JP2006292721A - 磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及び免疫測定法 - Google Patents

Abstract

【課題】クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法を提供する。
【解決手段】有機高分子物質と、前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなる、平均粒子径が５０〜５００ｎｍの磁性体内包粒子であって、前記有機高分子物質中における前記磁性体の分散径が１〜３０ｎｍであり、かつ、前記磁性体を５０〜８０重量％含有することを特徴とする磁性体内包粒子。
【選択図】なし

Description

本発明は、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法に関する。

測定試料中に含有される被検物質を検出する方法としては、例えば、抗原−抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス凝集法、免疫クロマト法等の生物学的反応を利用した種々の方法が提案されている。なかでも、簡便かつ迅速であることから、免疫クロマト法が多用されるようになってきている。

免疫クロマト法では、通常、少なくとも２種類の抗体を利用したサンドイッチ法が採用されている。すなわち、金属コロイドや着色粒子を支持体として、アイソトープ、酵素、蛍光物質等で標識された抗体を含む試薬と測定試料とを反応させ、測定試料中に含まれる抗原と標識抗体とを結合し、これをもう一つの抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中に抗原を捕捉し、捕捉された抗原を標識をもとに分析するというものである。

このような免疫クロマト法等に供するための支持体として、磁性体内包粒子が注目されている。磁性体内包粒子は、以前からラジオイムノアッセイ等において磁性により効率よく簡便にＢ／Ｆ分離を行うための支持体としての利用が提案されていたが、磁性体内包粒子の磁性量を標識とすることにより、他の標識物質で標識せずに分析を行うことができる等の利点があるとされる（特許文献１〜３）。

しかしながら、実際に磁性体内包粒子を免疫クロマト法に用いると、磁性体内包粒子がクロマト担体中に滞留してしまったり、展開させる側のクロマト先端部位付近に不均一に残留してしまったりする等、金属コロイドや着色粒子に比べてクロマト展開性が大きく劣るという問題があった。
特開平６−１４８１８９号公報 特開平７−２２５２３３号公報 特表２００１−５２４６７５号公報

本発明は、上記現状に鑑み、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法を提供することを目的とする。

本発明は、有機高分子物質と、上記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなる、平均粒子径が５０〜５００ｎｍの磁性体内包粒子であって、上記有機高分子物質中における上記磁性体の分散径が１〜３０ｎｍであり、かつ、上記磁性体を５０〜８０重量％含有する磁性体内包粒子である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、磁性体内包粒子を免疫クロマト法に用いた場合に、クロマト展開性が劣る原因について鋭意検討したところ、従来の磁性体内包粒子は自己凝集しやすいことから、二次粒子径が大きくなりクロマト担体の孔を通過しにくくなること、及び、クロマト担体自体にも非特異的に吸着しやすいことが原因であることを見出した。本発明者らは、更に鋭意検討した結果、磁性体内包粒子の平均粒子径を所定の大きさとし、かつ、磁性体の分散径及び含有量が特定の範囲内である磁性体内包粒子を用いた場合に、磁性体内包粒子の自己凝集が抑制され、クロマト展開性が向上するとともに、高感度な免疫測定が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の磁性体内包粒子は、有機高分子物質と、該有機高分子物質中に分散した磁性体とからなる。
上記有機高分子物質は、本発明の磁性体内包粒子のマトリックスとしての役割を有する。
上記有機高分子物質としては、スチレン系モノマーに由来するセグメントを有する共重合体であることが好ましい。スチレン系モノマーに由来するセグメントを有することにより、本発明の磁性体内包粒子の水系媒体中における分散性が向上する。

上記スチレン系モノマーとしては特に限定されず、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン等、又は、二官能性のジビニルベンゼン等が挙げられる。これらのスチレン系モノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。

上記スチレン系モノマーに由来するセグメントの含有量の好ましい下限は６０重量％である。６０重量％未満であると、得られる本発明の磁性体内包粒子の水系媒体中での分散性が劣ることがある。

