JP2007292596A

JP2007292596A - Method for regenerating carrier for immobilizing probe polynucleotide

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Publication number: JP2007292596A
Application number: JP2006120641A
Authority: JP
Inventors: Senju Oka; 千寿岡; Toru Itsunoi; 透五ノ井; Hiroshi Maeda; 浩前田; Mitsuhiro Shimizu; 三弘清水; Kenji Isogai; 健次磯貝; Hiroshi Okamura; 浩岡村; Noboru Mikami; 襄三上
Original assignee: Chiba Prefectural Government; Chiba University NUC; Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Chiba Prefectural Government; Chiba University NUC; Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2006-04-25
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2026-04-25
Also published as: JP4524392B2

Abstract

【課題】プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を分析に使用した後、プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去して、再生する手段を提供する。
【解決手段】プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において該担体を再生する方法であって、ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤の少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程、および該担体を洗浄する工程を含む、前記方法。
【選択図】図１Provided is a means for removing and regenerating a target polynucleotide hybridized to a probe polynucleotide after using a carrier on which the probe polynucleotide is immobilized for analysis.
A method for regenerating a carrier sample in a method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, the carrier comprising a target polynucleotide hybridized to the probe polynucleotide, and a humectant The method comprising the steps of: applying an aqueous dispersion comprising at least one of: and washing the carrier.
[Selection] Figure 1

Description

本発明は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体の再生方法、ならびにそのための試薬およびキットに関する。 The present invention relates to a method for regenerating a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, and a reagent and kit therefor.

多種多様な生物の遺伝子構造を明らかにするのみならず、その遺伝子機能をゲノムスケールで解明しようとする試みが行われつつあり、遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発も急速に進んでいる。マイクロアレイは、スライドガラス等の基板にＤＮＡなどのポリヌクレオチドを所定の領域毎に多数整列固定させた高密度のアレイであり、核酸の塩基配列の決定、並びに遺伝子の発現、変異、多型性などの同時解析に非常に有用である。このマイクロアレイを用いた遺伝子情報の解析は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発などに極めて有用であるため、マイクロアレイの作製技術および得られたデータの解析システムにより一層の開発が望まれている。 In addition to clarifying the genetic structures of a wide variety of organisms, attempts are being made to elucidate their gene functions on a genome scale, and technological development for efficient analysis of gene functions is rapidly progressing. Yes. A microarray is a high-density array in which a large number of polynucleotides such as DNA are aligned and fixed on a substrate such as a slide glass for each predetermined region. Determination of nucleic acid base sequences, gene expression, mutation, polymorphism, etc. It is very useful for simultaneous analysis. Analysis of genetic information using this microarray is extremely useful for drug discovery research, disease diagnosis and development of preventive methods, etc., so further development is desired by the microarray production technology and the analysis system of the obtained data. ing.

マイクロアレイを用いた検出に際しては、まず担体表面に高密度に整列したプローブポリヌクレオチドに対して、放射性同位体や蛍光色素で標識したポリヌクレオチド試料をハイブリダイズさせる。このとき、ターゲットポリヌクレオチド試料中の、プローブポリヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつ分子は、プローブポリヌクレオチドと相補的にハイブリダイズする。次いで、このハイブリダイズしているターゲットポリヌクレオチド分子上の標識に由来するシグナルを測定し、ハイブリダイズされたプローブポリヌクレオチドを同定する。具体的には、ＲＩや蛍光イメージスキャナーでマイクロアレイ上の放射線強度または蛍光強度を測定し、そして得られた画像データを解析処理する。従って、マイクロアレイによれば、数千〜数万個の分子を同時にハイブリダイズさせて検出することができ、微量の試料で短時間のうちに大量の遺伝子情報を得ることができる。 In detection using a microarray, first, a polynucleotide sample labeled with a radioisotope or a fluorescent dye is hybridized to a probe polynucleotide arranged on the carrier surface at a high density. At this time, molecules having a base sequence complementary to the probe polynucleotide in the target polynucleotide sample hybridize complementarily to the probe polynucleotide. The signal derived from the label on the hybridized target polynucleotide molecule is then measured to identify the hybridized probe polynucleotide. Specifically, the radiation intensity or fluorescence intensity on the microarray is measured by RI or a fluorescence image scanner, and the obtained image data is analyzed. Therefore, according to the microarray, thousands to tens of thousands of molecules can be simultaneously hybridized and detected, and a large amount of gene information can be obtained in a short time with a small amount of sample.

マイクロアレイにおいてプローブポリヌクレオチドを高密度かつ強固に固定化するため、例えば、担体表面に、ポリヌクレオチドと共有結合を形成する活性エステル基等の反応活性基を導入して、プローブポリヌクレオチドを共有結合を介して固定化させること（特許文献１〜３参照）などが報告されている。 In order to immobilize probe polynucleotides in a microarray at a high density and firmly, for example, reactive active groups such as active ester groups that form covalent bonds with polynucleotides are introduced on the surface of the carrier, so that the probe polynucleotides are covalently bonded. (See Patent Documents 1 to 3) and the like.

マイクロアレイは高価であることから、ターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせて分析した後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを除去して再生し、再利用することが望まれる。しかし、プローブポリヌクレオチドに一度ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを完全に除去することは困難であり、従ってマイクロアレイの再利用は実質的に不可能であった。 Since microarrays are expensive, it is desirable that the target polynucleotides are hybridized and analyzed, and then the hybridized polynucleotides are removed and regenerated for reuse. However, it has been difficult to completely remove the polynucleotide once hybridized to the probe polynucleotide, and therefore, it is substantially impossible to reuse the microarray.

ＷＯ００／２２１０８WO 00/22108 ＷＯ０１／７５４４７WO 01/75447 ＷＯ０２／１２８９１WO 02/12891

本発明の課題は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を分析に使用した後、プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去して、再生する手段を提供することである。 An object of the present invention is to provide means for removing and regenerating a target polynucleotide hybridized to a probe polynucleotide after using a carrier on which the probe polynucleotide is immobilized for analysis.

本発明者らは上記課題を解決するために検討を行った結果、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体にポリヌクレオチド試料を接触させてターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、未反応のポリヌクレオチドを除去した後、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を担体に塗布することにより、その後の担体洗浄工程においてターゲットポリヌクレオチドが効率的に除去されることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of investigations to solve the above problems, the present inventors contacted a polynucleotide sample with a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, hybridized the target polynucleotide, and removed unreacted polynucleotide. Then, by applying an aqueous dispersion containing at least one selected from the group consisting of a humectant, preferably a gelling agent and a sugar, to the carrier, the target polynucleotide can be efficiently used in the subsequent carrier washing step. It was found that it was removed, and the present invention was completed.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において該担体を再生する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤を含む水性分散液を塗布する工程、および
該担体を洗浄する工程
を含む、前記方法。
（２）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（１）記載の方法。
（３）担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤を含む水性分散液を塗布する工程、および
該担体を洗浄する工程を含む、前記方法。
（４）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（３）記載の方法。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for regenerating a carrier in a method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized,
The method comprising: applying an aqueous dispersion containing a humectant to a carrier in which a target polynucleotide is hybridized to a probe polynucleotide; and washing the carrier.
(2) The method according to (1), wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.
(3) A method of removing a target polynucleotide hybridized with a probe polynucleotide immobilized on a carrier,
The method comprising: applying an aqueous dispersion containing a humectant to a carrier in which a target polynucleotide is hybridized to a probe polynucleotide; and washing the carrier.
(4) The method according to (3), wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.

（５）プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法であって、
ａ）担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド試料を接触させてポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）未反応のポリヌクレオチドを除去する工程、
ｃ）保湿剤を含む水性分散液を担体に塗布する工程、および
ｄ）ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程
を含む前記方法。
（６）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（５）記載の方法。
（７）（５）または（６）に記載のｄ）の工程の後に担体を洗浄することにより、担体を再生する方法。
（８）プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において担体の再生を促進するための試薬であって、保湿剤を含む水性分散液からなる前記試薬。
（９）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（８）記載の試薬。
（１０）担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドにポリヌクレオチド試料を接触させ、ポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定することによりポリヌクレオチド試料を分析するためのキットであって、（８）または（９）に記載の試薬を含む前記キット。 (5) A method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized,
a) contacting a polynucleotide sample with a probe polynucleotide immobilized on a carrier to hybridize the target polynucleotide contained in the polynucleotide sample to the probe polynucleotide;
b) removing unreacted polynucleotide;
c) applying an aqueous dispersion containing a humectant to a carrier; and d) measuring a signal based on hybridization.
(6) The method according to (5), wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.
(7) A method for regenerating a carrier by washing the carrier after the step d) according to (5) or (6).
(8) A reagent for promoting regeneration of a carrier in a method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, the reagent comprising an aqueous dispersion containing a humectant.
(9) The reagent according to (8), wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.
(10) A polynucleotide sample is brought into contact with a probe polynucleotide immobilized on a carrier, a target polynucleotide contained in the polynucleotide sample is hybridized to the probe polynucleotide, and a signal based on hybridization is measured. A kit for analyzing a sample, comprising the reagent according to (8) or (9).

本発明により、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いて分析を行った後、該担体を再生して再利用することが可能になる。 According to the present invention, after carrying out an analysis using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, the carrier can be regenerated and reused.

一実施形態において本発明は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において該担体を再生する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体を、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程、および該担体を洗浄する工程を含む、前記方法に関する。 In one embodiment, the present invention relates to a method for regenerating a carrier in a method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized,
Applying an aqueous dispersion containing at least one selected from the group consisting of a humectant, preferably a gelling agent and a sugar, to the carrier in which the target polynucleotide is hybridized to the probe polynucleotide, and washing the carrier The method comprising the steps of:

本発明において担体、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された担体を再生するとは、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去することをさす。これにより担体を再度分析に使用することができる。 In the present invention, to regenerate a carrier, that is, a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, means to remove the target polynucleotide hybridized to the probe polynucleotide immobilized on the carrier. This allows the carrier to be used again for analysis.

