JP2007282598A - Sexual differentiation disorder diagnostic marker - Google Patents
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Abstract
【課題】性分化異常症を診断できるマーカー、及びそのマーカーを検出するための性分化異常症診断用キットを提供すること。
【解決手段】性分化異常症の診断マーカーをCXorf6遺伝子関連物質とする。例えば、野生型CXorf6ペプチド、CXorf6遺伝子の下流遺伝子（Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、Hes7遺伝子）の転写を活性化する機能を欠損しているポリペプチド、ヒトCXorf6において少なくとも第653番目のアミノ酸残基よりC末端側のペプチド領域を欠損しているペプチド、又はこれらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはそれらの相補鎖は、尿道下裂を主とする性分化異常症を診断するマーカーとして有用である。性分化異常症診断用キットは、上記のマーカーを検出するためのプローブ、プライマー、抗体等を含むキットとする。
【選択図】図１Disclosed are a marker capable of diagnosing sexual differentiation disorder and a kit for diagnosing sexual differentiation disorder for detecting the marker.
A diagnostic marker for sexual differentiation disorder is a CXorf6 gene-related substance. For example, a wild-type CXorf6 peptide, a polypeptide lacking the function of activating transcription of the downstream gene of the CXorf6 gene (Hes1, Hes5, and Hes7 genes), and at least the 653rd amino acid residue C in human CXorf6 Peptides lacking the terminal peptide region, or mRNAs, cDNAs or their complementary strands encoding these polypeptides are useful as markers for diagnosing sexual differentiation abnormalities mainly due to hypospadias. The kit for diagnosing sexual differentiation disorder is a kit containing a probe, a primer, an antibody and the like for detecting the above marker.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、性分化異常症における診断マーカーに関する。 The present invention relates to a diagnostic marker for abnormal sexual differentiation.
性分化は、個人の性的表現型の発現を規定する遺伝的プログラムによる、時間的・空間的に厳密な制御の下で進行する。その結果、性腺形成、性管・外性器形成、二次性徴出現、配偶子形成等の性的表現型が生じる。この性分化の過程は、
（１）性腺形成と外性器分化において、発生初期に両性に共通する原器が形成され、その後、遺伝的性に従って、異なる性腺や外性器に分化すること。
（２）性管形成において、発生初期に両性の器官が形成され、その後、遺伝的性に一致する性管のみが発達すること。
（３）生殖細胞という、次世代に引き継がれる唯一の細胞が発生すること。
によって、特徴づけられる。この遺伝的プログラムの進行過程のどこかに問題が生じると、性分化異常症が発症する。
Sexual differentiation proceeds under strict temporal and spatial control by a genetic program that regulates the expression of an individual's sexual phenotype. As a result, sexual phenotypes such as gonadal formation, genital duct / external genital formation, secondary sexual characteristics appear, gamete formation occur. This sexual differentiation process
(1) In gonadal formation and external genital differentiation, a common genital organ is formed in the early stages of development and then differentiated into different gonads and external genitals according to genetic sex.
(2) In sex tube formation, bisexual organs are formed in the early stage of development, and then only the sex tube that matches the genetic sex develops.
(3) The generation of the only cells that are inherited by the next generation, called germ cells.
It is characterized by. If a problem occurs somewhere in the course of this genetic program, sexual differentiation disorder develops.
性分化異常症の中でも、臨床的には、男児における外陰部異常症に遭遇することが多い。これまで、患者における遺伝子解析や実験動物を用いた研究から、男児における外陰部異常症に関与する遺伝子が多数同定されてきた。これらの遺伝子の異常は、胎児精巣形成不全（未分化性腺形成障害及び胎児精巣分化障害に大別される）、男性ホルモン産生障害（コレステロール合成障害及びステロイドホルモン合成酵素障害に大別される）、男性ホルモン効果障害、外陰部原器形成不全のいずれかを介して、外陰部異常症を招くことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、それらの疾病を引き起こす遺伝子型は知られていなかった。
特定の遺伝子型と疾病の発症を関連付けることができれば、正確な診断名を付けたり、病気の発症を予見したりすることができるようになり、その結果、患者に対して、例えば遺伝相談や治療方法等のフォローアップを行うことが可能になる。 If a specific genotype can be associated with the onset of the disease, it will be possible to give an accurate diagnosis name and foresee the onset of the disease. It is possible to follow up on methods.
そこで、本発明は、性分化異常症を診断できるマーカー、及びそのマーカーを検出するための性分化異常症診断用キットを提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a marker capable of diagnosing sexual differentiation disorder and a kit for diagnosing sexual differentiation disorder for detecting the marker.
発明者らは、種々の性分化異常症患者（男性化障害や染色体46,XY核型を有する患者等）166例（特発性症例152例、家族性症例（発端者）14例）を対象として、Ｘ染色体長腕末端に存在するヒトCXorf6遺伝子の変異を解析した。なお、この166人の患者のうち、尿道下裂を有する日本人患者は56例（重症例22例）であった。すると、尿道下裂の表現型を示す日本人患者3家系4例において、ヒトCXorf6遺伝子にナンセンス変異が認められ、欠失ポリペプチドが生じていた。このことから、上記患者における尿道下裂の原因遺伝子がCXorf6遺伝子であることが示唆された。 The inventors targeted 166 patients with various sexual differentiation disorders (patients with masculinization disorder, chromosome 46, XY karyotype, etc.) (152 idiopathic cases, 14 familial cases (probands)) The mutation of the human CXorf6 gene present at the end of the long arm of the X chromosome was analyzed. Of the 166 patients, there were 56 Japanese patients (22 severe cases) with hypospadias. Then, nonsense mutations were found in the human CXorf6 gene in 4 Japanese family 3 families with hypospadias phenotype, resulting in deletion polypeptides. This suggested that the causative gene of hypospadias in the patient was the CXorf6 gene.
これらの患者においては、アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ：androgen receptor）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）には変異が検出されなかった。また、マウスCXorf6遺伝子の発現を調べたところ、胎児の精巣で発現しており、これらの事実は、尿道下裂の原因遺伝子がCXorf6遺伝子であることを強く支持する。こうして、発明者らは、本発明を完成するに至った。 In these patients, no mutation was detected in the androgen receptor gene (AR) and the 5α-reductase gene (SRD5A2). Moreover, when the expression of the mouse CXorf6 gene was examined, it was expressed in the testes of the fetus, and these facts strongly support that the causative gene of hypospadias is the CXorf6 gene. Thus, the inventors have completed the present invention.
本発明にかかるCXorf6ポリペプチドは、CXorf6遺伝子の下流遺伝子の転写を活性化する機能を欠損していることを特徴とする。ここで、前記CXorf6遺伝子は、例えば、ヒト由来の遺伝子であってもよい。また、前記下流遺伝子は、例えば、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子であることが好ましい。また、前記CXorf6ポリペプチドは、少なくとも第６５３番目以降のアミノ酸残基を欠失していることが好ましい。 The CXorf6 polypeptide according to the present invention is characterized by lacking a function of activating transcription of a downstream gene of the CXorf6 gene. Here, the CXorf6 gene may be, for example, a human-derived gene. The downstream gene is preferably, for example, a Hes1 gene, a Hes5 gene, or a Hes7 gene. The CXorf6 polypeptide preferably lacks at least the 653rd and subsequent amino acid residues.
また、本発明にかかるポリペプチドは、ヒトCXorf6において、少なくとも第６５３番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損していることを特徴とする。ここで、前記機能は、ヒトCXorf6遺伝子の下流に存在する下流遺伝子の転写活性化であることが好ましい。また、前記下流遺伝子は、例えば、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子であることが好ましい。 The polypeptide according to the present invention is characterized in that the function of the peptide region on the C-terminal side of at least the 653rd amino acid residue is missing in human CXorf6. Here, the function is preferably transcriptional activation of a downstream gene existing downstream of the human CXorf6 gene. The downstream gene is preferably, for example, a Hes1 gene, a Hes5 gene, or a Hes7 gene.
さらに、本発明にかかる核酸は、前記いずれかに記載のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡであることを特徴とする。 Furthermore, the nucleic acid according to the present invention is genomic DNA, mRNA or cDNA encoding any of the polypeptides described above.