上記有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントのほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有することにより、該反応性官能基を介して抗原や抗体を容易に結合することができる。

上記反応性官能基を含有するビニルモノマーの反応性官能基としては、抗原や抗体等を共有結合により結合可能なものであれば特に限定されず、例えば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基等が挙げられる。このような反応性官能基を含有するビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、グリシジル（メタ）アクリレート、トリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの反応性官能基を含有するビニルモノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。

上記共重合体は、その他のビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。

上記共重合体は、架橋性モノマーに由来するセグメントを有していてもよく、これらのセグメントにより架橋が施されていてもよい。
上記架橋性モノマーとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリトリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。

上記磁性体は、上記有機高分子物質中に分散している。
上記磁性体としては特に限定されないが、残留磁気がない超常磁性を有するものが好適である。残留磁気があると自己凝集しやすくなり、クロマト展開性が劣ることがある。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、γ−三酸化二鉄（γ−Ｆｅ_２Ｏ_３）等の各種フェライト類；鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）が好適である。
このような磁性体としては、Ｆｅ^２＋とＦｅ^３＋とを１：２の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでＦｅ_３Ｏ_４が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドＨＣ−５０（タイホー工業社製）、ＨＸ―２０（シグマハイケミカル社製）等の市販品も用いることができる。

上記有機高分子物質中における磁性体の分散径の下限は１ｎｍ、上限は３０ｎｍである。１ｎｍ未満であると、磁性体の製造自体が困難であることに加え、磁性体の磁性応答特性が減少し、標識として用いたときの感度が低下する。３０ｎｍを超えると、残留磁気を生じやすくなり、自己凝集しやすくなることに加え、磁性体が磁性体内包粒子の表面に露出しやすくなる。好ましい下限は５ｎｍ、好ましい上限は２０ｎｍである。

本発明の磁性体内包粒子中における磁性体の含有量の下限は５０重量％、上限は８０重量％である。５０重量％未満であると、磁性量が低く、極微量の測定対象成分を分析する際に検出が困難となり、８０重量％を超えると、自己凝集しやすくなったり、磁性体内包粒子全体の重量が大きくなり過ぎたりしてクロマト展開性が劣る。好ましい下限は６０重量％、好ましい上限は７０重量％である。

磁性体を５０〜８０重量％含有する磁性体内包粒子は、例えば、製造過程で得られる磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて１分間で磁石に引き寄せられる磁性体含有率が高い分画を、磁性体内包粒子として分取することができる。
なお、磁性体含有率が８０重量％を超える粒子が生成した場合、磁性体凝集塊になり重合器壁面などに付着するため、混入することはない。

本発明の磁性体内包粒子は、平均粒子径の下限が５０ｎｍ、上限が５００ｎｍである。５０ｎｍ未満であると、媒体中に懸濁させたときの分散安定性が悪くなって自己凝集しやすくなり、５００ｎｍを超えると、クロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト展開性が劣る。好ましい下限は１００ｎｍ、好ましい上限は４００ｎｍである。

本発明の磁性体内包粒子は、粒子径のＣＶ値が５０％未満であることが好ましい。５０％以上であると、粒子径の大きい粒子がクロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト担体中に残存することがある。

本発明の磁性体内包粒子は、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と上記磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差の好ましい上限が０．３である。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体内包粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、すなわち、磁性体内包粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、すなわち、磁性体内包粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が０．３を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は０．２７、更に好ましい上限は０．２５、特に好ましい上限は０．２０である。

本発明の磁性体内包粒子を製造する方法としては特に限定されず、例えば、懸濁重合法、マイクロサスペンジョン重合法、ミニエマルジョン重合法、分散重合法等を応用した方法が挙げられる。なかでも、粒子径の小さな粒子を容易に製造することができることから、ミニエマルジョン重合法を応用した方法が好適である。
具体的には、有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液と、モノマー、重合開始剤、及び、共界面活性剤を含有するモノマー溶液とを混合してモノマー混合液を調製する工程１、前記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程２、前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程３、及び、前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が５０〜８０重量％の粒子を分画し、回収する工程４を有する磁性体内包粒子の製造方法が挙げられる。このような磁性体内包粒子の製造方法もまた、本発明の１つである。
以下、ミニエマルジョン重合法を応用した本発明の磁性体内包粒子の製造方法を詳しく説明する。

