JP2006280207A - New carbonyl reductase, gene thereof and method for utilizing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、式（１）： The present invention relates to formula (1):
本発明はまた、該ポリペプチド、又は、該形質転換体を用いた、光学活性アルコール類、とりわけ前記式(２)で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの製造法に関する。（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルは、医薬品の中間体として有用な化合物である。 The present invention also relates to a method for producing optically active alcohols, particularly ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate represented by the above formula (2), using the polypeptide or the transformant. . (R) -2-Hydroxymethylhexanoic acid is a useful compound as an intermediate for pharmaceuticals.
（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルをはじめとする３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法としては、１）パン酵母を用いて２−ホルミルへキサン酸エチルなどの２−ホルミル酢酸エステル誘導体を還元することにより、目的物を得る方法（非特許文献１）、２）パン酵母から単離した還元酵素（Ｌ−１酵素）を用いて２−ホルミルへキサン酸エチルなどの２−ホルミル酢酸エステル誘導体を還元することにより、目的物を得る方法（非特許文献２）、３）２−ホルミル酢酸エステル誘導体を還元する能力を有する酵素源を用いて還元することにより、目的物を得る方法（特許文献１）等が知られている。 (R) As a method for producing 3-hydroxypropionic acid ester derivatives including ethyl 2-R-hydroxymethylhexanoate, 1) 2-formyl acetate such as ethyl 2-formylhexanoate using baker's yeast A method for obtaining a target product by reducing a derivative (Non-patent Document 1), 2) 2-formyl such as ethyl 2-formylhexanoate using a reductase (L-1 enzyme) isolated from baker's yeast A method for obtaining a target product by reducing an acetate derivative (Non-patent Document 2), 3) A method for obtaining a target product by reduction using an enzyme source capable of reducing a 2-formyl acetate derivative. (Patent Document 1) and the like are known.
しかし、上記方法のうち、１）については、高い光学純度の生成物を得るためにはパン酵母を熱および添加物により処理する必要があり、操作が煩雑で、かつ、反応収率も低い。２）については、反応収率が低く、特に、２−ホルミルヘキサン酸エチルに対する反応性が極めて低い。３）についても、反応収率、および生成物の光学純度が共に高くなるような反応条件は見出されていない。またいずれの方法も、使用される酵素の基質特異性の点で、他の光学活性アルコールの生産に使用できる汎用性のある製造方法とはいえない。 However, among the above methods, for 1), in order to obtain a product with high optical purity, it is necessary to treat baker's yeast with heat and additives, the operation is complicated, and the reaction yield is low. Regarding 2), the reaction yield is low, and in particular, the reactivity to ethyl 2-formylhexanoate is extremely low. Also for 3), no reaction conditions have been found that increase both the reaction yield and the optical purity of the product. Neither method is a versatile production method that can be used for the production of other optically active alcohols in terms of the substrate specificity of the enzyme used.
このようにいずれの方法も効率的な製造方法とは言い難く、工業的製法としては大きな課題を有している。
上記に鑑み、本発明は、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの製造において有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。 In view of the above, the present invention provides a polypeptide useful in the production of ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate, a DNA encoding the polypeptide, a vector containing the DNA, and a vector transformed with the vector An object is to provide a transformant.
また、本発明は、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする種々の光学活性アルコールの効率的な製造方法を提供することを課題とする。 The present invention also provides an efficient method for producing various optically active alcohols including ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate using the polypeptide or the transformant. This is the issue.
本発明者らは、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有する微生物より、該活性を有するポリペプチドを単離した。さらに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離し、これを利用して、該ポリペプチドを高生産する形質転換体を創製することに成功した。そして、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用することにより、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする種々の有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have isolated a polypeptide having the activity from a microorganism having an activity of asymmetrically reducing ethyl 2-formylhexanoate to produce ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate. Released. Furthermore, the present inventors succeeded in isolating a DNA encoding the polypeptide and using this to create a transformant that produces the polypeptide at a high yield. And, by using the polypeptide or the transformant, it is possible to efficiently produce various useful optically active alcohols such as ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate. As a result, the present invention has been completed.
