JP2006516410A

JP2006516410A - 発現プロファイリングのためのｃＤＮＡ増幅

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Publication number: JP2006516410A
Application number: JP2006503272A
Authority: JP
Inventors: ネルソン，ジョン
Original assignee: Amersham Biosciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 2003-02-03
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2006-07-06
Also published as: WO2004070053A2; US20040180372A1; EP1590470A2; EP1590470A4; US7309571B2; WO2004070053A3

Abstract

本発明は新規なｃＤＮＡ増幅方法に関する。ＲＮＡをまずｃＤＮＡに変換する。このｃＤＮＡの合成はプロモーター付加されたオリゴヌクレオチドを含み、次いでこのｃＤＮＡを連結して環状構造（又は場合によりコンカテマー構造を）形成する。次いでこれを、ローリングサークル増幅及び鎖置換増幅に基づくＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する。本発明は、ＲＮＡプロモーター配列をｃＤＮＡに連結させ、この増幅されたｃＤＮＡからのＲＮＡの生成を介した付加的な増幅を手助けする。得られる生成物は次いで遺伝子発現の研究用、又はその他のＲＮＡ分析手法用の材料作製に使用できる。

Description

本発明は概して核酸増幅及び発現プロファイリングの分野に関する。

核酸の指数関数的増幅のための多数の方法が開発されている。これらには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自立性塩基配列複製（３ＳＲ）、核酸配列性増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ、米国特許第６１２４１２０号）、及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ、米国特許第６１４３４９５号）が含まれる。

現在のＰＣＲ増幅方法は、プライマーの位置で開始するＤＮＡ複製が対象の核酸配列を複製し得るように、対象の核酸配列に隣接する領域にハイブリダイズする２つのプライマーの使用を伴う。

変性ステップとともにテンプレート鎖から複製鎖を分離することにより、同じプライマーを使用する複製をもう１サイクル行うことで、対象の核酸の幾何学的増幅をもたらすことができる。ＰＣＲ増幅は、増幅反応が連続的に進行しない、また核酸サンプルを一連の反応条件のもとで複数サイクルに供して行わねばならないという欠点を有する。

全ゲノムＰＣＲと呼ばれるＰＣＲ増幅変法は、同一のＰＣＲ反応において生物の全ゲノムを増幅するために、ランダム又は部分的ランダムプライマーの使用を伴う。この技法は、ゲノムＤＮＡ全体にわたり、中程度の間隔でプライマー対がハイブリダイズし得るように、十分な数のランダム又は部分的ランダム配列のプライマーが存在することに依存する。プライマーの位置で開始した複製は、次いで、もう一方のプライマーがハイブリダイズし得るオーバーラップ部位（重なり合う部分）の複製鎖を生じ得る。ゲノムサンプルを増幅サイクルに供することにより、ゲノム配列は増幅され得る。全ゲノムＰＣＲは、他の形態のＰＣＲと同様の欠点を有する。

増幅が特に関係する分野は、生物サンプル中の多くの異なるＲＮＡ分子種の相対濃度の測定を目的とするＲＮＡ発現プロファイリングである。対象のＲＮＡのいくつかは相対的に低濃度で存在し、分析に先立ちそれらを増幅することが望ましい。該ｍＲＮＡ混合物は複雑である（一般的に、５０００〜２００００の異なる分子種からなる）ことから、それらを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することは不可能である。ポリメラーゼ連鎖反応は、異なる分子種が異なる割合で増幅され、ｍＲＮＡの相対濃度を歪曲するという欠点を有する。

サンプル中の全ＲＮＡを同時に穏やかに増幅させることを可能にするいくつかの方法が記載されている。例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：１６７５−１６８０（１９９６）において、強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを各ｃＤＮＡ末端に取り込ませるようにして２本鎖ｃＤＮＡが合成された。次に、このプロモーター配列を用いてｃＤＮＡを転写し、各ｃＤＮＡ分子あたり約１００〜１５０のＲＮＡコピーを生成した。この弱い増幅系は、最低１０００個の細胞を含む生物学的サンプルのＲＮＡプロファイリングを可能にした。しかしながら、非常に数が少ない細胞を含むサンプルのプロファイリング分析を可能にし得る、より強力な増幅方法が必要とされている。また、多数の方法では、ｃＤＮＡ合成中に第１鎖を生成するために使用されるプライマーの５’末端に結合するＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用する。次いで、第２鎖が生成され、得られた２本鎖ｃＤＮＡが転写されて、発現試験のために使用し得るアンチセンスＲＮＡ転写物を生成する。しかし、増幅のレベルは非常に限られている。

従って、より信頼性が高く、短時間でより多量の増幅を行える増幅方法が求められている。この懸案事項に関しては、以下に詳細に取り扱う。
米国特許第６１２４１２０号明細書米国特許第６１４３４９５号明細書Ｌｏｃｋｈａｒｔｅｔ．ａｌ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：１６７５−１６８０（１９９６）

本発明は、ＲＮＡ配列の増幅レベルを顕著に増大させ得る新規なｃＤＮＡ増幅方法に関する。ｍＲＮＡをまずｃＤＮＡに変換する。このｃＤＮＡの合成はプロモーター付加されたオリゴヌクレオチドを含み、次いでこのｃＤＮＡを平滑末端にて連結して環状構造（又は場合によりコンカテマー構造を）形成する。次いでこれを、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにもとづくランダムプライムド鎖置換増幅方法（図１参照）を用いて増幅する（米国特許第６３２３００９、当該文献は参照により本明細書中に組み入れるものとする）。得られる生成物は次いで遺伝子発現試験の材料作製に使用できる。

この方法は少数の細胞からの遺伝子発現分析を可能にするよう設計されている。このタイプのサンプルから調整されるｃＤＮＡは非常に低濃度で、コンカテマー化が最も起こりにくく、その代わりにほとんどの部分でｃＤＮＡは環状化することになる。この環状化したｃＤＮＡを増殖に使用するテンプレートとする。実際、連結して環形成（モノマーサイズ）したｃＤＮＡは、コンカテマー化してもしなくても、ローリングサークル増幅及び／又は鎖置換増幅によって増幅可能である。これら両増幅方法は、鎖置換ＤＮＡ合成による増幅（ＡＳＤ）に依存し、この間に２本鎖テンプレートが、鎖を置換するポリメラーゼによって複製され、２本鎖テンプレートを変性させる温度サイクリングなしに、ポリマー化された材料を純量得ることができる。この方法論はランダムプライミング及び特異的プライミングされた増幅方法に対して適用できる。

１つの実施形態においては、ｍＲＮＡを複製しｃＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブリッドを作成する（第１ｃＤＮＡ鎖合成）。このｃＤＮＡ鎖を次いで連結し、コンカテマーを伴う、又は伴わない環（モノマーサイズ）を形成する。この連結はｃＤＮＡ合成の開始に使用するプライマーの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチドの添加により促進される（図５参照）。この連結された材料を次いでＡＳＤ（ローリングサークル増幅もしくは鎖置換増幅）により増幅することができる。この方法論はランダムプライミング及び特異的プライミングされた増幅方法に対して適用できる。

さらに、従来の方法論と異なり、本発明の方法では、プロモータータグを有するｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ連結のためのテンプレートに用い、連結を行って環もしくはコンカテマーのいずれか、あるいはそれらの混合物を形成し、これらを次いでローリングサークル増幅もしくは鎖置換増幅により増幅する（図２参照）。この増幅された材料は、次いで定量的研究に使用するため転写され、それによって現在入手できるものより多量の増幅を提供することができる。さらに、第１のｃＤＮＡ鎖合成の開始に用いるオリゴヌクレオチドがプロモータータグを付与されている場合、得られるＲＮＡはアンチセンスとなり、ある種の応用において有利である。

プロモータータグを有するｃＤＮＡ又はプロモータータグを有しないｃＤＮＡを作製するために用いるプライマーは、ＲＮＡのポリＡ尾部（ポリＡ尾部をアニ−ルするために）、又はＲＮＡ集団内の特異的配列に対し相補的になるよう設計される。これは第１又は第２のｃＤＮＡ鎖合成を開始するために使用することもできる。

さらに、この環状化もしくはコンカテマー化したｃＤＮＡの鎖置換増幅は、用いるテンプレートｃＤＮＡ単位の、端と端を接したコンカテマーを生じる。これらの単位はそれぞれ別々のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する。これらのコンカテマー化された単位からのオーバーラップ転写を防ぐため、ＲＮＡポリメラーゼの終止配列又はそれにかわる制限酵素認識配列が、第１ｃＤＮＡ鎖合成に用いるプライマー中で使用されるプロモーター配列の上流に含めることができる（図３及び図４参照）。このターミネーターは、上流のプロモーターからの読み合わせ転写による繰り返し転写によりｃＤＮＡに結果として起こる過剰な増幅を防ぎ得る。

