JP2007514442A - 前立腺癌治療を評価するための方法および物質 - Google Patents

Abstract

同系前立腺癌異種移植モデルのマイクロアレイに基づくプロファイリングを使用して、本発明者らは、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）ｍＲＮＡの適度の増加（２〜５倍）が、抗アンドロゲン治療に対する抵抗性の発生に矛盾なく関連する唯一の発現の変化であることを見出した。増加したレベルのＡＲは、低レベルの残余のリガンドからシグナル出力を増幅すること、およびアンタゴニストに対する正常な応答を変更することにより、抗アンドロゲンに対する抵抗性を与える。本発明は、新規の治療様式の試験における使用のための細胞に基づくアッセイを提供し、そして新規抗アンドロゲンの設計への洞察を提供する。

Description

（発明の背景）
本発明は、米国政府の支援による国防総省助成金ＤＡＭＤ１７−０２−１−００２４の下でなされた。米国政府は、本発明に対する特定の権利を保有し得る。

（１．発明の分野）
本発明は、前立腺癌治療を評価するための方法および物質に関する。

（２．関連する分野の説明）
癌は、心臓の冠性心疾患に次ぐ、第２の主要な人間の死因である。世界的に、毎年数百万もの人々が癌で死亡する。米国癌学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）により報告されるように、米国だけでも、癌は、毎年５０万人をはるかに超える人々の死を引き起こし、１年あたりに診断される新しい症例は１２０万例をこえる。心臓疾患由来の死亡は有意に減少する一方で、癌に起因する死亡は、徐々に増加傾向にある。今世紀中に、癌が主要な死因になることが予測される。

世界的に数種類の癌は、主要な致命的な病気として際立っている。特に、肺癌腫、前立腺癌腫、乳癌腫、結腸癌腫、膵臓癌腫および卵巣癌腫は、癌による死亡の主要な原因である。これらの癌および実質的に他の全ての癌腫は、共通の致命的な特徴を共有する。ごくわずかな例外はあるが、癌腫由来の転移性の疾患は致命的である。さらに、原発性の癌を最初は生き延びた癌患者でさえ、共通の経験は、彼らの人生が劇的に変更されることを示している。

前立腺の腺癌は、米国における男性において最も頻繁に診断される癌であり、そして男性の癌による第２の主要な死因である（非特許文献１）。前立腺癌に対する治療は、代表的に、血清テストステロンを低下させるホルモン薬物を使用して開始され、しばしば競合的アンドロゲンレセプター（ＡＲ）アンタゴニストと組み合わせて与えられる。最初は腫瘍の増殖をブロックすることにおいて有効であっても、これらの治療は、一様に致命的であるアンドロゲン非依存性疾患またはホルモン無反応性（ＨＲ）疾患と呼ばれる薬物抵抗性段階を誘導し、最終的には失敗する。

ホルモン治療への抵抗性を説明する仮定の機構は、３つの大まかなカテゴリに分類され得る（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。第一のカテゴリには、全体でも少数の患者でしか発生しない、ＡＲ遺伝子におけるＤＮＡに基づく改変（例えば、増幅または点変異）が含まれる（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。これらのＡＲ変異の部分集合は、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に位置し、エストロゲンもしくはヒドロコルチゾンのような非正統のリガンドまたはフルタミドのようなＡＲアンタゴニストでさえもアゴニストとして挙動するように、レセプターの応答を改変することにより抵抗性をもたらすことが提唱されている（非特許文献９、非特許文献１０）。抗アンドロゲン抵抗性との、これらの臨床的な関連性は強いが、ＡＲ増幅または変異の全体の頻度は、ホルモン無反応性疾患の大半の症例について説明し得ない。

第２のカテゴリは、ＡＲ遺伝子の増幅または変異を有せずに、活性的なＡＲシグナル伝達を維持する大多数の患者にあてはまる。癌遺伝子（例えば、ＥｒｂＢ２またはＲａｓ）により媒介される、増進されたマイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達は、ＡＲのリガンド非依存的な活性化をもたらし得る（非特許文献１１、非特許文献１２）。この場面においてＡＲ活性化の原因のキナーゼおよび基質は未知であるが、これは、ＡＲ関連タンパク質またはＡＲそれ自体（エストロゲンレセプター（ＥＲ）に類似する）の下流のリン酸化を通じて生じると推定される（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。同様に、コアクチベーターまたはコリプレッサーの平衡における変更は、ＡＲ活性化に影響し得（非特許文献１６、非特許文献１７）、ＥＲについての同様な発見に基づく（非特許文献１８）。これらの事象の相対頻度およびこの臨床的な薬物抵抗性への関連性は、未だ明確にされていない。

ホルモン抵抗性機構の第３のカテゴリは、ＡＲが疾患の進行にもはや関連しないように、ＡＲの増殖促進作用および生存機能が、代替的なシグナル伝達経路により「バイパス」され得るという概念に基づく。一例は、末期臨床サンプルにおける抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２のアップレギュレーションである（非特許文献１９、非特許文献２０）が、ホルモン抵抗性における役割の機能的証拠が欠如している。ＡＲバイパス仮説はまた、数例のＨＲ癌におけるＡＲ発現の低下または欠失を誘導するＡＲ遺伝子のメチル化の観察（非特許文献２１）、ならびにアンドロゲンが特定の状況において増殖停止またはアポトーシスを誘導するという報告（非特許文献２２、非特許文献２３）とも一致する。

まとめると、これらのデータは、前立腺癌がホルモン治療への抵抗性を獲得する複数の機構に関係し、そして、末期の疾患の進行におけるＡＲの役割についての継続する論議を強調する。したがって、当該分野において、この疾患の進行（具体的には、前立腺癌における、癌細胞がホルモンアンタゴニストに感受性である初期段階から次の薬物抵抗性段階への移行）の臨床的に重大な局面を再現するモデルに対する必要性がある。特に、明確でありかつ操作可能な細胞に基づくモデルが、この薬物感受性期から薬物抵抗性期への進行に関連する分子事象を分析するために必要とされる。加えて、当該分野において、前立腺癌の薬物感受性期および／または薬物抵抗性期を再現する細胞ベースの前立腺癌モデルに対する必要性があり、このモデルは、例えば、新規の治療様式の評価において使用され得る。本明細書に開示される発明は、この必要性を満たす。
Ｋａｒｐら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９６）５６：５５４７−５５５６ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｂ．Ｊ．およびＦｅｌｄｍａｎ，Ｄ．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ（２００１）１，３４−４５ Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００２）２０，３００１−１５ Ｂａｌｋ，Ｓ．Ｐ．Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌｏｇｙ（２００２）６０，１３２−８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １３８−９ Ｔａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｄｒｏｇｅｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９９）５９，２５１１−５ Ｔａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｕｄｙ ９６６３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００３）２１，２６７３−８ Ｖｉｓａｋｏｒｐｉ，Ｔ．ら Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９５）９，４０１−６ Ｔａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｅ．ら Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９９５）３３２，１３９３−８ Ｖｅｌｄｓｃｈｏｌｔｅ，Ｊ．ら Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＬＮＣａＰ ｃｅｌｌｓ ａｆｆｅｃｔｓ ｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｔｉ−ａｎｄｒｏｇｅｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９９０）１７３，５３４−４０ Ｍａｔｉａｓ，Ｐ．Ｍ．ら Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａ ｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＲ（ｃｃｒ））ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００２）４５，１４３９−４６ Ｃｒａｆｔ，Ｎ．，Ｓｈｏｓｔａｋ，Ｙ．，Ｃａｒｅｙ，Ｍ．およびＳａｗｙｅｒｓ，Ｃ．Ｌ．Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ（１９９９）５，２８０−５ Ｇｉｏｅｌｉ，Ｄ．ら Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００２）２７７，２９３０４−１４ Ｋａｔｏ，Ｓ．ら Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２７０，１４９１−４ Ｆｏｎｔ ｄｅ Ｍｏｒａ Ｊ．およびＢｒｏｗｎ，Ｍ．ＡＩＢ１ ｉｓ ａ ｃｏｎｄｕｉｔ ｆｏｒ ｋｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２０００）２０，５０４１−７ Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ａ．，Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｇ．Ｂ．，Ｌａｂｒｉｅ，Ｆ．およびＧｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＳＲＣ−１ ｔｏ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＡＦ−１．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（１９９９）３，５１３−９ Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｃ．Ｗ．ら Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００１）６１，４３１５−９ Ｌｉ，Ｐら Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２００２）１６１，１４６７−７４ Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．Ｔｈｅ ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（２０００）１４，１２１−４１ Ｒａｆｆｏ，Ａ．Ｊ．ら Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｃｌ−２ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９５）５５，４４３８−４５ ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｔ．Ｊ．ら Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ｂｃｌ−２ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９２）５２，６９４０−４ Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｈ．ら Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｉｌｅｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００）６０，３６２３−３０ Ｓｈａｎｇ，Ｙ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｍ．およびＢｒｏｗｎ，Ｍ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２００２）９，６０１−１０ Ｚｈａｕ，Ｈ．Ｙ．ら Ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（１９９６）９３，１５１５２−７