従って一実施形態において、本発明は、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体を、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程、および該担体を洗浄する工程を含む、前記方法に関する。 Accordingly, in one embodiment, the present invention provides a method for removing a target polynucleotide hybridized to a probe polynucleotide immobilized on a carrier, comprising:
Applying an aqueous dispersion containing at least one selected from the group consisting of a humectant, preferably a gelling agent and a sugar, to the carrier in which the target polynucleotide is hybridized to the probe polynucleotide, and washing the carrier The method comprising the steps of:

換言すれば本発明は、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドの除去を促進する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体を、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程を含む、前記方法に関する。 In other words, the present invention is a method for promoting the removal of a target polynucleotide hybridized to a probe polynucleotide immobilized on a carrier,
Applying the carrier in which the target polynucleotide is hybridized to the probe polynucleotide to an aqueous dispersion containing at least one selected from the group consisting of a humectant, preferably a gelling agent and a saccharide. .

本明細書においてポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドも包含され、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、ならびに核酸誘導体も包含される。ＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが包含される。核酸誘導体の例としては、リン酸ジエステル部位を修飾した人工核酸；フラノース部位のグリコシル結合やヒドロキシル基を修飾した人工核酸；核酸塩基部位を修飾した人工核酸；および糖・リン酸骨格以外の構造を利用した人工核酸などが挙げられ、より具体的には、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型またはメチルホスホノチオエート型の人工核酸；フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、または多環式糖骨格型の人工核酸；ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型、または環拡張修飾塩基型の人工核酸などが挙げられる。ならびにそれらに標識が付加されたもの、また、担体に固定化するために反応性の官能基が付加されたものも包含される。 In the present specification, the polynucleotide includes oligonucleotides, and also includes nucleic acids including DNA and RNA, and nucleic acid derivatives. DNA includes single-stranded DNA and double-stranded DNA. Examples of nucleic acid derivatives include artificial nucleic acids modified with phosphodiester sites; artificial nucleic acids modified with glycosyl bonds and hydroxyl groups at furanose sites; artificial nucleic acids modified with nucleobase sites; and structures other than sugar / phosphate skeletons Artificial nucleic acid used, etc. are mentioned. More specifically, phosphorothioate type, phosphorodithioate type, phosphorodiamidate type, methylphosphonate type or methylphosphonothioate in which the oxygen atom of the phosphate site is substituted with a sulfur atom -Type artificial nucleic acid; substituent-modified type on furanose ring, pyranose type with 1-carbon increase in sugar ring skeleton, or polycyclic sugar skeleton type artificial nucleic acid; pyrimidine C-5 modified base type, purine C-7 Examples thereof include artificial nucleic acids having a position-modified base type or a ring-expanded modified base type. In addition, those having a label added thereto, and those having a reactive functional group added to be immobilized on a carrier are also included.

本明細書においてプローブポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、目的遺伝子を検出するために用いられるポリヌクレオチドであって、目的遺伝子に対応するポリヌクレオチドまたはその断片と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさす。プローブポリヌクレオチドとしては、通常、合成オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの（例えば、一本鎖を二本鎖に変性させたもの）等が用いられる。プローブポリヌクレオチドは、通常２０〜５０００塩基長、好ましくは２０〜１５００塩基長を有する。 In the present specification, the probe polynucleotide has a meaning usually used in the art, and is a polynucleotide used for detecting a target gene, specifically a polynucleotide corresponding to the target gene or a fragment thereof. A polynucleotide that hybridizes. As the probe polynucleotide, synthetic oligonucleotides, cDNA and genomic DNA, fragments thereof, and those obtained by denaturing them (for example, those obtained by modifying a single strand into a double strand) are used. The probe polynucleotide usually has a length of 20 to 5000 bases, preferably 20 to 1500 bases.

本明細書においてターゲットポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、検出対象であるポリヌクレオチドをさす。ターゲットは標的と称される場合もある。通常、プローブにハイブリダイズさせる被検試料由来のポリヌクレオチドおよびそれを基にして酵素的に合成されたポリヌクレオチド、具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ａＲＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの等が用いられる。 In this specification, a target polynucleotide has the meaning normally used in this technical field, and refers to the polynucleotide which is a detection target. A target may be referred to as a target. Usually, a polynucleotide derived from a test sample to be hybridized to a probe and a polynucleotide enzymatically synthesized based on the polynucleotide, specifically, mRNA, cDNA, aRNA, fragments thereof, and their denatured A thing etc. are used.

ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、相補的な配列を持つポリヌクレオチド同士、例えば、一本鎖のＤＮＡ同士、一本鎖のＲＮＡ同士、または一本鎖のＤＮＡと一本鎖のＲＮＡが適切な条件下で二本鎖を形成することをいう。 Hybridization or hybridization has the meaning normally used in the art, and polynucleotides having complementary sequences, for example, single-stranded DNAs, single-stranded RNAs, or single-stranded It means that DNA and single-stranded RNA form a double strand under appropriate conditions.

プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法は、当技術分野で慣用の分析方法をさし、通常、以下の工程によって実施される：
担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド試料を接触させてポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、未反応のポリヌクレオチドを除去する工程、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程。 The method of analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized refers to an analysis method commonly used in the art, and is usually performed by the following steps:
For contacting a polynucleotide sample with a probe polynucleotide immobilized on a carrier to hybridize the target polynucleotide contained in the polynucleotide sample to the probe polynucleotide, removing unreacted polynucleotide, and hybridization. Measuring a signal based thereon.

ポリヌクレオチド試料は、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズするターゲットポリヌクレオチドを含みうる試料であれば特に制限されない。例えば、血液、血清、尿、涙、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑液組織、軟骨細胞、滑液マクロファージ、内皮細胞、皮膚、これらの抽出物および破砕物、ならびに培養細胞、胚細胞、幹細胞、動物細胞抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物および真核単細胞抽出物等の生物学的試料が挙げられる。ポリヌクレオチド試料には、上記の生物学的試料に由来する試料、例えば、特定の核酸が増幅された試料等も包含される。通常、ポリヌクレオチド試料として、含まれるポリヌクレオチドが標識されたものを用いることにより、ハイブリダイゼーションを検出する。上記生物学的試料およびこれに由来する試料を、ＳＳＣ（saline-sodium citrate）などの水性媒体に溶解または分散することにより、ポリヌクレオチド試料（以下、ハイブリダイゼーション溶液と称する場合もある）を調製することができる。 The polynucleotide sample is not particularly limited as long as it can contain a target polynucleotide that hybridizes to a probe polynucleotide immobilized on a carrier. For example, blood, serum, urine, tears, cells, organs, tissues, bone, bone marrow, lymph, lymph nodes, synovial tissue, chondrocytes, synovial macrophages, endothelial cells, skin, extracts and debris thereof, and Examples include biological samples such as cultured cells, embryonic cells, stem cells, animal cell extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, and eukaryotic single cell extracts. The polynucleotide sample includes a sample derived from the above biological sample, for example, a sample in which a specific nucleic acid is amplified. Usually, hybridization is detected by using a polynucleotide sample labeled with the contained polynucleotide. A polynucleotide sample (hereinafter also referred to as a hybridization solution) is prepared by dissolving or dispersing the biological sample and a sample derived therefrom in an aqueous medium such as SSC (saline-sodium citrate). be able to.

ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定するとは、換言すれば、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを示すシグナル、通常、標識に基づくシグナルを測定することをさし、得られるシグナルおよびその強度は、検出方法、標識方法や標識の種類によって異なる。 Measuring a signal based on hybridization means, in other words, measuring a signal indicating hybridization between a probe polynucleotide and a target polynucleotide, usually a signal based on a label. Depending on the detection method, labeling method and type of label.

標識方法や標識の種類は、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば特に制限されず、当技術分野で公知である。例えば、ターゲットポリヌクレオチドを合成または増幅する際に放射能標識や蛍光標識などの標識を共有結合させた基質（主にＵＴＰ）を取り込ませ、その標識によって、ハイブリダイゼーションを検出することができる。標識としては、当技術分野で通常用いられるもの、例えば、放射能標識、蛍光標識、化学ルミネッサー、ルミネッサーおよび感光剤等を使用することもできる。蛍光標識としては、Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられ、放射能標識としては、α−^３２Ｐ、γ−^３２Ｐ、^３５Ｓなどが挙げられる。さらに、酵素、酵素断片、酵素阻害剤、抗体、触媒等を結合させてもよい。 The labeling method and the kind of label are not particularly limited as long as hybridization between the probe polynucleotide and the target polynucleotide can be detected, and is known in the art. For example, when a target polynucleotide is synthesized or amplified, a substrate (mainly UTP) to which a label such as a radioactive label or a fluorescent label is covalently bound is incorporated, and hybridization can be detected by the label. As the label, those usually used in the art, for example, a radioactive label, a fluorescent label, a chemiluminescence, a luminescence and a photosensitizer can also be used. Examples of the fluorescent label include CyDye such as Cy3 and Cy5, FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, TET, TAMRA, FAM, HEX, ROX, and the like. As radioactive labels, α- ³² P, γ- ³² P , ³⁵ S and the like. Furthermore, an enzyme, an enzyme fragment, an enzyme inhibitor, an antibody, a catalyst or the like may be bound.

例えば、標識として蛍光標識を用いた場合は、蛍光シグナルを好適な検出器により検出する。検出器としては、例えば蛍光レーザー顕微鏡、冷却ＣＣＤカメラおよびコンピュータを連結した蛍光スキャニング装置が用いられ、担体上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣＤカメラの代わりに共焦点型または非焦点型のレーザーを用いてもよい。これにより、画像データが得られる。得られたデータから、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドに対して相補性を有するターゲットポリヌクレオチドを同定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファイルを作成したり、ポリヌクレオチド試料の塩基配列を決定することもできる。 For example, when a fluorescent label is used as the label, the fluorescent signal is detected by a suitable detector. As the detector, for example, a fluorescence scanning apparatus in which a fluorescence laser microscope, a cooled CCD camera, and a computer are connected is used, and the fluorescence intensity on the carrier can be automatically measured. A confocal laser or a non-focus laser may be used instead of the CCD camera. Thereby, image data is obtained. From the obtained data, target polynucleotides having complementarity to the probe polynucleotide immobilized on the carrier can be identified, and gene expression profiles can be created based on the target polynucleotides. The sequence can also be determined.

ターゲットポリヌクレオチドのプローブポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、プローブポリヌクレオチドを固定化した担体上に、上記ポリヌクレオチド試料をスポッティングした後インキュベートすることにより実施できる。例えば、スポッティングは、９６穴または３８４穴等のプラスチックプレートに試料を分注し、スポット装置を用いて滴下することにより実施できる。インキュベーションは、室温〜１００℃の範囲の温度で、１〜２４時間の範囲の時間で実施することが好ましい。 Hybridization of the target polynucleotide to the probe polynucleotide can be carried out by spotting the polynucleotide sample on a carrier on which the probe polynucleotide is immobilized and incubating the sample. For example, spotting can be performed by dispensing a sample into a plastic plate having 96 holes or 384 holes and dropping the sample using a spot device. Incubation is preferably carried out at a temperature ranging from room temperature to 100 ° C. for a time ranging from 1 to 24 hours.

ハイブリダイゼーション終了後、未反応のポリヌクレオチドを除去することが好ましい。例えば、界面活性剤の溶液と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応のポリヌクレオチドを除去することができる。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、またはグッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。 It is preferable to remove unreacted polynucleotide after completion of hybridization. For example, washing can be performed using a mixed solution of a surfactant solution and a buffer to remove unreacted polynucleotide. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, or the like can be used, and a citrate buffer solution is preferably used.

本発明の担体の再生方法は、上記のような分析方法において、ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程を含むことを特徴とする。上記工程は、ハイブリダイゼーション反応後に実施する。好ましくは、ハイブリダイゼーション終了後、未反応のポリヌクレオチドを除去した後、シグナルを測定する前に実施するのが好ましい。 The carrier regeneration method of the present invention is the above analysis method, wherein the target polynucleotide is at least selected from the group consisting of a humectant, preferably a gelling agent and a carbohydrate, on the carrier hybridized to the probe polynucleotide. It includes a step of applying an aqueous dispersion containing one kind. The above step is performed after the hybridization reaction. Preferably, after completion of hybridization, it is carried out after removing unreacted polynucleotide and before measuring the signal.

本発明者らは、保湿剤の少なくとも１種、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を担体に塗布することにより、分析終了後の担体の再生工程において、プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドの除去が促進されることを見出した。従って上記水性分散液は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において担体の再生を促進するための試薬として使用できる。 The present inventors apply an aqueous dispersion containing at least one humectant, preferably at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide, to the carrier after analysis. It has been found that the removal of the target polynucleotide hybridized with the probe polynucleotide is promoted in the regeneration step. Therefore, the aqueous dispersion can be used as a reagent for promoting the regeneration of the carrier in the method of analyzing a polynucleotide sample using the carrier on which the probe polynucleotide is immobilized.

上記水性分散液は、水を主成分とする溶媒に保湿剤の少なくとも１種、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を分散または溶解することにより調製しうる。本発明において、水性分散液には水溶液も含まれる。溶媒として、水を７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上含むものを用いる。溶媒として、好ましくは純水、より好ましくは超純水を用いる。本発明の水性分散液は、保湿剤を飽和濃度以下で使用する。 The aqueous dispersion can be prepared by dispersing or dissolving at least one humectant, preferably at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide, in a solvent containing water as a main component. In the present invention, the aqueous dispersion includes an aqueous solution. As the solvent, a solvent containing 70% or more of water, preferably 80% or more, more preferably 90% or more is used. As the solvent, preferably pure water, more preferably ultrapure water is used. The aqueous dispersion of the present invention uses a humectant at a saturation concentration or less.

本明細書において保湿剤は、ある物質もしくは組織に対して、接触、浸透または結合することなどにより、物質もしくは組織に対して水分を与える効果を有する物質、または水分を保持する効果を有する物質と定義され、ゲル化剤および糖質が包含される。具体的には、グリセリン、キシリトール（キシリット）、ジグリセリン、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、ソルビトール（ソルビット）、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム、３−メチル−１，３−ブタンジオール、１、３−ブチレングリコール（１、３ＢＧ）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（カーボワックス）、ポリグリセリンなどの多価アルコール、混合異性化糖、アミノ酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラキン酸ナトリウム、ＤＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−グリシン（アミノ酢酸）、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、γ−アミノ酪酸（ピぺリジン酸）、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｌ−オキシプロリン）、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸（ＰＣＡ）、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム液（ＰＣＡソーダ）、乳酸、乳酸ナトリウム（液）、尿素、尿酸、酸性ムコ多糖類、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、グルクロン酸、コラーゲン、可溶性コラーゲン（水溶性コラーゲン）、コラーゲン加水分解物（加水分解コラーゲン）、加水分解コラーゲン液、加水分解コラーゲン末、加水分解コラーゲンエチル、加水分解コラーゲンヘキサデシル、コラーゲンアミノ酸、アテロコラーゲン、ゼラチン、加水分解ゼラチン末、エラスチン、水溶性エラスチン、加水分解エラスチン（エラスチン加水分解物）、細胞間脂質、スフィンゴ脂質（セラミド）、ケラチン、加水分解ケラチン、ケラチンアミノ酸、核酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、グアノシン、グアニン、リン酸、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、リン酸リボフラビンナトリウム、リン脂質、レシチンなどの生体系保湿成分、アルブミン（乾燥脱糖卵白）、血清アルブミン、脱脂粉乳、ホエ一（乳清、乳酸菌発酵液）、乳糖、カゼイン、牛乳糖たんぱく、ラクトフェリン、加水分解シルク、シルクアミノ酸、シルク抽出液、シルクパウダー、セリシン、加水分解コンキオリン液（真珠たんぱく描出液）、コンキオリンパウダー、キチン、キトサン、グルコサミン（キトサミン）、ローヤルゼリー、ハチミツ、ブドウ糖（グルコース）、大豆たんぱく質、大豆たんぱく加水分解物、大豆リン脂質（大豆レシチン）、大豆リゾリン脂質（リゾレシチン）、卵黄レシチン（卵黄リン脂質）、納豆エキス（大豆発酵代謝液）、アルファヒドロキシ酸（ＡＨＡ）、グリコール酸、リンゴ酸、海藻エキス、褐藻エキス、含硫ケイ酸アルミニウム（マリンクレイ）、塩化マグネシウム、マリンコラーゲン、酵母エキス、乾燥酵母、プルラン、サルファキニン、トレハロースなど動植物性成分からなる保湿成分があげられる。 In this specification, the humectant is a substance having an effect of providing moisture to a substance or tissue by contacting, penetrating or binding to a certain substance or tissue, or a substance having an effect of retaining moisture. Defined and includes gelling agents and carbohydrates. Specifically, glycerin, xylitol (xylit), diglycerin, dipropylene glycol (DPG), sorbitol (sorbit), sodium DL-pyrrolidonecarboxylate, 3-methyl-1,3-butanediol, 1,3-butylene Polyols such as glycol (1, 3BG), propylene glycol, polyethylene glycol (carbowax), polyglycerol, mixed isomerized sugar, amino acid, L-aspartic acid, sodium L-aspartate, DL-alanine, L- Arginine, L-isoleucine, L-lysine, L-lysine hydrochloride, L-glycine (aminoacetic acid), L-glutamine, L-glutamic acid, sodium L-glutamate, γ-aminobutyric acid (piperidine acid), L- Threonine, L-serine, L-tyrosine, L- Liptophan, L-valine, L-histidine, L-histidine hydrochloride, L-hydroxyproline (L-oxyproline), L-phenylalanine, L-proline, L-leucine, L-cysteine, L-cystine, L- Methionine, DL-pyrrolidonecarboxylic acid (PCA), DL-pyrrolidonecarboxylate sodium solution (PCA soda), lactic acid, sodium lactate (solution), urea, uric acid, acidic mucopolysaccharide, hyaluronic acid, sodium hyaluronate, chondroitin sulfate sodium , Glucuronic acid, collagen, soluble collagen (water-soluble collagen), collagen hydrolyzate (hydrolyzed collagen), hydrolyzed collagen liquid, hydrolyzed collagen powder, hydrolyzed collagen ethyl, hydrolyzed collagen hexadecyl, collagen amino acid, atelocolla Gen, gelatin, hydrolyzed gelatin powder, elastin, water-soluble elastin, hydrolyzed elastin (elastin hydrolyzate), intercellular lipid, sphingolipid (ceramide), keratin, hydrolyzed keratin, keratin amino acid, nucleic acid, deoxyribonucleic acid (DNA) ), Ribonucleic acid (RNA), guanosine, guanine, phosphate, ATP (adenosine triphosphate), phosphoflavin sodium phosphate, phospholipid, lecithin and other biological system moisturizing ingredients, albumin (dried deglycated egg white), serum albumin, Non-fat dry milk, whey (whey, lactic acid bacteria fermentation liquid), lactose, casein, milk sugar protein, lactoferrin, hydrolyzed silk, silk amino acid, silk extract, silk powder, sericin, hydrolyzed conchiolin liquid (pearl protein drawing liquid) , Conchiolin powder, chitin, chitosa , Glucosamine (chitosamine), royal jelly, honey, glucose (glucose), soy protein, soy protein hydrolyzate, soy phospholipid (soy lecithin), soy lysophospholipid (lysolecithin), egg yolk lecithin (yolk phospholipid), natto extract (Soybean fermentation metabolite), alpha hydroxy acid (AHA), glycolic acid, malic acid, seaweed extract, brown algae extract, sulfur-containing aluminum silicate (marine clay), magnesium chloride, marine collagen, yeast extract, dry yeast, pullulan, Moisturizing ingredients composed of animal and plant ingredients such as sulfakinin and trehalose can be mentioned.

