JP2006292421A - 蛍光検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 極めて微量の蛍光色素の有無から、ある程度の量の蛍光色素の定量まで、高感度でダイナミックレンジの広い２次元の動的蛍光検出を可能とする。
【解決手段】 試料の被検出面４４に励起光を照射する光源１０と、試料から発せられる蛍光を検出するＣＣＤエリアイメージセンサ２４と、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４の検出結果に基づき情報処理部４１で生成した励起光の２次元照射パターンを試料面に照射するためのマイクロミラーアレイ素子１１とを備えて、構成され、蛍光色素量が多く強い蛍光を発する場所には弱い励起光を照射することで、蛍光量を少なくして周辺部への蛍光波長光の散乱等による悪影響を抑えるとともに蛍光検出手段の光量過多による飽和を防止し、蛍光色素量が少なく蛍光が微弱な場所には強い励起光を照射することで、蛍光検出手段で検出可能な蛍光量を得ることができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、観察対象物に光を照射することで得られる蛍光、反射光、透過光等の光強度を検出する光検出装置に関するものであり、主には励起光を照射したときの蛍光分布を検出する装置であり、特に蛍光標識された試料の電気泳動等による２次元的な分離・展開状態を検出する蛍光検出装置に関する。

一般に、観察対象物に光を照射して光学的な検出手段により観察対象物の情報を得るという方法は、様々な技術分野において様々な目的のために古くから行われている。光を照射することで観察対象物から発せられる蛍光、反射光等を光電変換素子に集光して光強度を電気信号として検出し、観察対象物の情報を得る光検出装置も様々な構成のものが開発され、利用されている。

光強度の検出では、観察対象物に光を照射したときに観察対象物から発せられる光の中で、検出に不必要な波長成分や偏向成分等を分光や光学フィルタ等の光学的手段でカットすることにより検出の精度が向上する。

特に、観察対象が蛍光物質である場合には、一般に照射する励起光の波長と検出する蛍光の波長が異なるという点で微弱蛍光の検出が可能となる。特に蛍光検出の分野に限定されるべきものではないが、従来技術の光検出装置の一例として、励起光を照射したときの蛍光分布を検出する蛍光検出装置があり、中でも蛍光標識された試料の電気泳動等による２次元的な分離・展開状態を検出する蛍光検出装置は、極めて微量の蛍光色素の検出から、ある程度の量の蛍光色素の検出まで、高感度でダイナミックレンジの広い検出性能を要求されるものがある。

従来の蛍光検出装置としては、スキャン型蛍光検出装置、あるいは撮像型蛍光検出装置が主に用いられている。スキャン型蛍光検出装置では、検出ポイントに励起光をレーザ照射し、照射ポイントの蛍光をＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）で検出し、さらに観察対象全域をスキャンすることにより２次元領域の蛍光情報を得る（特許文献１参照）。

一方、撮像型蛍光検出装置では、励起光を面光源により検出領域に照射し、広域の蛍光をＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ）エリアイメージセンサにより一括撮影して２次元領域の蛍光情報を得る。ＣＣＤは冷却して暗電流ノイズを低減することで高感度化させて用いることが多い。

例えば、ゲル板等を用いた２次元電気泳動法により２次元領域に分画した試料は、事前または事後の蛍光色素による染色工程を経て、蛍光検出装置により蛍光輝点分布として検出される。

図７は、従来の撮像型蛍光検出装置を示す図である。

ランプ光源９０からの光は、励起光として選定された波長を透過させる光学フィルタ９１や所望の位置に集光させるためのレンズ等９２を介して試料面９３に照射される。蛍光標識された試料は励起光の照射により蛍光を発し、その蛍光は、蛍光波長のみを透過させる光学フィルタ９４や試料面付近に焦点を合わせるためのレンズ等９５を介してＣＣＤエリアイメージセンサ９６に入射する。ＣＣＤエリアイメージセンサ９６により一括画像として試料の蛍光輝点分布の情報を得るために比較的短時間に２次元領域の検出を行うことができる。

タンパク質等の２次元分離観察では、極めて微量の試料を分離し、それを検出できることが望まれている。また、２次元分離からより多くの情報量を得るためには、従来からの分離後の静的観察のみではなく、電気泳動等による連続的な分離過程を検出するための動的エリア観察が必要と考えられる。

特開平０９−２１０９０７号公報

しかしながら、上述の従来の蛍光検出装置構成においては、いずれの装置構成であっても、極めて微量の試料の分離を検出する目的と、試料の連続的な分離過程を検出する目的とを同時に達成すること困難であった。

スキャン型蛍光検出装置では、励起光レーザ照射によるスポット検出であるために、照射ポイント以外からの光の悪影響が非常に少なく検出感度には優れるが、基本的に１スポットでの１点検出であり２次元の観察領域全体をスキャンするためには検出時間が長くなる。そのため、試料の分離変化が非常に低速である場合を除き、連続的な分離過程を検出することは実質的に困難となる。