（発明の要旨）
同系前立腺癌異種移植モデルのマイクロアレイに基づくプロファイリングを使用して、本発明者らは、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）ｍＲＮＡの適度の増加（２〜５倍）が、抗アンドロゲン治療に対する抵抗性の発生に矛盾なく関連する唯一の発現の変化であることを見出した。このＡＲ ｍＲＮＡおよびタンパク質の増加は、前立腺癌の増殖をホルモン感受性段階からホルモン無反応性段階へ移行するのに必要かつ十分であり、これは機能的なリガンド結合ドメインに依存した。さらに、ＡＲアンタゴニストは、増加したＡＲレベルを有する細胞においてアゴニスト活性を示し、そして、このアンタゴニスト／アゴニスト移行は、ＡＲ標的遺伝子のプロモーターに補充されるコアクチベーターおよびコリプレッサーのパターンにおける変更に関連した。増加したレベルのＡＲは、低レベルの残余のリガンドからシグナル出力を増幅すること、およびアンタゴニストに対する正常な応答を変更することにより、抗アンドロゲンに対する抵抗性を与える。これらの知見に基づいて本明細書中で提供される開示は、哺乳動物細胞（例えば、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞）に対する治療化合物の効果を調べるためのアッセイを含み、さらに、新規抗アンドロゲンの設計への洞察を提供する。

本発明の一実施形態は、哺乳動物前立腺癌細胞に対する影響について、化合物を試験する方法である。この方法は、試験される化合物と哺乳動物前立腺癌細胞とを接触させる工程、次に、この化合物が投与される哺乳動物前立腺癌細胞の１つ以上の特性と、化合物が投与されていないコントロールの哺乳動物前立腺癌細胞の１つ以上の同一の特性とを比較する工程を包含する。試験される化合物と哺乳動物前立腺癌細胞とを接触させる工程において、哺乳動物癌細胞は、この細胞におけるアンドロゲンレセプター（ＡＲ）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルまたはＡＲポリペプチドのレベルが、哺乳動物前立腺細胞における正常な／内因性のＡＲ ｍＲＮＡのレベルまたはＡＲポリペプチドレベルよりも、少なくとも約２倍高いように、ＡＲのポリペプチドをコードする外因性の野生型ＡＲのポリヌクレオチドを発現するため、この試験のために選択される。上記比較する工程において、１つ以上の特性のうちの１つ以上における相違は、この化合物がこの哺乳動物前立腺癌細胞に対する影響を有することを示す。

本発明の別の実施形態は、哺乳動物前立腺癌細胞に対する化合物の生理学的な影響を調べる方法である。この方法は、試験される化合物と哺乳動物前立腺癌細胞とを接触させる工程、次に、この哺乳動物前立腺癌細胞に対する化合物の生理学的な影響が調べるために、この化合物が投与される哺乳動物前立腺癌細胞の１つ以上の生理学的特徴を調べる工程を包含する。試験される化合物と哺乳動物前立腺癌細胞とを接触させる工程において、哺乳動物前立腺癌細胞は、ＡＲポリペプチドをコードする外因性の野生型ポリヌクレオチドまたはＡＲポリペプチドの改変体をコードするポリヌクレオチドのいずれかを発現することから、この方法のために選択される。ここで、この改変体は、ＡＲポリペプチドアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換を有し、そして、この細胞における、ＡＲポリペプチド改変体をコードするｍＲＮＡの全レベルまたはＡＲポリペプチド改変体の全レベルは、この細胞における正常な／内因性のＡＲ ｍＲＮＡまたはＡＲポリペプチドよりも、少なくとも約２倍高い。

本発明の関連する実施形態は、上記のように選択される哺乳動物前立腺癌細胞に対する、複数の化合物の生理学的な影響を試験する工程をさらに包含する方法である。この方法において、第二の化合物により発揮される１つ以上の生理学的特徴と比較したときの、第一の化合物により発揮される１つ以上の生理学的特徴において観察可能な相違が、第一の化合物が、この哺乳動物前立腺癌細胞に対して、第二の化合物よりも強いかまたは弱い生理学的な影響を有することを示す。代表的に、この方法は、高スループット形式により実行される。代替的に、この方法は低スループット形式により実行される。このようなアッセイにより試験される化合物は、代表的に、アンタゴニストまたはアゴニストである。実際のところ、本発明者らは、薬物がリガンドの結合または刺激を阻害または競合し、そしてアンドロゲンレセプターの生物学的な機能を阻害する場合、この薬物をＡＲアンタゴニストとして定義する。薬物がアンドロゲンレセプターの生物学的な機能を刺激または活性化する場合、この薬物はＡＲアゴニストとして定義される。

本発明のさらに別の実施形態は、哺乳動物細胞に対する影響について１つ以上の化合物を試験する方法である。この方法は、少なくとも１つの試験される化合物と哺乳動物細胞とを接触させる工程、および、この化合物が投与される哺乳動物細胞の１つ以上の特性と、この化合物を投与されていないコントロール哺乳動物細胞の同一の１つ以上の特性とを比較する工程を包含する。少なくとも１つの試験される化合物と哺乳動物細胞とを接触させる工程において、この哺乳動物細胞は、この細胞が、外因性の野生型または変異型の目的のタンパク質（例えば、エストロゲンレセプター）を発現するので、この試験のために選択される。その結果、細胞における、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの全レベルまたは目的のタンパク質の全タンパク質レベルは、細胞における目的のタンパク質（エストロゲンレセプターが挙げられる）の正常／内因性のｍＲＮＡまたはポリペプチドよりも、少なくとも約２倍高い。上記比較する工程において、１つ以上の特性における相違は、この化合物が哺乳動物癌細胞または哺乳動物細胞に対する影響を有することを示す。このような方法において、この哺乳動物細胞は、代表的には、癌細胞（例えば、乳癌細胞、卵巣癌細胞または前立腺癌細胞）である。

本発明の関連する実施形態は、上記のように選択される哺乳動物細胞に対する複数の化合物の生理学的な影響を試験する工程をさらに包含する方法である。この方法において、第二の化合物により発揮される１つ以上の生理学的特徴と比較したときの、第一の化合物により発揮される１つ以上の生理学的特徴において観察可能な相違が、第一の化合物が、この哺乳動物細胞に対して、第二の化合物よりも強いかまたは弱い生理学的な影響を有することを示す。

本発明の別の実施形態は、患者におけるホルモン無反応性前立腺癌を処置する方法であって、この方法は、この患者に因子を投与する工程を包含する。この因子は、アンドロゲンレセプターのリガンド結合、核内移行に影響することによってか、もしくはＤＮＡ結合に影響することによってか、またはアンドロゲンレセプターに関連するコアクチベーター複合体もしくはコリプレッサー複合体の形成を変更することを通してアンドロゲンレセプターの生物学的機能を低下させるか、または、この機能に影響する。

本発明の別の実施形態は、患者におけるホルモン無反応性前立腺癌を処置する方法であって、この方法は、この患者に因子を投与する工程を包含する。この因子は、アンドロゲンレセプターのＤＮＡレベル、アンドロゲンのｍＲＮＡのレベルまたはアンドロゲンのタンパク質レベルに影響することを通してアンドロゲンレセプターの生物学的機能を低下させるか、または、この機能に影響する。このような方法において、このアンドロゲンレセプターのタンパク質レベルは、シグナル伝達経路の調節（例えば、アンドロゲンレセプターとクロストークするＥＧＦレセプターを標的にすること）を通して低下され得る。代替的に、このアンドロゲンレセプターのタンパク質レベルは、細胞性分解経路（例えば、プロテアソーム分解機構）の誘導により低下される。代替的に、このアンドロゲンレセプターのタンパク質レベルは、アンドロゲンレセプターの完全性を維持する熱ショックタンパク質からアンドロゲンレセプターを解離させることにより低下される。好ましくは、このアンドロゲンレセプターのタンパク質レベルは、アンドロゲンレセプターアンチセンス技術、またはｍＲＮＡノックダウン技術を使用して低下される。本発明者らは、これら上記の操作のうちの任意の１つまたは任意のこれらの操作の組み合わせが、アンドロゲンレセプターの生物学的機能に影響すると考える。これらの方法の好ましい手段は、アンドロゲンレセプターのリガンド結合を混乱する因子または低減する因子を使用することである。

本発明の別の実施形態は、患者におけるホルモン無反応性前立腺癌を処置する方法であって、この方法は、この患者に因子を投与する工程を包含する。この因子は、アンドロゲンレセプタータンパク質を修飾することを通してアンドロゲンレセプターの生物学的機能を低下させるか、または、この機能に影響する。必要に応じて、このアンドロゲンレセプタータンパク質は、アンドロゲンレセプターのポリヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列を改変することによってか、またはアンドロゲンレセプターの翻訳後修飾（リン酸化、アセチル化、ユビキチン化およびスモ化（ｓｕｍｏｌａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない）により修飾される。

本発明の別の実施形態は、薬物または処置の標的であるタンパク質の濃度を増大することにより、この薬物、処置、または薬物と処置との併用に対し抵抗性である疾患または状態を処置する方法である。この方法は、１つ以上の因子を投与する工程または前記段落に記載される手段を通して、このタンパク質の生物学的機能に影響を及ぼす技術を利用する工程を包含する。代表的に、この疾患または状態は、外科的去勢後もしくは内科的去勢後、抗アンドロゲン治療による処置後、あるいは去勢と抗アンドロゲン治療との併用後に、前立腺癌細胞において、アンドロゲンレセプターのＤＮＡレベル、ｍＲＮＡのレベルまたはタンパク質レベルが増大するホルモン無反応性癌である。例示的な実施形態において、この疾患または状態は、ホルモン療法（例えば、タモキシフェンまたはラロキシフェンによる処置）後に、乳癌細胞において、エストロゲンレセプターのＤＮＡレベル、ｍＲＮＡのレベル、またはタンパク質レベルが増大するホルモン無反応性乳癌である。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書で開示される方法を使用して、化合物（例えば、ＡＲアゴニストまたはＡＲアンタゴニスト）を試験するのに有用な物質を含む製品およびキットが提供される。この製品は、ラベル付きの容器を備える。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアルおよび試験管が挙げられる。これらの容器は、種々の物質（例えば、ガラスまたはプラスティック）から形成され得る。この容器上のラベルは、上記のようなインビボの使用またはインビトロの使用のいずれかについての指示を示し得る。本発明のキットは、上記の容器および緩衝液を含む第二の容器を備える。それは、商業的な観点および使用者の観点から望ましい他の物質（他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用についての指示書を伴った添付物が挙げられる）をさらに備え得る。