本明細書においてゲル化剤は、１０〜９０℃程度で固体から液体への相変化が、その物質自体もしくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質であれば特に制限されない。ゲル化剤は通常その物質自体もしくはその物質と溶媒の混合物において保湿効果を有する。具体的には、ゼラチン、コラーゲン、寒天、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、マンナン、コンニャク、コンニャクマンナン、グルコマンナン、キトサン、キサンタンガム、タマリンド種子多糖類、ジェランガム、カラヤガム、アカシアガム、プルラン、カードラン、キシログルカン、グアーガム、アラビアガム、ローカストビーンガム、カルボキシメチルセルロース多価金属塩、ＤＰＰＣ（Dipalmitoyl phosphatidylcholine）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ε−カプロラクトン）などが挙げられる。ゲル化剤は、単一で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えばゲル化剤がゼラチンであれば、本発明の水性分散液は、０．０５％（Ｗ／Ｖ）以上３．０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは０．５％（Ｗ／Ｖ）以上２．０％（Ｗ／Ｖ）以下、より好ましくは１．０％（Ｗ／Ｖ）以上１．５％（Ｗ／Ｖ）以下のゲル化剤を含む。 In the present specification, the gelling agent is not particularly limited as long as the phase change from solid to liquid at about 10 to 90 ° C. is observed in the substance itself or a mixture of the substance and a solvent. The gelling agent usually has a moisturizing effect on the substance itself or a mixture of the substance and a solvent. Specifically, gelatin, collagen, agar, carrageenan, pectin, alginic acid, sodium alginate, mannan, konjac, konjac mannan, glucomannan, chitosan, xanthan gum, tamarind seed polysaccharide, gellan gum, caraya gum, acacia gum, pullulan, curdlan Xyloglucan, guar gum, gum arabic, locust bean gum, carboxymethyl cellulose polyvalent metal salt, DPPC (Dipalmitoyl phosphatidylcholine), poly (N-isopropylacrylamide), poly (ε-caprolactone) and the like. A single gelling agent may be used, or a plurality of types may be used in combination. For example, if the gelling agent is gelatin, the aqueous dispersion of the present invention is 0.05% (W / V) or more and 3.0% (W / V) or less, preferably 0.5% (W / V). The gelling agent is contained in an amount of 2.0% (W / V) or less, more preferably 1.0% (W / V) or more and 1.5% (W / V) or less.

本明細書において糖質には、単糖、オリゴ糖（二糖、三糖および四糖など）および多糖、ならびにこれらの還元誘導体（糖アルコール、デオキシ糖、グリカール）、アルキル化誘導体（アルキル化糖）、硫酸化誘導体（硫酸化糖）、酸化誘導体（アルドン酸、ウロン酸、アルダル酸など）および脱水誘導体(グリコセエン、アンヒドロ糖など）が包含される。糖質は通常その物質自体もしくはその物質と溶媒の混合物において保湿効果を有する。糖質としては、好ましくは水溶性のものを用いる。また、室温で緩徐に溶媒中に溶解する性質を有するものが好ましい。糖質の具体例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース、フルクトース、キシロース、ソルボースなどの単糖、α,α-トレハロース(トレハロース)、アルキル化トレハロース、硫酸化トレハロース、β,β-トレハロース (イソトレハロース) 、α,β-トレハロース (ネオトレハロース) 、トレハロサミン、コウジビオース、ニゲロース、マルトース、マルチトール、マルツロース、イソマルトース、イソマルツロース(パラチノース)、ソホロース、ラミナラビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、ガラクトスクロース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラクトビオン酸、ラクチトール、ラクツロース、メリビオース、ネオラクトース、プリメベロース、ルチノース、シラビオース、スクラロース、スクロース(サッカロース)、ツラノース、ビシアノース、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロース、リコテトラオース、マルトテトラオース、スタキオース、マルトペンタオース、ベルバスコース、マルトヘキサオース、α-シクロデキストリン(α-ＣＤ)、β-シクロデキストリン(β-ＣＤ)、γ-シクロデキストリン(γ-ＣＤ)、δ-シクロデキストリン(シクロマルトノナオース)などのオリゴ糖およびそれらの誘導体、澱粉加水分解物およびデキストランなどの多糖、ならびにエチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、１，３―ブチレングリコール、エリトリトール、ペンチトール、ヘキシトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの糖アルコールなどが挙げられる。糖質は、単一で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えば糖質がトレハロースであれば、本発明の水性分散液は、０．１％（Ｗ／Ｖ）以上３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは１．０％（Ｗ／Ｖ）以上２５％（Ｗ／Ｖ）以下、より好ましくは５％（Ｗ／Ｖ）以上２０％（Ｗ／Ｖ）以下の糖質を含む。 In this specification, saccharides include monosaccharides, oligosaccharides (such as disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides) and polysaccharides, and reduced derivatives thereof (sugar alcohols, deoxysugars, glycals), alkylated derivatives (alkylated sugars). ), Sulfated derivatives (sulfated sugars), oxidized derivatives (aldonic acid, uronic acid, aldaric acid, etc.) and dehydrated derivatives (glycosene, anhydrosugar, etc.). Carbohydrates usually have a moisturizing effect in the substance itself or in a mixture of the substance and a solvent. As the saccharide, a water-soluble saccharide is preferably used. Moreover, what has the property to melt | dissolve in a solvent slowly at room temperature is preferable. Specific examples of carbohydrates include monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, arabinose, ribose, fructose, xylose, sorbose, α, α-trehalose (trehalose), alkylated trehalose, sulfated trehalose, β, β-trehalose (Isotrehalose), α, β-trehalose (neotrehalose), trehalosamine, kojibiose, nigerose, maltose, maltitol, maltulose, isomaltose, isomaltulose (palatinose), sophorose, laminarabiose, cellobiose, gentiobiose, galactosucrose, lactose , Lactosamine, lactose diamine, lactobionic acid, lactitol, lactulose, melibiose, neolactose, primeverose, lutinose, sylabiose, sclaro , Sucrose (sucrose), turanose, vicyanose, cellotriose, cacotriose, gentianose, isomaltotriose, isopanose, maltotriose, manninotriose, melezitose, panose, planteose, raffinose, soratriose, umbelliferose, lycotetraose , Maltotetraose, stachyose, maltopentaose, verbascose, maltohexaose, α-cyclodextrin (α-CD), β-cyclodextrin (β-CD), γ-cyclodextrin (γ-CD), δ -Oligosaccharides such as cyclodextrin (cyclomaltononaose) and their derivatives, polysaccharides such as starch hydrolysates and dextran, and ethylene glycol, diethylene glycol, polyethylene glycol, dipro Glycol, polypropylene glycol, glycerin, diglycerin, polyglycerin, 1,3-butylene glycol, erythritol, pentitol, hexitol, xylitol, such as sugar alcohols such as sorbitol and mannitol. Carbohydrates may be used alone or in combination of two or more. For example, if the carbohydrate is trehalose, the aqueous dispersion of the present invention has a concentration of 0.1% (W / V) to 30% (W / V), preferably 1.0% (W / V) to 25%. (W / V) or less, More preferably, it contains 5% (W / V) or more and 20% (W / V) or less of carbohydrates.

本発明の水性分散液は、保湿剤の１種、好ましくはゲル化剤と糖質のうちのいずれか１つを含んでいてもよいし、複数のものを含んでいてもよい。本発明において水性分散液は、保湿剤以外の成分、例えば、緩衝剤や界面活性剤などを適宜含んでいてもよい。 The aqueous dispersion of the present invention may contain one kind of humectant, preferably any one of a gelling agent and a saccharide, and may contain a plurality of humectants. In the present invention, the aqueous dispersion may appropriately contain components other than the humectant, such as a buffering agent and a surfactant.

上記水性分散液を担体に塗布する方法は、プローブポリヌクレオチドが固定化された表面の全体に水性分散液を塗布できる方法であれば特に制限されない。例えば、担体を水性分散液に浸漬することにより塗布してもよい。その場合、浸漬した後、担体を遠心処理に付すことにより、水性分散液を担体表面に均一に塗布することができる。水性分散液を担体表面に滴下または噴霧することにより塗布してもよい。 The method for applying the aqueous dispersion to the carrier is not particularly limited as long as the aqueous dispersion can be applied to the entire surface on which the probe polynucleotide is immobilized. For example, the support may be applied by immersing the carrier in an aqueous dispersion. In that case, after the immersion, the aqueous dispersion can be uniformly applied to the surface of the carrier by subjecting the carrier to a centrifugal treatment. The aqueous dispersion may be applied by dropping or spraying on the surface of the carrier.

上記水性分散液を担体に塗布する方法は、プローブポリヌクレオチドが固定化された表面の全体に水性分散液を塗布できる方法で、担体表面に水分を保持させる方法であれば特に制限されない。 The method for applying the aqueous dispersion to the carrier is not particularly limited as long as the aqueous dispersion can be applied to the entire surface on which the probe polynucleotide is immobilized, and the water is retained on the surface of the carrier.

上記水性分散液を塗布した担体についてハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定してポリヌクレオチド試料を分析した後、担体を洗浄することにより、担体を再生すること、すなわちプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたポリヌクレオチドを除去することができる。この洗浄工程における条件は、使用した水性分散液の種類に基づき、適宜設定することができる。通常、水性洗浄液を用いて洗浄を行う。水性洗浄液は、水を主成分とする洗浄液をさし、界面活性剤や緩衝剤などを含んでいてもよい。水性洗浄液として、好ましくは超純水を用いる。具体的には、沸点以下、好ましくは３０℃以上１００℃以下、より好ましくは６０℃以上１００℃以下の水性洗浄液を用いることで洗浄することができる。 The carrier coated with the aqueous dispersion is subjected to measurement of a signal based on hybridization to analyze a polynucleotide sample, and then the carrier is washed to regenerate the carrier, that is, the polynucleotide hybridized to the probe polynucleotide Can be removed. The conditions in this washing step can be set as appropriate based on the type of aqueous dispersion used. Usually, cleaning is performed using an aqueous cleaning solution. The aqueous cleaning liquid refers to a cleaning liquid mainly composed of water, and may contain a surfactant, a buffering agent, or the like. Ultrapure water is preferably used as the aqueous cleaning liquid. Specifically, the cleaning can be performed by using an aqueous cleaning liquid having a boiling point or lower, preferably 30 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, more preferably 60 ° C. or higher and 100 ° C. or lower.

