JP2008237198A - New lactic acid bacteria - Google Patents
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Abstract
【課題】虫歯の予防や治療に有効であり、かつ、風味の良好な発酵乳の製造に用いることのできる乳酸菌の提供。
【解決手段】１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と併用して、３７℃で培養した場合に、培地が凝固する発酵性と、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の増殖抑制性を有するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、前記乳酸菌を有効成分とする虫歯予防用組成物及び発酵食品、前記発酵食品の製造方法、並びに前記乳酸菌を含有する菌末。
【選択図】なしAn object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium which is effective in preventing and treating caries and can be used for producing a fermented milk having a good flavor.
SOLUTION: When fermented with 10% (w / w) reduced nonfat dry milk medium in combination with Streptococcus thermophilus at 37 ° C., the fermentability that the medium solidifies and Streptococcus mutans (Leptococcus mutans) Lactobacillus delbruecki sub-species lactis having anti-proliferative properties, a composition for preventing dental caries and fermented food containing the lactic acid bacterium as an active ingredient, a method for producing the fermented food, and the lactic acid bacterium Fungus powder.
[Selection figure] None
Description
本発明は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ）に属する新規乳酸菌、該乳酸菌を含有する虫歯予防用組成物、該乳酸菌を含有する発酵食品、該乳酸菌を用いる発酵食品の製造方法、及び、該乳酸菌を含有する菌末に関する。 The present invention relates to a novel lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus delbrückii subspecies lactis, a composition for preventing caries containing the lactic acid bacterium, a fermented food containing the lactic acid bacterium, and a fermented food using the lactic acid bacterium. And a bacterial powder containing the lactic acid bacteria.
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌等の乳酸菌は、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られており、生活者の健康志向の高まりと共に、乳酸菌の食品への利用が盛んになってきている。乳酸菌の整腸作用は、主に、摂取した乳酸菌が腸内で増殖する結果、人体に有害な細菌の繁殖が抑制され、腸内フローラ（細菌嚢）が改善されるためと考えられている。口腔内も、腸内と同様に、多種多様な細菌によりフローラが形成されているため、乳酸菌が、口腔内環境の改善作用、特に虫歯や歯周病の予防・治療効果を有する可能性が検討されている。 Lactic acid bacteria such as Lactobacillus are known to have an intestinal regulating action that restores the balance of enteric bacteria, an immune enhancing action, a carcinogenesis suppressing action, etc. At the same time, the use of lactic acid bacteria in foods has become popular. The intestinal action of lactic acid bacteria is thought to be mainly due to the fact that ingested lactic acid bacteria proliferate in the intestine, thereby preventing the growth of bacteria harmful to the human body and improving the intestinal flora (bacterial sac). In the oral cavity, as in the intestine, flora is formed by a wide variety of bacteria, so the possibility that lactic acid bacteria may have an effect of improving the oral environment, especially the prevention and treatment of dental caries and periodontal disease. Has been.
乳酸菌を用いて、虫歯や歯周病の予防や治療をする種々の方法等が開示されている。例えば、（１）乳酸菌ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）を有効成分とする口腔内フローラを正常化するために用いる生菌製剤または乳酸菌含有食品が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。該乳酸菌含有食品は、歯周病菌、虫歯菌を原因菌とする歯周病および／又は虫歯の発症または再発・再燃を防止することができるとともに、口腔内フローラを正常化することにより、口臭の発生防止さらに唾液のｐＨを生理的に正常に保つことができるものである。 Various methods for preventing and treating caries and periodontal disease using lactic acid bacteria have been disclosed. For example, (1) a live bacterial preparation or a lactic acid bacteria-containing food used to normalize oral flora containing a lactic acid bacterium Lactobacillus salivarius as an active ingredient is disclosed (for example, see Patent Document 1). . The lactic acid bacteria-containing food can prevent periodontal disease and / or caries caused by periodontal disease bacteria and caries fungi, and can prevent the onset, recurrence, and relapse of teeth, and normalize oral flora. In addition, the pH of saliva can be kept physiologically normal.
また、虫歯の予防等に有効な乳酸菌として、例えば、（２）ラクトバチルス属に属する、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の増殖を抑制するための細菌、特にラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。 Examples of lactic acid bacteria effective for preventing dental caries include, for example, (2) bacteria for suppressing the growth of Streptococcus mutans belonging to the genus Lactobacillus, particularly Lactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri). (For example, refer to Patent Document 2).
その他、歯周病の予防等に有効な食品として、例えば、（３）ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＯＬＬ１２５５株及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＯＬＳ３２９４株を含有する口腔内疾患予防用及び／又は治療用の発酵乳が開示されている（例えば、特許文献３参照。）。特定の乳酸菌を組み合わせることにより、歯周病関連菌の増殖等が抑制されるため、口臭抑制と歯肉の腫れを抑制する効果のある発酵乳を製造できる。 Other effective foods for the prevention of periodontal disease include, for example, (3) Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1255 strain and Streptococcus thermospirus strain 94 The fermented milk for oral disease prevention and / or treatment containing is disclosed (for example, refer patent document 3). By combining specific lactic acid bacteria, the growth of periodontal disease-related bacteria and the like are suppressed, so that fermented milk having an effect of suppressing bad breath and suppressing swelling of gums can be produced.
これらの乳酸菌を用いた食品等は、食品等として摂取した乳酸菌が、口腔内において、虫歯や歯周病の原因菌に作用することにより、虫歯や歯周病を予防し、治療するものである。一方で、乳酸菌は、酸に弱いという性質を有するため、ある程度増殖すると、自ら産生した乳酸により死滅してしまう。このため、虫歯等に有効な乳酸菌を含有する食品等による虫歯等の予防効果を得るためには、該食品を継続的に摂取することが重要である。したがって、該食品が、風味が良好で嗜好性に優れていることや、工業上、製造することが容易であることが好ましい。
しかしながら、上記（１）の乳酸菌含有食品では、ラクトバチルス・サリバリウスは、口内唾液に存在する細菌であり、酸性条件下に弱いため、ラクトバチルス・サリバリウスをスターターとして発酵乳を製造しようとした場合、カードを形成することができないという問題がある。このため、ラクトバチルス・サリバリウスの生菌を含有する発酵乳を製造する場合には、予め単独で培養したラクトバチルス・サリバリウスを、遠心分離法や膜分離法等により所定の濃度まで濃縮した後、カードを形成するスターターの乳酸菌と共に、発酵前の調合乳へ添加し、混合培養する製造工程が必要となる。該製造工程は、煩雑でかつ工程管理が困難であり、経済上も好ましくない。さらに、該製造方法により得られた発酵乳は、風味生成の点で不十分であるという問題もある。 However, in the lactic acid bacteria-containing food of (1) above, Lactobacillus salivarius is a bacterium present in the mouth saliva and is weak under acidic conditions, so when trying to produce fermented milk using Lactobacillus salivarius as a starter, There is a problem that a card cannot be formed. For this reason, when producing fermented milk containing live bacteria of Lactobacillus salivarius, after concentrating Lactobacillus salivarius cultured beforehand in advance to a predetermined concentration by a centrifugal separation method or a membrane separation method, A starter lactic acid bacterium forming the card is added to the pre-fermented formula milk and mixed and cultured. The production process is complicated and difficult to manage, and is not economical. Furthermore, the fermented milk obtained by this manufacturing method also has the problem that it is insufficient at the point of flavor production | generation.