（発明の詳細な説明）
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、他の科学用語または専門用語は、本発明が属する分野における当業者により一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般に理解される意味を有する用語は、明瞭さのために、および／または、容易な参照のために本明細書で定義される。そして本明細書におけるこのような定義の包含は、当該分野において一般的に理解されるものに優先しての実質的な差異を示すように解釈される。本明細書で記載または参照される多くの技術および手順は、当業者により、慣習的な方法論を使用して、良く理解され、そして一般的に使用される。このような技術および手順としては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載される広範に利用される分子クローニング方法論が挙げられる。必要に応じて、市販されているキットおよび試薬の使用を伴う手順が、他で記述されない限り、概して製造者が規定するプロトコールおよび／またはパラメーターにしたがって実行される。

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも約１０塩基長または１０塩基長対のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾された形態のいずれか）の重合体の形態を意味し、そしてＤＮＡの単鎖形態および二重鎖形態を含むことが意味される。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも約６アミノ酸のポリマーを意味する。用語「アンドロゲンレセプターポリヌクレオチド」は、アンドロゲンレセプターポリペプチドをコードする、任意のポリヌクレオチドを意味する。このようなポリヌクレオチドは、当業者にとって公知である。例えば、Ｃｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０（４８５０），３２４〜３２６（１９８８）を参照のこと。

もまた参照のこと。用語「アンドロゲンレセプターポリペプチド」は、任意の公知のアンドロゲンレセプターポリペプチドを意味する。例えば、Ｃｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０（４８５０），３２４〜３２６（１９８８）を参照のこと。

もまた参照のこと。用語「アンドロゲンレセプターポリペプチドの改変体」は、ＡＲ活性を示し、かつＣｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０（４８５０），３２４〜３２６（１９８８）に記載されたＡＲポリペプチドアミノ酸配列中に少なくとも１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換を有するポリペプチドを意味する。

用語「アゴニスト」および「アゴニスト性」は、本明細書で使用される場合、ＡＲのような分子の生物学的な活性もしくは活性化を、直接的または間接的に、実質的に誘発、促進または亢進し得る分子をいう。用語「アンタゴニスト」および「アンタゴニスト性」は、本明細書で使用される場合、ＡＲのような分子の生物学的な活性もしくは活性化を、直接的または間接的に、実質的に阻害し得る分子をいう。

「処置」または「治療」は、治療上の処置および予防的手段または防止的手段の両方をいう。

用語「治療上の有効量」は、哺乳動物における疾患または障害を処置するのに有効な薬物の量をいう。癌の場合、治療上の有効量の薬物は、癌細胞の数を減少させ得る；腫瘍の大きさを縮小し得る；周辺臓器への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで遅滞させる、そして好ましくは停止させる）し得る；腫瘍の転移を阻害（すなわち、ある程度まで遅滞させる、そして好ましくは停止させる）し得る；ある程度まで、腫瘍の増殖を阻害し得る；および／または、ある程度まで、この障害に関連する１つ以上の症状を緩和し得る。この薬物が増殖を防止し得る程度、および／または存在する癌細胞を殺す程度まで、この薬物は細胞増殖抑制性および／または細胞障害性であり得る。癌治療に対して、インビボの効能は、例えば、腫瘍の負荷量または体積、疾患の進行の所要時間（ＴＴＰ）を評価することによって、および／または、応答速度（ＲＲ）を決定することによって測定され得る。

処置または治療の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される、任意の動物をいい、哺乳動物としては、ヒト、家畜および農場の動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園の動物、スポーツ用動物または愛玩動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が挙げられる。好ましくは、この哺乳動物はヒトである。

用語「癌」、「癌性」または「悪性」とは、代表的に、哺乳動物において制御されない細胞増殖により特徴づけられる生理学的な状態をいうか、または記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、乳癌、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、精巣癌、食道癌、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、グリア芽腫、頚癌、神経膠腫、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝臓癌腫ならびに種々の型の頭部頸部の癌が挙げられる。

本発明は、本明細書に開示される発見に基づく。この発見は、前立腺癌細胞におけるアンドロゲンレセプター（ＡＲ）ｍＲＮＡの適度の増加（２〜５倍）が、抗アンドロゲン治療に対する抵抗性の発生に矛盾なく関連する、唯一の発現の変化であることである。このＡＲ ｍＲＮＡおよびＡＲタンパク質の増加は、前立腺癌の増殖をホルモン感受性段階からホルモン無反応性段階へ移行するのに必要かつ十分であり、これは機能的なリガンド結合ドメインに依存した。さらに、ＡＲアンタゴニストは、増加したＡＲレベルを有する細胞においてアゴニスト活性を示し、そして、このアンタゴニスト／アゴニスト移行は、ＡＲ標的遺伝子のプロモーターに補充されるコアクチベーターおよびコリプレッサーのパターンにおける変更に関連した。増加したレベルのＡＲは、低レベルの残余のリガンド由来のシグナル出力を増幅すること、およびアンタゴニストに対する正常な応答を変更することにより、抗アンドロゲンに対する抵抗性を与える。これらの発見は、新規抗アンドロゲンの設計への洞察を提供する。

本明細書で開示される本発明の一実施形態は、哺乳動物前立腺癌細胞に対する影響について、化合物を試験する方法である。この方法は、この試験される化合物と哺乳動物前立腺癌細胞とを接触させる工程、そして次に、この化合物が投与された哺乳動物前立腺癌細胞の１つ以上の特性と、この化合物が投与されていないコントロールの哺乳動物前立腺癌細胞の同一の１つ以上の特性とを比較する工程を包含する。この試験される化合物と哺乳動物前立腺癌細胞とを接触させる工程において、この哺乳動物癌細胞は、ＡＲのポリペプチドをコードする外因性の野生型アンドロゲンレセプター（ＡＲ）ポリヌクレオチドを発現するため、この試験のために選択され、その結果、この細胞における、ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルまたはＡＲポリペプチドのレベルが、哺乳動物前立腺細胞における正常な／内因性のＡＲ ｍＲＮＡのレベルまたはＡＲポリペプチドレベルよりも、少なくとも約２倍高い。比較する工程において、この１つ以上の特性のうちの１つ以上における相違は、この化合物がこの哺乳動物前立腺癌細胞に対する影響を有することを示す。

次に、ＡＲに結合する試験化合物は、さらに特定の生理学的な活性（例えば、チロシンキナーゼ活性）の阻害についてスクリーニングされ得る。このような実施形態は、例えば、この試験化合物が、分子生物学的プロトコールを利用することにより、ＡＲのシグナル伝達を阻害するか否かを決定し、組換え構築物を創出する工程を包含する。この組換え構築物の酵素学的な性質および生物学的な性質は直接調べられ得る。酵素学は、例えば、標準的なアッセイを使用して、インビトロでか、またはＡＲＳ発現細胞においてチロシンキナーゼ活性を測定することにより実行される。

本発明に関連する特定の発見および特定の生理学的なプロセスは、以下に議論される。

比較的偏らない様式でＨＲ機構の範囲を調べるために、本発明者らは、「同系」のホルモン感受性（ＨＳ）ヒト前立腺癌異種移植片およびＨＲヒト前立腺癌異種移植片の７つの組（全１４異種移植片）に関して全体的な遺伝子発現プロファイリングを実行した。全てのＨＲ亜系統を、去勢マウスにおいて、継代により、それらのＨＳ親細胞系より直接誘導し、そしてインタクトなマウスでの同様の継代数のＨＳ腫瘍と比較した^{２３〜２６}。マイクロアレイデータセットを、多くの生物情報学の戦略（教師なし（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）学習および教師付き（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）学習）を使用して分析した。まず、本発明者らは、任意のＨＲ前立腺癌の部分集団が、階層的クラスター化アルゴリズムを使用して同定されうるか否かを求めた。以下の手順を続けた：（ａ）各々の異種移植片（インタクトなマウス（ＨＳ）または去勢マウス（ＨＲ）のいずれかで増殖される）由来の７つの０．５ｃｍ^３の腫瘍をプールし、全ＲＮＡを、単一のサンプルを生成するために抽出した。処理後、このｃＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ９５Ａチップにハイブリダイズし、そしてこのマイクロアレイデータを、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅにより分析する。有意に変動しなかった（標準偏差＜１０００および変動係数＜１）か、またはこのサンプルのいずれにおいても検出されなかった（ミスマッチのコントロールシグナル強度よりも、有意に異ならない完全に一致するハイブリダイゼーションとして定義される）バックグラウンドの要素を除去した。それから、この残りの要素（１，０５６遺伝子を示す）を、階層的クラスター化ダイアグラムを生成するために、教師なし学習アルゴリズムにより使用した。（ｂ）（ａ）に記載されるように得られたマイクロアレイデータを、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅを使用して再分析した。これによって、各々の組は、各々のＨＳ異種移植片とそのＨＲ異種移植片対応物との間の発現の比を代表する単一のデータセットに要約される。加えて、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウェアにより規定される多くのパラメータ（例えば、倍あたりの変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）、絶対的なシグナル強度および完全一致／ミスマッチの比により与えられる各々のプローブセットについての信頼度）を使用して、この要約されたデータセットからの要素に、増加（Ｉ）、わずかな増加（ＭＩ）、変化無し（ＮＣ）、わずかな減少（ＭＤ）、または減少（Ｄ）の独立した表示を割り当てた。全異種移植片の組について、ＮＣと評価された要素を除いて、３，７７４遺伝子のリストを生成した。次に、このリストを、階層的クラスター化ダイアグラムを生成するために、教師なし学習アルゴリズムにより使用した。（ｃ）（ｂ）に記載される各々の表示に、＋１（Ｉ）〜−１（Ｄ）の範囲の値を割り当てた。そして、各々の要素のスコアが、各々ＨＳ／ＨＲ異種移植片の７つの組にわたり、この値を合計することで生成された。この試験は、ＨＳ異種移植片対応物に対してクラスター化された各々のＨＲ異種移植片は、これらの組が同系である事実と矛盾しないことを示した。