さらに別の本方法の好ましい態様において、コンカテマー化ｃＤＮＡの鎖置換増幅（ＭＳＤＡ−ＣＤ）にならい、ｃＤＮＡの断片をまず、場合によりリンカーと共にコンカテマー化又は環状化する。このコンカテマー化又は環状化したＤＮＡを、次いで適切なプライマーを用いて鎖置換合成により増幅する。プライマーのランダムなセットが、全ゲノム増幅と類似の方法で、ＤＮＡコンカテマーのランダムプライム合成に使用できる。全ゲノム増幅においては、ランダム又は部分的にランダムな配列の、十分に大きなプライマーセットを選択することにより、このセットの中のプライマーは共同的かつランダムに、コンカテマー化ＤＮＡを通じて転写される核酸配列と相補的となるだろう。もしＤＮＡ断片をコンカテマー化するためにリンカーを使用すれば、リンカー配列に相補的な配列を、コンカテマーを増幅するために用いることができる。リンカーからの合成は、次のリンカーに対するコンカテマー化ＤＮＡ部分を通じて進行し、さらに継続する。リンカー領域を複製する時には、ＤＮＡ合成用の新たなプライミング部位が創り出される。このようにして、全コンカテマー化ＤＮＡサンプルの複数のオーバーラップするコピーを短時間で合成し得る。

環状標的ＤＮＡ分子を増幅する方法には価値がある。なぜなら、このような増幅されたＤＮＡは、ＤＮＡ配列解析、クローニング、マッピング、ジェノタイピング、プローブ作製及び診断的同定を含む次なる方法によく用いられるからである。

従来、核酸を増幅させ得るいくつかの有益な方法が開発されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ、ＬＣＲ）、自立性塩基配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、３ＳＲ）、核酸配列性増幅（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ）、及びＱベータレプリカ−ゼによる増幅（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ及びＭｕｓｈａｈｗａｒ，Ｊ．ＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，３５：１１７−１２６（１９９１）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔｉｃｓ，９：１９９−２０２（１９９３））を含むそのほとんどが、選択されたＤＮＡ標的及び／又はプローブの増幅を行い得るように設定されている。

加えて、プラスミドや、Ｍ１３などのバクテリオファージからのＤＮＡのような環状ＤＮＡ分子を増幅させるためのいくつかの方法が採用されている。ひとつはＥ．ｃｏｌｉの好適な宿主株にこれらの分子を増殖させ、次いでこのＤＮＡを良く確立されたプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８９，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に従って単離する方法である。プラスミドや、Ｍ１３などのバクテリオファージからのＤＮＡのようなＤＮＡ標的中の、決められた配列を増幅するためには、ＰＣＲもしばしば用いられる（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９０，Ｅｄ．Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ．）これらの方法のいくつかは困難であり、高価であり、時間を要し、不十分で、感度に乏しいことが難点となっている。

これらの方法の改善として、直鎖ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）は、環状標的ＤＮＡ分子に対しアニ−ルされたプライマーを用い、またＤＮＡポリメラーゼを添加する。この増幅標的（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｔａｒｇｅｔｃｉｒｃｌｅ、ＡＴＣ）は、新たなＤＮＡが作られるためのテンプレートを形成し、これによりプライマー配列を環に対し相補的な繰り返し配列の連続配列の形で延長させるが、１時間あたり数千コピーのみを生じる。ＬＲＣＡの改善は、指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）の使用であり、複製された相補的配列にアニ−ルする付加的なプライマーを伴って新たな増殖中心を提供し、それにより指数関数的反応速度論及び増幅の増大をもたらす。

指数関数的ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）は、ＨＲＣＡ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３１（１９９８））にならって鎖置換反応のカスケードを採用する。しかし、ＥＲＣＡは、プライマーＰ１に対し特異的なＤＮＡ配列を知る必要がある場合、環状ＤＮＡ標的分子が１本鎖ＤＮＡである必要性により、環状ＤＮＡ標的分子に対してアニ−ルさせたシングルプライマーＰ１のみを使用するという制限を有する。

本発明の方法（多重プライムドローリングサークル増幅、ＭＰＲＣＡ）は、個々の標的環増幅のために複数のプライマーを用いることで直鎖ローリングサークル増幅の感度を向上させる方法を採用することにより、このような不都合を解消する。本発明は各環状標的ＤＮＡ分子から複数のタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）のコピーを生じるという優位性を有する。加えてＭＰＲＣＡは、環状標的ＤＮＡ分子の配列が未知であり、さらに環状標的ＤＮＡ分子が１本鎖（ｓｓＤＮＡ）又は２本鎖（ｄｓＤＮＡ）である可能性があるいくつかの実施形態において優位性を有する。いくつかの実施形態における本発明のその他の優位性は、１本鎖又は２本鎖の環状標的ＤＮＡ分子の増幅が恒温的及び／又は室温で実施できるということである。

その他の有利な点としては、ローリングサークル増幅の新たな応用法として非常に有用であり、低価格で、標的の環が低濃度でも感度が良く、特に検出試薬の使用における柔軟性を有し、またコンタミネーションの危険が低いことが挙げられる。

本発明のいくつかの実施形態において、反応中に存在し得るエキソヌクレアーゼ活性による分解に対し耐性を有するプライマーを使用することにより、増幅ＤＮＡの収率を向上させる方法が採用される。例えば、プライマーは、その３’末端において１、２、３又は４個のホスホロチオエート連結を保持することができる。すなわち、いくつかの実施形態において、本発明は酵素による分解、特にエキソヌクレアーゼ、最も特別には３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性による分解に対し耐性を有するプライマーを作製する少なくとも１つのヌクレオチドをプライマーに含有させる方法に関する。このような実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドであるか、又はなんらかの修飾ヌクレオチドであり得る。このようなヌクレオチドは共通的であるが、本発明の方法はまた、このようなヌクレオチドが３’−末端部位以外の部位に配置され、上記プライマーの３’−末端ヌクレオチドが３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性により除去され得るような実施形態にも関する。このことは−エキソヌクレアーゼ活性を含み、長時間のインキュベーション時間をかけて行われ得る反応において、プライマーを残しつづけさせることができるという優位性を有する。このプライマーの維持は、ＥＲＣＡの特徴のひとつである反応の全体時間の延長に次いで起こる新たなプライミング事象を可能にし、増幅ＤＮＡの収率を向上させるという優位性を有する。

ランダムプライマーＲＣＡはまた、２本鎖生成物を生じるという優位性を有する。これは、環状のテンプレートによるコピー作製により生じる１本鎖ＤＮＡ自身が、ＤＮＡ合成のランダムプライミングにより変換され、２重鎖型となるであろうからである。２本鎖ＤＮＡ生成物は、いずれかの鎖のＤＮＡ配列解析、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び、クローニングや標識及び検出に使用するその他の方法を可能にすることにおいて優れている。２本鎖ＤＮＡ生成物はまた、ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎｖｉｔｒｏ転写を可能にさせることにおいて優れている。

鎖置換ＤＮＡ合成がランダムプライミングＲＣＡ中に起こり、指数関数的増殖をもたらし得るということも期待される。

増幅に続き、増幅された配列はＰＣＲ増幅配列に関し既知の確立されたあらゆる目的に関しても使用することができる。例えば、増幅された配列は蛍光標識、酵素に連関した検出系、抗体が介在する標識検出、及び放射活性標識などのあらゆる従来の核酸検出系を用いて検出可能である。開示された方法の鍵となる特徴は、増幅がサイクルの中において起こるのではなく、連続的な恒温的な複製により起こることである。このことが増幅を複雑なものでなくし、より一貫性のある増幅を可能にする。鎖置換によって、単一の、連続的、恒温的な反応において、核酸配列又はサンプルの複数のコピーが迅速に発生可能となる。開示された方法を用いて生産されるＤＮＡは、次いであらゆる目的、又はあらゆる所望の他の方法に関して使用できる。例えば、全ゲノム鎖置換法により予め増幅した特定のＤＮＡ配列をさらに増幅させるためにＰＣＲを使用することができる。

本発明の目的及び特徴は、添付の図面を伴って、以下の本発明の詳細な記述の概説によって、より十分に明確化される。

本発明の方法は、標的核酸配列及び全ゲノム又は他の高度に複雑な核酸サンプルの増幅を可能にする特定の１）材料及び２）方法を利用する。これらの材料及び方法について以下に詳細に記載する。

１．材料
標的配列
本発明の方法の増幅対象である標的配列は環状又はコンカテマー化ｃＤＮＡである。標的配列を含む核酸サンプルは単一細胞からの核酸サンプルであることができる。

アドレスタグ
プライマーの非相補的部分に含まれ得る配列のその他の例がアドレスタグである。アドレスタグはアドレスプローブに相補的な配列を有する。アドレスタグは、増幅される鎖の末端に取り込まれることになる。結果として得られる物は、アドレスプローブの相補的部分に相補的であるアドレスタグ配列を有する増幅されたＤＮＡである。プライマー上に存在する場合には、１以上のアドレスタグが存在し得る。好ましくは、プライマーは１又は２のアドレスタグを含む。最も好ましくは、プライマーは１のアドレスタグを含む。