また、撮像型蛍光検出装置では、２次元領域を一括撮影する構成であるために、撮影領域全体の蛍光情報をおおよそ同時刻に検出することができ、所定時間毎に撮影することで連続的な分離過程の検出が可能である。ところが、撮影領域の全域を面光源で照射する構成であるため、観察領域内に複数の蛍光輝点が存在すると領域全体に広がる蛍光波長の光でバックグラウンドが上昇し、極めて微弱な蛍光は分離検出できなくなる。さらに、強い蛍光を発する輝点の近傍ではその傾向が顕著であり、微弱な蛍光輝点が埋もれてしまい分離が困難となる。

すなわち、２次元分離観察において、極めて微量の試料からの微少蛍光が分離していく過程を連続的に蛍光検出するということは、従来の蛍光検出装置構成では実質的に困難であるいう問題があった。

そこで、本発明は、上記従来の問題を解決するものであって、極めて微量の試料が発する微少蛍光を２次元領域の中で分離検出するとともに、その連続的な変化過程を検出可能な蛍光検出装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明に係る蛍光検出装置は、以下の構成からなり、特徴を備えている。

本発明に係る蛍光検出装置は、試料に励起光を照射する光源手段と、試料から発せられる蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備えた蛍光検出装置であって、前記蛍光検出手段の検出結果に基づいて、前記試料の試料面に照射される励起光の照射パターンを生成する励起光パターン形成手段を備えることを特徴とする。

また、本発明に係る蛍光検出装置は、前記励起光パターン形成手段がマイクロミラーアレイ素子を備えて構成したことを特徴とする。

また、本発明に係る蛍光検出装置は、前記励起光パターン形成手段が反射型液晶素子を備えて構成したことを特徴とする。

また、本発明に係る蛍光検出装置は、前記励起光パターン形成手段が透過型液晶素子を備えて構成したことを特徴とする。

また、本発明に係る蛍光検出装置は、前記蛍光検出手段がＣＣＤエリアイメージセンサを備えて構成したことを特徴とする。

また、本発明に係る蛍光検出装置は、前記蛍光検出手段が電子冷却素子を備えて構成したことを特徴とする。

また、本発明に係る蛍光検出装置は、前記光源手段により照射される励起光を受けて、前記励起光のパターンを生成する前記励起光パターン形成手段の最小単位領域と前記蛍光検出手段の単位検出領域とが前記試料の蛍光を発する面内において略同一のサイズ領域となるように前記励起光パターン形成手段を配置することを特徴とする。

このように構成することにより、試料面の場所毎に最適な強度の励起光をおおよそ同時に照射することができる。蛍光色素量が多く強い蛍光を発する場所には弱い励起光を照射することで、蛍光量を少なくして周辺部への蛍光波長光の散乱等による悪影響を抑えるとともに高感度蛍光検出手段の光量過多による飽和を防止し、蛍光色素量が少なく蛍光が微弱な場所には強い励起光を照射することで、蛍光検出手段で検出可能な蛍光量を得ることができる。

以上により、本発明によれば、試料に励起光を照射する光源手段と、試料から発せられる蛍光を検出する蛍光検出手段とからなり、光源手段から該試料までの光路途中に配置され、試料面に照射される励起光の２次元照射パターンを蛍光検出手段の検出結果に基づき生成する励起光パターン形成手段を備えることから、試料面の場所毎に最適な強度の励起光をおおよそ同時に照射することができる。

また、蛍光色素量が多く強い蛍光を発する場所には弱い励起光を照射することで、蛍光量を少なくして周辺部への蛍光波長光の散乱等による悪影響を抑えるとともに高感度蛍光検出手段の光量過多による飽和を防止し、蛍光色素量が少なく蛍光が微弱な場所には強い励起光を照射することで、蛍光検出手段で検出可能な蛍光量を得ることができる。

本発明に係る蛍光検出装置の実施形態について、図面を参照して以下に説明する。

＜第１の実施形態の説明＞
図１は、本発明に係る蛍光検出装置の第１の実施形態を示す概略構成図である。

同図において、蛍光検出装置１は、励起光パターン形成照射部４２、蛍光画像検出部４３、及び情報処理部４１により構成される。

励起光パターン形成照射部４２においては、光源１０からの光がマイクロミラーアレイ素子１１に照射され、マイクロミラーアレイ素子１１で反射した光は、投影レンズ１６を通して試料の被検出面４４に投影される。マイクロミラーアレイ素子１１は、投影画像パターンの画素に相当する複数の角度可動型マイクロミラーで構成されており、マイクロミラーの角度切替え動作をＰＷＭ（Ｐｕｌｓｅ Ｗｉｄｔｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）制御することにより階調を設定する。

光源１０は、ランプ１３の背面に配置した光源ミラー１４、及びマイクロミラーアレイ素子１１へ光を照射するための光源レンズ１２から構成される。

マイクロミラーアレイ素子１１は、後述する励起光パターン形成情報に基づき制御回路を介してＰＷＭ制御されることにより光源１０からの光の反射方向が各々のマイクロミラーにより制御され、試料の被検出面４４では２次元の励起光パターンが形成される。

光源１０のランプ１３が白色光源等であって広範囲の波長帯域の発光である場合には、試料へ照射する励起光を所定の波長に限定するためにバンドパスフィルタ、カラーフィルタ等の光学フィルタ１５を光路途中に配置する。