また、上記（２）の方法では、ラクトバチルス・ロイテリをスターターに用いたヨーグルトの製造方法が開示されているが、ラクトバチルス・ロイテリはヘテロ発酵をする乳酸菌であるため、乳中での発酵性が弱く、風味生成も不十分であるという問題がある。さらに、ラクトバチルス・ロイテリをスターターに用いた場合には、発酵時間が１２時間以上と極端に長くなるため、工業上の製造特性に劣るという問題がある。一方、上記（３）の方法では、安価かつ風味の良好な口腔内疾患予防を目的としたヨーグルトが製造できるものの、虫歯菌の増殖については、一切記載がない。 In the method (2), a method for producing yogurt using Lactobacillus reuteri as a starter is disclosed. However, since Lactobacillus reuteri is a lactic acid bacterium that performs heterofermentation, it is fermentable in milk. However, there is a problem that flavor generation is insufficient. Furthermore, when Lactobacillus reuteri is used as a starter, the fermentation time becomes extremely long, 12 hours or more, and therefore there is a problem that the industrial production characteristics are inferior. On the other hand, in the above method (3), although yogurt can be produced for the purpose of preventing oral diseases with a good price and flavor, there is no description of the growth of caries.
本発明は、虫歯の予防や治療に有効であり、かつ、風味の良好な発酵乳の製造に用いることのできる乳酸菌を提供することを目的とする。
また、本発明は、該乳酸菌を含有する、主に発酵食品等の虫歯予防用組成物、該乳酸菌を用いる発酵食品の製造方法、及び、該乳酸菌を含有する菌末を提供することを目的とする。
An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium which is effective in preventing and treating caries and can be used for producing a fermented milk having a good flavor.
Another object of the present invention is to provide a composition for preventing caries such as fermented foods, a method for producing fermented foods using the lactic acid bacteria, and a bacterial powder containing the lactic acid bacteria. To do.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地における発酵性に優れた乳酸菌の菌株について、虫歯の主な原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有する乳酸菌を見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that a strain of lactic acid bacteria excellent in fermentability in a 10% (w / w) reduced skim milk medium is Streptococcus mutus which is the main causative bacterium of dental caries. The present invention was completed by finding a lactic acid bacterium having a growth-inhibiting ability of chest.
すなわち、本発明は、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と併用して、３７℃で培養した場合に、培地が凝固する発酵性と、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の増殖抑制性を有するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ）を提供するものである。
また、本発明は、菌株が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８株、及び、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株からなる群より選ばれる一菌株であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを有効成分とする虫歯予防用組成物（但し、抗菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼ抗体を含有する虫歯予防用組成物を除く）を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを含有する発酵食品（但し、抗菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼ抗体を含有する発酵食品を除く）を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを用いることを特徴とする、発酵食品の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記製造方法により製造された発酵食品を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを含有する菌末を提供するものである。
That is, the present invention relates to the fermentability that the medium solidifies when cultured at 37 ° C. in combination with Streptococcus thermophilus in a 10% (w / w) reduced skim milk medium. The present invention provides Lactobacillus delbruecki subspecies lactis having a growth inhibitory property of mutans (Streptococcus mutans).
In the present invention, the strains are Lactobacillus delbruxii subspecies lactis TL6 strain (FERM BP-10758), Lactobacillus delbruxi subspecies lactis JCM1248 strain, and Lactobacillus delbrucky subs The present invention provides Lactobacillus delbruecki sub-species lactis, which is one strain selected from the group consisting of strains lactis JCM1010.
Further, the present invention provides a composition for preventing dental caries comprising the aforementioned Lactobacillus delbruecki subspecies lactis as an active ingredient (provided that a composition for preventing caries containing an antibacterial-binding glucosyltransferase antibody). Excluding).
In addition, the present invention provides a fermented food containing Lactobacillus delbruecki subspecies lactis as described above (except for a fermented food containing an antibacterial-binding glucosyltransferase antibody). .
Moreover, this invention provides the manufacturing method of fermented food characterized by using Lactobacillus delbruecki subspecies lactis in any one of the said.
Moreover, this invention provides the fermented food manufactured by the said manufacturing method.
The present invention also provides a bacterial powder containing any of the aforementioned Lactobacillus delbruecki subspecies lactis.
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及び、本発明の発酵食品の製造方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖を顕著に抑制することができ、虫歯の予防や治療に有効な発酵食品を製造することができる。また、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、発酵乳等の発酵食品の製造の際のスターターとして用いることができるという、優れた製造特性を有しているため、該発酵食品は、工業上、容易に製造することができる。さらに、該発酵食品は、風味が良好で嗜好性に優れているため、消費者に継続的に摂取されることが期待できる。 The Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention and the method for producing a fermented food of the present invention can significantly suppress the growth of Streptococcus mutans, and is effective for the prevention and treatment of dental caries. Food can be produced. In addition, the Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention has excellent production characteristics that it can be used as a starter in the production of fermented foods such as fermented milk. Can be easily produced industrially. Furthermore, since the fermented food has a good flavor and excellent palatability, it can be expected to be continuously consumed by consumers.
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して、３７℃で培養した場合に、培地が凝固する発酵性と、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有するものである。該還元脱脂粉乳培地を凝固させることができるほど強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造のためのスターターとして使用することが可能であり、特別な製造工程を必要とせず、発酵食品を工業上、容易に製造することができるためである。 Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention is a fermentation in which the medium solidifies when cultured at 37 ° C. in combination with Streptococcus thermophilus in a 10% (w / w) reduced skim milk medium. And the ability to inhibit the growth of Streptococcus mutans. If it is a lactic acid bacterium having fermentability strong enough to coagulate the reduced skim milk medium, it can be used as a starter for producing fermented milk, and no special production process is required. This is because it can be easily manufactured industrially.
