JP2007524667A - 脂質組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明はカチオン性カルジオリピン類縁体及び他の脂質種を含むトランスフェクション剤として使用するのに適する組成物を提供する。本発明の組成物は広範な種類のポリヌクレオチド種（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、プラスミド、ＲＮＡｉ種等）のトランスフェクションを容易にすることができる。更にまた、本発明のトランスフェクション剤は一次細胞培養並びに形質転換細胞のトランスフェクションを促進する場合に有効である。更にまた、本発明のトランスフェクション剤はインビトロ及びインビボの両方において使用するのに適している。本発明の組成物は、例えば種々の活性剤の送達、皮膚科用及び化粧品の用途、及び農業用途のような別の用途も有している。本発明は更に本発明の組成物に細胞を接触させることにより細胞内への活性剤の導入方法を提供する。本発明は更に、活性剤が抗腫瘍薬である本発明の組成物を用いることによる、新生物細胞の成育を抑制する方法、および、新生物疾患に罹患した患者を治療する方法を提供する。本発明は更に（ａ）カチオン性リポソーム及びＳｉＲＮＡｉを含む組成物を細胞に投与することによりＳｉＲＮＡｉを細胞に進入させて細胞内の遺伝子発現を抑制させること、および（ｂ）遺伝子の抑制を試験すること、を含む、遺伝子標的を確認するための方法を提供する。方法はまた蛍光／ルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体及びそのような類縁体を含む組成物を提供する。カチオン性カルジオリピン類縁体を用いることにより、本発明は動物内の脂質物質の遊走を追跡する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年１月７日出願の米国暫定特許出願第６０／５３５，０４２号の優先権を請求する。本出願はまた参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年３月２７日出願の米国暫定特許出願第６０／５５６，８４３号の優先権を請求する。本出願はまた参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年３月２９日出願の米国暫定特許出願第６０／５５７，２３２号の優先権を請求する。

本発明は脂質組成物及び特にトランスフェクション剤としてのその使用に関する。

ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、プラスミド、ＲＮＡｉ等）は治療薬としての潜在的用途を有する。例えば癌遺伝子にターゲティングされたアンチセンスオリゴヌクレオチドは癌のような新生物疾患において期待されている。例示される薬剤であるヒトｃ−ｒａｆ癌遺伝子のｍＲＮＡにターゲティングされたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）はｃ−ｒａｆＡＯＮと称されている。ｃ−ｒａｆＡＯＮは放射線抵抗性の腫瘍及び多発性骨髄腫の治療のために使用される抗腫瘍薬である。ｃ−ｒａｆＡＯＮはｍＲＮＡにハイブリダイズして翻訳、タンパク質合成及び腫瘍生育を抑制することにより作用する。治療上の利益を有するポリヌクレオチドの他の例は癌遺伝子のような目的の遺伝子の発現を同じく抑制することができるＲＮＡｉを含む。目的の遺伝子を含有するプラスミド又は他のベクターもまた患者への目的のトランスジーンを送達することが可能であることにより治療薬としての潜在性を有する。

治療薬としての潜在性が期待される一方、その負荷電のために、薬剤は効率的に細胞膜を貫通して細胞をトランスフェクトすることができない。即ち、細胞トランスフェクションを向上させ、ポリヌクレオチドの治療効果を増大させるためには送達系が必要である。オリゴヌクレオチドの送達を増強させるためのカチオン性のリポソームの使用が報告されている（米国特許第６，５５９，１２９Ｂ１号および６，３３３，３１４Ｂ１号、Ｚｅｌｐｈａｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，７（１）：３１−４９（１９９７））。しかしながら、現在のカチオン性脂質トランスフェクション剤に関してはトランスフェクション剤としてのその有用性を制限する幾つかの難点が存在している。

例えば多くのカチオン性脂質は化学的安定性が低い。更に多くのカチオン性脂質を含むリポソームは、カチオン性２層膜の非柔軟性に概ね起因してポリヌクレオチドの担持力が乏しい。従って多くの現在使用可能なトランスフェクション剤はポリヌクレオチドの種々の型（ＤＮＡおよびＲＮＡｉ）によるトランスフェクションに適していない。更にまた、大半の使用可能なトランスフェクション剤、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）は一次細胞培養物をトランスフェクションする場合には有効ではない。更にまた多くのカチオン性トランスフェクション剤、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）は自体をインビボの使用に不適とする比較的高値の毒性を示す。上記に鑑みて、効果的なトランスフェクション剤の必要性がなお存在する。

医療技術が直面する問題は遺伝子的抑制又は治療的介入のための標的の確認である。特定の疾患の原因として、又は、それに関連するものとして標的遺伝子を確認するための典型的な方法は動物の系統から目的の遺伝子を除去して動物モデルを作成することである。これを達成するための一般的な方法は典型的にはげっ歯類のノックアウト動物を作成することである。しかしながら、この方法は負担が大きく、費用がかかり、使用可能となるまで時間を要する。当然ながら、特定の疾患にとって重要である多くの遺伝子が動物の正常な発達にとって重要であるため、ノックアウトを作成することは常時可能であるわけではない。更にまた、多くの遺伝子が正常な生理状態並びに疾患の発症に寄与しているため、ノックアウト動物が標的遺伝子の確認のための適当なモデル又は系として機能することを「補償効果」が妨害する場合がある。従って、疾患又は表現型に寄与するものとして標的遺伝子を確認する効果的な方法がなお必要とされている。

本発明はカチオン性カルジオリピン類縁体及び望ましくは他の脂質種を含むトランスフェクション剤として使用するのに適する組成物を提供する。本発明の組成物は広範な種類のポリヌクレオチド種（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、プラスミド、ＲＮＡｉ種等）のトランスフェクションを容易にすることができる。更にまた、本発明のトランスフェクション剤は一次細胞培養物並びに形質転換された細胞のトランスフェクションを促進する場合に有効である。また、本発明はインビトロ及びインビボの両方における使用に適している。本発明の組成物は種々の活性剤の送達、皮膚科及び化粧品用途及び農業用途のような別の用途も有する。

好ましいカチオン性カルジオリピン類縁体（ＣＣＬＡ）は１，３−ビス−（１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロピル−３−ジメチルエトキシアンモニウムブロミド）−プロパン−２−オール（ＰＣＬ−２）である。組成物は更に好ましくはコレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、αトコフェリル酸スクシネートおよび何れかの他のホスファチジルコリンからなる脂質群から選択される脂質を含む。組成物は活性剤、例えばポリヌクレオチドを含むことができる。本発明はまたｃ−ｒａｆの医薬品製剤を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｃ−ｒａｆＡＯＮ）及び血漿中のｒａｆ−ＡＯＮの急速な加水分解を最小限にするための抗真性物剤の安定なラメラ構造の複合体を作成するための方法は、インビボクリアランスを低減し、細胞のトランスフェクションを向上させ、そして、ｃ−ｒａｆＡＯＮの治療効果を増大させる。

本発明は更に本発明の組成物に細胞を接触させることにより細胞内への活性剤の導入方法を提供する。本発明は更に、活性剤が抗腫瘍薬である本発明の組成物を用いることによる、新生物細胞の成育を抑制する方法、および、新生物疾患に罹患した患者を治療する方法を提供する。本発明は更に（ａ）カチオン性リポソーム及びＲＮＡｉを含む組成物を細胞に投与することによりＲＮＡｉを細胞に進入させて細胞内の遺伝子発現を抑制させること、および（ｂ）遺伝子の抑制を試験すること、を含む、遺伝子標的を確認するための方法を提供する。

本発明はまた蛍光カチオン性カルジオリピン類縁体及びそのような類縁体を含む組成物を提供する。カチオン性カルジオリピン類縁体を使用することにより、本発明は動物内の脂質物質の遊走を追跡する方法を提供する。本発明は更にルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体及びそのような類縁体を含む組成物を提供し、これは、蛍光類縁体よりも高値の崩壊時間を要する測定において有用となる。

本発明の上記及び他の利点並びに別の本発明の特徴は本明細書に記載する本発明の説明より明らかになる。

１つの実施形態において、本発明はカチオン性カルジオリピン類縁体（ＣＣＬＡ）及び望ましくは別の脂質種を含む組成物を提供する。本発明の組成物において使用するために適するカチオン性カルジオリピン類縁体は参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／３３０９９に記載されている。本発明の組成物に含有させるために最も好ましいカチオン性カルジオリピン類縁体（ＣＣＬＡ）は１，３−ビス−（１，２−ビステトラデシルオキシ−プロピル−３−ジメチルエトキシアンモニウムブロミド）−プロパン−２−オール（ＰＣＬ−２）であり、これはＰＣＴ／ＵＳ０３／３３０９９においては化合物１９として確認される。

本発明はまた蛍光及び／又はルミネセントのカチオン性カルジオリピン類縁体を提供する。例えば蛍光類縁体は蛍光部分にコンジュゲートした化合物１９としてのカチオン性カルジオリピン分子（例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／３３０９９に記載のもの）を含むことができる。蛍光部分の例はフルオレセイン誘導体、例えば［Ｎ−（５−フルオレセイニル）−５−カルバミルペンタン酸］等、２，１，３−ベンゾオキサジアゾール誘導体、クマリン誘導体、例えば３−ブロモアセチル−６，７−メチレンジオキシクマリン、４−（７−ジエチルアミノクマリン−３−イル）ベンゼンイソチアネート等、４−（４，５−ジフェニル−１Ｈ−イミダゾ−２−イル）ベンゾイルクロリド、２−ダンシルエチルクロロホルメート、５−（５，６−ジメトキシ−２−フタルイミジニル）−２−メトキシフェニルスルホニルクロリド等を含む。好ましい蛍光類縁体はＰＣＬ−２の蛍光類縁体である。蛍光カチオン性カルジオリピン類縁体はカチオン性の脂質のような分子に蛍光部分をコンジュゲートするための何れかの適当な方法により構築でき、それらの多くは当分野で既知である。ルミネセント類縁体もまた当業者が合成できる。蛍光又はルミネセント類縁体は本発明において使用できる。

本発明の蛍光及びルミネセントのカチオン性カルジオリピンを用いてカチオン性カルジオリピンリポソームの通路／位置を追跡できる。本発明の蛍光及びルミネセントのカチオン性カルジオリピンはまた種々の組織におけるリポソームの取り込み及び遺伝子送達の分布を調べるために使用できる。また本発明の蛍光及びルミネセントのカチオン性カルジオリピンは細胞内部の遺伝子の送達の機序を調べるために使用できる。

本明細書においては何れかの適当な量のカチオン性カルジオリピン類縁体（ＣＣＬＡ）を組成物中に使用でき、望ましくはカチオン性カルジオリピン類縁体ＰＣＬ−２は約０．３ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば約１ｍＭ〜約１５ｍＭで存在するが、組成物は所望によりより大量又は少量のカチオン性カルジオリピンＰＣＬ−２を含むことができる。特定の好ましい組成物においては、カチオン性カルジオリピンＰＣＬ−２は約０．３５ｍＭで存在する。

望ましくは、組成物は更にカチオン性カルジオリピン類縁体のほかに少なくとも１つの脂質を含む。別の脂質はＰＣＴ／ＵＳ０３／３３０９９に記載されているもののような目的の組成物を形成するために適する何れかの望ましい脂質種であることができる。本発明の組成物に含有させるための好ましい脂質はコレステロール、コレステロール誘導体、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、αトコフェリル酸スクシネートおよび何れかの他のホスファチジルコリンからなる脂質群から選択される。典型的には、組成物の総脂質濃度は約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ（例えば少なくとも約５．０ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ又は更には少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬそして約５０ｍｇ／ｍＬまで、又は約４０ｍｇ／ｍＬまで又は更には約３０ｍｇ／ｍＬまで）であるが、所望により上記した量より高値又は低値であることができる。

本発明により最も好ましい組成部はＤＯＰＣ、カチオン性カルジオリピンＰＣＬ−２及びコレステロールを含む。この組成物において、カチオン性カルジオリピン類縁体、ＤＯＰＣおよびコレステロールは何れかの適当な比率で存在できる。しかしながら、このような組成物は好ましくはＤＯＰＣ：ＰＣＬ−２：コレステロールのパーセントモル比が約（５０〜６５）：（２５〜３５）：（５〜２０）である。更にまた、望ましくはこのような組成物は更にＤ−αトコフェリル酸スクシネートを含む。Ｄ−αトコフェリル酸スクシネートは組成物中何れかの適当な量で存在できるが、望ましくは約０．１重量％〜約１重量％、最も好ましくは約０．２重量％で存在する。しかしながらＤ−αトコフェリル酸スクシネートの量は所望によりこれらの量より高値又は低値であることができる。

本発明の別の好ましい組成物はカチオン性カルジオリピンＰＣＬ−２及びコレステロールを含む。このような組成物において、カチオン性カルジオリピン及びコレステロールは何れかの適当なモル比で存在できる。しかしながら、望ましくはＰＣＬ−２及びコレステロールのモル比は１：３〜６：１、例えば１：３〜３：１、又は２：３〜３：２、更には１：２〜２：１である。

本発明の別の好ましい組成物はＰＣＬ−２及びＤＯＰＥを含む。このような組成物において、カチオン性カルジオリピン及びＤＯＰＥは何れかの適当なモル比で存在できる。しかしながら望ましくは、ＰＣＬ−２及びＤＯＰＥのモル比は１：３〜６：１、例えば１：３〜３：１、又は２：３〜３：２、更には１：２〜２：１である。

カチオン性カルジオリピン及び他の脂質のほかに、組成物は安定化剤、吸収増強剤、抗酸化剤、リン脂質、生体分解性の重合体及び医薬活性剤を他の成分と共に含むことができる。適当な抗酸化剤はアスコルビン酸、トコフェロール及びデテロキシムメシレートのような化合物を含む。適当な吸収増強剤はＮａ−サリシレート−ケノデオキシコレート、Ｎａデオキシコレート、ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル、ケノデオキシコレート−デオキシコレート及びポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル、モノレイン、Ｎａタウロ−２４，２５−ジヒドロフシデート、Ｎａタウロデオキシコレート、Ｎａグリコケノデオキシコレート、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸を含む。重合体吸収増強剤、例えばポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレン１０−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン１６−ラウリルエーテル及びアゾン（１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン）もまた含むことができる。

一部の実施形態においては、本発明の組成物、特にリポソーム組成物はターゲティング剤、例えば炭水化物又はタンパク質、又は特定の基質、例えば抗体（又はそのフラグメント）に結合する他のリガンド、又は細胞受容体を認識するリガンドを含むことが好ましい。このような物質（例えば炭水化物、又は、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ペプチドホルモン、受容体リガンド、例えば細胞受容体に対する抗体及びこれらの混合物からなるタンパク質群から選択されるタンパク質１つ以上）を含ませることは、所定の組織又は細胞型に対して組成物をターゲティングしやすくする。

好ましい実施形態においては組成物は糖又は生体分解性重合体少なくとも１つを含む。適当な糖及び重合体の例は、スクロース、乳糖、トレハロース、デキストロース、エピクロロヒドリン、スクロースの分枝鎖親水性重合体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、メトキシポリエチレングリコール、エトキシポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ポリビニルピロリドンポリピロリドン、デキストラン、セルロースアセテート、アルギン酸ナトリウム、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアセテート、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンＸ−ラウリルエーテル、ただしＸは９〜２０のもの、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルを含む。本発明の組成物に含ませる好ましい糖はスクロースである。糖または重合体が存在する場合は、それは典型的には、組成物の約１重量％〜約２０重量％、例えば約５重量％〜約３０重量％に相当する。特に糖がスクロースである場合は、組成物中に含有する当の適当な量は１０〜１２重量％である。更にまた、組成物はまた生理学的に許容される担体のような担体を含むことができる。生理学的（例えば医療用、家畜用、実験用等）な用途に対して適当な担体は生理学的に適合性のある緩衝液（例えばリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ等）であり、これらの多くは当分野で既知である。

組成物は典型的には約３〜約８のｐＨを有する。しかしながら、組成物のｐＨはその所望の用途に応じて大きく変動する。所望の用途に適するｐＨの選択は当業者のよく知る通りである。即ち、一部の実施形態においては、組成物のｐＨは酸性（例えば約２〜約６．９、例えば約３〜約６、又は約４〜約５）に調節することができる。別の用途においては組成物のｐＨはアルカリ性（例えば約７．１〜約１１、または約８〜約１０、例えば約９）であることが望ましい場合がある。組成物のｐＨは当業者に既知の通り、適当な酸性又はアルカリ性の緩衝液を用いて調節できる。