ここで、光学フィルタ１５は、光源レンズ１２の前または後、あるいは投影レンズ１６の前または後に配置すればよい。光源１０のランプ１３には、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ等のランプ、あるいは高輝度ＬＥＤ、高輝度蛍光管等を用いてもよく、また、発光の異方性等、光源素子の特性を考慮して光源ミラー１４や光源レンズ１２の構成や形状、及びそれらの使用の有無等を選定すればよい。

マイクロミラーアレイ素子１１には、例えばテキサス・インスツルメント・インコーポレイテッドの製品であるＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ−ｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いてもよく、それを用いた投影型プロジェクタ・システムであるＤＬＰ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）システムの構成要素を利用して、励起光パターン形成照射部４２を形成してもよい。

蛍光画像検出部４３において、試料の被検出面４４の蛍光画像は、撮像レンズ２１を介してＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ）エリアイメージセンサ２４に結像される。ＣＣＤエリアイメージセンサ２４への励起光波長の光の入射を防ぎ、蛍光波長の光を選択的に入射させ、検出するためにバンドパスフィルタ、ノッチフィルタ等の光学フィルタ２２を光路途中に配置する。

光学フィルタ２２は、撮像レンズ２１の前または後に配置すればよい。また、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４への光の入射タイミングをコントロールするために光路を遮る構成のシャッタ２３を光路途中に配置してもよい。

ＣＣＤエリアイメージセンサ２４は、ペルチェ素子等の熱電変換素子による冷却ユニット２５を用いて冷却し、暗電流ノイズを低減することで高感度化させる。さらに高感度検出のためには、電子増倍機能を有するＣＣＤエリアイメージセンサ２４を用いてもよい。

試料の被検出面４２において、励起光パターン形成照射部４２の投影パターンの最小単位である投影画素と、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４の撮像の最小単位である撮像画素とが、互いにピッチ、及び位置関係で１対１に対応させて、構成部品を選定することによって、両者の解像度を最大限に活かすことができ、最も好ましい構成となる。

ＣＣＤエリアイメージセンサ２４から出力される撮像情報は、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４の駆動及びデータ取得等を行う制御回路（図示していない）を介してコンピュータ等から構成される情報処理部４１へ伝達される。

情報処理部４１は、蛍光画像検出部４３によって収集される撮像情報と、その撮像情報等をもとに演算し設定する励起光パターン形成情報と、励起光パターン形成情報とそれに対応する撮像情報等とから算出する試料の蛍光情報とを含む試料の被検出面４４に関する２次元領域の数値情報の記録とその数値情報を基に試料の蛍光検出等の処理を行うとともに、構成する各部の制御を行う。

情報処理部４１のハードウェア形態は、汎用のコンピュータ、あるいはボードコンピュータであってもよく、また、ネットワークを介した形態であってもよい。

次に、第１の実施形態に係る蛍光検出装置１の蛍光検出動作について説明する。

図２は、本実施形態に係る蛍光検出装置１の動作を説明する部分イメージ図である。

簡単のために極めて単純化し、さらに部分的に抽出した５×５画素の領域のモデルを示している。

ここで、図２（ａ）は、被検出面の蛍光輝点を示す図である。

図中、被検出面４４の蛍光輝点を円形のハッチングで表している。座標点［３，ｃ］は、強い蛍光輝点を示し、座標点［２，ｂ］、［３，ｅ］、及び［５，ａ］は、弱い蛍光輝点を示す。

また、破線円２は強い励起光照射時における座標点［３，ｃ］の蛍光輝点の蛍光の広がり範囲を示す。

図２（ｂ）は、強い励起光照射時の蛍光検出画像を示す図である。

図２（ｃ）は、弱い励起光照射時の蛍光検出画像を示す図である。

図２（ｄ）は、座標点［３，ｃ］を除く領域への強い励起光照射時の蛍光検出画像を示す図である。

図２（ｅ）は、情報処理部を介して本実施形態の蛍光検出装置が検出した蛍光検出情報を示す図である。

蛍光検出するにあたって、蛍光検出対象の試料としては、例えば、予め蛍光標識された試料がゲル板等を用いた２次元電気泳動法により２次元領域に分画していく過程のように、蛍光強度の差異が非常に大きい複数の蛍光輝点がその強度と位置が時間をおって徐々に変化していく過程を想定する。

まず、第１工程では、励起光パターン形成照射部４２により検出領域全体に均一な強度の励起光を照射し、蛍光画像検出部４３によりそのときの蛍光画像を撮影し、情報処理部４１によって、各々の位置の蛍光強度を認識する。この工程は、ある程度以上の強度をもつ蛍光輝点の検出が目的であるために、励起光パターン形成照射部４２による励起光照射強度を微弱設定とする。さらに、蛍光画像検出部４３によるエリアイメージセンサ２４の撮影露光時間を短時間の設定としてもよく、撮像レンズ光学系の絞り値を大きく設定してもよい。

このように、上記工程によって、図２（ａ）に示すように、被検出面４４の強い蛍光輝点に対して、弱い励起光を照射して図２（ｃ）の蛍光検出画像を得る。すなわち、座標点が[３，ｃ]である強い蛍光輝点のみ抽出することができる。