本発明の乳酸菌が有する発酵性を、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して培養した場合の発酵性としたのは、単に培地が凝固するだけではなく、風味生成及び組織形成が良好な発酵食品の製造に用いることができる乳酸菌を得るためである。従来より、ヨーグルト等の発酵食品の製造には、スターターとして、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・カゼイ等の乳酸菌が用いられている。スターターは、単一菌種であってもよく、二菌種以上であってもよいが、単一菌種では、酸生成、風味生成、組織形成で、不十分であるという問題が生ずる。このため、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に、ヨーグルト用乳酸菌として汎用されているストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して培養した場合に、培地が凝固し、良好な風味生成及び組織形成がなされる発酵性を有する乳酸菌を、本発明の乳酸菌とした。 The fermentability possessed by the lactic acid bacteria of the present invention, when cultured in combination with Streptococcus thermophilus, is not only that the medium is solidified, but also the production of fermented foods with good flavor generation and tissue formation This is to obtain a lactic acid bacterium that can be used in Conventionally, in the production of fermented foods such as yogurt, lactic acid bacteria such as Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helvetics, Lactobacillus casei have been used as starters. Yes. The starter may be a single bacterial species, or may be two or more bacterial species, but the single bacterial species has a problem that acid generation, flavor generation, and tissue formation are insufficient. For this reason, when cultured in combination with Streptococcus thermophilus, which is widely used as a lactic acid bacterium for yogurt, in 10% (w / w) reduced skim milk medium, the medium coagulates, and good flavor generation and tissue formation are achieved. The lactic acid bacteria having fermentability made were used as the lactic acid bacteria of the present invention.
なお、該ストレプトコッカス・サーモフィルスは、通常、発酵乳等の発酵食品を製造するために用いられているストレプトコッカス・サーモフィルスであれば、特に限定されるものではない。該ストレプトコッカス・サーモフィルスとして、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株やストレプトコッカス・サーモフィルスＡＴＣＣ１９２５８株等がある。 The Streptococcus thermophilus is not particularly limited as long as it is Streptococcus thermophilus that is usually used for producing fermented foods such as fermented milk. Examples of the Streptococcus thermophilus include Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain and Streptococcus thermophilus ATCC 19258 strain.
また、虫歯は、口腔内細菌が、糖を分解して発生させた酸により、歯のエナメル質中の無機質が脱灰するために生じる。より詳細には、まず、主にストレプトコッカス・ミュータンスが、グルコシルトランスフェラーゼを用いて、口腔内の糖から菌体結合性の不溶性グルカンを生成して、菌体を歯面に付着させる。この付着したストレプトコッカス・ミュータンスを足場に、さらに多種多様な口腔細菌が凝集し、プラークを形成する。プラーク中では、口腔内細菌が発生した酸等の代謝物が非常に高濃度に存在するため、歯の脱灰が進行し、虫歯となる。したがって、虫歯の主な原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンスの、口腔内での増殖を抑制することができる乳酸菌は、虫歯の発生を有意に低減させることができるため、虫歯の予防や治療に有効であることが期待できる。なお、該ストレプトコッカス・ミュータンスは、通常、口腔内で虫歯の原因菌となり得るものであれば、特に限定されるものではない。該ストレプトコッカス・ミュータンスとして、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０５Ｔ株やストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５１７５株等がある。 In addition, caries is caused by the demineralization of minerals in tooth enamel by the acid generated by decomposition of sugar by oral bacteria. More specifically, first, Streptococcus mutans mainly produces microbial cell-binding insoluble glucan from sugar in the oral cavity using glucosyltransferase, and attaches the microbial cell to the tooth surface. Using this attached Streptococcus mutans as a scaffold, a wider variety of oral bacteria aggregate and form plaques. In plaque, metabolites such as acids generated by oral bacteria are present at a very high concentration, so that the decalcification of teeth progresses and caries becomes caries. Therefore, lactic acid bacteria capable of suppressing the growth of Streptococcus mutans, the main causative agent of dental caries, in the oral cavity can significantly reduce the occurrence of dental caries and are therefore effective in preventing and treating caries. Can be expected. The Streptococcus mutans is not particularly limited as long as it can be a causative bacterium for caries in the oral cavity. Examples of the Streptococcus mutans include Streptococcus mutans JCM5705T strain and Streptococcus mutans JCM5175 strain.
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、例えば以下の方法により得ることができる。まず、各種の試料から菌株を分離し、この中から１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用した場合の発酵性が優れたもの、すなわち、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地で、３７℃でストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して培養した時に、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択する。次いで、選択された菌から、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有する菌株を選択することにより得ることができる。 The Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention can be obtained, for example, by the following method. First, strains were isolated from various samples, and 10% (w / w) reduced nonfat dry milk medium with excellent fermentability when used in combination with Streptococcus thermophilus, that is, 10% (w / w) w) A reduced nonfat dry milk medium is selected that has a fermentability that can coagulate the medium when cultured in combination with Streptococcus thermophilus at 37 ° C. Subsequently, it can obtain by selecting the strain which has the growth inhibitory property of Streptococcus mutans from the selected microbe.
以下、さらに詳細に説明する。
１．菌株の取得
本発明者らは、前記の性質を有する菌株を自然界から取得すべく、自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。以下、参考文献１と記載する。）で希釈し、Ｂｒｉｇｇｓ ｌｉｖｅｒ ｂｒｏｔｈ（前記参考文献１、３１９ページ）の平板に塗布し、３７℃で嫌気培養した。そして得られたコロニーの中でグラム陽性桿菌である菌を釣菌した。該釣菌した菌を、ＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。これらの菌株を、後記の試験例１に記載の方法を用いて、まず、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地中で、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用した場合の発酵試験を行い、優れた発酵性を有する菌株を２０株得た。続いて、後記の試験例４に記載の方法を用いて、それぞれの菌株のストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を調べた結果、最も強い増殖抑制性を有していた菌株を１株取得した。該菌株は、ＴＬ６株と名付けられた。
This will be described in more detail below.