本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、まず、有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液と、モノマー、重合開始剤、及び、共界面活性剤を含有するモノマー溶液とを混合してモノマー混合液を調製する工程１を行う。
このように、いったん磁性体分散液を調製し、これをモノマーと混合してモノマー混合液を調製することにより、磁性体が上記有機高分子材料からなるマトリックス中に上述の分散径で微分散し、かつ、上述の絶対偏差の値を達成した磁性体の含有量が均一な磁性体内包粒子を得ることができる。

上記磁性体分散液に用いる有機溶媒としては、磁性体の分散性に優れ、磁性体を溶解してしまったりせず、かつ、モノマーと混合可能なものであれば特に限定されない。
このような有機溶媒としては、ブタノールや脂肪族炭化水素系溶媒を含有するものが好適である。上記脂肪族炭化水素系溶媒としては、磁性体の分散性に特に優れることから、炭素数５〜２０の直鎖又は分岐のものが好適であり、炭素数５〜７の直鎖又は分岐のものがより好適である。具体的には、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、イソブタン、イソペンタン等が挙げられる。これらの脂肪族炭化水素系溶媒は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。

上記有機溶媒中における上記脂肪族炭化水素系溶媒の含有量としては、８０重量％以上であることが好ましい。８０重量％未満であると、充分に磁性体を分散させることができず、ひいては得られる磁性体内包粒子中における磁性体の分散径が大きくなったり、磁性体の含有量のバラツキが大きくなったりすることがある。

上記有機溶媒の含有量としては、磁性体に対して好ましい下限が２０重量％、好ましい上限が５００重量％である。２０重量％未満であると、充分に磁性体を分散できないことがあり、５００重量％を超えると、重合工程後に残存溶媒の除去が必要となり操作が煩雑となることがある。より好ましい下限は３０重量％、より好ましい上限は３００重量％である。なお、沸点が高い有機溶媒を用いる場合には、より少ない量を用いることが好ましい。

上記重合開始剤としては、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−（２−メチルプロパンニトリル）、２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチルペンタンニトリル）、２，２’−アゾビス−（２−メチルブタンニトリル）、１，１’−アゾビス−（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）、２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス−（２−アミジノプロパン）ヒドロクロリド等のアゾ（アゾビスニトリル）タイプの開始剤、過酸化ベンゾイル、クメンヒドロペルオキシド、過酸化水素、過酸化アセチル、過酸化ラウロイル、過硫酸塩（例えば過硫酸アンモニウム）、過酸エステル（例えばｔ−ブチルペルオクテート、α−クミルペルオキシピバレート及びｔ−ブチルペルオクテート）等の過酸化物タイプのラジカル系重合開始剤等が挙げられる。
これらの重合開始剤は、モノマー混合物液滴の分散液の調製時に添加してもよいし、調整後に別に添加してもよい。
上記重合開始剤の含有量としては特に限定されないが、モノマー１００重量部に対して好ましい下限が０．１重量部、好ましい上限が３０重量部である。

上記共界面活性剤としては、ミニエマルジョン重合において一般的に用いられているものであれば特に限定されないが、例えば、ヘキサデカン、スクアラン、シクロオクタン等のＣ_８〜Ｃ_３０の直鎖、分岐鎖、環状アルカン類；ステアリルメタクリレート、ドデシルメタクリレート等のＣ_８〜Ｃ_３０アルキルアクリレート；セチルアルコール等のＣ_８〜Ｃ_３０アルキルアルコール；ドデシルメルカプタン等のＣ_８〜Ｃ_３０アルキルチオール；ポリウレタン、ポリエステル、ポリスチレン等のポリマー類；長鎖脂肪族又は芳香族カルボン酸類、長鎖脂肪族又は芳香族カルボン酸エステル類、長鎖脂肪族又は芳香族アミン類、ケトン類、ハロゲン化アルカン類、シラン類、シロキサン類、イソシアネート類等が挙げられる。なかでも、炭素数が１２以上のアルカン類が好適であり、なかでも炭素数１２〜２０のアルカン類がより好適である。これらの共界面活性剤は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
上記共界面活性剤の含有量としては特に限定されないが、モノマー１００重量部に対して好ましい下限が０．１重量部、好ましい上限が５０重量部である。