次に、第２工程では、前工程で蛍光輝点として検出された位置には励起光がおおよそ照射されないように情報処理部４１において励起光パターン形成情報を生成し、励起光パターン形成照射部４２によりパターン化した励起光を照射する。ここでは、前工程では検出困難であった強度の蛍光輝点の検出が目的であるために、前工程より強度を上げた励起光を照射し、蛍光画像検出部４３によりそのときの蛍光画像を撮影し、情報処理部４１において各々の位置の蛍光強度を認識する。さらに、蛍光画像検出部４３によるエリアイメージセンサ２４の撮影露光時間を前工程より長時間の設定としてもよく、撮像レンズ光学系の絞り値を前工程より小さく設定してもよい。

この工程によって、図２（ａ）の被検出面の弱い蛍光輝点に対して、座標点が［３，ｃ］である強い蛍光輝点を除く領域へ強い励起光を照射して図２（ｄ）に示す蛍光検出画像を得ることができる。

さらに、第３工程おいて、上記第１及び２工程によって得られた蛍光検出画像情報をもとに、情報処理部４１は、図２（ｅ）に示すようにそれぞれの輝度点が分離された蛍光検出画像情報を得る。この工程により、強い蛍光輝点及び弱い輝度点が混在している場合であっても、それぞれが分離された蛍光検出画像情報を得ることができる。

ここで、従来の蛍光検出装置と本実施形態に係る蛍光検出装置１のそれぞれの蛍光検出動作について図３を用いて補足的に説明しておく。

図３は、従来の蛍光検出装置と本実施形態に係る蛍光検出装置１の蛍光検出動作について補足説明する図である。

同図（ａ）に示す従来の蛍光検出装置においては、弱い蛍光輝点６の蛍光を検出するために、均一的に強い励起光を照射する必要があり、強い励起光照射時において強い蛍光輝点７の蛍光広がりの影響で、バックグランド領域３（図２（ａ）に示す破線円２の領域）の輝度が上がり、弱い蛍光輝度点の検出が困難となる。すなわち、図２（ｂ）に示すように、各蛍光輝点が連続したような蛍光検出画像となってしまい、各異なった蛍光輝度点を有する蛍光点を分離することができず、蛍光強度の検出が困難となる。

一方、本実施形態に係る蛍光検出装置１の蛍光検出動作は、上述したように、ＤＭＤを使用して領域を分けて、それぞれの領域に異なった強度の励起光を照射することができるために（図３（ｂ）に示す弱い蛍光輝点６の周辺領域４および強い蛍光輝点７の周辺領域５）、図２（ｃ）、（ｄ）に示すように、それぞれの蛍光輝度を有する蛍光点を分離して、蛍光強度の検出が可能となる。

本実施形態の蛍光検出装置１においては、必要に応じて、前記第２工程を多段化する目的で、第Ｎ工程（Ｎ＝３、４、・・・）として第２工程と同様の工程を段階的に行ってもよく、それにより励起光強度の設定可能範囲、ＣＣＤエリアイメージセンサの感度範囲、撮影露光時間の設定可能範囲等の装置構成要素の特性を有効に利用した、ダイナミックレンジの広く検出感度の高い蛍光検出装置の動作が可能となる。第１工程の励起光照射強度、及びエリアイメージセンサの撮影露光時間等、ならびに第２工程以降のパターン化した励起光照射強度、及びエリアイメージセンサの撮影露光時間等は、検出対象の蛍光強度等の特性、及び蛍光画像検出部の光学部品構成やＣＣＤエリアイメージセンサの感度特性等を考慮して設定すればよい。

情報処理部４１では、基本的には試料の被検出面での検出点毎に、照射した励起光強度とそのときに検出された蛍光強度から各検出点の実質的な蛍光強度を算出する。蛍光強度は検出条件等が異なる複数回の検出結果から総合的に算出してもよく、また、例えば非常に強い蛍光を発する場所が被検出点に隣接する場合等、周囲の状況がその被検出点の検出結果に何らかの影響を与える場合は、その影響の割合を考慮して補正を行っても良い。

励起光パターン形成照射部４２のマイクロミラーアレイ素子１１等の構成要素に起因する特性のバラツキ等により、均一な励起光強度を設定しているにもかかわらず試料の被検出面において励起光に何らかの強度分布が発生する場合や、あるいは所定の投影パターンを設定しているにもかかわらず試料の被検出面４４において設定と異なる何らかのバラツキが生じる場合等には、励起光パターン形成照射部４２の投影パターンの最小単位である投影画素毎に補正を行うことによって均一化させることができる。

上記補正は、情報処理部４１での励起光パターン形成情報に対して行い、実際に照射する励起光照射強度を補正するとよい。あるいは実際の検出を行った後に、情報処理部での蛍光強度算出時に数値的に補正してもよい。また、蛍光画像検出部４３のＣＣＤエリアイメージセンサ等の構成要素に起因するバラツキが検出結果に影響を及ぼす場合にも、情報処理部４１での蛍光強度算出時に数値的に補正を行うとよい。