また、本発明にかかる遺伝子マーカーは、性分化異常症の指標となる遺伝子マーカーであって、前記遺伝子マーカーが、CXorf6遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。 The gene marker according to the present invention is a gene marker that serves as an index of sexual differentiation disorder, wherein the gene marker is a gene-related substance related to the CXorf6 gene. The sexual differentiation disorder may be hypospadias.
さらに、本発明にかかる診断用キットは、性分化異常症を診断するための診断用キットであって、前記遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含むことを特徴とする。ここで、前記塩基配列決定用プライマーは、前記いずれかに記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定することができるプライマーであってもよい。また、前記ＰＣＲ用プライマーは、CXorf6のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの一部又は全部を増幅することができるプライマーであってもよい。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。 Furthermore, the diagnostic kit according to the present invention is a diagnostic kit for diagnosing sexual differentiation disorder, which is a hybridization probe, a base sequence determination primer, and a PCR primer capable of detecting the gene marker. A pair or specific antibody is included. Here, the primer for determining a base sequence may be a primer capable of determining the base sequence of cDNA encoding any of the polypeptides described above. The PCR primer may be a primer capable of amplifying a part or all of cDNA encoding the amino acid sequence of CXorf6. The sexual differentiation disorder may be hypospadias.
また、本発明にかかる遺伝子マーカーは、CXorf6ポリペプチドの機能を評価するための遺伝子マーカーであって、前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする。 The gene marker according to the present invention is a gene marker for evaluating the function of a CXorf6 polypeptide, and the gene marker is related to a gene of any one of the Hes1 gene, the Hes5 gene, and the Hes7 gene. It is a substance.
さらに、本発明にかかる遺伝子マーカーは、性分化異常症の指標となる遺伝子マーカーであって、前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。 Furthermore, the gene marker according to the present invention is a gene marker that serves as an index of sexual differentiation disorder, and the gene marker is a gene-related substance that is related to any one of the Hes1 gene, the Hes5 gene, and the Hes7 gene. It is characterized by being. The sexual differentiation disorder may be hypospadias.
また、本発明にかかる診断用キットは、性分化異常症を診断するための診断用キットであって、前記遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含んでいてもよい。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。 The diagnostic kit according to the present invention is a diagnostic kit for diagnosing sexual differentiation disorder, which is a hybridization probe, a base sequence determination primer, and a PCR primer capable of detecting the gene marker. Pairs or specific antibodies may be included. The sexual differentiation disorder may be hypospadias.
なお、本発明において「CXorf6遺伝子」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするヒト由来の遺伝子及びそのホモログ（homolog）やオーソログ（ortholog）をいう。「CXorf6」とは、上記「CXorf6遺伝子」がコードするポリペプチドを意味し、例えば、「ヒトCXorf6」とは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト由来のポリペプチドを言うが、野生型と同じ機能を持っているのであれば、遺伝的多型による変異を含んでいてもかまわない。 In the present invention, the “CXorf6 gene” refers to a human-derived gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and homologs and orthologs thereof. “CXorf6” means a polypeptide encoded by the above “CXorf6 gene”. For example, “human CXorf6” means a human-derived polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is the same as the wild type. As long as it has a function, it may contain a mutation caused by genetic polymorphism.
また、本発明において「遺伝子マーカー」は、ある対象物の状態又は作用の評価の指標となる検出対象物質であって、ここではある遺伝子の発現過程に関連する遺伝子関連物質をいう。「遺伝子関連物質」とは、遺伝子それ自体、又はその遺伝子に関わる物質であり、例えば、CXorf6遺伝子を含むゲノムＤＮＡ、転写物であるｈｎＲＮＡやｍＲＮＡ、その逆転写物であるｃＤＮＡ、翻訳物であるペプチド、遺伝子発現の最終産物であるタンパク質及びそれらの一部等が含まれる。 Further, in the present invention, the “gene marker” is a detection target substance that serves as an index for evaluating the state or action of a certain object, and here refers to a gene-related substance related to the expression process of a certain gene. “Gene-related substance” is a gene itself or a substance related to the gene, for example, genomic DNA including CXorf6 gene, transcript hnRNA or mRNA, reverse transcript cDNA or translation. Peptides, proteins that are the final product of gene expression, and parts thereof are included.
また、本発明において「性分化異常症」とは、男性又は女性における性腺、性管又は外性器形成過程のどこかに障害が生じた疾患をいい、例えば、尿道下裂等の外陰部異常症、性腺形成障害、真性半陰陽、仮性半陰陽等をいう。 Further, in the present invention, “sexual differentiation disorder” refers to a disease in which a disorder occurs somewhere in the gonad, genital tract, or external genital formation process in men or women, for example, vulvar abnormalities such as hypospadias , Gonadal dysgenesis, true semi-yin-yang, pseudo-half-yin-yang, etc.
また、「CXorf6（遺伝子）の下流遺伝子」とは、CXorf6が直接転写を活性化する遺伝子だけでなく、CXorf6が機能することによって、発現が変化する全ての遺伝子を意味する。 Further, the “downstream gene of CXorf6 (gene)” means not only a gene for which CXorf6 directly activates transcription but also all genes whose expression is changed by the function of CXorf6.
本発明によれば、性分化異常症を診断できるマーカー、及びそのマーカーを検出するための性分化異常症診断用キットを提供することが可能になる。 According to the present invention, it is possible to provide a marker capable of diagnosing sexual differentiation disorder and a kit for diagnosing sexual differentiation disorder for detecting the marker.
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。 Hereinafter, embodiments of the present invention completed based on the above knowledge will be described in detail with reference to examples. Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or explanation, and the present invention is not limited thereto. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝性分化異常症診断マーカー＝＝
ヒトCXorf6(chromosome X open reading frame 6、別名:F18又はCG1)（配列番号１）は、Ｘ染色体長腕遠位に存在する遺伝子としてLaporteらにより同定されたが（Hu, L. J. et al. Deletions in Xq28 in two boys with myotubular myopathy and abnormal genital development define a new contiguous gene syndrome in a 430kb region. Hum. Mol. Genet. 5, 139-143 (1996), Laporte, J. et al. Cloning and characterization of an alternatively spliced gene in proximal Xq28 deleted in two patients with intersexual genitalia and myotubular myopathy. Genomics 41, 458-462 (1997)）、現在まで、その機能は知られていない。
== Sexual differentiation disorder diagnostic marker ==
Human CXorf6 (chromosome X open reading frame 6, also known as F18 or CG1) (SEQ ID NO: 1) was identified by Laporte et al. As a gene located in the long arm of the X chromosome (Hu, LJ et al. Deletions in Xq28 in two boys with myotubular myopathy and abnormal genital development define a new contiguous gene syndrome in a 430kb region.Hum. Mol. Genet. 5, 139-143 (1996), Laporte, J. et al. Cloning and characterization of an alternatively spliced gene in proximal Xq28 deleted in two patients with intersexual genitalia and myotubular myopathy. Genomics 41, 458-462 (1997)).
本発明者らは、性分化異常症のうち尿道下裂の表現型を有する患者のヒトCXorf6遺伝子の塩基配列を調べたところ、370番目、589番目、1957番目の塩基にナンセンス変異が生じている患者が存在することを見出した（図１〜図３を参照のこと）。その結果、ヒトCXorf6ポリペプチドは、第124番目、第197番目、又は第653番目のコドンが終止コドンとなり、それぞれ、第124番目、第197番目、又は第653番目のアミノ酸残基以降のＣ末端領域が欠失したポリペプチドが生産される。このことは、ヒトCXorf6ポリペプチドの第653番目以降のＣ末端領域の機能の欠損が尿道下裂の表現型を引き起こすことを示す。 When the present inventors examined the base sequence of the human CXorf6 gene of a patient having a hypourethral phenotype among sexual differentiation abnormalities, nonsense mutations occurred at the 370th, 589th, and 1957th bases. The patient was found to be present (see FIGS. 1-3). As a result, human CXorf6 polypeptide has the 124th, 197th, or 653rd codon as a stop codon, and the C-terminal after the 124th, 197th, or 653rd amino acid residue, respectively. A polypeptide in which the region is deleted is produced. This indicates that a deficiency in the function of the C-terminal region from the 653rd and later of human CXorf6 polypeptide causes a hypospadias phenotype.