組成物は何れかの適当な形態、例えばリポソーム製剤、複合体、乳液、懸濁液等であることができる。このような製剤は組成物の型に応じて何れかの適当な手法により調製することができ、これらは当業者のよく知る通りである。好ましい組成物はリポソーム組成物又は脂質小胞を含有する他の組成物である。このような組成物は単層ラメラ又は多層ラメラ構造の小胞、又はそれらの混合物を含む。何れかの適当な手法を用いてこのようなリポソーム製剤を製造することができる。適当な手法は薄膜水和法、逆相蒸発法、エタノール注入法等を含む。例えば、親油性のリポソーム形成成分を適当な溶媒又は溶媒の組合せに溶解又は分散させ、乾燥させる。適当な溶媒は薬学的に許容されない残留物を残存させること無く蒸発させることができるｔ−ブタノール、エタノール、メタノール、クロロホルム又はアセトンのような何れかの非極性又は僅かに極性の溶媒を含む。乾燥は何れかの適当な手段、例えば凍結乾燥、ロータリードライヤーの使用等によることができる。親水性の成分、例えば一部の薬品、保存料及び他の薬剤は、極性溶媒、例えば水に溶解することができ、そしてこれを乾燥前又は希釈再調製時に脂質相と混合することができる。乾燥した親油性の成分と親水性の混合物の混合によりリポソームが形成できる。極性溶液と乾燥脂質膜の混合は混合物を強力にホモゲナイズする何れかに手段により行うことができる。回転混合、磁気攪拌及び／又は超音波処理によりホモゲナイズできる。

活性剤がリポソームに含まれる場合は、それらは適当な溶媒に溶解又は分散させ、そして混合前にリポソーム混合物に添加することができる。典型的には、親水性の活性剤は極性溶媒に直接添加し、疎水性の活性剤は他の成分の溶解に使用される非極性溶媒に添加するが、これは必須ではない。活性剤は第３の溶媒又は溶媒混合物に溶解し、極性溶媒と脂質膜の混合物に添加した後に、混合物をホモゲナイズすることができる。

本発明のリポソームは特定の組成物及びそれを製造する操作法に応じて多層ラメラ又は単層ラメラ構造の小胞であることができる。リポソームは選択されたサイズの範囲内で実質的に均質なサイズを有するように調製でき、例えば約１ミクロン以下、又は約５００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下又は約１００ｎｍ以下である。粒径はリポソームの生体分布及び細胞侵入の経路において重要な役割を果たすことが解っている。より大型のリポソームは主に網内皮細胞（ＲＥＳ）系に分布し、他の組織中は無視できる量となるが、より小型の他の臓器に局在する。更にまた、不均質な粒径分布の多層ラメラ構造の小胞のクリアランスは２相性のパターンを示し、より大型のリポソームはクリアランスが急速であり、小型リポソームのクリアランスは緩徐な速度である。オリゴヌクレオチドを含有するカチオン性リポソームの生体分布に関しては情報が限定されている。Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒらは以前に直径約２．０ミクロンのカチオン性リポソームと複合体化したオリゴヌクレオチドが一過性に肺により取り込まれ、後に肝臓に急速に分布したことを報告している。最近の試験によれば、カチオン性リポソームを介したオリゴヌクレオチドの送達のための主要な経路はエンドサイトーシスであることが明らかになっている。好ましくは本発明のリポソームのラメラ複合体の形成では小型のリポソームを含むことにより、活性剤のクリアランス速度を緩徐化する。１つの効果的なサイジングの方法は選択された均一な孔径を有するポリカーボネート膜のシリーズを通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含み；膜の孔径はその膜を通して押し出すことにより製造されるリポソームの最大のサイズに概ね相当する。生理学的使用のためには、リポソームを０．２２μｍ以下のフィルターから押し出すことにより製剤の滅菌を行う。望ましくは、リポソームの平均の大きさは約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば約１００ｎｍ〜約２００ｎｍ、又は約１５０ｎｍ〜２５０ｎｍである。好ましくは、リポソームの粒径分布は実質的に均一である。更に、調製毎に望ましくはリポソームの約９９％が約５０ｎｍ未満の直径を有し（即ち約５００ｎｍ未満のＤ９９）、そして、望ましくは本発明のリポソーム組成物のＤ９９は約１７０ｎｍ〜約５００ｎｍ、例えば約２００ｎｍ〜約３５０ｎｍ、又は約２５０ｎｍ〜約３００ｎｍである。

好ましい製造プロトコルは、ｉ）脱水エタノール中の脂質賦形剤、即ちＤＯＰＣ、コレステロール、ＰＣＬ−２及びＤ−αトコフェリル酸スクシネート、およびｉｉ）活性成分、即ちポリヌクレオチド（図１においてｃ−ｒａｆ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドとして示す）及びスクロースを、注射用滅菌水に溶解すること、を含む。エタノール性の脂質溶液を水性の活性物質溶液に添加してリポソームを形成する。バッチサイズに応じて所望の重量まで生成物の重量を増大させる目標となるバッチ重量とするのに十分な量（ＱＳ）に従って、リポソームは０．２μ孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを通して３回、０．１μ孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを通して５回押し出すことによりサイズ減少させることにより、サイズの仕様を満足させる。添加したエタノールは真空下にロータリーエバポレーターで蒸発させることにより押し出されたリポソームから除去する。注射用滅菌水を用いて生成物重量を溶媒除去前の重量に合わせた後、生成物を０．２２μ滅菌フィルターで濾過し、滅菌バイアルに充填し、蓋をして密封する。この方法を用いて１０〜２０キログラムの規模の製剤を製造する。

本発明の組成物は安定であることがわかっている。この意味において、組成物は冷蔵及び室温において長時間保存できる。一般的に、組成物は少なくとも約２ヶ月このような条件下で安定である。安定性は所望の時間枠に渡って組成物の成分の変化を測定することにより評価できる。例えば、組成物は、室温又は冷蔵において２ヶ月の後、組成物が初期に製剤した時点で存在したカチオン性カルジオリピン（例えばＰＬＣ−２）の量の少なくとも約７０〜１１０％を含んでいれば安定とみなすことができる。製剤は製品の有効期間中に失われた活性部分が１０％以下であれば安定とみなされる。

リポソーム（又は他の脂質）の組成物又は製剤は何れかの所望の形態であることができる。例えば医薬品としての使用の場合は、組成物はそのまま患者に投与できる。そのような組成物がリポソーム又は他の型の脂質小胞を含有する場合は、そのような製剤は典型的には水性媒体（例えばエタノールおよび注射用水）中の小胞の形態とする。或いは、製剤は乾燥又は凍結乾燥された形態であることができ、このような場合は、組成物は好ましくは低温保護剤も含む。適当な低温保護剤は例えば糖、例えばトレハロース、麦芽糖、乳糖、スクロース、グルコース及びデキストランを含み、性能の観点から最も好ましい糖はトレハロース及びスクロースである。他のより複雑な糖類、例えばアミノグリコシド、例えばストレプロマイシン及びジヒドロストレプトマイシンもまた使用できる。

本発明のカチオン性カルジオリピンを含む本発明の組成物は種々の用途、例えばヒト又は動物（典型的には脊椎動物）の患者、植物又は培養細胞に対する活性剤、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子及び他の活性剤のインビボ又はインビトロの送達において使用できる。このような使用を容易にするためには組成物はカチオン性カルジオリピン種、他の脂質及び他の成分のほかに、少なくとも１つのこのような活性剤を含むことができる。組成物は例えばインビトロ又はインビボの何れかで細胞内に物質を送達するためのリポソームまたは脂質小胞の使用を含む何れかの操作法において使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２６４，６１８号）。組成物はまた例えば皮膚科用製剤として化粧品的な使用もできる。従って、組成物は所望の最終用途に応じた使用のために製剤できる。

本発明の組成物に含ませるために最も好ましい活性剤はポリヌクレオチドであり、これはＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡの混合物であることができる。治療用のポリヌクレオチドの例は、リボザイム、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ配列を含み、これらは細胞内の所望の配列、例えば疾患状態に関連する遺伝子（例えば癌遺伝子又はウィルス遺伝子）をターゲティングすることができる。望ましくは本発明の組成物中で使用するためのポリヌクレオチドは細胞内の特定のヒトｍＲＮＡにハイブリダイズし、そして更にターゲティングされたｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの結果として遺伝子発現を抑制する。例えばポリヌクレオチドはｒａｓ、ｒａｆ ｃｏｔ、ｍｏｓ、ｍｙｃ等のような癌遺伝子に対してターゲティングさせることができ、そして好ましくはヒトｃ−ｒａｆ遺伝子にターゲティングされる。治療用のリボザイム、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ配列を用いてターゲティングするための他の好ましい遺伝子はウィルス遺伝子、特にＨＩＶ遺伝子、例えばｒｅｖ転写活性化物質を含む。他の実施形態においては、治療用ポリヌクレオチドは疾患状態では非存在又は突然変異しているものであることができ、又は、疾患状態において欠損又は非存在である遺伝子産物をコードすることができる。他のポリヌクレオチドは治療用ポリペプチド、例えば免疫原性ペプチド（ワクチンとして使用できる）、天然ホルモン又は天然のホルモンの合成の類縁体をコードすることができる。

本発明の組成物中で使用するための好ましいポリヌクレオチドは５〜５０量体のアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくは１０〜４０量体の配列、より好ましくは１５〜２５量体の配列であって、目的の特定の遺伝子にターゲティングされているものである（例えば配列５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’を有する１５量体の抗ｃ−ｒａｆ−１オリゴヌクレオチドを開示している米国特許第６，１２６，９６５号を参照）。別の適当な抗ｒａｆオリゴデオキシリボヌクレオチド配列は当分野で知られており、そして本発明の内容において適宜使用できる（例えば米国特許第６，０９０，６２６号、６，１２６，９６５号、６，３３３，３１４号、６，４１０，５１８号及び国際特許出願公開ＷＯ９４／１５６４５及び９４／２３７５５参照）。オリゴヌクレオチドを組成物に含ませる場合は、それらは好ましくはホスホチオエート結合１つ以上、好ましくはホスホチオエート結合２つを含む。最も好ましくは本発明の組成物に含ませるオリゴヌクレオチドは各末端にホスホチオエート結合１つを含有するが、それらはオリゴヌクレオチドの一端から他端までの何れかの位置（例えば両末端の間）に存在できる。

本発明の最も好ましい組成物は配列５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’を有する１５量体の抗ｃ−ｒａｆ−１オリゴヌクレオチド、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、新しい正荷電のリン脂質１，３−ビス−（１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロピル−３−ジメチルエトキシアンモニウムブロミド）−プロパン−２−オール（ＰＣＬ−２）及び安定化剤としてのコレステロール、抗酸化剤としてのＤ−αトコフェリル酸スクシネート、浸透圧調節剤としてのスクロース及び溶媒としてのエタノール及び注射用水を含有する。この組成物は２ｍｇ／ｍＬのｒａｆＡＯＮ（バイアル当たり５０ｍｇ ｒａｆＡＯＮ）を含有する滅菌液体として提供することができる。各バイアルを５％デキストロースＵＳＰで２倍希釈することにより１ｍｇ／ｍＬのｒａｆＡＯＮリポソーム製剤とする。投与前に更に５％デキストロースＵＳＰで８倍まで希釈してよい。

本発明の組成物で使用するための別の好ましいポリヌクレオチドはＲＮＡｉ種である。ＲＮＡｉ技術は細胞遺伝子の活性を抑制する有効な方法を提供する。ＳｉＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は第１の相補鎖及び第２の相補鎖を含む２本鎖構造を有するＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）である。２本鎖ＲＮＡは約２０〜２６ヌクレオチド長、好ましくは２１又は２３ヌクレオチドを含む。ｄｓＲＮＡの最初の２本鎖の各々は５’末端及び３’末端を有する。ｄｓＲＮＡの各鎖は１〜４ヌクレオチドハングオーバー、好ましくは２ヌクレオチドを３’末端に有する。ハングオーバーヌクレオチドは典型的にはチミジン又はウリジンを含む。ｓｉＲＮＡ内において、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の第１の鎖はその配列の少なくとも部分において標的配列に相当するヌクレオチド配列を有する（例えば標的遺伝子の標的ｍＲＮＡ転写物部分）。ｄｓＲＮＡの第２の鎖はｄｓＲＮＡの第１の鎖に相補的である。望ましくは標的配列は本明細書に記載するもののような癌遺伝子（好ましくはｃ−ｒａｆ−１）に相当するが、何れかの所望の標的遺伝子であることができる。特定の遺伝子をターゲティングするための適当なＲＮＡｉを構築することは当業者のよく知る通りである。望ましくはｄｓＲＮＡは化学合成により製造される。

本発明に従ってＲＮＡｉでターゲティングされるべき遺伝子は所望の最終用途に応じていずれかの所望の種から選択できる。即ち、例えば、組成物は作物植物のような植物の遺伝子、又は、植物又はカビの寄生虫又は病原体の遺伝子をターゲティングすることにより農業用途において使用できる。同様にＲＮＡｉは動物の遺伝子、例えばペット（例えばネコ、イヌ等）、一般的家畜類（例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、家禽類（例えばニワトリ、シチメンチョウ又は狩猟鳥）又は毛皮用の動物、例えばミンク、クロテン、キツネ等のものをターゲティングさせることができる。ターゲティングされるべき遺伝子はまたこのような種の寄生虫又は病原体（例えば細菌又はウィルス病原体）であることもできる。

技術はまたヒト遺伝子をターゲティングすることにより医療上の用途に使用できる。好ましい実施形態においては、ターゲティングすべき遺伝子（例えばオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡによる）はヒト又は動物の癌遺伝子、例えばｒａｓ、ｒａｆ ｃｏｔ、ｍｏｓ、ｍｙｃ等である。最も好ましくは、ターゲティングすべき遺伝子はｃ−ｒａｆ−１である。このような遺伝子の配列は公開されており、当業者は特に実験を行うことなくこのような遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡを構築することができる。この点に関する指針は、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドによりこのような遺伝子を抑制することが良好に行えることにより更に供給される。本発明の内容において使用するためのｓｉＲＮＡ分子の例は以下のものを含む。

一部の実施形態においては、組成物は本明細書に記載のものや当分野で既知である活性剤複数を含むことが好ましい。例えば本発明の組成物は望ましくは上記した通り少なくとも１つの核酸種（例えばオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ等）を含むが、組成物はこのような種１つより多くを含むこともできる。例えば本発明の組成物は複数のオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ種又はその混合物を含むことができる。この点に関し、好ましい実施形態においては、本発明の組成物内に存在する少なくとも２つの活性剤が核酸を含む。例えば所望により該核酸の少なくとも一方がｓｉＲＮＡ種、オリゴヌクレオチド又は核酸の別の種であることができる。核酸は遺伝子配列をターゲティング（例えばＲＮＡｉ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの抑制のような抑制のため）するが、組成物中に存在する第１及び第２の核酸種は個別の遺伝子配列をターゲティングするように設計することもできる。このような個別の標的配列は個別の遺伝子内に存在することができ、これにより標的細胞内の複数の遺伝子の抑制を容易にすることができる。或いは、又は更に加えて、個別の標的配列が同じ遺伝子内に存在することもできる。このような実施形態においては、組成物中の核酸の抑制の種々の種の複合的作用が標的遺伝子の発現を低減する能力を増強することができる。

望ましくは、ポリヌクレオチドを本発明の組成物内に含む場合は、カチオン性の脂質：ポリヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡｉ等）のそれぞれの電荷の比は（１〜４）：１の範囲、例えば２：１〜３：１である。ＰＣＬ−２は２正電荷を有するため、全体的な脂質：薬剤のモル量は以前に報告されているカチオン性のリポ製剤よりも本発明においては低減することができる。望ましくはそれぞれの総脂質のポリヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡｉ等）に対するモル量は約１０：１〜約２００：１、例えば約２０：１〜約１５０：１又は約５０：１〜約１００：１である。組成物がリポソームである場合は、望ましくは少なくとも約４０％及びより望ましくは少なくとも約５０％のポリヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡｉ等）をリポソームの内部コア内のカチオン性脂質と複合体化する。典型的には約６０％〜約８０％のポリヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡｉ等）をリポソームの内部コア内のカチオン性脂質と複合体化し、そして約４０〜約２０％のポリヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡｉ等）を膜の外部表面上とする。しかしながら、一部の実施形態においては、より高値（例えば約９０％又は更には約９５％）のポリヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡｉ等）をリポソームの内部コア内のカチオン性脂質と複合体化することができる。高いリポソーム内捕獲により製剤からのｃ−ｒａｆＡＯＮの除放性が可能となる。