洗浄時間は、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程により、適宜、設定することができる。また、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルは通常、標識に基づくシグナルを測定することをさし、シグナルを測定する工程は、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば特に制限されない。 The washing time can be appropriately set according to the step of measuring a signal based on hybridization. Further, the signal based on hybridization usually means measuring a signal based on a label, and the step of measuring the signal is not particularly limited as long as it can detect hybridization between the probe polynucleotide and the target polynucleotide. .

換言すれば本発明はまた、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法であって、
ａ）担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド試料を接触させてポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）未反応のポリヌクレオチドを除去する工程、
ｃ）保湿剤の少なくとも１種、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を担体に塗布する工程、および
ｄ）ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程
を含む前記方法に関する。ポリヌクレオチド試料を分析する方法においてｃ）の工程を実施することにより、分析後に洗浄することにより担体を容易に再生することができる。 In other words, the present invention also provides a method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized,
a) contacting a polynucleotide sample with a probe polynucleotide immobilized on a carrier to hybridize the target polynucleotide contained in the polynucleotide sample to the probe polynucleotide;
b) removing unreacted polynucleotide;
c) applying an aqueous dispersion containing at least one humectant, preferably at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide, to a carrier; and d) measuring a signal based on hybridization. The method comprising the steps of: By carrying out step c) in the method for analyzing a polynucleotide sample, the carrier can be easily regenerated by washing after the analysis.

プローブポリヌクレオチドを固定化するための担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使用でき、その形状や材料は特に制限されない。例えば、マイクロアレイ等の平板状のもの、ビーズ等の粒子状のもの、および糸状のものが挙げられるが、好ましくはマイクロアレイ等の平板状のものを用いる。材料としては、例えば、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライトおよび感光性ガラス等のガラス材料；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。 As the carrier for immobilizing the probe polynucleotide, those commonly used in the art can be used, and the shape and material are not particularly limited. For example, a flat plate such as a microarray, a particle such as a bead, and a thread may be used, and a flat plate such as a microarray is preferably used. Examples of the material include metals such as gold, silver, copper, aluminum, tungsten, molybdenum, chromium, platinum, titanium, and nickel; alloys such as stainless steel, hastelloy, inconel, monel, and duralumin; and the above metals and ceramics. Laminate; Silicon; Glass material such as glass, quartz glass, fused silica, synthetic quartz, alumina, sapphire, ceramics, forsterite and photosensitive glass; plastic (for example, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile) Butadiene Styrene resin), nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin).

本発明においては、担体として、基板上にポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるための静電層、およびポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を有するものが好ましく用いられる。ここで基板の材料としては、特に制限されないが、上記の材料が挙げられる。基板の形状およびサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。 In the present invention, a carrier having an electrostatic layer for electrostatically attracting a polynucleotide on a substrate and a functional group capable of covalently bonding to the polynucleotide is preferably used. Here, the material of the substrate is not particularly limited, and examples thereof include the above materials. The shape and size of the substrate are not particularly limited, and examples of the shape include a flat plate shape, a thread shape, a spherical shape, a polygonal shape, a powder shape, and the size is usually 0.1 mm in width when a flat plate shape is used. ˜100 mm, length 0.1˜100 mm, thickness 0.01˜10 mm.

基板には、表面処理を施してもよい。表面処理には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。 The substrate may be subjected to a surface treatment. For surface treatment, synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (eg, diamond-like carbon), amorphous carbon, carbon-based material (eg, graphite, fullerene, carbon nanotube), a mixture thereof, or It is preferable to use a laminate of them. Further, carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide may be used. Here, the soft diamond is a generic term for an imperfect diamond structure that is a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC), and the mixing ratio is not particularly limited. The thickness of the surface treatment layer is preferably 1 nm to 100 μm.

表面処理された基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。 As an example of the surface-treated substrate, a substrate obtained by forming a soft diamond film on a slide glass can be given. Such a substrate is preferably prepared by ionized vapor deposition of diamond-like carbon in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of the remaining methane gas.

基板の表面処理層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ(Chemical Vapor Deposit)法、ＥＣＲＣＶＤ(Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit)法、ＩＣＰ(Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ(Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ(Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。 The surface treatment layer of the substrate is formed by a known method, for example, microwave plasma CVD (Chemical Vapor Deposit) method, ECRCVD (Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit) method, ICP (Inductive Coupled Plasma) method, DC sputtering method, ECR (Electric Cyclotron Resonance) A sputtering method, an ion plating method, an arc ion plating method, an EB (Electron Beam) vapor deposition method, a resistance heating vapor deposition method, an ionization vapor deposition method, an arc vapor deposition method, a laser vapor deposition method, or the like.

本発明の担体には、ポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるために静電層が設けられていることが好ましい。静電層としては、ポリヌクレオチドを静電的に引き寄せ、ポリヌクレオチドの固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。 The carrier of the present invention is preferably provided with an electrostatic layer in order to attract the polynucleotide electrostatically. The electrostatic layer is not particularly limited as long as it attracts polynucleotides electrostatically and improves the amount of immobilized polynucleotides. For example, a positively charged compound such as an amino group-containing compound is used. Can be formed.

前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ_２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。 Examples of the amino group-containing compound include an unsubstituted amino group (—NH ₂ ), or a compound having an amino group (—NHR; R is a substituent) monosubstituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, Ethylenediamine, hexamethylenediamine, n-propylamine, monomethylamine, dimethylamine, monoethylamine, diethylamine, allylamine, aminoazobenzene, aminoalcohol (eg, ethanolamine), acrinol, aminobenzoic acid, aminoanthraquinone, amino acid (glycine, alanine) , Valine, leucine, serine, threonine, cysteine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, proline, cystine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, arginine, histidine ), Aniline, or polymers thereof (for example, polyallylamine, polylysine) or copolymers; polyamines (polyvalent amines) such as 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene, spermidine, spermine, and putrescine ).

静電層は、基板または表面処理層と共有結合させずに形成してもよく、基板または表面処理層と共有結合させて形成してもよい。 The electrostatic layer may be formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, or may be formed to be covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer.

静電層を基板または表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。 In the case where the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, for example, when the surface treatment layer is formed, the amino group-containing compound is introduced into the film forming apparatus to thereby form an amino group. A carbon-based film containing is formed. Ammonia gas may be used as the compound introduced into the film forming apparatus. Further, the surface treatment layer may be a multi-layer structure in which a film containing an amino group is formed after the adhesion layer is formed, and in this case, it may be performed in an atmosphere containing ammonia gas.

また、静電層を基板または表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板または表面処理層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物および炭素化合物を蒸着させた後、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。 In the case where the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, the affinity between the electrostatic layer and the substrate or the surface treatment layer, that is, the adhesion is improved on the substrate. It is preferable to introduce a functional group capable of covalently bonding to a polynucleotide after vapor-depositing the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group and a carbon compound. The carbon compound used here is not particularly limited as long as it can be supplied as a gas. For example, methane, ethane, and propane which are gases at normal temperature are preferable. As a method of vapor deposition, ionized vapor deposition is preferable, and as conditions for ionized vapor deposition, it is preferable that an operating pressure is 0.1 to 50 Pa and an acceleration voltage is in a range of 200 to 1000 V.

静電層を基板または表面処理層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板または表面処理層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４''-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。基板表面を塩素化した後、アンモニアガス中でＵＶ照射することにより、アミノ基を導入してもよい。 When the electrostatic layer is formed by covalently bonding to the substrate or the surface treatment layer, for example, the surface of the substrate or the substrate to which the surface treatment layer is applied is chlorinated by irradiating with ultraviolet rays in chlorine gas, and then the amino group. Among the contained compounds, for example, a polyamine such as polyallylamine, polylysine, 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, and triamterene is reacted to form an amino group at the terminal not bonded to the substrate. By introducing, an electrostatic layer can be formed. After chlorination of the substrate surface, amino groups may be introduced by UV irradiation in ammonia gas.

また、静電層が施された基板にポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。 In addition, when a reaction for introducing a functional group capable of covalently bonding to a polynucleotide (for example, introduction of a carboxyl group using a dicarboxylic acid or a polycarboxylic acid) in a solution is performed in a solution, It is preferable to introduce a functional group that can be covalently bonded to the polynucleotide after the substrate is immersed in the solution containing the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group. Examples of the solvent for the solution include water, N-methylpyrrolidone, and ethanol.

静電層が施された基板に、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。 When a carboxyl group is introduced into a substrate on which an electrostatic layer has been applied using dicarboxylic acid or polyvalent carboxylic acid, the substrate is activated with N-hydroxysuccinimide and / or carbodiimide in advance, or the reaction is N -It is preferably carried out in the presence of hydroxysuccinimide and / or carbodiimides.

基板を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、ポリヌクレオチドの固定化量がより向上する。 In the case where an electrostatic layer is formed by immersing the substrate in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, when polyallylamine is used as the amino group-containing compound, the substrate is in close contact with the substrate. And the amount of immobilized polynucleotide is further improved.

静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
前記のようにして、静電層を施した基板表面には、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入するため、化学修飾を施すことが好ましい。 The thickness of the electrostatic layer is preferably 1 nm to 500 μm.
As described above, it is preferable to chemically modify the surface of the substrate on which the electrostatic layer has been applied in order to introduce a functional group that can be covalently bonded to the polynucleotide.

前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。 Examples of the functional group include a carboxyl group, an active ester group, a haloformyl group, a hydroxyl group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, and an amino group.