また、これらの変異遺伝子を用いて、その産物の下流遺伝子に対する転写活性化能を調べたところ、実施例に記載のレポーターアッセイから示されるように、これらの変異遺伝子のコードするポリペプチドには、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等の転写を活性化する機能が欠損していることを見出した（図６を参照のこと）。このことは、ヒトCXorf6ポリペプチドの第653番目以降のＣ末端領域には、下流遺伝子の転写を活性化する機能があり、その転写活性化能が欠損すると、尿道下裂の表現型が生じることを示す。 In addition, when the transcription activation ability of the product for the downstream gene of these mutant genes was examined, as shown by the reporter assay described in the Examples, the polypeptides encoded by these mutant genes include: It was found that the function of activating transcription such as Hes1 gene, Hes5 gene or Hes7 gene is deficient (see FIG. 6). This indicates that the C-terminal region from the 653rd and subsequent C-terminal region of human CXorf6 polypeptide has a function of activating transcription of downstream genes, and if the transcription activation ability is deficient, a hypourethral phenotype is generated. Indicates.
従って、CXorf6の下流遺伝子に対する転写活性化能を評価することにより、CXorf6遺伝子関連物質及び下流遺伝子の遺伝子関連物質を「性分化異常症を診断するための遺伝子マーカー」（以下、「性分化異常症の診断マーカー」と記載する）として利用できる。これは、ヒトに限定されず、どんな生物種にも適用可能である。 Therefore, by evaluating the transcriptional activation ability of CXorf6 for downstream genes, CXorf6 gene-related substances and gene-related substances of downstream genes can be identified as “gene markers for diagnosing sexual differentiation disorders” (hereinafter referred to as “sexual differentiation disorders”). As a diagnostic marker). This is not limited to humans and can be applied to any species.
このような性分化異常症を診断する際の一つのマーカーとしては、CXorf6遺伝子の下流に存在する下流遺伝子の転写活性化能が欠損しているポリペプチドが考えられ、それは、例えば、CXorf6遺伝子において、塩基の欠失、挿入、置換などの変異により、CXorf6遺伝子の転写活性化能を欠損しているポリペプチドであって、例えば、ヒトCXorf6（配列番号１）のアミノ酸配列においては、少なくとも第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損しているものが考えられる。他の例として、実施例に示すような、第197番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損しているポリペプチドや、第124番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損しているポリペプチドであってもよい。 As a marker for diagnosing such sexual differentiation disorder, a polypeptide lacking the transcriptional activation ability of a downstream gene present downstream of the CXorf6 gene can be considered. For example, in the CXorf6 gene, , A polypeptide lacking the transcriptional activation ability of the CXorf6 gene due to mutations such as base deletion, insertion, substitution, etc., for example, at least the 653rd in the amino acid sequence of human CXorf6 (SEQ ID NO: 1) Those lacking the function of the peptide region on the C-terminal side from the 2nd amino acid residue are considered. As other examples, a polypeptide lacking the function of the peptide region on the C-terminal side from the 197th amino acid residue as shown in the Examples, or a peptide on the C-terminal side from the 124th amino acid residue It may be a polypeptide lacking the function of the region.
典型的な例としては、ヒトCXorf6（配列番号１）のアミノ酸配列において、少なくとも第653番目のアミノ酸残基以降のＣ端側領域を欠失しているポリペプチドが挙げられ、実施例に記載されるような、第197番目以降のアミノ酸残基を欠失しているポリペプチドや、又は第124番目以降のアミノ酸残基を欠失しているポリペプチドであってもよい。 A typical example is a polypeptide lacking at least the C-terminal region after the 653rd amino acid residue in the amino acid sequence of human CXorf6 (SEQ ID NO: 1), which is described in the Examples. For example, a polypeptide lacking the 197th and subsequent amino acid residues, or a polypeptide lacking the 124th and subsequent amino acid residues may be used.
なお、下流遺伝子としては、例えば、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等が挙げられる。 Examples of the downstream gene include Hes1 gene, Hes5 gene, Hes7 gene, and the like.
また、本発明の診断マーカーは、前述のポリペプチドだけに限らず、それらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はそれらの相補鎖（二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またＲＮＡとＤＮＡのヘテロ二重鎖を含む）であってもよい。 In addition, the diagnostic marker of the present invention is not limited to the aforementioned polypeptides, but mRNA, hnRNA, cDNA or their complementary strands (double stranded RNA, double stranded DNA, or RNA and DNA encoding the polypeptides). Or a heteroduplex of 2).
さらに、CXorf6の発現自体が無くなれば、下流遺伝子に対する活性能は無くなることから、野生型のCXorf6遺伝子関連物質も、本発明のマーカーに含まれる。 Furthermore, if CXorf6 expression itself disappears, the ability to activate downstream genes is lost, and therefore a wild-type CXorf6 gene-related substance is also included in the marker of the present invention.
＝＝CXorf6転写活性化機能評価用遺伝子マーカー＝＝
実施例に記載するレポーターアッセイから示されるように、ヒトCXorf6は、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等下流遺伝子の転写を活性化することができ、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域に、その転写活性化領域が存在する。従って、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等下流遺伝子の発現を調べることにより、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域が機能しているどうか判断できる。そこで、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等CXorf6の下流遺伝子に関連する遺伝子関連物質は、CXorf6遺伝子の下流遺伝子に対する転写活性化機能を評価するマーカーとして利用できる。
== Genetic marker for CXorf6 transcriptional activation function evaluation ==
As shown from the reporter assay described in the Examples, human CXorf6 can activate transcription of downstream genes such as Hes1, Hes5, and Hes7 genes, and C3 from the 653rd amino acid residue of human CXorf6. The transcription activation region exists in the terminal peptide region. Therefore, by examining the expression of downstream genes such as the Hes1, Hes5, or Hes7 genes, it can be determined whether the peptide region on the C-terminal side of the 653rd amino acid residue of human CXorf6 is functioning. Therefore, a gene-related substance related to the downstream gene of CXorf6 such as Hes1 gene, Hes5 gene or Hes7 gene can be used as a marker for evaluating the transcriptional activation function for the downstream gene of CXorf6 gene.
また、前述のように、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の欠失と、尿道下裂の表現型とは相関がある。従って、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等CXorf6の下流遺伝子に関連する遺伝子関連物質は、性分化異常症の診断マーカーとしても有用である。 Further, as described above, there is a correlation between the deletion of the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue of human CXorf6 and the hypospadias phenotype. Therefore, a gene-related substance related to a downstream gene of CXorf6 such as Hes1 gene, Hes5 gene or Hes7 gene is also useful as a diagnostic marker for sexual differentiation disorder.
＝＝性分化異常症の診断方法＝＝
上述の遺伝子マーカーを用いて性分化異常症を診断するには、ヒトCXorf6の場合、第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能の有無を調べればよく、具体的には、（１）ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現、又は（２）ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の転写活性化機能、を調べる。以下に、それぞれの検出方法の例を述べるが、検出方法としては、これらの方法に限定されない。
== Diagnosis of sexual differentiation disorder ==
In order to diagnose sexual differentiation disorder using the above gene marker, in the case of human CXorf6, the presence or absence of the function of the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue may be examined. Specifically, (1) expression of a peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue of human CXorf6, or (2) transcription activation function of a peptide region on the C-terminal side of the 653rd amino acid residue of human CXorf6, Check out. Examples of each detection method will be described below, but the detection method is not limited to these methods.
なお、図３に示す通り、尿道下裂は、陰茎の形態異常等の臨床所見が認められるので、本発明のマーカーの検出とこのような臨床所見とを併せれば、性分化異常症をより正確に診断することができる。 In addition, as shown in FIG. 3, hypospadias have clinical findings such as abnormal penile morphology. Therefore, combining the detection of the marker of the present invention with such clinical findings further increases sexual differentiation abnormalities. It can be diagnosed accurately.
