン−欠陥突然変異体ＴＮＦ−α（非特許文献６５）、Ｎ−末端部位特異的ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（非特許文献６６）、およびグリコシル化部位特異的ＰＥＧ化ＩＬ−２（非特許文献６７）を含む。特許文献９は、ｐ７５腫瘍壊死因子受容体の部位特異的突然変異およびＰＥＧ化を開示し、特許文献１０は、（Ｎ−結合グリコシル化部位、または天然に生じる蛋白質において通常は溶媒が接近可能な残基の位置における）存在するシステイン残基を介する部位特異的ＰＥＧ化、または部位特異的システイン残基の導入を開示する。Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇ，Ｓ．ら、は、免疫原性を低下させるための、可能な抗原性エピトープ領域の周りの部位特異的ＰＥＧ付着の使用を議論している（非特許文献６８）。蛋白質のイン・ビボ寿命を改良するための同様なアプローチが、Ｃｙｓ−ＰＥＧ化ヒト化抗−インターロイキン−８抗体（Ｌｅｏｎｇら、 （２００１） ｉｄｉｄ．）、および表皮成長因子上で誘導体化されたＮ−末端アルデヒド活性化アルファ−アミン基（非特許文献６９）のために採用されている。関連するアプローチにおいて、ヒトエリスロポエチンの過剰グリコシル化形態は、改善された血清中半減期およびより大きなイン・ビボ能力を呈し、それにより、より頻度の低い投与を可能として、同一の生物学的応答が得られ（非特許文献７０）；エリスロポエチンのこの形態の化学的修飾は、イン・ビボ効率をなおより多く改良した（特許文献１１）。１つの例において、ＰＥＧ化＋さらなる部位特異的突然変異誘発が、活性なＩＬ−１５改変体を作成するのに必要であった（非特許文献７１）。
ＰＥＧ化で安定化された天然Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ ＰＡＬは、癌療法における治療剤として調べれられてきた。しかしながら、これらの剤は残存する免疫原性およびプロテアーゼ感受性を呈し、それにより、それらから臨床テストのようなヒトでの使用を排除した（非特許文献７２）。
産業的適用のためのＬ−フェニルアラニン合成能力を改善し、および治療的適用のためのＰＡＬの免疫原性を低下させるためのＰＡＬのＰＥＧ化が報告されている。特許文献１２および特許文献１３は、各々、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−フェニルアラニンアナログの生産のためにＰＡＬの活性を改良するための剤としてのポリエチレングリコールの使用を開示する。特許文献３および特許文献１４は、フェニルケトン尿症のためにＰＡＬの免疫原性を安定化し、可溶化し、および／または低下させるためのＰＥＧの使用を記載する。特許文献１０は、半減期を改良し免疫原性および抗原性を減少させて、および生物学的活性の実質的の同一のレベルを保持するための、共有結合ＰＥＧ付着のためのＰＡＬのような蛋白質におけるシステイン残基の部位−導入の特異的使用を開示する。
（経口治療剤）
非経口投与された蛋白質治療剤はそれらの臨床的効果を示したが、別の投与経路も使用される。例えば、食事消化養生法のために用いられる「オーバー−ザ−カウンター」２つの経口酵素置換療法がある。ＢｅａｎｏＴＭ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ ｎｉｇｅｒ（食品グレードの黴）からのアルファ−ガラクトシダーゼは、マメ科植物消費からの不完全な炭水化物処理（および腸ガス形成）に関連する消化不良を治すのに用いられる。加えて、ＬａｃｔａｉｄＴＭ、ラクターゼ酵素の経口的に活性な形態は、ラクトース（乳糖）不耐性に関連する問題を軽減するのに用いられる。これらの製品は、共に、経口投与された酵素が胃腸管において機能でき、食事代謝不良を首尾よく治すことができることを示す。
天然Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬは、プロテアーゼ不活化に対して非常に感受性であり（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ、Ｃ．Ｎ．ら、（１９９９）ｉｂｉｄ．）、部位特異的突然変異誘発および／または経口的に有効なＰＡＬ改変体を生じさせるためのＰＥＧ化のような蛋白質表面保護特徴の導入を必要とする。さらなるプロテアーゼ保護は、マイクロカプセルを用いることによって提供することができる（非特許文献７４）。複雑なマイクロカプセルをさらなる尺度として用いて、胃および腸双方における不活化から治療酵素を保護することができよう。半−透過性マイクロカプセルは、さらに、腸溶物質によってカプセル化して、マイクロカプセルを胃液から保護することができる。カプセル化された酵素が腸に入ると、小さな分子であるＬ−フェニルアラニンは迅速に拡散し、半透過性膜を横切って平衡化し、カプセル化された酵素を解する非毒性産物への変換を可能とすることができる。
特許文献２は、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬの突然変異体を開示し、そこでは、蛋白質分解切断に対して感受性である１以上のアミノ酸が、蛋白質分解切断に対して感受性の低い他のアミノ酸によって置き換えられている。
米国特許出願公開第２００２００５２０３８号明細書 米国特許第５，７５３，４８７号明細書 米国特許出願公開第２００２０１０２７１２号明細書 米国特許第６，６８６，１６４号明細書 米国特許第６，４６１，８４９号明細書 米国特許第５，１６６，３２２号明細書 国際公開第９０／１２８７４号パンフレット 米国特許第５，２０６，３４４号明細書 米国特許第６，４５１，９８６号明細書 米国特許第５，７６６，８９７号明細書 米国特許第６，５８６，３９８号明細書 米国特許第４，５６２，１５１号明細書 米国特許第５，９８１，２３９号明細書 米国特許出願公開第２００３００８２２３８号明細書 Ｋｏｕｋｏｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９６１）２３６，ｐｐ．２６９２−２６９８ Ｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｅｍｚｙｍｅｓ（１９７２）（Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．７５−１６６ Ｒａｏら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９６７）４５１２，ｐｐ．１８６３−１８７２ Ａｂｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１４２，ｐｐ．２４２−２５３ Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９０）２６５（３０），ｐｐ．１８１９２−１８１９９ Ｓｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９３）１２１６（２），ｐｐ．２９３−２９５ Ｓｃｈｗｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９９９）３８（１７），ｐｐ．５３５５−５３６１ Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｌａｎｃｅｔ，（１９８０）ｉ（８１６５），ｐｐ．３９２−３９４ Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，（１９８１）１９９（３）：７１５−７２３ Ｌｉｕら、Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔ，Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００２）３０（４）：２４３−２５７ Ｗｉｅｄｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，（１９７９）２５４（２４）：１２５７９−１２５８７ Ａｍｂｒｕｓら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，（１９８３）２２４（３）：５９８−６０２ Ａｍｂｒｕｓら、Ｓｃｉｃｎｃｅ，（１９７８）２０１（４３５８）：８３７−８３９ Ｋａｌｇｈａｔｇｉ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（１９８０）２７（３）：５５１−５６１ Ａｍｂｒｕｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（１９８２）３７（１）：１０５−１１１ Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（１９８５）１３１（２）５５７−５６３ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，（１９７８）２０（３）：５５９−５６９ Ｍａｒｃｏｎｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，（１９８０）６２（８−９）５７５−５８０ Ｌａｒｕｅら、Ｄｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，（１９８６）９（２）：７３−８１ Ｂｏｕｒｇｅｔら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｃｃｈｎｏｌ．，（１９８４）１０：５７−５９ Ｂｏｕｒｇｅｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，（１９８５）１８０（１）：５−８ Ｂｏｕｒｇｅｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９８６）８８３（３）：４３２−４３８ Ｃｈａｎｇら、Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌ．，（１９９５）２３（１）：１−２１ Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００１）１７（３）：２４９−２６０ Ａｍｂｒｕｓら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，（１９８７）１０６（４），ｐｐ．５３１−５３７ Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．Ａ．ら、"Ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉｃ ａｄｕｌｔｓ：ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ"，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，（１９８４）１１（６），ｐｐ．２９６−３００ Ｌｅｖｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９９９）９６（５），ｐｐ．１８１１−１８１３ Ｍａｔａｌｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，（２００４）６（１），ｐｐ．２７−３２ Ｗｏｏｌｆら、Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．，（１９５８）３３（１６７），ｐｐ．３１−４５ Ｋｉｍ，ＭｏｌＴｈｅｒ．，（２００４）１０（２），ｐｐ．２２０−２２４ Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｃｔ．Ｍｅｔａｂ．，（２０００）６９，ｐｐ．１８８−１９４ Ｆｒｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９７６）２５１（１５）：７２６ Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ．，（１９７６）６０（３）：２６１−２６３ Ｓｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９７７）３７（４）：１０５１−１０５６ Ｓｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ．（１９７９）６３（６）：１０６３−１０６８ Ｗｉｅｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，（１９７９）２５４（２４）：１２５７９−１２５８７ Ａｂｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９７３）３３：２５２９−２５３２ Ｄ‘Ｃｕｎｈａら、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９６）１９（６），ｐｐ．４２１−４２７ Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９８５）３（３），ｐｐ．６４−６８ Ａｌｕｎｎｉら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，（２００３）４１２（２），ｐｐ．１７０−１７５ "Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｃａｓｅｓ"，（１９７３）Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ９，Ｅ．Ｄ．Ｂｅｒｇｓｍａ，Ｅｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９９９）５５（６）：ｐｐ．３８４−３９４ Ｌａｚａｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，（２００３）１３（４），ｐｐ．５１３−５１８ Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，（２００３）８（５），ｐｐ．２１２−２２１ Ｂｒａｎｎｉｇａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，（２００２）３（１２），ｐｐ．９６４−９７０ Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９９３）９０（１２），ｐｐ．５６１８−５６２２ Ｗｉｌｋｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９９２）３１（３４），ｐｐ．７８０２−７８０６ ３６Ｈｅｄｓｔｒｏｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９２）２５５（５０４９），ｐｐ．１２４９−１２５３ Ｈｏｐｆｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９９８）９５（１７），ｐｐ．９８１３−９８１８ Ｃｈｉｒｉｎｏら、 Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，（２００４）９（２）， ｐｐ．８２−９０ Ｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，（２００１）１０（３），ｐｐ．４９１−５０３ Ａｂｒａｍｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２０００）１２（１）， ｐｐ．８５−９１ Ｔａｎｇｒｉら、 Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（２００２）９（２４）， ｐｐ．２１９１−２１９９ Ｈａｒｒｉｓら、 Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，（２００３） ２（３），ｐｐ．２１４−２２１ Ｇｒｅｅｍｗａｌｄら、 Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，（２００３） ５５（２），ｐｐ．２１７−２５０ Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、 ＡｄｖＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，（２００２） ５４（４），ｐｐ．４５３−４５６ Ｍｅｈｖａｒ， Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，（２０００） ３（１），ｐ．１２５−１３６ Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（１９９２）９（３−４），ｐｐ．２４９−３０４ Ｗａｎｇら、 Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，（２００２） ５４（４）， ｐｐ．５４７−５７０ Ｒａｊｅｎｄｅｒ Ｒｅｄｄｙら、 ‘Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，（２００２） ５４（４），ｐｐ．５７１−５８６ Ｇｒａｈａｍ， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，（２００３） ５５（１０），ｐｐ．１２９３−１３０２ Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ， Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，（１９９３） ４（１−４）， ｐｐ．９３−９７ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，（２００３） ５５（１０）， ｐｐ．１３０３−１３１４ Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９１） ８８，ｐｐ．７１８５−７１８９ Ｙｏｓｈｉｏｋａら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｏｍｕｎ．，（２００４） ３１５（４）、ｐｐ．８０８−８１４ Ｋｉｎｓｔｌｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，（１９９６） １３（７），ｐｐ．９９６−１００２ Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９０） ８（４）， ｐｐ．３４３−３４６ Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，（２００４） ２１（６）， ｐｐ．８９７−９０３ Ｌｅｅら、 Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，（２００３） ２０（５）， ｐｐ．８１８−８２５ Ｅｇｒｉｅら、 ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，（２００１） ８４（Ｓｕｐｐｌ １）， ｐｐ．３−１０ Ｐｅｔｔｉｔら、 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，（１９９７）２７２（４）ｐｐ．２３１２−２３１８ Ｗｉｅｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ ＣＨｅｍ．，（１９７９）２５４（２４），ｐｐ．１２５７９−１２５８７ Ｗａｎｇら、"Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９３）２１（５），ｐｐ．６３７−６４６
かくして、優れた触媒活性およびより大きな生物学的半減期、より大きな生化学安定性、および減衰した免疫原性を含めた最適な動的特徴を持つＰＡＬおよびＨＡＬ分子に対する要望が存在する。
（発明の要旨）
本発明は、結晶化されたＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）の三次元構造の同定および特徴付けに基づく。本発明は、結晶化されたＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、および１．６Å以上の解像度と決定された結晶化されたＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓＰＡＬの三次元構造を提供する。本発明では、より優れた触媒活性、より大きな生化学的安定性のような増強された特性を持ち、かつ治療的適用、減衰された免疫原性およびより大きな生物学的半減期のための、突然変異体およびアナログを含めた改変体の調製が考えられる。本発明は、かくして、ＰＡＬおよびその生物学的に活性な断片、突然変異体改変体およびアナログの最適な組成物、それらの生産および精製、および治療的および産業的目的のそのような組成物を用いる方法を提供する。
第１の態様において、本発明は、結晶化されたＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、および１．６Å以上の解像度と決定された結晶化されたＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓＰＡＬの三次元構造を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、ＰＡＬの三次元構造を評価することによってＰＡＬの表面−露出残基を測定する方法、およびＰＡＬの改変体および突然変異体を設計するための情報の使用を提供する。各得られたＰＡＬの改変体および突然変異体は、治療剤としての、または産業的適用における用途を見出す。
第２の態様において、本発明は、構造ベースの分子エンジニアリングアプローチによって得られた最適化されたＰＡＬの組成物、および／またはＰＡＬの化学的に修飾された（例えば、ＰＥＧ化）形態を提供する。いくつかの実施形態では、増強された安定性、低下した免疫原性および／または蛋白質分解感度を持つＰＡＬの最適な組成物が考えられる。
第３の態様において、本発明は、治療および産業目的でＰＡＬ組成物を用いる新規な方法をその要旨とする。１つの実施形態において、本発明では、治療上有効量のＰＡＬを含む医薬組成物をかかる治療を必要とする被験体に投与することによって、ＰＡＨ活性の欠乏に全てまたは部分的に引き起こされる障害を治療する方法が考えられる。ＰＡＨ活性の欠乏は、例えば、ＰＡＨ活性の正常なレベルと比較して５０％以下、２５％以下、または１０％以下もしくは１％以下の活性レベルとして観察することができ、例えば、過剰フェニルアラニン血症、軽度のフェニルケトン尿症または古典的な重症フェニルケトン尿症におけるような上昇したフェニルアラニンレベルを呈することができる。
特定の実施形態において、該被験体は、突然変異体フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を有するものと診断されたものである。突然変異体ＰＡＨは、ＰＡＨの触媒ドメインにおける突然変異を含むことができる。そのような突然変異の例は、限定されるものではないが、突然変異Ｆ３９Ｌ、Ｌ４８Ｓ、１６５Ｔ、Ｒ６８Ｓ、Ａ１０４Ｄ、Ｓ１１０Ｃ、Ｄ１２９Ｇ、Ｅ１７８Ｇ、Ｖ１９０Ａ、Ｐ２１１Ｔ、Ｒ２４１Ｃ、Ｒ２６１Ｑ、Ａ３００Ｓ、Ｌ３０８Ｆ、Ａ３１３Ｔ、Ｋ３２０Ｎ、Ａ３７３Ｔ、Ｖ３８８Ｍ、Ｅ３９０Ｇ、Ａ３９５Ｐ、Ｐ４０７ＳおよびＹ４１４Ｃを含む。
また、被験体の血漿フェニルアラニン濃度の減少を生じさせるのに効果的な量のＰＡＬ組成物を被験体に投与することを含む、（例えば、１８０μＭより大きな、より好ましくは３６０μＭより大きな）血漿フェニルアラニンの前記正常濃度を有する被験体を治療する方法が考えられる。該被験体は、ＰＡＬの投与に先立って１８０μＭより大きな血漿フェニルアラニン濃度を有するようである。より具体的には、被験体は１２０μＭおよび２００μＭの間の血漿フェニルアラニン濃度を有する。他の実施形態において、被験体は２００μＭおよび６００μＭの間の血漿フェニルアラニン濃度を有する。さらに他の実施形態において、被験体は６００μＭおよび１２００μＭの間の血漿フェニルアラニン濃度を有する。治療すべき被験体のなお別のクラスは、１２００μＭより大きな制限されない血漿フェニルアラニン濃度を有するものである。
特定の実施形態において、被験体は幼児、さらに詳しくは、１２００μＭよりも大きな血漿フェニルアラニン濃度を有する幼児である。本発明では、幼児の血漿フェニルアラニン濃度の減少を生じるのに効果的な量にてＰＡＬ組成物を被験体に投与することを含む、フェニルケトン尿症を有する幼児を治療する方法が考えられ、ここに、該幼児は０ないし３歳の間であって、該幼児は約３６０μＭないし約４８００μＭの間の血漿フェニルアラニン濃度を有する。ＰＡＬの投与に先立ち、幼児は約１２００μＭのフェニルアラニン濃度を有し、ＰＡＬの投与は血漿フェニルアラニン濃度を約１０００μＭまで減少させる。他の実施形態において、ＰＡＬの投与に先立ち、幼児は約８００μＭのフェニルアラニン濃度を有し、ＰＡＬの投与は血漿フェニルアラニン濃度を約６００μＭまで減少させる。なおさらなる実施形態において、ＰＡＬの投与に先立ち、幼児は約４００μＭのフェニルアラニン濃度を有し、ＰＡＬの投与は血漿フェニルアラニン濃度を約３００μＭまで減少させる。本明細書中で考えられる治療方法は、好ましくは、幼児の血漿フェニルアラニン濃度を約１２０μＭないし約３６０μＭの間の範囲まで、最も好ましくは、約１２０μＭないし約２４０μＭの間の範囲まで低下させるべきである。
また、ここに考えられるのは、単独で、または蛋白質−制限食と組み合わせてＰＡＬを被験体に投与することを含む、過剰フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）を有する妊娠した女性を治療する方法であり、ここに、単独で、または蛋白質−制限食と組み合わせたＰＡＬの投与は、組み合わせた投与の不存在下における濃度と比較して、被験体の血漿中のフェニルアラニン濃度を降下させるのに効果的である。ある実施形態において、被験体は、１８０μＭより大であるが、６００μＭ未満である制限されない血漿フェニルアラニン濃度を有する。他の実施形態において、被験体は、５００μＭよりも大であるが、１２００μＭ未満である制限されない血漿フェニルアラニン濃度を有する。さらに他の実施形態において、被験体は１２００μＭより大きな制限されない血漿フェニルアラニン濃度を有する。１２００μＭより大きな血漿フェニルアラニン濃度を持つ妊娠した被験体は、考えられる妊娠である小児を持つ年齢の女性である被験体のように、このタイプの療法に対する特に魅力的な候補である。被験体が１２００μＭよりも大きな血漿フェニルアラニン濃度を有する実施形態においては、該方法は、さらに、蛋白質−制限食を被験体に投与することを含む。
本発明は、ＰＡＬ、またはその生物学的に活性な断片、突然変異体、改変体またはアナログを被験体に投与することを含む、被験体において古典的な重症フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療する方法を記載し、ここに、ＰＡＬの投与は、ＰＡＬ投与の不存在下における濃度と比較して、被験体の血漿中のフェニルアラニン濃度を降下させるのに効果的なものである。本発明の方法に従う治療のために選択された被験体は、上昇した血漿Ｐｈｅ濃度を有し、そのような濃度は治療剤の不存在下においては１８００μＭより大きいであろう。他の実施形態では、治療養生法の不存在下において１０００μＭよりも大きな血漿フェニルアラニン濃度を有する被験体が考えられる。好ましい実施形態において、本発明の組み合わせた投与方法は、被験体の血漿フェニルアラニン濃度を６００μＭ未満まで減少させる。より好ましくは、それは５００μＭ未満まで減少される。なおより好ましくは、組み合わせた投与は被験体の血漿フェニルアラニン濃度を約１２０μＭないし約３６０μＭの範囲まで減少させる。なおより好ましくは、被験体の血漿フェニルアラニン濃度は約１２０μＭないし約２４０μＭの範囲まで低下される。
好ましい実施形態は、治療すべき生物、好ましくは哺乳動物またはヒトの要望に対して用量を最適化して、疾患徴候を効果的に軽減させることを含む。ＰＡＬは単一日用量、日ベースの複数用量にて、単一週用量または週ベースの複数用量にて投与することができる。いくつかの実施形態において、ＰＡＬ療法は連続的ではなく、むしろ、被験体の血漿フェニルアラニン濃度が３６０μＭ未満まで減少するまで、ＰＡＬを日ベースで投与する。好ましくは、ここに、被験体の血漿フェニルアラニン濃度を日ベースでモニターし、血漿フェニルアラニン濃度の１０％増加が観察された場合、ＰＡＬを投与する。なお他の好ましい実施形態において、用量は毎週１回送達する。本発明では、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量が考えられ、１週間当たり０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲とすることができる。好ましい用量は０．００１ｍｇ／ｋｇ／週である。
経口、経皮、経粘膜、（エアロゾル化を含めた）肺内、筋肉内、皮下または静脈内を含めた、同等の用量を送達する種々の非経口または非経口投与経路が考えられる。関節またはＣＳＦへの直接的なボーラス注射または注入による投与も特別に考えられ、腰穿刺を介する、または大槽を介するクモ膜下腔、大脳内、脳室内等である。好ましくは、該用量は皮下または経口送達される。
ヒト被験体においてＰＡＬ活性を増加させる他の手段もまた考えられ、遺伝子治療を含む。ＰＡＬ遺伝子の導入は、ウイルスベクター、相同組換え、または直接的ＤＮＡ注射を含めた当該分野で公知の種々の手段を介して可能である。この態様の範囲内では、ＰＡＨ欠乏に罹った細胞へイン・ビボ投与することができる、ＰＡＬの全てまたは部分、またはその生物学的に活性な突然変異体またはアナログをコードする核酸配列を要旨とする実施形態がある。
別の実施形態において、ＰＡＬもまた蛋白質制限食と組み合わせて投与することもできる。ここに、該方法で投与される蛋白質−制限食は、フェニルアラニン−制限食であるものであり、ここに、被験体の合計フェニルアラニン摂取は１日当たり６００ｍｇ未満まで制限される。他の実施形態において、蛋白質−制限食は、フェニルアラニン−制限食であり、ここに、合計フェニルアラニンは１日当たり３００ｍｇ未満まで制限される。なお他の実施形態において、蛋白質−制限食は、チロシン、バリン、イソロイシンおよびロイシンのようなアミノ酸を補足したものである。また、ＰＡＬ、および医薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物が考えられる。該組成物は、さらに、医薬蛋白質補充物を含むことができる。他の実施形態において、ＰＡＬ組成物は幼児様式の一部である。なお他の実施形態において、蛋白質補充物はフェニルアラニンフリーである。蛋白質補充物は、好ましくは、２０ｍｇ／１００ｇ補充物の濃度のＬ−チロシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−カルニチン、４０ｍｇ／１００ｇ補充物の濃度のＬ−タウリン、およびセレンで強化される。それは、さらに、ミネラル、例えば、カルシウム、リンおよびマグネシウムの推奨される日用量を含むことができる。補充物は、さらに、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−リシン酢酸、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、およびＬ−アスパラギンからなる群より選択される１以上のアミン酸の推奨される日用量を含むことができる。加えて、該補充物はビタミンＡ、ＤおよびＥの推奨される日用量で強化することができる。該補充物は、好ましくは、補充物のエネルギーの少なくとも４０％を供する脂肪含有量を含む。そのような補充物は、粉末補充物の形態で、または蛋白質バー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｒ）の形態で供することができる。
本発明では、限定されるものではないが、リンパ芽球白血病、乳頭腫瘍、およびメラノーマを含めた種々の形態の新生物増殖および癌を治療する方法が考えられる。
本発明では、アンモニアおよびｔ−シンナメートからのフェニルアラニンの商業的生産のためにＰＡＬを用いる方法が考えられる。フェニルアラニンは、アスパルテーム、甘味剤、ならびに飲料、シリアル、ケーキ、デザート、卵およびチーズ料理、脂肪、油、魚および他のシーフード、肉および肉製品、乳および乳製品、ナッツ、ソースおよび調味料、スープ、糖、ジャムおよびスプレッド、および野菜を含めた他の食品製品で用いられる。