即ち、本発明は、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドである。また、本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡである。また、本発明は、該ＤＮＡを含むベクターである。また、本発明は、該ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、該ポリペプチドまたは該形質転換体を用いた、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする光学活性アルコール類の製造方法である。 That is, the present invention is a polypeptide having an activity of asymmetrically reducing ethyl 2-formylhexanoate to produce (R) -2-hydroxymethylhexanoate. The present invention is also a DNA encoding the polypeptide. Moreover, this invention is a vector containing this DNA. Moreover, this invention is a transformant containing this vector. Furthermore, the present invention is a method for producing optically active alcohols such as ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate using the polypeptide or the transformant.
本発明により、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする、有用な光学活性アルコール類の実用的な製造方法が提供される。 The present invention provides a practical method for producing useful optically active alcohols including ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。 Unless otherwise specified, genetic manipulations such as DNA isolation, vector preparation, and transformation described in this specification are described in documents such as Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). It can be carried out by the method described. Further,% used in the description of the present specification means% (w / v) unless otherwise specified.
本発明のポリペプチドは、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドであり、後述するようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有する微生物から単離することが出来る。当該活性を有する微生物は、例えば、各種の微生物の培養物、又はその処理物と２−ホルミルへキサン酸エチルを接触させ、生成した２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度を測定することにより見出すことが出来る。ここでいう「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体の破砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化したものであってもよい。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。また、上記反応において生成した、２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β（φ０．２５ｍｍ×６０ｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、カラム温度：１１０℃、キャリアガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて実施できる。 The polypeptide of the present invention is a polypeptide having an activity of asymmetrically reducing ethyl 2-formylhexanoate to produce ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate. A polypeptide having a sequence. The polypeptide of the present invention can be isolated from a microorganism having an activity of asymmetrically reducing ethyl 2-formylhexanoate to produce ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate. The microorganism having the activity can be obtained, for example, by contacting the culture of various microorganisms or a processed product thereof with ethyl 2-formylhexanoate and measuring the optical purity of the produced ethyl 2-hydroxymethylhexanoate. Can be found. As used herein, “microorganism culture” means a culture solution or culture containing cells, and “processed product” includes, for example, a crude extract, freeze-dried cells, acetone-dried cells, Means crushed cells. Further, they may be immobilized by a known means with the enzyme itself or cells. Immobilization can be performed by methods well known to those skilled in the art (for example, a crosslinking method, a physical adsorption method, a comprehensive method, etc.). The optical purity of ethyl 2-hydroxymethylhexanoate produced in the above reaction was measured by capillary gas chromatography (column: Cyclodex-β (φ0.25 mm × 60 m; manufactured by J & W Scientific), column temperature: 110. C., carrier gas: helium (300 kPa), detection: FID).
本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、上述した如く、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するものであれば特に限定されないが、例えばオガタエア（Ogataea）属に属する酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株を挙げることができる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手することができる。 As described above, the microorganism that is the source of the polypeptide of the present invention has an activity of asymmetrically reducing ethyl 2-formylhexanoate to produce (R) -2-hydroxymethylhexanoate. If it is, it will not specifically limit, For example, the yeast which belongs to Ogataea (Ogataea) genus is mentioned, As an especially preferable thing, Ogataea minuta var. Minuta (NBRC0975) strain | stump | stock can be mentioned. Such microorganisms can be obtained from the Biological Genetic Resource Department (NBRC: 2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818).
本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。 As a medium for culturing the microorganism that is the source of the polypeptide of the present invention, a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients, etc. may be used as long as the microorganism grows. it can.
本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを単離する。 Isolation of the polypeptide from the microorganism that is the source of the polypeptide of the present invention can be carried out by appropriately combining commonly known protein purification methods. For example, it can be implemented as follows. First, the microorganism is cultured in an appropriate medium, and the cells are collected from the culture solution by centrifugation or filtration. The obtained bacterial cells are crushed by an ultrasonic crusher or a physical method using glass beads or the like, and then the microbial cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. And salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fraction precipitation with acetone or ethanol, etc.), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, ultrafiltration The polypeptide of the present invention is isolated from the cell-free extract by using a technique such as these alone or in combination.