1. Acquisition of strains In order to acquire strains having the above-mentioned properties from the natural world, the present inventors collected anaerobic dilutions from samples collected from the natural world (published in 1980 by Shubunsha Publishing Co., Ltd., Tomokazu Mitsuoka, “The World of Enteric Bacteria”, page 322. (Hereinafter referred to as Reference Document 1), and applied to a plate of Briggs liver broth (Reference Document 1, page 319) and anaerobically cultured at 37 ° C. And the microbe which is a Gram positive bacillus was caught in the obtained colony. The fish strains were streaked on a BL agar plate, and anaerobic culture was repeated in the same manner as described above to obtain a purely isolated strain. These strains were first subjected to a fermentation test in combination with Streptococcus thermophilus in a 10% (w / w) reduced skim milk medium using the method described in Test Example 1 below. 20 strains having fermentability were obtained. Then, as a result of investigating the growth inhibitory property of Streptococcus mutans of each strain using the method described in Test Example 4 described later, one strain having the strongest growth inhibitory property was obtained. The strain was named TL6 strain.
２．ＴＬ６株の同定
ＴＬ６株の菌学的性質を、表１に示す。表１の結果から、明らかであるように、ＴＬ６株は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス菌種と共通の菌学的性質を有していた。なお、菌学的性質を測定するための試験は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Peter H. A. Sneath編、第２巻、Williams and Wilkins Company、１９８６年）にほぼ従って行った。
2. Identification of TL6 strain Table 1 shows the mycological properties of the TL6 strain. As is clear from the results in Table 1, the TL6 strain had bacteriological properties in common with the Lactobacillus delbruecki subspecies lactis species. Tests for measuring mycological properties are described in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, edited by Peter HA Sneath, Volume 2, Williams and Wilkins Company, 1986). Almost done so.
次に、ＴＬ６株の遺伝学的性質を調べるため、ＴＬ６株の１６Ｓ ｒＤＮＡの可変領域の塩基配列を常法により同定した。ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、国立バイオテクノロジー情報センター）の国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）上で、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）による該塩基配列についての相同性検索を行ったところ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスの基準株であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＢＣＲＣ１１０５１株と、９８．５２％の相同性があった。 Next, in order to examine the genetic properties of the TL6 strain, the nucleotide sequence of the variable region of the 16S rDNA of the TL6 strain was identified by a conventional method. A homology search for the base sequence by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) was performed on the international base sequence database (GenBank) of NCBI (National Center for Biotechnology Information, National Center for Biotechnology Information). There was 98.52% homology with the Lactobacillus delbruxii subspecies lactis BCCR11051 strain, which is the reference strain of delbruecki subspecies lactis.
以上の菌学的性質及び遺伝学的性質の結果から、ＴＬ６株は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス菌種であることが確認された。 From the results of the above mycological properties and genetic properties, it was confirmed that the TL6 strain is a Lactobacillus delbruecki subspecies lactis species.
そこで、出願人は、ＴＬ６株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに新規菌株として寄託した（寄託日：平成１９年１月１７日）。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５８である。 Therefore, the applicant deposited the TL6 strain as a new strain at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Deposit date: January 17, 2007). The accession number is FERM BP-10758.
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して、３７℃で培養した場合に、培地が凝固する発酵性と、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスであれば、特に限定されるものではないが、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８株、及び、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株からなる郡より選ばれる一菌株であることが好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株であることが特に好ましい。後記試験例に示すように、ストレプトコッカス・ミュータンスに対する増殖抑制能が顕著に高いためである。 Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention is a fermentation in which the medium solidifies when cultured at 37 ° C. in combination with Streptococcus thermophilus in a 10% (w / w) reduced skim milk medium. And Lactobacillus delbruecki sub-species lactis having the ability to suppress the growth of Streptococcus mutans, but not particularly limited, Lactobacillus delbruecki sub-species lactis strain TL6, lact Preferably, the strain is selected from the group consisting of the Bacillus delbruxii subspecies lactis JCM1248 strain and the Lactobacillus delbruxii subspecies lactis JCM1010 strain. It is particularly preferable are parts subsp. Lactis TL6 share. This is because, as shown in the test examples described later, the ability to suppress growth against Streptococcus mutans is remarkably high.
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、自然界から分離した乳酸菌の中から、発酵性、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有するものを選び出し得られたものである。したがって、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、口腔内に用いられる虫歯予防用組成物や食品として、安全に利用することが可能である。 The Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention has been selected from lactic acid bacteria isolated from the natural world having fermentability and growth inhibition of Streptococcus mutans. Therefore, the Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention can be safely used as a composition for preventing dental caries or food used in the oral cavity.
該虫歯予防用組成物の形態は、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスのストレプトコッカス・ミュータンスに対する増殖抑制作用を発揮することが可能な形態であれば、特に限定されるものではなく、食品、オーラルケア用品、及び飼料、並びにこれらに対する添加物であってもよい。摂取が簡便であること、及び、他の乳酸菌と同様に整腸作用等も期待できることから、食品や食品添加物の形態であることが好ましい。該食品は、通常乳酸菌を用いるものであれば、いずれの種類の食品であってもよい。該食品として、例えば、ヨーグルト等の発酵食品、チョコレートやキャンディー、チューインガム等の菓子類等がある。本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスの生菌を大量に摂取することができるため、発酵食品であることが特に好ましい。その他、該オーラルケア用品として、例えば、口腔洗浄剤やトローチ錠等がある。 The form of the composition for preventing dental caries is not particularly limited as long as it is a form capable of exhibiting the growth-inhibiting action against L. mutans of Lactobacillus delbruxii, Subspecies, and Lactis of the present invention. Alternatively, it may be food, oral care products and feed, and additives thereto. It is preferable to be in the form of a food or food additive because it is easy to ingest and can be expected to have an intestinal regulating action similar to other lactic acid bacteria. The food may be any kind of food as long as it normally uses lactic acid bacteria. Examples of the food include fermented foods such as yogurt, confectionery such as chocolate, candy, and chewing gum. Since it is possible to ingest a large amount of live bacteria of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention, it is particularly preferably a fermented food. Other oral care products include, for example, oral cleaning agents and lozenges.
その他、該虫歯予防用組成物の形態を、食品等への添加物の形態とする場合には、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを、生菌等の菌末として用いることもできる。該菌末は、常法により調製することができる。例えば、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを培養後、遠心分離することにより集菌した後、さらに凍結乾燥することにより、得ることができる。 In addition, when the composition for preventing dental caries is in the form of an additive to food or the like, the Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention should be used as a bacterial powder such as viable bacteria. You can also. The bacterial powder can be prepared by a conventional method. For example, the Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention can be obtained by culturing, collecting the cells by centrifugation, and then freeze-drying them.