官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ^１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ^２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^２は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ^３−ＣＯ−Ｒ^４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^３は水素原子または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ^４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^５は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。 As a compound used for introducing a carboxyl group as a functional group, for example, the formula: X—R ¹ —COOH (wherein X is a halogen atom, R ¹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) For example, chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid; formula: HOOC Dicarboxylic acid represented by —R ² —COOH (wherein R ² represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, Fumaric acid, phthalic acid; polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, butanetetracarboxylic acid and other polyvalent carboxylic acids; formula: R ³ —CO—R ⁴ —COOH (formula In which R ³ represents a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, and R ⁴ represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). A monohalide of a dicarboxylic acid represented by: X—OC—R ⁵ —COOH (wherein X represents a halogen atom, R ⁵ represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), for example, Examples include succinic acid monochloride, malonic acid monochloride; acid anhydrides such as phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride, maleic anhydride, and butanetetracarboxylic anhydride.

活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。 The active ester group means an ester group having a highly acidic electron-attracting group on the alcohol side of the ester group and activating a nucleophilic reaction, that is, an ester group having a high reaction activity. Those commonly used in the fields of synthesis, such as polymer chemistry and peptide synthesis.

実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。活性エステル基としては、具体的にはｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられる。 Actually, the ester group has an electron-attracting group on the alcohol side of the ester group and is activated more than the alkyl ester. More specifically, an active ester group in which phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, etc. have much higher activity than alkyl esters etc. Known as. Specific examples of the active ester group include a p-nitrophenyl group, an N-hydroxysuccinimide group, a succinimide group, a phthalimide group, and a 5-norbornene-2,3-dicarboximide group.

例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基は、前記のようにして導入されたカルボキシル基に、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物を反応させることにより生成することができる。 For example, the N-hydroxysuccinimide group is formed by adding a dehydration condensing agent such as cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide) to the carboxyl group introduced as described above. It can be produced by reacting a compound such as N-hydroxysuccinimide.

官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^６は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。 Examples of the compound used for introducing a haloformyl group as a functional group include, for example, the formula: X—OC—R ⁶ —CO—X (wherein X is a halogen atom, R ⁶ is a single bond or a carbon number of 1 to 12). And dicarboxylic acid dihalides such as succinic acid chloride and malonic acid chloride.

官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ^７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸またはフェノール酸が挙げられる。 As a compound used for introducing a hydroxyl group as a functional group, for example, represented by the formula: HO—R ⁷ —COOH (wherein R ⁷ represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). Hydroxy acids or phenolic acids.

官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。 Examples of the compound used for introducing an amino group as a functional group include amino acids.

前記の化合物は、そのカルボキシル基が静電層のアミノ基と縮合してアミド結合を形成する。 In the above compound, the carboxyl group is condensed with the amino group of the electrostatic layer to form an amide bond.

前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。 Among the above-mentioned compounds, polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, and butanetetracarboxylic acid can be used for improving hydrophilicity.

上記の工程において、アミノ基含有化合物による処理、官能基導入処理、活性エステル化処理は、数回繰り返して行うことが好ましい。 In the above step, the treatment with the amino group-containing compound, the functional group introduction treatment, and the active esterification treatment are preferably repeated several times.

プローブポリヌクレオチドを、適当な溶媒に溶解または分散して、担体上にスポッティングすることにより、ポリヌクレオチドを担体に固定化することができる。例えば、プローブポリヌクレオチドを含む溶液を、９６穴または３８４穴等のプラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポット装置等を用いて担体上に滴下してスポッティングを行う。スポット装置としては、ピン方式、インクジェット方式、毛細管によるキャピラリ方式などを利用したスポット装置を用いることができる。 The polynucleotide can be immobilized on the carrier by dissolving or dispersing the probe polynucleotide in an appropriate solvent and spotting the probe on the carrier. For example, a solution containing the probe polynucleotide is dispensed onto a 96-hole or 384-hole plastic plate, and the dispensed solution is dropped on a carrier using a spot device or the like to perform spotting. As the spot device, a spot device using a pin method, an ink jet method, a capillary method using a capillary tube, or the like can be used.

本発明はまた、担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドにポリヌクレオチド試料を接触させ、ポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定することによりポリヌクレオチド試料を分析するためのキットであって、ゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液からなる担体の再生を促進するための試薬を含む前記キットに関する。当該キットは、公知のポリヌクレオチド試料を分析するためのキットに加えて、担体の再生を促進するための試薬を含むことを特徴とする。本発明のキットは、上記担体の再生を促進するための試薬を含むことを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。例えば、ポリヌクレオチドを分解または断片化するための酵素、緩衝液、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質等を含みうる。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアルを組み合せることもできる。 The present invention also includes contacting a polynucleotide sample with a probe polynucleotide immobilized on a carrier, hybridizing a target polynucleotide contained in the polynucleotide sample to the probe polynucleotide, and measuring a signal based on hybridization. A kit for analyzing a polynucleotide sample, comprising: a reagent for promoting regeneration of a carrier comprising an aqueous dispersion containing at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide. . The kit is characterized by containing a reagent for promoting the regeneration of the carrier in addition to a kit for analyzing a known polynucleotide sample. The kit of this invention can be comprised by each element used for the well-known and official kit except including the reagent for promoting the reproduction | regeneration of the said support | carrier. For example, an enzyme for degrading or fragmenting a polynucleotide, a buffer solution, a matrix solvent, a washing buffer, a sample diluent, a reaction stop solution, a standard substance and the like can be included. Further, an instruction manual for explaining the assay method can be combined with the kit of the present invention.

実施例１蛍光ラベル化ｃＤＮＡ（ターゲットポリヌクレオチド）の調製
蛍光ラベル化ｃＤＮＡの調製にはアマシャムバイオサイエンス社製のＣｙＳｃｒｉｂｅＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇＫｉｔを用いた。 Example 1 Preparation of Fluorescent Labeled cDNA (Target Polynucleotide) For preparation of fluorescently labeled cDNA, CyScribe First-Strand cDNA Labeling Kit manufactured by Amersham Biosciences was used.

予め７０℃、４２℃、３７℃のヒートブロック、もしくは恒温器を準備し、ｍＲＮＡ試料および各試薬類を溶かし氷上に準備した。次にｍＲＮＡ試料を含め、以下の系を組んだ。この系は以後のハイブリダイゼーションを３回実施するのに充分な量であった。 A heat block of 70 ° C., 42 ° C., and 37 ° C. or a thermostat was prepared in advance, and the mRNA sample and each reagent were dissolved and prepared on ice. Next, the following system including mRNA samples was assembled. This system was sufficient to carry out subsequent hybridizations three times.

上記反応系を組んだ後、７０℃にて５分間保温し、室温に移し１０分間放置した。この反応液にさらに以下のように試薬を添加し、反応系を組んだ。また以後の操作はできる限り遮光条件下で行なった。 After assembling the above reaction system, the mixture was kept at 70 ° C. for 5 minutes, transferred to room temperature, and left for 10 minutes. Reagents were further added to the reaction solution as described below to form a reaction system. The subsequent operations were performed under light-shielding conditions as much as possible.

上記反応系を組んだ後、４２℃にて９０分間保温し逆転写反応により蛍光ラベル化ｃＤＮＡを合成した。次に２．５ＭＮａＯＨを２μｌ添加し、３７℃で１５分間保温することで未反応ｍＲＮＡを分解した。次に２ＭＨＥＰＥＳを１０μｌ添加することで中和し、蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液を得た。 After assembling the above reaction system, incubation was carried out at 42 ° C. for 90 minutes, and fluorescently labeled cDNA was synthesized by reverse transcription reaction. Next, 2 μl of 2.5 M NaOH was added and incubated at 37 ° C. for 15 minutes to decompose unreacted mRNA. Next, 10 μl of 2M HEPES was neutralized to obtain a fluorescently labeled cDNA solution.

次にアマシャムバイオサイエンス社製のＣｙＳｃｒｉｂｅＧＦＸＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを用いて、蛍光ラベル化ｃＤＮＡを精製した。コレクションチューブにＧＦＸスピンカラムをセットし、ＧＦＸスピンカラム内にＣａｐｔｕｒｅｂｕｆｆｅｒ５００μｌを添加し、蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液をさらに添加し、ピペッティングにより混和した。１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心し、コレクションチューブ内の濾液を廃棄した。同じコレクションチューブにＧＦＸスピンカラムを再度セットし、Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ６００μｌを添加した。１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心し、コレクションチューブ内の濾液を廃棄した。上記洗浄過程をさらに２回繰り返した。同じコレクションチューブにＧＦＸスピンカラムを再度セットし、１３，０００ｒｐｍにて１０秒間遠心し、カラムに付着したＷａｓｈｂｕｆｆｅｒを完全に除去した。新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブにＧＦＸスピンカラムをセットし、予め６５℃に保温しておいたＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ２２μｌをフィルターの中央部に添加し、１０分間放置した。１３，０００ｒｐｍにて１分間遠心し、マイクロチューブ内に濾液を回収した。上記溶出過程をさらに２回繰り返し、同じマイクロチューブ内に回収した。上記操作により合計６６μｌの蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液を得た。得られた蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液を２２μｌずつ新しいマイクロチューブに分注し、スピードバック等で乾固し、−２０℃、暗所にて保存した。 Next, the fluorescence-labeled cDNA was purified using a Cyscribe GFX Purification Kit manufactured by Amersham Biosciences. A GFX spin column was set in the collection tube, 500 μl of Capture buffer was added to the GFX spin column, a fluorescence labeled cDNA solution was further added, and mixed by pipetting. Centrifugation was performed at 13,000 rpm for 30 seconds, and the filtrate in the collection tube was discarded. The GFX spin column was set again in the same collection tube, and 600 μl of Wash buffer was added. Centrifugation was performed at 13,000 rpm for 30 seconds, and the filtrate in the collection tube was discarded. The washing process was repeated twice more. The GFX spin column was set again in the same collection tube, and centrifuged at 13,000 rpm for 10 seconds to completely remove the wash buffer attached to the column. A GFX spin column was set in a new 1.5 ml microtube, and 22 μl of Elution buffer that had been kept at 65 ° C. in advance was added to the center of the filter and left for 10 minutes. Centrifugation was performed at 13,000 rpm for 1 minute, and the filtrate was recovered in the microtube. The elution process was repeated twice more and collected in the same microtube. A total of 66 μl of fluorescence labeled cDNA solution was obtained by the above operation. The obtained fluorescently labeled cDNA solution was dispensed in 22 μl aliquots into new microtubes, dried to dryness with a speed bag and stored at −20 ° C. in the dark.