さらに、ＰＡＬは、除草剤、ならびにエンテロシンおよびエリスロマイシンを含めた抗微生物剤の生産で用いることができると考えられる。
第４の態様において、本発明は、酵素を治療的に用いるのを可能とする量のＰＡＬ、またはその生物学的に活性な断片、突然変異体、改変体もしくはアナログを生産する方法をその要旨とする。広い実施形態において、該方法は、ＰＡＬの全てまたは部分、またはその生物学的に活性な断片、突然変異体、改変体またはアナログについてコードするｃＤＮＡまたはＤＮＡを、その発現に適した細胞に形質転換する工程を含む。好ましい実施形態において、発現ベクターを用いて、該ＤＮＡをその発現のための適当な細胞または細胞系に導入する。１つの特に好ましい実施形態において、ｃＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉに形質転換され、組換えＰＡＬは融合蛋白質として過剰発現される。さらなる実施形態において、ＰＡＬを生産する方法は、（ａ）適当な増殖媒地中でＰＡＬの全て、または生物学的に活性な改変体、断片または突然変異体をコードするｃＤＮＡで形質転換された細胞を適当な密度まで増殖させて、シード培養を生じさせ、（ｂ）該形質転換された細胞をバイオリアクターに導入し、（ｃ）適当な増殖培地を該バイオリアクターに供給し、次いで、（ｄ）該酵素を含有する培地からトランスフェクトされた細胞を分離する工程を含む。
別の実施形態において、組換えＰＡＬまたはその改変体は、ベクター、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓｅＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）に関するような誘導性プロモーターとのＮ−末端オクタヒスチジルタグ付き融合蛋白質として過剰発現される。さらなる実施形態においてＰＡＬを生産する方法は：（１）シェークフラスコ中のグリセロールストックからのバイオリアクター／ファーメンター用のシード培養を増殖させ、（２）供給−バッチモードの制御されたバイオリアクターにそのようなシード培養を導入し；（３）７０ないし１００のＯＤ６００の細胞密度に到達するまで（〜２２ないし２５時間）、グルコース−補足培地、ｐＨ（７．８）、＞２０％溶存酸素、１２００ｒｐｍまでのアジテーションにて該培養を増殖させ；（４）０．４ｍＭ ＩＰＴＧで該培養を誘導し；（５）活性変化が＜０．１ ＩＵ／ｍｌとなるまで（ほぼ４０ないし４８時間、および典型的には２００のＯＤ６００）、２２ないし２６０℃の低下した温度にて該培養を増殖させ；次いで、（５）連続的遠心によって細菌を収穫する工程を含む。別の実施形態において、細胞培養媒地は典型的には規定され、酵母エキス蛋白質、ペプトン−トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、痕跡量の塩およびリン酸緩衝塩よりなる。
第５の態様において、本発明は、ＰＡＬ、またはその生物学的に活性な断片、突然変異体もしくはアナログを精製する方法をその要旨とする。１つの実施形態によると、形質転換された細胞塊を増殖させ、破壊し、粗製組換え酵素を得る。外因性物質は、通常、粗製バルクから分離されて、カラムの汚れを防止する。クロマトグラフィー精製は、１または数個のクロマトグラフィー樹脂を用いて行うことができる。引き続いて、精製された蛋白質を、長時間にわたって安定な活性を供するように設計された緩衝液に処方することができる。別の実施形態において、ＰＡＬを精製する方法は（ａ）組換えＰＡＬを含有する細菌の溶解；（ｂ）ウイルスを不活化するための溶解物の熱での処理；（ｃ）第２の連続的遠心工程および／または深さ濾過を用いるこの溶解物の清澄化；（ｄ）木炭濾過工程を通じる成長化された溶解物の通過；（ｅ）（ｄ）（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ０．２μｍフィルターでのような）最終濾過工程を通じての濾液の通過；（ｆ）ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーのような疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂上での最終濾液の通過；（ｇ）（ｆ）Ｑイオン交換カラムのようなアニオン性クロマトグラフィー樹脂上での溶出物の通過；（ｈ）横長濾過での緩衝液交換による最終産物の回収；および（ｉ）最終産物の滅菌の工程を含む。当業者であれば、１以上のクロマトグラフィー工程を省略し、または置き換えることができ、あるいはクロマトグラフィー工程の順序は本発明の範囲内で変更することができることを容易に認識する。所望により、適当な滅菌工程を必要に応じて行うことができる。
第６の態様において、本発明は、限定されるものではないが、ＰＡＬ活性の欠乏によって全てまたは部分的に引き起こされる障害を含めた、疾患の診断のためにＰＡＬ組成物を用いる方法を提供する。１つの実施形態において、ＰＡＬを用いて、血液試料中のフェニルアラニンのレベルを測定する。さらなる実施形態において、本発明では、上昇したレベルのフェニルアラニンを持つ患者の血液試料をモニタリングするのに用いられるＰＡＬを含む診断キットが考えられる。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の好ましい実施形態を示しつつ、詳細な記載および特別な例は説明のためだけに掲げるものであるのは理解されるべきである。なぜならば、本発明の精神および範囲内の種々の変形および修飾は、この詳細な記載から当業者に明らかとなるだろうからである。
（発明の詳細な説明）
特に断りのない限り、明細書および特許請求の範囲を含めた本出願の以下の用語は以下に掲げる定義を有する。明細書および添付の請求の範囲で用いるように、単数形「ある」および「該」は、文脈が明らかに他のことを示すのでなければ、複数の被験体を含む。標準的な化学用語の定義は、Ｇａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（１９９２）”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．”Ｖｏｌｓ．Ａ ａｎｄ Ｂ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを含めた参考書籍で見出すことができる。本発明の実施は、特に示すのでなければ、当業者の技量内の、合成有機化学、マススペクトロスコピー、クロマトグラフィーの分取および分析方法、蛋白質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の慣用的方法を使用する。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）参照。
以下のアミノ酸略語をテキストを通じて用いる：
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｕ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リシン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
用語「ポリペプチド」および「蛋白質」とは、アミン酸残基のポリマーをいい、産物の最少長さに制限されない。かくして、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマー等は定義内に含まれる。全長蛋白質およびその断片は定義に含まれる。該用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、本発明の目的では、「ポリペプチド」は、蛋白質が所望の活性を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、負荷および置換（一般的には性質は保存的）のような修飾を含む蛋白質をいう。これらの修飾は部位特異的突然変異を通じるように慎重なものであり得、あるいはＰＣＲ増幅のため蛋白質またはエラーを生じる宿主で生起する突然変異を通じるように偶然であり得る。
本明細書中で用いるように、「アナログ」または「誘導体」は、与えられた化合物、例えば、ペプチドに対して約７０％を超える配列同様性を有するが、１００％未満の配列同様性を有する化合物、例えば、ペプチドである。そのようなアナログまたは誘導体は、例として、限定されるものではないが、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミンおよびノルバリンを含めた天然に生じないアミノ酸残基、ならびに天然に生じるアミノ酸残基を含むことができる。そのようなアナログまたは誘導体もまた、１または複数のＤ−アミノ酸を含むことができ、２以上のアミノ酸残基の間の非−ペプチド相互結合を含むことができる。
用語「有効量」または「医薬上有効量」とは、所望の生物学的結果を供する剤の非毒性であるが効果的な量をいう。その結果は、疾患の症状、徴候または原因の低下および／または軽減、または生物学的系のいずれかの他の改変であり得る。例えば、治療的使用についての「有効量」は、例えば、心臓発作に由来するもののような、心血管病の徴候の臨床学的に有意な減少を供するのに必要な、本明細書中に開示されたオリゴヌクレレオチドを含む組成物の量である。いずれかの個体の場合における適当な「有効」量は、ルーチン的な実験を用いて当業者によって決定できる。
「処置」とは、予防的処置または治療的処置または診断的処置をいう。
「予防的」処置は、病理を発症する危険性を減少させる目的で、疾患の徴候を呈しない、または初期の徴候のみを呈する被験体に投与される処置である。本発明のコンジュゲート化合物は、病理を発症する尤度を低下させる、またはもし発症すれば、病理の重症度を最小化する予防的処置として与えることができる。
「治療的処置」は、症状または徴候を減少または排除する目的で、それらの症状または徴候を呈する被験体に投与される処置である。該症状または徴候は生化学的、細胞的、組織学的、機能的、主観的、または客観的であってよい。本発明のコンジュゲート化合物は、治療的処置として、または診断のために与えることができる。
「診断」は、病理学的状態の存在または性質の同定を意味する。診断方法は、それらの特異性および選択性において異なる。特定の診断方法は状態の明確な診断を供しないかも知れないが、もし該方法が診断を助ける陽性表示を供するならば、それは満足する。
「医薬組成物」とは、ヒトおよび哺乳動物を含めた、被験体動物における医薬的使用に適した組成物をいう。医薬組成物は、医薬上有効量のＰＡＬポリペプチドを含み、また、医薬上許容される担体を含む。医薬組成物は、有効成分、および担体をなす不活性な成分、ならびにいずれかの２以上の成分の組合せ、複合体化、または凝集から、あるいは１以上の成分の溶解から、あるいは１以上の成分の他のタイプの反応または相互作用から直接的にまたは間接的に由来するいずれかの生成物を含む組成物を含む。従って、本発明の医薬組成物は、本発明のコンジュゲート化合物および医薬上許容される担体を混合することによって作成されたいずれの組成物も含む。
「医薬上許容される」または「薬理学上許容される」は、生物学的に、またはその他で望ましくないのではない物質を意味し、すなわち、該物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こし、あるいはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと有害に相互作用することなく個体に投与することができる。
「医薬上許容される担体」とは、リン酸緩衝化生理食塩水、５％デキストロース水溶液、および油／水または水／油エマルジョンのごときエマルジョン、ならびに種々のタイプの湿潤剤および／またはアジョバントのような、標準的医薬担体、緩衝液、および賦形剤のいずれかをいう。適当な医薬担体および処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。好ましい医薬担体は、活性剤の意図した投与形態に依存する。典型的な投与形態は、腸（例えば、経口）または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内注射；または局所、経皮、または経粘膜投与）を含む。「医薬上許容される塩」は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含めた、医薬用途の化合物に処方することができる塩である。
本明細書中で用いるように、用語「単位投与形態」とは、ヒトおよび動物被験体のための単位の用量として適当な物理的に区別される単位をいい、各単位は、医薬上許容される希釈剤、担体またはビヒクルと一緒に所望の効果を生じるのに十分な量にて計算された、所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の化合物の新規な単位投与形態についての仕様は、使用される特定のコンジュゲート、および達成されるべき効果、および宿主における各化合物に関連するファルマコダイナミックスに依存する。
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」は、包括的にほぼ７．２ないし８．０の範囲の、より典型的には、包括的にほぼ７．２ないし７．６の範囲のｐＨを意味する。
本明細書中で用いるように、用語「被験体」は、哺乳動物および非−哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、限定されるものではないが、哺乳動物クラスのいずれかのメンバー：ヒト、チンパンジーのような非−ヒト霊長類、および他の類人猿およびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタのような農場動物；ウサギ、イヌ、およびネコのような家畜動物；ラット、マウスおよびモルモットのようなげっ歯類を含めた実験室動物、等を含む。非−哺乳動物の例は、限定されるものではないが、鳥類、魚類等を含む。該用語は、特定の年齢または性別を示さない。
（Ａ．構造ベースの蛋白質エンジニアリング）
主として、蛋白質構造情報（Ｂｒａｎｎｉｇａｎ，Ｊ．Ａ．ら、（２００２）ｉｂｉｄ．；７３５Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｓ．Ａ．ら、“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，８（５），ｐｐ．２１２−２２１（２００３））に基づく合理的最適化を用いる蛋白質エンジニアリングのための多数の方法が知られている。構造特徴のシステム的置換は、改良された蛋白質特性および／または基質特異性の再設計に導くことができる。遺伝子ファミリーの１つのメンバーから別の同種メンバーへの機能のレクルートメントは、直ちの基質結合近接における限定された数のアミノ酸置換の導入によって達成することができる。改良された蛋白質改変体を創製することによる蛋白質機能におけるそのような改良は、産業的、農業的、および治療的適用のための有用な蛋白質に導くことができる（Ｂｏｃａｎｅｇｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（１１）：２７３７−２７４０（１９９３）；Ｆａｉｌｌａら、Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ．，１（１）；３５−４２（１９９６）；Ｈａｙｅｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，９９（２５）：１５９２６−１５９３１（２００２）；Ｖｏｉｇｔら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９（７）：５５３−５５８（２００２）；Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，２（７）：５４８−５５３（１９９５）；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，８４（１５）：５１６７−５１７１（１９８７）；Ｗｉｌｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｎｃｅ，２４２（４８８５）：１５４１−１５４４（１９９８））。
（Ｂ．ＰＡＬの構造）
野生型未リガンド化Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬの三次元構造（図１）は、１．６Å解像度におけるＸ線結晶学を用いて決定した。該解像度は少なくとも３．０Åにおける、好ましくは少なくとも２．５Åにおける、またはより好ましくは少なくとも２．０Åにおけるものであり得る。
ＰＡＬ蛋白質はホモテトラマーであり、各モノマーは、主として、アルファー−ラセンよりなり、４つのドメイン−中央触媒ドメイン、Ｎ−末端ドメイン、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａヒスチジンアンモニア−リアーゼ構造に対する同様性を持つ小さなＣ−末端ドメイン（ＨＡＬ，Ｓｃｈｗｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１７），ｐｐ．５３５５−５３６１（１９９９））＋無傷テトラマー分子の末端から突出するＣ−末端領域に挿入されたさらなるドメインに細分される。Ｎ−末端の最初の２５残基は、テトラマーにおける全ての４つのモノマーについての構造において目に見えず、この領域は恐らくは乱れている。残基１０９ないし１２３および３５０ないし３５３の間のループ領域は、モノマーＢについて乱れており、領域１０３ないし１２３および３５０ないし３５３はＰＡＬテトラマーにおけるモノマーＡ、ＣおよびＤについて乱れている。Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬの２つの他のＸ線構造は、結晶化プロセスの間においてトランス−シンナメートおよびＮＨ４イオン付加を用いて、２．１Å（Ｐ３２２１空間群）および２．７Å（Ｐ２１空間群；Ｃａｌａｂｒｅｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３（３６），ｐｐ．１１４０３−１１４１６（２００４））にて決定された。結晶化で用いられるより低いｐＨ、およびこれらの構造のより低い解像度は、該構造における（特に、Ｎ−末端領域における）より固有の乱れ、およびＭＩＯ補因子に存在するさらなる電子密度をＮＨ２アダクトに明確に帰属させる無能力に導いた。
該アンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ、ＨＡＬ、およびアスパルテートアンモニア−リアーゼ（ＡＡＬ））、フマラーゼ、およびアルギノコハク酸リアーゼを含めた、カルボン酸からの種々の基の脱離を触媒するテトラマー酵素のこのファミリーにおいて（ＤＡＬＩ，Ｈｏｌｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３３，１２３−１３８（１９９３）を用いる）多数の関連構造がある（ｓｃｈｗｅｄｅ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１７），ｐｐ．５３５５−５３６１（１９９９））。加えて、δ−クリスタリン鳥類の目ガラス体蛋白質は、同様であるが、この構造ファミリーの非−酵素形態である折り畳みを有する（Ｓｃｈｗｅｄｅら、（１９９９），ｉｂｉｄ．）。
本明細書中で提供されるＰＡＬの高−解像度三次元蛋白質結晶構造は、ＰＡＬの生化学的および生物物理学的特性を改良するために、およびＰＡＬのイン・ビボ治療効果を増加させるために蛋白質エンジニアリングを用いる方法で用いることができる。加えて、該構造は、該構造のいずれの領域が（ＰＡＬのよりコンパクトで安定な形態を除去し、創製するのに）最もフレキシブルであるか、いずれの残基が（活性を増強し、および／または蛋白質のサイズを最小化し、ならびに構造ベースの阻害剤設計のための情報を供するために突然変異するのに）活性な部位近くに位置するか、およびいずれの表面位置が（プロテアーゼマッピング研究から）免疫原性（例えば、マッピング研究において同定された線状エピトープ）および／または蛋白質分解感受性部位に近くて、問題の部位の直接的破壊のための部位特異的突然変異体の導入、あるいは別法として、天然ＰＡＬに存在する感受性部位を保護するための表面ＰＥＧ化または他の化学的誘導体化を可能とするかについての情報を提供する。
（Ｃ．ＰＡＬの構造座標の使用）
本明細書中で提供されるＰＡＬの高−解像度三次元結晶構造は、突然変異、修飾、または組み合わせた突然変異および修飾のために蛋白質の領域を選択するコンピュータ化方法で用いることができる。例えば、商業的に取得可能なプログラムＧＥＴＡＲＥＡは、Ｘ線結晶学座標に基づいてアミノ酸残基についての表面−露出を計算する。
本明細書中で提供される高−解像度三次元結晶構造を、さらに、イン−シリコ方法で用いて、酵素の活性部位に対するリガンドを設計することができる。例えば、構造ベースの小−分子をドッキングし、設計するための商業的に取得可能なソフトウェアプログラムを用いて、ＰＡＬ阻害剤を設計することができる（Ｂｉｌｌｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，５２４（１），ｐｐ．２１９−２３０（１９７８）；Ｊａｎａｓら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ．，３２（２），ｐｐ．１３１−１４３（１９８５）；Ｚｏｎら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５９（１），ｐｐ．９−２１（２００２）；Ａｌｕｎｎｉら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，４１２（２），ｐｐ．１７０−１７５（２００３））。
（構造ベースのＰＡＬエンジニアリング）
一旦、信頼できる三次元構造または構造モデルが特異的マクロ分子で利用できれば、合理的設計は該マクロ分子の特異的構造および／または機能の最適化のための生産的な方法となった（Ｐｅｎｎｉｎｇら、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．，１０１（１０），ｐｐ．３０２７−３０４６（２００１））。例えば、補酵素特異性は再−エンジニアリングされており（Ｂｏｃａｎｅｇｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（１１），ｐｐ．２７３７−２７４０（１９９３））、蛋白質安定性は改良されており（Ｍａｌａｋａｕｓｋａｓら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，５（６），ｐｐ．４７０−４７５（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１０（７），ｐｐ．１４５４−１４６５（２００１）；Ｌｕｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１１（５），ｐｐ．１２１８−１２２６（２００２）；Ｆｉｌｉｋｏｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１１（６），ｐｐ．１４５２−１４６１（２００２）；Ｏ‘Ｆａｇａｉｎ，Ｅｎｚ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３３，ｐｐ．１３７−１４９（２００３）；Ｃａｍｍｅｔｔら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３２７（１，ｐｐ．２８５−２９７（２００３））、基質特異性は再設計されており（Ｈｅｄｓｔｒｏｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４９），ｐｐ．１２４９−１２５３（１９９２）；Ｆａｉｌｌａら、Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ．，１（１），ｐｐ．３５−４２（１９９６）；Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，２（７），ｐｐ．５４８−５５３（１９９５）；Ｗｉｌｋｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（３４），ｐｐ．７８０２−７８０６（１９９２）；Ｆｅｉｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１０（３），ｐｐ．２５５−２６２（１９９７）；Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７６（２４），ｐｐ．２１５００−２１５０５（２００１））、リガンドまたは受容体結合特異性は改変されており（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，８８（８），ｐｐ．３４０７−３４１１（１９９１）；Ｒｅｄｄｙら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４（１３），ｐｐ．１６９６−１６９９（１９９６）；Ｄｏｙｌｅら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，４（１），ｐｐ．６０−６３（２０００））、および生物学的活性は再−エンジニアリングされている（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０（１２），ｐｐ．５６１８−５６２２（１９９３）；Ｓａｒｋａｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，ｐｐ．９０８−９１３（２００２）；Ｂｌａｔｔら、Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１６（７），ｐｐ．４９−４９９（１９９６））。
構造ベースのエンジニアリングを用いて、切形、欠失、挿入、スプライス改変体、点突然変異、置換、キメラ、ループ再−エンジニアリング突然変異体、ループスワッピング突然変異体、表面ベニアリング突然変異体、ならびに（単独、合理的に開発された突然変異体と組み合わせた、指向性進化−由来突然変異体を含んだ）確率的に−由来する突然変異体のような合理的突然変異体を含めた、ＰＡＬ改変体を創製することができる。加えて、ＰＡＬ突然変異体を含むＰＡＬ改変体を作成することができ、ここに、突然変異が部位特異的ＰＥＧ化および／または他の化学的誘導体化のために導入されている。そのような方法で用いられるＰＡＬ突然変異体は、親ＰＡＬ蛋白質の改変体、断片および化学的誘導体を含めた、野生型Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬと実質的に同一の機能活性を有するいずれのＰＡＬ改変体も含む。
（指向性進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）蛋白質最適化）
指向性進化方法は、蛋白質突然変異空間のより完全に大きな領域を開発するために注目する遺伝子をランダムに突然変異させる。エラー−傾向ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列全体に多様性を導入するためのランダム挿入および欠失（ＲＩＤ）突然変異誘発、および部位−飽和突然変異誘発のようなより焦点を合わせたまたは「指向性」多様性−創製方法、および他のオリゴヌクレオチド−ベースの突然変異誘発方法を含めた、多数の指向性進化方法が存在する（Ｂｒａｎｎｉｇａｎ，Ｊ．Ａ．ら、（２００２）ｉｂｉｄ．）。加えて、ＤＮＡ配列レコンビナトーリアル方法が、突然変異の有利な部位を組み合わせ、有害な突然変異を同時に除去し、新規なＤＮＡ配列を生じさせるのに用いられてきた（例えば、ＤＮＡシャフリング、ＳｔＥＰ、ＲＡＣＨＩＴＴ、ＩＴＣＨＹの方法）。最後に、構造ベースの指向性進化技術は、治療的利点のために蛋白質を再設計するのに用いられてきた（構造ベースのコンビナトーリアルエンジニアリング、ＳＣＯＰＥ、および蛋白質設計自動化、ＰＤＡ、方法）。ＳＣＯＰＥ方法は、ＤＮＡ操作技術とカップリングさせた蛋白質構造情報を用いて、非−相同遺伝子から多数のクロスオーバー蛋白質改変体ライブラリを設計し、創製する半−合理的蛋白質エンジニアリングアプローチに基づく（Ｏ‘Ｍａｉｌｌｅら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３２１（４），ｐｐ．６７７−６９１（２００２））。ＰＤＡにおいて、突然変異空間のコンピュータプレ−スクリーニングは、特異的蛋白質折畳みに適合する唯一の突然変異を含めることを可能とし、かくして、実験的スクリーニングで使用できるサイズまで配列改変体の数を低下させる（米国特許第６，４０３，３１２号；Ｄａｈｉｙａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳＣｉ，Ｕ Ｓ Ａ．，９４（１９），ｐｐ．１０１７２−１０１７７（１９９７）；Ｄａｈｉｙａｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６（６），ｐｐ．１３３３−１３３７（１９９７）；Ｈａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，９９（２５），ｐｐ．１５９２６−１５９３１（２００２））。
（効果的な選択またはスクリーニングプロトコルにカップリングさせた）指向性進化の使用が、初期酵素種から出発し、改変されたおよび／または改良された機能につきその種を突然変異する、改良された触媒機能および生物物理的特性（例えば、低下した免疫原性、増大した安定性）に導いた非常に多数の例が存在する（Ｖａｓｓｅｒｏｔら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，８（３），ｐｐ．１１８−１２６（２００３））。例えば、多数の異なる蛋白質についての、指向性進化および他の「ランダム」突然変異誘発方法を用い、成功した突然変異体が得られている（トリオース−リン酸イソメラーゼ，Ｈｅｒｍｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，８７（２）：６９６−７００（１９９０）；ベータ−ラクタマーゼ，Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０（６４８８）；３８９−３９１（１９９４），Ｏｒｃｎｃｉａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，８：２３８−２４２（２００１），Ｖｏｉｇｔら、（２００２）ｉｂｉｄ；パラ−ニトロベンジルエステラーゼ），Ｍｏｏｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：４５８−４６７（１９９６）；ガラクトシダーゼないしフコシダーゼ，Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４（９）：４５０４−４５０９（１９９７）；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ，Ｙａｎｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９５（１０）：５５１１−５５１５（１９９８）；緑色蛍光蛋白質，Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４（３）：３１５−３１９（１９９６）；ホースラディッシュペルオキシダーゼ，Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，１５：４６７−４７１（１９９９）；チトクロームＰ４５０，Ｊｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３９９（６７３７）：６７０−６７３（１９９９）；ビフェニルジオキシゲナーゼ，Ｋｕｍａｍａｒｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６（７）：６４−６６６（１９９８）；アルセネート解毒経路，Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（５）：４３６−４３８（１９９７）；セファロスポリナーゼ，Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１（１９９８）；種々の蛋白質，Ｓｈａｏら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，６（４）：５１３−５１８（１９９６），種々の蛋白質，Ｓｋａｎｄａｌｉｓら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，４，ｐｐ．８８９−８９８（１９９７）；スブチリシン，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１（４）：３１９−３２５（１９８７）；ニトリラーゼ，ＤｅＳａｎｔｉｓら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ．，１２５（３８）：１１４７６−１１４７７（２００３）；アルファ−アスパルチルジペプチダーゼ，Ｋｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２８９（１）１３７−１４２（２００１）；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３（３）：７６３−７７２（２００４）；Ｌ−アスパルターゼ，Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２７６（１）：３４６−３４９（２０００）；および乳酸デヒドロゲナーゼ，Ｗｉｌｋｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１（３４）：７８０２−７８０６（１９９２）。