虫歯予防用組成物として用いる場合において、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスの、虫歯予防用組成物中の含有量や１日あたりの摂取量等は、虫歯予防効果が期待できる量であれば、特に限定されるものではない。例えば、１日あたり、１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ程度のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを摂取することが好ましい。 When used as a composition for preventing dental caries, the content of the Lactobacillus delbruecki, Subspecies, and Lactis of the present invention in the composition for preventing dental caries and the amount of intake per day can be expected to prevent dental caries. The amount is not particularly limited. For example, it is preferable to take about 1 × 10 7 to 1 × 10 11 CFU of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis per day.
また、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを含有する発酵食品は、本発明の発酵食品の製造方法により、簡便かつ効率よく製造することができる。該方法は、具体的には、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを、単に発酵用ベースに添加して培養することにより行うことができる。予め前培養したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを、スターターとして発酵用ベースに添加してもよい。 Moreover, the fermented food containing the Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention can be easily and efficiently produced by the method for producing a fermented food of the present invention. Specifically, this method can be performed by simply adding the Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention to a fermentation base and culturing. Pre-cultured Lactobacillus delbruecki subspecies lactis may be added to the fermentation base as a starter.
本発明において、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスを含有する発酵食品の製造に用いられる発酵用ベースは、発酵食品の製造に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではないが、乳を主成分とする乳性発酵用ベースであることが好ましい。該乳を主成分とする乳性発酵用ベースとして、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。 In the present invention, the fermentation base used in the production of the fermented food containing Lactobacillus delbruecki subspecies lactis is not particularly limited as long as it is a base usually used in the production of fermented food. It is preferably a base for milky fermentation mainly composed of milk. As a base for dairy fermentation mainly composed of the milk, for example, milk, skim milk, fresh cream, butter, whole milk powder, skim milk powder, sweeteners such as sucrose, pectin, fruit, fruit juice as necessary , Agar, gelatin, fats and oils, fragrances, coloring agents, stabilizers, reducing agents, and the like, and can be prepared by sterilization, homogenization, cooling, and the like according to conventional methods.
本発明の発酵食品は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスのストレプトコッカス・ミュータンスに対する増殖抑制効果を阻害しない範囲において、他の乳酸菌を含有してもよい。該他の乳酸菌は、通常発酵乳等の発酵食品の製造に用いられるものであれば、特に限定されないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスであることが好ましい。本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスとストレプトコッカス・サーモフィルスを、乳性発酵用ベース中で混合培養することにより、風味が良好で嗜好性に優れた発酵食品を製造することができるためである。その他、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を含有した発酵食品であってもよい。 The fermented food of the present invention may contain other lactic acid bacteria as long as it does not inhibit the growth inhibitory effect of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis on Streptococcus mutans. The other lactic acid bacteria are not particularly limited as long as they are usually used for producing fermented foods such as fermented milk, but are preferably Streptococcus thermophilus. By mixing and cultivating Lactobacillus delbruecki subspecies lactis and Streptococcus thermophilus of the present invention in a base for milk fermentation, a fermented food with good flavor and excellent palatability can be produced. Because. In addition, it may be a fermented food containing Lactococcus lactis.
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスの発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、該発酵用ベースに対して０．０１〜１０（ｗ／ｗ）％が好ましく、０．１〜５（ｗ／ｗ）％が特に好ましい。また、ストレプトコッカス・サーモフィルス等の他の乳酸菌を併用して培養する場合には、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスと、ストレプトコッカス・サーモフィルス等の、スターターとしての発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、１：１００〜１０：１が好ましく、１：１０〜１：１が特に好ましい。 Although the inoculation ratio to the fermentation base of the Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention is not particularly limited, it is 0.01 to 10 (w / w)% with respect to the fermentation base. Is preferable, and 0.1 to 5 (w / w)% is particularly preferable. In addition, when culturing in combination with other lactic acid bacteria such as Streptococcus thermophilus, to the fermentation base as a starter such as Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention and Streptococcus thermophilus The inoculation ratio is not particularly limited, but is preferably 1: 100 to 10: 1, particularly preferably 1:10 to 1: 1.
本発明において、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスや、ストレプトコッカス・サーモフィルス等の前培養に用いられる培地は、通常乳酸菌の培養に用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（ｗ／ｗ）以上が好ましく、８％（ｗ／ｗ）以上が特に好ましい。さらに、酵母エキス等の生育促進物質を添加することが好ましい。例えば、０．１〜１％（ｗ／ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いることが好ましい。該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。 In the present invention, the medium used for the preculture such as Lactobacillus delbruecki subspecies lactis and Streptococcus thermophilus is not particularly limited as long as it is a medium normally used for culturing lactic acid bacteria. A milky medium is preferable. A reduced skim milk medium is particularly preferred because of easy handling. The concentration of the reduced skim milk medium is preferably 3% (w / w) or more, particularly preferably 8% (w / w) or more. Furthermore, it is preferable to add a growth promoting substance such as yeast extract. For example, a medium containing 0.1 to 1% (w / w) yeast extract can be used. Moreover, it is preferable to use what was sterilized as the culture medium used for preculture. The sterilization treatment can be performed by a commonly used method, for example, by heat treatment at 80 to 122 ° C. for 5 to 40 minutes, preferably 85 to 95 ° C. for 5 to 35 minutes.
本発明の発酵食品の製造方法における、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスの培養の温度は、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃が特に好ましい。本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスが充分に生育可能な温度範囲であるためである。また、培養時間は、製造する発酵食品の種類によって適宜決定されるが、４〜１８時間が好ましい。 In the method for producing a fermented food according to the present invention, the culture temperature of Lactobacillus delbrucky subspecies lactis is preferably 30 ° C to 40 ° C, and particularly preferably 36 ° C to 38 ° C. This is because the Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention is in a temperature range in which it can sufficiently grow. Moreover, although culture | cultivation time is suitably determined by the kind of fermented food to manufacture, 4-18 hours are preferable.
培養後得られた発酵乳等の発酵食品は、そのまま食品としてもよく、例えば、均質化して液状に加工してもよい。その他、例えば、果汁、果実等を適宜添加してもよい。また、容器への充填等は、特に限定されるものではなく、通常用いられる方法で行うことができる。 Fermented foods such as fermented milk obtained after culturing may be used as they are, for example, homogenized and processed into liquid form. In addition, for example, fruit juice, fruit and the like may be added as appropriate. Further, filling of the container and the like are not particularly limited, and can be performed by a commonly used method.
次に試験例及び実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の試験例及び実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although a test example and an Example are shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to the following test examples and Examples.