組成物内のポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）が癌遺伝子をターゲティングする場合は、本発明はそのような組成物を用いた新生物細胞の成育を抑制する方法を提供する。本発明の方法によれば、組成物はポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）が細胞内に侵入するための条件下においてこのような細胞に投与される。細胞内においては、ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）はそれがターゲティングしている癌遺伝子の活性を抑制し、これによりそのような新生物細胞の成育が抑制される。この点に関し、「抑制」とはこのような細胞の成育又は増殖の完全な停止を必要としない。方法は新生物の生育を遅延させれば十分である。しかしながら、新生物細胞の増殖は実質的に低減されるか、更には消失することが望ましい。

新生物細胞に対抗して使用する場合、方法はインビボ又はインビトロで細胞に対して使用できる。インビトロの適用については、方法は例えば新生物性の生育は増殖を調べる研究において使用できる。インビボの適用もまた本発明の方法に基づく治療法の開発において使用できる。このような適用のためには、組成物は細胞の培養用の培地に添加するか、又は一般的な脂質系のトランスフェクション剤（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））と同様の様式において使用できる。

インビボで使用する場合は、本発明の方法は感染性の疾患（例えば細菌感染症、ウィルス感染症等）、自己免疫疾患（例えば癌）に罹患した患者を治療するために使用できる。好ましくはこのような実施形態においてはカチオン性カルジオリピン類縁体及び癌遺伝子をターゲティングしているポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）を含む組成物が、ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）が患者の新生物細胞内に侵入するために十分な条件下で患者に送達する。細胞内においてはポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）は癌遺伝子の発現又は活性を抑制し、これにより患者内の新生物細胞の成育が抑制される。細胞は例えば癌細胞であることができ、そして腫瘍内にあるか、又は、転移することができる。

上記した通り、本発明の方法はそのような細胞の成育又は増殖を遅延させれば十分である。本発明の方法が患者から新生物細胞を完全に排除する必要はない。むしろ、本発明の方法は患者内の新生物細胞の生育又は増殖を遅延させれば十分である。好ましくは本発明の方法は新生物細胞の生育を実質的に抑制し、そして一部の実施形態においては、本発明の方法は腫瘍の後退又は患者からの新生物細胞の排除をもたらす場合がある。

本発明の方法によればポリヌクレオチドを含む組成物は第２の抗腫瘍薬と組み合わせて使用できる。そのような第２の抗腫瘍薬は例えば化学療法剤、放射線源、遺伝子療法ベクター又は他の抗腫瘍薬であることができる。このような化学療法剤の特定の例はカンプトテシン（例えばＳＮ−３８、イリノテカン等）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、タモキシフェン、トレミフェン、シスプラチン、エピルビシン、ドセタキサール、パクリタキセル、ゲムザー、塩酸ゲンシタビシン、ミキソタントロン及び癌の治療のために有用な他の知られた化学療法剤を含む。組み合わせて使用する場合は、本発明の組成物は第２の抗腫瘍薬の前、同時又は後に送達することができる。しかしながら、使用されれば本発明の組成物は第２の抗腫瘍薬の薬効を増強できる。即ち、本発明は化学療法剤の作用に対して腫瘍を化学感受性にするために使用できる。同様に、本発明は放射線の作用に対して腫瘍を放射線感受性とするために使用できる。この点に関し、カチオン性カルジオリピン類縁体及びポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）を含む組成物の使用を行う本発明の方法は、複合治療方法の薬効に寄与すれば十分である。

別の実施形態においては、本発明は遺伝子抑制のための標的を確認するための方法を提供する。本発明のこの態様によれば、特定の遺伝子にターゲティングされたポリヌクレオチドを含む本発明の組成物はポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）が細胞に進入するための条件下に目的の標的遺伝子を発現する細胞に投与する。細胞内においてポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｉ又はオリゴヌクレオチド）はそれがターゲティングされている遺伝子の活性を抑制する。その後、遺伝子の抑制作用を試験する。

遺伝子抑制のための標的を確認する方法は研究の性質に応じてインビトロ又はインビボの細胞を用いて実施できる。標的遺伝子の抑制の作用を評価するために実施する試験は、例えばターゲティングされた遺伝子のＲＮＡ又は発現されたタンパク質の存在又はレベルをプロービングすることにより、定量的であることができる。この意味において、標的遺伝子ＲＮＡのレベルの低下、又は、目的のコードされたタンパク質の発現の低下はオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ又は他の遺伝子発現の抑制剤の標的を確認するために機能することができる。代替となる試験は挙動又は表現型であることができる。例えば組成物を動物又は動物内の組織に投与し、そして動物をモニタリングすることにより挙動又は表現型の変化を評価することができる。この意味において、例えば、推定される食欲調製遺伝子の遺伝子抑制剤を含む組成物を動物に投与し、そして、動物の食欲に対する抑制の作用を観察することにより、食欲を媒介する遺伝子を確認することができる。遺伝子発現の抑制と動物の挙動変化の間の正の相関は標的の確認として機能することができる。この方法は治療介入のための標的を迅速に発見して確認することができる。伝統的には、確認の方法は費用と時間がかかり、例えばノックアウト動物のような動物モデルの作成を必要とする。これとは対照的に本発明の方法は細胞又は動物内の推定される標的遺伝子の発現をはるかにより迅速かつ容易に抑制することができ、これは標的の確認の過程を加速し、単純化することができる。

組成物が蛍光又はルミネセントのカルジオリピン類縁体（又は他の蛍光又はルミネセントの部分）を含む場合は、本発明は、動物、植物又は他の所望の系の内部の組成物の遊走を追跡する方法を提供する。本発明のこの態様によれば、蛍光又はルミネセントの部分を含む本発明の組成物を動物、植物又は他の所望の系に導入する。導入直後又は所望の時間経過の後、光、Ｘ線又は他のイオン化放射線照射により蛍光又はルミネセンスをモニタリングすることができる。これはリアルタイムの観察又は写真撮影による検出により測定できる。方法は動物、植物又は他の所望の系の内部の脂質組成物の遊走を注視するために使用できる。方法は例えば脂質組成物が濃縮される部位を同定するために機能する。これはターゲティング部分が組成物中に存在すればその有効性を評価するという機能を有する。更にまた、方法は動物、植物又は他の所望の系の内部の組成物の局所的濃度を測定する場合に利用できる。局所的な脂質の濃度はまた、目的の臓器組織又は血液の試料を採取し、蛍光又はルミネセンスの前に適当な薬品で処理することにより検出することもできる。このような情報は治療用組成物の局所濃度が関心対象である治療薬を設計して評価する場合に有用である。

当然ながら方法は反復して使用できる。この意味において、蛍光の初期検出の後、部分に再度蛍光を発生させ、その蛍光を再度検出する。これは組成物の経時的な位置変化を明らかにするために使用できる。このような情報は組成物が濃縮される組織の進行、特定の細胞型の遊走を追跡するために使用できる。或いは、方法は動物、植物又は他の所望の系からの組成物のクリアランスをモニタリングする場合に有用である。蛍光およびルミネセンスの方法の両方が用途に応じて有用となる。ルミネセンスの用途としては膜を通過する脂質の横方向の拡散の効果的なモニタリングのようなより高値の崩壊時間を要する試験が挙げられる。

別の態様において、本発明はトランスフェクション剤としての本明細書に記載の組成物の使用を包含する。即ち、組成物はポリヌクレオチドの所望の種又はライブラリと混合して細胞に送達することができる。本発明の組成物は所望のポリヌクレオチドを含み、そして本発明はインビボ及びインビトロで所望の細胞にポリヌクレオチドが進入するために十分な条件下に組成物にその細胞を曝露することによるそのようなポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトする方法を提供する。インビトロの用途については、組成物は細胞の培養用の培地に添加するか、又は一般的な脂質系のトランスフェクション剤（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））と同様の様式において使用できる。カチオン性カルジオリピン（特にＰＣＬ−２）を含む本発明の組成物の所望の量は一次培養であっても効果的なトランスフェクション剤として機能できるようなものであるのに対し、一般的に使用されているトランスフェクション剤は一般的には一次培養では有効ではない。更にまた、本発明の組成物を使用して細胞をトランスフェクトする方法はインビボで使用することができる。本明細書に記載の通り、方法は特定の遺伝子、特に癌遺伝子をターゲティングするポリヌクレオチドを送達するために使用できる。しかしながら、方法は何れかの所望のポリヌクレオチドでインビボの細胞をトランスフェクトするために使用できる。この目的のために本発明の組成物を使用することの利点は、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）及び他の脂質トランスフェクション剤で観察されるような実質的な毒性を伴うことなく目的のポリヌクレオチドを細胞に送達することができる点である。即ち、本発明は一次及び形質転換された細胞を含む、インビボ及びインビトロで使用することができるトランスフェクション剤を提供する。

本発明の多くの態様は動物、例えば家畜の患者又はヒトに対して組成物を送達することを含む。患者への送達のためには、組成物は何れかの適当な様式で供給できる。腫瘍への送達のためには、例えば組成物を腫瘍塊に直接注射するように製剤するか、腫瘍の循環系に注入することができる。或いは、組成物は所望により注射（例えば非経腸、静脈内等）によるか吸収（例えば経皮、経粘膜）により送達することができる。皮膚または粘膜組織に適する皮膚科用の調製品を適用できる。

以下の実施例はさらに本発明を説明するものであり、その範囲を限定するものではない。

実施例１
本実施例は遺伝子導入のための９種のＰＣＬ−２系のカチオン性リポソームの構築を示す。これらの製剤はトランスフェクション効率を評価するために選択された何れかのポリヌクレオチドと混合するために適している。

カチオン性カルジオリピン類縁体、ＰＣＬ−２およびＤＯＰＥ又はコレステロールの何れかの各製剤相当量（表１Ａに示す）を丸底フラスコ中のクロロホルムに溶解した。溶媒をロータリーエバポレーターを用いて減圧下に除去し、脂質膜を形成した。脂質膜を更に一夜真空下に乾燥し、２５〜４０℃窒素下に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で水和させた。塊状のカチオン性リポソームを０．２μｍの孔径のポリカーボネートのフィルターを３回、そして０．１μｍの孔径のポリカーボネートのフィルターを５回通して押し出した。押し出したカチオン性リポソームの大きさ及びｐＨを特性化した（表１Ａ）。

カチオン性カルジオリピン類縁体、ＰＣＬ−２およびＤＯＰＥ又はコレステロールの何れかの各製剤相当量（表１Ｂに示す）を丸底フラスコ中のクロロホルムに溶解した。溶媒をロータリーエバポレーターを用いて減圧下に除去し、脂質膜を形成した。脂質膜を更に一夜真空下に乾燥し、２５〜４０℃窒素下に水で水和させた。塊状のカチオン性リポソームを０．２μｍの孔径のポリカーボネートのフィルターを３回、そして０．１μｍの孔径のポリカーボネートのフィルターを５回通して押し出した。押し出したカチオン性リポソームの大きさ及びｐＨを特性化した（表１Ｂ）。

実施例２
本実施例はアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを含有するＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系のカチオン性リポソーム組成物の構築を示す。

組成物は５５：２７：１７の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）：コレステロール：及び１，３−ビス−（１，２−ビステトラデシルオキシ−プロピル−３−ジメチルエトキシアンモニウムブロミド）−プロパン−２−オール（ＰＣＬ−２）のパーセントモル比を有し、そして、９０：１の総脂質：ｃ−ｒａｆＡＯＮ比及び２．２：１のＰＣＬ−２：ｃ−ｒａｆＡＯＮの電荷比を有するｃ−ｒａｆＡＯＮ（配列５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’）をそこに複合体化させて有するラメラ構造の複合体である。この製剤はまたＤ−αトコフェリル酸スクシネート０．２重量％及びスクロース１０〜１２重量％を含有する。

ｃ−ｒａｆＡＯＮ（ロットＡＬＨ−０１Ｊ−００３−Ｍ）はＡｖｅｃｉａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＭＡ，ＵＳＡ）より入手した。ＤＯＰＣ、コレステロール、αトコフェリル酸スクシネートはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）より入手した。ＰＣＬ−２はＮｅｏＰｈａｒｍ Ｉｎｃ．で合成した。スクロースはＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。

この組成物を形成するために、ラメラ複合体の製剤を薄膜水和法により調製した。脂質（ＤＯＰＣ、ＰＣＬ−２、コレステロール及びＤ−αトコフェリル酸スクシネート）を脱水されたアルコールに溶解した。脂質溶液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた。蒸発の後、脂質残留物を更にデシケーター中で一夜乾燥させた。スクロース及びｃ−ｒａｆＡＯＮを脱イオン水に溶解した。次に乾燥した脂質残留物をｃ−ｒａｆＡＯＮ／スクロース溶液中で水和させて均質な懸濁液を形成した。懸濁液中の粒子の大きさは、０．８、０．４、０．２及び０．１μｍのサイズのポリカーボネートフィルターを通して押し出すことにより更に低減した。プロトタイプはまた逆相蒸発及びエタノールインジェクション法によっても調製できる。

製剤の形態は凍結割断顕微鏡法により測定した。慨すれば、試料をサンドイッチ法および液体窒素冷却プロパンを用いて、１０，０００ケルビン／秒の冷却速度でクエンチングした。割断工程はＪＥＯＬ ＪＥＤ−９０００凍結エッチング装置中で実施し、そして露出した割断平面を２５〜３５度の角度で３０秒間白金で、そして３５秒間炭素で陰影化した（ｋＶ／６０〜７０ｍＡ、１／１０−５Ｔｏｒｒ）。白金のレプリカは濃発煙硝酸で２４〜３６時間クリーニングし、その後新しいクロロホルム／メタノール（１：１体積）を用いて少なくとも５回反復して振とうした。その後、これらのクリーニングされたレプリカをＪＥＯＬ １００ＣＸ電子顕微鏡で検査した。

製剤の安定性は１ヶ月２〜８℃及び２５℃で保存した後に評価した。ラメラ構造複合体製剤の粒子は動的光散乱法（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ）により測定した。製剤の薬剤捕獲効率は限外濾過及び／又は１００，０００分子量カットオフを有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターの通過により測定した。遊離及び捕獲された薬剤及び脂質の含有量はＨＰＬＣ法により測定した。

凍結割断レプリカは約５０〜２００ｎｍの平均粒径の単層ラメラリポソームの複合体を示していた。２〜８℃又は２５℃で保存したｃ−ｒａｆＡＯＮ製剤は１ヶ月安定であった。平均の粒径、捕獲効率、ｃ−ｒａｆＡＯＮおよびＤＯＰＣの濃度は２〜８℃及び２５℃で１ヶ月保存した後も初期値と有意差がなかった。これらの結果を表２に示す。

実施例３
本実施例はアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを含有するＰＣＬ−２−系のカチオン性リポソーム組成物の構築を示す。

組成物は６０：３１：９の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）：１コレステロール：及び３−ビス−（１，２−ビステトラデシルオキシ−プロピル−３−ジメチルエトキシアンモニウムブロミド）−プロパン−２−オール（ＰＣＬ−２）のパーセントモル比を有し、そして、１９５：１の総脂質：ｃ−ｒａｆＡＯＮ比及び２．４：１のＰＣＬ−２：ｃ−ｒａｆＡＯＮの電荷比を有するｃ−ｒａｆＡＯＮをそこに複合体化させて有するラメラ複合体である。この製剤はまたＤ−αトコフェリル酸スクシネート０．２重量％及びスクロース１０重量％を含有する。