（1）発現を調べる場合
まず、CXorf6遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等をマーカーとし、診断対象の個体から得た、本来CXorf6が発現している細胞内において、これらの診断マーカーの存在をノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲで検出することにより、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現を調べることができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにおいては、特に、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域をコードする領域に対応するプローブやプライマーを用いることが好ましい。また、CXorf6遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等のＲＮＡの塩基配列を決定することにより、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現を無くさせるようなナンセンス変異などの突然変異の有無を知ることもできる。
(1) When examining expression First, mRNA, hnRNA, etc. transcribed from the CXorf6 gene are used as markers, and the presence of these diagnostic markers in the cells in which CXorf6 is originally expressed obtained from the individual to be diagnosed By detecting by hybridization or RT-PCR, the expression of the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue of human CXorf6 can be examined. In Northern hybridization and RT-PCR, it is particularly preferable to use a probe or primer corresponding to a region encoding a peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue of human CXorf6. In addition, nonsense mutations that eliminate the expression of the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue of human CXorf6 by determining the base sequence of RNA such as mRNA and hnRNA transcribed from CXorf6 gene It is possible to know the presence or absence of mutations.
なお、診断対象の個体から得た細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写して作成したｃＤＮＡを用い、CXorf6をコードするｃＤＮＡに対し、ｃＤＮＡの量や、発現を無くさせるような変異の有無を調べてもよい。その具体的な方法は、ハイブリダイゼーション、塩基配列の決定、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ検出など、特に限定されないが、ハイブリダイゼーションやＰＣＲにおいては、特に、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域をコードする領域に対応するプローブやプライマーを用いることが好ましい。 In addition, by extracting RNA from cells obtained from the individual to be diagnosed and using reverse-transcribed cDNA, the cDNA encoding CXorf6 was examined for the amount of cDNA and the presence or absence of mutations that would eliminate expression. Also good. The specific method is not particularly limited, such as hybridization, determination of base sequence, PCR, and RFLP detection. In hybridization and PCR, in particular, the C-terminal side of the 653rd amino acid residue of human CXorf6 It is preferable to use a probe or primer corresponding to the region encoding the peptide region.
また、診断対象の個体から得た細胞からゲノムＤＮＡを単離し、CXorf6の塩基配列を決定することにより、発現を無くさせるような変異の有無を調べることができる。 Further, by isolating genomic DNA from cells obtained from an individual to be diagnosed and determining the base sequence of CXorf6, it is possible to examine the presence or absence of a mutation that causes the expression to be lost.
なお、塩基配列を決定することにより、CXorf6遺伝子の変異を直接検出する場合、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ又はその相補鎖等の核酸にはCXorf6遺伝子全体が含まれている必要はなく、CXorf6遺伝子の変異を有する箇所の塩基が含まれ、その塩基を決定することができる塩基配列があれば十分である。 In addition, when the mutation of the CXorf6 gene is directly detected by determining the base sequence, the nucleic acid such as cDNA, mRNA, hnRNA or its complementary strand does not need to contain the entire CXorf6 gene, and the mutation of the CXorf6 gene It suffices if there is a base sequence that includes a base having a position where the base can be determined.
さらに、上記マーカーが、CXorf6の一部又は全部をコードするペプチドの場合、CXorf6の量を検出するためには、このようなペプチドに対して特異的に反応する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング法、免疫組織学的方法等を行えばよい。ヒトCXorf6の場合、第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域に特異的な抗体を用いることが好ましい。 Furthermore, when the marker is a peptide encoding part or all of CXorf6, in order to detect the amount of CXorf6, an antibody that reacts specifically with such a peptide is used, ELISA, Western blotting. Or immunohistological methods. In the case of human CXorf6, it is preferable to use an antibody specific for the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue.
このようにして調べた結果、診断対象の個体において、CXorf6の発現が全く無くなっていたり、発現していても、例えばヒトCXorf6において少なくとも第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側の領域を欠失したペプチドが発現していて、野生型ペプチドが発現していないような場合、その個体は性分化異常症であると診断する。 As a result of the examination, even if CXorf6 expression is completely lost or expressed in the individual to be diagnosed, for example, at least the region at the C-terminal side from the 653rd amino acid residue is deleted in human CXorf6. If the expressed peptide is expressed and the wild-type peptide is not expressed, the individual is diagnosed as having a sexual differentiation disorder.
（2）機能を検出する場合
CXorf6の転写活性化機能を検出するには、診断対象の個体から得た細胞において、CXorf6遺伝子の下流遺伝子の発現を調べればよい。下流遺伝子としては、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子などがあり、これらの遺伝子の発現を、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＴ、ＥＬＩＳＡ、組織染色など、遺伝子発現を検出できる公知の方法によって調べる。
(2) When detecting a function
In order to detect the transcriptional activation function of CXorf6, expression of the downstream gene of CXorf6 gene may be examined in cells obtained from the individual to be diagnosed. Downstream genes include the Hes1, Hes5, and Hes7 genes, and the expression of these genes is examined by a known method capable of detecting gene expression, such as Northern hybridization, RT-PCT, ELISA, and tissue staining.
また、CXorf6のHes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子のプロモーターへの結合を、ゲルシフトアッセイ等によって直接測定してもよい。この場合、例えば、診断対象の個体から得た細胞から抽出した抽出物を用いて、ラベルしたHes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子のプロモーターをプローブとして用いて実験を行う。 Further, the binding of CXorf6 to the promoter of Hes1 gene, Hes5 gene or Hes7 gene may be directly measured by gel shift assay or the like. In this case, for example, using an extract extracted from a cell obtained from an individual to be diagnosed, an experiment is performed using the labeled Hes1 gene, Hes5 gene or Hes7 gene promoter as a probe.
さらに、診断対象の個体から得た細胞から単離したCXorf6遺伝子やｃＤＮＡを用い、培養細胞を用いてレポーターアッセイを行なってもよい。例えば、実施例のように、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼを組み込んだレポーターとともに、単離したCXorf6遺伝子やｃＤＮＡの発現ベクターを細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、CXorf6の機能を調べることができる。 Furthermore, a reporter assay may be performed using cultured cells using CXorf6 gene or cDNA isolated from cells obtained from an individual to be diagnosed. For example, as in the examples, introducing an isolated CXorf6 gene or cDNA expression vector into a cell together with a reporter incorporating luciferase downstream of the Hes1 gene, Hes5 gene or Hes7 gene promoter, and measuring luciferase activity You can check the function of CXorf6.
このようにして調べた結果、診断対象の個体において、CXorf6の下流遺伝子に対する転写活性化機能が欠損している場合、その個体は性分化異常症であると診断する。 As a result of the examination, if an individual to be diagnosed lacks the transcriptional activation function for the downstream gene of CXorf6, the individual is diagnosed as having a sexual differentiation disorder.
＝＝診断マーカーの有用性＝＝
本発明の診断マーカーは、細胞（血液を含む）や組織等のサンプルから検出することができる。特に、CXorf6遺伝子の一部又は全部を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を調べる方法を用いれば、サンプルの細胞におけるCXorf6遺伝子の発現にかかわらず、診断が可能である。一般に、血液の採取は、生検に比べて患者へのリスクが少ないため、血液中から採取したゲノムＤＮＡをマーカーとし、その塩基配列を調べることが好ましく、例えば、先天異常をチェックする新生児検診や乳幼児健診等の集団検診において有用である。
== Usefulness of diagnostic markers ==
The diagnostic marker of the present invention can be detected from a sample such as a cell (including blood) or tissue. In particular, if a method for examining the base sequence of genomic DNA containing part or all of the CXorf6 gene is used, diagnosis is possible regardless of the expression of the CXorf6 gene in the sample cells. In general, since blood collection has less risk to the patient compared to biopsy, it is preferable to examine the base sequence using genomic DNA collected from blood as a marker. This is useful for group medical examinations such as infant medical examinations.
また、母胎の血液、羊水又は絨毛組織等をサンプルに用いることができれば、出生前の胎児における性分化異常症の診断も可能である。 Moreover, if maternal blood, amniotic fluid, or chorionic tissue can be used as a sample, it is possible to diagnose sexual differentiation abnormalities in a prenatal fetus.