これらの研究は、増大した安定性、活性および分解経路に対する抵抗性を持つ改良された酵素改変体の開発に、「ランダム」突然変異誘発技術を適用する用途を反復して示した。進化した蛋白質クローンの構造解析は、得られる改良された物理的および化学的特性に関係する分子変化についての洞察に導く（Ｏｒｅｎｃｉａら、ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ，Ｆ．Ｈ／Ａｍｏｌｄ，Ｅｄｉｔｏｒ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２２７−２５９（２００１））。指向性進化技術で獲得されるべき報酬は、有利な効果を有する酵素活性部位領域から１５ないし２０Åにわたって位置する突然変異のいくつかの部位と共に、非−活性部位残基に関係する有利な突然変異の反復した発生に照らして特に明らかである（Ｏｕｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（４），ｐｐ．２３４４−２３４９（１９９９））。選択およびスクリーニング手法にカップリングされた、指向性進化および他のランダム突然変異誘発技術は、産業適用で用いるべきＰＡＬのより蛋白質分解的に安定であって化学的に頑強な形態を開発するのに、あるいは別法として、例えば、ＰＫＵについての酵素置換療法のために用いることができる。
（Ｄ．ＰＡＬの突然変異体）
従前の実験はＰＡＬの突然変異体を記載してきた（Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３４９（２），ｐｐ．２５２−２５４（１９９４）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，９２（１８），ｐｐ．８４３３−８４３７（１９９５）；Ｌａｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，ｐｐ．１０８６７−１０８７１（１９９７）；Ｅｌ−Ｂａｔａｌら、Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｐｏｌ．，４９（１），ｐｐ．５１−６１（２０００）；Ｒｏｅｔｈｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９，ｐｐ．３０６５−３０７５（２００２））およびＨＡＬ ｍｕｔａｎｔｓ（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４４），ｐｐ．２７４７３−２７４７７（１９９４）；Ｂａｅｄｅｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９（６），ｐｐ．１７９０−１７９７（２００２））。
（ＰＡＬキネティックスの最適化−増強された触媒活性を持つ突然変異体）
本発明による野生型ＰＡＬの生物学的に活性な部位は、所望により、ＰＡＬキネティック特徴を最適化するように修飾することができる。Ｋｍ、半−最大活性を与える基質の濃度は、許容される範囲内、すなわち、１２０ｕＭないし２４０ｕＭのｐｈｅレベルを維持するにおいて、ＰＡＬの治療効果と密接に関連する。Ｋｍは基質に対する酵素の親和性である。親和性を制御することによって、異なる濃度において基質に対するいずれかの酵素の効率を制限または制御することができる。例えば、もしＫｍが１０００ｕＭであれば（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、酵素の活性は２４０ｕＭの血中ｐｈｅレベルにおいて約１２．５％まで、および６０ｕＭの血中ｐｈｅレベルにおいて約３％まで低下されるであろう。もしＫｍが２４０ｕＭであれば、酵素の活性は、２４０ｕＭの血中ｐｈｅレベルにおいて約５０％まで、および６０ｕＭの血中ｐｈｅレベルにおいて約１２％まで低下されるであろう。もしＫｍが１２０ｕＭであれば、酵素の活性は、２４０ｕＭの血中ｐｈｅレベルにおいて約７０％まで、および６０ｕＭの血中ｐｈｅレベルにおいて約３５％まで低下されるであろう。最適には、好ましい治療目的は、約１２０ｕＭないし約２４０ｕＭの最適範囲内に低下させるが、そこに維持する十分な活性を持つ酵素を有することであろう。高いＫｍ（すなわち、１０００ｕＭ）を持つ酵素は、ｐｈｅレベルが正常な範囲内に降下するにつれ迅速に活性を失い、高度に濃縮されたまたは大きな容量の用量の非現実的な投与を必要とするであろう。他方、非常に低いＫｍを持つ酵素は迅速にｐｈｅレベルを枯渇させることができ、これは、過剰フェニルアラニン血症について致命的であり得るが、癌の管理においては有用であろう。
最も好ましい実施形態において、生物学的に活性な修飾された突然変異体ＰＡＬは、少なくとも約４．０ｓ−１、好ましくは２０ｓ−１よりも大きなｋｃａｔを有する。他の好ましい実施形態において、生物学的に活性な修飾されたＰＡＬは、約１００μＭないし約１０００μＭの間のＫｍを有する。最も好ましい実施形態において、生物学的に活性な修飾されたＰＡＬは、野生型のそれよりも約２倍ないし約１０００倍大きな酵素活性を呈する。そのような生物学的活性突然変異体は、部位特異的突然変異誘発によるような、当該分野でよく知られた方法を用いて形成することができる。
（特異的蛋白質改変体：低下した免疫原性を有する改変体）
現在、蛋白質免疫原性を低下させるのに多数の戦略が用いられている。好ましくは、導入されて免疫応答を最小化させる修飾は、マクロ分子の構造、機能または安定性を破壊しない。用いる効果的な戦略は、ヒト配列含有量の増加（キメラおよび／または他の「ヒト化」アプローチ）、溶液特性の改良、抗体エピトープの除去、（ＰＥＧ化のような）化学的誘導体化の導入、および／またはＭＨＣアグレトープの同定および除去を含む。注射された治療剤では、イン・ビボ免疫反応性は、エピトープマッピング、続いて、合理的突然変異誘発を行うことによって、単独で、部位特異的ＰＥＧ化（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、（１９９１）ｉｂｉｄ．；Ｌｅｏｎｇら、（２００１）ｉｂｉｄ．；Ｌｅｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２０（５），ｐｐ．８１８−８２５（２００３））、あるいは蛋白質免疫原性を許容できるレベルまで低下させる他の化学的誘導体化方法と組み合わせて、免疫原性のこれらの部位を修飾し、および／またはそうでなければ突然変異させることによって取り込むことができる。
抗原性表面蛋白質領域の修飾は免疫原性を低下させる（Ｃｈｉｒｉｎｏら、（２００４）ｉｂｉｄ．）。改良の１つの方法は、触媒活性を保有するより小さなサイズの蛋白質の構築を含む（例えば、吸収アッセイを活性測定で用いる）。改良の第２の方法、ＥＬＩＳＡスクリーニングにカップリングさせた蛋白質エンジニアリングを用いて、低下した免疫原性を持つ突然変異体を同定することもできる。別の方法は、ＰＥＧ化誘導体化のためのさらなる表面Ｌｙｓ部位についての点突然変異を導入する。テスト酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼで免疫原性を低下させることが示された方法（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、（１９９１）ｉｂｉｄ．）。別の経路は、免疫原性部位を除去するための蛋白質エピトープ領域に局所化された残基の突然変異を用いる（Ｙｅｕｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２（１１），ｐｐ．６６５８−６６６５（２００４））。抗体ヒト化に類似するアプローチにおいて、ヒト抗体からの相同ループ領域および／または残基を、相同蛋白質の対応するループ領域に置換する。
蛋白質治療剤の蛋白質分解プロセッシング部位の除去は、プロテオソームプロセッシングを妨げることによって免疫原性の低下を供することもでき、それにより、抗原提示細胞結合のためのペプチド断片へのクリッピングおよびプロセッシングを妨げる。同様な現象は、クラスＩＩ ＭＨＣ決定基についてのフランキング領域の改変で観察されており、自己反応性Ｔ細胞に対するディスプレイを妨げる（Ｍａｖｅｒａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ．，１００（９），ｐｐ．５３４２−５３４７（２００３））。
（エピトープマッピング）
蛋白質治療剤エピトープは多数のアルゴリズムを用いて計算し、またはイン・ビトロまたはイン・ビボアプローチで実験的に決定することができる。「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．５ｚ．ｃｏｍ／ｃｓｐｓ／ｃｏｍｅｒ／ｐｃｏｍ／ｍａｎｕａｌ．ｈｔｍｌ）、およびＤＮＡＳｔａｒからのＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムパッケージソフトにおける「Ｐｒｏｔｅｉｎ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ）のようなコンピュータプログラムが、蛋白質の化学的組成および立体配座に基づいて蛋白質の表面エピトープ領域を見積もるのに通常に使用される。蛋白質配列における免疫原性領域は、親水性指標に基づく最高計算親水性、および計算された表面蛋白質領域の両親媒性および他の立体配座パラメーターに基づいての抗原性の領域である。別法として、蛋白質配列におけるアグレトープは、潜在的ＨＬＡ結合のコンピュータ−モデル化予測に基づいて突き止めることができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃａｄ Ｒｅｓ．，３１（１），ｐｐ．３１１−３１４（２００３））；Ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、Ｎｏｂａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．，２５４，ｐｐ５７−７２（２００３））。加えて、エピトープは、イン・ビトロ生化学的（Ｔａｎｇｒｉら、（２００２）ｉｂｉｄ．）およびイン・ビトロ細胞−ベースの方法（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２３（６），ｐｐ．６５４−６６０（２０００）；Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８１（１−２），ｐｐ．９５−１０８（２００３））を用いて同定することができる。蛋白質エンジニアリングについては、免疫原性の相対的低下は、Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．，７７（２），ｐｐ．２８０−２８９（２００４））のイン・ビトロ細胞−ベースのアッセイと同様なアッセイを用いてモニターすることができる。
アルゴリズムを用いる理論的エピトープマッピングは、野生型Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ蛋白質表面の免疫原性の６つの領域（残基７０−８８，２２６−２４３，３３７−３５６，３９６−４１３，５６９−５８９，および６１９−６３６）あるいは７つの領域（７１−１７０，２３１−２７０，３３１−３７０，３９１−４３０，５１１−５５０，５７１−６５０，および６７１−７１０）（図３）を示した。別法として、ＰＡＬ配列の表面領域をカバーする重複ペプチドのライブラリを用い、および全ＰＡＬ蛋白質配列をカバーする重複ペプチドに対して生起されたウサギポリクローナル抗体でプロービングするペプスカン分析（エピトープマッピング）は、ＰＡＬに存在する線状エピトープを示す。ＰＡＬの三次元構造に基づき、抗原性のこれらの実験的に同定された部位は、エピトープ領域残基をランダムに突然変異させて、エピトープ認識部位を除去するか、あるいは部位特異的突然変異を用いて、これらのエピトープ部位近くの表面にＬｙｓまたはＣｙｓ残基を導入し、ＰＥＧ化のための位置を供して、これらの部位をカバーし、これらの部位を免疫原性認識から保護することによって突然変異させる。これらの潜在的に非−免疫原性ＰＡＬ突然変異体（またはこれらのＰＡＬ突然変異体のＰＥＧ化形態）のＥＬＩＳＡスクリーニングは、減少した免疫原性をディスプレイするＰＡＬ突然変異体の部分集合のイン・ビトロ同定を供する。
（表面残基の同定および突然変異）
ＰＡＬの免疫原性領域中、またはその近くの表面−露出残基を同定することができる。これらの位置は、表面への近接性、ならびに免疫原性／抗原性の領域への近接性に依存して、蛋白質に存在する全数の溶媒−接近可能表面位置の部分集合であろう。Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、または相同性モデリングを用いて決定された蛋白質の三次元構造を商業的に取得可能なソフトウェアプログラムで用いて、マクロ分子の溶媒−接近可能表面領域を計算することができる。プログラムＧＥＴＡＲＥＡ １．１（Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１９，ｐｐ３１９−３３３（１９９８））を用いて供された出力は、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬに対する表面接近性の信頼性がある見積もりを与える（図７）。ＧＥＴＡＲＥＡおよびＰＡＲＡＲＥＡおよび同様なプログラムは、Ｇａｕｓｓ−Ｂｏｎｎｅｔ理論に基づいてパラメーターアプローチでの連続方法を用いて溶媒−接近可能表面積を計算する。ＰＡＲＡＲＥＡは、各原子の隣接リストにおける全ての原子対を用いるＧａｕｓｓ−Ｂｏｎｎｅｔ経路における潜在的交点を見出し、他方、ＧＥＴＡＲＥＡは、２つの球の交点の平面によって規定される交点半−空間を用いて溶媒−露出最高点をより効果的に計算する。
天然ＰＡＬにおいては、ＧＥＴＡＲＥＡは、テトラマーＰＡＬ蛋白質表面全体に分布した１２の表面−露出Ｌｙｓ残基、ならびに１つの部分的に露出した表面Ｃｙｓ残基（Ｃｙｓ１４０）を同定した。これらの位置はＰＥＧ化誘導体化で直接的に利用できる。さらに、ＰＡＬの三次元構造を用いて、部位特異的突然変異誘発で利用できるさらなる表面残基を同定することができる。これらのさらなる部位は、標準蛋白質エンジニアリング技術を用いて突然変異させて、低下した免疫原性、改良された蛋白質分解抵抗性、および／または改良された安定性／活性を持つより好都合なＰＡＬ突然変異体を創製することができる。
低下した免疫原性のような改良された特性を持つ蛋白質突然変異体を提供するための蛋白質の突然変異用の戦略は当該分野で知られている。１つの一般的な経路は、エピトープ中の各非−アラニン残基をＡｌａに突然変異させて、エピトープ中の各アラニン残基をＧｌｙに突然変異させる。他の方法は、突然変異または欠失いずれかによって、エピトープ領域から荷電した疎水性残基を除去する。さらなる突然変異戦略は、部位特異的突然変異を導入し、続いて、部位特異的化学的誘導体化を導入する。
切形を蛋白質改良の生産で用いることもできる。ヒスチジンアンモニア−リアーゼ（ＨＡＬ）に対するＰＡＬのバイオインフォーマティックス分析は、切形突然変異体を提案した（残基２３ないし７１６および１ないし５６４）。加えて、ＰＡＬ ３−Ｄ構造の分析は、高度に相同なＨＡＬ蛋白質の構造におけるＣ−末端ドメイン領域の不存在に基づいて、切形についての代替領域を提供する。ＨＡＬからの対応するループ領域がＰＡＬ配列に融合されて、（主要エピトープ領域を有すると計算された）ＰＡＬ構造のＣ−末端ドメイン突出領域を置き換える突然変異体を含めた、Ｃ−末端ドメイン欠失突然変異体は、ＰＡＬのより小さく、より頑強で、かつ予測された免疫原性が低い改変体を形成する。
別の方法において、指向性進化と組み合わせた合理的突然変異誘発を用いる蛋白質エンジニアリングを用いて、ＰＡＬの突然変異形態を得ることができる。例えば、実験的およびコンビナトーリアル設計と共に合理的設計の実行は、コンプスタチンの活性を改良した（Ｍｏｒｉｋｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３２（Ｐｔ１），ｐｐ．２８−３２（２００４））。合理的突然変異誘発および指向性進化の組合せもまた有望性を示した（Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５（２），ｐｐ．１３７−１４３（２００１）；Ｄｗｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４（５６７９），ｐｐ．１９６７−１９７１（２００４））。
最適未満の酵素活性をディスプレイするＰＡＬの突然変異形態は、指向性分子進化の蛋白質エンジニアリング方法を用いて活性につき進化させることができ、他方、ランダム突然変異誘発工程に続いて、活性である突然変異体に対する選択手法を行い、活性を有するクローンのみの新しい蛋白質突然変異体プールを得る。例えば、もし（我々が、構造のエピトープ−含有領域近くに表面リシン残基を導入するよう設計した）特異的突然変異体ＰＡＬが不活性であれば、（不活性突然変異体を突然変異させ、活性を持つ形質転換体につき選択する）この突然変異体についての指向性進化を実行すると、この有利な突然変異（表面リシン部位）＋各活性クローンに対して活性を回復させる構造全体に位置するさらなるランダム突然変異の部分集合を含有する新しい突然変異体プールを創製する。加えて、同一蛋白質の異なる種または異なる蛋白質の同様な配列を交差させることができる分子交雑の指向性進化技術（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１，ｐｐ．２８８−２９１（１９９８）；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３（３），ｐｐ．２８４−２９０（１９９９））は、ヒトヒスチジンアンモニア−リアーゼの配列を置き換えて、免疫系によって認識されないであろうヒト配列でＰＡＬの最も免疫原性の領域のいくつかを置き換えることができる。
ＰＡＬの突然変異体形態は、半−合理的アプローチに基づいてハイブリッド蛋白質改変体を作成し、それにより、純粋な指向性進化−ベースの方法に対して蛋白質設計のより指向性レベルを可能とし、ならびに、そのような偏った蛋白質エンジニアリングアプローチを用いて同定された蛋白質構造の領域に対するよりランダムなレベルの突然変異操作を供する。例えば、ＰＤＡ方法は、蛋白質改変体のコンピュータにより予めスクリーニングされたライブラリを創製し、純粋なランダムな、または偏っていない蛋白質エンジニアリング方法にわたって蛋白質特性のより迅速な最適化を可能とする（米国特許第６，４０３，３１２号；Ｄａｈｉｙａｔ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０（４），ｐｐ．３８７−３９０（１９９９）；Ｆｉｌｉｋｏｖら、ｉｂｉｄ．（２００２）；Ｈａｙｅｓら、（２００２）ｉｂｉｄ，；Ｌｕｏら、（２００２）ｉｂｉｄ．）。同様に、ＳＣＯＰＥ方法は、構造の「同等な」サブドメインに基づいてハイブリッド酵素改変体を構築し、非−相同遺伝子から出発して多数のクロスオーバー蛋白質改変体ライブラリの創製を可能とする（Ｏ‘Ｍａｉｌｌｅら、（２００２）ｉｂｉｄ．）。同様に、Ｖｏｉｇｔらによって開発された方法は、蛋白質の断片を同定する計算アルゴリズム、または蛋白質の三次元構造の一体性を破壊することなく組み換えることができる「スキーム」の適用に基づいてハイブリッドを構築した（Ｖｏｉｇｔら、（２００２）ｉｂｉｄ．）。計算分析は、二次構造エレメント帰属に基づいて、蛋白質折りたたみにおける構造的におよび機能的に重要な位置の保存されたコア領域を同定することもできる（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６（１２），ｐｐ．１１１１−１１１９（２０００））。ＰＡＬの突然変異体形態は、当該分野の方法のいずれかの手法に従って得ることができる。
（代替酵素代替物としてのＨＡＬ）
ヒトＨＡＬの構造は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＨＡＬの構造に基づいて相同にモデル化された（図６）。ＰＡＬよりも小さいにも拘らず、ヒトＨＡＬの構造は非常に似ており、ヒトＨＡＬをアンモニア−リアーゼの免疫原性により低い形態として、ＰＡＬ蛋白質エンジニアリングで用いるようにする。非−免疫原性ＰＡＬ改変体を得るための別の方法は、突然変異、続いて、ＰＡＬ活性を持つＨＡＬ突然変異体についての選択を用いて、突然変異および活性についての選択の工程に続いてさらにＰＥＧ化することができる「ヒト化」ＰＡＬ蛋白質を得るための、ヒトヒスチジンアンモニア−リアーゼの指向性進化突然変異（ＨＡＬ， Ｓｕｃｈｉら、（１９９３）ｉｂｉｄ．）を含む。
（特異的蛋白質改変体：低下したプロテアーゼ感度を有する改変体）
蛋白質プロテアーゼ感受性を低下させるのに、現在、多数の戦略が用いられている。蛋白質分解感度を最小化するのに導入された修飾は、好ましくは、マクロ分子の構造、機能、または安定性を破壊しない。効果的な戦略は、競合阻害剤のような部位特異的安定化種を酵素に供すること（Ｇｉｌｂｅｒｔら、（１９８１）ｉｂｉｄ．；米国特許第６，５８４，６４４号；６，４５１，９８６号；６，４３３，１５８号；６，４６１，８４９号）、トリプシン結合部位をブロックするように、感受性Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇ部位中のアミノ基を化学的に修飾すること、キモトリプシン−感受性Ｔｙｒ、Ｐｈｅおよび／またはＴｒｐ残基をより小さな中性アミノ酸に突然変異させて、切断感受性をなくし、ＰＡＬを（Ｆｃ抗体ドメインまたはボツリヌスニューロトキシン非特性成分のような）他の保護的マクロ分子に連結またはカップリングさせること、および／またはＰＥＧまたは他の化学的に保護的かつ安定化基での引き続いての化学的誘導体化のためのプロテアーゼ感受性部位近くにＬｙｓまたはＣｙｓ部位を導入することを含む。
蛋白質エンジニアリングを野生型ＰＡＬに対して行って、部位特異的突然変異体を構築して、プロテアーゼ感受性の２つの主な部位を除去した。Ｈｉｓタグ付きＰＡＬの２つの異なる部分的蛋白質消化物、続いて、蛋白質消化物をニッケルキレートカラムに通すことによる２つの主な蛋白質断片の分離を用い、天然ＰＡＬにおけるトリプシンおよびキモトリプシン感受性の主な部位を、最大ＰＡＬ断片について決定されたＮ−末端蛋白質配列に基づいて同定した。主なトリプシン部位はＡｒｇ１２３として同定され、他方、主なキモトリプシン感受性部位はＴｙｒ１１０として同定された。これらのプロテアーゼ認識部位の６つの突然変異体が作成された（Ｒ１２３Ｈ，Ｒ１２３Ａ，Ｒ１２３ＱおよびＹ１１０Ｈ，Ｙ１１０Ａ，Ｙ１１０Ｌ）。野生型蛋白質と同様なレベルで発現される６つの全ての突然変異体は凝集の徴候を示さなかったが、全ては、低い比活性を呈した（全て単位はμｍｏｌ×分−１ｍｇ−１）；Ｙ１１０Ｈ ０．０８４、Ｙ１１０Ａ ０、Ｙ１１０Ｌ ０、Ｒ１２３Ａ ０．１１、Ｒ１２３Ｈ ０．０７４、Ｒ１２３Ｑ ０．０３３（対−野生型１．３２）。プロテアーゼ感受性のテストは、点突然変異は、３つのＲ１２３ ＰＡＬ突然変異体（活性および無傷蛋白質サイズは共にトリプシン暴露で保持された）および３つのＹ１１０突然変異体（低い活性は残存活性についてのいずれの観察も無効としたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析は、キモトリプシンインキュベーションに際しての無傷蛋白質サイズの保持を示した）について保護を供したことを示した。次いで、これらのＰＡＬ突然変異体を指向性進化に付し、これらの不活性な部位特異的突然変異体についての改良された活性を呈する蛋白質を選択した。
別法として、酵素を化学的に保護するために（例えば、ＰＥＧ化）、Ｔｙｒ１１０およびＡｒｇ１２３プロテアーゼ感受性部位の近隣における多数の表面部位をリシンに突然変異させて、表面ＰＥＧ化のためのさらなる部位を創製した。野生型ＰＡＬの８つのリシン突然変異体を構築し、修飾された酵素の比活性を図４に示す（ゼロの活性を持つＴ１２４Ｋ突然変異体は示さず）。Ｌｙｓ突然変異体Ｒ９１ＫおよびＨ１３７Ｋは好都合な特徴を呈した。
（特異的蛋白質改変体：改良された活性を有する改変体）
突然変異体Ｒ９１Ｋ、Ｈ１３７Ｋ、Ｈ５９８ＱおよびＫ１３２Ｒ ＰＡＬは、野生型Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬに対して改良された活性を示した。Ｒ９１Ｋは、該蛋白質の表面近くの、Ａｓｐ８６ないしＬｅｕ１０１にわたるラセン中に位置する（非−「ｉ」スコア、表７出力参照）。Ｈ１３７ＫはＡｓｐ１２６ないしＬｅｕ１３９にわたるラセン中に位置し、野生型Ｈｉｓ１３７は、Ａｌａ１３３およびＬｅｕ１３４のアミドカルボニル（ＮＤ１につき）およびＧｌｎ１３８のＮＥ２（ＮＥ２につき）に対して水素結合を形成し；位置１３７をＬｙｓに突然変異させるプログラムを用い、側鎖をＨ１３７中の位置に対して移動させるが、水素結合相互作用は依然として存在する。
（Ｅ．化学的に修飾されたＰＡＬ改変体）
マクロ分子化学的修飾は、（誘導体化された種の混合物に導く）非特異的様式で、または（野生型マクロ分子反応性−指向性誘導体化および／または部位特異的突然変異誘発および化学的修飾の組合せを用いる部位−選択的修飾に基づいて）部位特異的様式で、あるいは別法として、発現された蛋白質連結方法（Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３（４），ｐｐ．２９７−３０３（２００２））を用いて行うことができる。好ましくは、化学的修飾を用いて、免疫原性を低下させる。ＰＥＧ化は、蛋白質の免疫原性を低下させるための示されている方法である（Ｂｈａｄｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７（１），ｐｐ．５−２９（２００２））が、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化での修飾を用いるグリコシル化および他の化学的誘導体化手法、酸−付加塩、アミド、エステル、およびＮ−アシル誘導体の創製も可能である（Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，ｐｐ．４８０−４８２（２００４））。
（ＰＥＧ化蛋白質）
ある範囲のＰＡＬ蛋白質に対するＰＥＧ化学的試薬の比率を用いる、ＰＡＬに対する一連の異なるＰＥＧ化反応は、各修飾方法についてのＰＥＧ−ＰＡＬ誘導体を提供した。ＰＥＧ化の最適な程度は、ＰＥＧ誘導体化の程度を決定するために、ＰＡＧＥおよび天然ゲル分析と組み合わせて吸光度アッセイを用いて各誘導体化ＰＡＬ種につき得られた残存活性に基づいて決定することができる。最適に修飾の初期範囲を決定した後、（ＶｍａｘおよびＫｍ決定、基質の結合定数、蛋白質分解安定性、活性のｐＨ依存性、活性の温度−依存性を含めた）比較キネティック分析、および最適なＰＥＧ−ＰＡＬ種の免疫反応性はＥＬＩＳＡ、免疫沈降、およびウエスタンブロットによって測定することができる。蛋白質エンジニアリングを用いて、最適誘導体化条件を用い、ＰＥＧ化のための最も好都合なＰＡＬ突然変異体を創製することもでき；ＰＡＬ蛋白質のサイズを最小化し、およびＰＡＬ表面の最も抗原性領域をただ修飾することによって、同時に、酵素活性の最大量および免疫原性の最小量を保持しつつ、ＰＥＧ修飾のコストは低下するであろう。同様に、部位特異的ＰＥＧを用いて、酵素誘導体を供することができる。
ｌｙｓ、ａｒｇ、ｃｙｓ残基のリン酸化または他の化学的修飾のような他の化学的修飾を用いて、免疫原性領域および／または蛋白質分解感受性領域をマスクすることができる。そのような化学的修飾は、Ｂｅｄｎａｒｓａｋｉのポリマー付加方法を含み、およびＰＡＬ安定性を改良し、免疫原性を低下させ、およびプロテアーゼ耐性を改良するためのＡｌｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ架橋方法は代表的な例である。Ｂｅｄｎａｒｓａｋｉは、ポリマー付加が蛋白質の温度安定性を改良することを示し（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４（１），ｐｐ３７８−３８０（１９９２））、およびＡｌｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、グルタルアルデヒド架橋が酵素安定性を改良することを見出した。
ＰＡＬのような蛋白質のイン・ビボ治療半減期がＰＥＧ化から利点を得るかを明らかにするために、種々の異なるＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートを合成し、イン・ビトロで特徴付け、Ｌ−Ｐｈｅ還元につきイン・ビボでテストした。ＰＥＧ化の潜在的効果を最適化し、およびＰＥＧ付着の好ましい部位を同定するために、ポリマー長さ、立体配座、およびＰＥＧ付着の程度を変化させた設計戦略を使用した。
本発明のＰＥＧ化ＰＡＬを調製するための方法は、一般に、（ａ）ＰＡＬが１以上のＰＥＧ基に付着するようになる条件下で、ＰＡＬをポリエチレングリコールと反応させ、次いで、（ｂ）反応生成物を得る工程を含む。ＰＡＬ修飾の特異的部位はコンジュゲートの固有の活性を有意に改変するだろうから、ＰＥＧの異なるタイプおよび量を探索した。ＰＡＬのＰＥＧ化で用いる化学は、メトキシ−ＰＥＧのＮＨＳ−エステル（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリプロピレングリコール）を用いるＰＡＬの第１級アミンのアシル化であった。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡでのアシル化の結果、元々の第１級アミンからの電荷をなくするアミド結合が得られる。
本発明の方法は、ポリマー：蛋白質コンジュゲートの実質的に均一な混合物を提供する。本明細書中で用いるように、「実質的に均一な」は、ポリマー：蛋白質コンジュゲート分子のみが観察されることを意味する。ポリマー：蛋白質コンジュゲートは生物学的活性を有し、ここに提供される本発明の「実質的に均一な」ＰＥＧ化ＰＡＬ調製物は、均一調製物の利点、例えば、ロット間の薬物動態の予測性における臨床的適用の容易性を呈するのに十分に均一であるものである。
本明細書中で記載されたＰＥＧ化アプローチで用いることが考えられるポリマー分子は、水溶性ポリマーまたはその混合物から選択することができる。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、デキストラン、ＨＰＭＡ、フレキシマー（Ｆｌｅｘｉｍｅｒ）ＴＭ、およびポリビニルアルコールからなる群より選択することができる。選択されたポリマーは、それに対してそれが付着する蛋白質が、生理学的環境のような水性環境において沈殿しないように水溶性であるべきである。ポリマーは分岐していてもよく、または分岐していなくてもよい。好ましくは、最終製品調製の治療的用途では、ポリマーは医薬上許容できるであろう。
ここに用いられる特に好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧと略されるポリエチレングリコールである。本明細書中で用いるように、ポリエチレングリコールは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような、他の蛋白質を誘導体化するのに用いられてきたＰＥＧの形態のいずれも含むことを意味する。
タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の割合は、反応混合物中のその濃度が変化するように変化する。一般に、（過剰な未反応蛋白質またはポリマーがない点で反応の効率に関する）最適な比率は、選択されたポリエチレングリコールの分子量によって、および存在する利用可能な反応性基（典型的には、εアミノ基）の数に基づいて決定されるであろう。分子量に関するように、一般には、用いるポリマーの分子量がより高いと、蛋白質に付着できるポリマー分子の数はより少なくなる。同様に、ポリマーの分岐は、これらのパラメーターを最適化する時に、考慮するべきである。一般には、分子量がより高いと（またはより多い分岐では）、ポリマー：蛋白質の比率がより高い。本発明においては、いくつかの異なる線状ＰＥＧポリマー長さを評価した（５ｋＤａおよび２０ｋＤａ）。同様に、２つのアームの分岐したＰＥＧポリマー（１０ｋＤａおよび４０ｋＤａ）のコンジュゲートもテストした。一般には、ここに考えられるＰＥＧ化反応では、好ましい平均分子量は約２ｋＤａないし約１００ｋＤａである（用語「約」は＋／−１ ｋＤａを示す）。より好ましくは、平均分子量は約５ｋＤａないし約４０ｋＤａである。ＰＡＬに対する水溶性ポリマーの比率は、一般には、モノＰＥＧ−については１：１、ｄｉＰＥＧ等については２：１の範囲であろう。
本発明のＰＡＬは、配列番号：１における１以上の残基での保存的アミノ酸変化も含むことができる。これらの変化は、アナログの生物学的活性においてほとんど影響を有しない。
Figure 2008513027
 （Ｆ．ＰＡＬおよびＨＡＬ融合蛋白質）
本発明では、限定されるものではないが、ｅｎｃＰＡＬのような細菌、酵母（Ｐｉｃｈｉａ）、およびヒトによって生産された細菌およびヒトＨＡＬ、ＰＡＬを含めた、異なる種のＨＡＬおよびＰＡＬの組み合わせを含む融合蛋白質の調製および使用が考えられる。融合蛋白質とは、別のＰＡＬまたはＨＡＬ蛋白質あるいはＨＡＬまたはＰＡＬポリペプチド、またはその断片に結合した、ＰＡＬまたはＨＡＬ蛋白質、あるいはＨＡＬまたはＰＡＬポリペプチド、またはその断片を含む化合物をいう。そのような融合蛋白質は、当業者に知られた組換え遺伝的エンジニアリング方法によって生産することができる。融合蛋白質は、当該分野で公知の標準技術を用いて調製することができる。典型的には、ＨＡＬまたはＰＡＬもしくはその部分をコードするＤＮＡ分子を、他のＨＡＬまたはＰＡＬ蛋白質もしくはその部分をコードするＤＮＡ分子に連結させる。適当な調節エレメントと共にキメラＤＮＡ構築体を発現ベクターにクローン化し、適当な宿主中で発現させることができる。得られた融合蛋白質は、他のＨＡＬまたはＰＡＬ蛋白質もしくはその部分に連結されたＨＡＬまたはＰＡＬもしくはその部分を含有する。本発明の融合蛋白質は、各々が融合蛋白質のドメインおよび、所望により、該ドメインに連結するように働くであろうアミノ酸または複数アミノ酸をコードする、全キメラ蛋白質をコードする単一核酸、または１を超える核酸配列を発現する宿主細胞を用いて生産することができる。
（Ｇ．選択およびスクリーニングアッセイ）
活性なＰＡＬまたはＨＡＬ改変体の生産およびスクリーニングでは、初期突然変異体クローン発現が、Ｈｉｓ−タグベクター発現系のような公知のベクター発現系の利用であり得るが、蛋白質改変体単離のための高−スループット金属キレート精製工程を容易とする。３−段スクリーニングシステムを用いて、好都合な蛋白質改変体を同定することができる。初期陽性クローン同定は、フェニルアラニン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株における成長のために形質転換および選択を用いることができる。第２ラウンドのスクリーニングは、抗−スループットプロセッシングに使用できるＯＤ２９０吸光度測定を利用することができる（Ｈｏｄｇｉｎｓ，Ｄ，Ｓ．，（１９６８）ｉｂｉｄ．）。最後に、（プロテアーゼカクテルの存在下でのインキュベーションを用いる）蛋白質分解耐性についてのスクリーニング、あるいは別法として、（競合的ＥＬＩＳＡ測定を用いる）免疫原性低下を用いて、好都合な蛋白質改変体を同定することができる。
（Ｈ．最適化されたＰＡＬ蛋白質の治療的使用および投与）
（過剰フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）の種々の形態）
本発明は、ＨＰＡおよび／またはＰＫＵを管理するための、単独で、または他の治療養生法と組み合わせた、ＰＡＬ組成物の使用を含む方法での、種々のＨＰＡ患者集団の治療に指向される。特に、ＰＡＬ組成物を用いて、食事介入が通常用いられない程度に十分に低いフェニルアラニン濃度を持つ患者集団（すなわち、軽度のＨＰＡを持つ患者）、中等度のＰＫＵを持つ患者、古典的または重症のＰＫＵを持つ患者、およびそのいずれかの亜集団を治療することができることが考えられる。ＰＡＬ組成物での治療に使用できて、軽度のＨＰＡの効果を軽減する患者は、２００μＭ未満の血清濃度を持つ妊婦および幼児を含む。種々の患者集団、およびそれらの異なる治療剤必要性は本セクションにおいてさらに詳細に議論する。
本発明のある実施形態は、ＰＡＬまたはその生物学的に活性な改変体、突然変異体および断片を含む組成物と組み合わせて蛋白質−制限食を被験体に投与することによって古典的な重症ＰＫＵを治療することに向けられ、ここに、蛋白質−制限食およびＰＡＬの組合せ投与は、該組合せ投与の不存在下における該濃度と比較して、該被験体の血漿中のフェニルアラニン濃度を降下させるのに効果的である。加えて、本発明では、蛋白質−制限食およびＰＡＬの組合せ投与が、該組合せ投与に不存在下におけるそのような濃度と比較して、妊婦の血漿中のフェニルアラニン濃度を降下させるのに効果的なように、ＰＡＬまたはその生物学的に活性な誘導体と組み合わせた蛋白質−制限食を女性に投与することによって、ＨＰＡを有する妊婦を治療することも考えられる。特定の実施形態において、４２０μＭを超えるＰｈｅレベルを発現する患者のための療法が考えられる。
本発明の他の実施形態は、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度の減少を生じさせるのに十分な量にて、ＰＡＬの投与に先立って１８０μＭより大きな血漿中Ｐｈｅ濃度によって特徴付けられる、ＨＰＡを有するいずれかの個体にＰＡＬ組成物を投与することを含む。本発明の方法は、本明細書中に記載されたＰＡＬ組成物で、３００μＭよりも大きい間の上昇したＰｈｅ濃度によって特徴付けられるＰＫＵを有する幼児を治療するのに有用であろう。「幼児」とは、本適用とは、０ないし３６月の年齢の間である患者を言う。
（重症古典的ＰＫＵの特徴、および本発明によるその治療方法）
重症ＰＫＵは１２００μＭよりも大きな血漿中Ｐｈｅ濃度において発現され、４８００μＭも高いことが見出され得る。この障害を有する患者はＰｈｅを含まない食事で治療して、その血漿中Ｐｈｅ濃度を、臨床的に許容されるレベル（典型的には、６００μＭ未満、好ましくは３００μＭ未満）まで低くしなければならない。これらの患者は、１日当たり２５０ないし３５０ｍｇの間の食事性Ｐｈｅの最大を許容できるに過ぎない（Ｓｐａａｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ．７８：９３−９９（２００３））。それ自体、これらの患者は、誕生後７ないし１０日の間にＰｈｅ制限処方食で開始し、この食事制限を残りの彼らの寿命の間、課される。これらの固体が厳格な食事制限のいずれの緩和も有益であろう。
古典的Ｐｈｅを持つ個体の診断で用いられるテストは後にさらに詳細に記載される。これらのテストは、古典的重症ＰＫＵを持つ患者は低フェニルアラニン食を必要とすることを明らかにした（Ｌｕｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．２８−２２８−２３０（２００３））。かくして、本発明の方法は、個体の血漿中Ｐｈｅ濃度をモニターすることによって古典的ＰＫＵに患者が罹っていることを判断することを含むことが考えられる。次いで、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度の少なくとも２５％減少が生じるように、ＰＡＬ組成物単独で、または低蛋白質食およびＰＡＬの組合せ養生法を投与することによって患者を治療する。好ましくは、該方法は血漿中Ｐｈｅ濃度の３０％減少を生じるであろう。なおより好ましくは、該方法は、個体の血漿中Ｐｈｅ濃度の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を生じるであろう（例えば、重症古典的ＰＫＵを持つ患者が４８００μＭのＰｈｅ濃度を有する場合、Ｐｈｅ濃度の９０％減少は、ほとんど食事制限を必要としない位十分に低い濃度である４８０μＭの血症中Ｐｈｅ濃度を生じるであろう）。もちろん、（重症古典的ＰＫＵまたは本明細書中に記載されたいずれかの他のＨＰＡを治療するためかを問わず）本発明の治療方法は、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度を、できる限り約１２０μＭないし約３６０μＭ±１５μＭの範囲近くのレベルまで、最も好ましくは約１２０μＭないし約２４０μＭの最適範囲まで降下させるよう試みるべきであることは理解されるべきである。
好ましい実施形態において、治療すべき古典的ＰＫＵ患者の血漿中Ｐｈｅ濃度を、１０００μＭよりも大きな制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度のいずれの値も、６００μＭ未満であるいずれかの血漿中Ｐｈｅレベルまで低下させる。もちろん、たとえＰＡＬおよび蛋白質−制限食との組合せ治療が、例えば、８００μＭないし約１２００μＭのレベルまでの、血漿中Ｐｈｅ濃度のより小さな減少を生じさせるとしても、これは該療法の臨床的に有用な結果と見られるであろう。なぜならば、この範囲に血漿中Ｐｈｅ濃度を有する患者は、Ｐｈｅ−制限処方を食べるのとは反対に食事中の蛋白質の量を単に制限することによって疾患を管理することができ、それにより、個体の生活の質が顕著に改善され、ならびに食事制限に関するより大きな患者コンプライアンスに導くからである。
治療の結果としても患者によって許容できる食事性Ｐｈｅレベルの量のいずれの増加も、治療的に効果的な結果であると考えられるであろう。例えば、ＰＡＬ療法の投与の結果として、患者は、２５０ないし３５０ｍｇ／日から３５０ないし４００ｍｇ／日までの食事性Ｐｈｅの彼の／彼女の摂取を増加させることができると考えられる（すなわち、患者のＰｈｅ許容性表現型は、古典的ＰＫＵ患者のそれから中程度ＰＫＵ患者のそれまで変化される）。もちろん、ここに教示された治療介入は、患者が、２５０ないし３５０ｍｇ／日から４００ないし６００ｍｇ／日への食事性Ｐｈｅの彼の／彼女の摂取を増加させることを可能とし（すなわち、患者のＰｈｅ許容性表現型は古典的ＰＫＵ患者のそれから軽度のＰＫＵ患者のそれへ変化し）、あるいはより好ましくは、患者が、６００ｍｇ Ｐｈｅ／日よりも大きな摂取（すなわち、正常な食事摂取）を有することを可能とするのは好ましいであろう。
（本発明によるＢＨ４−非応答性ＰＫＵ患者の特徴、およびその治療の方法）
本発明の方法で治療することができる患者の第２の群は、上昇した血漿中Ｐｈｅ濃度、すなわち、２００μｍよりも大きないずれかの濃度を有すると判断されたが、（後に記載されるＢＨ４負荷テストによって判断して）ＢＨ４療法に対して非−応答性であると診断された個体である。そのような患者は、軽度のＰＫＵ（すなわち、６００μＭまでの血漿中Ｐｈｅ濃度）を有する個体、中等度のＰＫＵ（すなわち、６００μＭないし約１２００μＭの間の血漿中Ｐｈｅ濃度）を有する個体、ならびに古典的重症ＰＫＵ（すなわち、１２００μＭよりも大きな血漿中Ｐｈｅ濃度）を有する患者を含むことができる。
ＢＨ４療法に対して非−応答性である患者には、その食事において低下した量の蛋白質を組み合わせたＰＡＬを与えて、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度を減少させる。本発明の方法は、ＰＡＬの投与が、ＰＡＬ療法の不存在下で投与された同一食事プロトコルで生じる減少と比較して、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度のより大きな減少を生じるようなものである。食事制限は、減少した量のＰｈｅを有する合成医薬蛋白質処方を供することによってＰｈｅ摂取を制限する食事であり得、あるいは別法として、食事制限は、患者が彼の／彼女の総じての蛋白質摂取を制限することを単に必要とするが、それにも拘らず、患者が限定された量の通常の食品を食べることを可能とするものであり得る。
古典的ＰＫＵ患者について議論した好ましい治療結果は、引用により本セクションに援用される。中等度ＰＫＵを持つ患者（すなわち、６００μＭ／Ｌないし１２００μＭの制限されない血漿中Ｐｈｅ濃度を有する患者）についての好ましい治療的結果は、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度の少なくとも２５％減少を含む。好ましくは、該方法は、血漿中Ｐｈｅ濃度の３０％減少を生じるであろう。なおより好ましくは、該方法は個体の血漿中Ｐｈｅ濃度の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を生じるであろう（例えば、中等度の古典的ＰＫＵを持つ患者が１０００μＭのＰｈｅ濃度を有する場合、Ｐｈｅ濃度の９０％減少が１００μＭの血漿中Ｐｈｅ濃度を生じ、これは、ほとんどまたは全く食事制限を必要としないのに十分低い濃度である）。
好ましい実施形態において、治療すべき中等度のＰＫＵ患者の血漿中Ｐｈｅ濃度は、６００μＭないし１２００μＭの間である制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度のいずれかの量から、３００μＭ未満であるいずれかの血漿中Ｐｈｅレベルまで低下される。（単独、あるいは食事制限を組み合わせた）ＰＡＬでの特に好ましい治療は、例えば、２００μＭないし約４００μＭの間のレベルまでの血漿中Ｐｈｅ濃度の減少を生じ、これは、療法の臨床的に有用な結果と見られるであろう。なぜならば、この範囲に血漿中Ｐｈｅ濃度を有する患者は、Ｐｈｅ−制限処方を食べるのに対して、単に食事中の蛋白質濃度の量を制限することによって疾患を管理することができるからである。事実、多くの研究において、そのような患者は通常の食事さえ食べることができると教示されている。
治療の結果として患者によって許容できる食事性Ｐｈｅレベルの量のいずれの増加も、治療上有効な結果であると考えられるであろう。例えば、（単独、あるいは他の治療的介入と組み合わせて）ＰＡＬ療法を投与する結果として、患者は、３５０ないし４００ｍｇ／日から４００ないし６００ｍｇ／日へ食事の彼の／彼女の摂取を増加させることができると考えられる（すなわち、患者のＰｈｅ許容性表現型は中等度ＰＫＵ患者のそれから軽度のＰＫＵ患者のそれへ変化する）。もちろん、本明細書中に教示された治療的介入は、患者が、３５０ないし４００ｍｇ／日から４００までの食事性Ｐｈｅの彼の／彼女の摂取を増加させて、患者が、６００ｍｇ Ｐｈｅ／日よりも大きな摂取（すなわち、正常な食事摂取）を有することを可能とするのは好ましいであろう。
治療すべき患者が軽度のＰＫＵのみを発現する患者であっても（すなわち、４００ないし６００ｍｇ Ｐｈｅ摂取／日の食事許容性を有するならば）、本発明のＰＡＬ−ベースの療法から利益を得るであろう。なぜならば、できる限り３６０μＭ±１５μＭに近い正常化された血漿中Ｐｈｅ濃度を生じるのが望ましいからである。そのような患者については、好ましい治療的結果は、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度の少なくとも２５％減少を含むであろう。好ましくは、該方法は、血漿中Ｐｈｅ濃度の３０％減少を生じるであろう。なおより好ましくは、該方法は、個体の血漿中Ｐｈｅ濃度の４０％、５０％、６０％以上の減少を生じるであろう（例えば、軽度のＰＫＵを持つ患者が６００μＭのＰｈｅ濃度を有する場合、Ｐｈｅ濃度の６０％減少は、３６０μＭの血漿中Ｐｈｅ濃度、すなわち、血漿中Ｐｈｅの許容される正常な濃度を生じるであろう）。
好ましい実施形態において、治療すべき軽度のＰＫＵ患者の血漿中Ｐｈｅ濃度は、４００μＭないし６００μＭの間の非−制限血漿中Ｐｈｅ濃度の量から、１００μＭ未満であるいずれかの血漿中Ｐｈｅレベルまで低下される。もちろん、例え（単独で、あるいは食事制限と組み合わせた）ＰＡＬでの治療が、例えば、２００μＭないし約４００μＭのレベルまでの、血漿中Ｐｈｅ濃度のより小さな減少を生じても、これは該療法の臨床的に有用な結果として見られるであろう。
治療の結果として患者によって許容できる食事性Ｐｈｅレベルの量のいずれの増加も、治療上有効な結果であると考えら得るであろう。例えば、（単独で、あるいは他の治療的介入と組み合わせて）ＰＡＬ療法を投与した結果として、患者は、４００ないし６００ｍｇ／日から食事性Ｐｈｅの彼の／彼女の摂取を増加させて（すなわち、患者のＰｈｅ許容性表現型は軽度のＰＫＵ患者のそれから軽度のＨＰＡ患者のそれへ変化する）、患者が６００ｍｇ Ｐｈｅ／日よりも大きな摂取（すなわち、正常な食事摂取）を有するのを可能とする。
さらに、たとえ患者が非ＰＫＵ ＨＰＡの徴候を発現するに過ぎない、すなわち、６００μＭまでの上昇した血漿中Ｐｈｅ濃度を有する患者であっても、正常な蛋白質食を食べることができるのは、本発明のＰＡＬ療法から利益を受けるであろう。なぜならば、上昇したＰｈｅ濃度はそのような個体のＩＱに対して有意な効果を有することが示されているからである。さらに、後に議論するように、特別な必要性を持つ被験体、例えば、妊婦および幼児のＰＡＬ治療的介入は、たとえ患者の血漿中Ｐｈｅレベルが２００μＭ未満の認められる「安全な」レベル内にあっても特に重要である。
（母性ＰＫＵ、および本発明によるその治療方法）
妊娠が予定されたＰＫＵ女性、および妊娠しているＰＫＵ女性における血漿中Ｐｈｅレベルの代謝制御は、胎児のＰＡＨ状態にかかわらず、イン・ウテロにおける中程度の上昇さえしたＰｈｅレベルに暴露された胎児の深刻な結果のため重要である。血漿中Ｐｈｅ濃度の治療的制御は、適切な制御を達成するのを失敗すると、小頭蓋骨症、精神的欠陥および先天的心臓病を含めた障害をもたらすので、妊娠の最初の３ヶ月間で特に重要である。
例えば、フェニルケトン尿症についてのＮＩＨ会議宣言（ｖｏｌ １７＃３、２０００年１０月）は、３ないし１０ｍｇ／ｄＬの母性Ｐｈｅレベルへの胎児の暴露は、小頭蓋骨症２４％発生率を生じ、他方、２０ｍｇ／ｄＬを超える（すなわち、１２００μＭよりも大）に暴露したものは、小頭蓋骨症７３％発生率を有したことを報告している。同様に、先天性心臓病は、２０ｍｇ／ｄＬよりも大きな母性Ｐｈｅレベルに暴露した小児の１０％を超えて見出された。重要なことには、６ｍｇ／ｄＬよりも大きなＰｈｅレベルは小児のＩＱを有意に減少させることが注記されている。かくして、フェニルケトン尿症の全ての形態を持つ女性、最も軽度のＨＰＡを発現するものの血漿中Ｐｈｅ濃度は、綿密に制御して、母性ＰＫＵ症候群の危険性を回避しなければならないのを保証するのは急務である。しかしながら、米国の臨床医で用いられてきたＰＫＵ女性の血漿中Ｐｈｅ濃度についての許容される標的レベルは、１０ｍｇ／ｄＬおよび１５ｍｇ／ｄＬの間の範囲であり、これは、妊婦で推奨される２ないし６ｍｇ／ｄＬレベル、あるいは母性ＰＫＵ症候群を発症する危険性を減少させるのに英国およびドイツの臨床医で用いられる１ないし４ｍｇ／ｄＬよりもかなり高い。
妊婦についての別の重要な考慮は、その総じての蛋白質摂取である。妊娠の間に、妊婦が十分な蛋白質を食べるのは重要である。なぜならば、妊娠中の低蛋白質食は、遅れた腎臓の発生、およびネフロンの数の引き続いての低下をもたらし、潜在的に、成人期における高血圧に導くことが示唆されているからである（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８（１７）：１７２３−１７２４（２００３））。以下の表は、種々の個体についての推奨された全食事性蛋白質摂取についての例示的なガイドラインを提供する。
Figure 2008513027
 前記例示したガイドラインから分かるように、米国においては、出産適齢期の女性（例えば、５１歳未満）についての推奨される蛋白質摂取は約４４ないし５０ｇ／日であり、他方、妊娠した女性は約６０ｇ／日の摂取が推奨される。カナダおよび英国においては、妊娠した女性についての推奨される蛋白質摂取は約７０ｇ／日および５０ｇ／日のオーダーである。かくして、妊婦の血漿中Ｐｈｅ濃度レベルは、綿密に制御されることを保証する必要性は、この群のＰＫＵ患者が匹敵する年齢の非−妊娠ＰＫＵ女性よりも多くの蛋白質を必要とする事実によってさらに複雑化される。
前記に鑑みると、本発明のＰＡＬ療法は妊婦で特に有用であると考えられる。妊娠している、または妊娠が考えられるＨＰＡのいずれかの形態に罹った女性は、ＰＡＬ療法のコースに置いて、彼女の血漿中Ｐｈｅ濃度レベルができる限り１８０μＭないし約３６０μＭ近くに維持されるのを保証することが考えられる。療法のそのようなコースは、恐らくは、正常な蛋白質摂取の彼女のレベルをその女性が増加させるのを可能とする。
セクションＩＡおよびＩＢにて前記にて議論された、血漿中Ｐｈｅ濃度のレベル、およびそのようなＰｈｅ濃度を減少させるべき程度の議論は、妊婦についての本セクションに援用される。
（幼児におけるＰＫＵの管理および本発明によるその治療方法）
全体と通じてここに議論されるように、幼児（年齢０ないし３歳）における血漿中Ｐｈｅ濃度の上昇の結果、小児のＩＱの有意な降下をもたらすと判断された。しかしながら、本明細書中において他の箇所で議論するように、４００μＭまでのどこかの上昇した血漿中Ｐｈｅ濃度を有する患者は、通常、いずれかの食事介入を受けない。かくして、年齢が０ないし３歳の幼児は、本発明の療法から有意な有害な効果を受ける。本適用では、その被験体の血漿中Ｐｈｅ濃度の有益な減少を生じさせるために、ＰＡＬを含む治療組成物で、３６０μＭ±１５μＭよりも大きな制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度を有するいずれかの幼児を治療することが考えられる。
好ましい実施形態において、幼児は０および３歳の年齢の間の年齢であり、ＰＡＬの投与に先立って約１２００μＭの制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度を有し、該投与は血漿中Ｐｈｅ濃度を減少させる。好ましくは、血漿中Ｐｈｅ濃度は、１８００μＭよりも大から、投与に際して、約１５００μＭ、約１２００μＭ、約１１００μＭ、約１０００μＭ、約９００μＭ、約８００μＭ、約７００μＭ、約６００μＭ、約５５０μＭ、約５００μＭ、約４５０μＭ、約４００μＭ、約３５０μＭ、約３００μＭ、約２７５μＭ、約２５０μＭまで低下される。他の実施形態において、幼児は０および３歳の年齢の間の年齢であり、１２００μＭよりも大きな制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度を有し、好ましくは、この血漿中Ｐｈｅ濃度は、単独で、あるいは食事と組み合わせたＰＡＬの投与に際して、約８００μＭ、またはより好ましくは約５００μＭ、あるいはなおより好ましくは約３６０μＭまで低下する。当業者であれば、本発明では、３６０μＭよりも大きな制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度を持つ幼児をＰＡＬで治療して、そのような血漿中Ｐｈｅ濃度の減少を生じさせるのが考えられることを理解するであろう。前記した血漿中Ｐｈｅ濃度の治療的低下の議論はここに引用して援用する。さらに、初期の制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度の１０％を超えるいずれの減少も、幼児に対する治療的養生法についての治療的結果と考えられるであろう。ＰＡＬ療法は食事制限と組み合わせて、そのような幼児において血漿中Ｐｈｅ濃度における治療的減少を行うことができることは理解されるべきである。
表２は、治療上有効量のＰＡＬの投与が役に立つであろう多数の疾患状態をリストするであろう。非経口、経口または他の標準的投与経路、および用量は標準的な方法を用いて決定できる。
Figure 2008513027
 （２．治療で用いられる組成物）
本発明では、ＰＫＵ／ＨＰＡの治療的介入が考えられる。そのような介入は、最初に、単独で、または食事制限と組み合わせて用いることができるＰＡＬの使用に基づく。さらなるＰＡＬおよび／または食事制限は、例えば、脳におけるＰｈｅ蓄積を回避するための大きな中性アミノ酸（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂｏｌ．７９：１１０−１１３（２００３）参照）、またはチロシン補充のような、例えば、ＰＫＵの他の発現に戦うように設計された他の治療組成物とさらに組み合わせることができる。本セクションは、ここに考えられる治療で用いることができる組成物の議論を提供する。
ＰＡＬ組成物
一般に、本発明では、医薬上許容される希釈剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に、有効量の本発明の蛋白質または誘導体生成物を含む医薬組成物が考えられる。そのような組成物は種々の緩衝液含有量（例えば、トリス−ＨＣｌ、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、抗−酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ二亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロザール、ベンジルアルコール）、および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）のような添加剤を含む；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２） ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２参照。有効成分の有効量は、体重、年齢および治療目標のような因子を考慮することによって、当業者が容易に決定することができる治療的に、予防的に、または診断的に有効な量である。
本発明のＰＥＧ：ＰＡＬ組成物は、所望の範囲内に溶液のｐＨを維持するための緩衝剤を含むこともできる。好ましい剤は酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含む。これらの緩衝剤の混合物を用いることもできる。組成物で有用な緩衝剤の量は、特定の用いる緩衝液および溶液のｐＨに大いに依存する。例えば、アセテートはｐＨ６よりもｐＨ５においてより効果的な緩衝液であり、従って、ｐＨ６におけるよりもｐＨ５において溶液中でより少量のアセテートを用いることができる。本発明の組成物ｐＨ範囲はｐＨ３．０ないし７．５である。
本発明の組成物は、さらに、溶液を等張および注射により適合するようにする等張性調節剤を含むことができる。最も好ましい剤は、０ないし１５０ｍｍの濃度範囲内の塩化ナトリウムである。
本明細書中で用いるように、かつＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートが考えられる場合、用語「治療上有効量」とは、患者に利益を与える血清Ｌ−フェニルアラニンの減少を与える量をいう。該量は、個体の間で変化し、患者の全身体的条件を含めた多数の因子に依存するであろう。療法で用いるＰＡＬの量は、血清Ｌ−フェニルアラニン減少の許容される速度を与え、この値を、有益なレベルに（通常、少なくとも約３０％、典型的には、１０％ないし５０％の範囲に）維持する。本発明の組成物の治療上有効量は、公に取得可能な材料および手法を用いて当業者が容易に確認することができる。
本発明は、天然ＰＡＬよりもしばしば少量のＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートを投与することを提供する。投与頻度は、治療すべき疾患に応じて変化するが、一般には、一週間当たり約１回であろう。現実に用いられる投与頻度は、ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートに対する異なる個体による応答性の変動のためここに開示する頻度から幾分変化し得ることは理解され；用語「約」は、そのような変動を反映することを意図する。
本発明は、かくして、血清Ｌ−フェニルアラニンレベルを低下させるのに用いることができる。最も普通には、血清Ｌ−フェニルアラニンレベルは過剰フェニルアラニン血症のため減少する。本発明によって治療可能な疾患の中には、フェニルケトン尿症に関連する過剰フェニルアラニン血症が含まれる。また、治療可能なのは、チロシン血症で見出されるもののような増大した血清Ｌ−チロシンレベルに導き得る疾患である。加えて、血清Ｌ−フェニルアラニンおよび／または血清Ｌ−チロシンレベルの枯渇が有益であろう多数の癌−関連疾患もまた本発明のＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートで治療することもできる。
本発明に従って調製されたＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートは、好ましくは、腹腔内、皮下または筋肉内にて注射によって投与される。しかしながら、当業者には、送達の他の経路も本発明の組成物を用いて効果的に利用することもできるのは明らかであろう。
本明細書中に記載された方法は、１以上の医薬上許容される賦形剤またはビヒクルおよび、所望により、他の治療剤および／または予防成分と一緒に、前記した分子を含む医薬組成物を用いる。そのような賦形剤は水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノール、シクロデキストリン、修飾されたシクロデキストリン（すなわち、スルホブチルエーテルシクロデキストリン）等のような液体を含む。非−液体処方のための適当な賦形剤もまた当業者に知られている。
医薬上許容される塩を本発明の組成物で用いることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息鉱酸塩等のような有機酸の塩を含む。医薬上許容される賦形剤および塩の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に取得可能である。
加えて、湿潤もしくは乳化剤、生物学的緩衝物質、界面活性剤等のような補助的物質をそのようなビヒクルに存在させることができる。生物学的緩衝液は、薬理学上許容でき、かつ所望のｐＨ、すなわち、生理学的に許容される範囲のｐＨを持つ処方を供する実質的にいずれの領域でもあり得る。緩衝溶液の例は生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ハンクスの緩衝生理食塩水等を含む。
意図した投与の態様に応じて、医薬組成物は、好ましくは、正確な用量の単一投与に適した単位投与形態の、例えば、錠剤、坐薬、丸剤、カプセル剤、粉末、液体、懸濁液、クリーム、軟膏、ローション等のような固体、半固体または液体投与形態の形態であり得る。組成物は、医薬上許容される担体と組み合わせた有効量の選択された薬物を含み、加えて、他の医薬剤、アジュバント、希釈剤、緩衝液等を含むことができる。
一般に、本発明の化合物は、（バッカルおよび舌下を含めた）経口、直腸、鼻腔内、局所、肺、膣または（筋肉内、動脈内、クモ膜下腔、皮下および静脈内を含めた）非経口投与に適した、あるいは吸入または通気による投与に適した形態のものを含めた医薬処方として投与されるであろう。投与の好ましい様式は、疾患の程度に従って調製することができる便宜な日投与養生法を用いる静脈内である。
固体組成物では、慣用的な非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む。液体の医薬上許容される組成物は、例えば、本明細書中に記載された活性な化合物および任意の医薬アジュバントを、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等のような賦形剤に溶解させ、分散等を行うことによって調製して、それにより、溶液または懸濁液を形成することができる。所望により、投与すべき医薬組成物は、少量の、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、等張化剤等のような非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート等を含有することもできる。そのような投与形態を調製する現実の方法は公知であるか、あるいは当業者に明らかであろう；例えば、前記引用のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ参照。