ｃ−ｒａｆＡＯＮ（ロットＡＬＨ−０１Ｊ−００３−Ｍ）はＡｖｅｃｉａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＭＡ，ＵＳＡ）より入手した。ＤＯＰＣおよびコレステロールはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）より、αトコフェリル酸スクシネートはＳｉｇｍａより入手した。ＰＣＬ−２はＮｅｏＰｈａｒｍ Ｉｎｃ．で合成した。スクロースはＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。

ラメラ複合体製剤は薄膜水和法により調製した。脂質（ＤＯＰＣ、ＰＣＬ−２、コレステロール及びＤ−αトコフェリル酸スクシネート）を脱水されたアルコールに溶解した。スクロース及びｃ−ｒａｆＡＯＮは脱イオン水に溶解した。一定に攪拌しながら、脂質溶液をｃ−ｒａｆＡＯＮ溶液に添加して多層ラメラ複合体を形成した。懸濁液中の粒子の大きさは、０．８、０．４、０．２及び０．１μｍのサイズのポリカーボネートフィルターを通して押し出すことにより更に低減した。ラメラ構造複合体製剤の粒子は動的光散乱法（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ）により測定した。薬剤捕獲効率は限外濾過及び／又は１００，０００分子量カットオフを有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターの通過、そしてその後のＨＰＬＣ法による濾液中の遊離ｃ−ｒａｆＡＯＮの分析により測定した。

ラメラ複合体製剤からのｃ−ｒａｆＡＯＮの放出は逆透析法により調べた。慨すれば、製剤２０ｍＬ分を攪拌リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４緩衝液１８０ｍＬ中に入れ、これには予め同じＰＢＳ緩衝液２ｍｌを含有する透析膜チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）を入れておいた。種々の時間間隔において、１本の透析チューブを取り出し、ｃ−ｒａｆＡＯＮ濃度を分析した。

製剤の安定性は２ヶ月２〜８℃で保存した後に評価した。ラメラ構造複合体製剤の粒子は動的光散乱法（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ）により測定した。製剤の薬剤捕獲効率は限外濾過及び／又は１００，０００分子量カットオフを有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターの通過により測定した。遊離及び捕獲された薬剤及び脂質の含有量はＨＰＬＣ法により測定した。２〜８℃で保存したラメラ複合体製剤は２ヶ月安定であることがわかった。平均の粒径、捕獲効率、ｃ−ｒａｆＡＯＮおよびＤＯＰＣの濃度は２〜８℃で２ヶ月保存した後も初期値と有意差がなかった。これらの結果を表３Ａおよび３Ｂに示す。

５％デキストロース溶液中の８倍希釈製剤試料の物理的及び化学的な安定性を４８時間まで室温及び冷蔵温度（２〜８℃）において保存した後に評価した。全ての安定性試料は外観、ｐＨ、粒径、ｃ−ｒａｆＡＯＮ捕獲効率、ｃ−ｒａｆＡＯＮ濃度、ＤＯＰＣ濃度、コレステロール濃度及びＰＣＬ２濃度について分析した。平均の小胞の大きさは約２００ｎｍであり、捕獲効率は＞９９％であった。ｃ−ｒａｆＡＯＮの２０パーセント未満が透析７２時間後に製剤から放出されていた。表３Ｃに示す通り、ｃ−ｒａｆＡＯＮ、ＤＯＰＣ、ＰＣＬ−２、コレステロール試験値、捕獲効率、ｐＨ及び平均小胞サイズは４８時間２〜８℃又は室温で保存した後も初期値と有意差がなかった。調製物は５％デキストロースＵＳＰ中に希釈した。

実施例４
本実施例は他のリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチド製剤と比較した場合のｃ−ｒａｆ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する本発明の組成物のインビボの薬効及び低毒性を示すものである。

製剤
被験製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）は図１に記載する通り調製した。慨すれば、脂質賦形剤、即ちＤＯＰＣ、コレステロール、ＰＣＬ−２及びＤ−αトコフェリル酸スクシネートを脱水エタノールに溶解し、そしてｉｉ）活性成分ｃ−ｒａｆ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’）及びスクロースを注射用滅菌水に溶解した。エタノール性の脂質溶液を水性活性溶液に添加してリポソームを形成した。バッチ重量（ＱＳ）を満たすようにした後、リポソームを押し出すことによりサイズの仕様を満足し、エタノールをロータリーエバポレーターで除去した。溶媒除去前の重量までバッチ重量を調節した後、生成物を０．２２μの滅菌フィルターで濾過し、滅菌バイアルに充填し、蓋をして密封した。

比較対照用の製剤（ＤＤＡＢ−ＬＥｒａｆＡＯＮ製剤）は同じ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有させたが、市販のカチオン性脂質であるジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）を用いて製剤した。

非超音波処理２バイアルＬＥｒａｆＡＯＮ製剤の製造工程では、凍結乾燥した脂質及びｒａｆＡＯＮの個別のバッチ調製を行った。凍結乾燥脂質については、脂質賦形剤、即ち卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、コレステロール及びジメチルドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）をまずｔ−ブチルアルコールに溶解し、溶液を０．２２μｍ滅菌フィルターで濾過し、滅菌バイアルに充填し、凍結乾燥した。凍結乾燥したｒａｆＡＯＮは、注射用滅菌水に薬剤を溶解し、その後０．２２μｍ滅菌フィルターで濾過し、滅菌バイアルに充填し、凍結乾燥することにより製造した。投与直前において、ｒａｆＡＯＮ凍結乾燥バイアルを０．９％塩化ナトリウムＵＳＰで希釈再調製した。次に希釈再調製したｒａｆＡＯＮを凍結乾燥脂質のバイアルに写し、水和させ、１０分間超音波処理した。

薬理学的試験
ＰＣＬ−２製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵのインビボの薬効を４種の試験においてＤＤＡＢ製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮと比較した。

１．ヒト前立腺（ＰＣ−３）腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ及びＬＥｒａｆＡＯＮのインビボの薬効
ＰＣＬ−２製剤ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ及び対照製剤ＬＥｒａｆＡＯＮの多用量治療薬効をヒト前立腺癌のＳＣＩＤマウス異種移植片モデルにおいて評価した。対数増殖期のＰＣ−３細胞をＣ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤマウスにおいて皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍担持動物（５０〜１２５ｍｍ３）を異なる投与群に無作為に割付（５〜７匹／群）、そしてマウスに対照ビヒクル、ＬＥｒａｆＡＯＮを１２．５又は２５ｍｇ／ｋｇ／日、又はＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを１２．５又は２５ｍｇ／ｋｇ／日で第１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３および１４日にｉｖ投与した。薬効は対照の％初期腫瘍容量（第１日＝１００％）を第２０日にＬＥｒａｆＡＯＮ及びＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ群と比較することにより評価した。

ＬＥｒａｆＡＯＮ及びＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ １２．５ｍｇ／ｋｇ／日を処置した動物は如何なる腫瘍生育抑制も示さなかった。しかしながら、ＬＥｒａｆＡＯＮ又はＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを２５ｍｇ／ｋｇ／日処置した動物はその各々の対照と比較して（１０％スクロース）それぞれ１５％及び４４％の腫瘍成育抑制を示した。体重減少では差がなかったため、ＬＥｒａｆＡＯＮ及びＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵは共に良好な耐容性を示した。

本試験の結果は全体としてＰＣＬ−２製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）及びＤＤＡＢリポソーム製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ）は両方ともＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデルに対して同等程度の治療薬効を有することを示唆している。

２．ヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵおよびＬＥｒａｆＡＯＮのインビボの薬効
ＰＣＬ−２製剤ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ及び対照製剤ＬＥｒａｆＡＯＮの多用量治療薬効をヒト乳癌のＳＣＩＤマウス異種移植片モデルにおいて評価した。対数増殖期のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＢ−１７雌ＳＣＩＤマウスにおいて皮下移植した。腫瘍担持動物（５０〜１００ｍｍ³）を異なる投与群に無作為に割付（８匹／群）、そしてマウスに対照ビヒクル又は２５ｍｇ／ｋｇ／日のＬＥｒａｆＡＯＮ又はＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを第１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３および１４日にｉｖ投与した。

最大腫瘍生育抑制はＬＥｒａｆＡＯＮおよびＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵにおいて対応するビヒクル対照と比較してそれぞれ第１２日の６５％及び第１５日の５９％であった。投与群の何れにおいても体重減少は観察されなかった。

結果はＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵが対照のＬＥｒａｆＡＯＮ製剤と比較してＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌腫瘍モデルに対して等しい治療薬効を有することを示している。

３．ヒト卵巣（ＳＫＯＶ−３）腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵおよびＬＥｒａｆＡＯＮ及びＴａｘｏｌ（登録商標）とのそれらの組合せのインビボの薬効
ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ及び対照製剤ＬＥｒａｆＡＯＮの単独及びＴａｘｏｌ（登録商標）との組合せの多用量治療薬効試験をヒト卵巣癌のＳＣＩＤマウス異種移植片モデルにおいて評価した。対数増殖期のＳＫＯＶ−３細胞をＣ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。対照又は被験物質の処置は腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ³に到達した時点で開始した。マウスは一群５〜７匹の投与群に無作為に割付、ビヒクル対照又は２５ｍｇ／ｋｇ／日のＬＥｒａｆＡＯＮおよびＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを第１、２、４、５、７、８、１０、１１、１２および１３日に静脈内投与した。Ｔａｘｏｌ（登録商標）（２５ｍｇ／ｋｇ）もまた第２、５及び９日に所定の群に静脈内投与した。複合療法群の動物にはｒａｆＡＯＮの対応するリポソーム製剤を投与後２〜３時間にＴａｘｏｌ（登録商標）を投与した。

ＬＥｒａｆＡＯＮおよびＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵは第２３日にそれぞれ３８％及び４５％の最大腫瘍生育抑制を示した。Ｔａｘｏｌ（登録商標）は第１９日に４１％の最大腫瘍生育抑制を示した。Ｔａｘｏｌ（登録商標）＋ＬＥｒａｆＡＯＮまたはＴａｘｏｌ（登録商標）＋ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵの組合せは９０％まで腫瘍生育を有意に低減した。更にまた、４００ｍｍ³超の体積までの腫瘍の生育はＴａｘｏｌ（登録商標）＋ＬＥｒａｆＡＯＮでは１３日、そしてＴａｘｏｌ（登録商標）＋ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵでは２４日遅延した。

本試験の結果はＰＣＬ−２製剤のＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵは単独薬として投与された場合はＳＣＩＤマウスにおけるＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌腫瘍モデルに対して対照のＬＥｒａｆＡＯＮと同等の治療薬効を有することを示している。しかしながら、Ｔａｘｏｌ（登録商標）との複合処置においては、ＰＬＣ−２製剤ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵはＤＤＡＢ製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ）と比較してより優れた腫瘍生育の遅延をもたらした。

４．ヒト前立腺（ＰＣ−３）腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵおよびＬＥｒａｆＡＯＮ及びＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）とのそれらの組合せのインビボの薬効
ＰＣＬ−２製剤ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ及び対照ＤＤＡＢ製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮ単独、及び、治療未満量のＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）との組合せの多用量治療薬効をヒト前立腺癌のＳＣＩＤマウス異種移植片モデルにおいて実施した。対数増殖期のＰＣ−３細胞をＣ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤマウスにおいて皮下移植した。腫瘍担持動物（５０〜１００ｍｍ³）を種々の投与群（５〜７匹／群）に無作為に割り付け、そして対照又は被験物質（２５ｍｇ／ｋｇ／日、ＬＥｒａｆＡＯＮ又はＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）を５日間連続で静脈内投与した。Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を所定の群に第２日に１０ｍｇ／ｋｇそして第５日に５ｍｇ／ｋｇ投与した。薬効は対照群の％初期腫瘍容（第１日＝１００％）を第２１日の投与群と比較することにより評価した。

腫瘍の生育はＬＥｒａｆＡＯＮおよびＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを投与したマウスでそれぞれ、その対照と比較して７％および４０％抑制された。Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）単独では８３％腫瘍生育抑制となったのに対し、複合療法においては、ＬＥｒａｆＡＯＮ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）は８１％の同様の腫瘍生育抑制をもたらした。ＰＣＬ−２製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を投与した動物は第２１日に９９％腫瘍成育抑制を示した。これらの結果は図４Ａ及び４Ｂに示す。

本試験の結果はＰＣＬ−２製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵをＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）と組み合わせた場合対照のＤＤＡＢ製剤ＬＥｒａｆＡＯＮ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）の組合せと比較してより高い治療薬効を有することを示唆している。

薬物動態
ＰＣＬ−２ｒａｆＡＯＮ製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵの薬物動態を対照（ＤＤＡＢ）リポソーム製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮとＣＤ２Ｆ１マウスにおいて比較した。

１．生物分析的方法
生物分析的方法はＬＥｒａｆＡＯＮ又はＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを含有するマウス血漿及びマウス組織中の総ｒａｆＡＯＮを定量するために開発され、そして、マウスにおける単回投与の薬物動態及び組織分布試験から血漿及び組織の試料中のｒａｆＡＯＮを定量するために使用した。ｒａｆＡＯＮは固相抽出（ＳＰＥ）によりマウス血漿試料から抽出し、次にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量した。方法はマウス結晶中２５〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲で直線的であることが解った。組織を機械的にホモゲナイズして５％（ｗ／ｖ）のホモジネートを形成し；次にこれを試料調製のためのタンパク質沈殿に付した。次に試料中の総ｒａｆＡＯＮを５０〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ組織ホモジネートの直線性を有するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により定量した。

２．マウスにおけるＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵおよびＬＥｒａｆＡＯＮの薬物動態及び組織分布試験
対照のＬＥｒａｆＡＯＮおよびＰＬＣ−２製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）の単回投与の薬物動態及び組織分布の試験を雄性ＣＤ２Ｆ１マウスへの３０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の後に実施した。マウス３匹／群／時点を製剤投与後５、１５及び３０分及び１、２、４、８、２４及び４８時間に屠殺した。血液試料は血漿から処理し、血漿及び組織はｒａｆＡＯＮ濃度について試験した。

ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを投与した動物の血漿中Ｃ_maxはＬＥｒａｆＡＯＮを投与した動物の約２倍であった。総曝露（ＡＵＣ０〜４８ｈおよびＡＵＣ０〜∞）はＬＥｒａｆＡＯＮ投与マウスよりもＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵで２．３倍高値であった。ＬＥｒａｆＡＯＮのクリアランスはＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵと比較して２．５倍速く、そして分布容量（Ｖｚ）は約４倍高値であった。

ｒａｆＡＯＮは投与後急速に組織に分布した。４８時間に渡る組織曝露の増大順は両方の製剤で肺＞脾臓＞肝臓＞腎臓＞心臓であった。ｒａｆＡＯＮ濃度はＤＤＡＢ製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ）と比較してＰＣＬ−２製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）投与マウスにおいて高値であることがわかった。

毒性学
ＰＣＬ−２ｒａｆＡＯＮ製剤、ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵの毒性をＣＤ２Ｆ１マウスにおいて対照リポソーム製剤ＬＥｒａｆＡＯＮと比較した。

マウスにおける多用量毒性
対照（ＬＥｒａｆＡＯＮ）及びＰＣＬ−２製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）の比較多用量毒性試験を雌雄のＣＤ２Ｆ１マウスにおいて実施した。動物を投与群（１０／性別／群）に無作為に割り付け、５日間連続で３５ｍｇ／ｋｇ／日のＬＥｒａｆＡＯＮ又はＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを静脈内投与した。

ＰＣＬ−２製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）を投与したマウスにおいては有意な体重減少または毒性の臨床兆候は観察されなかった。ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを投与した動物の死亡率は雌雄とも０％であり、ＬＥｒａｆＡＯＮを投与した雄は１００％、雌は４０％であった。ＬＥｒａｆＡＯＮを投与した全ての雄および雌の４０％が第５日に死亡しており、全てが毒性の臨床兆候を示していた（屈曲姿勢、粗放皮膜及び脱水）。雄では統計学的に有意な体重減少は観察されなかったのに対し、雌は第８日に１２％の体重減少を示したが、第１７日には回復した。５日を越えてＬＥｒａｆＡＯＮを投与した生存雌は昏睡状態となったが、第９日までには回復した。この試験を図４Ｃに示す。

組織病理学的評価によれば、ＬＥｒａｆＡＯＮを投与したマウスの死亡は肺出欠により起こったものであると結論付けられた。疾患はＬＥｒａｆＡＯＮ投与マウスの脾臓、肺及び肝臓で観察されたが、ＰＣＬ−２製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）投与マウスでは観察されなかった。臨床病理試験によれば対照を投与したマウスとＬＥｒａｆＡＯＮまたはＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵを投与したものとの間に臨床検査値の有意差を示さなかった。