実施例２マイクロアレイ（プローブポリヌクレオチド固定化担体）の製造
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスを、ポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に浸漬することにより、静電層を形成した。その後、静電層のアミノ基に、多価カルボン酸としてのポリアクリル酸を、０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドの存在下で縮合した。そして、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩と２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化することにより、ガラス基板の表面に静電層およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有する担体を製造した。 Example 2 Production of Microarray (Probe Polynucleotide Immobilization Carrier) By immersing a slide glass of 25 mm (width) × 75 mm (length) × 1 mm (thickness) in a polyallylamine aqueous solution (0.1 g / l), An electrostatic layer was formed. Thereafter, polyacrylic acid as a polyvalent carboxylic acid was condensed to the amino group of the electrostatic layer in the presence of 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide. Then, an activation solution in which 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide hydrochloride and 20 mM N-hydroxysuccinimide were dissolved in 300 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6). A carrier having an electrostatic layer and an N-hydroxysuccinimide group on the surface of the glass substrate was produced by activating by dipping in the substrate for 30 minutes.

得られた担体に、上記で得られた蛍光ラベル化ｃＤＮＡに対応するプローブポリヌクレオチドをそれぞれスポッティングすることにより、担体上にプローブポリヌクレオチドが固定化されたマイクロアレイを得た。 A probe polynucleotide corresponding to the fluorescence-labeled cDNA obtained above was spotted on the obtained carrier to obtain a microarray in which the probe polynucleotide was immobilized on the carrier.

実施例３ゼラチンを用いた再生方法
（１）マイクロアレイの前処理
実施例２で製造したマイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し、室温で１５分放置した。その後、マイクロアレイをあらかじめ９０℃に加温しておいた２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し５分間加熱後、超純水でリンスし、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。 Example 3 reproducing method using gelatin (1) was immersed preprocess the microarray prepared in Example 2 in 2 × SSC / 0.2% SDS microarray, and left at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the microarray was immersed in 2 × SSC / 0.2% SDS that had been heated to 90 ° C. in advance, heated for 5 minutes, rinsed with ultrapure water, centrifuged at 300 rpm for 3 minutes, and the moisture on the surface of the macroarray. Was removed.

（２）ハイブリダイゼーション
乾固した蛍光ラベル化ｃＤＮＡに１８μｌの５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳの溶液を加えハイブリダイゼーション溶液を調製した。前処理を施したマイクロアレイをハイブリダイゼーションカセット（ＡｒｒａｙＩｔ）にセットし、スポット位置に合うように２４×２４ｍｍのギャップ付きカバーグラスを載せ、ハイブリダイゼーション溶液を毛管現象により流し込んだ。カセット内の窪みに各々３０μｌの精製水とガラス上のカバーグラスと離れた位置２点に各々５μｌの３×ＳＳＣを滴下しハイブリダイゼーション中の乾燥を防いだ。６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行った。 (2) Hybridization 18 μl of 5 × SSC / 0.5% SDS solution was added to the dried fluorescently labeled cDNA to prepare a hybridization solution. The pretreated microarray was set in a hybridization cassette (ArrayIt), a cover glass with a gap of 24 × 24 mm was placed so as to match the spot position, and the hybridization solution was poured by capillary action. 30 μl each of purified water and 5 μl of 3 × SSC were dropped at two points away from the cover glass on the glass in the recesses in the cassette to prevent drying during hybridization. Hybridization was performed at 60 ° C. for 16 hours.

（３）洗浄（未反応のポリヌクレオチドの除去）
マイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬してカバーグラスを洗い落とし、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１５分間洗浄した。これを２×ＳＳＣで洗浄し、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。コントロール実験は、この段階で下記（５）と同様に蛍光強度を測定した（図１ａ）。 (3) Washing (removal of unreacted polynucleotide)
The microarray was immersed in 2 × SSC / 0.2% SDS to wash the cover glass, and washed with 2 × SSC / 0.2% SDS for 15 minutes. This was washed with 2 × SSC and centrifuged at 300 rpm for 3 minutes to remove moisture on the surface of the macroarray. In the control experiment, the fluorescence intensity was measured at this stage in the same manner as (5) below (FIG. 1a).

（４）ゼラチンコーティング
このマイクロアレイをあらかじめ５０〜６０℃に加温して溶解しておいた０．２×ＳＳＣ／１ｍＭＥＤＴＡ／１．５％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンに浸漬し、ただちに３００ｒｐｍにて３分間遠心を行い、室温で遮光して放置し、ゼラチンをゲル化した。ゼラチンは、新田ゼラチン（株）社製「ゼラチン２１」を使用した。 (4) Gelatin coating This microarray was immersed in 0.2 × SSC / 1 mM EDTA / 1.5% (W / V) gelatin previously heated to 50 to 60 ° C. and immediately dissolved at 300 rpm. Centrifugation was carried out for 3 minutes, and the mixture was allowed to stand at room temperature in the dark to gelatinize the gelatin. As gelatin, “Gelatin 21” manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd. was used.

（５）蛍光の測定および蛍光強度の数値化
このマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの蛍光をマイクロアレイスキャナーＧｅｎｅＴＡＣＵＣ−４（ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）で測定した。蛍光強度の数値化は、ＳｃａｎＡｌｙｚｅｖｅｒ．２．５を使用した（図１ｂ）。 (5) Measurement of fluorescence and quantification of fluorescence intensity The fluorescence of the fluorescence-labeled cDNA hybridized to the spot on the microarray was measured with a microarray scanner GeneTAC UC-4 (manufactured by Genomic Solutions). Quantification of fluorescence intensity was performed using ScanAlyze ver. 2.5 was used (FIG. 1b).

（６）担体の再生
５０ｍＬ容のファルコンチューブに入れた超純水（約５０ｍＬ）を沸騰湯浴上で加熱したものをあらかじめ準備した。蛍光強度を測定したマイクロアレイをこの沸騰湯浴上で加熱しておいた超純水に浸漬し、１５分間洗浄した。この操作を計４回繰り返してマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡを除去した。すなわち、超純水による加熱洗浄過程は、累計６０分実施した。その後、マイクロアレイを３００ｒｐｍにて３分間遠心し、マクロアレイ表面の水分を除去し、（５）と同様に蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図２）。 (6) Regeneration of carrier A solution prepared by heating ultrapure water (about 50 mL) in a 50 mL Falcon tube on a boiling water bath was prepared in advance. The microarray whose fluorescence intensity was measured was immersed in ultrapure water heated on the boiling water bath and washed for 15 minutes. This operation was repeated a total of 4 times to remove the fluorescently labeled cDNA hybridized to the spot on the microarray. That is, the heat cleaning process with ultrapure water was performed for a total of 60 minutes. Thereafter, the microarray was centrifuged at 300 rpm for 3 minutes to remove moisture on the surface of the macroarray, and fluorescence was measured with a microarray scanner in the same manner as in (5) (FIG. 2).

８つのスポット、すなわちグリッド１のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5、ならびにグリッド２のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5（図７参照）について、ゼラチンコーティングを行った場合および行わなかった場合（コントロール）で、１回目のハイブリダイゼーションおよび１回目の再生後の蛍光強度を測定した結果を以下の表３および図１ｃに示す。 Eight spots: ROW4 COL6, ROW4 COL7, ROW5 COL4, ROW5 COL5 on grid 1 and ROW4 COL6, ROW4 COL7, ROW5 COL4, ROW5 COL5 (see Figure 7) on grid 2 and when applied The results of measuring the fluorescence intensity after the first hybridization and the first regeneration in the absence (control) are shown in Table 3 and FIG. 1c below.

（７）ゼラチンコーティングを行ったマイクロアレイについて、上記（１）〜（３）の工程を繰り返し、再生後の２回目のハイブリダイゼーションを行い、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図３ａ）。再度担体の再生（６）を実施し、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図３ｂ）。 (7) The steps (1) to (3) were repeated for the gelatin-coated microarray, the second hybridization after the regeneration was performed, and the fluorescence was measured with a microarray scanner (FIG. 3a). The carrier was again regenerated (6) and fluorescence was measured with a microarray scanner (FIG. 3b).

結果：
（６）の再生工程の後、ゼラチンコーティングを行わなかった担体についてはハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの残存がみられるのに対し（図２ａ）、ゼラチンコーティングを行った担体については、ハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡがほぼ完全に除去されたことがわかる（図２ｂ）。さらに、再生工程の後、蛍光ラベル化ｃＤＮＡが、担体上のプローブポリヌクレオチドに再度ハイブリダイズすること（図３ａ）、さらに再度再生できることも示された（図３ｂ）。従って、本発明により、プローブポリヌクレオチド固定化担体を再生し、再利用できることが示された。 result:
After the regeneration step of (6), hybridized fluorescently labeled cDNA remains in the carrier that was not gelatin-coated (FIG. 2a), whereas the carrier that was gelatin-coated was hybridized. It can be seen that the fluorescently labeled cDNA was almost completely removed (FIG. 2b). Furthermore, it was shown that after the regeneration step, the fluorescently labeled cDNA rehybridizes to the probe polynucleotide on the carrier (FIG. 3a) and can be regenerated again (FIG. 3b). Therefore, according to the present invention, it was shown that the probe polynucleotide-immobilized carrier can be regenerated and reused.

実施例４トレハロースを用いた再生方法
（１）マイクロアレイの前処理
実施例２で製造したマイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し、室温で１５分放置した。その後、マイクロアレイをあらかじめ９０℃に加温しておいた２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し５分間加熱後、超純水でリンスし、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。 Example 4 Regeneration Method Using Trehalose (1) Pretreatment of Microarray The microarray produced in Example 2 was immersed in 2 × SSC / 0.2% SDS and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the microarray was immersed in 2 × SSC / 0.2% SDS that had been heated to 90 ° C. in advance, heated for 5 minutes, rinsed with ultrapure water, centrifuged at 300 rpm for 3 minutes, and the moisture on the surface of the macroarray. Was removed.