上記磁性体分散液とモノマーとを混合してモノマー混合液を調製する際には、必要に応じて後述するような界面活性剤を用いてもよい。

本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、次いで、上記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程２を行う。

上記水系媒体としては特に限定されず、通常は蒸留水やイオン交換水等が用いられる。

上記界面活性剤としては特に限定されず、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤のいずれも用いることができる。なかでも、アニオン性界面活性剤が好適である。

上記アニオン性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート及びこれらのナトリウム、カリウム、アンモニウム塩等が挙げられる。

上記カチオン性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。

上記ノニオン性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、ポリビニルアルコール等が挙げられる。また、上記ノニオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−３０５、Ｎ−１０１（以上、ユニオンカーバイド社製）、Ｔｗｅｅｎ ２０、４０、６０、８０、８５（以上、アイ・シー・アイ社製）、Ｂｒｉｊ ３５、５８、７６、９８（以上、アイ・シー・アイ社製）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（シェル社製）、Ｉｇｅｐｏｌ ＣＯ５３０、ＣＯ６３０、ＣＯ７２０、ＣＯ７３０（ローヌ・プーラン社製）等の市販のものを用いることができる。これらのなかでは、アニオン性界面活性剤が好ましい。

上記界面活性剤としては、上記モノマーと重合可能な反応基を有する反応性界面活性剤も用いることができる。上記反応基としては、例えば、ビニル基、アリル基、（メタ）アクリロイル基等のエチレン性不飽和基が好適である。
このような反応性界面活性剤としては特に限定されず、例えば、特開平９−２７９０７３号公報等に記載されるものが挙げられる。具体的には、上記アニオン性界面活性剤としては、例えば、ラウリル（アリルベンゼン）スルホン酸塩、ラウリルスチレンスルホン酸塩、ステアリル（アリルベンゼン）スルホン酸塩、ステアリルスチレンスルホン酸塩等のアルキルベンゼンスルホン酸塩類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；ラウリルアリルスルホ琥珀酸エステル、ラウリルビニルスルホ琥珀酸エステル、ステアリルアリルスルホ琥珀酸エステル、ステアリルビニルスルホ琥珀酸エステル等のアルキルスルホ琥珀酸エステル類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；（メタ）アクリル酸ラウリルスルホン酸塩、オレイルスルホン酸塩等のアルキル又はアルケニルスルホン酸塩類、（メタ）アクリル酸ステアリル硫酸塩、オレイル硫酸塩等のアルキル又はアルケニル硫酸塩類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類等が挙げられる。

上記カチオン性界面活性剤としては、例えば、ラウリルトリアリルアンモニウムクロライド、ステアリルトリアリルアンモニウムクロライド、ジステアリルジアリルアンモニウムクロライド等の第４級アンモニウム塩類等が挙げられる。

上記ノニオン性界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールオクチル（アリルフェニル）エーテル、ポリエチレングリコールノニル（アリルフェニル）エーテル、ポリエチレングリコールオレイルフェニルエーテル等のポリエチレングリコールアルキル又はアルケニルフェニルエーテル類；モノステアリル酸モノアリルグリセリル、ジステアリン酸モノアリルグリセリル等のグリセリン脂肪酸エステル類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；モノステアリン酸モノアリルソルビタン、トリステアリン酸モノアリルソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル類又はそれらのポリエチレンオキサイド付加物類；ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸のポリエチレンオキサイドエステル類等が挙げられる。