ＰＣＬ−２製剤（ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ）を示すこの試験結果は、対照製剤ＬＥｒａｆＡＯＮよりＣＤ２Ｆ１マウスに対して毒性が少ない。

実施例５
本実施例は細胞をトランスフェクトする場合の本発明の組成物のトランスフェクション効率を示す。実施例は一次細胞を含む種々の細胞系統をトランスフェクトするＰＣＬ−２製剤の能力に着目しており、そして結果は本発明の組成物がＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）やリポフェクタミン２０００（商標）のような一般的に使用されているトランスフェクション試薬よりも試験細胞系統においてより高い効率で細胞のトランスフェクションを媒介できることを明らかにしている。

本実施例において報告する実験において用いるための組成物（本明細書においては「ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）」と称する）は実施例１に記載した操作法を用いて調製した。本発明の製剤はＰＣＬ−２及びＤＯＰＥを含有させた。

１．ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション効率
ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）はＣＭＶ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドを用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてトランスフェクションに関して評価し、そしてＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と比較した。１μｇのＤＮＡを２４穴プレート中ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）又はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の存在下及び非存在下において、ＣＨＯ細胞に添加した。細胞を血清非含有培地で４時間インキュベートし、次に１０％血清含有培地に変えて更に２４時間保持した。タンパク質濃度は標準物質としてウシ血清アルブミンを用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質試験により測定し、そしてトランスフェクション効率は相対的光単位／ｍｇ細胞タンパク質を測定することにより求めた。この実験の結果（図５Ａ参照）はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）よりもＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）のほうが全ての濃度において有意に高値のトランスフェクション効率を示したことを示している。

２．ＣＯＳ−１細胞におけるトランスフェクション効率
ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）のＣＯＳ−１細胞におけるトランスフェクションについてＬａｃＺプラスミドを用いて評価した。４μｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ＬａｃＺをＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）又はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と共に血清非含有培地中室温で３０分間インキュベートした。その後、試薬混合物をウェルあたり０．３百万個の細胞に対して添加し、血清非含有培地中で６時間インキュベートした。混合物を１０％血清培地と置き換え、更に４８時間インキュベートした。トランスフェクション効率はβ−Ｇａｌ染色キットを用いて染色し、そして倒立顕微鏡を用いて視野当たりのトランスフェクトされた細胞の数を計数することにより測定した。この実験の結果（図５Ｂ参照）は全ての濃度においてＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）がＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）よりも有意に高値のトランスフェクション効率を示したことを示している。

３．一次ラット肺微小血管内皮細胞（ＲＬＭＶＥＣ）におけるＲＮＡｉのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）媒介送達
一次ラット肺微小血管内皮細胞（ＲＬＭＶＥＣ）におけるＲＮＡｉの送達についてＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を評価した。ＲＮＡｉをＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）と混合し、種々の濃度をＲＬＭＶＥＣに曝露した（図５Ｃ参照）。トランスフェクションの効率は相対的単位においてＲＮＡｉオリゴの取り込みを測定することにより試験した。この実験の結果（図５Ｃ参照）はＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）が効率的にＲＮＡｉをＲＬＭＶＥＣに送達したことを示している。

４．ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞におけるＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）のトランスフェクション効率
β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子試験を用いてＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）のトランスフェクション効率を評価した。一夜９６穴プレートで培養した後、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を６時間血清非含有培地中０．２μｇ／ウェルのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクター及び０．３７５〜６μｇ／ウェルのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）又はリポフェクタミン２０００（商標）でトランスフェクトした。トランスフェクションの後、リポソーム−ＤＮＡ複合体を血清含有培地と交換した。β−ガラクトシダーゼ活性はトランスフェクション後２４時間に測定し、外因性β−ガラクトシダーゼ標準物質に対してプロットした。この試験の結果（図５Ｄ参照）、リポフェクタミン２０００（商標）よりもＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）が有意に高値のトランスフェクション効率を示したことを明らかにした。

５．ラット肺微小血管内皮一次細胞培養物（ＰＬＭＶＥＣ）におけるＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を用いたｄｓＲＮＡ干渉によるサイトカイン受容体（ＴｂＲＩＩ）発現の抑制
ラット肺微小血管内皮細胞（ＰＬＭＶＥＣ）一次細胞培養物をＲＮＡｉのために使用することにより、腫瘍形成に関与するサイトカイン受容体の生産を抑制した。特異的２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いてＰＬＭＶＥＣ細胞をトランスフェクトするためにＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を使用した。細胞を種々の回数３７℃５％ＣＯ₂においてＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）及びオリゴヌクレオチドに曝露した。抑制は４８時間以内に観察され、抑制は７２及び９６時間において増大していた（図５Ｅ参照）。

６．４８時間後の一次細胞におけるＲＮＡｉ（２００ｎＭ）オリゴヌクレオチドのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）媒介送達の作用
ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）はＲＬＭＶＥＣ一次細胞におけるＲＮＡｉの送達について評価した。ＴｂＲＩＩ発現は間接的免疫蛍光を用いて検出した。一次抗体はウサギ及び抗ＴｂＲＩＩとし、二次抗体はＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギとした。ＲＮＡｉをＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）と混合し、２００ｎＭを一次細胞に曝露した（図５Ｃ参照）。ＲＮＡｉのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）媒介送達の作用を蛍光により測定した。４８時間後、ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）処置細胞は対照細胞と比較して顕著に低減した蛍光を示し（図５Ｆ参照）、細胞内の蛍光を媒介する遺伝子の抑制が示された。これらの結果はＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）が効率的にＲＮＡｉを一次細胞に送達し、そしてＲＮＡｉは遺伝子発現を抑制するために細胞内で機能できることを示している。

７．ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）（２．５μｇ／ｍＬ）媒介送達はＴ＿ＲＩＩ遺伝子発現を抑制する
ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）をラット肺微小血管内皮細胞（ＲＬＭＶＥＣ）、一次ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び一次ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）においてＲＮＡｉの送達について評価した。Ｔ＿ＲＩＩ遺伝子にターゲティングされたＲＮＡｉをＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）と混合し、２．５μｇ／ｍＬを３種の細胞型に曝露した（図５Ｇ、５Ｈ及び５Ｉ参照）。トランスフェクションの効率は対照細胞との相対比較によりパーセント遺伝子発現を測定することにより試験した。この実験の結果（図５Ｇ、５Ｈ及び５Ｉ参照）は ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）が効率的にＲＮＡｉを細胞に送達したことを示している。

実施例６
本実施例は本発明の組成物が安全で増強されたインビトロ及びインビボの送達のための新規なカチオン性カルジオリピンのプラットホームとなることを示している。

Ａ．材料及び方法
１． ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ−ＡＴ（商標）（ＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系リポソーム）の調製
ヘルパー脂質として使用されるコレステロール及びＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）より購入した。数種のＣＣＬＡ系のリポソームはＣＣＬＡ及びヘルパー脂質から種々のモル比で薄膜水和法を用いて調製した。慨すれば、ＣＣＬＡ、ＤＯＰＥ又はコレステロールを丸底フラスコ中のクロロホルムに溶解した。溶媒をロータリーエバポレーターにより減圧下に除去し、脂質膜を形成し、更に一夜真空下に乾燥した。脂質膜２５〜４０℃の窒素下においてＲＮａｓｅ非含有の水中１０％スクロースで水和させた。ＲＮａｓｅ非含有の水はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。塊状のカチオン性リポソームを０．２μｍ孔径のポリカーボネートフィルターを通して３回、０．１μｍ孔径のポリカーボネートフィルターを通して５回押し出した。押し出されたリポソームを０．２２μｍ滅菌フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐａｋ（登録商標）正電荷）を通して濾過することにより滅菌した。調製したリポソーム（ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ−ＡＴ（商標））は１１０〜１２０ｎｍの平均粒径を有していた。リポソームのサイズは光散乱粒径測定器（Ｎｉｃｏｍｐ３８０型、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて特性化した。

２．細胞培養物の調製
Ａ５４９（ヒト肺癌）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）、ＳＫ−ＯＶ−３（ヒト卵巣癌）、ＭＸ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌）細胞はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＩ−ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＡＬＢ／３Ｔ３（ネズミ胚線維芽細胞）及びＨｅｐＧ₂（ヒト肝細胞癌）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入した。ＣＨＯ細胞は１０％ＨＩ−ＦＢＳを含有するＨａｍのＦ１２培地のＫａｉｇｈｎの変性培地（Ｆ１２Ｋ）中に維持した。ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞は１０％ウシ血清添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅ培地に維持した。ＨｅｐＧ₂細胞は１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び１０％ＨＩ−ＦＢＳを添加したＥａｇｌｅ最小必須培地中に維持した。全ての培地及び試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入した。

Ｂ．リポソーム試験
１．インビトロ効率
トランスフェクションの１日前、ＣＨＯ（２５０００個／ウェル）、ＢＡＬＢ／３Ｔ３（２５０００個／ウェル）、ＭＸ−１（５００００個／ウェル）およびＡ５４９（２５０００個／ウェル）を９６穴プレートに、ＨｅｐＧ₂（２０００００個／ウェル）を２４穴プレートに播種し、５％ＣＯ₂インキュベーター中で一夜培養した。次に細胞をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄して残存する血清を除去した後にトランスフェクション混合物を添加した。

ＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系のリポソームのトランスフェクション効率はＣＨＯ、ＢＡＬＢ／３Ｔ３およびＨｅｐＧ₂細胞についてはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）レポーター遺伝子試験を用いて、そして、ＭＸ−１及びＡ５４９細胞についてはルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて測定した。ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ対照ベクターはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より購入し、ｇＷＩＺルシフェラーゼベクターはＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入した。ＤＮＡプラスミドの総量は９６穴プレートでは０．２μｇ／ウェル、２４穴プレートでは１μｇ／ウェルとした。プラスミドは細胞培養試験灌注ＯｐｔｉＭＥＭＩ減血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で希釈した。等しい量のＯｐｔｉＭＥＭＩ培地を用いてＣＣＬＡ系リポソームを希釈した。適切な量のＣＣＬＡ系リポソームをＯｐｔｉＭＥＭＩ培地中に再懸濁して８：１のＣＣＬＡ／ＤＮＡ（＋／−）電荷比とし、ＯｐｔｉＭＥＭＩ培地で４：１、２：１、１：１および１：２に連続希釈し、５分間室温でインキュベートした。次にＤＮＡをＣＣＬＡリポソーム系希釈物に滴下し、更に３０分間室温でインキュベートした。インキュベートの後、ＤＮＡ／ＣＣＬＡ系のリポソーム複合体を細胞に添加し、更に４〜６時間インキュベートした。トランスフェクションの後、残存するＤＮＡ／ＣＣＬＡ系リポソーム複合体を洗浄し、細胞に通常の培地を補充し、２４時間までインキュベートした。

β−ｇａｌレポーター遺伝子試験はβ−ｇａｌレポーター遺伝子試験系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いながら製造元のプロトコルに従って実施した。試料の光学密度（ＯＤ）はプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）を用いて４１４ｎｍで読み取った。β−ｇａｌ発現の量は外因性β−ｇａｌ標準物質に基づいて計算した。ルシフェラーゼの発現はルシフェラーゼ試験系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いながら測定した。試験用の試薬を細胞溶解物２０μｌと混合し、相対的光単位（ＲＬＵ）をルミノメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で測定した。

ＣＣＬＡ系リポソームトランスフェクションに関する旨適な組合せを決定するために２種の最も一般的に使用されているヘルパー脂質であるコレステロール及びＤＯＰＥを種々のモル比でＣＣＬＡと共に製剤し、β−ｇａｌレポーター遺伝子試験を用いてインビトロでそのトランスフェクション効率についてスクリーニングした。評価結果によれば、モル比１：２のＣＣＬＡ：ＤＯＰＥからなる製剤が試験した細胞系統中で高度なトランスフェクションをもたらすことが解った。

ＣＨＯ、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ａ５４９及びＭＸ−１細胞においてはレポーター遺伝子からのピーク遺伝子発現はＣＣＬＡ／ＤＮＡ（＋／−）電荷比２：１で得られたのに対し、ＨｅｐＧ₂細胞においてはピーク活性は１：１の電荷比で観察された（図６Ａ）。

２．インビボの薬効
雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系リポソームのトランスフェクション効率はルシフェラーゼレポーター遺伝子試験を用いて測定した。ｇＷＩＺルシフェラーゼベクター（５０μｇ／匹）をＣＣＬＡ系リポソームの表面に穏やかに混合した。ＤＮＡ／ＣＣＬＡ系リポソーム複合体を調製８時間以内に尾部静脈を介してマウスに静脈内投与した。Ｂａｌｂ／ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｏｒｔａｇｅ，ＭＩ）から入手した。等しい量のＤＮＡをＤＯＴＡＰ系製剤であるＩｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）（ＱＢｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により製造元の推奨するプロトコルに従って送達した。マウスは注射後２４時間に屠殺した。肺及び心臓の組織を迅速に採取し、エタノール／ドライアイスバス中で凍結した。次に組織をオートガイザー（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）を用いながら細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にホモゲナイズした。ホモジネートを１２０００ｒｐｍ（１６０００ｇ）で１０分間４℃で遠心分離し、上澄みを別の試験管に移した。上澄みの２０μＬ分を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各組織試料のタンパク質濃度は製造元のプロトコルに従ってＲＣ ＤＣタンパク質試験を用いて測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。

異なるモル比のＣＣＬＡ及びコレステロール又はＤＯＰＥからなる数種の製剤をスクリーニングした。興味深いことに、１：２のＣＣＬＡ：ＤＯＰＥモル比、即ちインビトロの製剤と同じ組成がコレステロールと組み合わせたＣＣＬＡよりも良好なトランスフェクション活性を示した。ＣＣＬＡ／ＤＮＡ（＋／−）の異なる電荷比をルシフェラーゼレポーター遺伝子５０μｇに対して試験した場合、ルシフェラーゼの最大発現は肺および心臓の組織の両方において５：１（＋／−）で観察された（図６Ｂ）。これとは対照的に、ＤＮＡ又はＣＣＬＡ系のリポソーム単独を処置したマウスでは発現は観察されなかった。

ＣＣＬＡ系のリポソームのトランスフェクション効率は雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて市販品のカチオン性リポソーム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標））とも比較した。ＤＯＴＡＰ系のＩｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）はインビボの実験のために使用される極めて小数の市販リポソームの１つである。ルシフェラーゼレポーター遺伝子（５０μｇ／匹）を製造元の推奨する条件を用いて旨適電荷比（＋／−５：１）のＣＣＬＡ系リポソーム又はＩｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）の何れかを用いて送達した。本発明者らの結果によれば、肺におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現はＣＣＬＡ系リポソームにより送達した場合はＩｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）による場合より約７倍高値であった（図６Ｃ）。ＤＯＴＡＰのＤＮＡに対する計算電荷比はやはり約５：１であった。

３．インビボ毒性
ＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系リポソームの毒性は雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて測定した。ＣＣＬＡ系リポソームの単回用量の毒性は尾部静脈を介してＣＣＬＡ系リポソーム１００ｍｇ／ｋｇをマウスに注射することにより評価した。ＤＯＴＡＰ系のＩｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）は比較分析のために使用した。多用量の毒性は連続３日間尾部静脈を介してＣＣＬＡ系リポソーム５０、７５または１００ｍｇ／ｋｇをマウスに注射することにより調べた。各群３匹を用いた。死亡率、体重及び毒性の臨床兆候は１４日間毎日モニタリングした。

ＣＣＬＡリポソーム投与群では死亡例は観察されなかったのに対し、Ｉｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）投与群では６６．６％の死亡率が記録された（表６）。多用量毒性試験においては、マウスには連続３日間ＣＣＬＡ系リポソーム５０、７５または１００ｍｇ／ｋｇを注射した。５０および７５ｍｇ／ｋｇ／日を注射した群では死亡例は観察されなかったが、１００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＣＬＡ系リポソーム投与後３日に３３．３％のマウスが死亡した（表６）。５０および７５ｍｇ／ｋｇ投与群では有意な体重減少は観察されず、１００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＣＬＡ系リポソーム投与マウスにおいては僅か１０．１％の体重減少のみであった。生存マウスは初回投与後１０日には完全に回復した。本発明者らの結果はＣＣＬＡ系リポソームの毒性はＩｎ Ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）よりも有意に低値であることを示していた。