経口投与では、組成物は、一般には、錠剤、カプセル、ソフトゲルカプセルの形態をとることができるか、あるいは水性もしくは非水性の溶液、懸濁液またはシロップとすることができる。錠剤およびカプセルは好ましい経口投与形態である。経口用途のための錠剤およびカプセルは、一般には、ラクトースおよびコーンスターチのような１以上の通常用いられる担体を含むであろう。ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤もまた典型的には加える。液体懸濁液を用いる場合、活性剤を乳化および懸濁剤と組み合わせることができる。所望であれば、フレーバー剤、着色剤および／または甘味剤を同様に加えることができる。経口処方に配合するための他の任意の成分は、ここでは、限定されるものではないが、保存剤、懸濁化剤、増粘剤等を含む。
非経口処方は、液状の溶液または懸濁剤、注射に先立って液体中へ可溶化または懸濁させるのに適した固体形態、またはエマルジョンとして慣用的形態に調製することができる。好ましくは、滅菌注射懸濁液は、適当な担体、分散もしくは湿潤剤、および懸濁化剤を用いて当該分野で公知の技術に従って処方される。滅菌注射処方は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であっても良い。使用することができる適当なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌下不揮発性油、脂肪エステルまたはポリオールは、慣用的には、溶媒または懸濁化媒体として使用される。加えて、非経口投与は、一定レベルの用量が維持されるように、遅延放出または維持放出システムの使用を含むことができる。
前記にて同定されたＰＥＧ：ＰＡＬ化合物は、心血管病を治療または軽減するのに治療上有効用量にて患者に投与することができる。そのような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な用量）を投与することによるなどして、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手法によって決定することができる。毒性および治療効果の間の用量比率は治療指標であって、それは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指標を呈する化合物は通常は好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを、ヒトで用いるある範囲の用量を処方するのに用いることができる。該用量は、好ましくは、ほとんどまたは最小の毒性しか持たないＥＤ５０を含むある範囲の循環濃度内にある。該用量は、使用する投与形態および利用する投与の経路に依存してこの範囲内で変化することができる。治療上効果的な用量は、細胞培養アッセイから、および動物モデルから決定することができる。
（食事性蛋白質）
ＰＡＬおよび関連アナログをＨＰＡ／ＰＫＵ患者に投与するに加えて、患者の食事性蛋白質を制限し、または修飾することもできると考えられる。当業者であれば、ＰＫＵの治療で用いる種々の商業的に取得可能な蛋白質処方を認識する。そのような処方はＭＡＸＩＭＡＩＤ、ＰＨＥＮＥＸ１、ＰＨＥＮＥＸ ２（Ｒｏｓｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ、ＵＫ）、ＬＯＦＥＮＡＬＡＣ、ＰＨＥＮＹＬ−ＦＲＥＥ（Ｍｅａｄ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）、等を含む。
当業者は、一般的にはＰｈｅ濃度を含まない引用された蛋白質処方を用いることができる。蛋白質処方は、しばしば、ＰＫＵ患者において欠乏しているアミノ酸を補充する。そのようなアミノ酸は、例えば、Ｌ−チロシン、およびＬ−グルタミンを含む。ＰＫＵ患者の食事にバリン、イソロイシンおよびロイシンを補足するのが望ましいであろうと提案されている（米国特許第Ｎｏ．４，２５２，８２２号参照）。ある臨床的状況においては、ＰＫＵの毒性効果は、チロシンおよびトリプトファンのような他のアミノ酸の脳摂取をブロックするＰｈｅによって引き起こされる。ＰＫＵ患者の食事をそのような大きな中性アミノ酸の過剰量で補足すると、脳へのＰｈｅ摂取がブロックされ、脳Ｐｈｅレベルを効果させることが判明した。かくして、本発明の方法では、食事養生法は、さらに、１以上のこれらのアミノ酸を含む組成物で補足することができると考えられる（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂｏｌ．７９：１１０−１１３（２００３））。
さらに、通常はヒト乳および動物起源の他の食品に見出されるＬ−カルニチンおよびタウリンもまた蛋白質制限に加えて供給すべきであることが知られている。ある実施形態においては、Ｌ−カルニチンは２０ｍｇ／１００ｇの蛋白質補足物として供給することができ、タウリンを４０ｍｇ／１００ｇ蛋白質補充物として供給して、ヒト乳および動物起源の食品に通常見出されるこれらの因子の量を供給するのを助けることができる。
加えて、患者に供給して、他の補足物が食事性蛋白質制限にもかかわらず供されていることを保証すべき必須のビタミンおよびミネラルのような他の成分のさらなるリストについては、２０００ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｎｔａｋｅｓを当業者は参照。
合計蛋白質量および望ましい血漿中Ｐｈｅ濃度に関する前記議論を参照し、当業者であれば、要求される食事性蛋白質制限の量を決定し、かくして、それに従って患者の食事を調整することができる。例えば、約１１ないし１４歳の男性を考えると、その個体は好ましくは４５ｇ蛋白質／日を摂取すべきである。該個体が重症古典的ＰＫＵを有する場合には、彼の制限されていない血漿中Ｐｈｅ濃度が同様に１２００μＭよりも大きいようであり、もしその個体についての食事性蛋白質源の全てが、好ましくは彼の血漿中Ｐｈｅ濃度を６００μＭ未満まで降下させる、粉末化蛋白質補充物からのものであるようであれば、大部分である。ＰＡＬをその被験体に投与することによって、治療結果は、患者の血漿中Ｐｈｅ濃度のより大きな減少を生じるものであり、別法として、治療的結果は、個体の血漿中Ｐｈｅ濃度が同様な程度まで降下されるものであるが、その個体は、食事処方からというよりはむしろ通常の食事からの蛋白質を許容することができる。
同様に、約１１ないし１４歳の男性は、中等度ＰＫＵを有するものであり、本発明の方法を用いて、彼に、制限された処方よりはむしろ通常の蛋白質摂取を通じて割当られた４５ｇ蛋白質／日を与えるのが可能であろう。本発明の方法が効果的であるか否かを決定することが、正規のベースで患者の血漿中Ｐｈｅ濃度を決定して、血漿中Ｐｈｅ濃度が少なくとも４００μＭ未満のままであることを保証することを含むであろう。そのような濃度を決定するためのテストは後に記載する。好ましくは、３６０μＭ未満のまたは約３６０μＭの濃度が達成される。
（３．患者集団の同定およびモニタリング）
本明細書全体を通じてここに議論するように、本発明の種々の実施形態においては、所与の患者がＰＡＬ療法に応答性であるか否かを決定し、および治療すべきＰＫＵ患者のクラスを同定し、および継続的治療養生法の間に、該養生法の効果をモニターするための患者のフェニルアラニン濃度を測定することが必要であろう。例示的なそのような方法は後に本明細書中で記載する。
（ＢＨ４負荷テスト）
ＢＨ４負荷テストは、ＢＨ４の欠乏による、またはＰＡＨの欠乏を通じてＨＰＡを有する患者の間の区別を可能とする。
最も単純なＢＨ４負荷テストは、内因性ＢＨ４を投与し、血漿中Ｐｈｅ濃度の降下に対する該投与の効果を決定するテストである。２ｍｇ／ｋｇのＢＨ４の静脈内負荷は最初Ｄａｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｌａｎｃｅｔ １：１２３６，１９７６）によって提案され、より大きな純度のＢＨ４が利用可能となるにつれて、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重の量のＢＨ４の経口投与を用いてテストを行うのが可能となった。結局、いくつかの研究所は依然として２０ｍｇ ＢＨ４／ｋｇ体重までを使用しているが、７．５ｍｇ／ｋｇのＢＨ４の単一経口用量が投与される標準化されたアプローチがＮｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．によって提案されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１３８：４４１（１９８２））。
単純なＢＨ４負荷テストが信頼性のある結果を生じるように、患者の血中Ｐｈｅレベルは４００μＭよりも高いことが必要とされる。従って、患者にとって、負荷テストを行うに先立って２日間でＰＫＵ食から除去されるのがしばしば慣用的である。ＢＨ４テストキットは取得可能であって、Ｄｒ．Ｓｃｈｉｒｃｋｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｊｏｎａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって配給される。このキットは、通常の食事の摂取から約３０分後における２０ｍｇ ＢＨ４／ｋｇ体重の用量を推奨する。
（Ｐｈｅ濃度の測定）
血中のＰｈｅの存在を測定するための多数の方法がある（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎ Ｂｉｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ ａｎｄ Ｓｏｍｅ Ｏｔｈｅｒ Ｉｎｂｏｒｎ Ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍ Ｖｃｒｌａｇ，４７−５６（１９７１））。典型的には、フェニルアラニンおよびチロシン濃度は、フルオロメトリックアッセイを用いて患者の血清から測定される。このアッセイは、ロイシルアラニンの存在下でニンヒドリンと共にフェニルアラニンを加熱した場合の蛍光物質の形成に依拠する（ＭｃＣａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．５９：８８５−８９０（１９６２））。
Ｐｈｅ濃度を測定するための最も一般的な方法はＧｕｔｈｒｉｅテストであり、そこでは、患者からの血液試料で飽和されている濾紙からディスクを打ち抜く。均一なディスクを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを接種され、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ増殖の特異的阻害剤を含有する寒天のトレイ中でインキュベートする。フェニルアラニンが均一なディスクから寒天上へ移動するにつれ、Ｐｈｅは増殖の阻害剤を逆行させ、それにより、既知量のＰｈｅを含有するディスクを用いて行った同様なアッセイと比較することによって、フェニルアラニン濃度に相関させることができる増殖の領域を生じる。
Ｐｈｅ濃度を定量する他の方法はＨＰＬＣ、マススペクトロメトリー、薄層クロマトグラフィー等を含む。そのような方法を用いて、療法の前に患者の血漿中Ｐｈｅ濃度を測定し、治療的養生法の間にＰｈｅ濃度をモニターして、その効率を測定することができる。
患者の血漿中Ｐｈｅレベルは、治療的養生法の時間コースを通じて便宜な間隔（例えば、毎日、一日おき毎にまたは毎週）モニターすることが考えられる。そのような規則性でもって血漿中Ｐｈｅレベルをモニターすることによって、臨床医は、治療の効率を評価し、それに従って、ＰＡＬおよび／または食事性蛋白質の要件を調整することが可能であろう。
（組合せ療法）
本発明のある方法は、種々の形態のＨＰＡを持つ患者において治療的結果を得るためのＰＡＬおよび食事性蛋白質制限の組合せ使用を含む。本明細書中で考えられる組合せ療法において適当な治療結果を達成するためには、所望の治療的結果を生じさせるのに有効な組合せ量にてＰＡＬ組成物および食事制限を被験体に一般的に投与する（すなわち、血漿中Ｐｈｅ濃度の降下、および／または血漿中Ｐｈｅ濃度の同時増加を生じさせることなくＰｈｅ／蛋白質摂取のより大きな量を許容する能力）。このプロセスは、同時に、ＰＡＬ組成物および食事性蛋白質治療組成物を投与することを含むことができる。これは、食事性蛋白質要件の全てを含み、また、当該蛋白質処方内にＰＡＬを含む単一組成物または薬理学的蛋白質処方を投与することによって達成することができる。別法として、食事性蛋白質（補足物または通常の蛋白質食事）を、ＰＡＬの薬理学的処方（錠剤、注射またはドリンク）としてほぼ同時に接種する。ＰＡＬは、摂食に適したブラウニー、パンケーキ、ケーキのような蛋白質バーまたは他の食品に処方することもできる。
他の代替法において、ＰＡＬ治療は、数分ないし数時間の範囲の間隔だけ食事性蛋白質療法に先んじ、または遅れさせることができる。蛋白質およびＰＡＬ組成物を別々に投与する実施形態においては、重要な時点は、ＰＡＬが依然として患者に対して有利な効果を発揮できるように、各送達の時間の間に消滅しないことを一般には保証するであろう。そのような場合には、食事性蛋白質摂取の約２ないし６時間内（前または後）にＰＡＬを投与することが考えられ、約１時間に過ぎない遅延時間は最も好ましい。ある実施形態において、ＰＡＬ療法は、日用量のＰＡＬが患者に規定されずに投与される連続的療法であろうと考えられる。他の状況においては、例えば、ＰＫＵおよびＨＰＡのより軽度の形態のみを有する妊婦においては、ＰＡＬ療法は、該女性が妊娠しておりおよび／または授乳させている限りは継続させるに過ぎないであろう。
さらに、ＰＡＬおよび食事性蛋白質調節の送達のみに基づく療法に加えて、本発明の方法では、ＨＰＡの徴候の１以上を特異的に標的とする第３の組成物との組合せ療法も考えられる。例えば、ＨＰＡによって引き起こされたチロシンの欠乏の結果、神経伝達物質ドーパミンおよびセロトニンが欠乏することが知られている。かくして、本発明の関係では、ＰＡＬおよび食事性蛋白質ベースの方法は、さらに、Ｌ−ドーパ、カルビドーパおよび５−ヒドロキシトリプトファン神経伝達物質の投与とさらに組み合わせて、食事におけるチロシンの減少した量に由来する欠陥を修正することができよう。
フェニラーゼの投与は（ＰＡＨの投与とは異なり）チロシンを生じさせないであろうから、そのような治療は、依然として、そのような患者のための必須のアミノ酸であるチロシンをもたらすであろう。従って、チロシンの食事補足は、ＢＨ４療法と組み合わせてフェニラーゼを受ける患者で望ましいであろう。
（Ｉ．ＰＡＬの製造）
本発明の別の態様はＰＡＬを生産する方法である。好ましい実施形態において、組換えＰＡＬを、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）に関するような誘導性プロモーターを含むベクター、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中にてＮ−末端オクタヒスチジルタグ付き誘導蛋白質として過剰発現させる。バイオリアクター／ファーメンターのためのシード培養は、シェーキングフラスコ中のグリセロースストックから増殖させることができる。次いで、そのようなシード培養を用いて、供給−バッチ様式にて制御されたバイオリアクターにスパイクすることができる。グルコースを補足し、ｐＨを塩基（ＮＨ４ＯＨ）で制御し、アジテーションを１２００ｒｐｍまでとする。Ｏ２供給は溶存酸素を２０％よりも大きく維持する。７０ないし１００のＯＤ６００に到達するまで（〜２２ないし２５時間）、細胞を３０℃の温度にて増殖させ、次いで、０．４ｍＭ ＩＰＴＧと共にインキュベートすることができる。該温度は２２ないし２６℃まで低下させ、活性の変化が＜０．１ ＩＵ／ｍｌとなるまで増殖させる（ほぼ４０ないし４８時間、および典型的には２００のＯＤ６００）。細胞培養基は典型的には規定され酵母エキス蛋白質、ペプトン−トリプトン、グルコース、グリセロール、カザミノ酸、痕跡量塩およびリン酸緩衝塩よりなる。組換えＴＡＬ産物を細胞内で生産させ、分泌させない。該細菌は連続的遠心（Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ，Ｃａｒｒ，Ｃｅｂａ，または同等物）によって収穫することができる。
（Ｊ．ＰＡＬの精製）
本発明のさらなる態様は、ＰＡＬ、またはその生物学的に活性な断片、突然変異体またはアナログを精製する方法をその要旨とする。第１の実施形態によると、形質転換された細胞塊を増殖させ、破壊して、粗製組換え酵素を得ることができる。外因性物質を、所望により粗製バルクから分離して、カラムの汚れを妨げることができる。クロマトグラフィー精製は１または数個のクロマトグラフィー樹脂を用いて行うことができる。引き続いて、精製された蛋白質は、長時間にわたって安定な活性を供するように設計された緩衝液に処方することができる。別の好ましい実施形態において、ＰＡＬを精製するための方法は（ａ）圧力ホモゲナイザーを用いる（が、潜在的には、ガラスビーズ溶解のような他の物理的手段によって）組換えＰＡＬを含有する細菌を溶解すること；（ｂ）加熱処理、（ｃ）（Ｃｕｏｎｏ Ｚｅｔａ ＰｌｕｓまたはＭａｘｉｍｉｚｅｒ，Ｐａｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ，またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｉｌｌｉｓｔａｋまたはＯｐｔｉｃａｏフィルターに関するように）第２の連続的遠心工程および／または深さ濾過を用いるこの溶解物の清澄化（ｄ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ ４０ＡＣに関するような）木炭濾過工程での通過；（ｅ）（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ０．２μｌフィルターに関するような）最終濾過工程での通過；（ｆ）（Ｔｏｓｏｈ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｍにおけるような）ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーでの通過；（ｇ）（ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑにおけるような）Ｑイオン交換カラムでの通過；（ｈ）（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ ＨｙｄｒｏｓａｒｔまたはＰＥＳ １００ ｋＤａ膜に関するような）接線方向流動濾過での緩衝液交換による最終産物の回収を含む。当業者であれば、クロマトグラフィー工程の１以上を省略し、または置き換えることができ、あるいはクロマトグラフィー工程の順序を本発明の範囲内で変化させることができるのは容易に認識する。最後に、適当な滅菌工程を所望により行うことができる。
さて、本発明を一般的に記載してきたが、それは以下の実施例を参照して、より容易に理解することができる。実施例は説明目的のためだけに掲げるものであり、断じて、本発明の範囲を限定する意図のものではない。用いた数字（例えば、量、温度等）に関しては正確性を保証するように努力をしたが、いくらかの実験誤差または偏差は、もちろん、許容されるべきである。
（実施例１）
（ＰＡＬの結晶構造）
（ＰＡＬ蛋白質の発現および精製）
全長Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ｐａｌ ＤＮＡクローン（ｐＩＢＸ−ＰＡＬ（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９ ｉｂｉｄ．）、野生型ＰＡＬアミノ酸配列（図５に示す）、およびＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位（ｐＥＴ−ＰＡＬ）の間のＨｉｓ−タグ−含有ｐＥＴ−２８ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）における再クローン化された構築体双方を用いた。ｐＥＴベクター構築体については、ＰＡＬ蛋白質は、Ｎ−末端でトロンビン−切断可能Ｈｉｓタグと共に発現された。野生型ｐＥＴ−ＰＡＬ構築体は３．５ｍｇ／Ｌレベルの活性なＰＡＬ（ｖｓ ｐＩＢＸ−ＰＡＬ ＰＡＬ構築体については１ｍｇ／Ｌ）を生じ、ＰＡＬの１−工程固定化金属アフィニティクロマトグラフィー精製を供する。ＰＡＬ蛋白質の双方の形態は、結晶化トライアルのために用いた。
Ｈｉｓタグ付きＰＡＬは、０．８のＯＤ６００にて１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導しつつ３７℃にて３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３） Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現させた。温度を２３℃まで低下させ、発現を３時間進行させる。細胞を回転沈降させ、−８０℃にて凍結した。細胞ペレットを、ＥＤＴＡ−フリーのプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を含む、１００ｍＭトリス、９０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．８に再懸濁させた。次いで、溶液を３分間音波処理し、続いて、４５，０００ｒｐｍにて２５分間遠心工程を行った。ついで、溶解物を０．２２μｍ膜を通して濾過した。清澄化した溶解物を、Ｎｉ＋２を荷電した７ｍＬのＰＯＲＯＳ ＭＣ２０カラムに負荷した。平衡／線状緩衝液は２５ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．８を含有した。溶出緩衝液は同一の平衡／洗浄緩衝液であったが、５０ｍＭイミダゾールを添加したものであった。０ないし５００ｍＭイミダゾールの直線状グラジエントをカラムに流し（２０カラム容量グラジエント）、Ｈｉｓ−ＰＡＬ蛋白質はほぼ７０ｍＭイミダゾールにて溶出を開始した。ＰＡＬを含有する画分をプールし、溶解するまで４℃にて３０分間攪拌しつつ、硫酸アンモニウムを０．６Ｍの濃度まで加え、続いて、３０分間４５，０００ｒｐｍにて遠心工程、および０．２２μＭ膜を通す濾過を行った。次いで、蛋白質溶液を、２５ｍＭトリス、０．６Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．８で平衡化した７ｍＬのＰＯＲＯＳ ＨＰカラムに流した。ＰＡＬはカラムに結合せず、それを通る流れ中に収集した。ＰＡＬ画分を収集し、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８、９０ｍＭ ＮａＣｌへの緩衝液交換工程を行いつつ、Ｏｒｂｉｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｐｏｌｌｏ ２０ないし３０ｋＤａ分子量カットオフスピンコンセントレーターを用いて７．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶化は、後に概説するセレノメチオニンＰＡＬ手法に続いて行う。酵素純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定し、酵素活性は、ＯＤ２９０測定を用いて測定した。精製されたＰＡＬ試料は、イン・ビトロ安定性および活性についてテストした。
別法として、セレノメチオニン−発現ＰＡＬを用いた。というのは、直接的ＭＡＤ（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ，９（５），ｐｐ．１６６５−１６７２（１９９０））および／またはＳＡＤ（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，５６（Ｐｔ ４），ｐｐ．４３１−４４１（２０００））結晶学溶液が可能だからである。セレノメチオニン発現では、ｐＩＢＸ−ＰＡＬ構築体をＥ．ｃｏｌｉメチオニン−要求株Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、細胞を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．７６ｍＭセレノメチオニンを含有する最小培地中で３７℃にて増殖させた。ＯＤ６００が０．６ないし０．８に到達すると、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることによって、培養を２４℃にて３時間誘導した。細胞を遠心によって収穫し、細胞ペレットを−８０℃にて凍結させた。
蛋白質結晶化トライアルのための精製は、ヘリウム下で４℃にて行った。９Ｌ培養からの細胞を、真空下で、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ベータ−メルカプトエタノール、ＥＤＴＡ−フリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）中で溶解させた。次いで、溶液を３分間音波処理し、続いて４５，０００ｒｐｍにて３０分間遠心工程を行った。次いで、溶解物を０．２２μｍ膜を通して濾過した。次いで、蛋白質溶液を、２５ｍＭトリス、０．０１％β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．８で平衡化させた７ｍＬのＰＯＲＯＳ ＨＱカラムに流した。直線グラジエントにて、２５ｍＭトリス、１ＭＮａＣｌ、０．０１％β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．８を用いてＰＡＬを溶出させた。ＰＡＬ画分を、溶出画分での活性アッセイを用いて同定し、活性な試料を収集し、真空下で４℃にて３０分間攪拌しつつ硫酸アンモニウムを１．７Ｍの濃度まで加え、続いて、４５，０００ｒｐｍにて３０分間遠心工程を行い、および０．２２μｍ膜を通して濾過を行った。次いで、蛋白質溶液を、２５ｍＭトリス、１．７Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．８で平衡化させた７ｍＬのＰＯＲＯＳ ＨＰカラムに流した。溶出は、２０カラム容量グラジエントにて２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８緩衝液を用いた。活性な画分を収集し、これは０．８Ｍ程度の硫酸アンモニウムにおけるものである。次いで、活性なＰＡＬ画分を、緩衝液交換工程にて２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８まで濃縮した。次いで、ＤＥＡＥカラムを、２０カラム容量グラジエントを用い、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８泳動緩衝液および２５ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ溶出緩衝液を用いて流した；活性な画分を収集し（第１のピーク）、濃縮し、緩衝液を交換して、最終のＨＱカラム（２０カラム容量グラジエントを用いる、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８負荷緩衝液、２５ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８溶出緩衝液）を流し、活性なＰＡＬを含有する画分を収集した。次いで、活性なＰＡＬを、Ｏｒｂｉｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｐｏｌｌｏ ２０−３０ｋＤａ分子量カットオフスピンコンセントレーターを用いて、７．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、緩衝液交換は２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８、９０ｍＭ ＮａＣｌまでであった。
（ＰＡＬの蛋白質構造の決定）
Ｈｉｓ−タグなしで発現させた活性なＰＡＬ（ｐＩＢＸ−ＰＡＬ）を１ｍｇ／Ｌ培養収率で生産した。２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８、９０ｍＭ ＮａＣｌ中の５ないし１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬの濃度におけるセレオメチオニン−発現ＰＡＬを、４℃におけるシッティングドロップ結晶化トライアルで用いた。１．６Åまで拡散したＰＡＬの野生型結晶が、１１ないし１６％のＭＰＥＧ ５Ｋ、８０ないし１００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５を用いて得られた。フラッシュ凍結は１５％ＭＰＤ低温保護剤浸漬を用いる。
結晶の初期評価、および低温保存戦略のために、データを、Ｒ−軸４デタクターおよび低温凍結機器を備えたイン−ハウス回転陰極ＦＲ−Ｄ（Ｒｉｇａｋｕ）上に収集した。低モザイク性、合理的寿命、および良好な拡散の組合せを呈することが見出された結晶は、最終のデータ収集のためにシンクロトン放射源まで輸送されるであろう。天然ＰＡＬ処理データをＳＨＥＬＸＤ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２７７，ｐｐ．３１９−３４３（１９９７））を用いるＳＡＤによって解析して、６０のセレン原子のうち５２の位置を突き止めた。位相をＳＨＥＬＸを用いて計算し、ＤＭ（Ｃｏｗｔａｎ，Ｊｏｉｎｔ ＣＣＰ４ ａｎｄ ＥＳＦ−ＥＡＣＢＭ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、３１，ｐｐ．３４−３８（１９９４））を用いて溶媒フラッテニングで改良した。主鎖をＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Ｐｅｒｒａｋｉｓら、 Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｅｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，５７（Ｐｔ１０），ｐｐ．１４４５−１４５０（２００１））によって追跡し、側鎖はｇｕｉＳＩＤＥを用いて追跡した。モデルの形成はプログラムＯ（Ｊｏｎｃｓら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ａ４７，ｐｐ．１１０−１１９（１９９１））で行った。修正は、ＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，Ｄ５３，ｐｐ．２４０−２５５（１９９７））を用いた。
添付書類Ａに示す結晶構造座標の出力は、高Ｂ−値を含み、非常に動的である残基（例えば、１０３ないし１２３、および３５０ないし３５３）を含む。
（ＰＡＬの構造的特徴）
Ｘ線結晶学を用い、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｔｅｓ ＰＡＬの構造は決定されている（図１）。全長野生型ＰＡＬは空間群Ｐ２１２１２１にて結晶化し（ａ＝１０４．７５９、ｂ＝１５１．６１２、ｃ＝１７９．９２２）、非対称ユニット当たり４つの分子であった。結晶構造はテトラマー酵素（Ｍｒ＝３０７，５１８）（図１）を明らかにし、これは、酵素が溶液中でテトラマーであることを示す以前の生化学的実験に合致する（Ｈａｖｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４（８），１６２０‐１６２６（１９７５））。単位セル内に４つの２−折畳み軸がある。ＰＡＬテトラマーにおいては、５０残基（１ないし２５、１０３ないし１２３および３５０ないし３５３）についての側鎖および骨格残基の部分は弱い密度を有し、全ての４つのモノマー中の表面ループに存在し、構造中で目に見えない。構造のこれらの領域は、恐らくは乱れており、表面−露出フレキシブルループ内に位置する。ＰＡＬテトラマーの鎖折畳みトポロジーは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａヒスチジンアンモニア−リアーゼ（ＨＡＬ．Ｓｃｈｗｅｄｅら、（１９９９）ｉｂｉｄ．）、およびアスパラギン酸アンモニア−リアーゼ（Ｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（３０），ｐｐ．９１３６−９１４４（１９９７））、フマラーゼ（Ｗｅａｖｅｒ，ｅｔ ａ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２（８），ｐｐ．６５４−６６２（１９９５））、およびアルギノコハク酸ラーゼ（Ｔｕｒｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，９４（１７），ｐｐ．９０６３−９０６８（１９９７））のようないくつかの他のテトラマー酵素と同様である構造のアルファ−ラセンよりなる。