（３）洗浄（未反応のポリヌクレオチドの除去）
マイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬してカバーグラスを洗い落とし、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１５分間洗浄した。これを２×ＳＳＣで洗浄し、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。コントロール実験は、この段階で下記（５）と同様に蛍光強度を測定した（図４ａ）。 (3) Washing (removal of unreacted polynucleotide)
The microarray was immersed in 2 × SSC / 0.2% SDS to wash the cover glass, and washed with 2 × SSC / 0.2% SDS for 15 minutes. This was washed with 2 × SSC and centrifuged at 300 rpm for 3 minutes to remove moisture on the surface of the macroarray. In the control experiment, the fluorescence intensity was measured at this stage in the same manner as (5) below (FIG. 4a).

（４）トレハロースコーティング
このマイクロアレイを２×ＳＳＣ／２０％（Ｗ／Ｖ）トレハロース溶液に浸漬し、ただちに３００ｒｐｍにて３分間遠心を行い、室温で遮光して放置した。トレハロースは、Ｓｉｇｍａ社製Ｄ−（＋）−Ｔｒｅｈａｌｏｓｅｄｅｈｙｄｒａｔｅ（Ｔ９５３１）：α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドを使用した。 (4) Trehalose coating This microarray was immersed in a 2 × SSC / 20% (W / V) trehalose solution, immediately centrifuged at 300 rpm for 3 minutes, and allowed to stand at room temperature, protected from light. As trehalose, Sigma D-(+)-Trehalose dehydrate (T9531): α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside was used.

（５）蛍光の測定および蛍光強度の数値化
このマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの蛍光をマイクロアレイスキャナーＧｅｎｅＴＡＣＵＣ−４（ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）で測定した。蛍光強度の数値化は、ＳｃａｎＡｌｙｚｅｖｅｒ．２．５を使用した（図４ｂ）。 (5) Measurement of fluorescence and quantification of fluorescence intensity The fluorescence of the fluorescence-labeled cDNA hybridized to the spot on the microarray was measured with a microarray scanner GeneTAC UC-4 (manufactured by Genomic Solutions). Quantification of fluorescence intensity was performed using ScanAlyze ver. 2.5 was used (Figure 4b).

（６）担体の再生
５０ｍＬ容のファルコンチューブに入れた超純水（約５０ｍＬ）を沸騰湯浴上で加熱したものをあらかじめ準備した。蛍光強度を測定したマイクロアレイをこの沸騰湯浴上で加熱しておいた超純水に浸漬し、１５分間洗浄した。この操作を計４回繰り返してマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡを除去した。すなわち、超純水による加熱洗浄過程は、累計６０分実施した。その後、マイクロアレイを３００ｒｐｍにて３分間遠心し、マイクロアレイ表面の水分を除去し、（５）と同様に蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図５）。 (6) Regeneration of carrier A solution prepared by heating ultrapure water (about 50 mL) in a 50 mL Falcon tube on a boiling water bath was prepared in advance. The microarray whose fluorescence intensity was measured was immersed in ultrapure water heated on the boiling water bath and washed for 15 minutes. This operation was repeated a total of 4 times to remove the fluorescently labeled cDNA hybridized to the spot on the microarray. That is, the heat cleaning process with ultrapure water was performed for a total of 60 minutes. Thereafter, the microarray was centrifuged at 300 rpm for 3 minutes to remove moisture on the microarray surface, and fluorescence was measured with a microarray scanner in the same manner as in (5) (FIG. 5).

赤線で囲った８つのスポット、すなわちグリッド１のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5、ならびにグリッド２のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5、（図７参照）について、トレハロースコーティングを行った場合および行わなかった場合（コントロール）で、１回目のハイブリダイゼーションおよび１回目の再生後の蛍光強度を測定した結果を以下の表４および図４ｃに示す。 Trehalose coating for 8 spots surrounded by red line, namely ROW4 COL6, ROW4 COL7, ROW5 COL4, ROW5 COL5 on grid 1 and ROW4 COL6, ROW4 COL7, ROW5 COL4, ROW5 COL5 on grid 2 (see Figure 7) Table 4 and FIG. 4c below show the results of measurement of the fluorescence intensity after the first hybridization and the first regeneration in the case where the measurement was performed and the case where the control was not performed (control).

（７）トレハロースコーティングを行ったマイクロアレイについて、上記（１）〜（５）の工程を繰り返し、再生後の２回目のハイブリダイゼーションを行い、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図６ａ）。再度担体の再生（６）を実施し（２回目の再生においては１５分間の洗浄を１回のみ実施した）、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図６ｂ）。 (7) For the microarray coated with trehalose, the above steps (1) to (5) were repeated, the second hybridization after regeneration was performed, and the fluorescence was measured with a microarray scanner (FIG. 6a). The carrier was regenerated (6) again (in the second regeneration, washing was performed only once for 15 minutes), and fluorescence was measured with a microarray scanner (FIG. 6b).

結果：
（６）の再生工程の後、トレハロースコーティングを行わなかった担体についてはハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの残存がみられるのに対し（図５ａ）、トレハロースコーティングを行った担体については、ハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡがほぼ完全に除去されたことがわかる（図５ｂ）。さらに、再生工程の後、蛍光ラベル化ｃＤＮＡが、担体上のプローブポリヌクレオチドに再度ハイブリダイズすること（図６ａ）、さらに再度再生できること（図６ｂ）も示された。従って、本発明により、プローブポリヌクレオチド固定化担体を再生し、再利用できることが示された。 result:
After the regeneration step of (6), the carrier that was not subjected to trehalose coating was left with hybridized fluorescently labeled cDNA (FIG. 5a), whereas the carrier that was coated with trehalose was hybridized. It can be seen that the fluorescently labeled cDNA was almost completely removed (FIG. 5b). Furthermore, it was shown that after the regeneration step, the fluorescently labeled cDNA re-hybridizes to the probe polynucleotide on the carrier (Fig. 6a) and can be regenerated again (Fig. 6b). Therefore, according to the present invention, it was shown that the probe polynucleotide-immobilized carrier can be regenerated and reused.

ゼラチンコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目のハイブリダイゼーション後に測定した蛍光画像を示す。また、蛍光強度の測定結果を示す（ｃ）。The fluorescence image measured after the 1st hybridization about the support | carrier (b) with which gelatin coating was performed, and the support | carrier (a) which was not performed is shown. Moreover, the measurement result of fluorescence intensity is shown (c). ゼラチンコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目の再生処理後に測定した蛍光画像を示す。The fluorescence image measured after the 1st reproduction | regeneration processing about the support | carrier (b) with which gelatin coating was performed, and the support | carrier (a) which was not performed is shown. ゼラチンコーティングを行った担体について、２回目のハイブリダイゼーション後（ａ）および２回目の再生処理後（ｂ）に測定した蛍光画像を示す。The fluorescence images measured for the gelatin-coated carrier after the second hybridization (a) and after the second regeneration treatment (b) are shown. トレハロースコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目のハイブリダイゼーション後に測定した蛍光画像を示す。また、蛍光強度の測定結果を示す（ｃ）。The fluorescence image measured after the 1st hybridization about the support | carrier (b) with which the trehalose coating was performed, and the support | carrier (a) which was not performed is shown. Moreover, the measurement result of fluorescence intensity is shown (c). トレハロースコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目の再生処理後に測定した蛍光画像を示す。The fluorescence image measured after the 1st reproduction | regeneration processing is shown about the support | carrier (b) with which the trehalose coating was performed, and the support | carrier (a) which was not performed. トレハロースコーティングを行った担体について、２回目のハイブリダイゼーション後（ａ）および２回目の再生処理後（ｂ）に測定した蛍光画像を示す。The fluorescence images measured after the second hybridization (a) and after the second regeneration treatment (b) for the carrier coated with trehalose are shown. プローブポリヌクレオチドを固定化した担体におけるスポット位置を示す。グリッド１とグリッド２のスポット位置は同じである。なお、グリッド１および２とも、ROW1 COL6およびROW1 COL7は、Cy3オリゴヌクレオチドを固定化した対照スポットである。The spot position on the carrier on which the probe polynucleotide is immobilized is shown. The spot positions of grid 1 and grid 2 are the same. In both grids 1 and 2, ROW1 COL6 and ROW1 COL7 are control spots on which Cy3 oligonucleotides are immobilized.

Claims

A method for regenerating a carrier in a method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized,
The method comprising: applying an aqueous dispersion containing a humectant to a carrier in which a target polynucleotide is hybridized to a probe polynucleotide; and washing the carrier.

The method according to claim 1, wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.

A method for removing a target polynucleotide hybridized to a probe polynucleotide immobilized on a carrier, comprising:
The method comprising: applying an aqueous dispersion containing a humectant to a carrier in which a target polynucleotide is hybridized to a probe polynucleotide; and washing the carrier.

The method according to claim 3, wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.

A method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, comprising:
a) contacting a polynucleotide sample with a probe polynucleotide immobilized on a carrier to hybridize the target polynucleotide contained in the polynucleotide sample to the probe polynucleotide;
b) removing unreacted polynucleotide;
c) applying an aqueous dispersion containing a humectant to a carrier; and d) measuring a signal based on hybridization.

The method according to claim 5, wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.

A method for regenerating a carrier by washing the carrier after the step d) according to claim 5 or 6.

A reagent for promoting regeneration of a carrier in a method for analyzing a polynucleotide sample using a carrier on which a probe polynucleotide is immobilized, the reagent comprising an aqueous dispersion containing a humectant.

The reagent according to claim 8, wherein the humectant is at least one selected from the group consisting of a gelling agent and a saccharide.

A polynucleotide sample is analyzed by contacting a polynucleotide sample with a probe polynucleotide immobilized on a carrier, hybridizing a target polynucleotide contained in the polynucleotide sample to the probe polynucleotide, and measuring a signal based on hybridization. It is a kit for carrying out, Comprising: The said kit containing the reagent of Claim 8 or 9.