Ｃ．ｓｉＲＮＡの送達
１．インビトロの薬効
ｃ−ｒａｆに対するｓｉＲＮＡの治療薬効はＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系リポソームを用いてＡ５４９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＫ−ＯＶ−３癌細胞にｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡをトランスフェクトすることにより試験した。ｓｉＲＮＡ２本鎖はｃ−Ｒａｆ遺伝子に対するヒトｍＲＮＡの特定の配列をターゲティングするように設計した（アクセッション番号Ｘ０３４８４）。選択された配列はＢＬＡＳＴ検索においてスクリーニングすることによりｃ−ＲａｆｍＲＮＡのみがターゲティングされたことを確認した。合成ｓｉＲＮＡ２本鎖は２’−脱保護脱塩形態でＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）において専用に合成した。２本鎖のセンス及びアンチセンス配列はそれぞれＡＵＵＣＣＵＧＣＵＣＡＡＵＧＧＡＵＵＵｄＴｄＴおよびＡＡＡＵＣＣＡＵＵＧＡＧＣＡＧＧＡＡＵｄＴｄＴであった。ミスマッチ２本鎖ｓｉＲＮＡ配列（５’−ＡＧＣＵＵＧＣＣＡＵＣＣＡＵＧＣＵＡＵｄＴｄＴ−３’および５−ＡＵＡＧＣＡＵＧＧＡＵＧＧＣＡＡＧＣＵｄＴｄＴ−３’）もまたＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から入手した。ミスマッチ配列もまたＢＬＡＳＴ検索でスクリーニングすることによりｃ−ｒａｆｍＲＮＡ配列との相同性がないことを確認した。

Ａ５４９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＫ−ＯＶ−３細胞はｓｉＲＮＡ単独又はＣＣＬＡ系リポソーム単独、又は両方の組み合わせでトランスフェクトした。ウェル当たり約１００００個の細胞を９６穴プレートにプレーティングし、４００ｎＭのｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡ及び／又は１０μｇ／ｍＬのＣＣＬＡ系リポソームで６時間トランスフェクトした。トランスフェクションの後、ｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡ／ＣＣＬＡ系リポソーム複合体を洗浄し、細胞に新しい培地を補充し、そして７２時間インキュベートした。細胞毒性はスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）試験を用いてトランスフェクション後７２時間に測定した。結果によればＣＣＬＡ系リポソームにより送達された４００ｎＭのｓｉＲＮＡは対照細胞と比較してＡ５４９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＫ−ＯＶ−３細胞においてそれぞれ５４％、６２％、３３％および３４％の細胞毒性を誘導した。遊離のｓｉＲＮＡ又はリポソーム単独を投与した細胞では見かけ上の細胞毒性は観察されなかった（図６Ｄ）。

２．インビボの薬効
ｃ−ｒａｆに対するｓｉＲＮＡの治療薬効は更にＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳癌異種移植片モデルに対して試験した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（０．１ｍｌ ＨＢＳＳ中２×１０⁶個）をＣＢ−１７ＳＣＩＤマウス（４〜５週齢、購入元はＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に皮下注射した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ³の体積に到達した時点で、マウスを４群に無作為に割り付けた。３群をＲＮａｓｅ非含有及びＤＮａｓｅ非含有の水中の遊離のｓｉＲＮＡ、ミスマッチｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡ／ＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系リポソーム又はｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡ／ＣＣＬＡ系リポソームをそれぞれ投与した。注射はｓｉＲＮＡ７．５ｍｇ／ｋｇ／日で尾部静脈注射により５日間位置に当たり２回（ｂ．ｉ．ｄ．）行った。リポソーム複合体の等容量のスクロース（１０％、ｗ／ｖ）を対照として第４の群に注射した。腫瘍の大きさはカリパスで週２回測定し、腫瘍体積は次の式、即ちａｘ（ｂ／２）²ｘπ（式中π＝３．１４、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長さ及び幅）を用いて計算した。対照群の腫瘍が最大堆積（〜４００ｍｍ³）に達する初回治療後１５日にマウスを屠殺した。全データとも平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表示した。群間の比較はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側、ｕｎｐａｉｒｅｄ）により行った。ｐ値＜０．０５の場合に統計学的に有意とみなした。

ｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡ／ＣＣＬＡ系リポソーム複合体の投与は初回投与後８日で遊離のｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡ群と比較した場合７３％の腫瘍生育抑制を示した（図６Ｅ）。差は統計学的に有意であった（ｔ検定でｐ＜０．０５）。これとは対照的に、ＣＣＬＡ計リポソームにより送達された１０％スクロース、遊離ｃ−ｒａｆｓｉＲＮＡ又はミスマッチｓｉＲＮＡは腫瘍生育に対して有意な作用を有さなかった。

実施例７
本実施例はＤＯＰＥ、コレステロール、カルジオリピン及びｒａｆｓｉＲＮＡを含む本発明の組成物が（１）腫瘍組織又はＰＣ−３腫瘍担持ＳＣＩＤマウスにおいてｒａｆ−１及びサイクリンＤ１の発現を効果的にノックダウンすることができ、そして（２）複合投与されたＴａｘｏｔｅｒｅの治療指数を増大させることを示すものである。

Ａ．材料及び方法
１．ＲＡＦｓｉＲＮＡの設計及び合成
ｒａｆｓｉＲＮＡ配列はｃ−ｒａｆ−１ｍＲＮＡ（ｎｔ６００〜６１８、ゲンバンクアクセッション番号Ｘ０３４８４）のコーディング領域内から設計し、ＢＬＡＳＴ検索においてスクリーニングすることによりｃ−ｒａｆ−１ｍＲＮＡとの顕著な配列相同性を確認した。Ｒａｆ−１に対する私有物の合成２本鎖ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から入手した。

２．リポソームの製造
ＰＬＣ−２−（ＣＣＬＡ）系リポソーム（ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ−ＡＴ（商標））は薄膜水和法を用いてＰＣＬ−２及びヘルパー脂質から実施例６に記載の通り製造した。

３．細胞培養
ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｂｒａｎｃｈ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した。腫瘍細胞は５％ＣＯ₂の湿潤雰囲気下３７℃において１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。培地及び関連の試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｎａｄ，ＣＡ）から購入した。

４．ｒａｆｓｉＲＮＡ−Ｎｅｏｐｈｅｃｔｉｎ複合体の製剤
凍結乾燥したｒａｆｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ非含有の水で水和させた。このｓｉＲＮＡ溶液をＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ−ＡＴ（商標）の適切な容量の入った試験管にゆっくり分注し、穏やかに混合し、マウスの投与前１５〜２０分間室温で維持した。ミスマッチｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ複合体は上記した通り製造した。

５．動物及び腫瘍の移植
雄性ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウス（３〜４週齢）をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）より入手した。マウスは無菌的に取り扱い、マイクロアイソレーター（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ，Ｉｔａｌｙ）中で飼育した。動物にはオートクレーブしたＴＥＫＬＡＤ１８％タンパク質のげっ歯類用飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびオートクレーブした水を自由摂取させた。対数生育期のＰＣ−３細胞を皮下注射した（５ｘ１０６個／０．１ｍｌ／動物）。腫瘍は約１２０ｍｍ３まで生育させた。

６．ウエスタンブロット分析
Ａｄｓｌｆｊ ＰＣ−３腫瘍担持ＳＣＩＤマウスを以下の投与群（投与は１日１回、ＱＤ、又は１日２回、ＢＩＤ）：ミスマッチｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ｘ５）、遊離ｒａｆｓｉＲＮＡ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ｘ５）、ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ又はＢＩＤ、ｘ５）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、遊離ｒａｆｓｉＲＮＡ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ、ｘ５）＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ、ｘ５）＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、及び対照（生理食塩水、ＢＩＤｘ５）に無作為に割り付けた。Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）単独投与群及び複合投与群においては、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を第２日（１０ｍｇ／ｋｇ）及び第５日（５ｍｇ／ｋｇ）に投与した。全ての投与は尾部静脈から静脈内投与した。腫瘍の組織は最終投与後６〜８時間以内に摘出した。Ｒａｆ−１及びサイクリンＤ１タンパク質発現は該当する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いたイムノブロッティングにより腫瘍組織ホモジネート中で検査した。ブロットをポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で再プロービングした。Ｒａｆ−１及びサイクリンＤ１タンパク質のレベルを低両氏、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて相当するレーンにおけるＧＡＰＤＨ発現に対して規格化した。

７．抗腫瘍薬効
ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎおよびｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎとＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）の組合せの治療薬効をヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）において評価した。動物を遊離のｒａｆｓｉＲＮＡ、ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）遊離のｒａｆｓｉＲＮＡ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、又はｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を尾部静脈から静脈内投与した。用量及び投与日程はウエスタンブロット分析において記載したものと同様とした。対照群にはｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎと同様の投与日程において生理食塩水を静脈内投与した。腫瘍の大きさは長さと幅をカリパスで測定することにより毎週１回又は２回モニタリングし、そして腫瘍容量は以下の式：長さｘ（幅／２）²ｘπを用いて計算した。各投与群の平均腫瘍体積±ＳＥＭを計算した。群間の統計学的有意差はスチューデントのｔ検定で求めた。

Ｂ．ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎの全身投与はＰＣ−３腫瘍組織におけるＲａｆ−１発現を抑制する。
連続５日間ＢＩＤで７．５ｍｇ／ｋｇの遊離のｒａｆｓｉＲＮＡを投与したところ、対照の生理食塩水群（１００％）と比較してＰＣ−３腫瘍組織においてＲａｆ−１の６３％発現がもたらされた（ｎ＝３）。ＱＤ又はＢＩＤ日程（連続５日間７．５ｍｇ／ｋｇ）でｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎを投与した動物はそれぞれ２１％及び１１％のＲａｆ−１発現を示した（図７Ａ及び７Ｂ）（ｎ＝２／３）。

連続５日間ＢＩＤで７．５ｍｇ／ｋｇのミスマッチｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎを投与した場合はＲａｆ−１のレベルに抑制作用は観察されなかった（ｎ＝３）。Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）単独又は遊離のｒａｆｓｉＲＮＡとＴａｘｏｔｅｒｅの組合せはそれぞれ４３％及び５１％のＲａｆ−１発現を示した（ｎ＝３）。

顕著な点は、ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎとＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）の組合せを投与した動物は対照群と比較してＰＣ−３腫瘍組織において僅か２％のＲａｆ−１発現を残存させたのみであった（ｎ＝３）（図７Ｃ及び７Ｄ）。

Ｃ．Ｒａｆ−１発現のｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ媒介抑制はＰＣ−３腫瘍組織の低下した発現と関連する。
サイクリンＤ１は細胞周期の進行の重要な調節物質である。更にサイクリンＤ１は数種の腫瘍型における癌遺伝子として機能する。本発明者らは腫瘍組織中のサイクリンＤ１発現に対するｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ投与の作用を評価した。遊離のｒａｆｓｉＲＮＡ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ｘ５）及びミスマッチｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、ｘ５）（ｎ＝３）の何れを投与した動物においてもＰＣ−３腫瘍組織におけるサイクリンＤ１発現には有意差はなかった（図７Ｅ及び７Ｆ）。

７．５ｍｇ／ｋｇ（ＱＤ、ｘ５）でのｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎのマウスへの投与は生理食塩水対照（１００％）と比較してサイクリンＤ１発現を５８％低下させた（ｎ＝３）。更にまた、７．５ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ、ｘ５）でのｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎの投与はサイクリンＤ１発現のより顕著な抑制をもたらした（７５％）。Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）単独又はＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）と遊離のｒａｆｓｉＲＮＡの組合せは腫瘍組織におけるサイクリンＤ１の発現を抑制しなかった。これと合致して、ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ、ｘ５）とＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）の組合せ投与はｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ単独の場合に匹敵するサイクリンＤ１発現の抑制をもたらした（ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ、６５％、ｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ、７５％；ｎ＝３）（図７Ｇおよび７Ｈ）。

Ｄ．ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎはＰＣ−３腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍生育を抑制しＴａｘｏｔｅｒｅへの応答を向上させる。
遊離のｒａｆｓｉＲＮＡは７．５ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ，ｘ５）は腫瘍生育に作用を有さない。Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）単独またはＴａｘｏｔｅｒｅを遊離のｒａｆｓｉＲＮＡと組み合わせて投与した動物は対照群と比較してそれぞれ７１％及び６６％の腫瘍生育抑制をもたらした（ｐ＜０．０５、投与開始後１８日）。ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎを７．５ｍｇ／ｋｇＱＤｘ５又は７．５ｍｇ／ｋｇＢＩＤｘ５を投与した動物は対照群と比較してそれぞれ３９％及び４９％の腫瘍生育抑制をもたらした（ｐ＜０．０５、投与開始後１８日）。

最も着目すべきは、ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ及びＴａｘｏｔｅｒｅの組み合わせの腫瘍に対する作用であった。投与開始後１８日において、ｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ及びＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）の組み合わせ投与は対照群と比較して８９％の腫瘍生育抑制および単剤に対して１８〜５０％増強された抑制をもたらした（図７Ｉ）。

病的状態又は死亡はｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ投与には伴わなかった。Ｒａｆ−１発現の顕著なノックダウンはＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ−ＡＴ（商標）がインビボのｒａｆｓｉＲＮＡの送達及び有効性を増強したことを示唆している。ＢＩＤ日程における遊離のｒａｆｓｉＲＮＡの投与はＲａｆ−１発現の中等度の抑制をもたらし、そしてこれは遊離のｒａｆｓｉＲＮＡの急速な分解又は不活性化、又は、遊離のｒａｆｓｉＲＮＡの乏しい細胞内取り込みに起因すると考えられる。ミスマッチのｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎを投与した動物と比較してＱＤ又はＢＩＤ日程でｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎを投与した動物の腫瘍組織中でＲａｆ−１タンパク質発現の顕著なダウンレギュレーション観察され、ｒａｆｓｉＲＮＡがＲａｆ−１を特異的にターゲティングすることを示唆している。Ｒａｆ−１のｒａｆｓｉＲＮＡ−媒介サイレンシングは細胞周期の進行及び新生物性の形質転換の調節に関与しているサイクリンであるサイクリンＤ１の低減された発現に関連していることがわかった。これらのデータはｒａｆｓｉＲＮＡが単独又は抗腫瘍薬と組み合わせてヒト前立腺又は他の癌の型の治療のために投与できる次世代の治療薬として研究開発することができることを示唆している。

製造実施例
実施例８−Ａ：カチオン性カルジオリピン類縁体（１１）［図８Ａ］の合成
１，３−ビス［（２−エトキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン）］−２−ベンジルオキシ−グレセロール（７）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水ＤＭＦ（３００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（５９．３ｇ、１．４８モル、油中６０％）の攪拌懸濁液に、ＤＭＦ（７００ｍＬ）中の２−ベンジルオキシ１，３−プロパンジオール（５）（９０ｇ、０．４９モル）の溶液を１５℃以下の温度を維持しながら２時間かけて添加した。２時間室温で攪拌後、２−（２−ブロモエトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（６）（３１０ｇ、１．４８モル）を温度を１０℃以下に維持しながら３時間かけて０℃で添加した。反応混合物を１２時間室温で攪拌した。反応混合物を０℃に冷却し、氷水を非常にゆっくり添加し、過剰の水素化ナトリウムをクエンチングした。反応混合物を減圧下に濃縮し、最大量のＤＭＦを除去し、粗製の溶液を水（１Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（２ｘ５００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上に乾燥した。溶媒を減圧下に濃縮した。粗製の化合物をヘキサン中の１０〜３０％酢酸エチルでシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として１，３−ビス−［（２−エトキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン）］−２−ベンジルオキシ−グリセロール（７）（１５４ｇ、７１％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（３：２）Ｒ_f〜０．４０。