異種移植片特異的な発現の形跡は、ＨＳ−ＨＲ移行の原因となる遺伝子発現の変化を不明瞭にしやすいので^２７、本発明者らは、各々のＨＳ／ＨＲ組を発現の倍あたりの変化を表す単一のデータセットに要約した。さらに、緊密に関連しない部分集合は現れなかった。このことは、各々の異種移植片において、異なる機構がＨＳ−ＨＲ移行の原因となったか、または共通の機構のいずれも、あまりに少量の遺伝子しか関わっていないため、このクラスター化パターンに影響しなかったかのいずれかを示唆した。本発明者らは、アルゴリズムを使用して、後者の可能性を追求して、ＨＳ−ＨＲ移行の間、一貫して変化する任意の要素を同定した。顕著に、１２，５５９プローブセットのうち、ただ一つ（ＡＲ ｃＤＮＡに特異的）が、ＨＳ／ＨＲの全７組において、異なって発現された（図１、上）。特に、２番目に高いプローブセット（７組のうち５組においてアップレギュレーションされた）もまた、ＡＲに特異的であった。このＲＮＡデータと一致して、免疫ブロット法は、ＨＲ腫瘍において、その親のＨＳ対応物よりも高いレベルのＡＲタンパク質を示した（図１、下）。ＡＲタンパク質における倍あたりの変化（個々の異種移植片腫瘍の分析に基づく）は、おそらくサンプル−サンプル間の変動のため、ＡＲ ｍＲＮＡにおける倍あたりの変化（各々の異種移植片に対する腫瘍のプールの発現の分析に基づく）とは完全には相関しなかった。あるいは、転写後の機構が、ＡＲタンパク質の定常状態のレベルに影響し得る^２８。それにもかかわらず、これらのデータは、ホルモン治療に対する抵抗性の共通の決定的な機構の可能性を生じる。

増加したＡＲタンパク質濃度が、ＨＳ−ＨＲ移行において原因となる役割を担うか否かを決定するために、本発明者らは、ＨＳ ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞に対し、レトロウイルス感染によりエピトープタグ化野生型ＡＲ ｃＤＮＡを導入した。ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞中での、ＡＲレベルにおける３倍の増加は、マイクロアレイ実験で研究されたＬＮＣａＰ ＨＳ／ＨＲの組において観察された発現の差異に類似する。増加したＡＲの発現がＨＳ−ＨＲ移行を引き起こすか否かを試験するために、本発明者らは、ＨＲ疾患の臨床状態を模倣する２つのインビトロアッセイを設計した。第１に、低濃度のアンドロゲンでの増殖する能力を測定する；第２に、抗アンドロゲン ビカルタミドの存在下での増殖を測定する。予想されたように、空のベクターにより感染されたＬＮＣａＰ細胞は、１００ｐＭの合成アンドロゲン、Ｒ１８８１を補充しなければ、ステロイド欠乏、チャコール処理（ｃｈａｒｃｏａｌ ｓｔｒｉｐｐｅｄ）血清中では増殖しなかった。対照的に、ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞は、少なくとも８０％低い濃度のＲ１８８１において増殖した。ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞はまた、ビカルタミドに対し抵抗性でもあった。

次に、本発明者らは、増加したＡＲの発現が、２つの異種移植片モデル（ＬＮＣａＰおよびＬＡＰＣ４）を使用して、外科的な去勢により達成されたホルモン治療に対する抵抗性をインビボで付与するのに十分であるか否かを求めた。ＨＳ ＬＡＰＣ４細胞を、ＡＲレンチウイルスに感染させた（ベクターに感染したコントロールよりも約３倍多くのＡＲタンパク質を発現することが示された）。次に、この細胞を、インタクトな雄性ＳＣＩＤマウスまたは去勢雄性ＳＣＩＤマウスの側腹に移植した。ＡＲの過剰発現は、ＬＡＰＣ４モデルおよびＬＮＣａＰモデルの去勢動物において、腫瘍形成の潜伏期間を５０％より短くした。

本発明者らは、ＨＲ異種移植片で観察されたＡＲの発現における増加が、ホルモン治療に対する抵抗性を発生させるのに必要であるのか否かという逆の質問に取り組むために、安定なＲＮＡ干渉を使用した。ＨＲ ＬＡＰＣ４細胞におけるＡＲレベルのノックダウンを、ＡＲに対する短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）とシス連結されたＧＦＰ発現カセットとを発現するレンチウイルスベクターを使用して達成した。去勢した雄性マウスの側腹への移植後、ＡＲ ｓｈＲＮＡ感染された腫瘍は、ベクター感染されたコントロールよりもゆっくりと増殖した。さらに、これらの増殖した腫瘍は、ベクター感染されたコントロールと比較して、ＧＦＰを発現せず、依然としてＡＲタンパク質を発現した。このことは、ＡＲノックダウンを免れた細胞についての選択を示した。ＨＲ ＬＮＣａＰ亜系統におけるＡＲノックダウンの平行する研究は、同様な結果を示した。

増加したＡＲレベルがＨＲ疾患を引き起こす機構を決定するために、本発明者らは２つの可能性を考慮した：（１）高レベルのレセプターが、リガンドが存在しない状態で恒常的な活性化を誘導すること（このことは、最近のＡＲ研究^２９（リガンド非依存性モデル）に矛盾しない）または（２）テストステロン低下治療後に、高レベルのレセプターが、残存している剰余量のリガンドに対して細胞を感作させること（リガンド依存性集団作用モデル）。これらの２つのモデルを区別するために、本発明者らは、リガンド非依存的な機能に干渉することなく選択的にリガンド結合を減じるために、２つのＡＲの変異（Ｎ７０５ＳおよびＲ７５２Ｑ）をＬＢＤに独立的に導入した。Ｎ７０５Ｓは、完全型アンドロゲン不応性症候群に関係する一方、Ｒ７５２Ｑは、部分的アンドロゲン不応性症候群を保有する患者で見出されている^３０。

実験手順の詳細は、以下の通りであった：変異体ＡＲ構築物または野生型ＡＲ構築物を、ＡＲヌル細胞（ＣＯＳ７）にトランスフェクトした。そして４８時間アンドロゲン欠乏させた。次に、細胞を、１００倍の過剰な非アイソトープ性Ｒ１８８１の存在下または非存在下において、増加量の^３Ｈ−Ｒ１８８１と共にインキュベートした。そして結合したリガンドを、シンチレーション計数により測定した。種々のＡＲ ＬＢＤ変異体またはジェノトロピック（ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｃ）変異体を発現するＬＮＣａＰ細胞を、既に上に記載された低アンドロゲン感作アッセイまたはアンタゴニスト抵抗性アッセイのいずれかを使用して、インビトロでのＨＲ増殖について評価した。全ての実験を、二連で行った。種々のＡＲ ｃＤＮＡ（ｎ＝１０）またはベクターコントロール（ｎ＝１０）を過剰発現する１×１０^６のＬＮＣａＰ細胞を、去勢雄性ＳＣＩＤマウスの側腹に移植した。そして腫瘍体積（±ＳＥＭ）を経時的に測定した。共焦点免疫蛍光を、ＦＬＡＧタグ化された３重点変異（Ｋ６１８Ｍ、Ｋ６３２Ｍ、Ｋ６３３Ｍ（ΔＮＬＳ））ＡＲまたはＦＬＡＧタグされた野生型ＡＲを安定的に発現するＬＮＣａＰ細胞について、ＦＬＡＧ特異的抗体を用いて実行した。