なお、CXorf6遺伝子又はその下流遺伝子の発現を調べる場合は、実施例及び図４に示されるような、各遺伝子が発現している細胞を用いればよい。 When examining the expression of the CXorf6 gene or its downstream gene, cells expressing each gene as shown in the Examples and FIG. 4 may be used.
＝＝性分化異常症診断用キット＝＝
本発明にかかる性分化異常症診断用キットは、CXorf6の下流遺伝子の活性化能の有無を検出するための試薬又は器具が含まれていればどのようなものでもよいが、ヒトCXorf6の場合、特に第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現の有無を検出するための試薬又は器具であるのが好ましい。そのような試薬又は器具の例として、サザンブロット法、ノーザンブロット法もしくはin situ ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブや試薬、ゲルシフトアッセイに用いられるプローブや試薬、塩基配列決定に用いられるプライマーや試薬、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーペアや試薬、又はウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織学的方法もしくはゲルシフトアッセイにおいて使用する特異的抗体等が挙げられる。ヒトCXorf6の発現を調べる場合は、特に、第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域を特異的に認識するプライマー、プローブ、又は抗体が好ましい。その他、細胞（血液を含む）又は組織からＲＮＡを単離するための試薬、酵素・蛍光物質・放射性物質等により標識された抗体、この酵素と反応する基質等を含んでいてもよい。なお、検出するための標識物質として、例えば、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ等の酵素、Cy2、FluorX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC（イソチオシアン酸フルオレセイン）、ローダミン等の蛍光物質、3H、32P、35S、121I、125I等の放射性物質を含んでいてもよい。
== Kit for diagnosis of sexual differentiation disorder ==
The kit for diagnosing sexual differentiation disorder according to the present invention may be anything as long as it contains a reagent or instrument for detecting the presence or absence of the ability to activate the downstream gene of CXorf6, but in the case of human CXorf6, In particular, a reagent or instrument for detecting the presence or absence of expression of the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue is preferable. Examples of such reagents or instruments include probes and reagents used in Southern blotting, Northern blotting or in situ hybridization, probes and reagents used in gel shift assays, primers and reagents used in sequencing, PCR Examples include primer pairs and reagents used in PCR methods and RT-PCR methods, or specific antibodies used in Western blotting, ELISA, immunohistological methods or gel shift assays. When examining the expression of human CXorf6, a primer, probe, or antibody that specifically recognizes the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue is particularly preferable. In addition, it may contain a reagent for isolating RNA from cells (including blood) or tissue, an antibody labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a radioactive substance, etc., a substrate that reacts with this enzyme, and the like. Examples of labeling substances for detection include horseradish peroxidase (HRP), enzymes such as alkaline phosphatase, Cy2, FluorX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FITC (fluorescein isothiocyanate) ), Fluorescent materials such as rhodamine, and radioactive materials such as 3 H, 32 P, 35 S, 121 I and 125 I.
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。 Hereinafter, although the embodiment described above will be specifically described using examples, this is an exemplification, and the present invention is not limited to these examples.
＝＝対象患者＝＝
Ｘ染色体長腕末端に存在するヒトCXorf6遺伝子の変異を解析するために、種々の性分化異常症患者（男性化障害や染色体46,XY核型を有する患者等）166例（特発性症例152例、家族性症例（発端者）14例）を対象として、以下の実験を行った。なお、この166人の患者のうち、尿道下裂を有する日本人患者は56例（重症例22例）であった。以下の実験の結果、患者の染色体に変異（アミノ酸置換）が認められた場合には、その患者の家族に対して同様の実験を行った。
== Target patient ==
In order to analyze mutations in the human CXorf6 gene at the end of the long arm of the X chromosome, 166 patients with various sexual differentiation disorders (patients with masculinization disorder and chromosome 46, XY karyotype, etc.) (152 idiopathic cases) The following experiments were conducted on 14 familial cases (probands). Of the 166 patients, there were 56 Japanese patients (22 severe cases) with hypospadias. As a result of the following experiment, when a mutation (amino acid substitution) was found in the patient's chromosome, the same experiment was performed on the patient's family.
＝＝遺伝子解析＝＝
上記患者における、Ｘ染色体長腕末端に存在するヒトCXorf6のエキソン３〜エキソン６をコードする領域及びそれらに隣接するスプライス部位に対して、以下のように塩基配列を決定した。
== Genetic analysis ==
In the above patient, the base sequence was determined for the region encoding exon 3 to exon 6 of human CXorf6 present at the end of the long arm of X chromosome and the splice site adjacent to them.
まず、上記患者の末梢血を採取し、採取した血液（白血球細胞）からゲノムＤＮＡを単離した。次に、単離したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒトCXorf6のエキソン3〜エキソン6をコードする領域及びそれらに隣接するスプライス部位をＰＣＲ法（95℃で2分間処理後、表１に示すアニーリング温度（AT）で45秒、次いで72℃で45秒伸長反応、95℃で45秒脱ハイブリダイゼーションを30回繰り返し、最終的に72℃で10分間処理した）で増幅した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に示す通りである。 First, peripheral blood of the patient was collected, and genomic DNA was isolated from the collected blood (white blood cells). Next, using the isolated genomic DNA as a template, the region encoding human exon 3 to exon 6 of human CXorf6 and the splice site adjacent to them were subjected to the PCR method (treatment at 95 ° C. for 2 minutes, followed by the annealing temperature shown in Table 1). AT) for 45 seconds, followed by a 45 second extension reaction at 72 ° C., a 45 second dehybridization at 95 ° C. for 30 times, and a final treatment at 72 ° C. for 10 minutes. In addition, the primers used for PCR are as shown in Table 1.
次に、ＣＥＱ8000自動シークエンサー（Beckman Coulter社）を用いて、こうして得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。 Next, the base sequence of the PCR product thus obtained was analyzed using a CEQ8000 automatic sequencer (Beckman Coulter).
図１に示す通り、尿道下裂の表現型を示す日本人患者3家系4例において、男児では1個のみ存在するCXorf6遺伝子にナンセンス変異が認められ、終止コドンが生じていた（図１において、黒の四角で示す）。具体的にいうと、家族Ａ由来の異母兄弟において370番目の塩基ＧがＴに変異した結果、124番目のGlu以降のポリペプチドが欠失し（症例1及び症例2）、家族Ｂ由来の患者において589番目の塩基ＣがＴに変異した結果、197番目のGln以降のポリペプチドが欠失し（症例３）、家族Ｃ由来の患者において1957番目の塩基ＣがＴに置換した結果、653番目のArg以降のポリペプチドが欠失することとなった（症例４）。なお、家族Ａ及び家族Ｃの母親は、上記変異についてヘテロ接合体である、変異のキャリアであった。（家族Ｂの母親は未解析）。また、コントロールである150人の日本人男性患者には、これらの変異が認められなかった。 As shown in FIG. 1, in 4 Japanese families with 4 cases of hypospadias phenotype, a nonsense mutation was found in the CXorf6 gene, which was present only in one boy, resulting in a stop codon (in FIG. 1). (Indicated by a black square). Specifically, the 370th base G was mutated to T in a half brother from family A, resulting in a deletion of the 124th Glu and subsequent polypeptides (cases 1 and 2), and patients from family B As a result of mutating the 589th base C to T, the polypeptide after the 197th Gln was deleted (case 3), and the 1957th base C was replaced with T in patients from family C, resulting in the 653rd The polypeptide after Arg was deleted (case 4). The mothers of Family A and Family C were mutation carriers that were heterozygotes for the mutation. (Family B's mother has not been analyzed). In addition, these mutations were not observed in 150 Japanese male patients as controls.