（試験例１） 発酵乳の調整
発酵乳の製造に汎用されているストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＪＣＭ１００２Ｔ株、特許文献２に記載のストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有するラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５３６０８株とラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２Ｔ株、並びに、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株、及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８Ｔ株を用いて、発酵乳を製造した。酸生成、風味生成、及び組織形成が十分となるように、単一菌株ではなく、表２に記載の組合せの２菌株、すなわち、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株と各ラクトバチルス属菌を、それぞれスターターとして、乳性発酵用ベースに添加して培養することにより、発酵乳を製造した。ここで、発酵乳１は、発酵乳の製造に汎用されている乳酸菌の組合せである。
(Test Example 1) Preparation of fermented milk Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain and Lactobacillus delbruxii subspecies bulgaricus JCM1002T strain, which are widely used in the production of fermented milk, Streptococcus Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain and Lactobacillus reuteri JCM1112T strain having mutans growth inhibitory properties, and Lactobacillus delbruecki subspecies lactis TL6 strain, Lactobacillus delbrucky subspecies lactis JCM1010 strain, Fermented milk was produced using Lactobacillus delbruecki Subspecies Lactis JCM1248T strain. In order to achieve sufficient acid production, flavor production, and tissue formation, two strains of the combinations described in Table 2, not Streptococcus thermophilus FERM P-17216, and each Lactobacillus genus are used instead of a single strain. As a starter, fermented milk was produced by adding to the base for dairy fermentation and culturing. Here, fermented milk 1 is a combination of lactic acid bacteria widely used in the production of fermented milk.
まず、上述した乳酸菌をそれぞれ、０．５％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に接種し、３７℃、１６時間培養したものをバルクスターターとした。また、１０％（ｗ／ｗ）脱脂粉乳からなる原料ミックスを、乳性発酵用ベースとして用いた。
該原料ミックスに、先に調製したバルクスターターをラクトバチルス属の各菌株については０．５％（ｗ／ｗ）ずつ、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株については１．５％（ｗ／ｗ）ずつ接種し、３７℃でｐＨ４．８になるまで培養を行い、発酵乳を得た。得られた発酵乳は、１０℃で２４時間保管し、再度ｐＨを測定した。表２にｐＨ４．８に到達するまでに要した時間と、調整された発酵乳を１０℃で２４時間保存した後のｐＨをそれぞれ示した。ただし、ラクトバチルス・ロイテリを用いた発酵乳５と６は、１２時間培養した時点でｐＨ４．８に到達しなかったため、培養１２時間後のｐＨを示した。
First, each of the lactic acid bacteria described above was inoculated into a 10% (w / w) reduced skim milk medium containing 0.5% (w / w) yeast extract and cultured at 37 ° C. for 16 hours to make a bulk starter. Moreover, the raw material mix which consists of 10% (w / w) skim milk powder was used as a base for milky fermentation.
In the raw material mix, the previously prepared bulk starter is 0.5% (w / w) for each strain of Lactobacillus, 1.5% (w / w) for Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain. Inoculated one by one and cultured at 37 ° C. until pH 4.8 was obtained to obtain fermented milk. The obtained fermented milk was stored at 10 ° C. for 24 hours, and the pH was measured again. Table 2 shows the time required to reach pH 4.8 and the pH after storing the adjusted fermented milk at 10 ° C. for 24 hours. However, fermented milks 5 and 6 using Lactobacillus reuteri did not reach pH 4.8 when cultured for 12 hours, and thus showed pH after 12 hours of culture.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを用いた発酵乳１〜４は、使用した菌株により若干発酵時間に差が認められたが、すべて発酵乳として良好な組織を得ることができた。特許文献２に記載のラクトバチルス・ロイテリの２菌株は、発酵性が弱く、発酵乳５と６は、発酵が不十分であり、１２時間経過後も充分なカードが得られなかった。すなわち、表２の結果から、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスは、乳性発酵用ベースに、ストレプトコッカス・サーモフィルスと併用して、３７℃で培養した場合に、良好な発酵乳を得るために十分な発酵性を有していることが明らかである。 Fermented milk 1 to 4 using Lactobacillus delbruecki subspecies lactis and Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus showed a slight difference in fermentation time depending on the strain used, but all fermented milk As a result, a good structure could be obtained. The two strains of Lactobacillus reuteri described in Patent Document 2 have poor fermentability, and fermented milks 5 and 6 are insufficiently fermented, and sufficient curds were not obtained even after 12 hours. That is, from the results of Table 2, the Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention is a good fermentation when cultured at 37 ° C. in combination with Streptococcus thermophilus on a base for milk fermentation. It is clear that it has sufficient fermentability to obtain milk.
（試験例２） 発酵乳の風味評価
試験例１で作成した発酵乳を用いて官能検査による風味評価を行った。５名のパネリストにより、各発酵乳に関するおいしさを５段階で評価した。大きい値ほどおいしい発酵乳であることを示す。表３は評価結果を示したものである。発酵が不十分であった発酵乳５と６は、風味評価も低かったが、発酵乳１〜４は、良好な風味を有していた。特に、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株を用いて製造された発酵乳２と４は、汎用されている発酵乳１よりも、風味が優れていることが明らかとなった。なお、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株に代えて、ストレプトコッカス・サーモフィルスＡＴＣＣ１９２５８株等の他のストレプトコッカス・サーモフィルスを用いた場合であっても、同様に風味の良好な発酵乳が得られた。
すなわち、表３の結果から、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスとストレプトコッカス・サーモフィルスを用いることにより、風味が良好で嗜好性に優れている発酵食品を製造できることが明らかである。
(Test example 2) Flavor evaluation of fermented milk Flavor evaluation by a sensory test was performed using the fermented milk prepared in test example 1. The taste of each fermented milk was evaluated by 5 panelists by 5 panelists. Larger values indicate more delicious fermented milk. Table 3 shows the evaluation results. Fermented milks 5 and 6 that had been poorly fermented had low flavor evaluation, but fermented milks 1 to 4 had good flavor. In particular, fermented milks 2 and 4 produced using Lactobacillus delbrucky subspecies lactis TL6 strain and Lactobacillus delbrucky subspecies lactis JCM1010 strain are more widely used than fermented milk 1 which is widely used. It became clear that the flavor was excellent. Even when Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain was used instead of other Streptococcus thermophilus ATCC19258 strain or the like, fermented milk having a good flavor was obtained. .
That is, it is clear from the results in Table 3 that fermented foods with good flavor and excellent palatability can be produced by using Lactobacillus delbruecki subspecies lactis and Streptococcus thermophilus of the present invention. .