一般的に、プライマーは１０以下のアドレスタグを含むことが好ましい。プライマーの大きさを除き、プライマー上に存在し得るアドレスタグの数には根本的な制限は存在しない。複数のアドレスタグが存在する場合、それらは同じ配列であってもよく、又は、それらは異なる配列であってもよく、異なるアドレスプローブに対して相補的なそれぞれ異なる配列を伴う。単一のアドレスプローブに対して全て相補的である同一の配列を有するアドレスタグをプライマーが含むことが好ましい。アドレスタグ部分は、アドレスタグとアドレスプローブとの間の特異的かつ安定したハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであることができる。この目的のために、１０〜３５のヌクレオチド長が好ましく、１５〜２０ヌクレオチド長のアドレスタグ部分が最も好ましい。

リンカー
ＤＮＡを連結させるために本発明において使用する場合、リンカーは小さな２本鎖ＤＮＡ分子である。ＳＤＡ−ＣＤのために、リンカーは２つの主要な目的を果たす：ＤＮＡ断片連結の容易化及び増幅の容易化である。第１の目的のために、リンカーは通常、連結させようとするＤＮＡ断片の末端と適合し得る末端を有するように設計される。例えば、ＤＮＡ断片が平滑末端を有する場合（又は平滑末端となるように作製された場合）、平滑末端化されたリンカーが使用される。１以上のヌクレオチドからなる尾部を有するＤＮＡ断片に対しては、リンカーは相補的な尾部を有する必要がある。かかる尾部形成の例は、ｃＤＮＡの３’末端への単一のアデノシン残基の付加である。増幅を容易にするために、リンカーは、ＭＳＤＡ−ＣＤで使用されるプライマーに相補的な１以上の配列を有する必要がある。かかる配列はリンカーのプライマー相補的部分と呼ばれる。リンカーのプライマー相補的部分は、プライマーの相補的部分に相補的である。プライマー相補的部分は、それが意図されたプライマーの部分に相補的であるかぎり、任意の配列を有することができる。プライマー相補的部分がリンカーの逆鎖上にある場合、それらは重なり合うべきではない。該プライマーは１以上の制限酵素切断部位を有することもできる。かかる制限部位は、増幅されたＤＮＡが切断されて断片化されることを可能にし、好ましくは、元々コンカテマー化されているＤＮＡ断片が断片化されることを可能にする。この目的のために、希少な制限部位（例えば、８塩基認識部位）が使用されるのが好ましい。このタイプのリンカーの構造例を以下に示す。

リンカーは１以上のプロモーター配列を含むこともできる。かかるプロモーター配列は、増幅されたＤＮＡがＭＳＤＡ−ＣＤ後の転写によるさらなる増幅を可能にする。２つのプロモーターがリンカー内に組み込まれる場合、それらは好ましくはリンカーの異なる鎖に位置する。両方の３’末端に単一の突出するチミジン残基を有し、両方の５’末端にリン酸基を有するリンカーの例を以下に示す（Ｐはリン酸エステルを示す）。

プロモーター及びプライマー配列は任意の順序で並ばせることができるが、上記した並び方が好ましい。任意の数のプロモーター及びプライマーを使用することができる。しかしながら、コンカテマー化させるＤＮＡがｃＤＮＡであり、ｃＤＮＡ合成のために使用されるプライマーの部分としてのｃＤＮＡにプロモータが組み込まれる場合が好ましい（Ｌｏｃｋｈａｒｔら）。

検出標識
本発明の方法を用いて増幅された核酸の検出及び定量を補助するために、検出標識を増幅される核酸に直接取り込ませるか、又は検出分子と結合させることができる。本明細書中で使用する場合、検出標識とは、増幅される核酸と直接的又は間接的に結合させることができ、それにより直接的又は間接的に測定可能・検出可能なシグナルを生じ得る任意の分子である。

核酸分子に取り込ませるための、又は核酸プローブと結合させるためのかかる標識の多くが当業者に公知である。本発明の方法で使用するのに適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光性分子、リン光発生分子、酵素、抗体、及びリガンドである。

好適な蛍光標識の例としては、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニリノドール（ＤＡＰＩ）、及びシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７を挙げることができる。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）及びローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。好ましい蛍光標識は、ＦＩＴＣ及びシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７である。これらの蛍光物質についての吸収及びエミッションの最大（波長）はそれぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ：７０３ｎｍ）、及びＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがってそれらの同時検出が可能となる。蛍光標識は様々な商業的供給源から入手することができ、かかる供給源の例として、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ及びＲｅｓｅａｒｃｈＯｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏを挙げることができる。

標識したヌクレオチドは、合成中に増幅産物中に直接取り込ませることができることから、好ましい形態の検出標識である。増幅されるＤＮＡ又はＲＮＡへ取り込ませることができる検出標識の例として、ＢｒｄＵｒｄ（Ｈｏｙ及びＳｃｈｉｍｋｅ，ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ２９０：２１７−２３０（１９９３））、ＢｒＵＴＰ（Ｗａｎｓｉｃｋら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ１２２：２８３−２９３（１９９３））などのヌクレオチドアナログ、及びビオチンで修飾されたヌクレオチド（Ｌａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６６３３（１９８１））又はジゴキシゲニンなどの適当なハプテンで修飾されたヌクレオチド（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））を挙げることができる。好適な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセインイソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰ及びシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））である。ＤＮＡに対する好ましいヌクレオチドアナログ検出標識はＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲトリホスフェート，Ｓｉｇｍａ）であり、ＲＮＡに対する好ましいヌクレオチドアナログ検出標識はビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェート（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３、及びＣｙ５は直接標識のためにｄＵＴＰに結合させることができる。Ｃｙ３．５及びＣｙ７は、ビオチン又はジゴキシゲニン標識したプローブの２次検出のためのアビジン又は抗ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利用することができる。

増幅される核酸に取り込まれる検出標識（例えばビオチン）は、当技術分野で周知の感知方法を用いて、続いて検出することができる。

例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ社）を用いて検出することができる。該コンジュゲートは、ビオチンと結合し、次いで、適正基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：２ナトリウム，３−（４−メトキシスピロ−［１，２，ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１．ｓｕｐ．３７］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート、Ｔｒｏｐｉｘ社）の化学発光により検出される。

増幅ＲＮＡの検出に使用するための好ましい検出標識は、アクリジニウム−エステル−標識ＤＮＡプローブ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ社、Ａｒｎｏｌｄら，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：１５８８−１５９４（１９８９）に記載されているようなもの）である。ハイブリダイズしていないプローブをアルカリで破壊することができることからアクリジニウム−エステル−標識検出プローブにより、洗浄することなく、増幅されたＲＮＡの検出が可能になる（Ａｒｎｏｌｄら（１９８９））。

２以上のこれらの検出標識を組み合わせた分子も検出標識として考えられる。本発明の方法を用いて増幅される核酸を標識及び検出するために、本発明のプローブ、タグ、及び方法とともに公知の検出標識のいずれも使用することができる。検出標識によって生成されるシグナルを検出及び測定するための方法も当業者には公知である。例えば、放射性同位体はシンチレーション計測又は直接的視覚化により検出することができ；蛍光分子は蛍光分光光度計により検出することができ；リン光分子は、分光光度計を用いて検出するか、又はカメラを用いて直接視覚化することができ；酵素は、酵素によって触媒される反応の生成物を検出又は視覚化することにより検出することができ；抗体は、抗体と結合した２次検出標識を検出することにより、検出することができる。本明細書中で使用する場合、検出分子とは、増幅される核酸分子と相互作用し、かつ、１以上の検出標識と結合する分子である。

検出プローブ
検出プローブは、増幅される核酸分子上の検出タグに相補的な配列を有する、標識されたオリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的部分は、検出プローブと検出タグとの間の特異的かつ安定したハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであることができる。この目的のためには、１０〜３５個のヌクレオチド長が好ましく、検出プローブの相補的部分が１６〜２０個のヌクレオチド長であるのが最も好ましい。検出プローブは上記検出標識のいずれも含むことができる。好ましい標識はビオチン及び蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは分子ビーコンである。

分子ビーコンは、検出プローブがハイブリダイズする時のみ蛍光部分が蛍光を発する該蛍光部分を用いて標識された検出プローブである（Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０９（１９９５））。ハイブリダイズしていない検出プローブはシグナルを生成しないことから、標識検出に先立つハイブリダイズしていないプローブの除去が、かかるプローブの使用により必要でなくなる。このことは、複合アッセイにおいて特に有用である。