予想されたように、両方の変異体どちらも、放射性標識Ｒ１８８１結合アッセイにおいてリガンド結合を損なっていた。疾患の重症度に一致して、Ｒ７５２Ｑは、レポーターアッセイにおいて低レベルのリガンド結合活性および低レベルの転写活性を維持し、少なくとも１つのＬＢＤ変異の適切な折りたたみを保証する内部コントロールとしての役割を果たす。ＬＮＣａＰ細胞において、いずれのＬＢＤ変異ＡＲ構築物の過剰発現も、内在性のＡＲよりも約１０倍高いレベルでさえも、低アンドロゲン培地において、ビカルタミドの存在下においてまたは外科的に去勢されたマウスにおいても、ベクターコントロールを越えたレベルでＨＲ増殖を促進しなかった。これらのデータは、ＡＲが、ＨＲ増殖を与えるためにリガンドに結合しなければならないことを確証し、そしてレセプター濃度の適度な増加が、ＡＲに対し、去勢した患者に存在するより低レベルのアンドロゲンを利用することを可能にさせることを意味する。この結論はまた、広範に使用される用語「アンドロゲン非依存性」が、誤解を招くＨＲ前立腺癌の表現であり得ることも示唆する。

ＡＲ機能についてのインビトロアッセイでのこれらの利用可能性は、ＡＲが、ジェノトロピック機能または非ジェノトロピック機能によりＨＳ−ＨＲ移行を誘導するか否かについての、さらなる質問に取り組む機会を提供した。核内移行シグナル（ＮＬＳ）の欠失は、核移行をブロックし、そして低濃度のアンドロゲン中またはビカルタミドの存在下において、ＨＲ増殖を停止させた。同様の結果が、ＤＮＡ結合活性を欠失している第二のＡＲ変異体Ｖ５８１Ｆを使用して得られた^３１。最後に、ＳｒｃのＳＨ３ドメインに結合することが報告されるＡＲのポリプロリン領域の欠失（ΔＰ ＡＲ）^３２は、これらのアッセイにおいてＡＲ機能に対する阻害効果を有さなかった。したがって、以前に報告された骨成長および前立腺癌細胞の生存に対するＡＲの非ジェノトロピック効果^{３２〜３４}は、アンドロゲン治療に対する抵抗性における役割を担わないようである。

リガンド結合の変異誘発研究は、アンドロゲン低下ホルモン治療に対する抵抗性を説明する集団作用モデルのための証拠を提供する。この機構が抵抗性の唯一の原因であるなら、薬理学的濃度をこえたビカルタミドは、過剰レベルのＡＲを克服し、転写活性をブロックするはずである。驚くべきことに、本発明者らは、過剰なＡＲを発現する細胞における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の発現に対する高用量のビカルタミドの影響を試験したときに、反対の現象を観察した。ビカルタミドは、ＰＳＡ ｍＲＮＡ発現の阻害およびＰＳＡタンパク質発現の阻害により測定されるように、親ＬＡＰＣ４細胞において代表的なアンタゴニスト活性を示した。しかしビカルタミドは、増加したレベルのＡＲを発現するＬＡＰＣ４細胞においては、アゴニストとして機能した。同様の結果が、他のＡＲアンタゴニスト（例えば、酢酸シプロテロンおよびフルタミド）を使用して観察されるので、このアンタゴニスト−アゴニスト移行は、ビカルタミドについても、またＬＡＰＣ４細胞株についても特有のものではない。同様の結果は、ＬＮＣａＰ細胞についても観察された。加えて、増加したＡＲレベルは、ＬＮＣａＰ細胞におけるＴ８７７Ａ ＡＲ ＬＢＤ変異の影響^８を想起させる非標準的な（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ）リガンド（例えば、エストロゲン）に対する応答性を付与した。

上記の高用量試験の詳細は、以下の通りである：ＡＲまたはＧＦＰコントロールを過剰発現するＬＡＰＣ４細胞は、チャコール処理血清により、５日間アンドロゲン欠乏させた。そして次に、この細胞を、９６時間、ビカルタミドまたは酢酸シプロテロンまたはフルタミドでチャレンジした。ＰＳＡおよびβ−アクチンメッセージを、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用してアッセイした。ビカルタミドまたは１７β−エストラジオールによるチャレンジの４８時間後に分泌されたＰＳＡを、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＡＲ発現ウイルスまたはコントロールウイルス（Ｎｅｏ）で安定的に感染されたＬＮＣａＰ細胞を、５日間アンドロゲン欠乏させた。そして次に、これらの細胞を、４８時間、ビカルタミドでチャレンジした。それから、ＰＳＡおよびβ−アクチンを測定した。ＡＲ発現ウイルスまたはベクターコントロールにより安定的に感染されたＬＮＣａＰ細胞を、５日間、飢餓状態にさせた。そして次に、この細胞は、ビヒクル、１０μＭ ビカルタミド、１００ｐＭ Ｒ１８８１または１ｎＭ ＤＨＴのいずれかでチャレンジした。１時間後、細胞を回収し、そしてクロマチン免疫沈降のために処理した^２１。

上記に記載される移行が、ＰＳＡ遺伝子に特有であるのか、または他のアンドロゲンに制御される遺伝子に当てはまるのかを決定するために、本発明者らはマイクロアレイ実験を行った。ＡＲ発現レトロウイルスまたは空のベクターコントロールにより感染されたＬＮＣａＰ細胞ｗ、増加用量のＲ１８８１または１０μＭ ビカルタミドでチャレンジした。そして次に、これらの細胞を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａチップへのハイブリダイゼーションのために処理した。ビカルタミドは、ＬＮＣａＰ−ＡＲ細胞において４８プローブセットの発現を誘発した（２倍の増加として規定される、Ｐ＜０．０５、５００の最小の発現）、一方でコントロール細胞において、有意にアップレギュレーションされた要素はなかった。このリストは、大半はアンドロゲンに制御される遺伝子（周知のメンバー（ＰＳＡおよびカリクレイン２（ＫＬＫ２）^３５）が挙げられる）から構成された。（この試験された遺伝子の完全なリストについて、本明細書の末尾の表を参照のこと）。しかしながら、ビカルタミドは、アンドロゲンに制御される遺伝子の総数（＞６００プローブセット）のうちの部分集合（＜１０％）しか誘発しなかった。より詳しい試験において、ビカルタミドにより誘導される遺伝子は、大半の部分について、最も高く誘導されるアンドロゲン応答性遺伝子と重なった。このことと一致して、このサンプルの教師なし階層的クラスター化は、１０μＭ ビカルタミドにより誘発される遺伝子プロフィールを、低用量（１０ｐＭ〜３０ｐＭ）のＲ１８８１により誘発される遺伝子プロフィールの最も近傍に分類した。まとめると、これらのデータは、増加したＡＲ発現が、アンタゴニストを弱いアゴニストに全体的に変換し、そしてそれゆえ最もアンドロゲン感受性である遺伝子の誘発のみを導くことを示唆する。

ビカルタミドが、増加したＡＲレベルの状況においてアゴニスト特性を得る機構を説明するために、本発明者らはクロマチン免疫沈降実験を実行した。この実験は、マイクロアレイ実験でビカルタミドにより活性化された２つの遺伝子（ＰＳＡおよびＫＬＫ２）のプロモーター上のＡＲ転写複合体の構成要素を規定する。伝統的なアゴニストＲ１８８１またはジヒドロテストステロンへの暴露後、先行研究^{２１、３６}から予想されるように、ＡＲおよびポリメラーゼＩＩが、ＡＲレベルに関係無く両方のプロモーターに補充された。ＡＲはまた、ベクター過剰発現細胞およびＡＲ過剰発現細胞において、ビカルタミドへの暴露後、両方のテンプレートに補充された。しかしポリメラーゼＩＩは、過剰なＡＲの状況においても少ししか存在しなかった。しかしながら、ＡＲ過剰発現細胞において、ビカルタミドによりこれらのプロモーターに補充されるコアクチベーターのレパートリーは、Ｒ１８８１またはジヒドロテストステロンと比較される場合、より制限されていた（例えば、ＳＲＣ１であり、ＡＩＢ１ではない）。本発明者らはまた、コリプレッサーによるプロモーターの占有率に対する、増加したＡＲレベルの影響も調べた。予想されたように、ＮＣｏＲは、ビカルタミド処理に続いて、親細胞において両方のプロモーターに補充され、ヒストンアセチル化の形跡も、またはポリメラーゼＩＩ補充の形跡も無かった。しかしながら、ＮＣｏＲ補充は、ビカルタミド処理後、増加したＡＲタンパク質レベルを有する細胞において減少していた（ＰＳＡプロモーター）か、または発生していなかった（ＫＬＫ２プロモーター）。したがって、ＡＲタンパク質レベルにおける適度な変化は、ＡＲ標的遺伝子のプロモーター上に会合されるコアクチベーターまたはコリプレッサーの相対的な存在量はシフトし得、結果として、転写活性に対する影響を生ずる。

本発明者らの実験プロファイリングからの驚くべき結果は、全てのＨＲ異種移植片モデルにおけるＡＲ ｍＲＮＡの普遍的なアップレギュレーションであり、患者の物質におけるＡＲレベルの調査に基づく臨床的関連性を有するような発見である^７，３７。ＡＲ遺伝子増幅は、増加したＡＲレベルを明白にもたらし得るが、このことは、少数の患者でしか生じず、ＨＳ−ＨＲ移行の間、ＡＲのコピー数に増加は無かったので、本発明者らの異種移植片の発見に対して説明とはなり得ない^３８。ＡＲ遺伝子調節の研究は、ＡＲ遺伝子に結合し、そして増加したＡＲ ｍＲＮＡのレベルを導くポジティブに作用する転写因子としてＡＲそれ自体を意味づけた^３９。したがって、増加したＡＲ活性を与えると想定される他の機構（例えば、増加したキナーゼ経路シグナル伝達（ＥｒＢ２、Ｒａｓ、ＭＡＰＫ）または変更したコアクチベーター／コリプレッサー比）はまた、たとえ間接的でも、増加したＡＲ ｍＲＮＡのレベルを導き得る。それゆえ、ＡＲ活性を変更する多くの初期の分子事象のうちの任意の１つは、ＡＲ ｍＲＮＡにおける増加を引き起こし得、このことは、標準的なホルモン療法を回避するための最終的な共通経路を示唆する。