上記反応性界面活性剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤であるアクアロンＨＳ−１０（第一工業製薬社製）、Ａｎｔｏｘ−ＭＳ−６０、ＲＡ−１０００シリーズ、Ａｎｔｏｘ−ＭＳ−２Ｎ（日本乳化剤社製）、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ（旭電化工業社製）、テラムルＳ−１８０Ａ（花王社製）、エレミノールＪＳ−２（三洋化成工業社製）；カチオン性界面活性剤であるＲＦ―７５１（日本乳化剤社製）；ノニオン性界面活性剤であるアデカリアソープＮＥ−１０（旭電化工業社製）、ブレンマーＰＥ−２００、ブレンマーＰＥ−３５０、ブレンマーＰＥ−４００（日本油脂社製）等の市販品が挙げられる。

これらの界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
上記界面活性剤の含有量としては、モノマー１００重量部に対し好ましい下限は０．０１重量部、好ましい上限が５重量部であり、より好ましい下限は０．１重量部、より好ましい上限は３０重量部である。

上記モノマー混合液からなる液滴を微分散させる方法としては特に限定されず、例えば、界面活性剤を含有する水系媒体中に上記モノマー混合液を加え、高い剪断力を発生させる剪断混合装置によって乳化させる方法等の従来公知の方法を用いることができる。
上記剪断混合装置としては特に限定されず、例えば、ピストンホモジナイザー、マイクロ流動化装置（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（みずほ工業社製））、超音波分散機等が挙げられる。なかでも、プローブ式の超音波分散機が好適に用いられる。

微分散させる際に超音波分散機を用いる場合、超音波出力の好ましい下限は５Ｗ、好ましい上限は２００Ｗである。５Ｗ未満であると、分散力不足により大きな液滴が生じ、次工程の重合反応が困難となることがあり、２００Ｗを超えると、所望の磁性体内包粒子が得られないことがある。
また、超音波の照射時間としては、超音波出力にもよるが、１０〜３０秒の範囲で行うことが好ましい。

ここで、完全に均一なモノマー液滴を形成させる、一般的なミニエマルジョン重合法の場合、高含有率の磁性体内包粒子を得ることができない。
本明細書において、不均一とは、液滴が均一になる前に分散工程を止めることであって、磁気分離法により回収する磁性体内包粒子については、粒子径や磁性体含有量は粒子毎に不均一ということではない。不均一になる条件は、数値化することは難しいが、超音波ホモジナイザーの出力が低く、かつ、処理時間が短い条件で実現できている。
また、不均一なモノマー液滴とは、超音波分散処理の際、磁性体内包量によってモノマー液滴が、同じ超音波出力であっても液滴の分裂効率が変わることを利用し、系全体としては液滴径が均一に至るまでの不均一な状態で処理を終えることにより得られる。また、この方法により得られるモノマー液滴は、液滴径を均一にする場合よりも磁性体含有率の高い液滴になる。また、磁性体内包粒子は、モノマー液滴が不均一な状態で重合後、磁気分離法により磁性体含有率が高く、かつ、均一性の高い分画を回収することにより得られる。

本発明の免疫測定用磁性粒子の製造方法においては、超音波出力や乳化時間を調整し、不均一な乳化状態で微分散処理を終了する。このように完全均一なモノマー液滴にしないことにより、磁性体含有率の高い磁性体内包粒子を得ることができる。

本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、次いで、前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程３を行う。
上記重合は、通常５０〜９５℃で５〜２４時間程度加熱することにより行う。

本発明の磁性体内包粒子の製造方法では、次いで、前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が５０〜８０重量％の粒子を分画し、回収する工程４を行う。

上記分画の方法としては特に限定されず、例えば、遠心分離法、磁気分離法等の精製方法が挙げられる。これにより、所望の平均粒子径、磁性体分散径及び磁性体含有量を有するものを採取することができ、本発明の磁性体内包粒子を得ることができる。
特に、精製方法のなかでも、磁気分離法が好適に用いられる。磁気分離の処理時間を短くすることで磁性体含有率の高い磁性体内包粒子を回収することができる。