アドレスプローブ
アドレスプローブは、プライマー上のアドレスタグに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的部分は、アドレスプローブとアドレスタグとの間の特異的かつ安定したハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであることができる。この目的のためには、１０〜３５個のヌクレオチド長が好ましく、アドレスプローブの相補的部分が１２〜１８個のヌクレオチド長であるのが最も好ましい。アドレスプローブは、単一の相補的部分又は複数の相補的部分を含むことができる。好ましくは、アドレスプローブは、固相支持体に直接的に又はスペーサー分子を介して結合している。アドレスプローブと固相支持体のかかる組み合わせは好ましい形態の固相検出装置である。

オリゴヌクレオチド
プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、及びいずれの他のオリゴヌクレオチドも、確立されたオリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドを生成又は合成するための方法は当技術分野において周知である。かかる方法は、標準的な酵素による消化に次ぐヌクレオチド断片の単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第５章、第６章を参照されたい）から、例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ又はＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍ１ＰｌｕｓＤＮＡ合成装置（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡの自動合成装置Ｍｏｄｅｌ８７００又はＡＢＩＭｏｄｅｌ３８０Ｂ）を用いるシアノエチルホスホルアミダイト法による純粋な合成方法に及ぶ。また、オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成方法が、Ｉｋｕｔａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（ホスホトリエステル及びホスファイト−トリエステル法）及びＮａｒａｎｇら，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０）（ホスホトリエステル法）により記載されている。蛋白核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）に記載されているような公知の方法を用いて作製することができる。

本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドの多くが、安定したハイブリッドがそれらの間で形成され得るように、他のオリゴヌクレオチド又は核酸分子の特定の部分と相補的となるように設計される。これらのハイブリッドの安定性は、ＬｅｓｎｉｃｋとＦｒｅｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１０８０７−１０８１５（１９９５）、ＭｃＧｒａｗら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ８：６７４−６７８（１９９０）、及びＲｙｃｈｌｉｋら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：６４０９−６４１２（１９９０）に記載されているもののような公知の方法を用いて計算することができる。

固相検出装置
固相検出装置は、アドレスプローブ又は検出分子が結合している固体の担体又は支持体である。好ましい形態の固相検出装置はアレイ検出装置である。アレイ検出装置は、複数の異なるアドレスプローブ又は検出分子がアレイ状、グリッド状、又は他の系統立ったパターンで結合している固相検出装置である。

固相検出装置において使用するための固相担体は、オリゴヌクレオチドが結合し得るいずれの固相担体も含むことができる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、酢酸ポリエチレンビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸などの物質が含まれる。固相担体は、薄膜もしくは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、ファイバー、ウーブン・ファイバー、成形ポリマー、粒子及び微粒子などのいずれの有用な形態を示し得る。固相担体のための好ましい形態はマイクロタイターディッシュである。最も好ましい形態のマイクロタイターディッシュは標準的９６ウェル型である。

固相担体上に固定化されたアドレスプローブによって、固相検出装置上で本発明の増幅方法による生成物の捕捉が可能になる。かかる捕捉によって、続く検出ステップを妨害し得る反応成分の簡便な洗浄手段が提供される。固相検出装置の異なる領域に異なるアドレスプローブを結合させることにより、固相検出装置上の異なる位置に、したがって診断的位置に、異なる増幅生成物が捕捉され得る。

例えば、マイクロタイタープレート複合アッセイにおいて、増幅される９６種類までの異なる核酸（それぞれが、異なるプライマーセットを介して増幅される、異なる標的配列を表す）のための特異的なアドレスプローブは、マイクロタイタープレート上（各々異なるウェル中）に固定化することができる。対応する標的配列がサンプル中に存在した場合の、増幅された核酸が対応するウェル中にのみ捕捉と検出が行われる。

固相担体へのオリゴヌクレオチドの固定化方法は十分に確立されている。オリゴヌクレオチド（アドレスプローブ及び検出プローブを含む）は、確立された結合方法を用いて、担体に結合させることができる。例えば、好適な結合方法は、Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）、及びＫｈｒａｐｋｏら，ＭｏｌＢｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）によって記載されている。カゼイン被覆したスライド上で３’−アミンオリゴヌクレオチドを固定化するための方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６３７９−６３８３（１９９５）によって記載されている。オリゴヌクレオチドを固相担体へ結合させる好ましい方法は、Ｇｕｏら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）によって記載されている。

固相サンプル
固相サンプルは、標的配列が結合又は付着している固相担体又は支持体である。標的配列は、好ましくは、標的サンプル又はアッセイサンプル中に送達される。好ましい形態の固相サンプルはアレイサンプルである。アレイサンプルは、複数の異なる標的配列がアレイ状、グリッド状、又は他の規則的なパターンで結合又は付着している固相サンプルである。

固相サンプル中で使用するための固相担体は、標的配列が結合又は付着し得るいずれの固相担体も含むことができる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、酢酸ポリエチレンビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸などの物質が含まれる。固相担体は、薄膜もしくは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、スライド、ファイバー、ウーブン・ファイバー、成形ポリマー、粒子及び微粒子などのいずれの有用な形態を示し得る。固相担体のための好ましい形態はマイクロタイターディッシュ及びガラススライドである。最も好ましい形態のマイクロタイターディッシュは標準的９６ウェル型である。

固相担体上に固定化された標的配列によって、固相担体上に局在する標的特異的な増幅核酸の形成が可能になる。かかる局在化によって、続く検出ステップを妨害し得る反応成分の簡便な洗浄手段と、複数の異なるサンプルを同時にアッセイする簡便な方法、が提供される。増幅された核酸は、異なるサンプルが付着しているそれぞれの部位で独立して形成され得る。固相サンプルを作製するため標的配列又は他のオリゴヌクレオチド分子を固定化するために、上記方法を使用することができる。

好ましい形態の固相担体は、最大２５６の別々の標的サンプルが小さなドットのアレイとして付着しているガラススライドである。各ドットは、好ましくは直径０．１〜２．５ｍｍであり、最も好ましくは直径約２．５ｍｍである。かかるマイクロアレイは、例えば、Ｓｃｈｅｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４８７−４７０（１９９５）によって記載されている方法を用いて、製造することができる。簡潔に言うならば、マイクロアレイは、ポリ−Ｌ−リジンがコーティングされた顕微鏡スライド（Ｓｉｇｍａ）上に、印刷用チップを１つ備えたアレイ作製装置を用いて作製することができる。１μｌのＤＮＡサンプル（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートから、チップに充填し、所望の間隔で複数のスライド上に、スライドあたり約０．００５μｌ沈着させる。次いで、印刷されたスライドは、湿潤チャンバ内で２時間再水和させ、１００℃にて１分間素早く乾燥させ、０．１％ＳＤＳ中ですすぎ、かつ、５０％１−メチル−２−ピロリジンオンと５０％ホウ酸からなるバッファー中で調製した０．０５％無水コハク酸を用いて処理した。次いで、スライド上のＤＮＡは、例えば、使用する直前に、９０℃にて２分間蒸留水中で変性させることができる。マイクロアレイ固相サンプルは、例えば、コンピュータ制御されたＸＹステージ及び顕微鏡対物を備えたレーザー蛍光スキャナーを用いてスキャンすることができる。混合ガス・マルチラインレーザーが複数の発色団の逐次的励起を可能にする。

ＤＮＡポリメラーゼ
複数置換増幅において有用なＤＮＡポリメラーゼは、単独で、又は適合する鎖置換因子と組み合わせて、複製中に現れるハイブリダイズ鎖を置換できなければならない。かかるポリメラーゼを本明細書中では鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと呼ぶ。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは５’から３’方向へのエキソヌクレアーゼ活性を有しないことが好ましい。鎖置換は、標的配列の複数のコピーが合成されるために必要である。５’から３’方向へのエキソヌクレアーゼ活性が存在する場合、それは合成された鎖の分解をもたらし得る。本発明の方法で使用するためのＤＮＡポリメラーゼは反応性が高いことも好ましい。本発明の方法で使用するためのＤＮＡポリメラーゼの適合性は、鎖置換複製を実行するその能力を評価することにより容易に測定することができる。好ましい鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、ＢｓｔラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｏ（−）Ｂｓｔ；Ａｌｉｏｔｔａら，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１２：１８５−１９５（１９９６））及びｅｘｏ（−）ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ（Ｗａｌｋｅｒ及びＬｉｎｎ，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４２：１６０４−１６０８（１９９６））である。他の有用なポリメラーゼの例としては、バクテリオファージｐｈｉ．２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｌａｎｃｏらによる米国特許第５１９８５４３号及び同第５００１０５０号）、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｇｅｎｅ８４：２４７（１９８９））、ファージｐｈｉ．ＰＲＤ１ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：８２８７（１９８７））、ｅｘｏ（−）ＶＥＮＴ．ＲＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｊａｃｏｂｓｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：６２３−６２７（１９７４））、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら，Ｇｅｎｅ９７：１３−１９（１９９１））、シーケナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＰＲＤ１ＤＮＡポリメラーゼ（ＺｈｕとＩｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−２７６（１９９４））、及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（ＫａｂｏｏｒｄとＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４９−１５７（１９９５））を挙げることができる。