１つの注意は、ＡＲについての本発明者らの結論は、ほぼ全ての異種移植片がＨＲ疾患を保持する男性に由来するＨＳ異種移植片モデルの研究に基づくということである。このような腫瘍がインタクトな雄性マウスに外植されるときに、ＨＳ増殖がどのようにして「再構築」されるのかという質問は、前立腺癌の分野において、長く議論された矛盾であり、その機構は未知のままである。本発明者らは、以前に、このような移植片はＨＳクローンおよびＨＲクローンの混合物を含み、そしてアンドロゲン欠乏の選択圧下において、ＨＲ亜系統がクローン性増殖を生じるという証拠を提供した^４０。このような移植片から発達するＨＳクローンは、相対的な条件においてのみＨＳであり得、真にホルモン未処理の前立腺癌（抗アンドロゲン治療に暴露されたことがない）と完全なＨＲ疾患との間の連続体における移行状態を反映する。ＡＲのアップレギュレーションが、ホルモン未処理細胞にＨＲ増殖を与えるのに十分であるか否かについて、未だ決定されていない。マウス前立腺癌のより新しいトランスジェニックモデルまたはノックアウトモデルは、「よりきれいな」実験系において、この疑問に取り組む機会を提供し得る^{４１，４２}。

増加したＡＲの発現がどのようにして抗アンドロゲン治療に対する抵抗性を与え得るかについて説明する最も単純なモデルは、集団作用である。このモデルによれば、本発明者らの異種移植片モデルで観察されたレセプターレベルにおける３倍〜５倍の増加は、低いリガンドレベルを補い得、そしてＡＲシグナル伝達を再構築し得る。しかしながら、増加したレセプターレベルがアンタゴニストにアゴニストとして機能させるという事実は、別のレベルの複雑性を示唆する。ビカルタミドにより誘導される遺伝子と、アンドロゲンの用量の範囲により誘導される遺伝子との本発明者らの比較は、増加したＡＲレベルの状況においてアンタゴニストが弱いアゴニストとして機能することを示す。ＡＲ標的遺伝子のプロモーター上に集合される転写複合体の比較分析は、潜在的な機構を明らかにした。特に、より制限されたコアクチベーターのレパートリーが、ビカルタミドによる刺激後にＡＲ標的遺伝子に補充される。このことは、最適に及ばないリガンドは、最大の転写活性のためのコファクターの最適な並びを集合し得ないことを示唆する（図２を参照のこと）。ステロイドレセプター−アンタゴニスト複合体は、種々の立体配座を選択するので^{４３，４４}、アンタゴニストが結合したＡＲは、コアクチベーター機構の完全な相補体を結合し得ない。

アンタゴニズムの喪失に対する分子的な根拠は、あまり明白ではない。先行研究は、ＥＲのような核内レセプターのアゴニスト対アンタゴニストの応答が、増加したコアクチベーター（増加したＳＲＣ１）の発現または減少したコリプレッサー（減少したＮＣｏＲ）の発現により変更されることを示した^{４５，４６}。本発明者らのデータは、増加した核内レセプター自体の発現が、おそらく細胞内においてコリプレッションとコアクチベーションとの平衡を乱すことにより、同様の結果を引き起こすことを確証する。これらの構成要素の各々を調べるさらなる実験が、これらの説明または代替的な説明を選ぶために必要とされる。

アンタゴニスト／アゴニスト移行の臨床的関連性もまた、考慮されるべきである。ＡＲアンタゴニストによる処置の間、疾患が進行する男性のうちの約３０％は、このアンタゴニストが打ち切られるときに、血清ＰＳＡレベルの矛盾した低下を経験する。このことは、抗アンドロゲン離脱症候群と呼ばれる^４７。提唱される１つの機構は、ＡＲ遺伝子における変異である。これは、Ｔ８７７Ａ ＡＲ変異を発現する細胞において、フルタミドがアゴニストとして機能するという事実に基づく^８。説得力があるが、ＨＲ患者におけるＡＲ変異の頻度についての最近の推定値が極めて低いので、この機構は全ての場合を説明し得ない^５。本発明者らの知見は、抗アンドロゲン離脱症候群を保有する患者が、最高レベルのＡＲのアップレギュレーションを保有する患者であり得ることを示唆する。

おそらく、本発明の最も重要な意味は新規抗アンドロゲンの開発に向けられる。インタクトなＬＢＤが、ホルモン治療に対する抵抗性を引き起こすために、ＡＲに必要とされるという事実は、新規アンタゴニストの設計についての説得力がある論理を提供する。この設計は、この良く規定された結合ポケットについての既存の知見を利用する^４８。ＡＲ作用は、ジェノトロピック機構を介して、排他的に媒介されるようなので、ＡＲの核内移行を防止するか、または標的遺伝子上のＡＲ転写複合体の集合を損なう薬物もまた構想され得る。最後に、本明細書中で関係する抗アンドロゲン抵抗性機構が他のホルモン依存性疾患（例えば、乳癌）への関連性を有するか否かを決定することが重要である。

宿主細胞（例えば、前立腺癌細胞）は、本明細書で記載されるヒトＡＲタンパク質の発現のための発現ベクターまたはクローニングベクターによりトランスフェクションされ得るか、形質転換され得る。これらの細胞は、プロモーターを誘導するためか、形質転換体を選択するためか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切であるように改変される慣習的な栄養培地において培養され得る。培養条件（例えば、培地、温度およびｐＨなど）は、過度の試行を伴わずに当業者により選択され得る。一般的に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコールおよび実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，編（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に見出され得る。

哺乳動物細胞を形質転換する広範な種類の方法が、当該分野において公知である。この方法は、例えば、試薬および方法（例えば、ウイルスベクター（例えば、以下の実施例で開示されるレトロウイルスベクター）、脂質（例えば、リポフェクション）、ＣａＰＯ_４およびエレクトロポレーションなど）を使用する。使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、このような細胞に適切な標準的な技術を使用して実行される。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載される）またはエレクトロポレーションが、原核生物または頑丈な細胞壁の障壁を備える他の細胞に対して一般的に使用される。このような細胞壁を有さない哺乳動物細胞に対して、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６〜４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法が使用され得る。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な局面は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。しかしながら、細胞にＤＮＡを導入する他の方法（例えば、核内マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラストの融合またはポリカチオン（例えば、ポリブレンおよびポリオルニチン））もまた、使用され得る。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７〜５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８〜３５２（１９８８）を参照のこと。

本明細書のベクター内のＡＲ ＤＮＡをクローニングするか、または発現するのに適切な宿主細胞としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ株（ＤＵ１４５およびＴｓｕＰｒ１））、他のトランスフェクション可能な細胞または形質転換可能な前立腺癌細胞、初代細胞（ＰｒＥＣ）ならびに組換えタンパク質の発現に通常使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞および２９３Ｔ細胞）が挙げられる。

ＡＲをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能なベクターに挿入され得る。種々のベクターが、公に利用可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列は、種々の手順により、ベクターに挿入され得る。一般的に、ＤＮＡは、当該分野において公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され得る。一般的に、ベクターの構成要素としては、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上のこれらの構成要素を含む適切なベクターの構築は、当業者にとって公知である標準的な連結反応技術を使用する。

ＡＲタンパク質は、直接的に組換え生成され得るだけではなく、異種のポリペプチド（例えば、本明細書で開示されるＦＬＡＧタグ）との融合ポリペプチドとしても組換え生成され得る。この異種のポリペプチドは、成熟タンパク質または成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的な開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る。一般的に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であり得るか、またはシグナル配列は、ベクターに挿入されるＡＲ ＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼのリーダー、ペニシリナーゼのリーダー、ｌｐｐのリーダーまたは熱安定エンテロトキシンＩＩのリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であり得る。酵母の分泌のために、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼのリーダー、αファクターのリーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのαファクターのリーダーおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのαファクターのリーダーが挙げられ、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載される）もしくは酸性ホスファターゼのリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのグルコアミラーゼのリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ３６２，１７９）または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現において、哺乳動物シグナル配列（例えば、同一の種または関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列ならびにウイルスの分泌性リーダー由来のシグナル配列）が、タンパク質の分泌を導くために使用され得る。

発現ベクターおよびクローニングベクターの両方は、代表的に、１つ以上の選択される宿主細胞において、このベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が、大半のグラム陰性細菌に適切である。２μプラスミド起点が、酵母に適切である。種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。ＡＲの発現に適切な広範囲の宿主−ベクター系が利用可能である、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９、上記；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，上記を参照のこと。哺乳動物の発現のために好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現ベクターを使用して、ＡＲは、前立腺癌細胞株および非前立腺細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ ３Ｔ３およびＴｓｕＰｒ１）において発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、ＡＲタンパク質またはそのフラグメントの生成に有用である。このような宿主−ベクター系は、ＡＲおよびＡＲの変異またはＡＲアナログの機能特性を研究するために使用され得る。