ＰＡＬの各モノマーは、主として、アルファ−ラセンよりなり、４つのドメイン−中央触媒ドメイン、Ｎ−末端ドメイン、およびヒスチジンアンモニア−リアーゼ構造に対して同様性を持つ小さなＣ−末端ドメイン（Ｓｃｈｗｅｄｅら、（１９９９）ｉｂｉｄ．）＋無傷テトラマー分子の末端から突出し、１１１Å×４７Å×４４Åの近似的寸法を持つ細長い構造を形成する、Ｃ−末端領域に挿入されたさらなるドメインに細分化できる（図１）。ドメイン１、２および４は一緒に、０．８９２Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．を持つＨＡＬのコアと重複する。
ドメイン１（Ｄ１）は、残基１ないし２７３よりなり、これは種々の長さの１１のα−ラセンおよび７つの短いβ−ストランドよりなる。Ｄ１は、ＨＡＬのＮ−末端領域とよく重複し、ＨＡＬの最も保存された配列である（図２）。ＰＡＬのＭＩＯ補綴分子族触媒活性中心（残基２１１ないし２１３）はこのドメイン中に位置する。基質結合に関与し得る残基１０２ないし１２４の領域に位置するフレキシブルな表面ループもまたこのドメインに位置する。残基１ないし２５、１０３ないし１２３、および３５０ないし３５３は、構造の表面領域に位置し、高いＢ−値を有する。我々の生化学的な部位特異的突然変異誘発および切形実験は、このドメインが活性で重要であることを示す。切形突然変異体１０ないし７１６は活性を呈さず、Ｎ−末端のまさに端部がＰＡＬ機能で重要であることを示す。
ドメイン２（Ｄ２）は、ＰＡＬのモノマーおよびテトラマー双方の中心ドメインであり、残基２７４ないし５４０を含有し、ほとんど全てのα−ラセンセグメントよりなる。Ｄ２のコアは、その長さの範囲が１５ないし３８残基で変化する、６つのほとんど平行なα−ラセンよりなる。ＰＡＬテトラマーにおいては、６つのラセン束が組み立てられて、２４のほとんど平行なα−ラセンの中心コアを形成する。Ｄ２の６つのα−ラセン束は、長さが１０ないし３０残基の範囲のループによって相互に結合し、これは、構造のこの領域を非常に柔軟にし得る。
ドメイン３（Ｄ３）は、ＰＡＬおよびＨＡＬの間の主要な構造的に区別されるドメインであり、ＨＡＬに対してＰＡＬ構造における過剰なドメインである。Ｄ３は残基５４１ないし６５５を含み、４つのα−ラセン束よりなる。４つのα−ラセンは共平面から約３０度だけ偏って、相互に対してほとんど平行である。Ｄ３におけるα−ラセンのうちの１つ（残基５４１ないし５４９）およびＤ２における１つのα−ラセン（残基５０５ないし５４０）は、一緒になって、４４残基長のα−ラセンを形成する。Ｄ３は、ＤＡＬＩ（９４７ Ｈｏｌｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３３，ｐｐ．１２３−１３８（１９９３））を用いて剛性サーチを行うと、同様な構造構築物を有しないが、Ｄ３は、プログラムＦＡＴＣＡＴ（９４４ Ｙｅ，ｙ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９（Ｓｕｐｐｌ ２），ｐｐ．ｉｉ２４６−ｉｉ２５５（２００３））を用いて柔軟な整列を行うと、１つのひねりにて、ＨＡＬのＣ−末端領域の端部（残基４５３ないし５０９）と（１．９９Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．にて）より整列することができる。Ｄ３は、４つのＰＡＬモノマーのうちの中央界面に位置せず、その代わり、そのＤ３テトラマー−関連カウンターパート（モノマーＡないしＤ、またはモノマーＢないしＣ）とでヘッド−ツー−ヘッドパッキング配置されて、テトラマーの主要領域から突き出ている。
ドメイン４（Ｄ４）は、３α−ラセン束および２０残基長ループを含有する、ＰＡＬ（残基６５６ないし７１６）における最小ドメインである。Ｄ４は、ＨＡＬ（残基４５３ないし５０９）のＣ−末端構造の端部と同様の配置を有する。ＰＡＬ中のドメインＤ４は、２４α−ラセンの束の周囲に位置するが、依然として、テトラマーの主領域に位置する。我々の切形実験は、Ｄ４が活性で重要であることを示した。
以下の表は、本発明に従ってＰＡＬの構造を決定するのに用いたＰＡＬのＸ線結晶学データ組をまとめる（表３）。
Figure 2008513027
 （実施例２）
（ヒトヒスチジンアンモニアーリアーゼ（ＨＡＬ）の構造）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＨＡＬ（４２７ Ｓｃｈｗｅｄｅら、（１９９９）ｉｂｉｄ．）３−Ｄ構造に基づいて、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗ３ｏｒｇ／Ｊｉｇｓａｗ／）で利用可能なＪＩＧＳＡＷサーバーを用い、ヒトＨＡＬの残基１１４ないし６０７の三次元構造（図６）をモデル化した。ヒトＨＡＬは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＨＡＬに対して相同なコアを持つ、全体中に６５７のアミノ酸を有するが、Ｎ−およびＣ−末端は差を呈する。
（実施例３）
（ＰＡＬの活性部位の確認）
ＨＡＬの構造、配列の整列、メカニズム研究および部位特異的突然変異誘発に対する比較からの組み合わせた情報に基づいて、ＰＡＬの活性部位を同定した。ＰＡＬは、残基Ａｌａ２１１、Ｓｅｒ２１２、およびＧｌｙ２１３によって形成されるＨＡＬと同一の活性部位ＭＩＯ補欠分子族を有する。我々は、ＭＩＯの５Å内にあるＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ活性部位において残基を定義する。該ＰＡＬ活性部位は、モノマーＡからの残基（Ａ１３８、Ａ２０８−Ａ２１８、Ａ２６６、Ａ２７０−Ａ２７２、Ａ２７４−Ａ２７５、Ａ３９５−Ａ３９６、Ａ４１１−Ａ４１５、Ａ４９６、Ａ４９９−Ａ５００、およびＡ５０２−Ａ５０５）、モノマーＢからの残基（Ｂ３６０、Ｂ３６３、Ｂ３６６−Ｂ３６７、およびＢ３７０−Ｂ３７１）、およびモノマーＣからの残基（Ｃ４７２）を含めた、ＰＡＬテトラマーにおける３つの異なるモノマーからの残基よりなる。Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ活性部位における全ての残基は、ドメインＤ１およびＤ２からのものである。柔軟なループ領域Ａ１０６ないしＡ１２４は、活性部位の進入に対するカバーとして作用する。提案され、かつＨＡＬ活性部位において構造的にかつ生化学的に特徴付けられている殆どの残基はＰＡＬ活性部位に見出されている：Ａｌａ２１１ ｖｓ． Ａｌａ１４２、Ｓｅｒ２１２ ｖｓ． Ｓｅｒ１４３、Ｇｌｙ２１３ ｖｓ． Ｇｌｙ１４４、Ａｓｐ２１４ ｖｓ． Ａｓｐ１４５、Ｔｙｒ３６３ ｖｓ． Ｔｙｒ２８０、Ｐｈｅ４１３ ｖｓ． Ｐｈｅ３２９、Ａｒｇ３６６ ｖｓ．Ａｒｇ２８３、Ａｓｎ２７０ ｖｓ． Ａｓｎ１９５、Ｇｌｙ２７１ ｖｓ． Ｇｌｙ１９６、Ｌｅｕ２１４ ｖｓ． Ｌｅｕ１４６、Ｐｈｅ１１６ ｖｓ． Ｐｈｅ５９、３６０ ｖｓ． Ｇｌｎ２７７；ＰＡＬおよびＨＡＬ活性部位の間のただ２つの異なる残基はＧｌｎ４９９ ｖｓ Ｇｌｕ４１４、およびＧｌｎ１３８ ｖｓ Ｈｉｓ８３である。
活性部位領域の帰属に合致して、これらの領域でなされた多数の突然変異は許容されない（Ｒ１０２Ｋ、Ｑ１０４Ｋ、Ｓ１０８Ｋ、Ｙ１１０Ｈ、Ｙ１１０Ａ、Ｙ１１０Ｌ、Ｔ１１４Ｋ、Ｒ１２３Ｈ、Ｒ１２３Ａ、Ｒ１２３Ｑ、Ｔ１２４Ｐ、Ｔ１２４Ｋ、およびＱ１３１Ｋ）。しかしながら、活性部位領域に存在する残基の他の突然変異は、もし改良された活性でなくても、同様な活性のＰＡＬの改変体を生じる（Ｒ９１Ｋ、Ｈ１３７Ｋ、Ｒ９１Ｋ＋Ｈ１３７Ｋ）。そのような改変体のＰＥＧ化または他の化学的誘導体化は、改良された免疫保護および／または改良された蛋白質分解耐性のような改良された性質を持つＰＡＬコンジュゲートに導くであろう。
ＰＡＬ活性部位の周りには５つの柔軟性ループがある：モノマーＡからのループ１９７ないし２１８、 ループ１０１ないし１２４、ループ３９２ないし４１５およびループ４８６ないし５０５、ならびにモノマーＢからのループ３６０ないし３６３。突然変異誘発実験は、Ｙ１１０の多数の突然変異体が活性をなくしたことを示しており、これは、このループ中の残基Ｔｙｒ１１０がＰＡＬ活性で重要であることを示す。切断産物の蛋白質配列決定と組み合わせた我々の蛋白質分解実験は、トリプシンおよびキモトリプシンについてのＰＡＬにおける殆どの接近可能な切断部位は、各々、Ｔｙｒ１１０およびＡｒｇ１２３であり、双方は、１０１ないし１２４ループにおけるものである、かくして、このループの柔軟性および重要性に対するさらなる証拠を提供することを示した。他の種からのＰＡＬと同様に、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬは、それを、チロシンのような競合的阻害剤と共にインキュベートすることによって、プロテアーゼ不活化から保護することができる。活性部位のこの柔軟な部分を「ロックダウン」するように設計されたＰＡＬの突然変異体は、特に、柔軟なループ領域がプロテアーゼ切断の共通した部位であるという観察に徴して、より低いプロテアーゼ感受性を持つ改変体に導くことができる（米国特許第６，２６１，５５０号）。加えて、Ｔｙｒ１１０およびＡｒｇ１２３の近隣における部位（例えば、Ａｓｐ９５、Ｌｙｓ９６、Ｇｌｕ９９、Ａｒｇ１０２、Ｔｈｒ１２４、Ｇｌｕ１２５、Ａｓｐ１２６、Ｇｌｕ４０３、Ａｓｎ４０４、Ｌｙｓ４０５、Ｖａｌ２５９、Ｐｒｏ２６２、Ｖａｌ１８６、Ａｒｇ３５９、Ｖａｌ３４９、Ｌｙｓ３５０、Ｖａｌ３５１、Ｌｙｓ３５２、Ｇｌｙ６８５、Ｌｙｓ６８６）の、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、または化学的に誘導体化することができる他の残基への突然変異もまた、プロテアーゼ耐性を持つＰＡＬ改変体を作り出すことができる。
（実施例４）
（ＰＡＬの表面残基の確認）
インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｓｂ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ／ａｒｅａ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）利用できるプログラムＧＥＴＡＲＥＡ １．１を用いて、ＰＡＬ結晶構造原子座標（表４）に基づいて、溶媒接近可能残基（Ｉｎ／Ｏｕｔ比率表示「Ｏ」）、構造内部の残基（Ｉｎ／Ｏｕｔ比率表示「ｉ」）、および部分的に表面に露出された残基（Ｉｎ／Ｏｕｔ比率表示ｍｉｓｓｉｎｇ）を決定した。このタイプの情報に関しては、残基は、それらの表面接近可能性に基づいて突然変異について選択することができる。
表４ Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬテトラマーのモノマーＡにおける残基についてのＧＥＴＡＲＥＡ １．１出力（計算で用いた１．４００のプローブ半径）（配列番号１の残基２６〜１０２、残基１２４〜３４９、および残基３５４〜７１５）。同様の値はＰＡＬのＢ、Ｃ、およびＤモノマーで得られる。
Figure 2008513027
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 （実施例５）
（未知のＰＡＬ結晶構造を解明するための分子置き換えおよび他の方法の使用）
有意な変化が三次元構造に起こり（例えば、大きな切形）、かつ分子置き換えを用いることができない場合には、直接的ＭＡＤ（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｗ．Ａ．ら、（１９９０）ｉｂｉｄ．）および／またはセレノメチオニン含有ＰＡＬを用いるＳＡＤ（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．ら、（２０００）ｉｂｉｄ．）フェージングを用いた。基質および／または阻害剤−複合体化野生型ＰＡＬならびにＰＡＬ突然変異体のような、有意に変化しない構造では、これらの構造は、分子置き換えを用いて決定した。
（実施例６）
（ＰＡＬの蛋白質エンジニアリング）
高解像度三次元ＰＡＬ蛋白質結晶構造に関しては、分子エンジニアリング方法を適用して、触媒効率、安定性、免疫−耐性、およびプロテアーゼ耐性を改良して、ＰＡＬのイン・ビボ有効性を増大させた。前記で開示した１．６Å解像度構造に関しては、当業者であれば、（よりコンパクトで安定なＰＡＬの形態を除去し、および生じさせるための）最もフレキシブルな構造の領域、（突然変異させて、蛋白質の活性を増強し、および／またはサイズを最小化させるために）活性部位近くに位置する残基、および免疫原性（例えば、マッピング研究で同定された線状または立体配座エピトープ）および／または（プロテアーゼマッピング研究からの）蛋白質分解感受性部位を決定することができ、それにより、問題の部位の直接的破壊のための部位特異的突然変異体の導入、あるいは免疫反応および／または蛋白質分解から、ＰＡＬに存在する感受性部位を保護するための表面ＰＥＧ化または他の化学的誘導体化を可能とする。
（ＰＡＬの突然変異誘発）
突然変異体創製のための一般的な合理的説明は、設計の４つの一般的方法に基づく。まず、プロテアーゼおよび／または免疫原性部位を邪魔し、またはそうでなければそれを除去するための、切形、挿入、および表面ベニアリングを含めた点突然変異を用いる。第２に、ループ再−エンジニアリング、ＰＡＬ配列へＨＡＬ配列をグラフトするためのループスワッピングを含めたキメラを用いて、改良されたＰＡＬ改変体を生じさせることができる。第３に、点突然変異体を作成して、部位特異的誘導体化のための部位を導入する。最後に、指向性進化を用いて、方法１ないし３を用いて作成されたいずれかの突然変異体の活性を改良することができる。
（切形および他の突然変異体の作成）
部位特異的突然変異誘発はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国特許第５，７８９，１６６号および第６，３９１，５４８号）を用いて行い、切形は、切形されたＰＡＬ配列を創製するように設計された適当なプライマーを用いるＰＣＲでなされた。ループスプライスド突然変異体は２−工程ＰＣＲプロセスで構築して、適当な（切形された）ループ配列を野生型ＰＡＬ配列にスプライシングした。全ての突然変異は、ＤＮＡ配列決定で確認した。
ループ−指向性エンジニアリングは、治療的利点のためのＰＡＬ分子フレームワークを十分に改良するための指向性進化方法の可能な包含と共に、点突然変異誘発の取込、飽和部位突然変異誘発の取込につき選択されたＰＡＬ構造における表面ループでの、ＰＡＬ分子人工物改良のために用いた。
ＰＡＬの全体的３−Ｄ構造、およびＰＡＬにおけるプロテアーゼ−感受性部位および主要エピトープ免疫原性部位のマッピング結果に基づいて、Ｈｉｓタグ付きＰＡＬの特異的点突然変異体を構築して、プロテアーゼ／免疫原性感受性のこれらの部位を除去し、続いて、活性につき選択し、あるいは別法として、点突然変異体を作成して、部位特異的ＰＥＧ化誘導体化のために、特異的アミノ酸残基をこれらのＰＡＬループ領域に導入した（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、（１９９１）ｉｂｉｄ．；Ｂｈａｄｒａら、（２００２）ｉｂｉｄ．，Ｖａｓｓｅｒｏｔら、（２００３）ｉｂｉｄ．，Ｓａｔｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５４（４），ｐｐ．４８７−５０４（２００２））。
蛋白質配列によって同定されたトリプシン（Ａｒｇ１２３）およびキモトリプシン（Ｔｙｒ１１０）の一次認識部位における単一点突然変異を作成し：トリプシン部位における突然変異はＡｒｇ１２３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２３ＡｌａおよびＡｒｇ１２３Ｇｌｎであり、キモトリプシン部位においては、Ｔｙｒ１１０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１１０ＡｌａおよびＴｙｒ１１０Ｌｅｕであった。突然変異体Ｔ１２４Ｐを作成して、トリプシン標的部位であるＡｒｇ１２３が、このプロテアーゼについての認識配列を修飾した場合に、蛋白質分解から保護されたかをテストした。全ての突然変異体は野生型ＰＡＬに対して減少した活性を有したが、低下した蛋白質分解感受性は多数の試料で明らかであった（ＰＡＬ改変体プロテアーゼ消化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定された低下した蛋白質分解）。
いくつかの残基における単一点突然変異をなして、ＰＥＧ化できる蛋白質中にさらなるリシン部位を導入した：Ｒ９１Ｋ、Ｒ１０２Ｋ、Ｑ１０４Ｋ、Ｓ１０８Ｋ、Ｔ１１４Ｋ、Ｔ１２４Ｋ、Ｑ１３１Ｋ，およびＨ１３７Ｋ（図４）。これらの突然変異の中で、Ｒ９１ＫおよびＨ１３７Ｋは、各々、野生型ＰＡＬと比較して増加したまたは同様な触媒活性を示し、ついで、これらの突然変異は、さらなる発現およびＰＥＧ化分析のためにｐＩＢＸＰＡＬベクターに導入した。また、二重突然変異体Ｒ９１Ｋ＋Ｈ１３７Ｋも作成し、これらの新しい構築体のＰＥＧ化は、活性（図７）および免疫保護の点で有望なように見える。残基Ｒ９１Ｋは部分的に表面に露出され、かつアルファ−ラセンＡｓｐ８６−Ｌｅｕ１０１に位置し、他方、残基Ｈ１３７ＫはＰＡＬ構造に対して内部であり、アルファ−ラセンＡｓｐ１２６−Ｌｅｕ１３９に位置する（Ｈ１３７のＮＤ１はＡｌａ１３３およびＬｅｕ１３４のアミドカルボニルとで水素結合を形成し、他方、Ｈ１３７のＮＥ２はＧｌｎ１３８に水素結合する）。表５は、ＰＥＧ化の前および後における、野生型ＰＡＬおよび二重突然変異体Ｒ９１Ｋ＋Ｅ４０３Ｑの活性と比較した、単一点突然変異によって生じたいくつかの突然変異体の触媒活性を示す。Ｈ５９８Ｑ突然変異体を創製して、Ｂ−細胞エピトープマッピングデータによって予測されるエピトープの免疫原性を減衰させることを試み、ここに、残基５９７ないし６０１によって規定される領域は免疫優性と定義された。Ｈ５９８はこの領域における唯一の部分的に露出された残基であり、より小さな中性アミノ酸Ｇｌｎに突然変異された。Ｋ１３２は、ループ１０１ないし１２４およびループ１３９ないし１５２と連結するラセン１２５ないし１３８に位置する。このラセンは、ＭＩＯの周りで正の極性を示す唯一のものである。Ｋ１３２は表面に部分的に露出され、Ａｒｇに突然変異されて、リシンの数を低下させ、このラセンの極性を増強させた。三重突然変異体、Ｒ９１Ｋ＋Ｅ４０３Ｑ＋Ｈ５９８ＱおよびＲ９１Ｋ＋Ｅ４０３Ｑ＋Ｋ１３２Ｒは、ＰＥＧ化後における二重突然変異体Ｒ９１Ｋ＋Ｅ４０３Ｑのそれと比較して、活性の増加を示した。
Figure 2008513027
 ＰＡＬのさらなる部位特異的突然変異体を構築して、蛋白質分解および／または免疫原性領域の近隣にＬｙｓ残基を導入して、ＰＡＬ蛋白質分解および／または免疫原性感度を妨げるＰＥＧ誘導体化のための領域を提供することができる。
以下のプライマーをＰＡＬ突然変異誘発で用いる。
Figure 2008513027
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 （配列番号４４および４５）。
プログラムＰｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（Ｂｉｏｎｅｘｕｓによって決定された予測）を用いる、計算予測ＰＡＬエピトープに基づくさらなる突然変異を、蛋白質のＲ９１Ｋ突然変異体において行った。陽性突然変異（触媒的に活性で改良された免疫耐性）を、さらなる発現、活性、ＰＥＧ化、免疫原性、プロテアーゼ感受性およびイン・ビボ研究のために、野生型ＰＡＬおよびＲ９１Ｋ−ＰＡＬ構築体に導入した。
作製された単一点突然変異は以下のものを含んだ：
エピトープ２２６ないし２４３において：Ｈ２３７Ｓ、Ｈ２３７Ｑ、Ｈ２３７Ｇ、Ｅ２３８Ｑ
エピトープ３３７ないし３５６において：Ｒ３４０Ｋ、Ｋ３５２Ｒ、Ｅ３３７Ｑ、Ｅ３４６Ｑ、Ｅ３４７Ｑ
エピトープ３９６ないし４１３において：Ｅ４０３Ｑ
エピトープ５６９ないし５８９において：Ｒ５７０Ｋ、Ｅ５７５Ｑ、Ｅ５８６Ｑ、Ｄ５７１Ｓ
エピトープ６１９ないし６３０において：Ｅ６３１Ｑ。
加えて、ＰＡＬエピトープにおける残基の欠失は：
ｄｅｌ＿６１ないし８４、ｄｅｌ＿２３７ないし２３８、ｄｅｌ＿３４８ないし３５６、ｄｅｌ＿３９６ないし４１０、およびｄｅｌ＿５４１ないし６５５を含んだ。
以下のプライマーをＲ９１Ｋ−ＰＡＬ改変体突然変異誘発で用いる。
突然変異誘発エピトープＰＡＬ
Figure 2008513027
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 別の方法において、部位飽和突然変異誘発を特異的ループ配列に適用して、ＰＡＬ配列のこれらの領域を突然変異させて、ＰＡＬ表面に見出されるいずれの不都合な特徴も除去した（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，４９（６），ｐｐ．７１６−８２０（１９９９）；Ｐａｌｚｋｉｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１４（１），ｐｐ．２９−４４（１９９２））。最後に、もし合理的エンジニアリングが、改良されたＰＡＬ突然変異体を創製するのに困難なことが判明すれば、ＤＮＡシャフリング（Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９８） ｉｂｉｄ．）および分子育種（Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、（１９９９） ｉｂｉｄ．）の指向性進化方法を、ＨＡＬと組み合わせたＰＡＬおよび／またはＰＡＬの突然変異体で用いて、ＰＡＬ蛋白質人工物を最適化することができる。指向性進化技術は、酵素のキネティックおよび他の生物物理学特徴を改良するのに用いられており、突然変異体選択プロセスのために代替ｐＨ値を用いてＰＡＬ用のｐＨ活性プロフィールを改変するのに用いることができる。加えて、（最小活性を除いてプロテアーゼ耐性を持つＲ１２３Ｈ、Ｒ１２３Ａ、およびＲ１２３Ｑ ＰＡＬ突然変異体のような）酵素的に貧弱なＰＡＬ突然変異体を生じさせる合理的に設計されたＰＡＬクローンについては、これらの突然変異体を、（（Ｖａｓｓｅｒｏｔら、（２００３）ｉｂｉｄ．）に例示されているように）指向性進化酵素活性改良のための出発点として用いることができる。
天然ＰＡＬについてのプロテアーゼマッピング研究は、蛋白質分解感受性の主な部位を示している。これらの部位は、効果的な経口ＰＫＵ酵素代替物の開発のために除去することができる。ＰＡＬ人工物の改良の最初のサイクルにおいては、より小さなサイズのＰＡＬ蛋白質を構築し、（活性測定用の単純な吸光度アッセイを用いて）活性の保持につきスクリーニングし、改良の第２のサイクルにおいて、蛋白質エンジニアリングを用いて、低下した蛋白質分解感受性を持つ突然変異体についてスクリーニングした。一旦、ＰＡＬ蛋白質のサイズが最小化されれば、合理的および指向性進化方法の組合せを用い、プロテアーゼ感受性部位をＰＡＬフレームワークから除去した。修飾の第１の方法は部位特異的ＰＥＧ化を用いて、ＰＡＬの表面からの蛋白質分解感受性部位をマスクし、除去した。突然変異を、プロテアーゼ感受性部位（一次部位Ｔｙｒ１１０およびＡｒｇ１２３）において、またはそれ近くのＰＡＬ表面残基において行って、ＬｙｓまたはＣｙｓ部位を加え、あるいは他の残基を突然変異させて、そのような部位をなくした。不活性な合理的に設計されたＰＡＬ突然変異体については、活性な突然変異体蛋白質についてのフェニルアラニン要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株において選択を伴う指向性進化を用いる蛋白質エンジニアリングを用いて、例えば、さらなるＰＥＧ化誘導体化のために、ＰＡＬの活性な突然変異体形態を生じさせた。
全ての指向性進化突然変異誘発方法は、ＰＡＬ活性を欠乏したＥ．ｃｏｌｉ突然変異体への形質転換を伴う規定された最小培地中での初期増殖および選択を用いて、酵素的に活性な突然変異体を同定した。突然変異は、活性を持つ新しい突然変異体についての陽性選択が最初のクローン同定工程であるように、最小活性を示す突然変異体ＰＡＬクローン（例えば、Ｙ１１０Ａ、Ｙ１１０ＬまたはＳ１０８Ｋ）を用いた。株ＪＰ２２５０、成長のためにチロシンを必要とするＥ．ｃｏｌｉ株（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２１１（１），ｐｐ．６６−７５（１９８１））、またはチロシンを要求する突然変異体である株ＡＴ２４７１（ｔｙｒＡ）（Ｚｈａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１（４），ｐｐ．１３６６−１３７０（１９９４））いずれかを、チロシンおよびフェニルアラニンを欠くＭ９最小培地で形質転換された細胞を誘導し、それを平板培養することによって、機能的Ｈｉｓタグ付きＰＡＬクローンの陽性選択で用いた。
別法として、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、によって研究されたフェニルアラニン要求株を利用した（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８３，ｐｐ．２５６−２６３（１９６２））。Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬは基質としてのＬ−Ｐｈｅおよびチロシン双方と可逆的に反応するので、ＰＡＬ反応の産物（トランス−桂皮酸、トランス−クマリン酸、および塩化アンモニウム）の存在下で、形質転換されＩＰＴＧ誘導されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を増殖させて、逆ＰＡＬ反応の反応性を示す突然変異体ＰＡＬについて選択することによって、活性なＰＡＬ突然変異体を選択する。別法として、［Ｇｕ，ｅｔｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｏｍｐ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２（２）：１４１−１５８（１９９７）に引用された］フェニルアラニン要求株を選択で用いる。
ＰＡＬ突然変異誘発実験で作成した有望なクローンの分析は、ＰＡＬについての光学吸光度キネティック測定方法、ならびに突然変異体候補に存在する突然変異の部位を決定するための配列決定を用い、（ＶｍａｘおよびＫｍ決定、基質の結合定数、蛋白質分解安定性、イン・ビトロ免疫原性、活性のｐＨ依存性活性の温度−依存性を含めた）精製されたクローンの特徴付けを含んだ。活性、免疫原性、およびプロテアーゼ感受性要件をパスした有望なＰＡＬクローンを、考慮するエンジニアリングスキームに応じて、恐らくはＰＥＧ化誘導体化後に、マウスＰＫＵモデルシステムでのテストに付す。加えて、突然変異のこれらの好都合な部位のＰＡＬ ３−Ｄ構造のマッピングは、改良された安定性に関連するメカニズムが判断されるのを可能とする。指向性進化の最初のラウンドの後、結果は、「ホットスポット」および／または他の構造ベースの機能的相関が存在するか否かを示す。指向性進化のさらなるラウンドは、機能的に重要な「ホットスポット」の部位−飽和突然変異誘発を取り込んで、イン・ビボ酵素有効性をさらに改良することができる。
指向性進化で得られた突然変異体は、ＰＥＧ化を用いて研究される。もし突然変異体ＰＡＬ蛋白質のＰＥＧ化が通常のＰＥＧ化条件（変化したｐＨ、ＰＥＧ化反応時間、モル比率ＰＥＧ：蛋白質、ＰＥＧの分子量の変化（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、１９９１ ｉｂｉｄ．））下で起こらないならば、リシンまたはシステリン残基への表面残基のさらなる部位特異的突然変異誘導を使用して、指向性進化実験からの陽性クローンへさらなるＰＥＧ化部位を導入する。
（ＰＡＬ改変体についての活性アッセイ）
活性なＰＡＬ改変体についての最初の選択は、天然またはＰＥＧ化ＰＡＬ試料と同一の、光学密度活性測定を用いる。
（実施例７）
ベクターｐＩＢＥＸ−ＰＡＬを用いて、タグ無しでＥ．ｃｏｌｉにてＰＡＬを発現させ、以下の修飾を施した文献の方法（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９））を用いて蛋白質を精製した。ホモゲナイゼーションの後に、ＰＡＬ溶解物を５５℃にて２時間加熱し、続いて、遠心した。活性化された木炭を濾過された液体画分に加え、一晩揺らした。一旦、１Ｍトリス、ｐＨ７．８および硫酸アンモニウム塩を加えることによって溶液を調整したならば、清澄化された溶解物を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂（Ｔｏｙｏｐｃａｒｌ Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｍ；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に負荷した。２５ｍＭトリス、１２０ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．８を有する緩衝液を用いて産物を溶出させた。ＰＡＬ溶出物溶液を、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．８で、５ｍＳの導電度まで希釈し、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に負荷した；産物を９０ｍＭ ＮａＣｌの段階グラジエントで溶出させた。Ｃａｒｙ ５０ ＵＶ分光光度計にて、キネティックスモードで、標準的な反応条件を用い、ＰＡＬ活性測定を行った。
（実施例８）
線状５ｋＤａまたは２０ｋＤａメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）または１０ｋＤａまたは４０ｋＤａ分岐メトキシ−（ＰＥＧ）２−ＮＨＳ（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）いずれかをＰＡＬにカップリングすることによって、ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートを製造した。確立された反応プロトコル（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８（１９９１），ｐｐ．７１８５−７１８９）を用い、多数のＰＥＧ化条件を、まず、各ＰＥＧ試薬についてテストした。反応条件を、異なる緩衝液、与えられた反応についての異なる温度、ＰＥＧに対するＰＡＬの種々のモル比率、異なるｐＨ値、および反応時間に関してＰＡＬ蛋白質について最適化した。
反応混合物中のＰＡＬの濃度は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．５中で１ｍｇ／ｍｌであった。加えるべきＰＥＧの量は、ＰＡＬ（２９）に存在するリシンの数、ＰＡＬ（４）におけるサブユニットの数、および選択されたＰＥＧのモル比率過剰に基づいて計算し、これは以下によって記載される。
グラムｍＰＥＧ−ＳＰＡまたはｍ（ＰＥＧ）２−ＮＨＳ＝（モルＰＡＬ）（＃ＰＡＬサブユニット）（＃リシン／サブユニット）（ＭＷ ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）（ＰＡＬに対するｍＰＥＧ−ＳＰＡまたはｍ（ＰＥＧ）２−ＮＨＳのｎ−倍増加）
用いたＰＥＧのモル過剰は１ないし３２倍であった（表６）。
Figure 2008513027