鎖置換は、ヘリカーゼなどの鎖置換因子を使用することによって容易にすることができる。鎖置換因子の存在下で鎖置換複製を実行し得るいずれのＤＮＡポリメラーゼも、たとえＤＮＡポリメラーゼがかかる因子の非存在下では鎖置換複製を実行しなくても、本発明の方法で使用するのに適している、と考えられる。鎖置換複製において有用な鎖置換因子としては、例えば、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６７（１２）：７６４８−７６５３（１９９３））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ及びｖａｎｄｅｒＶｌｉｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６８（２）：１１５８−１１６４（１９９４））、単純ヘルペスウルスタンパク質ＩＣＰ８（Ｂｏｅｈｍｅｒ及びＬｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６７（２）：７１１−７１５（１９９３）；Ｓｋａｌｉｔｅｒ及びＬｅｈｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（２２）：１０６６５−１０６６９（１９９４））、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；Ｒｉｇｌｅｒ及びＲｏｍａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−８９１９（１９９５））、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質（Ｖｉｌｌｅｍａｉｎ及びＧｉｅｄｒｏｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：１４３９５−１４４０４（１９９６））、ならびにウシ胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌら，Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６７：１３６２９−１３６３５（１９９２））を挙げることができる。

鎖置換複製を実行するためのポリメラーゼの能力は、鎖置換複製アッセイにおけるポリメラーゼを使用することにより測定することができる。かかるアッセイは、使用する酵素が至適活性となる温度にて実行する必要があり、例えば、ｐｈｉ．２９ＤＮＡポリメラーゼについては３２℃、ｅｘｏ（−）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼについては４６℃〜６４℃、又は、好高温性生物からの酵素については約６０℃〜７０℃にて実行する必要がある。６０℃〜７０℃の範囲で行うアッセイのためには、プライマーの長さは、ランダムプライマーについては２０塩基まで、又は特異的プライマーについては２２塩基まで増加させることができる。ポリメラーゼを選択するための別の有用なアッセイは、Ｋｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３）によって記載されているプライマーブロックアッセイである。該アッセイは、伸長するプライマーの上流に、プライマー伸長の進行をブロックするようにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが存在又は非存在する中でＭ１３ｓｓＤＮＡテンプレートを用いる、プライマー伸長アッセイからなる。本アッセイにおけるブロッキングプライマーを置換し得る酵素は、本発明の方法に対して有用である。

上記材料は、本発明の方法を実行するための有用なキットとして、いずれか好適に組み合わせた状態で一緒に梱包することができる。

２．方法
本発明の方法は、複数のプライマーによる核酸配列の鎖置換複製に基づく。該方法は、１以上の特定の配列（鎖置換増幅）、又は高度に複雑な他のｃＤＮＡ、又はコンカテマー化もしくは環状化されているｃＤＮＡを増幅するために使用することができる。本発明の方法は、概して、標的核酸配列へのプライマーのハイブリダイゼーションと、標的配列の複製が標的配列に相補的な複製鎖を生じ得るような、ハイブリダイズしたプライマーによってプライミングされた標的配列の複製とを伴う。

複製中、成長する複製鎖が、別の複製鎖と標的配列とを（又は別の複製鎖とを）鎖置換複製により置換する。かかる複製鎖置換の例は、米国特許第６３２３００９号中に記載されている。本明細書中で使用する場合、複製鎖とは、標的配列又は別の複製鎖にハイブリダイズしたプライマーの伸長から生じる核酸鎖のことである。鎖置換複製とは、複製鎖の成長する末端がテンプレート鎖（もしくはその他の複製鎖）に由来する別の鎖と遭遇し、置き換わるＤＮＡ複製を意味する。他の複製鎖による複製鎖の置換は、単一の恒温反応において標的配列の複数のコピーを生成させ得る本発明の方法の顕著な特徴である。

増幅に続いて、増幅された配列は、いかなる目的（例えば、ＰＣＲ増幅配列のための公知の確立されたいずれかの用途）のためにも使用することができる。例えば、増幅された配列は、従来の核酸検出系（例えば、蛍光標識の検出、酵素に連関した検出系、抗体介在性標識検出、及び放射活性標識の検出）のいずれかを用いることにより検出することができる。本発明の方法の鍵となる特徴は、増幅がサイクルで行われるのでなく連続的に恒温状態で行われるということである。このことにより、増幅の複雑さは減少し、生成量はより一貫したものとなる。鎖置換は、単一の連続的恒温反応状態において、複数コピーの核酸配列又はサンプルの迅速な生成を可能にする。さらに、増幅された配列は、遺伝子発現分析に適した材料を作製するために使用することができる。これには、遺伝子発現分析を行うために使用されるマイクロアレイ分析及び他の定量的方法が含まれる。増幅産物は、選択的スプライシング転写産物、編集後ＲＮＡ配列を調べるために、及び遺伝子クローニング実験のために使用することができる。

ＳＤＡに使用されるプライマー対は、プライマーが核酸サンプル内で所望の間隔でハイブリダイズすることが可能な配列組成を有し、かつ、かかる濃度で使用されるのが好ましい。例えば、プライマー対がハイブリダイズすることができるような濃度（平均して４０００〜８０００塩基ごと）でプライマー対を使用することにより、これらの部位で開始されるＤＮＡ複製は隣接する部位に伸長し、該部位から複製される鎖と置換する。該プライマーは標準的間隔で標的配列にハイブリダイズすることは予想されないことに留意すべきである。むしろ、平均間隔がプライマー濃度の一般的機能となり得る。

鎖置換増幅の場合と同様に、隣接鎖の置換により、別のプライマーとのハイブリダイゼーション及び続くさらなる１ラウンドの複製の開始が可能となる。プライマー対が標的配列にハイブリダイズする場合、プライマーの間隔が増幅レベルを決定する。例えば、平均間隔が短い場合、隣接鎖は迅速かつ高頻度で置換される。平均間隔が長い場合、隣接鎖は、複製の実施が長かったときのみ置換される。

本発明の方法においてＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの伸長と、６００００ヌクレオチド長以上の分子が生成されるように所望の限り長く進行させる進行性鎖置換重合反応における鎖置換を触媒する。好ましい鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｏ（−）Ｂｓｔ）、ｅｘｏ（−）ＢｃａＤＮＡポリメラーゼの大きな断片、バクテリオファージｐｈｉ．２９のＤＮＡポリメラーゼ、及びシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）である。鎖置換複製中、反応で生成されるＤＮＡを標識するために、ブロモデオキシウリジントリホスフェートなどの放射性の、又は修飾されたヌクレオチドをさらに含ませてもよい。あるいは、ビオチン化ヌクレオチドなどの結合部分を提供する適切な前駆物質を含ませてもよい（Ｌａｎｇｅｒら（１９８１））。

連結ＤＮＡの鎖置換増幅
本発明の方法の別の好ましい形態（コンカテマー化されたＤＮＡの鎖置換増幅（ＭＳＤＡ−ＣＤ）と呼ばれる）において、コンカテマー化されたＤＮＡが増幅される。好ましい形態のコンカテマー化されたＤＮＡはコンカテマー化されたｃＤＮＡである。．コンカテマー化されたＤＮＡは、全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）の場合と同様にランダム又は部分的ランダムなプライマー対を用いて、又は、コンカテマー化されたＤＮＡの状態の特異的ハイブリダイゼーション標的に相補的な特異的プライマーを用いて、増幅することができる。ＭＳＤＡ−ＣＤは、比較的短い核酸サンプル（すなわち、一般的に１００〜６０００ヌクレオチドの範囲の断片）の複雑な混合物又はサンプルの増幅のために好ましい。メッセンジャーＲＮＡは、かかる複雑な混合物の最も重要な例である。ＭＳＤＡ−ＣＤは、細胞中の全てのｃＤＮＡを同様に増幅させる手段を提供する。コンカテマー化されたｃＤＮＡを１００倍以上に増幅させることができることから、ＭＳＤＡ−ＣＤは、わずか数個の細胞に基づいてＲＮＡプロファイリング分析を可能にする。ＭＳＤＡ−ＣＤを実施するために、ＤＮＡを最初にコンカテマー化ステップに供する必要がある。ＲＮＡサンプル（例えばｍＲＮＡ）を増幅する場合、標準的方法を用いてＲＮＡを最初に２本鎖ｃＤＮＡに変換する。該ｃＤＮＡ、又は増幅しようとするいずれかのＤＮＡ断片のセットを、次に、潜在的にリンカーが取り込まれるＤＮＡコンカテマーに変換する。