本発明の磁性体内包粒子は、磁性体の含有量が多いことから、本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗体を結合又は吸着させ、免疫測定用粒子をすることにより、極微量の磁性体内包粒子であっても磁性量の検出が可能となり、高感度な免疫測定を行うことができる。
このような免疫測定用粒子もまた、本発明の１つである。

また、本発明の磁性体内包粒子は、平均粒子径が５０〜５００ｎｍであり、かつ、磁性体の分散径が１〜３０ｎｍであることから、自己凝集を抑制することができ、本発明の磁性体内包粒子を支持体として、抗原や抗体等を結合又は吸着させた免疫測定用粒子は、通常孔径が５〜２０μｍであるクロマト担体中を容易に展開（移動）することができる。更に、クロマト担体に非特異的に吸着することもないことから、クロマト展開性にも極めて優れる。従って、本発明の免疫測定用粒子を用いれば、磁性体内包粒子の磁性量を標識として分析を行う免疫測定法、特に免疫クロマト法を好適に行うことができる。
このような本発明の免疫測定用粒子を用いた免疫測定法もまた、本発明の１つである。

本発明によれば、磁性体内包粒子の平均粒子径を所定の大きさとし、かつ、磁性体の分散径及び含有量が特定の範囲内である磁性体内包粒子を用いた場合に、磁性体内包粒子の自己凝集が抑制され、クロマト展開性が向上するとともに、高感度な免疫測定を可能することができる。
本発明によれば、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法を提供することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）磁性体内包粒子の作製
磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０（タイホー工業社製）」１０．０ｇ（磁性体５ｇ含有）をインキュベーター中で８０℃にて１２時間乾燥し、濃縮された磁性流体７．０ｇを得た。得られた磁性流体にヘキサン３ｇを加えて、一晩放置し、磁性体を分散させて磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液の全量に対して、スチレン１０ｇ、ヘキサデカン０．８ｇ及び２，２’−アゾビスイソブチロニトリル０．０５ｇを加え、スターラーを用いて氷冷下で混合してモノマー混合液を得た。

次いで、水１００ｇにドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．８ｇを溶解させた水溶液を、得られたモノマー混合液を加え、出力２００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、氷冷下、出力目盛り５（７０Ｗ）で２分間処理して、磁性体を含むモノマー混合液の液滴が水中に分散したミニエマルジョン溶液を調製した。
得られたミニエマルジョン溶液を窒素雰囲気下、８０℃で、２４時間重合することにより、磁性体内包粒子分散液を得た。
次いで、得られた磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて１分間で磁石に引き寄せられる磁性体含有率が高い分画を、磁性体内包粒子として分取した。

得られた磁性体内包粒子について、動的光散乱光度計（Ｐｈｏｔａｌ ＰＡＲ−ＩＩＩＳ、大塚電子社製）を用いて動的光散乱法により粒子径を測定したところ、平均粒子径は２６３ｎｍであった。また、得られた磁性体内包粒子を水で希釈し、金属メッシュで支持したコロジオン膜上に沈着固定した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、磁性体の分散径を測定したところ、１０〜２５ｎｍであった。更に、ＴＧ−ＤＴＡ分析により磁性体内包粒子中の磁性体含有量を測定したところ６７重量％であった。

（２）免疫測定用粒子の作製
得られた磁性体内包粒子５．０ｍｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に存在する界面活性剤を除去した。続いて、得られた磁性体内包粒子に、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、超音波で再分散後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を３回繰り返した。

続いて、得られた磁性体内包粒子に、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体１００μｇ加え、３７℃恒温槽中で２時間攪拌した。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの７２％であることを確認した。

得られた磁性体内包粒子を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その後、磁性体内包粒子を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。次いで、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン及びグリセロールを各々１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用粒子を得た。

（実施例２）
出力２００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、氷冷下、出力目盛り３（３０Ｗ）で５分間処理したこと以外は、実施例１と同様にして、平均粒子径３１０ｎｍ、磁性体の分散径１０〜２５ｎｍ、磁性体の含有量６２重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。