 適当な量のＰＥＧおよびＰＡＬを一緒に混合した後、揺さぶりつつ、ＰＥＧ化反応を２５℃にて５時間から一晩までの間インキュベートし、次いで、４℃または−２０℃の反応に置くことによって停止した。反応のＰＥＧ濃度、温度および時間を変化させることによって、修飾の程度を制御した。試料の特徴付けに先立って、かつ未反応の過剰のＰＥＧを除去するために、全ての試料を徹底的に透析した。蛋白質修飾反応を完了させた後、過剰の未反応のＰＥＧを除去するために、Ｔｕｂｅ−Ｏ−Ｄｉａｌｙｚｅｒ （ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて攪拌しつつ、１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４緩衝液に対して試料を４℃にて一晩透析した。一旦、ＮＩ蛋白質アッセイキット（Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて蛋白質濃度を測定すれば、室温にて、Ａｂｓ２９０ｎｍでトランス−経皮酸生成を測定する標準反応条件を用い、誘導体化されていない、およびＰＥＧ誘導体化ＰＡＬ試料についてＰＡＬ活性測定を行った。
（実施例９）
本実施例は、置換の程度、およびポリマーサイズの変動、およびＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートについての立体配座の活性に対する効果を示す。メトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡおよびメトキシ−（ＰＥＧ）−ＮＨＳ双方を用い、種々のＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートを、５ｋＤａまたは２０ｋＤａ、あるいは５ｋＤａ＋２０ｋＤａ線状ポリマーの組み合わせ、ならびに１０ｋＤａまたは４０ｋＤａ分岐ポリマーから合成した。ＰＥＧ：ＰＡＬの試料は、誘導体化の程度の分析のための、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で特徴付けした。得られた調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価して、約８０ｋＤａないし約２００ｋＤａのサイズの範囲であった（図８）。加えて、活性の保持の程度を、光学吸光度アッセイで測定した（表８）。
ＰＥＧ化ＰＡＬ試料を、４ないし１０％ビス−トリスゲルおよび４％および４ないし１２％トリス−グリシン天然ゲル（ＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎからのＮｕＰａｇｅゲル）を用い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した（図８）。ＰＡＬのＰＥＧ化形態についての天然ゲル分析は、高いＰＡＬ：ＰＥＧ比率においてさえ、テトラマー解離についての証拠は示さず、形成されたＰＥＧ化ＰＡＬ種のオリゴマー状態が確認された。
サブユニット解離を改良するための０．５Ｍ尿素または０．０２５Ｍグアニジン−ＨＣｌを用いるマトリックス−援助レーザー脱着イオン化時間飛行マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用い、各ＰＥＧ化ＰＡＬコンジュゲートに付着したＰＥＧ分子の数を定量的に測定した。図８に示すように、多数の異なるＰＥＧ化種がＰＡＬで形成される。ＰＡＬに存在する全てのリシン残基（合計２９）は表面に露出され、恐らくは、誘導体化で利用できる。既に公表されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは、蛋白質−誘導体化種に付着したＰＥＧの数を特徴付けるための正確な技術を提供する（Ｌｅｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９９，１６（６），ｐｐ．８１３−８１８；Ｌｅｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２００３，２０（５），ｐｐ．８１８−８２５；Ｄｉｗａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２００３，２５２（１−２），ｐｐ．１１１−１２２；Ｎａら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３，１７，ｐｐ．２２４１−２２４４）。各ＰＡＬ誘導体種に存在するＰＥＧユニットの相対的数は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルから直接的に測定することができ；ＭＡＬＤＩイオン化は、それらのオリゴマー立体配座からの各ＰＡＬサブユニットを放出するのを助ける尿素またはグアニジン−ＨＣｌのような剤の使用と共に、ＰＡＬオリゴマー解離を破壊する。
線状２０ＫＤａ ＰＡＬＰＥＧ分子の場合には、それらの高いＭＷのため、この特別な技術での高ＭＷ分子についての分解の制限のため、天然ゲルまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析いずれかによって、修飾された蛋白質の状態を決定することが可能でなかった。分岐１０ＫＤｄシリーズのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ結果は、１および２のＰＥＧ分子が、比率１：１６にてＰＡＬモノマー当たりに付着し、１：２４種では１、２および３であった。
ウエスタンブロット分析を用いて、天然ゲルを用い、分岐ＰＥＧ試料に対するＰＡＬ試料の免疫学的反応性の程度をイン・ビトロで特徴付けた。結果は、以下に記載するイン・ビボ結果とやはり相関する天然蛋白質と比較して、分岐ＰＥＧによるわずかな免疫保護を示した。線状ＰＥＧ２０ＫＤａは、試料の高いＭＷのため、この技術によってテストすることができなかったが、他の試料においては、同一タイプのＰＥＧを用い、線状２０ＫＤａ ＰＥＧの比率１：８が、それを免疫沈降によってテストした場合に、完全な免疫保護を与えた。
ＰＫＵまたはチロシン血症療法で用いるために酵素代替物を開発するにおける目的の１つは、酵素のＰＥＧ誘導体化形態に触媒活性を保持させることである。表８にリストするように、ＰＥＧ化ＰＡＬ試料についての活性測定は、これが事実当てはまり、非常に高度にＰＥＧ化された試料のみが、小さな程度の触媒活性を失ったことを示した。酵素ＰＥＧ化のほとんどの場合には、触媒活性の減少が実現され（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２２１（２００３））、しかしながら、活性の同様な改良が、酵素フェニルアラニンヒドロキシダーゼのＰＥＧ化に際して観察された（Ｇａｍｅｚら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９（１）：１２４−１２９（２００４））。驚くべきことに、これらのＰＡＬのＰＥＧ化形態の全ては、それらの非−ＰＥＧ化形態に対して、増大した触媒活性を保持し、ある場合には、それを保有した（表７）。
Figure 2008513027
 略語：
ｎｔ、テストせず；ｎ／ａ、適用できず（天然ゲルで流すことができない試料）
＋：結合；−：非結合；＋／−：部分的結合
ａサブユニットの解離および検出の再現性を改良するための０．５ｍ尿素または０．４Ｍグアニジン−ＨＣｌを用いるマトリックス−援助レーザー脱着イオン化時間飛行マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いる各ＰＡＬモノマーに付着させたＰＥＧ分子の数。
ｂ高分子量ＰＥＧ化種のＰＡＬのモノマー当たりに付着したＰＥＧの数を見積もるために、我々は、還元条件においてＭｕｌｔｉＭａｒｋおよびＨＷＭ天然マーカーを用いてＭＥＳ（２−（Ｎモルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液で流した還元および天然４ないし１２％ビス−トリスゲルを用いた（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
ｃウエスタンブロット試料を天然ゲルに流して、ニトロセルロース膜に移した。ＰＡＬ処理マウスからの抗−血清は陽性対照であり、緩衝液−処理マウスからの抗体および血清は陰性対照であった。アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は二次抗体であり、ウエスタンブルー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発色させた。これらの結果は以下のようにスコア取りした：抗体結合については（＋）、部分的結合については（＋／−）、および抗体結合なしについては（−）。
ｄｐＨ８．５トリス−ＨＣｌ緩衝液中２ないし８μｇ／ｍＬの試料のＥＬＩＳＡアッセイを標準条件下で行い、スコア取りした：陰性対照血清とのインキュベーションよりも高い値を、抗−ＰＡＬ抗体との陽性対照インキュベーションが与えた場合には、陽性（＋）；いずれかの血清試料につき同等の吸光度値があった場合には、陰性（−）；および陽性対照がわずかにより高いとスコア取りされた場合には、（＋／−）。
ｅ免疫沈降をＴＴＢＳ緩衝液（トリス緩衝化生理食塩水中０．１％Ｔｗｅｅｎ）で行った；抗体試料を加える前に、ＰＡＬ活性を測定した。各試料を８倍過剰の抗−ＰＡＬ血清、および非−免疫マウス血清を用いる二連陰性対照反応と共にインキュベートした。インキュベーション後、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４（５０％、ｖ／ｖ）を過剰に加え、試料を回転させつつ４℃にて一晩インキュベートした。ビーズを遠心によって除去し、各上清のＰＡＬ活性をアッセイした。ビーズペレットをウエスタンブロットによって分析して、抗体−ビーズの結合が起こったことを確認した。貧弱な抗体結合を持つＰＡＬ改変体は、ウエスタンブロットによって測定されるようにビーズ画分において、対応して、ほとんどＰＡＬを有さず、上清中に残存するより高い活性を有した。免疫沈降の結果をＥＬＩＳＡ結果と同様にスコア取りし、試料は、値の大きさに応じて、（＋）または（＋／−）とスコア取りされる抗−ＰＡＬ抗体結合を示し、他方、抗−ＰＡＬ抗体結合の低い値を生じる試料は陰性とスコア取りした。
ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝液中の１０％ビス−トリスゲルを用いるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、ＰＥＧ化ＰＡＬ試料を分析した。ＰＥＧ化の後に反応していないおよび潜在的に免疫原性のＰＡＬ蛋白質を検出するために、０．４ｍＬ／分の流速にて、１×ダルベッコのＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＨＰＬＣ（Ｖｉｓｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。イン・ビボでテストした線状２０ｋＤａ ＰＥＧ−ＰＡＬシリーズ処方のイン・ビトロ特徴付けを表８に掲げる。
Figure 2008513027
 ａ蛋白質濃度は、非−修飾蛋白質試料につき、２８０ｎｍで、ＰＡＬ消光係数（０．５ｍｇｍＬ−１ｃｍ−１）を用いて決定した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾（ＰＥＧ化）ＰＡＬについては、ＢＳＡ標準曲線およびＮＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて濃度を計算した。
ｂＰＡＬの１ユニットは、室温にて一分当たりに１μモルのトランス−桂皮酸を生じる酵素の量と定義される。
（実施例１０）
本実施例においては、種々の程度のＰＥＧ化を持つ異なるＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートをＥｎｕ２／Ｅｎｕ２マウス（ＰＫＵモデル遺伝子型（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６（５），ｐｐ．２３３９−２３４４（１９９９）；ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．，７６（４），ｐｐ．２５６−２６１（２００２）；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．，６９，ｐｐ．１８８−１９４（２０００））において評価して、それらのＬ−フェニルアラニン還元ポテンシャルおよび持続ならびに抗体力価を比較し、対比した（免疫原性測定）。テストした化合物の３つのシリーズは：線状５ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬ、分岐１０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬ、および線状２０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートであった。各ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートを単一ボーラス、１ユニットの投与における皮下用量としてテストした。修飾されていないＰＡＬを、単一のボーラス注射における１ユニットの投与において用いた。注射は１、８および２２日に行った。イン・ビボアッセイの結果を図９に示し、これは、ｍＰＥＧ−ＳＰＡまたはｍ（ＰＥＧ）２−ＮＨＳをＰＡＬにカップリングさせることによって調製されたＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートが、Ｅｎｕ２／Ｅｎｕ２マウスアッセイにおいてＰＡＬ単独に対して良好またはそれに少なくとも匹敵する性能であることを示す。さらに、これらのＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートは、修飾されていないＰＡＬに対して延長された効率を示す。Ｅｎｕ２／Ｅｎｕ２マウスでは、酵素投与でのそれらの被膜色の暗化はユーフェニルアラニン血症の獲得を示し、多数のＰＥＧ：ＰＡＬ処理マウスは表現型においてこの変化を呈した。
線状および分岐状ポリマーシリーズからの各ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートは、Ｌ−フェニルアラニン還元効果の有意かつ匹敵する延長を示した（図９参照）。これらのシリーズのコンジュゲートについての抗体力価は認識可能に異なった（図１０）。線状５ｋＤａ−および分岐状１０ｋＤａ−置換ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートはより免疫原性であったが、予期せぬことに、線状２０ｋＤａ置換ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートは、天然ＰＡＬに対して改良された活性および低下した免疫反応性を示した。ＰＥＧ置換ＰＡＬコンジュゲートの全ては、線状２０ｋＤａ置換ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートに匹敵する延長された活性を示した。これらの例は、かくして、ＰＫＵマウスモデルにおける、単一−用量ボーラス注射を用いる、種々のＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートによるＬ−フェニルアラニン還元の増強された持続を示す。
これらのデータは、該結果が、大きさの明瞭な増加、およびＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートに対する応答の持続を示す点で、ＰＡＬ単独に対する、ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートについてのＬ−フェニルアラニン還元活性半減期の増加の予期せぬ利点を示す。いくつかの場合において、線状５ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートは、分岐１０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートを少し凌ぐように見え、これは、線状２０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートを少し凌ぐ。免疫原性の基準に基づき、２０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡｌコンジュゲートは好ましい立体配置であろう。
（実施例１１）
（ＰＥＧ化ＰＡＬ改変体の創製）
（蛋白質ＰＥＧ化）
ＰＡＬ改変体のＰＥＧ化は、文献方法（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、（１９９１） ｉｂｉｄ．，３０４ 米国特許第６，０５７，２９２号；５５８ Ｌｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（４４），ｐｐ．１３２８８−１３３０１（２００１）；Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００３カタログ）の修飾法を用いて行った。活性化されたＰＥＧは、線状ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ＭＷ ５ｋＤａまたはＭＷ ２０ ｋＤａ）、および分岐状ＰＥＧヒドロスクシンイミド（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、ＭＷ １０ｋＤａまたはＭＷ ４０ｋＤａ）双方を含み、これらは、共に、メトキシ基で一端がキャップされ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから取得可能であり；最適なＰＥＧ化蛋白質の実験的決定が通常は必要とされる（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１２：１９６−２０７（１９９７））。最適なＰＥＧ化条件は、異なる比率のＰＡＬ：ＰＥＧ（蛋白質モノマー当たりのリシンの数と共に蛋白質のモル比を考慮）、異なるｐＨ、異なる緩衝液、種々の温度およびインキュベーション時間を用いて決定した。高いＰＡＬ蛋白質：ＰＥＧ誘導体化比率が必要である。というのは、天然ＰＡＬは非常に多数のリシン（モノマー当たり２９）を有するからであり、また、修飾されていないＰＡＬは反復されたマウスにおける注射に際して免疫反応性を呈するからであり、かつ裸の（野生型）ＰＡＬはプロテアーゼへの暴露に際して迅速に不活化されるからである。ＰＥＧ化反応は−２０℃での凍結によって停止させ、試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロスコピー、活性評価、蛋白質分解感度、および免疫反応性によって分析した。
活性、蛋白質分解、および免疫評価に先立って、かつ過剰の未反応のＰＥＧを除去するために、Ｔｕｂｅ−Ｏ−Ｄｉａｌｙｚｅｒｓ（Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて攪拌しつつ、ｐＨ８．５、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液に対して、反応を４℃にて一晩透析した。ＮＩ蛋白質アッセイキット（Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて蛋白質濃度を測定した後、前記したように、標準反応条件を用い、誘導体化されていないおよびＰＥＧ誘導体化ＰＡＬ試料に対してＰＡＬ活性測定を行った。イン・ビトロ特徴付けに続いて、ＰＫＵマウスモデルを用い、イン・ビボトライアルを、最も有望なＰＥＧ化治療剤候補で行った。
（特徴付け）
蛋白質濃度は、非−修飾蛋白質試料につき、２８０ｎｍで、ＰＡＬ消光係数（０．５ｍｇ ｍＬ−１ｃｍ−１）を用いて決定し、ＰＥＧ化蛋白質試料については、濃度は、正確な蛋白質濃度決定に緩衝するであろう非−蛋白質汚染物を除去するための試料処理を含むＮＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて濃度を計算する。
ＰＥＧ−ＰＡＬ産物をＭＡＬＤＩ−ＴＤＦ ＭＳで特徴付けて、各ＰＡＬモノマーに付着されたＰＥＧ分子の数を決定し、並びに、活性評価およびＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび天然ゲル分析を用いて特徴付けて、各々、活性の保持、完全な誘導体化、およびテトラマーのＰＡＬ形成の喪失無しを保証した。ＰＡＬおよびＰＥＧ−ＰＡＬ試料については、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロスコピー分析は、サブユニットの解離および種検出の再現性を改良するためには、０．５Ｍ尿素または０．０２５Ｍグアニジン−ＨＣｌの使用を必要とする。
（活性）
キネティックスモードにて、Ｃａｒｙ ＵＶ分光光度計（Ｃａｒｙ ５０）を用い、ＰＡＬ活性アッセイを行った。Ｌ−フェニルアラニン基質とでのＰＡＬの活性は、２９０ｎｍにおける吸光度の増加によってモニターしたトランス−桂皮酸の生産を測定することによって室温（２５℃）で検定した（Ｈｏｄｇｉｎｓ，Ｄ．Ｓ．，”Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃａｒｂｏｎｙｌ ｇｒｏｕｐ ａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３２，ｐｐ．２４６−２５３（１９６８））。２９０ｎｍにおけるトランス−桂皮酸のモル消光係数は１０．２３８１リットルＭ−１ｃｍ−１である。反応混合物は、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５中に２２．５ｍＭフェニルアラニンを含有した。標準測定では、最終酵素濃度は０．００３５ｍｇ／ｍＬであり、キネティック実験では、アッセイにおける酵素濃度は、一分当たりの２９０ｎｍにおける勾配が０．００５ないし０．０２の範囲にあるように調整した。活性データは、比活性（μモル×分−１ｍｇ−１）として表す。ＰＡＬの１ユニットは、室温において１分当たりに１μモルのトランス−桂皮酸を生じる酵素の量と定義される。
Figure 2008513027
 （イン・ビボ半減期および免疫原性のテスト）
生化学的特徴付けの後、最も有望なＰＥＧ−ＰＡＬ候補を、３つの異なる補充的技術（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、および免疫沈降（ＩＰ））を用い、天然ＰＡＬ（非−ＰＥＧ化）で注射したＰＫＵマウスによって生起された抗体に対する免疫反応性につきスクリーニングした。
ウエスタンブロット分析では、（天然ＰＡＬで注射したマウスからの）ＰＡＬ抗−血清を希釈１：１０，０００で用いた。陰性対照として、緩衝液処理−マウスからの血清も同一希釈で用いた。二次抗体、アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１：５，０００に希釈し、ＡＰ基質ウエスタンブルー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発色させた。ＥＬＩＳＡテストは、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬのＰＡＬを用いる標準的な手法、およびＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２％ＢＳＡでのブロッキングに従い、Ｎｕｎｃ／Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて行った。（天然ＰＡＬ暴露マウスからの）マウス抗血清を、ＥＢブロック溶液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２％ＢＳＡ）中に１：１０，０００希釈し、ＨＲＰ−ヤギ抗−マウスＩｇＧを、４５０ｎｍにおける検出で用いるＴＭＢと共に二次抗体として用いた。
免疫沈降を用いて、ＰＡＬ抗体結合についてテストした。蛋白質試料（ＰＡＬまたはＰＥＧ化ＰＡＬ）をＴＴＢＳ緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎを含むトリス緩衝化生理食塩水）中でインキュベートし、抗体試料を加える前にＰＡＬ活性を測定した。各試料は、８倍過剰の陽性対照抗−ＰＡＬ血清、および非−免疫マウス血清を用いる二連陰性対照反応と共にインキュベートした。インキュベーションの後、ビーズのマウスＩｇＧ結合能力を考慮して、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４（５０％、ｖ／ｖ）を過剰に加え、試料を回転しつつ４℃にて一晩再度インキュベートした。
上清を遠心によって回収し、各試料のＰＡＬ活性を上清でアッセイした。ビーズペレットは捨てず、従って、ウエスタンブロットによるさらなる分析を行うことができる。抗体−ビーズ結合が起こったことを確認するために、ウエスタンブロットを用いてビーズ上のＰＡＬ抗原を検出した。ＰＡＬ結合工程後の遠心によって回収されたビーズをＴＴＢＳおよびＴＢＳ緩衝液で数回洗浄した。これらの濯ぎに続き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液をビーズに加え、試料を９５℃にて５分間加熱した。次いで、試料を、ＰＡＬ抗−血清を用いてウエスタンブロットによって分析した。貧弱な抗体結合を示す酵素改変体は、ウエスタンブロットによって検出されるように、ペレット化されたビーズ画分において対応するＰＡＬをほとんど有さず、高い抗体結合を呈する天然未修飾ＰＡＬと比較して上清に残存するより高い活性を示す。
イン・ビトロ実験に基づく有望なＰＡＬ改変体は、１：３２線状５ｋＤａ ＰＥＧ、１：３２分岐状１０ｋＤａ ＰＥＧ、１：８線状２０ｋＤａ ＰＥＧ、および１：１６線状２０ｋＤａ ＰＥＧを用いるＰＥＧ化試料を含む。
（プロテアーゼ感度のテスト）
活性を保持する前記した蛋白質エンジニアリング方法、チロシン／キモトリプシンプロテアーゼカクテルとのインキュベーションを用いるプロテアーゼ耐性についてのスクリーニング、続いての、（ＯＤ２９０測定を介する）活性の保持および（ＰＡＧＥゲル分析を介する）低下した蛋白質切断についてのモニタリングを介して得られた改良されたＰＡＬ（およびＰＥＧ−ＰＡＬ）突然変異体は、イン・ビボテストで用いられる適当なイン・ビトロ特性を持つ突然変異体の同定を可能とした。
蛋白質分解安定性は、腸環境に近似したプロテアーゼカクテルとのインキュベーションを用いて評価し、２．３ｍＭトリプシン、３．５ｍＭキモトリプシン、３．０５ｍＭカルボキシペプチダーゼＡ、および３．６５ｍＭカルボキシペプチダーゼＢを含有する。蛋白質分解テストは、酵素インキュベーション、プロテアーゼをＰＡＬ溶液に加えて、活性保持の時間コース、およびプロテアーゼ暴露後の安定性保持を含めた、調べるべき異なる蛋白質改変体（ＰＥＧ化または他の化学的修飾を含むまたは含まない天然または突然変異体蛋白質）につきプロテアーゼ感度の程度を測定することを含んだ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーマッピング実験を用いて、いずれのプロテアーゼ感受性部位の位置も決定した（Ｋｒｉｗａｃｋｉら、（ｈｔｔｐ：／／ａｂｒｆ．ｏｒｇ／ＪＢＴ／１９９８／Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ９８；ｓｅｐ９８ｍ ｒ．ｈｔｍｌ）（１９９８０）。これらのマッピング結果は、全ての主要な感受性部位を、ＰＥＧ化保護および／または突然変異を用いて除去して、ＰＡＬ人工物からの感受性領域を除去し、および／または保護することができるように、（既に同定された２つの一次部位のような）プロテアーゼ感受性の一次部位を決定するのに重要である。
（実施例１２）
分岐状および線状ＰＥＧ−ｒＰＡＬおよび裸のｒＰＡＬの、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の種々の処方、および対照緩衝液、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を表１０に示すように注射用に処方した。
Figure 2008513027
 （血漿Ｐｈｅ測定）
動物から尾静脈を介して採血して、（ほぼ１００μＬ）血液、１、８および２２日に、投与から０時間、６０、３６０および７２０分、２４、４８および７２時間後に、Ｐｈｅ測定用の血漿を収集した。血漿を血液試料から単離し、凍結し、分析（Ｐｈｅ濃度の測定）までドライアイス上に移した。データを図１１に示し、そこでは、群１は分岐状１０ＫＤａ １：１６試料に対応し、群２は分岐状１０ＫＤａ １：２４に対応し、群３は分岐状１０ＫＤａ １：３２試料に対応し、群４は線状２０ＫＤａ １：８に対応し、群５は野生型ＰＡＬ蛋白質非−修飾に対応し、群６は対照緩衝液に対応する。この図面中で分かるように、線状２０ＫＤａ １：８の群は、テストした処方の全ての血中Ｐｈｅレベルの最も顕著かつより長い維持された降下を生じる。
（抗−ＰＥＧ−ｒＰＡＬ／ｒＰＡＬ抗体分析）
動物から尾静脈を介して採血して（ほぼ１００μＬ血液）、７、２１および３６実験日に、投与から１日先立って、ＰＥＧ−ｒＰＡＬ／ｒＰＡＬ抗体測定用の血清を収集した。収集は、適用可能な日に用量投与に先立って行った。
これらの調製物の免疫イン・ビボ効果を図１２に示す。結果は、線状２０ＫＤａ１：８ ＰＡＬＰＥＧ分子が野生型ＰＡＬと比較して保護を付与することを示す。
ＰＡＬＰＥＧのこの調製が生じるより低い抗−ＰＡＬ抗体生産と共に低下したＰｈｅレベルの組み合わせた効果は、線状ＰＥＧ２０ＫＤａが、比率１：８ ＰＡＬ：ＰＥＧを用いてＰＫＵ酵素置換療法で用いられるのに最も有望な処方とする。
（実施例１３）
一連のＰＥＧ−ｒＰＡＬ誘導体を構築して、血漿Ｐｈｅの低下、およびｒＰＡＬに対する免疫応答の減衰に対する、ｒＰＡＬに対するＰＥＧの割合の変化の効果を測定した。１：４、１：８および１：１６の比率（ｒＰＡＬ：ＰＥＧ）で、線状２０ｋＤａ ＰＥＧおよびｒＰＡＬよりなるコンジュゲートを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中に処方した。該処方をＥＮＵ−２マウスに皮下注射した。コンジュゲートしていないｒＰＡＬおよび緩衝液単独を対照として用いた（表１１参照）。
Figure 2008513027
 （血漿Ｐｈｅ測定）
動物から尾静脈を介して採血して（ほぼ１００μＬ血液）、１、８および２２日に、投与から０時間、６０、３６０および７２０分、２４、４８および７２時間後に、Ｐｈｅ測定のために血漿を収集した。血漿を血液試料から単離し、凍結し、分析（Ｐｈｅ濃度の測定）までドライアイスに移した。これらのデータは、図１３に示すように、各時点において、１：１６ ｒＰＡＬ：ＰＥＧ比率（群３）が、他の誘導体よりも経時的に血漿中Ｐｈｅのより大きな低下を生じる傾向があったことを示す。
（抗−ＰＥＧ−ｒＰＡＬ／ｒＰＡＬ抗体分析）
動物から尾静脈を介して採血して（ほぼ１００μＬ血液）、７、２１および４３実験日に、投与から１日先立って、抗−ｒＰＡＬ抗体測定用の血清を収集した。血清収集は、適用可能な日に用量投与に先立って行った。テストした全ての比率におけるｒＰＡＬへのＰＥＧのコンジュゲーションは、抗−ｒＰＡＬ血清抗体力価を低下させた。ｒＰＡＬに対する免疫応答を低下させるこれらの誘導体の能力は、より大きな量のコンジュゲートしたＰＥＧで増加する傾向があった（図１４）。１：１６ ｒＰＡＬ：ＰＥＧ比率において、Ａｂ力価は天然ｒＰＡＬに対して１００倍減少した。
（実施例１４）
結晶中Ｐｈｅの低下、およびｒＰＡＬに対する免疫応答の減衰に対する、１：８ ｒＰＡＬ：ＰＥＧコンジュゲートの用量の増加の効果を決定するために、１：８ ＰＥＧ−ｒＰＡＬを３つの異なる用量−０．２、０．６、１．２５ＩＵにおいてＥＮＵ−２マウスに皮下送達した。各用量は、天然ｒＰＡＬ処理に加えて、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中に処方した。緩衝液単独もまた陰性対照として注射した（表１２参照）。
Figure 2008513027
 （血漿中Ｐｈｅ測定）
動物から尾静脈を介して採血して（ほぼ１００μＬ血液）、１、８および２２日に、投与から０時間、６０、３６０および７２０分、２４、４８および７２時間後に、Ｐｈｅ測定用の血漿を収集した。血漿を単離し、凍結し、分析（Ｐｈｅ濃度の測定）までドライアイスに移した。これらのデータは、図１５に示すように、各時点において、最高用量のｒＰＡＬが血漿中Ｐｈｅにおける最大低下を生じる傾向があったことを示す。最高用量におけるコンジュゲーテッド分子は、同一用量のコンジュゲートしていない分子と比較して、血漿中Ｐｈｅのより長い低下を生じた。
（抗−ＰＥＧ−ｒＰＡＬ／ｒＰＡＬ抗体分析）
動物から尾静脈を介して採血して（ほぼ１００μＬ血液）、７、２１および４３の実験日に、投与に１日先立って抗−ｒＰＡＬ抗体測定用の血清を収集した。収集は、適用可能な日に用量投与に先立って行った。テストした全ての用量におけるｒＰＡＬへのＰＥＧのコンジュゲーションは、天然ｒＰＡＬのそれに対してほぼ１０倍、抗−ｒＰＡＬ血清抗体力価を低下させた。コンジュゲートしたｒＰＡＬの３つの用量の間で抗体力価に有意な差はなかった（図１６）。