ＤＮＡ断片は標準的条件を用いて連結させることによりコンカテマー化させることができる。ＤＮＡをコンカテマー化する場合、ＤＮＡ断片の末端の状態（例えば、平滑型、ねじれ型、又は不規則型）を考慮する必要がある。例えば、制限酵素による消化によって生成されるもののようなねじれ型末端は、突出配列と適合性を有する場合に、コンカテマー化を仲介するために使用することができる。ねじれ型又は不規則型末端を有するＤＮＡは、連結させる前に平滑末端化することができる。これらの操作の全てが周知なものでありかつ一般的に使用されるものである。リンカーを使用する場合、リンカーは平滑末端ＤＮＡに連結させるか（平滑末端リンカーを使用する）、突出末端に適合性を有するＤＮＡに連結させることができ、この場合、リンカーはアダプターの形態をとることができる。

ＲＣＡのローリングサークル複製ステップにおいて有用なＤＮＡポリメラーゼは、プライミングされた１本鎖環（又は２重鎖基質の各鎖）のローリングサークル複製を行う必要がある。かかるポリメラーゼは本明細書中においてローリングサークルＤＮＡポリメラーゼと呼ぶ。ローリングサークル複製のためには、ＤＮＡポリメラーゼが、テンプレート鎖と相補的な鎖を置換（鎖置換と呼ばれる）することができ、かつ、５’から３’方向へのエキソヌクレアーゼ活性を有しないことが好ましい。増幅標的環（ＡＴＣ）の複数タンデムコピーを合成するために鎖置換が必要である。５’から３’方向へのエキソヌクレアーゼ活性が存在する場合には、合成された鎖の分解が生じ得る。本発明の方法で使用するためのＤＮＡポリメラーゼは反応性が高いことも好ましい。本発明の方法で使用するためのＤＮＡポリメラーゼの適合性は、ローリングサークル複製を実行するその能力を評価することにより容易に測定することができる。好ましいローリングサークルＤＮＡポリメラーゼ（これらの全てが３’，５’−エキソヌクレアーゼ活性を有する）の例としては、バクテリオファージｐｈｉ．２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｌａｎｃｏらによる米国特許第５１９８５４３号及び同第５００１０５０号）、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｇｅｎｅ８４：２４７（１９８９））、ファージＰＲＤ１ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：８２８７（１９８７）、ならびにＺｈｕ及びＩｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−２７６（１９９４））、ＶＥＮＴ．ＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｊａｃｏｂｓｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：６２３−６２７（１９７４））、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら，Ｇｅｎｅ９７：１３−１９（１９９１））、ならびにＴ４ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ及びＢｅｎｋｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４９−１５７（１９９５））を挙げることができる。ｐｈｉ．２９ＤＮＡポリメラーゼが最も好ましい。同様に好ましいポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７ｎａｔｉｖｅポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ（Ｔｔｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５７４４３１２号）、及び、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。同様に好ましいｐｈｉ．２９型ＤＮＡポリメラーゼは、以下に示すファージのＤＮＡポリメラーゼから選択される：ｐｈｉ．２９、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、ｐｈｉ．１５、ｐｈｉ．２１、ＰＺＥ、ＰＺＡ、Ｎｆ、Ｍ２Ｙ、Ｂ１０３、ＳＦ５、ＧＡ−１、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、及びＬ１７。特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはバクテリオファージｐｈｉ．２９ＤＮＡポリメラーゼであり、この場合、複数のプライマーがエキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を示し、かつ、標的ＤＮＡが直鎖ＤＮＡ、特に高分子量かつ／又は複雑な直鎖状ｃＤＮＡである。

ＲＣＡ中の鎖置換は、特にテンプレートとして２重鎖ＡＴＣが利用できる場合、ヘリカーゼなどの鎖置換因子を使用することによって容易にすることができる。通常、鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を実行し得るいずれのＤＮＡポリメラーゼも、たとえＤＮＡポリメラーゼがかかる因子の非存在下ではローリングサークル複製を実行しなくても、本発明の方法で使用するのに適している。ＲＣＡに有用な鎖置換因子としては、例えば、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６７（１２）：７６４８−７６５３（１９９３））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ及びｖａｎｄｅｒＶｌｉｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６８（２）：１１５８−１１６４（１９９４））、単純ヘルペスウィルスタンパク質ＩＣＰ８（Ｂｏｅｈｍｅｒ及びＬｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６７（２）：７１１−７１５（１９９３）；Ｓｋａｌｉｔｅｒ及びＬｅｈｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（２２）：１０６６５−１０６６９（１９９４））、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；Ｒｉｇｌｅｒ及びＲｏｍａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−８９１９（１９９５））、ならびにウシ胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌら，Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６７：１３６２９−１３６３５（１９９２））を挙げることができる。

ローリングサークル複製を行うためのポリメラーゼの能力は、Ｆｉｒｅ及びＸｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：４６４１−４６４５（１９９５）中及びＬｉｚａｒｄｉ（米国特許第５８５４０３３号、例えば、当該特許文献中の実施例１）中に記載されているもののようなローリングサークル複製アッセイ中でポリメラーゼを試験することにより測定することができる。

３．修飾及び付加的な操作
増幅生成物の検出
増幅生成物は直接的に、例えば１次標識又は２次標識により、以下に記載するように検出することができる。

Ａ．１次標識
１次標識は蛍光性ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、又はブロモデオキシウリジンなどの標識分子の、鎖置換複製の間における取り込みからなる。例えば、１００ヌクレオチドごとに４アナログという頻度で、シアニン色素ＵＴＰアナログを取り込ませることができる（Ｙｕら（１９９４））。ｉｎｓｉｔｕにおける、増幅された核酸の好適な検出方法は、増幅中にＤＮＡをＢｒｄＵｒｄで標識し、次いで、取り込まれたＢＵＤＲをビオチン化抗−ＢＵＤＲ抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｓ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）と結合させ、このビオチン分子とストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）とを結合させて、最終的にフルオレセイン−チラミド（ＤｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．，ＭｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＤｅｐｔ．）を用いて蛍光を生じさせる方法である。

Ｂ．検出用プローブによる２次標識
増幅されたＤＮＡ又はＲＮＡを検出するために、２次標識は、検出用プローブとして参照される好適な分子プローブの使用を含む。例えば、プライマーは、非相補的部分において、検出タグを参考にして既知の任意の配列を含むように設計することができる。２次ハイブリダイゼーションのステップは、これらの検出タグに対して検出用プローブを結合させるために用いられる。この検出用プローブは上記される、例えば酵素、蛍光性分子、又は放射活性同位体などで標識しうる。１つのプライマーあたり３つの検出タグを用い、各検出プローブあたり４つの蛍光性分子を用いることで、各複製鎖に対し合計１２の蛍光シグナルを得ることができる。

Ｃ．多重化及びハイブリダイゼーションアレイ検出
増幅した核酸の検出は、各セットが異なる標的配列を増幅するため設計された、異なるプライマーの複数セットを用いて多重化することができる。標的を見つけることができるそれらのプライマーのみが増幅生成物を生じさせ得る。

固相検出装置における固定化された位置に対する、任意の増幅された核酸を捕捉するために２つの異なる方法がある。１つは、これらのプライマーにおける非相補的部位の内部に、特有のプライマーセットの各々に特有のアドレスタグ配列を組み込むことである。任意のプライマーセットを用いて増幅された核酸は、すなわち特異的なアドレスタグ配列に相当する配列を含むことになる。第２の好ましい別の方法は、標識配列内に存在する配列をアドレスタグとして使用する方法である。

Ｄ．酵素と連関した検出
標識されたヌクレオチドの取り込みにより標識された増幅配列は、すでに確立された酵素と連関した検出系により検出することができる。例えば、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の取り込みにより標識された増幅核酸は以下のように検出可能である。増幅核酸中に存在する標的配列（又はその相補体）に対し相補的な、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（アドレスプローブ）とのハイブリダイゼーションによって、この核酸を硬いガラス表面に固定化する。ハイブリダイゼーション後、このガラス製スライドを洗浄し、アルカリホスファターゼ−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ社，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）と接触させる。この酵素−ストレプトアビジンコンジュゲートは、増幅された核酸上のビオチン分子と結合する。このスライドを再洗浄し、過剰の酵素コンジュゲートを除去し、化学発光基質ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ社）を添加してガラス製カバースリップでカバーする。次いでこのスライドをＢｉｏｒａｄＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒにおいてイメージ化する。

直鎖置換増幅
標識配列の直線的増幅をもたらす改変型の鎖置換増幅を実施することができる。この改変法は直鎖置換増幅（ＬＳＤＡ）を参考にし、全てのプライマーが標的配列の同鎖に対して相補的であるプライマーセットを用いることで実現される。ＬＳＤＡにおいては、ＭＳＤＡにおける場合と同様、プライマーセットは標的配列とハイブリダイズし、鎖置換増幅が起こる。しかし、標的配列の一方の鎖しか複製されない。ＬＳＤＡは複製の各ラウンドの間に、新たなプライマーセットを標的配列にハイブリダイズさせるための温度サイクリングを必要とする。このような温度サイクリングはＰＣＲにおいて使用されるものと類似する。しかし、直鎖、又はシングルプライマー、ＰＣＲに似ず、ＬＳＤＡにおける複製の各サイクルは、標的配列の複数のコピーを生じる。用いるプライマーに対し、１コピーが作られる。従って、もし２０のプライマーをＬＳＤＡで使用すれば、複製の各サイクルにおいて２０コピーの標的配列が作られる。