発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的に、選択遺伝子（選択可能なマーカーとも呼ばれる）を含む。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリン）に対する抵抗性を付与するか、（ｂ）栄養素要求株の欠損を補充するか、または（ｃ）複合培地から取得できない決定的な栄養素を供給する（例えば、ＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）タンパク質をコードする。

哺乳動物細胞のための適切な選択可能なマーカーの例は、ＡＲ核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にする選択可能なマーカー（例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼ）である。野生型ＤＨＦＲが使用される場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損している、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）により記載されるように調製され、そして増殖されたＣＨＯ細胞株である。酵母における使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））である。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠損する酵母変異系統（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）））に対して選択マーカーを提供する。

本発明の実施に関する、さらなる詳細は、以下の通りである：オリゴヌクレオチドＵ９５ＡおよびＵ１３３Ａ遺伝子アレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入した。チャコール処理したデキストラン処理（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）ウシ胎児血清は、Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。ビカルタミドは、ＵＣＬＡ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｐｈａｒｍａｃｙから入手し、そしてアセトン中に溶解した。非アイソトープ性Ｒ１８８１および^３Ｈ−Ｒ１８８１は、ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＡＲ抗体Ｎ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびＦｌａｇ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）は、免疫ブロットアッセイにおいて使用した。分泌されたＰＳＡは、ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）により測定した。タンパク質の抽出物は、全細胞の溶解を確保するために、高界面活性剤緩衝液（２％ＳＤＳ）中で調製された。

代表的なＤＮＡ構築物は、以下のように調製した：ｐＣＳＵＡＣＧ（Ｕ６−ｓｈＲＮＡαＡＲ；ＣＭＶ−ＧＦＰ）は、ｐＣＳＣＧのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化物とＵ６−ｓｈＲＮＡαＡＲのＰＣＲ産物とを連結することにより構築した。Ｕ６−ｓｈＲＮＡαＡＲのＰＣＲは、６０℃のアニーリング温度において、適切なプライマーと共にｈＵ６−含有プラスミドを使用することにより実行した。ｐＣＳＣＡ（ＣＭＶ−ＡＲ）は、ｐＳＲα−ＡＲのＸｂａＩフラグメントをｐＣＳＣＧのＮｈｅＩ部位へサブクローニングすることにより作製した。ＡＲ変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、標準的なＰＣＲに基づく特定部位の突然変異誘発により作製した。□ＮＬＳは、以前に核内移行を乱すことを示された３箇所の点変異（Ｋ６１８Ｍ、Ｋ６３２Ｍ、Ｋ６３３Ｍ）^４９を含む。□Ｐｒｏは、先行研究^３２に基づき、アミノ酸３７２〜３８１の欠失を含む。ＡＲＲ_２Ｐｂ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅは、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍａｔｕｓｉｋ（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ）により好意的に提供された。ＰＳＡのＲＴ−ＰＣＲもまた、適切なプライマーを使用して実行した。

代表的なインビトロ増殖実験およびインビボ増殖実験の詳細は、以下の通りである：ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ）細胞およびＬＡＰＣ４細胞を、１０％ウシ胎児血清で補充されたＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地において維持した。ＬＮＣａＰ−ＡＲおよびＬＮＣａＰベクターを、それぞれｐＳＲ□−ＡＲレトロウイルスまたはｐＳＲ□レトロウイルスによる感染、そして５００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８における選択により得た。他の実験におけるＬＮＣａＰ−ＡＲ、ＬＮＣａＰベクター、ＬＡＰＣ４−ＡＲおよびＬＡＰＣ４ベクターを、それぞれｐＣＳＣＡレンチウイルスまたはｐＣＳＣレンチウイルスによる感染（選択せず）（＞９０％感染）により得た。インビトロ実験のために、異なる構築物により安定的に感染されたＬＮＣａＰ細胞およびＬＡＰＣ４細胞は、３〜５日間のチャコール処理血清における増殖により、アンドロゲンを欠乏させた。５×１０^４の細胞を、種々の濃度のＲ１８８１で補充させた１０％チャコール処理血清を含有する培地においてか、または１０％完全な血清と種々の濃度のビカルタミドとを含有する培地においてウェル毎にプレートした。コロニーを、２週間後のクリスタルバイオレット染色により可視化した。インビボ腫瘍形成能は、インタクトな雄性ＳＣＩＤマウスの側腹または去勢雄性ＳＣＩＤマウスの側腹への１００μｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）中の５×１０^５のＬＡＰＣ４細胞または１×１０^６のＬＮＣａＰ細胞の皮下注射により測定した。腫瘍の大きさは、記載されるようにノギス（ｃａｌｉｂｅｒ）を使用して、毎週、三次元的に測定した^２６。ＡＲのノックダウンを、ｓｈＲＮＡ ＡＲレンチウイルスを用いたＨＲ ＬＡＰＣ４の感染により実行した。去勢したマウス内で増殖した腫瘍を外植し、そしてＧＦＰ陽性細胞の割合について、フローサイトメトリにより分析した。全てのマウス実験を、ＵＣＬＡのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＲＣ）の指針にしたがって実行した。

マイクロアレイ研究のためのＨＳ異種移植片およびＨＲ異種移植片の組は、３つの施設より収集された。ＬＵＣａＰ２３、ＬＵＣａＰ３５およびＬＵＣａＰ４１は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎにおいて開発された；ＣＷＲ２２は、Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌにより好意的に提供された；ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓにおいて開発された；ＬＮＣａＰは、ＡＴＣＣから購入され、マウスに移植された。ＨＳ異種移植片を、インタクトなヌードマウスまたは雄性ＳＣＩＤマウスのいずれかにおいて増殖した。そしてそのＨＲ異種移植片対応物は、去勢雄性マウスにおける連続継代により成長させた。マイクロアレイ実験を実行し、そのデータを、製造者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の説明書にしたがって分析した。本発明者らは、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）およびＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを、各々の異種移植片について２〜８個の腫瘍のプールから抽出した。これらの腫瘍は、同等の大きさおよび同等の血清ＰＳＡレベルを有する。各々のサンプルについて、１５μｇの全ＲＮＡを、二本鎖ｃＤＮＡを生成するために使用した。ｃＲＮＡを、ビオチン標識ヌクレオチド（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて転写した。このｃＲＮＡを、フラグメント化し、そしてＵ９５Ａマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）へハイブリダイズさせた。スキャンしたイメージを、絶対分析および比較分析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ説明書）のために使用した。マイクロアレイデータをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇプログラム（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）により生成した。

代表的なクロマチン免疫沈降の詳細は、以下の通りである：ＬＮＣａＰ−ＡＲまたはＬＮＣａＰベクターは、アンドロゲン欠乏させ、そしてビヒクル、１００ｐＭのＲ１８８１、１ｎＭのＤＨＴまたは１０μＭのビカルタミドのいずれかで１時間チャレンジした。可溶性クロマチンを、ホルムアルデヒド架橋および音波処理により調製した。ＡＲ、Ｎ−ＣｏＲ、ＰｏｌＩＩ、Ａｃ−Ｈ３／４、ＳＲＣ１、ＴＩＦ２、ＡＩＢ１およびＰＣＡＦに対する特異的ＩｇＧを、タンパク質結合ＤＮＡフラグメントを免疫沈降するために使用した。架橋の反転後、ＰＣＲ反応を実行し、ＫＬＫ３／ＰＳＡまたはＫＬＫ２のプロモーター領域を増幅した^２１。ビカルタミド処理またはビヒクル処理についての２つの組を、平均化し、そして少なくとも１つのサンプルにおける５００の最小の発現について、２倍（Ｐ＜０．０５）誘導されたプローブセットの数を求めた。このデータセットを、最小でも２倍の増加を誘導したプローブセットの数について分析した。このデータは、増加したＡＲ発現が、全体的にアンタゴニストを弱いアゴニストに移行することを示した。

この出願の全体にわたって、種々の刊行物が参照される（例えば、括弧内）。これらの刊行物の開示は、それらの全体について参考として、本明細書により援用される。本発明の種々の代表的な局面の理解を容易にするために、これらの援用される資料の特定の局面が、本明細書において再現される。

本発明は、本明細書において開示される実施形態（本発明の個々の局面の単なる例示であることが意図される）により、その範囲が限定されない。そして、機能的に同等であるいかなる実施形態も、本発明の範囲内である。本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変（本明細書に記載されるものも加えて）が、前記の記述および教示から当業者に明白となる。そしてこれらの改変は、同様に本発明の範囲内に含まれることが意図される。このような改変または他の実施形態は、発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、実施され得る。しかしながら、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ、限定される。

図１は、ＨＳ異種移植片およびＨＲ異種移植片におけるＡＲ ｍＲＮＡの発現を表す試験の結果を示す。上、ＡＲプローブセット１および２（それぞれＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＩＤ １５７７および１５７８）に対する正規化したマイクロアレイの値が、１４異種移植片各々由来の腫瘍のプールについて示される。下、２％ＳＤＳ中に溶解させた、各々の異種移植片プールのうちの１つの腫瘍由来のＡＲウェスタンブロット。より長い曝露において、ＨＳ ＬＵＣａＰ３５におけるＡＲタンパク質の発現は明らかであった。 図２は、前立腺癌の進行のモデルを図式的に示す。アンドロゲン低下薬物および競合的ＡＲアンタゴニストからなるホルモン治療は、活性的なレセプターの数を減少させ、決定的な応答を誘導する（ＨＳ疾患）。治療の失敗（ＨＲ疾患）は、アンタゴニストに対する応答を反転させ、そして全てのリガンド（残余のアンドロゲン、アンタゴニストおよび他のステロイド）に対する応答を増幅する、増加したレセプターレベルに起因する。