（試験例３） ストレプトコッカス・ミュータンスの阻止円の形成
２００ｇ／Ｌのスクロースと０．２Ｕ／ｍＬのバシトラシンを加えたＭｉｔｉｓ Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０５Ｔ株を塗布した選択培地を用いて、試験例１で用いた乳酸菌のストレプトコッカス・ミュータンスの阻止円の形成能を測定した。
まず、３％（ｗ／ｖ）のショ糖を加えたＧＡＭブイヨン液体培地（ニッスイ社製）に、試験例１で使用した乳酸菌を、それぞれ単独で接種した後、３７℃で２４時間培養した。その後、得られた培養液から、それぞれ３０μＬを分取して、濾紙に染み込ませた。該濾紙を該選択培地に載せ、３７℃で４８時間培養した後、阻止円の形成を観察した。観察した結果を表４に示す。
(Test Example 3) Formation of Streptococcus mutans circle of inhibition Streptococcus mutans JCM5705T strain was applied to Mitis Salivarius agar medium (Difco) supplemented with 200 g / L sucrose and 0.2 U / mL bacitracin. Using the selective medium, the ability to form the inhibition circle of Streptococcus mutans of lactic acid bacteria used in Test Example 1 was measured.
First, the lactic acid bacteria used in Test Example 1 were individually inoculated into a GAM bouillon liquid medium (Nissui Co., Ltd.) supplemented with 3% (w / v) sucrose, and then cultured at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, 30 μL of each of the obtained culture broth was collected and soaked in filter paper. After the filter paper was placed on the selective medium and cultured at 37 ° C. for 48 hours, formation of inhibition circles was observed. The observation results are shown in Table 4.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスに属する全ての菌株は、特許文献２に記載のラクトバチルス・ロイテリの２菌株と同様に、濾紙周辺にストレプトコッカス・ミュータンスの阻止円が形成された。中でもＴＬ６株の培養液は、ラクトバチルス・ロイテリよりも非常に大きな阻止円を形成した。一方、発酵乳の製造に適しているストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ−１７２１６株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＪＣＭ１００２Ｔ株は阻止円を形成しなかった。すなわち、表４の結果から、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスが、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有することが明らかである。 In all strains belonging to Lactobacillus delbruecki subspecies lactis, a stop circle of Streptococcus mutans was formed around the filter paper in the same manner as the two strains of Lactobacillus reuteri described in Patent Document 2. Among them, the culture solution of TL6 strain formed a much larger inhibition circle than Lactobacillus reuteri. On the other hand, Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain and Lactobacillus delbruecki subspecies Bulgarix JCM1002T strain suitable for the production of fermented milk did not form a blocking circle. That is, it is clear from the results in Table 4 that the Lactobacillus delbruecki subspecies lactis of the present invention has the ability to inhibit the growth of Streptococcus mutans.
（試験例４） ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性の検証
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５３６０８株、及び、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２Ｔ株のストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を比較検証した。
まず、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０５Ｔ株とストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５１７５株を、それぞれＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地に接種し、３７℃で１６時間培養し、各菌株の菌溶液を調製した。また、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５３６０８株を、それぞれ０．５％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地に接種し、３７℃で１６時間培養し、各菌株の菌溶液を調製した。
(Test Example 4) Verification of growth inhibitory properties of Streptococcus mutans Growth of Streptococcus mutans of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis TL6 strain, Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain, and Lactobacillus reuteri JCM1112T strain The inhibitory properties were compared and verified.
First, Streptococcus mutans JCM5705T strain and Streptococcus mutans JCM5175 strain were each inoculated into BHI (Brain heart Infusion) medium and cultured at 37 ° C. for 16 hours to prepare bacterial solutions of each strain. In addition, 10% (w / w) reduced skim milk medium containing 0.5% (w / w) yeast extract was inoculated with Lactobacillus delbruecki subspecies Lactis TL6 strain and Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain, respectively. The cells were cultured at 37 ° C. for 16 hours to prepare bacterial solutions of each strain.
次に、３％（ｗ／ｖ）のショ糖を加えたＧＡＭブイヨン液体培地（ニッスイ社製）を５ｍＬずつ分注したガラス試験管に、表４記載の各菌株の菌溶液を、０．１％（ｗ／ｗ）濃度となるように添加し、３７℃で培養した。１６時間後、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数を寒天平板法により測定した。ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数は、具体的には、各ガラス試験管中の培養液の一部を、試験例３記載の選択培地に塗布した後、３７℃で７２時間培養し、コロニー数を計数して、菌数を算出した。 Next, in a glass test tube in which 5 mL of GAM bouillon liquid medium (Nissui Co., Ltd.) added with 3% (w / v) sucrose was dispensed, the bacterial solution of each strain described in Table 4 % (W / w) concentration was added and cultured at 37 ° C. After 16 hours, the number of Streptococcus mutans was measured by the agar plate method. Specifically, the number of Streptococcus mutans was determined by applying a portion of the culture solution in each glass test tube to the selective medium described in Test Example 3 and then culturing at 37 ° C. for 72 hours. The number of bacteria was calculated by counting.
表５は、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌数測定の結果を示したものである。なお、各菌数は、独立した３回の測定の平均値を示している。表５より明らかであるように、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株は、ストレプトコッカス・ミュータンスの生育を非常に強く抑制した。一方、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５３６０８株は、若干のストレプトコッカス・ミュータンスの生育抑制は観察されたものの、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株に比較して非常に弱く、ほぼ静菌効果に止まった。すなわち、表５の結果から、本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスが、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有する公知の菌株よりも、非常に強いストレプトコッカス・ミュータンスの増殖抑制性を有していることが明らかである。 Table 5 shows the results of measuring the number of Streptococcus mutans. In addition, each number of bacteria has shown the average value of three independent measurements. As is clear from Table 5, the Lactobacillus delbruecki subspecies lactis TL6 strain very strongly suppressed the growth of Streptococcus mutans. On the other hand, the Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain was observed to be slightly weaker than the Lactobacillus delbruxii subspecies Lactis TL6 strain, although the growth of some Streptococcus mutans was observed. Stopped. That is, from the results in Table 5, the Lactobacillus delbruxii subspecies lactis of the present invention is much stronger than the known strains having the ability to inhibit the growth of Streptococcus mutans. It is clear that
０．１％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｇを、１１５℃で２０分間殺菌し、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のシードカルチャーを３０ｇ接種し、３７℃１６時間培養して、バルクスターターを調製した。一方、０．１％（ｗ／ｗ）酵母エキス含有１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｇを、９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株を３０ｇ接種し、３７℃５時間培養して、バルクスターターを調製した。
これとは別に、脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質等の原料を混合溶解し、乳脂肪３．０％（ｗ／ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（ｗ／ｗ）からなる乳性発酵用ベース５０ｋｇを、７０℃に加温して、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌して、４０℃に冷却した。該殺菌した乳性発酵用ベースに、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のバルクスターター１５０ｇと、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株のバルクスターター４５０ｇを接種し、３７℃で４時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。得られたヨーグルトはｐＨ４．９５であり、６．５×１０７ＣＦＵ／ｍＬのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含有していた。
A 10% (w / w) reduced skim milk medium containing 0.1% (w / w) yeast extract is sterilized at 115 ° C. for 20 minutes, and the seed culture of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis TL6 strain is obtained. 30 g was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours to prepare a bulk starter. On the other hand, 1000 g of 0.1% (w / w) yeast extract-containing 10% (w / w) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, and 30 g of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain was inoculated. A bulk starter was prepared by culturing at 37 ° C. for 5 hours.