ＭＳＤＡ及びＷＧＳＤＡを用いて増幅されたＤＮＡは、さらに転写により増幅され得る。この目的に関し、鎖置換増幅に用いられるプライマーの非相補的部分中に、又はＭＳＤＡ−ＣＤのためにＤＮＡをコンカテマー化するのに用いられるリンカー配列中に、プロモーター配列を含み得る。

本発明を以下の実施例を参照してさらに記載する。

以下の実施例は本発明の一部の好ましい実施形態を説明するものであるが、全ての実施形態を説明することを意図するものではなく、これらの実施例が添付の請求項及び／又は本発明の適用範囲を限定すると解釈されるべきではない。

Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用したｃＤＮＡの増幅
手順
Ｉ−２本鎖ｃＤＮＡの合成
１．全ＲＮＡサンプル（ｌ００ｎｇ−１０μｇ）を使用し、ＴｉｍｅｓａｖｅｒｃＤＮＡ合成キット（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の手順に従い、２本鎖ｃＤＮＡを作製する。５’−リン酸化されたＮｏｔＩ／Ｐ−Ｔ７／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２４プライマーを使用するよう留意する（配列５’リン酸ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’）（配列番号１）。
２．Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにもとづく増幅のためのサンプルを調製するため、エタノール沈殿（１／ｌ０量の１．５ＭＮａＯＡｃ／２５０ｍＭＥＤＴＡ、及び３倍量の１００％ＥＴＯＨを添加し、小型遠心管中、３０分間遠心分離する）により、ｃＤＮＡを精製した。
３．１０μｌの蒸留水中に再懸濁する。
４．所望によりｃＤＮＡの回収率を調べてもよい（ピコグリーン又はアガロースゲル電気泳動、これは任意の操作である）。

ＩＩ−連結（ライゲーション）
１．２本鎖ｃＤＮＡの末端を連結して環状化する。

成分１ｒｘ
ｃＤＮＡ（＜１ｇ）７μｌ
１０×リガーゼ緩衝液１μｌ
５０％ＰＥＧ−８０００１μｌ
４００単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ
合計１０μｌ
２．１６℃にて１晩インキュベートする。
３．サンプルを移し、−２０℃又は−８０℃で保存する。
ＩＩＩ−ｃＤＮＡ増幅
１．連結したサンプルを沈殿させる（１／ｌ０量の１．５ＭＮａＯＡｃ／２５０ｍＭＥＤＴＡ、及び３倍量の１００％ＥＴＯＨを添加し、小型遠心管中、３０分間遠心分離する）。２０μｌの標準反応液を以下のように調製する。

成分１ｒｘ
連結したｃＤＮＡペレット（＜１ｇ）０μｌ
サンプル緩衝液（プライマーを含む）１０μｌ
合計１０μｌ
２．９５℃、３分間変性させる。
３．氷中で急冷する。
４．９μｌの反応緩衝液（ヌクレオチドと緩衝液を含む）及び１μｌのＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ／ランダムプライマー混合液を合わせて基準混合物を調製し、別のチューブに入れて氷中に保存する。
５．上記基準混合物（反応緩衝液＋酵素）１０μｌを変性させたサンプルに加える。
６．穏やかに攪拌し、短時間の遠心分離を行う。
７．反応液の総容量は２０μｌである。
８．３０℃、１２−１６時間インキュベートし、ｃＤＮＡ増幅を行う。
９．サンプルを６５℃、１０分間インキュベートし、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを不活化する。
１０．１００単位のＮｏｔＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を添加し、３７℃、１時間インキュベートする。
１１．ピコグリーン分析又はゲル電気泳動により、増幅生成物の定量を行う。

ＩＶ−標識アンチセンスＲＮＡを作製するためのｉｎｖｉｔｒｏ転写
１．マイクロアッセイスライド上でハイブリダイズさせるための標識ＲＮＡプローブを作製する（増幅され、制限酵素消化されたＤＮＡを使用する）。
注意：直接光に曝すことをさける。ＲＮＡｓｅの混入に注意する。
２．各色素の各テンプレートとの複合反応を準備する。ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔｉｎｖｉｔｒｏ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用する。

成分１ｒｘ４．５ｒｘ終濃度
ＤＮＡテンプレート^＊５２２．５１μｇ
１０×転写緩衝液２９１×
１０ｍＭｒＡＴＰ１４．５５０μＭ
１０ｍＭｒＣＴＰ１４．５５０μＭ
１０ｍＭｒＧＴＰ１４．５５０μＭ
１０ｍＭｒＵＴＰ０．６２．７５０μＭ
Ｃｙ３ｒＵＴＰ又はＣｙ５ｒＵＴＰ０．４１．８５０μＭ
（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
ＲＮａｓｅインヒビター１４．５２０Ｕ
Ｔ７ＲＮＡｐｏｌミックス２９３０Ｕ
ＤＥＰＣｄＨ _２Ｏ６２７
合計２０９０
３．３７℃、２−４時間インキュベートする。
４．１μｌの０．５ＭＥＤＴＡを添加して反応を停止する。
^＊ＤＮＡサンプル量は反応液ごとに変え、ＤＥＰＣ及びｄＨ_２Ｏを添加して最終容量を２０μｌとする。

ＶＩ−精製
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した精製
１．手順説明書に従いＲＮＡをきれいにした。
２．洗浄ステップ後、最初の５０μｌＤＥＰＣｄＨ_２Ｏによる溶出、及び２度目の３０μｌＤＥＰＣｄＨ_２Ｏによる溶出によってサンプルを回収し、合計８０μｌの容量とした。
３．各色素による複合反応が起きた場合には、反応液をひとつのチューブに集めることができる。
４．分光光度計測定により１：５に希釈したプローブを定量し（Ｃｙ５Ｏ．Ｄ＠６５０ｎｍ、Ｃｙ３Ｏ．Ｄ＠５５０ｎｍ）、所望によりエタノール沈殿により、１０−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルを精製した。

ＶＩＩ−標識ＲＮＡの断片化（所望による）
１．３−４μｇの標識されたＲＮＡを５％の断片化緩衝液で処理した。
５×断片化緩衝液
Ｔｒｉｓｂａｓｅ６．０６ｇ
ＤＥＰＣｄＨ_２Ｏ１７５ｍｌ
完全に溶解しｐＨを８．１に合わせる（氷酢酸にて）。
以下を添加する：
酢酸カリウム１２．３ｇ
酢酸マグネシウム８．０４ｇ
溶解し容量を２５０ｍｌに合わせる。
最終ｐＨ〜８．４
濾過滅菌を行う
小分けして−２０℃にて保存する。

成分１ｒｘ終濃度
プローブ（標識ＲＮＡ）Ｘμｌ３−４μｇ
５×断片化緩衝液１０μｌ０．５×
ＤＥＰＣｄＨ _２ＯＸμｌ
合計１００μｌ
２．９５℃、３５分間インキュベートする。
３．ゆっくりと室温にさまし、氷上に置く。
４．迅速にエタノール沈殿を行う。
５．１０μｌの５Ｍ酢酸アンモニウム（ＤＥＰＣ）を加える。
６．３００μｌの冷エタノールを添加する。
７．−８０℃、３０分間置く。
８．冷却遠心機にて、高速で２０分間遠心分離する。
９．上清を捨てる。
１０．７０％（ＤＥＰＣ）エタノールで洗浄する。
１１．ペレットを迅速に風乾する。
１２．６μｌのＤＥＰＣｄＨ_２Ｏに再懸濁する。
１３．断片化されたプローブは−８０℃で保存できる。

ＶＩＩＩ−マイクロアレイスライド上でのハイブリダイゼーション
１．手動−ハイブリダイゼーション混合液の調製
成分１ｒｘ
断片化されたＲＮＡプローブ６μｌ
５０％ホルムアミド１５μｌ
４×ハイブリダイゼーション緩衝液７．５μｌ
Ａ _８０１．５μｌ
合計１０μｌ
２．穏やかに攪拌する。
３．９５℃、２分間、プローブを変性させる。
４．高速で２分間遠心分離する。
５．ＣｏｒｎｉｎｇＭｉｒｒｏｒスライド又はＡｌｉｃｅｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅスライド上でハイブリダイズする。
６．ハイブリダイゼーションは４２℃、１８時間、オーブン中で行う。