励起光パターン形成照射部４２の投影パターンの最小単位である投影画素と、ＣＣＤエリアイメージセンサの撮像の最小単位である撮像画素とが、試料の被検出面４４において、ズレが無く、互いにピッチ、及び位置関係で１対１に対応している方が両者の解像度を最大限に活かすためにはもっとも好ましい。

しかしながら、装置を構成する上でのマイクロミラーアレイ素子やＣＣＤエリアイメージセンサ等のデバイス類は、コストや性能等を考慮して既製のデバイスを選定し組合せる場合に限っては、必ずしもそれらの条件を完全に一致させることは容易ではない。

また、本実施形態の蛍光検出装置１では、試料の被検出面４４に対する励起光パターン形成照射部４２の光軸と蛍光画像検出部４３の光軸とが同軸ではない光学構成においては、試料の被検出面までの距離が大きく変化すると、対応する励起光パターン形成照射部の投影画素と蛍光画像検出部４３の撮像画素の組み合わせ自体が変化することになる。これらのデバイス類の仕様に起因する不一致、装置製造上のバラツキ等による不一致、あるいは装置構成や被検出物形状、及びそれらの配置関係による不一致、等の種々の要因による励起光パターン形成照射部４２の投影画素と蛍光画像検出部４３の撮像画素との対応関係は、事前情報として情報処理部に記録しておき、補正を行うとよい。

本実施形態では、２次元撮像デバイス２４と２次元の励起光パターン形成照射部４２を用いた２次元領域の蛍光情報の検出を示しているが、必ずしもこれに限るものではなく、同様の手段によりＣＣＤラインイメージセンサ等の１次元の受光デバイスと１次元の励起光パターン形成照射部４２を組合せて１次元の蛍光情報の検出を行うこともできる。

また、同期させてスキャンする機構を付加することにより２次元領域の蛍光情報の検出に用いることも可能であり、励起光パターン形成照射部４２、あるいは蛍光画像検出部４３のいずれか一方のみを１次元デバイスとしたスキャン機構との組み合わせで構成されていてもよいが、スキャンによる２次元領域の検出動作には、ある程度の時間を要するために、短サイクルでの連続検出にはあまり適さない。何れの構成を用いるかの判断は、必要とする動的観察のサイクルや検出性能、装置製造コスト等を考慮して選定すればよい。

また、本実施形態では、励起光パターン形成手段にマイクロミラーアレイ素子１１を用いた例で説明しているが、励起光パターン形成手段に反射型液晶素子を用いこともできる。

また、反射型液晶パネルＬＣＯＳ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ）を用いた液晶プロジェクタの構成要素を利用して、励起光パターン形成照射部を形成してもよい。その他の基本的な構成や動作は、第１の実施形態に準ずるものであり、詳しい説明は省略する。励起光パターン形成手段に用いる素子は、励起光波長域、素子仕様、光学特性、コスト等を含めて判断すればよい。

＜第２の実施形態の説明＞
図４は、本発明の第２の実施形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。

第２の実施形態の蛍光検出装置は、一部共通の同軸光学系により構成された励起光パターン形成照射部４２ａと蛍光画像検出部４３ａ、及び情報処理部４１により構成される。

励起光パターン形成照射部４２ａにおいては、光源１０からの光がマイクロミラーアレイ素子１１に照射され、マイクロミラーで反射した光はさらにダイクロイックミラー３２で反射した後、主レンズ３１を通して試料の被検出面４４に投影される。マイクロミラーアレイ素子１１は、投影画像パターンの画素に相当する複数の角度可動型マイクロミラーで構成されており、このマイクロミラーの角度切替動作をＰＷＭ（Ｐｕｌｓｅ Ｗｉｄｔｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）制御することにより階調を設定する。

光源１０は、ランプ１３、ランプ１３の背面に配置した光源ミラー１４、及びマイクロミラーアレイ素子１１へ光を照射するための光源レンズ１２から構成される。

マイクロミラーアレイ素子１１は後述の励起光パターン形成情報に基づき上述した制御回路を介してＰＷＭ制御されることにより光源からの光の反射方向が各々のマイクロミラーにより制御され、試料の被検出面４４では２次元の励起光パターンが形成される。

光源のランプ１３が白色光源等であって広範囲の波長帯域の発光である場合には、試料の被検出面４４に照射する励起光を所定の波長に限定する必要があるが、ダイクロイックミラー３２は、特定波長領域の光を反射し、それ以外の波長の光を透過する特性を有するため、所望の励起光波長に合わせてダイクロイックミラー３２の波長特性を設定する。さらに、試料の被検出面４４へ照射する励起光の波長を限定するためには、バンドパスフィルタ、カラーフィルタ等の光学フィルタ１５を光路途中に追加する。光学フィルタ１５は光源レンズ１２の前または後、あるいはダイクロイックミラー３２の前に配置すればよい。

光源１０のランプ１３は、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ等のランプ、あるいは高輝度ＬＥＤ、高輝度蛍光管等を用いてもよく、また、発光の異方性等を考慮して光源ミラー１４や光源レンズ１２の構成や形状、及びそれらの使用の有無等を選定すればよい。