Separately from this, raw materials such as skim milk powder, cream and milk protein are mixed and dissolved, and the dairy composition is composed of milk fat 3.0% (w / w) and nonfat milk solids 12.0% (w / w). 50 kg of the fermentation base was heated to 70 ° C., homogenized at a pressure of 15 MPa, sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and cooled to 40 ° C. 150 g of the bulk starter of Lactobacillus delbrucky subspecies lactis TL6 strain previously cultured as described above and 450 g of the bulk starter of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 were preliminarily cultured as described above. Inoculated and cultured at 37 ° C. for 4 hours to obtain fermented milk. The fermented milk was immediately stirred and cooled, filled into a 100 mL paper cup container, and sealed to obtain yogurt. The obtained yogurt had a pH of 4.95 and contained 6.5 × 10 7 CFU / mL of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis strain TL6.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株に代えてラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８株を、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株に代えてストレプトコッカス・サーモフィルスＡＴＣＣ１９２５８株を、それぞれ用いて、３７℃で４時間ではなく、３７℃で６時間培養した以外は、全て実施例１と同様にして、ヨーグルトを得た。得られたヨーグルトはｐＨ４．８５であり、４．５×１０７ＣＦＵ／ｍＬのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１２４８株を含有していた。 Lactobacillus delbruxii subspecies lactis TL6 strain is replaced by Lactobacillus delbruecki subspecies lactis JCM1248 strain, Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain is replaced by Streptococcus thermophilus ATCC19258 strain, respectively The yogurt was obtained in the same manner as in Example 1 except that the culture was performed at 37 ° C. for 6 hours instead of at 37 ° C. for 4 hours. The obtained yogurt had a pH of 4.85 and contained 4.5 × 10 7 CFU / mL of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis JCM1248 strain.
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株に代えてラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株を用いた以外は、全て実施例１と同様にして、ヨーグルトを得た。得られたヨーグルトはｐＨ４．９２であり、５．２×１０７ＣＦＵ／ｍＬのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ１０１０株を含有していた。 A yogurt was obtained in the same manner as in Example 1 except that the Lactobacillus delbruxii subspecies lactis JCM1010 strain was used in place of the Lactobacillus delbruxii subspecies lactis TL6 strain. The obtained yogurt had a pH of 4.92 and contained 5.2 × 10 7 CFU / mL of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis JCM1010 strain.
実施例１と同様にして、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株とストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株の、それぞれのバルクスターターを調製した。一方、１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｇを、９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクティスＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４６株を３０ｇ接種し、２５℃１６時間培養して、バルクスターターを調製した。
これとは別に、脱脂粉乳、クリーム及び乳タンパク質等の原料を混合溶解し、乳脂肪３．０％（ｗ／ｗ）、無脂乳固形分１２．０％（ｗ／ｗ）からなる乳性発酵用ベース５０ｋｇを、７０℃に加温して、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌して、４０℃に冷却した。該殺菌した乳性発酵用ベースに、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株のバルクスターター１５０ｇと、ストレプトコッカス・サーモフィルスＦＥＲＭ Ｐ-１７２１６株のバルクスターター４５０ｇと、ラクトコッカス・ラクティスＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４６株のバルクスターター４５０ｇを接種し、３７℃で４時間培養して発酵乳を得た。該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、１００ｍＬ容の紙カップ容器に充填し、密封し、ヨーグルトを得た。得られたヨーグルトはｐＨ４．８０であり、４．５×１０７ＣＦＵ／ｍＬのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＴＬ６株を含有していた。
In the same manner as in Example 1, respective bulk starters of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis TL6 strain and Streptococcus thermophilus FERM P-17216 strain were prepared. On the other hand, 1000 g of 10% (w / w) reduced skim milk medium was sterilized at 90 ° C. for 30 minutes, 30 g of Lactococcus lactis FERM BP-10746 strain was inoculated, and cultured at 25 ° C. for 16 hours to prepare a bulk starter did.
Separately from this, raw materials such as skim milk powder, cream and milk protein are mixed and dissolved, and the milkiness is composed of 3.0% (w / w) milk fat and 12.0% (w / w) non-fat milk solid content. 50 kg of the fermentation base was heated to 70 ° C., homogenized at a pressure of 15 MPa, sterilized at 90 ° C. for 10 minutes, and cooled to 40 ° C. 150 g of a bulk starter of Lactobacillus delbrucky subspecies lactis TL6 strain pre-cultured as described above and 450 g of a bulk starter of Streptococcus thermophilus FERM P-17216 were preliminarily cultured as described above. , 450 g of a bulk starter of Lactococcus lactis FERM BP-10746 strain was inoculated and cultured at 37 ° C. for 4 hours to obtain fermented milk. The fermented milk was immediately stirred and cooled, filled into a 100 mL paper cup container, and sealed to obtain yogurt. The obtained yogurt had a pH of 4.80 and contained 4.5 × 10 7 CFU / mL of Lactobacillus delbruecki subspecies lactis strain TL6.
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及び、本発明の発酵食品の製造方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスの増殖を顕著に抑制することができ、かつ、風味の良好な発酵食品等を簡便に製造することができるため、虫歯の予防や治療のオーラルケア分野や発酵食品等の製造分野で利用が可能である。 By the Lactobacillus delbrucky subspecies lactis of the present invention and the method for producing a fermented food of the present invention, the growth of Streptococcus mutans can be remarkably suppressed, and a fermented food having a good flavor, etc. Can be easily produced, and thus can be used in the oral care field for the prevention and treatment of dental caries and in the field of manufacturing fermented foods.
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