自動化されたスライド処理装置（ＡＳＰ）におけるハイブリダイゼーション
１．ハイブリダイゼーション混合液を調製する。

成分１ｒｘ
断片化されたＲＮＡプローブ２２．５μｌ
５０％ホルムアミド１１５ μｌ
４×ハイブリダイゼーション緩衝液５８ μｌ
Ａ_８０１１．５μｌ
８Ｍ尿素２３ μｌ
合計１０μｌ
２．穏やかに攪拌する。
３．９５℃、２分間プローブを変性させる。
４．高速で２分間遠心分離する。
５．ＣｏｒｎｉｎｇＭｉｒｒｏｒスライド又はＡｌｉｃｅｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅスライド上でハイブリダイズする。
６．ハイブリダイゼーションは４２℃、１８時間、オーブン中で行う。

ＩＸ−洗浄緩衝液及び条件
１．２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ５５℃予備加温
（カバースリップを除くため）＜２分間
２．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ室温スライドチャンバー２分間
３．０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ室温スライドチャンバー２分間
４．０．１×ＳＳＣ３回浸す
５．ＤＥＰＣｄＨ_２Ｏ１回浸す
６．窒素の緩やかな流れにより、迅速にスライドを乾燥させる。
７．Ｃｙ３＠５５０ｐｍｔ／Ｃｙ５＠６００ｐｍｔをスキャンする。

Ｘ−定量的リアルタイムＰＣＲ分析
１．ヒト肺ｍＲＮＡサンプルを使用し、第１ｃＤＮＡ鎖、２本鎖ｃＤＮＡ及び増幅ｃＤＮＡを作製し、発現レベルを定量するためにサンプルの連続的１０倍希釈系列を調製した。
２．サンプル中の検出及び発現レベルの定量のために、ベータ−アクチン（ｃＤＮＡ）に対するＭＧＢＥｃｌｉｐｓｅ^ＴＭプローブシステムを用いる。Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’ＧＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴ（センス））（配列番号２）、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５’ＧＡＴＧＧ^＊ＧＧＴＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴ（アンチセンス））（配列番号３）をＦＡＭ標識プローブ（５’ＭＧＢ−ＥＤＱ−ＧＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＴＧＧＧＣＧＡ（センス）（配列番号４）と共に、ベータ−アクチン転写物に特異的なＤＮＡプローブを作製した（８９塩基対の増幅物サイズ）。
３．定量的リアルタイムＰＣＲを以下のように準備した。

成分１ｒｘ
ＲＮａｓｅ非含有の水Ｘ μｌ^＊
ハイブリダイゼーション緩衝液２．５ μｌ
１０ｍＭｄＮＴＰ’ｓ１ μｌ
２０×プライマー混合液１．２５μｌ
２０×プローブ１．２５μｌ
活性化Ｔａｑ０．４ μｌ
テンプレートＸ μｌ ^＊
合計２５ μｌ
^＊テンプレートの量は反応液ごとに変え、ＤＥＰＣ及びｄＨ_２Ｏを添加して最終容量を２５μｌとする。
４．ＰＣＲの条件：９５℃で２分間、次いで９５℃１０秒、５６℃３０秒、７６℃３０秒にて５０サイクル。

上記に説明されたような本発明が教示する利益を有する当業者は、これらに多くの改変を施し得る。それらの改変は、添付の請求項において上記に説明されるように、本発明の適用範囲内に包含されるものと解釈される。

増幅方法論の手順を模式的に表した図である。プロモーターを含む増幅方法論を模式的に表した図である。プロモーター／ターミネーター配列を含む方法論を模式的に表した図である。プロモーター／制限酵素認識配列を含む方法論を模式的に表した図である。第１の鎖ｃＤＮＡの増幅に対する方法論を模式的に表した図である。増幅したｃＤＮＡの標識、及び直接的な第１鎖ｃＤＮＡの標識を比較したマイクロアレイ分析の結果を表す図である。増幅しないｃＤＮＡサンプル及び増幅したｃＤＮＡサンプルにおける、ベータアクチンｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析の結果を表す図である。

Claims

ａ）ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、ｂ）前記ｃＤＮＡからコンカテマー又は環状ｃＤＮＡ生成物を生成するｃＤＮＡの自己連結、およびｃ）ランダム配列プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを用いた、連結された前記ｃＤＮＡ生成物の増幅を含んでなるＲＮＡ配列の増幅方法。
ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１に記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼが、ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、バクテリオファージＴ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲＤＩＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ１５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２１ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＺＥＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＺＡＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＮｆＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＭ２ＹＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＢ１０３ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＦ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＧＡ−１ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＣｐ−５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＣｐ−７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ４ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ７２２ＤＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファージＬ１７ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
ｃＤＮＡが自己連結ステップに先立ち２本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
ランダム配列プライマーがヌクレア−ゼに耐性を有するものである、請求項１に記載の方法。
ａ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むプライマーを使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡを生成する逆転写、ｂ）前記ｃＤＮＡからコンカテマー又は環状ｃＤＮＡ生成物を生成するｃＤＮＡの自己連結、ｃ）得られた連結ｃＤＮＡの、ランダム配列プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅、及びｄ）得られた増幅されたプロモーター含有ＤＮＡの、ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写を含んでなるＲＮＡ配列の増幅方法。
ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有するものである、請求項６に記載の方法。
ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６に記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼが、ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、バクテリオファージＴ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲＤＩＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ１５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２１ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＺＥＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＺＡＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＮｆＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＭ２ＹＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＢ１０３ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＦ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＧＡ−１ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＣｐ−５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＣｐ−７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ４ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ７２２ＤＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファージＬ１７ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
ｃＤＮＡが自己連結ステップに先立ち２本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項６に記載の方法。
ランダム配列プライマーがヌクレア−ゼに耐性を有するものである、請求項６に記載の方法。
前記プライマーがさらに制限酵素認識配列を含み、そこにおいて増幅されたプロモーター含有ＤＮＡを転写に先立ち制限酵素処理することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
前記プライマーがＲＮＡポリメラーゼの終止配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
ａ）ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、ｂ）前記ｃＤＮＡからコンカテマー又は環状ｃＤＮＡ生成物を生成するｃＤＮＡの自己連結、及びｃ）１種以上の特異的配列プライマーを使用し、恒温で行う特異的配列プライマーに基づくＤＮＡ増幅により得られる自己連結ｃＤＮＡ生成物の増幅を含んでなるＲＮＡ配列の増幅方法。
１から５０の上記特異的配列プライマーを使用する、請求項１４に記載の方法。
上記１種以上の特異的配列プライマーが、それぞれ独立して７〜５０ヌクレオチドの長さである、請求項１４に記載の方法。
上記１種以上の特異的配列プライマーが、それぞれ独立して１２〜２５ヌクレオチドの長さである、請求項１６に記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１に記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼが、ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、バクテリオファージＴ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲＤＩＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ１５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２１ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＺＥＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＺＡＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＮｆＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＭ２ＹＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＢ１０３ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＦ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＧＡ−１ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＣｐ−５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＣｐ−７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ４ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ５ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＰＲ７２２ＤＮＡポリメラーゼ、及びバクテリオファージＬ１７ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
ｃＤＮＡが自己連結ステップに先立ち２本鎖ｃＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
前記１種以上の特異的配列プライマーがヌクレア−ゼに耐性を有するものである、請求項１４に記載の方法。
請求項１又は１４に記載の方法に従ってＤＮＡを増幅することを含んでなる標識ＤＮＡの生産方法であって、その方法において前記増幅ステップがさらに１種以上の検出可能な標識ヌクレオチドアナログ、又は検出標識の直接的あるいは間接的な連結手段を提供する１種以上のヌクレオチドアナログを含んでなる、標識ＤＮＡの生産方法。
標識ＤＮＡをハイブリダイゼーション分析に使用することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
前記ハイブリダイゼーション分析がマイクロアレイを使用して行われる発現分析であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
請求項６に記載の方法に従ってＲＮＡを増幅することを含んでなる標識ＤＮＡの生産方法であって、その方法において前記転写ステップがｄ）さらに１種以上の検出可能な標識ヌクレオチドアナログ、又は検出標識の直接的あるいは間接的な連結手段を提供する１種以上のヌクレオチドアナログを含んでなる、標識ＲＮＡの生産方法。
標識ＲＮＡをハイブリダイゼーション分析に使用することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
前記ハイブリダイゼーション分析がマイクロアレイを使用して行われる発現分析であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
ＲＮＡ配列の同定方法であって、請求項１、６、又は１３のいずれか１項に記載の方法に従ってＲＮＡを増幅し、得られる増幅ＲＮＡを配列依存的な検出方法により同定することを含む、同定方法。
逆転写酵素、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡポリメラーゼを含んでなるＲＮＡ増幅キット。
ランダム配列増幅プライマーをさらに含んでなる、請求項２９に記載のＲＮＡ増幅キット。