マイクロミラーアレイ素子１１には、上述したように、テキサス・インスツルメント・インコーポレイテッドの製品であるＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ−ｍｉｒｒｏｒＤｅｖｉｃｅ）を用いてもよく、それを用いた投影型プロジェクタ・システムであるＤＬＰ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）システムの構成要素を利用して、励起光パターン形成照射部４２ａを形成してもよい。

蛍光画像検出部４３ａは、試料の被検出面４４の蛍光の画像を主レンズ３１、及びダイクロイックミラー３２を介してＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ）エリアイメージセンサ２４に結像する。

ダイクロイックミラー３２は、特定波長領域の光を反射し、それ以外の波長の光を透過する特性を有するため、蛍光波長領域が透過するようにダイクロイックミラー３２の波長特性が設定される。

すなわち、励起光波長は、反射し、蛍光波長は、透過するようにダイクロイックミラー３２の波長特性を設定する。

さらに、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４への不要な波長の光の入射を防ぎ、蛍光波長の光を選択的に入射させ、検出するためにバンドパスフィルタ、ノッチフィルタ等の光学フィルタ２２を光路途中に追加してもよい。光学フィルタ２２は、ダイクロイックミラー３２の後に配置すればよい。

また、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４への光の入射タイミングをコントロールするために光路を遮る構成のシャッタ２３を光路途中に配置してもよい。ＣＣＤエリアイメージセンサ２４は、ペルチェ素子等の熱電変換素子による冷却ユニット２５を用いて冷却し、暗電流ノイズを低減することで高感度化させる。さらに高感度検出のためには、電子増倍機能を有するＣＣＤエリアイメージセンサ２４を用いてもよい。

試料の被検出面４４においては、励起光パターン形成照射部４２ａの投影パターンの最小単位である投影画素と、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４の撮像の最小単位である撮像画素とが、互いにピッチ、及び位置関係で１対１に対応させることが、構成部品を選定する上で可能であれば、両者の解像度を最大限に活かすためにはもっとも好ましい構成である。

このように、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４の撮像情報は、制御回路を介してコンピュータ等から構成される情報処理部４１へ伝達される。

情報処理部４１においては、蛍光画像検出部４３ａから収集する撮像情報と、撮像情報等をもとに演算し設定する励起光パターン形成情報と、励起光パターン形成情報とそれに対応する撮像情報等とから算出する試料の蛍光情報とを含む試料の被検出面４４に関する２次元領域の数値情報の記録と情報処理を行うとともに、接続されている機器の制御を行う。

情報処理部４１のハードウェアの形態は、汎用のコンピュータ、あるいはボード型コンピュータであってもよく、またネットワークを介した形態であってもよい。

次に、第２の実施形態に係る蛍光検出装置の動作を説明する。

検出対象の試料としては、例えばゲル板等を用いた２次元電気泳動法により２次元領域に分画していく過程のように、蛍光強度の差異が非常に大きい複数の蛍光輝点がその強度と位置が時間をおって徐々に変化していく過程を想定する。

まず、第１工程では、励起光パターン形成照射部４２ａにより検出領域全体に均一な強度の励起光を照射し、蛍光画像検出部４３ａによりそのときの蛍光画像を撮影し、情報処理部４１によって、各々の位置の蛍光強度を認識する。ここでは、ある程度以上の強度をもつ蛍光輝点の検出が目的であるために、励起光パターン形成照射部４２ａによる励起光照射強度を微弱設定とする。

さらに、蛍光画像検出部４３ａによるエリアイメージセンサ２４の撮影露光時間を短時間の設定としてもよく、撮像レンズ光学系の絞り値を大きく設定してもよい。

次に、第２工程では、前工程で蛍光輝点として検出された位置には励起光がおおよそ照射されないように情報処理部において励起光パターン形成情報を生成し、励起光パターン形成照射部４２ａによりパターン化した励起光を照射する。

ここでは、前工程では検出困難であった強度の蛍光輝点の検出が目的であるために、前工程より強度を上げた励起光を照射し、蛍光画像検出部４３ａによりそのときの蛍光画像を撮影し、情報処理部４１において各々の位置の蛍光強度を認識する。さらに、蛍光画像検出部４３によるエリアイメージセンサ２４の撮影露光時間を前工程より長時間の設定としてもよく、撮像レンズ光学系の絞り値を前工程より小さく設定してもよい。

本実施形態の蛍光検出装置においては、第１の実施形態の場合と同様に、必要に応じて、前記第２工程を多段化する目的で、第Ｎ工程（Ｎ＝３、４、・・・）として第２工程と同様の工程を段階的に行ってもよい。

これにより励起光強度の設定可能範囲、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４の感度範囲、撮影露光時間の設定可能範囲等の装置構成要素の特性を有効に利用した、ダイナミックレンジの広く検出感度の高い蛍光検出装置の動作が可能となる。

第１工程の励起光照射強度、及びＣＣＤエリアイメージセンサ２４の撮影露光時間等、ならびに第２工程以降のパターン化した励起光照射強度、及びエリアイメージセンサ２４の撮影露光時間等は、検出対象の蛍光強度等の特性、及び蛍光画像検出部４３ａの光学部品構成やＣＣＤエリアイメージセンサ２４の感度特性等を考慮して設定すればよい。