Claims (18)

1. 哺乳動物前立腺癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、ここで、該前立腺癌細胞は、外因性野生型アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを発現し、該外因性野生型アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドは、アンドロゲンレセプターポリペプチドまたはアンドロゲンレセプターポリペプチド改変体をコードし、
   該細胞は、正常な前立腺細胞における該アンドロゲンレセプターポリペプチドまたは該アンドロゲンレセプターポリペプチドの改変体をコードするｍＲＮＡのレベルと比較して、該アンドロゲンレセプターポリペプチドまたは該アンドロゲンレセプターポリペプチド改変体をコードするｍＲＮＡを異常なレベルでさらに含み、該方法は、以下：
   （ａ）該前立腺癌細胞における該ｍＲＮＡの異常なレベルが、該正常な前立腺細胞におけるｍＲＮＡのレベルよりも、少なくとも２倍高いことを決定する工程；
   （ｂ）試験される化合物と該前立腺癌細胞とを接触して、処理した前立腺癌細胞を提供する工程；および
   （ｃ）該処理した前立腺癌細胞の１つ以上の生理学的特徴を調べる工程
   を包含する、方法。
2. 哺乳動物前立腺癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、ここで、該前立腺癌細胞は、外因性野生型アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドを発現し、該外因性野生型アンドロゲンレセプターポリヌクレオチドは、正常な前立腺細胞によりコードされるアンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたはアンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルと比較して、アンドロゲンレセプターポリペプチドの異常なレベルまたはアンドロゲンレセプターポリペプチド改変体の異常なレベルをコードし、
   該方法は、以下：
   （ａ）該アンドロゲンレセプターポリペプチドの異常なレベルまたは該アンドロゲンレセプターポリペプチド改変体の異常なレベルが、該正常な前立腺細胞におけるアンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたはアンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルよりも、少なくとも２倍高いことを決定する工程；
   （ｂ）試験される化合物と該前立腺癌細胞とを接触して、処理した前立腺癌細胞を提供する工程；および
   （ｃ）該処理した前立腺癌細胞の１つ以上の生理学的特徴を調べる工程
   を包含する、方法。
3. 請求項１に記載される哺乳動物前立腺癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、該方法は、さらなる工程：
   （ａ）該前立腺癌細胞と同一であり、かつ該化合物と接触させない哺乳動物前立腺癌細胞を提供して、コントロール前立腺癌細胞を提供する工程；
   該コントロール前立腺癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴を調べる工程；および
   該コントロール前立腺癌細胞の該１つ以上の生理学的特徴を、前記処理した前立腺癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴と比較する工程
   を包含する、方法。
4. 請求項２に記載される哺乳動物前立腺癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、該方法は、さらなる工程：
   （ａ）前記前立腺癌細胞と同一であり、かつ前記化合物と接触させない哺乳動物前立腺癌細胞を提供して、コントロール前立腺癌細胞を提供する工程；
   該コントロール前立腺癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴を調べる工程；および
   該コントロール前立腺癌細胞の該１つ以上の生理学的特徴を、前記処理した前立腺癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴と比較する工程
   を包含する、方法。
5. 選択された哺乳動物癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、ここで、該癌細胞は、外因性野生型ポリヌクレオチドを発現し、該外因性野生型ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードし、
   該細胞は、正常な選択された細胞における該目的のタンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルと比較して、該目的のタンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡの異常なレベルをさらに含み、該方法は、以下：
   （ａ）該選択された癌細胞における該ｍＲＮＡの異常なレベルが、該正常な選択された細胞におけるｍＲＮＡのレベルよりも、少なくとも２倍高いことを決定する工程；
   （ｂ）試験される化合物と該選択された癌細胞とを接触させて、処理した癌細胞を提供する工程；および
   （ｃ）該処理した癌細胞の１つ以上の生理学的特徴を調べる工程
   を包含する、方法。
6. 選択された哺乳動物癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、ここで、該選択された癌細胞は、外因性野生型ポリヌクレオチドを発現し、該外因性野生型ポリヌクレオチドは、正常な選択された細胞によりコードされる該目的のタンパク質のレベルまたはポリペプチドのレベルと比較して、目的のタンパク質またはポリペプチドの異常なレベルをコードし、該方法は、以下：
   （ａ）該目的のタンパク質またはポリペプチドの該異常なレベルが、該正常な選択された細胞における該目的のタンパク質のレベルまたはポリペプチドのレベルよりも、少なくとも２倍高いことを決定する工程；
   （ｂ）試験される化合物と該選択された癌細胞とを接触させて、処理した癌細胞を提供する工程；および
   （ｃ）該処理した癌細胞の１つ以上の生理学的特徴を調べる工程
   を包含する、方法。
7. 請求項５に記載される選択された哺乳動物癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、該方法は、さらなる工程：
   （ａ）該選択された癌細胞と同一であり、かつ該化合物と接触させない哺乳動物癌細胞を提供して、コントロール癌細胞を提供する工程；
   該コントロール癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴を調べる工程；および
   該コントロール癌細胞の該１つ以上の生理学的特徴を、前記処理した癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴と比較する工程
   を包含する、方法。
8. 請求項６に記載される選択された哺乳動物癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、該方法は、さらなる工程：
   （ａ）該選択された癌細胞と同一であり、かつ該化合物と接触させない哺乳動物癌細胞を提供して、コントロール癌細胞を提供する工程；
   該コントロール癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴を調べる工程；および
   該コントロール癌細胞の該１つ以上の生理学的特徴を、前記処理した癌細胞の前記１つ以上の生理学的特徴と比較する工程
   を包含する、方法。
9. 請求項５または６に記載される選択された哺乳動物癌細胞に対する化合物の生理学的影響を調べる方法であって、該選択された哺乳動物癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞および前立腺癌細胞からなる群から選択される、方法。
10. ホルモン無反応性の前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞は、生物学的な機能を示すアンドロゲンレセプターを備え、該方法は、該アンドロゲンレセプターの生物学的な機能を低下させる工程を包含する、方法。
11. 請求項１０に記載されるホルモン無反応性の前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記アンドロゲンレセプターの生物学的な機能を低下させる工程は、該アンドロゲンレセプターＤＮＡレベル、アンドロゲンｍＲＮＡレベル、またはアンドロゲンタンパク質レベルに影響を及ぼす工程を包含する、方法。
12. 請求項１１に記載されるホルモン無反応性の前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記アンドロゲンレセプタータンパク質レベルは、該アンドロゲンレセプターとクロストークするＥＧＦレセプターを標的にするようにシグナル伝達経路を調節することにより低下される、方法。
13. 請求項１１に記載されるホルモン無反応性の前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記アンドロゲンレセプタータンパク質レベルは、細胞性分解経路の誘導により低下される、方法。
14. 請求項１１に記載されるホルモン無反応性の前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記アンドロゲンレセプタータンパク質レベルは、該アンドロゲンレセプターの完全性を維持する熱ショックタンパク質からアンドロゲンレセプターを解離させることにより低下される、方法。
15. 請求項１１に記載されるホルモン無反応性の前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記アンドロゲンレセプタータンパク質レベルは、アンドロゲンレセプターアンチセンス技術またはｍＲＮＡノックダウン技術を使用して低下される、方法。
16. 請求項１１に記載される、ホルモン無反応性の前立腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記アンドロゲンレセプタータンパク質は、前記アンドロゲンレセプターのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を改変することによってか、あるいは、該アンドロゲンレセプターの翻訳後修飾によって低下され、該翻訳後修飾は、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化およびスモ化からなる群から選択される、方法。
17. 選択された前立腺癌細胞がホルモン感受性であるか、またはホルモン無反応性になっているか否かを決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）該選択された細胞において、アンドロゲンレセプターポリペプチドまたはアンドロゲンレセプターポリペプチド改変体をコードするｍＲＮＡのレベルを決定する工程；
    （ｂ）選択されたホルモン感受性の前立腺癌細胞におけるｍＲＮＡのレベルを決定する工程；
    （ｃ）工程（ａ）において決定した該ｍＲＮＡのレベルを、工程（ｂ）において決定した該ｍＲＮＡのレベルと比較する工程；および
    （ｄ）工程（ａ）において決定した該ｍＲＮＡのレベルが、工程（ｂ）において決定した該ｍＲＮＡのレベルよりも少なくとも２倍高い場合、該選択された前立腺癌細胞がホルモン感受性であるか、またはホルモン無反応性になっていることを決定する工程
    を包含する、方法。
18. 選択された前立腺癌細胞がホルモン感受性であるか、またはホルモン無反応性になっているかどうかを決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）該選択された細胞において、アンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたはアンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルを決定する工程；
    （ｂ）選択されたホルモン感受性の前立腺癌細胞におけるアンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたはアンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルを決定する工程；
    （ｃ）工程（ａ）において決定した該アンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたは該アンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルを工程（ｂ）において決定した該アンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたは該アンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルと比較する工程；および
    （ｄ）工程（ａ）において決定した該アンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたは該アンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルが、工程（ｂ）において決定した該アンドロゲンレセプターポリペプチドのレベルまたは該アンドロゲンレセプターポリペプチド改変体のレベルよりも少なくとも２倍高い場合、該選択された前立腺癌細胞がホルモン感受性であるか、またはホルモン無反応性になっていることを決定する工程
    を包含する、方法。

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