（実施例１５）
（抗体エピトープマッピング）
抗体抗−ＰＡＬによって認識される主要結合部位は、ＰＡＬの抗原ペプチドライブラリ（ペプチドスキャンフォーマット１３／１１）をスキャンすることによって測定した（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ−ＩＤ：ＰＡＬＹ ＲＨＯＴＯ；７１６アミノ酸残基；３５３ペプチドをもたらす）。合成された抗原ペプチドに含まれるシステイン残基の全ては、セリンによって置き換え、全てのＮ−末端はアセチル化した。
（材料および方法）
材料は、一次抗体抗−ＰＡＬ（フォーマットマウスＩｇＧ１、１０μｇ／ｍＬ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された二次抗体抗−マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ａ５９０６、１．０μｇ／ｍＬ）よりなるものであった。
抗原ペプチドは、段階的にセルロース膜上で合成し、規定された配列（ペプチドアレイ）をもたらし、セルロース膜に共有結合される。結合アッセイはペプチドアレイ上で直接的に行った。ペプチドアレイをブロッキング緩衝液中の一次（抗原ペプチド結合）抗体と共にインキュベートし、次いで、該一次抗体に選択的に結合しホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識二次抗体と共にインキュベートした。抗原ペプチドアレイを、数時間、ブロッキング緩衝液と共にインキュベートして、抗体の非−特異的結合を低下させた。別法として、ブロッキング緩衝液中のＨＲＰ−標識一次抗体を用いることができる。二次抗体またはＨＲＰ−標識一次抗体との抗原ペプチドアレイのインキュベーション、続いての、最初のケミルミネセンス実験直後の、短いＴ（Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ−緩衝液洗浄）を作成して、いずれの抗原ペプチドが一次抗体に結合するかの初期概観を得た。いくつかの緩衝液洗浄工程に続いて（Ｔ−ＴＢＳ−およびＴＢＳ−緩衝液）、偽−陽性結合を低下させた（セルロース膜それ自体に対する非特異的抗体結合）。これらの洗浄工程の後、最終ケミルミネセンス分析を行う。データを、各ペプチドについて単一測定としてのシグナル強度（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｌｉｇｈｔユニット、ＢＬＵ）を示すイメージングシステムで分析した。二次抗体の非−特異的結合を評価するために、インキュベーションは、対照インキュベーションとして一次抗体の不存在下で行わなければならない。この場合、二次抗体は対照実験で結合を示さなかった。
（結果）
抗体抗−ＰＡＬは３つの主な結合部位：アミノ酸残基１４７ないし１５７に対応するペプチド番号７３ないし７４、アミノ酸残基３０７ないし３１７に対応するペプチド番号１５３ないし１５４、およびアミノ酸残基５９７ないし６０１に対応するペプチド番号２９５ないし２９９を認識した（図１７参照）。最も強いシグナルおよび対応するペプチド配列を以下にリストする。重複するアミノ酸残基を、以下にリストする対応するアミノ酸残基と共に太字でマークする；ペプチドの各群：
Figure 2008513027
 アミノ酸残基５９７〜６０１
まとめると、該抗体は、主要ペプチド番号７４、３０７および２９６を持つ３つの免疫優性領域を認識した。
（実施例１６）
（イン・シリコ免疫原性領域の同定）
ＰＡＬの総じての免疫原性能力を評価し、有意な潜在的免疫原性を持つＰＡＬの配列を含有する領域（長さが１５ないし２５アミノ酸）を同定した。
（材料および方法）
材料は、ＰＡＬの完全なアミノ酸配列（Ｐ１１５４４、ＢＩＯＭＡＲＩＮＴＭ）およびＥｐｉＭａｔｒｉｘＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥｐｉＶａｘ）を含んだ。
ＰＡＬの完全なアミノ酸配列を９−量体分析フレームに区分し、ここに、各フレームは少なくとも８アミノ酸重複した。各９−量体フレームを、８つのパネル、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、およびＤＲＢ１＊１５０１を含めたＤＲＢ１＊０４０１共通クラスＩＩ ＨＬＡに対する潜在的免疫原性につき評価した。分析フレームの各々を、ＧｅｎｅＢａｎｋにおける蛋白質データベースに対してブラストし、全ての有意な相同性をリストする報告を作成した。分析フレームの各々を、公知のエピトープおよびＭＨＣリガンドのＥｐｉＶａｘ所有データベースに対してブラストし、同定された全ての有意な相同性をリストする報告を作成した。分析の結果に基づき、ＰＡＬの総じての免疫原性能力、および免疫原性に対する有意な能力を持つＰＡＬの配列内に含まれる領域（長さが１５ないし２０アミノ酸）を評価した。
（結果）
ＰＡＬ蛋白質は固有に免疫原性ではないが、蛋白質の大きな潜在的免疫原性を、アルブミンのような他の安全な非−免疫原性蛋白質、または免疫グロブリンの定常領域と同一レベルまで低下させるように修飾することができるより高い免疫原性能力のいくつかの領域を含有する。
（総じての免疫原性評価）
８つの共通クラスＩＩ対立遺伝子のパネルに対する７１６アミノ酸長配列内の７０８ ９−量体クレームの分析に際して試料の約５％を表す同定された３０３の潜在的エピトープがあった。潜在的エピトープの数およびＰＡＬ ｐ［蛋白質］の長さを考慮し、総じての免疫原性スコアを平均した。しかしながら、免疫原性の危険性を評価すると、総じての能力のみならず領域的能力を考慮することが重要である。潜在的Ｔ細胞エピトープは蛋白質配列全体にランダムに分布しないが、その代わり、一緒に群をなす傾向があり、「Ｔ細胞エピトープクラスター」または丁度「クラスター」という。クラスターは長さが９ないし２５アミノ酸の範囲であり、複数対立遺伝子に対する、および複数フレームを横切ってのそれらの親和性を考慮すると、４ないし４０の結合モチーフを含有することができる。かくして、総じての平均免疫原性能力を持つ蛋白質は、１以上のクラスター群のため増強された免疫原性を有し得る。
ＰＡＬ蛋白質を潜在的Ｔ細胞エピトープのクラスターにつきスキャンすると、９つは、１１８、または３０３の存在的エピトープの３９％を含有する免疫原性に対する有意な能力を持ってクラスターを形成する。免疫原性に対して優位性が小さな能力を持つ別の８つのクラスターは、５１の潜在的エピトープまたは全体の１７％を含有した。１７のクラスターは、ＰＡＬを脱免疫化するための標的と考えられるであろう。１７の標的領域内で、詳細な分析を行って、複数の対立遺伝子および複数のフレームを考慮した場合、結合親和性に対して最大の凝集寄与を成す個々のアミノ酸を強調した。そのような感受性アミノ酸は、蛋白質を脱免疫化した場合に修飾の標的と考えられるであろう。
図１８は、ＰＡＬ−Ｐ１１４５蛋白質のＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスター分析を示す。顕著には、クラスタースコアは、実施例１５に記載された抗体エピトープマッピングによって同定されたアミノ酸残基１４７ないし１５７、３０７ないし３１７および５９７ないし６０１の範囲内で高い。
ＰＡＬ蛋白質に含有された９−量体フレームを公知のＭＨＣリガンドおよびＴ細胞エピトープのデータベースに対してスクリーニングすると、有意な相同性は見出されなかった。ヒト配列に対して相同なペプチド配列は、望まない自己免疫反応をもたらす免疫耐性を破る増大した危険性があり得る。かくして、ＰＡＬ配列において同定されたクラスター形成領域に含有された９−量体フレームを、Ｇｅｎｅｂａｎｋ中のヒト配列蛋白質データベースに対してブラストした。同定された数個のみの有意な相同性があったに過ぎなかった。
ＰＡＬ蛋白質の９−量体フレームが、ヒトペプチドに対して９つのマッチのうち８つであり、潜在的エピトープでもあった３つの例があった。ペプチドＶＹＧＩＴＴＧＦＧ（配列番号９５）を持つフレーム１０９は、ヒトペプチドＶＹＧＶＴＴＧＦＧ（配列番号９６）に対して９つのうち８つにマッチし、対立遺伝子ＤＲＢ１＊１１０１およびＤＲＢ１＊１５０１に対して「ヒット」であった。ペプチドＶＬＳＳＴＳＬＳＬ（配列番号９７）を持つフレーム６１１は、ヒトペプチドＶＬＳＳＴＳＬＲＬ（配列番号９８）に対して９つのうち８つマッチし、対立遺伝子ＤＲＢ１＊０７０１およびＤＲＢ１＊１５０１で「ヒット」であった。ペプチドＡＬＳＹＬＳＰＲＴ（配列番号９９）を持つフレームは、ヒトペプチドＡＬＳＹＬＫＰＲＴ（配列番号１００）に対して９つのうち８つがマッチし、対立遺伝子ＤＲＢ１＊１５０１で「ヒット」であった。完全なマッチは同定されなかった。ＰＡＬ蛋白質の配列およびヒトゲノムの間で見出された限定された相同性は、ヒト治療剤としてのＰＡＬ蛋白質のさらなる開発に対する有意な障害を表さない。
高いスコアリングクラスターの有意な数を除いてそのサイズのＰＡＬ蛋白質に対する予測される免疫原性の平均量に基づき、クリニックに進める前に蛋白質をマウスでテストした。もしＰＡＬがトランスジェニックマウスにおいてＴ−細胞活性および抗体形成を誘導すれば、クリニックへの登録に先立って蛋白質を脱免疫化する。
（実施例１７）
（フェニラーゼの生産に対する新しいＰＥＧ化技術（ＰＥＧ−ＰＡＬ））
ＰＥＧ−ＰＡＬの生産のための現在のＰＥＧ化プロセスは、１．５ｍｇ／ｍｌ酵素濃度における２０ｋＤａ線状ＰＥＧ ＳＰＡ（ＰＥＧ−プロパン酸−ＮＨＳ）、およびモラーリシン濃度に（Ｚ−因子と呼ばれる）比率を掛けたものと同等な量のＰＥＧの間の反応を含む。１：８のＺ−因子では、最終ＰＥＧ濃度は９３．５ｍｇ／ｍｌであり、他方、酵素濃度は１．５ｍｇ／ｍｌである。１：１６のＺ−因子では、ＰＥＧの最終濃度は１８７ｍｇ／ｍｌであり、他方、酵素濃度は１．５ｍｇ／ｍｌ酵素に留まる。
１：８および１：１６の比較的高いＺ−因子は経済的に有効であると考えられてこなかった。加えて、２０ｋＤａ線状ＰＥＧ ＳＰＡ（ＰＥＧ−プロパン酸−ＮＨＳ）を用いる１：８のＺ−因子は、マウスで観察された免疫応答に対するＰＥＧ−ＰＡＬ分子に対して十分な保護を与えなかった。事実、ＰＥＧ−ＰＡＬの第３の注射によって、ＰＥＧ−ＰＡＬ力価に特異的な抗体は対照と比較して１０４よりも大きい。改良されたＰＥＧ化プロトコルは、最終薬物物質の経済的有効性を改良し、およびその効率を改良する双方のために必須であると考えられた。
ＰＥＧ化プロセス改良のための理由付けは以下のようである。水性溶液中での２０ｋＤａ線状ＰＥＧ ＳＰＡ（ＰＥＧ−プロパン酸−ＮＨＳ）の半減期は比較的短く、ほぼ２０分である。活性のこの喪失は実質的に非生産的であり、加水分解反応と競合する。加水分解および有用なＰＥＧ化反応は共に、典型的な二分子反応としての試薬濃度に比例するようである：
（１）ＰＥＧ−ＮＨＳ＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ（未反応、「除去済」）、反応速度＝ｋ１［ＰＥＧ−ＮＨＳ］［Ｈ２Ｏ］
（２）ＰＥＧ−ＮＨＳ＋ＰＡＬリシン→ＰＥＧ−ＰＡＬ、反応速度＝ｋ２［ＰＥＧ−ＮＨＳ］［リシン］
反応（１）で消費された反応物質の割合を低下させるために、反応（２）における組成物、特に蛋白質（リシン）の濃度の増加が望まれる。従って、Ｚ−因子は、ＰＥＧ−ＮＨＳを一定（高い）に維持しつつ、蛋白質濃度を増大させることによって変化させるべきである。
図１９Ａは、元の反応条件を用い、２つの異なるＰＥＧ源（２０ｋＤａ線状ＰＥＧ ＳＰＡ（ＰＥＧ−プロパン酸−ＮＨＳ）および２０ｋＤａ線状ＭＥ−２００ＨＳ（ＰＥＧ−ヘキサン酸−ＮＨＳ））での種々のＺ−因子を用いてＰＥＧ化を行った実験を示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥによって観察された分子量は、Ｚ−因子に大いに依存した。図１９Ｂにおいて、Ｚ−因子は、蛋白質濃度を１．５から６．０ｍｇ／ｍｌまで増加させることによって改変した。この場合、見掛けの分子量はＺ−因子に依存してより小さく、全ての場合において一般には高かった。
（手法）
最終ＰＥＧ濃度は８ｍＭ（１６０ｍｇ／ｍｌ）に設定した。なぜならば、より高い濃度は過剰に粘性であって、取り扱い、溶解させるのが困難だったからである。従って、１．３のＺ−因子では、最終リシン濃度は２．６７ｍＭであり、これは、３０リシン／モノマーでのＰＡＬ分子について６．８５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を与えた。ＰＥＧ化手法は以下の通りであった：
１）蛋白質（ＰＡＬ）を５０ないし７０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．５まで緩衝液交換した。
２）必要な乾燥ＰＥＧの量を５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．５に溶解させ、ボルテックスさせて、溶解させた。この工程は迅速に行った。
３）蛋白質溶液をＰＥＧ溶液と直ちに混合して、最終濃度のＰＥＧおよびＰＡＬを作成し、数回温和に倒立させた。
４）該物質を非常に温和に揺らせつつ、室温にて３時間放置した。
５）ＰＥＧ−ＰＡＬは処方する準備ができた。
（結果）
新しいＰＥＧ化手法を用いて、１：３のＺ−因子にてＰＥＧ−ＰＡＬを作成し、免疫原性についてのイン・ビボマウスモデルでテストした。用いたＰＡＬは突然変異していない野生型形態であった。表１３はＰＥＧ化結果を示す。
Figure 2008513027
 図２０は、これらの物質（ならびに他の物質）のＳＤＳ ＰＡＧＥ移動を示す。レーン３および５は、関連するＰＥＧ−ＰＡＬ形態を示す。
マウス実験は、新しいＰＥＧ化方法の結果、元のＰＥＧ化方法のそれよりもかなり免疫原性が低いＰＥＧ−ＰＡＬがもたらされたことを示した。
より低いＺ−因子での新しいＰＥＧ化手法を用い、および別のＰＥＧ供給業者（２０ｋＤａ線状ＭＥ−２００ＨＳ（ＰＥＧ−ヘキサン酸−ＮＨＳ）を用い、続いての実験を行った。特徴づけ結果を表１４に示す。新しいＰＥＧ化プロトコルを「ＨＣ」（高濃度）ということに注意すること。用いるＰＡＬの形態はＲ９１Ｋ突然変異体であった。
Figure 2008513027
 １：１「ＨＣ」物質では、ＰＥＧ濃度は８ｍＭ（１６０ｍｇ／ｍｌ）であり、モラーリシン濃度は８ｍＭ（２０．５ｍｇ／ｍｌ ＰＡＬ）であった。１：２「ＭＣ」物質では、ＰＥＧ濃度は８ｍＭであり、モラーリシン濃度は４ｍＭ（１０．３ｍｇ／ｍｌのＰＡＬ）であった。１：３物質は先の実験に記載したように作成した。
前記物質のＳＤＳ ＰＡＧＥ結果を図２１に示す。新しいＰＥＧ化プロトコルはテストした全てのＺ−因子においてより高い分子量を与え、これは、テストした全ての新しい（「ＨＣ」）試料においてより高い程度のＰＥＧ化を示唆する。
表１５はＰＥＧ化手法からの回収を示す。
Figure 2008513027
 （実施例１８）
（ＰＡＬ組成物での臨床的評価）
以下の実施例は、本発明の治療方法における、ＰＡＬまたはその生物学的に活性な改変体、突然変異体、および断片（「ＰＡＬ」）を含む組成物の臨床的評価で用いられるパラメーターについてのガイダンスを提供する。本明細書中全体で議論したように、ＰＡＬは、ＨＰＡ、軽度のフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）および古典的ＰＫＵを含めたＨＰＡの治療で用いられるであろう。臨床試験が行われ、それは、代替物および規定された臨床的終点双方の安全性、薬物動態、および最初の応答についてのＰＡＬの経口または皮下用量の評価を供するであろう。試験は最小限、必ずしも限定されるものではないが、２４週間行って、１００人の評価可能な患者について十分な安全性情報を集める。試験についての初期用量は約０．００１ないし約１．０ｍｇ／ｋｇ／週変化させるであろう。この用量が患者において過剰な血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの低下を生じさせなければ、あるいは血漿Ｐｈｅレベルの増大なくして日経口Ｐｈｅ摂取を増大させる能力として測定された有意な直接的臨床的利点を生じさせない場合には、該用量は必要に応じて増大させるべきであり、２４週間のさらなる最小期間（必ずしも限定されない）維持して、安全性を確立し、およびさらなる効率を評価すべきである。
安全性の測定は有害事象、アレルギー反応、完全な臨床化学パネル（腎臓および肝臓の機能）、尿分析、および差を伴ってのＣＢＣを含むであろう。加えて、血中Ｐｈｅレベルのレベル低下、神経精神病学的および認識テスト、および全体的評価を含めた他のパラメーターもモニターされるであろう。本実施例では、循環系における薬物のファルマコキネティックパラメーター、および血液中でのＰＡＬの一般的分布および半減期の測定も考えられる。これらの尺度は、用量を臨床的応答に関係させるのを助けるであろうと予測される。
（方法）
血漿中Ｐｈｅの上昇したレベルを有する患者はベースライン、医学的履歴、および身体検査、神経精神学的および認識テスト、臨床実験室的テストの標準的な組（ＣＢＣ、パネル２０、ＣＨ５０、ＵＡ）、尿プテリンのレベル、ジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）レベル、および血清アミノ酸の絶食血中（血漿）パネルを受けるであろう。患者は続いて毎週クリニックを訪問するであろう。処置期間が完了の後、患者は完全な評価のために１週間クリニックに戻るであろう。もし用量の上昇が必要であれば、患者は前記にて概説した同一スケジュールに従うであろう。試験を通じて安全性をモニターする。
（診断および包括／除外基準）
患者は、遺伝子テスト、および血液中の上昇したＰｈｅレベルの証拠によって確認されたＨＰＡまたは軽度のＰＫＵの書面での診断を持つ男性または女性であり得る。該実験は、食事制御に正確に従わないＨＰＡまたはＰＫＵ患者を含むであろう。小児を持つ可能性がある女性患者は、各投与に丁度先立って陰性妊娠テスト（尿β−ｈＣＧ）を受けなければならず、実験を通じて避妊の医学的に認められた方法を用いるようアドバイスされなければならない。もし患者が妊娠しているか、または授乳しており；実験記録に先立って３０日以内に調査薬物を受けた；または医療的疾患、重篤な介在性疾患、あるいは有意に実験コンプライアンスを減少させるであろう他の酌量すべき状況を有するならば、該患者はこの実験から排除されるであろう。
（食事介入）
初期ランダム化および２週間の処置期間に続き、全ての実験参加者は食事カウンセリングを受け、Ｐｈｅ−特異的医療食品を補足した標準Ｐｈｅ−制限食に合計４ないし６週間従うであろう。食事は家庭で管理され、食事摂取は毎日記録される。栄養素および医療的食品の摂取の分析、および推奨食事摂取（ＲＤＩ）のパーセントは処理群間で比較される。
（ＰＡＬ安全性）
もし有意な急性または慢性薬物反応が実験の間に起こらなければ、ＰＡＬ療法は安全であると判断される。薬物の長期間の投与は、もし有意な異常性が臨床的調査、臨床ラボ、または他の適当な実験で観察されなければ安全であると判断されるであろう。
本明細書中で引用した全ての印刷された特許および刊行物は、ここに引用して、その全体が援用される。
本発明の好ましい実施形態を説明し、記載してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変形をなすことができるのは認識されるであろう。
（表１６ Ｇａｍｅｚら ＴＳＲＩ）
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図１は、ＰＡＬテトラマーの１．６ÅＸ線結晶学的に決定された構造の模式図である。 図２は、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ（配列番号４）、Ｐ．ｐ ＨＡＬ（配列番号２）、Ｐ．ｃ ＨＡＬ（配列番号５）およびヒトＨＡＬ（配列番号３）についての配列の整列である。 図３は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＤＮＡＳｔａｒプログラム（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ、図３Ａ）またはＰｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎプログラム（ＢｉｏＮｅｘｕｓ、図３Ｂ）におけるＰｒｏｔｅａｎ蛋白質構造注釈モジュールを用いる計算された免疫原性を持つ表面領域の位置を示す（緑色）ＰＡＬモノマーの構造の模式図を供する。 図４は、野生型ＰＡＬに対するＰＡＬ突然変異体の活性を示すグラフである（活性はμｍｏｌ／分×ｍｇで表す）。 図５は、Ｘ線結晶学によって決定されたＰＡＬの三次元構造で見出される二次構造エレメントへのそれらの帰属を含めた、野生型Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬの推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。 図６は、ヒトＨＡＬモノマーのモデル化された構造である。 図７Ａおよび７Ｂは、野生型ＰＡＬに対するＰＥＧ化ＰＡＬ突然変異体の活性を示すグラフである（活性はμモル／分×ｍｇで表す）。 図８は、５ｋＤａおよび２０ｋＤａ直鎖上および１０ｋＤａおよび４０ｋＤａ分岐上ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび天然ゲル分析を示す。 図９は、種々のＰＥＧ化ＰＡＬコンジュゲート ｖｓ 未修飾ＰＡＬのイン・ビボ活性データを示すグラフである。ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートは 徐々に高くなる置換度にて、５ｋＤａ直鎖状、１０ｋＤａ分岐状、または２０ｋＤａ直鎖状、ＰＥＧが結合した状態で調べた。血漿Ｌ−Ｐｈｅ濃度は投与後の時間に対してプロットする。図９Ａ試料は：群１ 直鎖状１：８ ５ｋＤａ；群２ 直鎖状１：２４ ５ｋＤａ；群３ 直鎖状１：３２ ５Ｄａ；群４ ｗｔ ＰＡＬ；群５緩衝液対照である。図９Ｂ試料は：群１ 分岐状１：８ １０ｋＤａ；群２ 分岐状１：２４ １０ｋＤａ；群３ 分岐状１：３２ １０ｋＤａ；群４ 直鎖状１：３２ ５ｋＤａ；群５ ｗｔ ＰＡＬ；群６緩衝液対照である。図９Ｃ試料は：群１ 分岐状１：１６ １０ｋＤａ；群２ 分岐状１：２４ １０ｋＤａ；群３ 分岐状１：３２ １０ｋＤａ；群４ 直鎖状 １：８ ２０ｋＤａ；群５ ｗｔ ＰＡＬ；群６ 緩衝液対照である。 図９は、種々のＰＥＧ化ＰＡＬコンジュゲート ｖｓ 未修飾ＰＡＬのイン・ビボ活性データを示すグラフである。ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートは 徐々に高くなる置換度にて、５ｋＤａ直鎖状、１０ｋＤａ分岐状、または２０ｋＤａ直鎖状、ＰＥＧが結合した状態で調べた。血漿Ｌ−Ｐｈｅ濃度は投与後の時間に対してプロットする。図９Ａ試料は：群１ 直鎖状１：８ ５ｋＤａ；群２ 直鎖状１：２４ ５ｋＤａ；群３ 直鎖状１：３２ ５Ｄａ；群４ ｗｔ ＰＡＬ；群５緩衝液対照である。図９Ｂ試料は：群１ 分岐状１：８ １０ｋＤａ；群２ 分岐状１：２４ １０ｋＤａ；群３ 分岐状１：３２ １０ｋＤａ；群４ 直鎖状１：３２ ５ｋＤａ；群５ ｗｔ ＰＡＬ；群６緩衝液対照である。図９Ｃ試料は：群１ 分岐状１：１６ １０ｋＤａ；群２ 分岐状１：２４ １０ｋＤａ；群３ 分岐状１：３２ １０ｋＤａ；群４ 直鎖状 １：８ ２０ｋＤａ；群５ ｗｔ ＰＡＬ；群６ 緩衝液対照である。 図１０は、８４０時間までの１ユニットのＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲートの単一皮下ボーラス注射後のマウスの抗体応答を示すグラフである：（◆）、１：１６ 分岐状１０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲート；（■）、１：２４ 分岐状１０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲート；（▲）、１：３２ 分岐状１０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲート；および（●）、１：８ 直鎖状２０ｋＤａ ＰＥＧ：ＰＡＬコンジュゲート ｖｓ 未修飾ＰＡＬ（○）。（マイクロリットル当たりの光学密度で表した）抗体力価を処理後の時間に対してプロットする。 図１１は、ＰｋｕマウスモデルにおいてテストしたＰＡＬＰＥＧ分子のＰｈｅレベルを示す。 図１２は、ＰＡＬ：ＰＥＧ（１０ｋＤａ 分岐状 ｖｓ ２０ｋＤａ直鎖状）を皮下注射したＥＮＵ２マウスにおける抗−ｒＰＡＬ抗体力価を示す。 図１３は、皮下注射に続いての、ＥＮＵ−２マウスにおける血漿Ｐｈｅレベルに対する、１：４、１：８および１：１６の比率の（ｒＰＡＬ：ＰＥＧ）の直鎖状２０ｋＤａ ＰＥＧおよびｒＰＡＬのコンジュゲートの効果を示す。 図１４は、皮下注射に続いての、ＥＮＵ２マウスにおける抗−ｒＰＡＬ血清抗体力価に対する、１：４、１：８および１：１６の比率の（ｒＰＡＬ：ＰＥＧ）の直鎖状２０ｋＤａ ＰＥＧおよびｒＰＡＬのコンジュゲートの効果を示す。 図１５は、皮下注射に続いての、ＥＮＵ−２マウスにおける血漿Ｐｈｅレベルに対する、１：８ ２０ｋＤａ直鎖状ｒＰＡＬ−ＰＥＧコンジュゲートの増大する用量の効果を示す。 図１６は、皮下注射に続いての、ＥＮＵ−２マウスにおける抗−ｒＰＡＬ血清抗体力価レベルに対する、１：８ ２０ｋＤａ直鎖状ｒＰＡＬ−ＰＥＧコンジュゲートの増大する用量の効果を示す。 図１７は、ペプチド番号７３ないし７４（ａａ残基１４７ないし１５７）、ペプチド番号１５３ないし１５４（ａａ残基３０７ないし３１７）およびペプチド番号２９５ないし２９９（ａａ残基５９７ないし６０１）にピークがある、抗体抗−ＰＡＬおよびＩｇＧ抗−マウス−ＨＲＰでのＰＡＬ抗原ペプチドアレイのケミルミネセンス実験の結果を示す。 図１８は、ＰＡＬ−Ｐ１１４５５についてのＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスター分析を示す。 図１９は、２つの異なるＰＥＧ源（２０ｋＤａ直鎖状ＳＰＡ（ＰＥＧ−プロパン酸−ＮＨＳ）および２０ｋＤａ直鎖状ＭＥＲ−２００ＨＳ（ＰＥＧ−ヘキサン酸ＮＨＳ））での種々のＺ−因子を用いて行ったＰＥＧ化を示す。 図２０は、関連するＰＥＧ−ＰＡＬ形態を含有するレーン３および５でのＳＤＳ ＰＡＧＥ移動を示す。 図２１は、ＰＥＧ−プロパン酸−ＮＨＳ（１：８）、およびＰＥＧ−ヘキサン酸−ＮＨＳ（１：４、１：８、１：１ ＨＣ、１：２ ＨＣ、および１：３ ＨＣ）についてのＳＤＳ ＰＡＧＥ結果を示す。

Claims (37)

  1. 単離されたＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼ結晶。
  2. 前記結晶が単位格子寸法ａ＝１０４．７Å、ｂ＝１５１．６Å、およびｃ＝１７９．９Åを有する、請求項１記載の結晶構造。
  3. 前記結晶が少なくとも３．０Å解像度にてＸ線を回折する（ｄｅｆｒａｃｔ）、請求項１記載の結晶構造。
  4. 前記結晶が少なくとも２．５Å解像度にてＸ線を回折する、請求項１記載の結晶構造。
  5. 前記結晶が少なくとも２．０Å解像度にてＸ線を回折する、請求項１記載の結晶構造。
  6. 前記結晶が少なくとも１．６Å解像度にてＸ線を回折する、請求項１記載の結晶構造。
  7. 野生型ＰＡＬと比較して低下した免疫原性を示す突然変異体ＰＡＬを含むフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）。
  8. アミノ酸７０ないし８８、１２５ないし１３８、２２６ないし２４３、３３７ないし３５６、３９６ないし４１３、５６９ないし５８９、５９７ないし６０１、および６１９ないし６３６からなる群より選択されるアミノ酸残基が別のアミノ酸によって置き換えられ、ここに、該置き換えは前記野生型ＰＡＬ上のエピトープを改変する、請求項７記載のＰＡＬ。
  9. 前記アミノ酸残基が部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、または点突然変異誘発によって置き換えられる、請求項８記載のＰＡＬ。
  10. 前記突然変異体ＰＡＬがＲ１２３Ｈ、Ｒ１２３Ａ、Ｒ１２３Ｑ、Ｙ１１０Ｈ、Ｙ１１０Ｈ、およびＹ１１０Ｌからなる群より選択される、請求項８記載のＰＡＬ。
  11. 前記突然変異体ＰＡＬがＲ９１Ｋ、Ｈ１３７Ｋ、Ｈ５９８Ｑ、およびＫ１３２Ｒからなる群より選択される、請求項８記載のＰＡＬ。
  12. さらにＰＥＧ化を含む、請求項８記載のＰＡＬ。
  13. 前記ＰＡＬが前記野生型ＰＡＬよりも高い活性を有する、請求項１２記載のＰＡＬ。
  14. 前記ＰＡＬが前記野生型ＰＡＬよりも少なくとも２０％高い活性を有する、請求項１３記載のＰＡＬ。
  15. アミノ酸７１ないし１７０、２３１ないし２７０、３３１ないし３７０、３９１ないし４３０、５１１ないし５５０、５７１ないし６５０、５９７ないし６０１、および６７１ないし７１０からなる群より選択されるアミノ酸残基が別のアミノ酸によって置き換えられ、ここに、該置き換えが前記野生型ＰＡＬ上のエピトープを改変する、請求項８記載のＰＡＬ。
  16. 前記アミノ酸残基が部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、または点突然変異誘発によって置き換えられる、請求項１５記載のＰＡＬ。
  17. さらにＰＥＧ化を含む、請求項１５記載のＰＡＬ。
  18. 前記ＰＡＬが前記野生型ＰＡＬよりも高い活性を有する、請求項１７記載のＰＡＬ。
  19. 前記ＰＡＬが前記野生型ＰＡＬよりも少なくとも２０％高い活性を有する、請求項１８記載のＰＡＬ。
  20. 修飾されたＰＡＬおよび医薬上許容される賦形剤を投与することを含むアミノ酸代謝疾患を治療するための組成物。
  21. 前記疾患がフェニルケトン尿症、過剰フェニルアラニン血症、チロシン血症、ヒスチジン血症、または癌である、請求項２０記載の組成物。
  22. 前記修飾されたＰＡＬが、前記野生型ＰＡＬと比較して低下した免疫原性を示す突然変異体ＰＡＬを含む、請求項２０記載の組成物。
  23. 前記突然変異体ＰＡＬが、別のアミノ酸によって置き換えられたアミノ酸７０ないし８８、２２６ないし２４３、３３７ないし３５６、３９６ないし４１３、５６９ないし６８９、５９７ないし６１０および６１９ないし６３６からなる群より選択されるアミノ酸残基を含み、ここに、該置き換えは前記野生型ＰＡＬ上のエピトープを改変する、請求項２２記載の組成物。
  24. 前記突然変異体ＰＡＬがＲ１２３Ｈ、Ｒ１２３Ａ、Ｒ１２３Ｑ、Ｙ１１０Ｈ、Ｙ１１０Ｈ、Ｙ１１０Ｌ、およびＨ５９８Ｑからなる群より選択される、請求項２３記載の組成物。
  25. 前記突然変異体ＰＡＬがＲ９１Ｋ、Ｈ１３７Ｋ、または５９８Ｑである、請求項２３記載の組成物。
  26. 前記修飾されたＰＡＬがＰＥＧ化ＰＡＬを含む、請求項２０記載の組成物。
  27. 添付書類Ａの構造座標によって規定されるＰＡＬの三次元構造に基づいて化合物を設計する工程；
    該化合物をＰＡＬまたはその部分と接触させる工程；および、
    該化合物がＰＡＬまたはその部分に結合したか否かを測定する工程；
    を包含する、ＰＡＬまたはその部分に結合する化合物を同定する方法。
  28. 添付書類Ａの構造座標によって規定されるＰＡＬの三次元構造の部分集合が前記設計工程で用いられる、請求項２７記載の方法。
  29. 前記化合物が、ＰＡＬの活性部位と非共有結合を形成するように設計されている、請求項２７記載の方法。
  30. 前記化合物が、公知の化合物から設計されるか、または新規に設計される、請求項２７記載の方法。
  31. 前記公知の化合物が化学ライブラリのメンバーである、請求項３０記載の方法。
  32. 少なくとも２．５Åの解像度までＰＡＬの三次元構造を規定する構造座標の組を取得する工程；
    該ＰＡＬの三次元構造に基づいて化合物を設計する工程；
    該化合物をＰＡＬまたはその部分と接触させる工程、および
    該化合物がＰＡＬまたはその部分に結合するか否かを決定する工程；
    を包含する、ＰＡＬまたはその部分に結合する化合物を同定する方法。
  33. 前記ＰＡＬの三次元構造が添付書類Ａの座標を含む、請求項３２記載の方法。
  34. 前記ＰＡＬの三次元構造が添付書類Ａの構造座標の部分集合を含む、請求項３２記載の方法。
  35. 前記化合物が、ＰＡＬの活性部位と非共有結合を形成するように設計される、請求項３２記載の方法。
  36. 前記ＰＡＬ解像度が少なくとも２．０Åである、請求項３２記載の方法。
  37. 前記ＰＡＬ解像度が約１．６Åである、請求項３６記載の方法。
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