（比較例１）
磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０」４．０ｇ（磁性体２ｇ含有）をインキュベーター中で８０℃にて１２時間乾燥し、濃縮された磁性流体３．０ｇを得た。次いで、得られた磁性流体にヘキサン１ｇを加え、一晩放置し、磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液について、出力４００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ４５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて出力目盛り５（１１０Ｗ）で１０分間処理したこと、及び、磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて５分間で磁石に引き寄せられる分画を磁性体内包粒子として分取したこと以外は実施例１と同様にして、平均粒子径１８０ｎｍ、磁性体の分散径１０〜２５ｎｍ、磁性体の含有量３６重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。

（比較例２）
０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸第一鉄水溶液５０ｍＬと、０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸第二鉄水溶液５０ｍＬとの混合液に、更に２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム１１０ｍＬを混合し、マグネタイトを得た。得られたマグネタイト５ｇに５重量％のオレイン酸ナトリウム溶液４０ｇを添加し、オレイン酸によって被覆された磁性体を得た。得られた磁性体５ｇにヘキサン１ｇを加え、磁性体分散液を得た。
得られた磁性体分散液について、出力４００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ４５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、出力目盛り５（１１０Ｗ）で１０分間処理したこと、及び、磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて５分間で磁石に引き寄せられる分画を磁性体内包粒子として分取したこと以外は実施例１と同様にして、平均粒子径２３０ｎｍ、磁性体の分散径２０〜４０ｎｍ、磁性体の含有量４１重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。

（比較例３）
実施例１で得られた磁性体分散液について、出力４００Ｗのプローブ型の超音波ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ４５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、出力目盛り７（１４０Ｗ）で１０分間処理したこと、及び、磁性体内包粒子分散液のうち、ネオジム磁石を用いて６０分間で磁石に引き寄せられる分画を磁性体内包粒子として分取したこと以外は、実施例１と同様にして、平均粒子径１１０ｎｍ、磁性体の分散径１０〜３０ｎｍ、磁性体の含有量２８重量％の磁性体内包粒子及び免疫測定用粒子を得た。

（比較例４）
市販の磁性体内包粒子（エスタポールＭ１―０３０／４０、メルク社製、平均粒子径４２０ｎｍ、磁性体の分散径１５〜３５ｎｍ、磁性体の含有量４０．２重量％）を用い、磁性体内包粒子１２．５ｍｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に添加されている界面活性剤を除去した。続いて、得られた沈渣に、０．０２Ｍリン酸バッファーを６２５μＬ、予め調整した２％濃度のカルボジイミド溶液（ＰＢＳバッファー）を０．６２５ｍＬ添加し、３７℃恒温槽中で１．５時間攪拌した。反応溶液は、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離を行い、上清を除去後、０．０２Ｍリン酸バッファー１．２ｍＬを添加し、超音波で再分散した。この遠心洗浄操作を３回繰り返し、未反応のカルボジイミドを除去した。

続いて、得られた沈渣に、０．１Ｍホウ酸バッファー１．２ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体２００μｇ加え、３７℃恒温槽中で一晩攪拌した。翌日、反応溶液に３０ｍＭグリシン溶液（ホウ酸バッファー）５０μＬを添加し、３７℃恒温槽中で３０分間攪拌した。その後、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの６５％であることを確認した。

得られた沈渣を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。得られた沈渣を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で３０分間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離を行い、その沈渣を牛血清アルブミン及びグリセロールを各々５％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用粒子を得た。

（評価）
実施例１〜２及び比較例１〜４で得られた免疫測定用粒子について、以下の方法により性能評価を行った。

ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より２ｃｍの部位（反応部位）に、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７℃で２時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。さらにその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定化した試験片を得た。

得られた試験片を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（ＡＰ２２、日本ミリポア社製）を、下端に幅５ｍｍ×長さ１５ｍｍのコンジュゲートパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。