情報処理部４１では、基本的には試料の被検出面４４での検出点毎に、照射した励起光強度とそのときに検出された蛍光強度から各検出点の実質的な蛍光強度を算出する。蛍光強度は検出条件等が異なる複数回の検出結果から総合的に算出してもよく、また、例えば非常に強い蛍光を発する場所が被検出点に隣接する場合等、周囲の状況がその被検出点の検出結果に何らかの影響を与える場合は、その影響の割合を考慮して補正を行ってもよい。

励起光パターン形成照射部４２ａのマイクロミラーアレイ素子１１等の構成要素に起因する特性のバラツキ等により、均一な励起光強度を設定しているにもかかわらず試料の被検出面４４において励起光に何らかの強度分布が発生する場合や、あるいは所定の投影パターンを設定しているにもかかわらず試料の被検出面４４において設定と異なる何らかのバラツキが生じる場合等には、励起光パターン形成照射部４２ａの投影パターンの最小単位である投影画素毎に補正を行うことによって均一化させることができる。

上記補正は、情報処理部４１での励起光パターン形成情報に対して行い、実際に照射する励起光照射強度を補正するとよい。あるいは実際の検出を行った後に、情報処理部４１での蛍光強度算出時に数値的に補正してもよい。

また、蛍光画像検出部４３ａのＣＣＤエリアイメージセンサ２４等の構成要素に起因するバラツキが検出結果に影響を及ぼす場合にも、情報処理部４１での蛍光強度算出時に数値的に補正を行うとよい。

励起光パターン形成照射部４２ａの投影パターンの最小単位である投影画素と、ＣＣＤエリアイメージセンサ２４の撮像の最小単位である撮像画素とが、試料の被検出面４４において、ズレが無く、互いにピッチ、及び位置関係で１対１に対応している方が両者の解像度を最大限に活かすためにはもっとも好ましい。

しかしながら、装置を構成する上でのマイクロミラーアレイ素子１１やＣＣＤエリアイメージセンサ２４等のデバイス類は、コストや性能等を考慮して既製のデバイスを選定し組合せる場合に限っては、必ずしもそれらの条件を完全に一致させることは容易ではない。

これらのデバイス類に起因する不一致、装置製造上のバラツキ等による不一致、あるいは装置構成や被検出物形状、及びそれらの配置関係による不一致、等の種々の要因による励起光パターン形成照射部４２ａの投影画素と蛍光画像検出部４３ａの撮像画素との対応関係は、事前情報として情報処理部に記録しておき、補正を行うとよい。

本実施形態のように試料の被検出面４４に対する励起光パターン形成照射部４２ａの光軸と蛍光画像検出部４３ａの光軸とを被検出面上で同軸とした光学構成においては、主レンズから被検出面４４までの距離が変化しても、対応する励起光パターン形成照射部４２ａの投影画素と蛍光画像検出部４３ａの撮像画素との組み合わせが変化しない構成とすることができる。

そのため、被検出面領域のサイズや被検出面４４までの距離を意図して大きく変化させる必要がある場合に適した構成である。ただし、照射、及び検出の光路中に追加挿入される光学部品による若干の光量損失等の発生は考慮する必要がある。

また、本実施形態では、励起光パターン形成手段にマイクロミラーアレイ素子１１を用いた例で説明しているが、励起光パターン形成手段に反射型液晶素子を用いこともできる。

上記例として、反射型液晶パネルＬＣＯＳ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ）を用いた液晶プロジェクタの構成要素を利用して、励起光パターン形成照射部４２ａを形成してもよい。その他の基本的な構成や動作は第１の実施形態に準ずるものであり、詳しい説明は省略する。励起光パターン形成手段に用いる素子は、励起光波長域、素子仕様、光学特性、コスト等を含めて判断すればよい。

＜第３の実施形態の説明＞
図５は、本発明の第３の実施形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。

本実施形態３の蛍光検出装置は、励起光パターン形成照射部４２ｂ、蛍光画像検出部４３、及び情報処理部４１により構成される。

励起光パターン形成照射部４２ｂにおいては、光源１０から照射された光が透過型液晶素子１７を透過し、投影レンズ１６を通して試料の被検出面４４に投影される。

光源１０は、ランプ１３、ランプの背面に配置した光源ミラー１４、及び透過型液晶素子１７へ光を照射するための光源レンズ１２から構成される。透過型液晶素子１７は、励起光パターン形成情報に基づき制御回路を介して制御されることにより光源１０からの光の透過状態が各々の液晶画素により制御され、試料の被検出面４４では２次元の励起光パターンが形成される。

光源１０のランプ１３が白色光源等であって広範囲の波長帯域の発光である場合には、試料へ照射する励起光を所定の波長に限定するためにバンドパスフィルタ、カラーフィルタ等の光学フィルタ１５を光路途中に配置する。光学フィルタ１５は、光源レンズ１２の前または後、あるいは投影レンズ１６の前または後に配置すればよい。