一方、尿道下裂の表現型を有するスウェーデン人男性患者には、856番目の塩基ＣがＴに置換し、その結果ヒトCXorf6ペプチドで286番目のProがSerに置換するミスセンス変異が認められた。なお、同じ表現型を有する患者の兄弟及び患者のいとこには、この変異が認められなかった（家族Ｄ）。同様に、女性化された性器を有するイタリア人患者の兄弟において、1520番目のＡがＧに置換し、その結果ヒトCXorf6ペプチドで507番目のGlnがArgに置換するミスセンス変異が認められた。しかし、同じ表現型を有するいとこ（男性）では、この変異が認められなかった（家族Ｅ）。従って、これらのミスセンス変異は、尿道下裂の原因であるとは考えられない。 On the other hand, a Swedish male patient with hypospadias phenotype had a missense mutation in which the 856th base C was replaced with T, and as a result, the human CXorf6 peptide had 286th Pro replaced with Ser. This mutation was not observed in siblings and cousins of patients with the same phenotype (family D). Similarly, in a sibling of an Italian patient with a feminized genitalia, a missense mutation was observed in which A at position 1520 was replaced with G, and as a result, 507th Gln was replaced with Arg in human CXorf6 peptide. However, this mutation was not observed in the cousin (male) who had the same phenotype (family E). Therefore, these missense mutations are not considered to be responsible for hypospadias.
なお、上記のナンセンス変異、ミスセンス変異、及び既に報告されている遺伝子多型（N589S）の位置関係を示したヒトCXorf6遺伝子の構造は、図２に示す通りである。 The structure of the human CXorf6 gene showing the positional relationship of the nonsense mutation, the missense mutation, and the previously reported gene polymorphism (N589S) is as shown in FIG.
以上より、尿道下裂の発現は、ヒトCXorf6において653番目のArg以降のポリペプチドの欠失、すなわち653番目のArg以降のＣ末端領域が担う機能の欠損によることが示唆された。 From the above, it was suggested that the expression of hypospadias was due to the deletion of the polypeptide after the 653rd Arg in human CXorf6, that is, the loss of the function of the C-terminal region after the 653rd Arg.
＝＝尿道下裂の臨床所見＝＝
ヒトCXorf6遺伝子に変異を有する、家族Ａ（症例１及び２）及び家族Ｃ（症例４）由来の3人の患者における臨床所見を図３に示す。なお、家族Ａ〜家族Ｃのヘテロ接合体の母親が臨床所見上正常であったことから、この変異がＸ染色体連鎖劣性変異であることがわかる。
== Clinical findings of hypospadias ==
The clinical findings in three patients from family A (cases 1 and 2) and family C (case 4) having mutations in the human CXorf6 gene are shown in FIG. In addition, since the mother of the heterozygote of family A to family C was normal clinically, it can be seen that this mutation is an X-linked linkage recessive mutation.
＝＝アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ：androgen receptor）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）の解析＝＝
前述のように、症例１〜４においてヒトCXorf6遺伝子に変異が認められたので、これらの患者（症例１及び２：2歳5ヶ月、症例３：1ヶ月、症例４：3ヶ月）をさらに詳しく調べた。
== Analysis of androgen receptor gene (AR) and 5α-reductase gene (SRD5A2) ==
As mentioned above, since mutations were found in the human CXorf6 gene in cases 1 to 4, these patients (cases 1 and 2: 2 years 5 months, case 3 months, case 4: 3 months) are described in more detail. Examined.
まず、これらの患者において、血中の下垂体由来のゴナドトロピンの値を測定した。その結果、この値は全ての患者において正常範囲内であった。これより、患者の性腺刺激ホルモンは正常であることが分かった。
次に、これらの患者において、血中のテストステロンの値を測定した。その結果、症例１では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの負荷によってテストステロンの産生が認められた。また、症例２及び症例４において、血中テストステロンの値は基準値の範囲であった。
First, in these patients, the value of gonadotropin derived from the pituitary gland in blood was measured. As a result, this value was within the normal range in all patients. This showed that the patient's gonadotropin was normal.
Next, in these patients, the level of testosterone in the blood was measured. As a result, in case 1, production of testosterone was observed by loading with human chorionic gonadotropin. In cases 2 and 4, the blood testosterone value was within the range of the reference value.
以上の所見から、これらの患者において、アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ：androgen receptor）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）に変異があるか否かを確認するために、これらの遺伝子の塩基配列を決定した。具体的な方法は、以下の通りである。 Based on the above findings, in these patients, the base sequences of these genes were determined in order to confirm whether the androgen receptor gene (AR) and 5α-reductase gene (SRD5A2) had mutations. . A specific method is as follows.
まず、上記患者の末梢血を採取し、採取した血液（白血球細胞）からゲノムＤＮＡを単離した。次に、単離したゲノムＤＮＡを鋳型とし、アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）をＰＣＲ法（95℃で2分間処理後、表２及び表３に示すアニーリング温度（AT）で45秒、次いで72℃で45秒伸長反応、95℃で45秒脱ハイブリダイゼーションを30回繰り返し、最終的に72℃で10分間処理した）で増幅した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、以下に示す通りである。 First, peripheral blood of the patient was collected, and genomic DNA was isolated from the collected blood (white blood cells). Next, using the isolated genomic DNA as a template, the androgen receptor gene (AR) and the 5α-reductase gene (SRD5A2) were treated with the PCR method (at 95 ° C. for 2 minutes, followed by the annealing temperatures (AT ) For 45 seconds, followed by a 45-second extension reaction at 72 ° C., a 45-second dehybridization at 95 ° C. for 30 times, and a final treatment at 72 ° C. for 10 minutes. In addition, the primers used for PCR are as shown below.
こうして得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析したが、症例１〜症例４の患者全てにおいて、ＡＲ遺伝子及びSRD5A2遺伝子に変異は認められなかった。このことは、症例１〜症例４の患者においては、尿道下裂の原因遺伝子がヒトCXorf6遺伝子であるという結論を支持する。 The nucleotide sequence of the PCR product thus obtained was analyzed, and no mutation was found in the AR gene and the SRD5A2 gene in all patients of cases 1 to 4. This supports the conclusion that in cases 1 to 4 patients, the causative gene of hypospadias is the human CXorf6 gene.
＝＝各組織におけるヒトCXorf6遺伝子等の発現解析＝＝
ヒトCXorf6がどの組織に発現しているかを調べるために、以下の実験を行った。
まず、包茎を合併している思春期前の男児の陰茎皮膚から線維芽細胞（図４の陰茎の皮膚に対応）を調製し、また、ＡＲ変異のために外性器異常を合併している思春期前の患者の性器皮膚から線維芽細胞（図４の性器の皮膚に対応）を調製した。次に、Superscript III逆転写酵素（Invitrogen社）を用いて、これらの線維芽細胞からｃＤＮＡを調製した。
また、これらの細胞以外のヒトｃＤＮＡは、Invitrogen社又はClontech社から購入し、そのうち0.5ngのｃＤＮＡをＰＣＲに用いた。
== Expression analysis of human CXorf6 gene etc. in each tissue ==
In order to investigate in which tissue human CXorf6 is expressed, the following experiment was performed.
First, fibroblasts (corresponding to the skin of the penis shown in FIG. 4) were prepared from the penile skin of a prepubertal boy who was also associated with phimosis, and puberty that was also associated with external genital abnormalities due to AR mutation Fibroblasts (corresponding to the genital skin of FIG. 4) were prepared from the genital skin of the pre-term patient. Next, cDNA was prepared from these fibroblasts using Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen).
Further, human cDNA other than these cells was purchased from Invitrogen or Clontech, and 0.5 ng of cDNA was used for PCR.
次に、上記のｃＤＮＡを鋳型とし、表４に記載の各種プライマーを用いて、ＰＣＲ法（95℃で2分間処理後、表４に示すアニーリング温度（AT）で45秒、次いで72℃で45秒伸長反応、95℃で45秒脱ハイブリダイゼーションを30回繰り返し、最終的に72℃で10分間処理した）行った。なお、表中のRBP-Jは、「recombination signal binding protein-J」の略である。 Next, using the above cDNA as a template and various primers shown in Table 4, PCR method (after treatment at 95 ° C. for 2 minutes, annealing temperature (AT) shown in Table 4 for 45 seconds, then 72 ° C. at 45 ° C. The second extension reaction and 45-second dehybridization at 95 ° C. were repeated 30 times and finally treated at 72 ° C. for 10 minutes). In the table, RBP-J is an abbreviation for “recombination signal binding protein-J”.