３，７−ジオキサ−５−ベンジルオキシ−１，９−ノナンジオール（８）

メタノール（５００ｍＬ）中の１，３−ビス［（２−エトキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン）］−２−ベンジルオキシ−グリセロール（７）（５０ｇ、０．１１モル）の溶液に、エーテル（５ｍＬ）中の１ＮＨＣｌを添加し、２時間室温で攪拌した。反応混合物を溶液が中和するまで重炭酸ナトリウムで中和した。反応混合物を濾過し、減圧下に濃縮した。粗製の化合物を酢酸エチル（１Ｌ）中に溶解し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上に乾燥した。有機層を減圧下に濃縮し、粗製の化合物を酢酸エチル次いで酢酸エチル中の５％メタノールを溶離剤とするシリカゲル（７０〜２３０メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として３，７−ジオキサ−５−ベンジルオキシ−１，９−ノナンジオール（８）（２７ｇ、８８％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）酢酸エチルＲ_f〜０．１０。

１，９−ジブロモ−３，７−ジオキサ−５−ベンジルオキシ−ノナン（９）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水ジクロロメタン（４００ｍＬ）中の３，７−ジオキサ−５−ベンジルオキシ−１，９−ノナンジオール（８）（２７ｇ、０．１モル）の溶液に、トリフェニルホスフィン（６５．５ｇ、０．２５モル）次いで四臭化炭素（７９．４ｇ、０．２４モル）を添加した。反応混合物を２時間０℃で攪拌した。反応混合物を水（３００ｍＬ）で希釈し、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上に乾燥した。有機層を減圧下に濃縮し、粗製の化合物をヘキサン中の２０％酢酸エチルでシリカゲル（７０〜２３０メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として１，９−ジブロモ−３，７−ジオキサ−５−ベンジルオキシ−ノナン（９）（３６ｇ、９１％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（３：２）Ｒ_f〜０．６０。

１，３−ビス−（２−ブロモエトキシ）プロパン−２−オール（１０）

１，９−ジブロモ−３，７−ジオキサ−５−ベンジルオキシ−ノナン（９）（３６ｇ、９０．９０ミリモル）をエタノール（１１０ｍＬ）中に溶解し、５０ｐｓｉ気圧で２時間１０％Ｐｄ／Ｃ（３．６ｇ）とともに水素化した。触媒を濾過後、溶液を減圧下に蒸発させた。粗製の物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０〜２３０メッシュ）に付し、ヘキサン中の６０％酢酸エチルで溶離して、無色の油状物として１，３−ビス−（２−ブロモエトキシ）プロパン−２−オール（１０）（２６ｇ、９４％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：１）Ｒ_f〜０．３０。

（Ｒ，Ｓ）−１，３−ビス−（１，２−ジテトラデシルオキシプロピル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−エトキシアンモニウムブロミド）プロパン−２−オール（１１）

無水エタノール（６００ｍＬ）中の１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（２）（５０．２ｇ、９８．３６ミリモル）および１，３−ビス−（２−ブロモエトキシ）プロパン−２−オール（１０）（１０ｇ、３２．７８ミリモル）の溶液を５日間かけて７８〜８０℃で還流した。反応混合物を冷却し、溶媒を蒸発させ、粗製のワックス状固体を得た。ヘキサン（４００ｍＬ）を添加し、１時間攪拌した。固体を濾過し、ヘキサン（６ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。化合物を再結晶［化合物／メタノール／アセトン比率（１：３：５０）］により精製し、一夜−２０℃を保持した。分離した固体を濾過し、冷アセトンで洗浄した。再結晶を２回繰り返し、分析上純粋な試料を得た。化合物を真空下に２４時間、次に３６時間Ｐ₂Ｏ₅上に乾燥し、白色固体としてカチオン性カルジオリピン類縁体（１１）（３０ｇ、６９％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）メタノール／クロロホルム（１：９）Ｒ_f〜０．１１。

実施例８Ｂ：カチオン性カルジオリピン類縁体（１９）［図８Ｂ］の合成
（Ｒ）−４−（ベンジルオキシメチル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（１３）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（３０．３ｇ、０．７５モル、油中の６０％）の攪拌懸濁液に、内部温度を２０℃以下に維持しながら１時間かけてＲ（−）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（１２）（５０ｇ、０．３７モル）を添加した。１時間室温で攪拌後、臭化ベンジル（９７．１ｇ、０．５６モル）を１時間かけて０℃で添加した。添加完了後、反応混合物を室温で１４時間攪拌した。反応混合物を０℃に冷却し、冷水を非常にゆっくり添加し、この混合物を飽和塩化アンモニウム水（５００ｍＬ）で希釈した。水層を酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出し、水（３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下に濃縮し、シロップとして（Ｒ）−４−ベンジルオキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（１３）（１２１ｇ）粗生成物を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．２６（粗製の物質を精製することなく次工程に付した）。

（Ｓ）−（−）−３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（１４）

メタノール（７００ｍＬ）中の（Ｒ）−４−ベンジルオキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（１３）（１２０ｇ）の溶液に濃ＨＣｌ（２０ｍＬ）を添加し、１０時間室温で攪拌した。反応混合物を溶液が中和するまで重炭酸ナトリウムで中和した。反応混合物を濾過し、減圧下に濃縮した。粗製の化合物をジクロロメタン（６００ｍＬ）中に溶解し、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上に乾燥した。有機層を減圧下に濃縮した。粗製の化合物を溶離剤としてヘキサン中の１０〜２０％酢酸エチル次いで酢酸エチル中の１０％メタノールでシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、シロップとして（Ｓ）−（−）−３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（１４）（６４ｇ、９３％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）酢酸エチルＲ_f〜０．４４。

（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−Ｏ−ベンジルプロパン（１５）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水ＤＭＦ（２２０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（５４．５ｇ、１．３６モル、油中６０％）の攪拌懸濁液にＤＭＦ（４００ｍＬ）中の（Ｓ）−（−）−３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（１４）（６２ｇ、０．３４モル）の溶液を内部温度を２０℃以下に維持しながら１時間かけて添加した。２時間室温で攪拌後、臭化テトラデシル（３７７．４ｇ、１．３６モル）を２時間かけて０℃で添加した。添加完了後、反応混合物を室温で２時間攪拌し、温度を徐々に７０℃に上昇し、次に５時間攪拌した。反応混合物を０℃に冷却し、冷水を非常にゆっくり添加し、飽和塩化アンモニウム水（５００ｍＬ）で希釈した。水層を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出し、水（３ｘ１Ｌ）で洗浄した。有機層を減圧下に濃縮し、粗生成物をヘキサン中の２〜１０％酢酸エチルを溶離剤とするシリカゲル（７０〜２３０メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデジルオキシ−３−Ｏ−ベンジルプロパン（１５）（１４６ｇ、７５％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．５３。

（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロパン−３−オール（１６）

（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−Ｏ−ベンジルプロパン（１５）（７０ｇ、０．１２ミリモル）の溶液を酢酸エチル（２８０ｍＬ）中に溶解し、５０ｐｓｉ気圧で１２時間１０％パラジウム（３ｇ）とともに水素化した。触媒を濾過後、溶液を減圧下に蒸発させた。残存物を熱エタノール（５００ｍＬ）中に溶解し、一夜−２０℃で保持した。分離した固体を濾過し、真空下に乾燥し、白色固体として（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロパン−３−オール（１６）（５４ｇ、９２％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．１７。

（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ブロモプロパン（１７）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水ジクロロメタン（２８０ｍＬ）中の（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロパン−３−オール（１６）（５２ｇ、０．１モル）の溶液に、トリフェニルホスフィン（３５．１ｇ、０．１３モル）を添加した。ジクロロメタン（２４０ｍＬ）中の四臭化炭素（４６．２ｇ、０．１３モル）の溶液を反応混合物に１時間かけて滴下し、さらに３時間０℃で攪拌した。反応混合物を水（５００ｍＬ）で希釈し、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上に乾燥した。有機層を減圧下に濃縮し、粗製の化合物をヘキサン中の１〜５％酢酸エチルでシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ブロモプロパン（１７）（５３ｇ、９０％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．７２。

（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（１８）

（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ブロモプロパン（１７）（５０ｇ、０．０９モル）をネジ蓋圧力ビン中にジメチルアミンの２Ｍメタノール性溶液（４００ｍＬ）中に溶解した。圧力ビンを密封し、６０時間８８〜９０℃で攪拌しながらオイルバス中に加熱した。圧力ビンを冷却し、溶液を減圧下に濃縮した。粗製の残存物を酢酸エチル（５００ｍＬ）中に溶解し、水（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下に濃縮し、溶離剤としてヘキサン中の５〜２０％酢酸エチルでシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、明色の油状物として（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（１８）（４１ｇ、８８％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）メタノール／クロロホルム（１：９）Ｒ_f〜０．５１。

（Ｒ）−１，３−ビス−（１，２−ジテトラデシルオキシプロピル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−エトキシアンモニウムブロミド）プロパン−２−オール（１９）

無水エタノール（４３０ｍＬ）中の（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（１８）（３５．６ｇ、６９．８ミリモル）および１，３−ビス−（２−ブロモエトキシ）プロパン−２−オール（１０）（７．１ｇ、２３．２ミリモル）の溶液を５日間かけて７８〜８０℃で還流した。熱反応混合物をエルレンマイヤーフラスコに移送し、２時間かけてアセトン（４．３Ｌ）を滴下した。混合物を一夜−２０℃で保持した。固体を濾過し、冷アセトン（５００ｍＬ）で洗浄し、無色の白色固体（２８ｇ）を得た。粗製の固体を温メタノール（１４０ｍＬ）：アセトン（１．４Ｌ）の混合物中での再結晶により精製し、次に一夜−２０℃で貯蔵した。固体を分離し、濾過し、冷アセトン（３００ｍＬ）で洗浄した。再結晶を２回繰り返し、分析上純粋な試料を得た。化合物を２４時間、次に真空下にＰ₂Ｏ₅上に３６時間乾燥し、白色固体として（Ｒ）−カチオン性カルジオリピン類縁体（１９）（２４ｇ、７８％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）メタノール／クロロホルム（１：９）Ｒ_f〜０．１３。

実施例８Ｃ：カチオン性カルジオリピン類縁体（２７）［図８Ｃ］の合成
（Ｓ）−４−（ベンジルオキシメチル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（２１）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水テトラヒドロフラン（３５０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（２２．７ｇ、０．５７モル、油中６０％）の攪拌懸濁液に内部温度を２０℃以下に維持しながら１時間かけてＳ（−）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（２０）（５０ｇ、０．３７モル）を添加した。１時間室温で攪拌後、臭化ベンジル（９７．１ｇ、０．５６モル）を１時間かけて０℃で添加した。添加完了後、反応混合物を室温で１８時間攪拌した。反応混合物を０℃に冷却し、氷水（２０ｍＬ）を非常にゆっくり滴下し、この混合物を飽和塩化アンモニウム水（５００ｍＬ）で希釈した。水層を酢酸エチル（７５０ｍＬ）で抽出した。有機層を減圧下に濃縮し、シロップとして粗生成物（Ｓ）−４−ベンジルオキシメチル−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（２１）（８３ｇ）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．２６。

（Ｒ）−（−）−３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（２２）

メタノール（８００ｍＬ）中の（Ｓ）−４−（ベンジルオキシメチル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（２１）（８３ｇ）の溶液に、濃ＨＣｌ（２０ｍＬ）を添加し、１５時間室温で攪拌した。反応混合物を溶液が中和するまで重炭酸ナトリウムで中和した。反応混合物を濾過し、減圧下に濃縮した。粗製の化合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）中に溶解し、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上に乾燥し、減圧下に濃縮した。粗製の化合物を溶離剤としてヘキサン中の１０〜２０％酢酸エチル次いで酢酸エチル中の１０％メタノールでシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、シロップとして（Ｒ）−（−）−３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（２２）（６５ｇ、９４％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）酢酸エチルＲ_f〜０．４４。

（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−Ｏ−ベンジルプロパン（２３）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（３８．４ｇ、０．９６モル、油中６０％）の攪拌懸濁液に、内部温度２０℃以下を維持しながら１時間かけてＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の（Ｒ）−（−）−３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（２２）（３５ｇ、０．１９モル）の溶液を添加した。２時間室温で攪拌後、臭化テトラデシル（２６６ｇ、０．９７モル）を２時間かけて０℃で添加した。添加完了後、反応混合物を２時間室温で攪拌し、温度を徐々に６０℃に上昇し、次に２０時間攪拌した。反応混合物を０℃に冷却し、氷水を非常にゆっくり滴下し、飽和塩化アンモニウム水（５００ｍＬ）で希釈した。水層をヘキサン（３ｘ５００ｍＬ）で抽出し、水（５００ｍＬ）および塩水（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下に濃縮し、粗生成物をヘキサン中の２〜１０％酢酸エチルを溶離剤とするシリカゲル（７０〜２３０メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−Ｏ−ベンジルプロパン（２３）（８８ｇ、８０％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．５３。

（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロパン−３−オール（２４）

（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−Ｏ−ベンジルプロパン（２３）（８３．８ｇ、０．１４モル）を酢酸エチル（４５０ｍＬ）中に溶解し、５０ｐｓｉ気圧で１２時間１０％Ｐｄ／Ｃ（３．１ｇ）とともに水素化した。触媒を濾過後、溶液を減圧下に蒸発させた。残存物を熱ヘキサン（２００ｍＬ）中に溶解し、一夜−２０℃で保持した。分離した固体を濾過し、乾燥して白色固体として（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロパン−３−オール（２４）（６４．８ｇ、９２％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．１７。

（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ブロモプロパン（２５）

０℃でアルゴン雰囲気下に無水ジクロロメタン（３７５ｍＬ）中の（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロパン−３−オール（２４）（３６．８ｇ、５９．０ミリモル）の溶液に、トリフェニルホスフィン（２７．９ｇ、１０６．０ミリモル）を添加した。ジクロロメタン（６０ｍＬ）中の四臭化炭素（３６．２ｇ、１０９．０ミリモル）の溶液を１時間かけて反応混合物に滴下した。反応混合物をさらに２時間０℃で攪拌し、次に水（３ｘ３００ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上に乾燥し、減圧下に濃縮した。粗製の化合物をヘキサン中の１〜５％酢酸エチルでシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の油状物として（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ブロモプロパン（２５）（３７．８ｇ、８７％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）ヘキサン／酢酸エチル（１：９）Ｒ_f〜０．７２。

（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（２６）

（Ｒ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ブロモプロパン（２５）（３６．７ｇ、０．０７モル）をネジ蓋圧力ビン中にジメチルアミンの２Ｍメタノール性溶液（４５０ｍＬ）中に溶解した。圧力ビンを密封し、７５時間９２℃で攪拌しながらオイルバス中に加熱した。圧力ビンを冷却し、溶液を減圧下に濃縮した。粗製の残存物を酢酸エチル（５００ｍＬ）中に溶解し、水（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下に濃縮し、溶離剤としてヘキサン中の５〜２０％酢酸エチルでシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、明色の油状物として（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（２６）（２８．７ｇ、８０％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）メタノール／クロロホルム（２：８）Ｒ_f〜０．６６。

（Ｓ）−１，３−ビス−（１，２−ジテトラデシルオキシプロピル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−エトキシアンモニウムブロミド）プロパン−２−オール（２７）

無水エタノール（２２０ｍＬ）中の（Ｓ）−１，２−ビス−テトラデシルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（２６）（２２．５ｇ、４３．９ミリモル）および１，３−ビス−（２−ブロモエトキシ）プロパン−２−オール（１０）（４．４８ｇ、１４．６ミリモル）の溶液を５日間かけて７８〜８０℃で還流した。熱溶液をエルレンマイヤーフラスコに移送し、溶液を攪拌しながらアセトン（２．５Ｌ）を滴下した。フラスコを１５時間冷凍庫（−２５℃）中に貯蔵した。白色固体を濾過し、冷アセトン（１００ｍＬ）で洗浄した。生成物をクロロホルム（１００ｍＬ）中に溶解し、アセトン（１Ｌ）を添加した。フラスコを１５時間−２５℃で貯蔵した。分離した白色固体を濾過し、冷アセトン（１００ｍＬ）で洗浄した。再結晶工程を３回繰り返した。生成物をヘキサン（１Ｌ）で磨砕し、濾過し、２４時間高真空下にＰ₂Ｏ₅上に乾燥し、白色固体として（Ｓ）−カチオン性カルジオリピン類縁体（２７）（１５．５ｇ、８０％）を得た。ＴＬＣ（ＳｉＯ₂）メタノール／クロロホルム（１：９）Ｒ_f〜０．１３。