光源１０には、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ等のランプ、あるいは高輝度ＬＥＤ、高輝度蛍光管等を用いてもよく、また発光の異方性等、光源素子の特性を考慮して光源ミラー１４や光源レンズ１２の構成や形状、及びそれらの使用の有無等を選定すればよい。また、透過型液晶素子を用いた液晶プロジェクタ・システムの構成要素を利用して、励起光パターン形成照射部４２ｂを形成してもよい。

なお、蛍光画像検出部４３及び情報処理部４１、並びに蛍光検出装置の動作等に関しては、前述の第１の実施形態の蛍光検出装置に準ずるため、詳しい説明は省略する。

＜第４の実施形態の説明＞
本実施形態の蛍光検出装置（図示しない）は、一部共通の同軸光学系により構成された励起光パターン形成照射部と蛍光画像検出部、及び情報処理部により構成され、励起光パターン形成照射部が透過型液晶素子により構成される。上述の実施形態２に実施形態３を部分的に組合せた構成であり、蛍光画像検出部、及び情報処理部、並びに蛍光検出装置の動作等に関しては、前述の第２の実施形態に係る蛍光検出装置に準ずるため、詳しい説明は省略する。

その他にもＣＲＴプロジェクタ等、動画像を投影可能な機構を有するものであれば、励起光パターン形成照射部に用いることが可能であるため、励起光波長域、素子仕様、光学特性、コスト等を含めて判断し、励起光パターン形成照射部の構成要素として選択すればよい。

＜第５の実施形態の説明＞
図６は、本発明の第５の実施形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す図である。

本実施形態の蛍光検出装置は、励起光パターン形成照射部４２ｃと蛍光画像検出部４３、及び情報処理部４１により構成され、励起光パターン形成照射部４２ｃは、蛍光画像検出面４４の裏面側に配置されている。

励起光パターン形成照射部４２ｃは、バックライト４６上に液晶パネル４５が配置されている。これにより、試料の被検出面４４は、裏面側から励起光が照射される。透過型液晶パネル４５の上面、あるいは下面には、励起光波長を限定するための光学フィルタ等を配置してもよく、光の利用効率や、試料面の照射領域を考慮してマイクロレンズアレイ等を配置してもよい。

なお、蛍光画像検出部４３及び情報処理部４１、並びに蛍光検出装置の動作等に関しては、基本的に前述の実施形態の蛍光検出装置に準ずるため、詳しい説明は省略する。

本実施形態では、励起光パターン形成照射部４２ｃに平面型の発光表示デバイスを用いた例であり、バックライト４６と液晶パネル４５の組み合わせで構成しているが、所望の励起光波長や光強度、画素数等が得られるものであれば、これに限るものではなく、例えば有機ＥＬ（ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）パネルや無機ＥＬパネル、あるいはＬＥＤディスプレイ、ＰＤＰ（Ｐｌａｓｍａ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐａｎｅｌ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ Ｒａｙ Ｔｕｂｅ）等を用いることも可能である。

本発明の第１の実施形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す断面図である。 本発明の第１の実施形態に係る蛍光検出装置の動作を示す部分イメージ図である。 従来の蛍光検出装置と本実施形態に係る蛍光検出装置１の蛍光検出動作について補足説明する図である。 本発明の第２の実施形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す断面図である。 本発明の第３の実施形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す断面図である。 本発明の第５の実施形態に係る蛍光検出装置の概略構成を示す断面図である。 従来の蛍光検出装置の概略構成を示す断面図である。

符号の説明

１ 蛍光検出装置
２ 破線円
３、４、５ 周辺領域
６ 弱い蛍光輝度点
７ 強い蛍光輝度点
１０ 光源
１１ マイクロミラーアレイ素子
１２ 光源レンズ
１３ ランプ
１４ 光源ミラー
１５ 光学フィルタ
１６ 投影レンズ
２１ 撮像レンズ
２２ 光学フィルタ
２３ シャッタ
２４ ＣＣＤエリアイメージセンサ
２５ 冷却ユニット
３１ 主レンズ
３２ ダイクロイックミラー
４１ 情報処理部
４２、４２ａ、４２ｂ、４２ｃ 励起光パターン形成照射部
４３、４３ａ 蛍光画像検出部
４４ 試料の被検出面
４５ 液晶パネル
４６ バックライト

Claims (7)

1. 試料に励起光を照射する光源手段と、試料から発せられる蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備えた蛍光検出装置であって、
   前記蛍光検出手段の検出結果に基づいて、前記試料の試料面に照射される励起光の照射パターンを生成する励起光パターン形成手段を備えることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記励起光パターン形成手段がマイクロミラーアレイ素子を備えて構成したことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記励起光パターン形成手段が反射型液晶素子を備えて構成したことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
4. 前記励起光パターン形成手段が透過型液晶素子を備えて構成したことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
5. 前記蛍光検出手段がＣＣＤエリアイメージセンサを備えて構成したことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
6. 前記蛍光検出手段が電子冷却素子を備えて構成したことを特徴とする請求項５に記載の蛍光検出装置。
7. 前記光源手段により照射される励起光を受けて、前記励起光のパターンを生成する前記励起光パターン形成手段の最小単位領域と前記蛍光検出手段の単位検出領域とが前記試料の蛍光を発する面内において略同一のサイズ領域となるように前記励起光パターン形成手段を配置することを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。

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