試験液として、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、トリトン−１００ ０．０３％（ｗ／ｖ）、及び、ｈＣＧ濃度が０ｍＩＵ／ｍＬ、１０ｍＩＵ／ｍＬ、５０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬになるような生理食塩水を調製した。
次いで、各試験液２００μＬに免疫測定用粒子１０μｇを添加、混合した後、作製した試験片のコンジュゲートパッドに１００μＬをそれぞれ滴下した。

滴下から２０分経過後、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて、試験片の反応部位の磁性量を測定した。
測定結果を表１に示した。

表１に示したように、実施例１〜２で作製した免疫測定用粒子では、滴下から２０分後において、ｈＣＧ濃度を０ｍＩＵ／ｍＬとした場合を除いた全ての試験片で一定の磁性量が検出された。また、検出された磁性量は、ｈＣＧ濃度に依存していることが確認された。これにより、実施例１で作製した免疫測定用粒子は、磁性を標識とする免疫測定法に有用であることが判った。

一方、比較例１、３で作製した免疫測定用粒子では、ｈＣＧが高濃度の場合、磁性量が確認できたが、ｈＣＧが低濃度（比較例１：１０ｍＩＵ／ｍＬ、比較例３：５０ｍＩＵ／ｍＬ）の場合は、磁性量が検出限界以下であるため、検出できなかった。
また、比較例２、４で作製した免疫測定用粒子では、何れの試験片においても反応部位及び反応部位までの部位で免疫測定用粒子に基づく着色が認められた。特に、コンジュゲートパッドを重ねた部位付近の着色があり、免疫測定用粒子が滞留していることが認められた。また、被検物質が存在しない場合（０ｍＩＵ／ｍＬ）にも、磁性量が検出されていることから、非特異的に反応部位に免疫測定用粒子が捕捉されてしまうことが判った。

本発明によれば、クロマト展開性に優れ、高感度な免疫測定を行うことが可能な磁性体内包粒子、磁性体内包粒子の製造方法、免疫測定用粒子及びこれを用いた免疫測定法を提供することができる。

Claims (9)

1. 有機高分子物質と、前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなる、平均粒子径が５０〜５００ｎｍの磁性体内包粒子であって、前記有機高分子物質中における前記磁性体の分散径が１〜３０ｎｍであり、かつ、前記磁性体を５０〜８０重量％含有することを特徴とする磁性体内包粒子。
2. 磁性体は、超常磁性を有するものであることを特徴とする請求項１記載の磁性体内包粒子。
3. 磁性体は、酸化鉄であることを特徴とする請求項２記載の磁性体内包粒子。
4. 有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントを６０重量％以上含有することを特徴とする請求項１、２又は３記載の磁性体内包粒子。
5. 有機溶媒中に磁性体を分散させた磁性体分散液と、モノマー、重合開始剤、及び、共界面活性剤を含有するモノマー溶液とを混合してモノマー混合液を調製する工程１、
   前記モノマー混合液を、界面活性剤を溶解させた水系媒体に滴下し、微分散させることにより、不均一なモノマー液滴が形成したミニエマルジョン溶液を調製する工程２、
   前記モノマー液滴を重合させ、磁性体内包粒子分散液を調製する工程３、及び、
   前記磁性体内包粒子分散液から、磁気分離法により磁性体含有率が５０〜８０重量％の粒子を分画し、回収する工程４を有する
   ことを特徴とする磁性体内包粒子の製造方法。
6. 工程２において、出力が５〜２００Ｗの超音波で微分散させることを特徴とする請求項５記載の磁性体内包粒子の製造方法。
7. 請求項１、２、３又は４記載の磁性体内包粒子と、前記磁性体内包粒子に結合又は吸着した抗原又は抗体とからなることを特徴とする免疫測定用粒子。
8. 請求項１、２、３又は４記載の磁性体内包粒子を担体として用い、前記磁性体内包粒子の磁性量を標識として分析を行うことを特徴とする免疫測定法。
9. 免疫クロマト法を用いて分析を行うことを特徴とする請求項８記載の免疫測定法。