図４に示す通り、ヒトCXorf6遺伝子は、主に胎児の精巣、成人の下垂体、成人の視床下部、小児の陰茎の皮膚で特に強く発現していた。また、Hes5遺伝子及びHes7遺伝子は、胎児の精巣において強く発現していた。これより、ヒトCXorf6遺伝子及びHes5遺伝子及びHes7遺伝子は、胎児の精巣の発生過程において重要な役割を有することが示唆された。 As shown in FIG. 4, the human CXorf6 gene was particularly strongly expressed mainly in fetal testis, adult pituitary gland, adult hypothalamus, and pediatric penile skin. Further, the Hes5 gene and the Hes7 gene were strongly expressed in the fetal testis. This suggests that the human CXorf6 gene, Hes5 gene, and Hes7 gene have an important role in the developmental process of the fetal testis.
＝＝マウスCXorf6遺伝子のin situハイブリダイゼーション＝＝
さらに詳細に、胎児期におけるCXorf6遺伝子の発現を調べるため、in situハイブリダイゼーションを行った。ここで、プローブには、胎生14.5日のマウス精巣のｃＤＮＡにおいて、マウスCXorf6遺伝子のエキソン3の667bpの領域を含む851bpのフラグメント（配列番号７０及び配列番号７１）を用いた（表５を参照のこと）。
== In situ hybridization of mouse CXorf6 gene ==
In more detail, in situ hybridization was performed to examine the expression of the CXorf6 gene in the fetal period. Here, as a probe, an 851 bp fragment (SEQ ID NO: 70 and SEQ ID NO: 71) containing the 667 bp region of exon 3 of mouse CXorf6 gene in cDNA of embryonic day 14.5 mouse testis was used (see Table 5). thing).
まず、胎生11.5日目、胎生12.5日目及び胎生14.5日目のＩＣＲマウスの胎仔から性腺を摘出し、これらの性腺を4％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、20％スクロースに浸し、OTC compound（ティッシュテック社）で包埋した。包埋したサンプルを凍結切片にし、ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット（Roche社）によってジゴキシゲニンで標識したプローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行った（図５ａを参照のこと）。 First, gonads were removed from fetuses of ICR mice on embryonic day 11.5, embryonic day 12.5 and embryonic day 14.5, these gonads were fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde, soaked in 20% sucrose, and OTC compound ( Embedded in Tissue Tech). The embedded samples were frozen sections and in situ hybridization was performed using a probe labeled with digoxigenin with a DIG RNA labeling kit (Roche) (see FIG. 5a).
図５ａに示す通り、胎生11.5日目のマウスの精巣の内部には、マウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。また、精巣が形成される胎生12.5日目には、精巣の内部にマウスCXorf6遺伝子の発現が認められ、特に、この発現はセルトリ細胞に局在していた。さらに、小数のライディッヒ細胞において、弱いながらもマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。胎生14.5日目には、マウスCXorf6遺伝子の発現はやや弱くなっていたが、セルトリ細胞及びライディッヒ細胞の大部分においてマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。このようにして明らかになったマウスCXorf6遺伝子の発現パターンは、ヒトにおいて尿道下裂の原因遺伝子がCXorf6遺伝子であることを支持する。 As shown in FIG. 5a, expression of the mouse CXorf6 gene was observed inside the testis of the 11.5 day-old mouse. In addition, on day 12.5 of the embryonic day when the testis were formed, the expression of the mouse CXorf6 gene was observed inside the testis, and in particular, this expression was localized in Sertoli cells. Furthermore, mouse CXorf6 gene expression was observed in a small number of Leydig cells, albeit weakly. On day 14.5, the expression of the mouse CXorf6 gene was somewhat weak, but the expression of the mouse CXorf6 gene was observed in the majority of Sertoli cells and Leydig cells. The expression pattern of the mouse CXorf6 gene thus revealed supports that the causative gene of hypospadias in humans is the CXorf6 gene.
また、卵巣では、胎生11.5日目及び胎生12.5日目において、主に、中腎へ分化する少数の体細胞において、マウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。胎生14.5日目には、少数の体細胞の内部領域において、弱いマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。胎生12.5日目の性腺外組織では、発達中の副腎においてマウスCXorf6遺伝子の発現が認められなかった。一方、性器結節を含む性器領域の外側において、マウスCXorf6遺伝子の発現が認められ、この発現は、性器外組織の周りと同レベルであった。また、ミュラー管、前脳、体節、神経管及び膵臓にもマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。従って、これらの組織から得られた細胞において、CXorf6遺伝子やその転写産物、翻訳産物の構造や量を調べることができる。 In the ovaries, the expression of the mouse CXorf6 gene was observed mainly on a small number of somatic cells that differentiated into the middle kidney on day 11.5 and day 12.5. On day 14.5 of the embryonic day, weak mouse CXorf6 gene expression was observed in the internal region of a small number of somatic cells. In the extragonadal tissue on day 12.5 of the embryonic day, mouse CXorf6 gene expression was not observed in the developing adrenal gland. On the other hand, expression of the mouse CXorf6 gene was observed outside the genital region including the genital nodules, and this expression was at the same level as that around the extragenital tissue. In addition, expression of the mouse CXorf6 gene was also observed in the Muller tube, forebrain, somites, neural tube and pancreas. Therefore, in the cells obtained from these tissues, the structure and amount of the CXorf6 gene, its transcription product and translation product can be examined.
＝＝トランスアクチベーション（transactivation）機能の解析＝＝
Hes1遺伝子、Hes5遺伝子及びHes7遺伝子に対するCXorf6変異体の転写活性化能を調べるため、各遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポーターを用い、培養細胞においてレポーターアッセイを行った。
== Analysis of transactivation function ==
In order to examine the transcriptional activation ability of the CXorf6 mutant for the Hes1, Hes5, and Hes7 genes, reporter assays were performed in cultured cells using reporters in which the luciferase gene was inserted into the promoter of each gene.
まず、ヒト胎児精巣ｃＤＮＡ（Invitrogen社、D8921-01）を用いて、ヒトCXorf6(アミノ酸配列番号1〜701)の全長ｃＤＮＡをＰＣＲ法（98℃で2分間処理後、98℃10秒−60℃20秒−72℃2分のサイクルを35回繰り返し、72℃で7分間処理した）で増幅した。また、変異導入法（site-directed mutagenesis）を用いて、in vitro突然変異導入法により、ヒトCXorf6遺伝子に対してナンセンス変異(E124X、Q197X、Q653X)、ミスセンス変異（P286S、Q507R、N589S）を導入した。なお、ヒトCXorf6のｃＤＮＡの作製に用いたプライマーは、表４に記載の通りである。 First, using human fetal testis cDNA (Invitrogen, D8921-01), the full-length cDNA of human CXorf6 (amino acid sequence number 1 to 701) was treated by PCR (98 ° C for 2 minutes, 98 ° C for 10 seconds to 60 ° C). A cycle of 20 seconds-72 ° C. for 2 minutes was repeated 35 times and treated at 72 ° C. for 7 minutes). In addition, nonsense mutations (E124X, Q197X, Q653X) and missense mutations (P286S, Q507R, N589S) were introduced into the human CXorf6 gene by in vitro mutagenesis using site-directed mutagenesis. did. The primers used for the preparation of human CXorf6 cDNA are as shown in Table 4.
次に、これらの変異を有するｃＤＮＡと、△エキソン4のｃＤＮＡをＰＣＲ法（98℃で2分間処理後、98℃10秒−60 20秒−72℃2分のサイクルを35回繰り返し、72℃で7分間処理する）で増幅し、発現ベクターpEF-Bos（大阪大学, 長田重一教授から供与）に挿入した（Mizushima, S. & Nagata, S. pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990).を参照）。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、表６に示す通りである。 Next, the cDNA having these mutations and the cDNA of exon 4 were subjected to PCR method (after treatment at 98 ° C. for 2 minutes, a cycle of 98 ° C. 10 seconds-60 20 seconds-72 ° C. 2 minutes 35 times, 72 ° C. And then inserted into the expression vector pEF-Bos (provided by Osaka University, Prof. Shigekazu Nagata) (Mizushima, S. & Nagata, S. pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990)). The primers used for PCR are as shown in Table 6.