本明細書において引用した全ての公開物、特許出願及び特許は参照によりそれらの個々の全体が特に本明細書に記載されているがごとく本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載するものは（特に後続する請求項において）単数と複数は特段の記載が無い限り区別しない。「含む」、「有する」、「含む」及び「含有する」とは特段の記載が無い限り範囲が開放された意味である（即ち「含むが限定されない」意味）。本明細書の数値範囲の記載は特段の記載が無い限りその範囲に個々の数値が属することを独立して指すための簡便な方法として機能することを意図するのみであり、そして個々の数値は独立して本明細書に記載されるがごとく明細書中に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は特段の記載が無い限り、または、内容により矛盾が生じない限り、如何なる適当な順序において実施することもできる。実施例及び例示の表記法（例えば「のような」）の使用は本発明をよりよく説明することを意図しており、特段の記載が無い限り本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の表記は請求項に記載しない要素の何れも本発明の実施のために必須であるものとして指し示すものとする。

本発明を実施するために発明者ら既知の最良の様式を含む本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載した。これらの好ましい実施形態の変形例は本明細書を読むことにより当業者には自明である。本発明者らは当業者がそのような変形例を適宜使用することを予測しており、本明細書に特記したもの以外で本発明を実施することも意図している。従って本発明は適用される法律の許可する限り添付請求項に記載した要件の全ての変更例及び同等物を包含するものとする。更にまた、全ての可能な変形例における上記した要素の如何なる組み合わせも、特段の記載が無い限り、または、内容により矛盾が生じない限り、本発明に包含されるものとする。

ＬＥａｆＡＯＮ−ＥＴＵの製造方法を示す。 ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺（ＰＣ−３）腫瘍生育に対抗するＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）と組み合わせたＤＤＡＢ−リポソーム又はカチオン性カルジオリピンリポソーム系のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の治療効果に関するグラフで表示したデータである。 ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺（ＰＣ−３）腫瘍生育に対抗するＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）と組み合わせたＤＤＡＢ−リポソーム又はカチオン性カルジオリピンリポソーム系のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の作用を示す。 マウスにおけるＤＤＡＢ^*−リポソーム又はカチオン性カルジオリピンリポソーム系のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の毒性に関するグラフで表示したデータである。 ＣＨＯ細胞におけるＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）のトランスフェクション効率に関するグラフで表示したデータである。 ＣＯＳ−１細胞におけるＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）のトランスフェクション効率に関するグラフで表示したデータである。 一次ラット肺微小血管内皮細胞（ＲＬＭＶＥＣ）におけるＲＮＡｉのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）媒介送達に関するグラフで表示したデータである。 ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞におけるＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）のトランスフェクション効率に関するグラフで表示したデータである。 ラット肺微小血管内皮一次細胞培養物（ＰＬＭＶＥＣ）におけるＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を用いたｄｓＲＮＡ干渉によるサイトカイン受容体（ＴｂＲＩＩ）発現の抑制に関するグラフで表示したデータである。 ４８時間後の一次細胞におけるＲＮＡｉ（２００ｎＭ）オリゴヌクレオチドのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）媒介送達の作用を示す。 ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）（２．５μｇ／ｍＬ）媒介送達が一次ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴ＿ＲＩＩ遺伝子を抑制することを示すグラフで表示したデータである。 ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）（２．５μｇ／ｍＬ）媒介送達が一次ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）におけるＴ＿ＲＩＩ遺伝子を抑制することを示すグラフで表示したデータである。 ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）（２．５μｇ／ｍＬ）媒介送達が一次ラット肺微小血管内皮細胞（ＲＬＭＶＥＣ）におけるＴ＿ＲＩＩ遺伝子を抑制することを示すグラフで表示したデータである。 ＣＨＯ、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、ＨｅｐＧ₂、ＭＸ−１及びＡ５４９細胞におけるＰＣＬ−２−（ＣＣＬＡ）系リポソームのトランスフェクション効率に関するグラフで表示したデータである。 Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺（上パネル）及び心臓（下パネル）組織におけるＰＣＬ−２−ＣＣＬＡ−系のリポソームのトランスフェクション活性に関するグラフで表示したデータである。 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるインビボＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）と比較した場合のＣＣＬＡ系リポソームの形質転換効率に関するグラフで表示したデータである。 Ａ５４９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＫ−ＯＶ−３癌細胞におけるｃ−ｒａｆに対抗するＣＣＬＡ系リポソームにより送達されたｓｉＲＮＡのインビトロの抗力に関するグラフで表示したデータである。 ＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳癌腫瘍異種移植片モデルを用いたｃ−ｒａｆに対抗するＣＣＬＡ系リポソームにより送達されたｓｉＲＮＡのインビボの抗力に関するグラフで表示したデータである。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を投与した動物におけるＲａｆ−１の発現を示す。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を投与した動物におけるＲａｆ−１の発現に関するグラフで表示したデータである。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）およびＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を投与した動物におけるＲａｆ−１の発現を示す。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）およびＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を投与した動物におけるＲａｆ−１の発現に関するグラフで表示したデータである。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を投与した動物におけるサイクリンＤ−１の発現を示す。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）を投与した動物におけるサイクリンＤ−１の発現に関するグラフで表示したデータである。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）およびＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を投与した動物におけるサイクリンＤ−１の発現を示す。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるヒト前立腺腫瘍モデル（ＰＣ−３）におけるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）およびＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）を投与した動物におけるサイクリンＤ−１の発現に関するグラフで表示したデータである。 ＣＢ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるＰＣ−３腫瘍異種移植片における腫瘍生育を抑制し、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）への応答を向上させるｒａｆｓｉＲＮＡ−ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ（商標）の能力に関するグラフで表示したデータである。 本発明の内容において有用なカチオン性カルジオリピン分子の合成を示す。 本発明の内容において有用なカチオン性カルジオリピン分子の合成を示す。 本発明の内容において有用なカチオン性カルジオリピン分子の合成を示す。

Claims (119)

1. １，３−ビス−（１，２−ビステトラデシルオキシ−プロピル−３−ジメチルエトキシアンモニウムブロミド）−プロパン−２−オール（ＰＣＬ−２）を含み、そして更にコレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、αトコフェリル酸スクシネートおよび何れかの他のホスファチジルコリンからなる脂質群から選択される少なくとも１つの脂質を含む組成物。
2. ＤＯＰＣ、ＰＣＬ−２及びコレステロールからなる請求項１に記載の組成物。
3. ＤＯＰＣ：コレステロール：ＰＣＬ−２のパーセントモル比が約（５０〜６５）：（２５〜３５）：（５〜２０）である請求項２に記載の組成物。
4. 更にＤ−αトコフェリル酸スクシネートを含む請求項２又は３に記載の組成物。
5. Ｄ−αトコフェリル酸スクシネートが約０．１重量％〜約１重量％存在する請求項４に記載の組成物。
6. ＰＣＬ−２及びコレステロールからなる請求項１に記載の組成物。
7. ＰＣＬ−２とコレステロールのモル比が１：３〜６：１である請求項６に記載の組成物。
8. ＰＣＬ−２及びＤＯＰＥからなる請求項１に記載の組成物。
9. ＰＣＬ−２とＤＯＰＥのモル比が１：３〜３：１である請求項８に記載の組成物。
10. ＰＣＬ−２とＤＯＰＥのモル比が１：２である請求項９に記載の組成物。
11. 総脂質濃度が約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬである請求項６〜１０のいずれかに記載の組成物。
12. ＰＣＬ−２の濃度が約１０ｍＭである請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
13. 更に糖を含む請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
14. 糖がスクロースである請求項１３に記載の組成物。
15. 糖が約５重量％〜約３０重量％存在する請求項１３又は１４に記載の組成物。
16. 更に担体を含む請求項１〜１５に記載の組成物。
17. 担体が水である請求項１６に記載の組成物。
18. 担体が生理学的に適合性のある緩衝液である請求項１６に記載の組成物。
19. ＰＣＬ−２の一部が乳液の部分である請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
20. ＰＣＬ−２の一部がリポソーム内に存在する請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
21. リポソームの平均サイズが約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである請求項２０に記載の組成物。
22. リポソームの９９％が約１７０ｎｍ〜約５００ｎｍより小さい直径を有する請求項２０又は２１に記載の組成物。
23. 約３〜約８のｐＨを有する請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
24. 約７〜約８のｐＨを有する請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
25. 更に少なくとも１つの活性剤を含む請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
26. 活性剤がポリヌクレオチドである請求項２５に記載の組成物。
27. ポリヌクレオチドが治療用ポリペプチドをコードする請求項２６に記載の組成物。
28. 治療用ポリペプチドが免疫原性のペプチドを含む請求項２７に記載の組成物。
29. ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項２６に記載の組成物。
30. ＤＮＡがオリゴデオキシルボヌクレオチドである請求項２９に記載の組成物。
31. カチオン性のカルジオリピンＰＣＬ−２：オリゴデオキシリボヌクレオチドの対応する電荷比が（１．０〜４．０）：１の範囲である請求項３０に記載の組成物。
32. 前記対応する総脂質がオリゴデオキシリボヌクレオチドモル量に対して（１０〜２００）：１の範囲である請求項３０に記載の組成物。
33. オリゴデオキシリボヌクレオチドが少なくとも１つのホスホチオエート修飾を含有する請求項３０に記載の組成物。
34. オリゴデオキシリボヌクレオチドの大きさが１０〜４０ヌクレオチドである請求項３０に記載の組成物。
35. オリゴデオキシリボヌクレオチドの大きさが１５〜２５ヌクレオチドである請求項３４に記載の組成物。
36. リポソームを含み、オリゴデオキシリボヌクレオチドの６０〜８０％がリポソームの内部コア内のカチオン性脂質と複合体化している請求項３０〜３５のいずれかに記載の組成物。
37. オリゴデオキシリボヌクレオチドが５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号１）を含む配剤を有する請求項３０〜３６のいずれかに記載の組成物。
38. ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項２６に記載の組成物。
39. ＲＮＡがｓｉＲＮＡである請求項３８に記載の組成物。
40. ポリヌクレオチドがヒトｍＲＮＡにハイブリダイズする請求項２６〜３９のいずれかに記載の組成物。
41. ポリヌクレオチドが植物ｍＲＮＡにハイブリダイズする請求項２６〜３９のいずれかに記載の組成物。
42. ポリヌクレオチドが植物、寄生虫又はカビのｍＲＮＡにハイブリダイズする請求項２６〜３９のいずれかに記載の組成物。
43. ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへの結合により遺伝子の発現を抑制する請求項４０〜４２のいずれかに記載の組成物。
44. ｍＲＮＡが癌遺伝子である請求項４０に記載の組成物。
45. 癌遺伝子がｒａｓ、ｒａｆ ｃｏｔ、ｍｏｓ、ｍｙｃからなる癌遺伝子群から選択される請求項４４に記載の組成物。
46. 癌遺伝子がｃ−ｒａｆ−１である請求項４４又は４５に記載の組成物。
47. 化粧品用の請求項１〜４６のいずれかに記載の組成物の使用。
48. ワクチン用の請求項１〜４６のいずれかに記載の組成物の使用。
49. 農業目的の請求項１〜４６のいずれかに記載の組成物の使用。
50. 前記ポリヌクレオチドが前記細胞に進入し、これによりポリヌクレオチドが、前記新生物細胞内で自体がターゲティングされている前記癌遺伝子の発現を抑制するような条件下において、新生物細胞に請求項４０〜４６のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、新生物細胞の成育の抑制方法。
51. 前記細胞がインビトロである請求項５０に記載の方法。
52. 前記細胞がインビボである請求項５０に記載の方法。
53. 前記ポリヌクレオチドが患者の新生物細胞に進入し、これによりポリヌクレオチドが、前記新生物細胞内で自体がターゲティングされている前記癌遺伝子の発現を抑制するような条件下において、前記患者に請求項４０、４３、４４、４５又は４６のいずれかに記載の組成物を投与することを含む新生物疾患に罹患した患者を治療する方法。
54. 患者が脊椎動物である請求項５３に記載の方法。
55. 脊椎動物がヒトである請求項５４に記載の方法。
56. 前記新生物疾患が癌を含む請求項５３〜５５のいずれかに記載の方法。
57. 前記新生物細胞が腫瘍内にある請求項５３〜５６のいずれかに記載の方法。
58. 前記新生物細胞が転移性の細胞である請求項５３〜５６のいずれかに記載の方法。
59. 組成物を第２の抗腫瘍薬と組み合わせて投与する請求項５３〜５８のいずれかに記載の方法。
60. 組成物を第２の抗腫瘍薬の前、同時、又は後投与する請求項５９に記載の方法。
61. 抗腫瘍薬が放射線である請求項５９又は６０に記載の方法。
62. 抗腫瘍薬が化学療法剤である請求項５９又は６０に記載の方法。
63. 抗腫瘍薬がドセタキセルである請求項５９又は６０に記載の方法。
64. （ａ）カチオン性リポソーム及びＲＮＡｉを含む組成物を細胞に投与することによりＲＮＡｉを細胞に進入させて細胞内の遺伝子発現を抑制させること、および（ｂ）遺伝子の抑制を試験すること、を含む、標的遺伝子を確認するための方法。
65. 組成物が請求項１〜４６のいずれかに記載の組成物である請求項６４に記載の方法。
66. 蛍光カチオン性カルジオリピン類縁体。
67. 蛍光／ルミネセント部分にコンジュゲートしたカチオン性カルジオリピン分子を含む請求項６６に記載の蛍光カチオン性カルジオリピン類縁体。
68. カチオン性カルジオリピン分子がＰＣＬ−２である請求項６７に記載の蛍光カチオン性カルジオリピン類縁体。
69. ルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体。
70. 蛍光／ルミネセント部分にコンジュゲートしたカチオン性カルジオリピン分子を含む請求項６９に記載のルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体。
71. カチオン性カルジオリピン分子がＰＣＬ−２である請求項６９〜７０のいずれかに記載のルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体。
72. 請求項６６〜７１のいずれかに記載の蛍光／ルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体及び生理学的に許容される担体を含む組成物。
73. 請求項６６〜７１のいずれかに記載の蛍光／ルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体を含むリポソーム組成物。
74. 別の脂質を更に含む請求項７３のリポソーム組成物。
75. 生理学的に許容される担体を更に含む請求項７４に記載のリポソーム組成物。
76. （ａ）請求項７２〜７５のいずれかに記載の組成物を動物に導入すること、（ｂ）蛍光／ルミネセントカチオン性カルジオリピン類縁体に蛍光又はルミネセントとすること、及び、（ｃ）蛍光又はルミネセンスの位置を観察すること、を含む動物内の脂質物質の遊走を追跡する方法。
77. 工程（ｂ）及び（ｃ）を一回以上反復する請求項７６に記載の方法。
78. トランスフェクション剤としての請求項１〜４６のいずれかに記載の組成物の使用。
79. 組成物内に存在するポリヌクレオチドが細胞内に進入するのに十分な条件下で請求項１〜４６のいずれかに記載の組成物に細胞を曝露することを含むポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトする方法。
80. 細胞がインビトロである請求項７９に記載の方法。
81. 細胞がインビボである請求項７９に記載の方法。
82. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
83. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
84. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
85. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
86. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
87. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
88. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
89. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
90. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
91. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
92. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
93. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
94. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
95. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
96. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
97. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
98. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
99. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
    

    

    を含む請求項３９に記載の組成物。
100. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
101. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
102. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
103. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
104. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
105. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
106. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
107. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
108. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
109. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
110. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
111. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
112. ｓｉＲＮＡが以下の配列：
     

     

     を含む請求項３９に記載の組成物。
113. 活性剤複数を含む請求項１〜１１２のいずれかに記載の組成物。
114. 少なくとも２つの活性剤が核酸を含む請求項１１３に記載の組成物。
115. 前記少なくとも１つの核酸がｓｉＲＮＡ種である請求項１１４に記載の組成物。
116. 前記少なくとも１つの核酸がオリゴヌクレオチドである請求項１１４に記載の組成物。
117. 第１及び第２の核酸が個別の遺伝子配列をターゲティングする請求項１１４〜１１６のいずれかに記載の組成物。
118. 個別の遺伝子配列が個別の遺伝子内に存在する請求項１１７に記載の組成物。
119. 個別の遺伝子配列が同じ遺伝子内に存在する請求項１１７に記載の組成物。

Images