次に、10％胎児ウシ血清含有RPMI1640を用いて、5％CO2、37℃の条件下で、MLT細胞（American Type Culture Collection, カタログナンバー CRL-2065）を培養した。この細胞を6ウェルの培養皿に1.0〜1.5×105細胞/ウェルの濃度で播種し、リポフェクタミン（Invitrogen社）を用いて、これらの細胞に0.6μgのHes1遺伝子プロモーター、Hes5遺伝子プロモーターもしくはHes7遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼを組み込んだレポーター（pHES1-luc、pHES5-lucもしくはpHES7-luc: Nishimura, M. et al. Structure, chromosomal locus, and promoter of mouse Hes2 gene, a homologue of Drosophila hairy and Enhancer of Split. Genomics 49, 69-75 (1998), Bessho, Y., Miyoshi, G., Sakata, R. & Kageyama, R. Hes7: a bHLH-type repressor gene regulated by Notch and expressed in the presomitic mesoderm. Genes Cells 6, 175−185 (2001).
を参照）に、0.6μgのCXorf6遺伝子の各発現ベクター及び／又は0.8μgのN1-ICD（Notch 1 intracellular domain）もしくはN2-ICD（Notch 2 intracellular domain）の発現ベクター（pEF-BOSneo-mNOtch1もしくはpEF-BOSneoaNotch2、Mizutani, T., Taniguchi, Y., Aoki, T., Hashimoto, No. & Honjo, T. Conservation of the biochemical mechanisms of signal transduction among mammalian Notch family members. Proc Natl. Acad. Sci.U. S. A. 98, 9026-9031 (2001), Shimizu, K., Chiba, S., Saito, T., Kumano, K., Hamada, Y. & Hirai, H. Functional diversity among Notch1, Notch2, and Notch3 receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 291, 775-779 (2002)を参照）をトランジエントに導入した。なお、導入効率の内部コントロールとして、上記細胞に20ngのpRL-CMVベクター（Promega社）を導入した実験を行った。また、発現ベクターに対するコントロールとしては、上記のｃＤＮＡを含まないオリジナルのベクターを導入した。
Next, MLT cells (American Type Culture Collection, catalog number CRL-2065) were cultured using RPMI1640 containing 10% fetal bovine serum under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. These cells are seeded at a concentration of 1.0 to 1.5 × 10 5 cells / well in a 6-well culture dish, and 0.6 μg of Hes1 gene promoter, Hes5 gene promoter or Hes7 gene is added to these cells using Lipofectamine (Invitrogen). Reporters incorporating luciferase downstream of the promoter (pHES1-luc, pHES5-luc or pHES7-luc: Nishimura, M. et al. Structure, chromosomal locus, and promoter of mouse Hes2 gene, a homologue of Drosophila hairy and Enhancer of Split Genomics 49, 69-75 (1998), Bessho, Y., Miyoshi, G., Sakata, R. & Kageyama, R. Hes7: a bHLH-type repressor gene regulated by Notch and expressed in the presomitic mesoderm. Genes Cells 6, 175-185 (2001).
0.6 μg CXorf6 gene expression vector and / or 0.8 μg N1-ICD (Notch 1 intracellular domain) or N2-ICD (Notch 2 intracellular domain) expression vector (pEF-BOSneo-mNOtch1 or pEF) -BOSneoaNotch2, Mizutani, T., Taniguchi, Y., Aoki, T., Hashimoto, No. & Honjo, T. Conservation of the biochemical mechanisms of signal transduction among mammalian Notch family members.Proc Natl. Acad. Sci. USA 98 , 9026-9031 (2001), Shimizu, K., Chiba, S., Saito, T., Kumano, K., Hamada, Y. & Hirai, H. Functional diversity among Notch1, Notch2, and Notch3 receptors.Biochem. Biophys. Res. Commun. 291, 775-779 (2002)) was introduced into the transient. In addition, as an internal control of the introduction efficiency, an experiment was conducted in which 20 ng of pRL-CMV vector (Promega) was introduced into the cells. As a control for the expression vector, the original vector not containing the above cDNA was introduced.
トランスフェクトしてから48時間経過後に、Lumat ＬＢ9507（Berthold社）を用いて蛍光強度を測定した（これを4〜5回繰り返した）。これらの結果は、図６に示す通りである。なお、統計解析にはt検定を用いた。 After 48 hours from the transfection, fluorescence intensity was measured using Lumat LB9507 (Berthold) (this was repeated 4 to 5 times). These results are as shown in FIG. Note that t-test was used for statistical analysis.
野生型のヒトCXorf6は、Hes1遺伝子プロモーター、Hes5遺伝子プロモーター及びHes7遺伝子プロモーターを活性化できるのに対し、性分化異常症の原因であるナンセンス変異（E124X、Q197X、R653X）を有するヒトCXorf6は、これら下流遺伝子のプロモーターを活性化しなかったが、性分化異常症の原因にならないミスセンス変異（P286S、Q507R、N589S）を有するヒトCXorf6遺伝子はこれらの下流遺伝子プロモーターを活性化することができた。 Wild-type human CXorf6 can activate the Hes1 gene promoter, Hes5 gene promoter and Hes7 gene promoter, whereas human CXorf6 with nonsense mutations (E124X, Q197X, R653X) that cause sexual differentiation disorders The human CXorf6 gene having a missense mutation (P286S, Q507R, N589S) that did not activate the downstream gene promoter but did not cause sexual differentiation abnormalities was able to activate these downstream gene promoters.
従って、ヒトCXorf6の第６５３番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域が、下流遺伝子の転写活性化能を有することが示された。このように、ヒトCXorf6遺伝子の下流遺伝子の発現はヒトCXorf6の転写活性化機能を反映するため、ヒトCXorf6の第６５３番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能の有無を、下流遺伝子の発現の有無によって調べることが可能である。さらに、下流遺伝子の活性化と性分化異常症の相関が観察され、性分化異常症が下流遺伝子の転写活性化の機能欠損によることが示された。 Therefore, it was shown that the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue of human CXorf6 has the ability to activate transcription of the downstream gene. Thus, since the expression of the downstream gene of human CXorf6 reflects the transcriptional activation function of human CXorf6, the presence or absence of the function of the peptide region on the C-terminal side from the 653rd amino acid residue of human CXorf6 is determined by the downstream gene. It is possible to examine by the presence or absence of the expression of. Furthermore, a correlation between activation of downstream genes and sexual differentiation abnormalities was observed, indicating that sexual differentiation abnormalities are due to functional deficiencies in downstream gene transcriptional activation.
Claims (19)
前記遺伝子マーカーが、CXorf6遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー。 A genetic marker that is an index of sexual differentiation disorder,
A gene marker, wherein the gene marker is a gene-related substance related to the CXorf6 gene.
請求項９に記載の遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含むことを特徴とする診断用キット。 A diagnostic kit for diagnosing sexual differentiation disorder,
A diagnostic kit comprising a hybridization probe capable of detecting the gene marker according to claim 9, a nucleotide sequencing primer, a PCR primer pair, or a specific antibody.
前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー。 A genetic marker for evaluating the function of a CXorf6 polypeptide,
The gene marker, wherein the gene marker is a gene-related substance related to any one of the Hes1 gene, the Hes5 gene, and the Hes7 gene.
前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー。 A genetic marker that is an index of sexual differentiation disorder,
The gene marker, wherein the gene marker is a gene-related substance related to any one of the Hes1 gene, the Hes5 gene, and the Hes7 gene.
請求項１６に記載の遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含むことを特徴とする診断用キット。 A diagnostic kit for diagnosing sexual differentiation disorder,
A diagnostic kit comprising a hybridization probe capable of detecting the gene marker according to claim 16, a primer for sequencing, a primer pair for PCR, or a specific antibody.
The diagnostic kit according to claim 18, wherein the sexual differentiation disorder is hypospadias.
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|---|---|---|---|---|
| US9175291B2 (en) | 2012-10-11 | 2015-11-03 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of androgen receptor expression |
| CN111751529A (en) * | 2020-05-12 | 2020-10-09 | 陕西中医药大学 | A kind of serum polypeptide marker P of tic disorder and its detection method |
-
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| CN111751529A (en) * | 2020-05-12 | 2020-10-09 | 陕西中医药大学 | A kind of serum polypeptide marker P of tic disorder and its detection method |
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