単離されたポリペプチドの２−ホルミルへキサン酸エチルを還元する活性は、例えば、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、１．０ｍＭの基質２−ホルミルへキサン酸エチル、２.０ｍＭの補酵素ＮＡＤＰＨ、および粗酵素を添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出できる。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を１ｕｎｉｔと定義する。 The activity of the isolated polypeptide to reduce ethyl 2-formylhexanoate is, for example, as follows: 1. 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.33% (v / v) dimethyl sulfoxide; It can be calculated from the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm when 0 mM substrate 2-formylhexanoate, 2.0 mM coenzyme NADPH, and crude enzyme are added and reacted at 30 ° C. for 1 minute. Under this reaction condition, the activity of oxidizing 1 μmol of NADPH to NADP per minute is defined as 1 unit.
本発明のＤＮＡは、上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。 The DNA of the present invention is a DNA encoding the above-described polypeptide of the present invention, and any DNA can be used as long as it can express the polypeptide in a host cell introduced according to the method described below. A translation area may be included. If the polypeptide can be obtained, such DNA can be obtained by a person skilled in the art from a microorganism that is the origin of the polypeptide by a known method. For example, it can be acquired by the method shown below.
単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。 The isolated polypeptide of the present invention is digested with an appropriate endopeptidase, and the resulting peptide fragment is fractionated by reverse phase HPLC. Then, for example, part or all of the amino acid sequences of these peptide fragments are determined by an ABI492 type protein sequencer (Applied Biosystems).
上述のようにして得られた本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ＡＢＩ３７３Ａ型 ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行うことができる。 Based on the amino acid sequence information of the polypeptide of the present invention obtained as described above, a PCR (Polymerase Chain Reaction) primer for amplifying a part of the DNA encoding the polypeptide is synthesized. Next, chromosomal DNA of the microorganism that is the origin of the polypeptide is prepared by a conventional DNA isolation method, for example, the method of Visser et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)). Using this chromosomal DNA as a template, PCR is carried out using the PCR primers described above, a part of the DNA encoding the polypeptide is amplified, and the base sequence is determined. The base sequence can be determined using, for example, ABI373A type DNA Sequencer (Applied Biosystems).
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988) ）によりその全体の配列を決定することができる。 If the partial base sequence of DNA encoding the polypeptide is clarified, the entire sequence can be determined by, for example, i-PCR (Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)). .
このようにして得られる本発明のＤＮＡの例としては、オガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株由来のポリペプチドの情報を元にして配列が決定された配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。 As an example of the DNA of the present invention thus obtained, the sequence of the sequence listing in which the sequence is determined based on the information of the polypeptide derived from Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain. A DNA containing the base sequence shown in No. 1 can be mentioned. Further, it is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and ethyl 2-formylhexanoate is asymmetrical. The DNA of the present invention also includes a DNA encoding a polypeptide having the activity of reducing to (R) -2-hydroxymethylhexanoate.
配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。 A DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a DNA that hybridizes under stringent conditions are a colony hybridization method, a plaque hybridization method, or a Southern hybridization. When the method or the like is carried out, DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing refers to DNA that specifically forms a hybrid.
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。 Here, stringent conditions include, for example, 75 mM trisodium citrate, 750 mM sodium chloride, 0.5% sodium dodecyl sulfate, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, and 0.1 An aqueous solution composed of 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride, and 0.1% sodium dodecyl sulfate after hybridization at 65 ° C. in an aqueous solution composed of% Ficoll 400 (Amersham Biosciences) The conditions under which cleaning is performed at 60 ° C. are used. Preferably, after hybridization under the above conditions, washing is performed at 65 ° C. using an aqueous solution composed of 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride, and 0.1% sodium dodecyl sulfate. More preferably, the washing is performed at 65 ° C. using an aqueous solution composed of 1.5 mM trisodium citrate, 15 mM sodium chloride, and 0.1% sodium dodecyl sulfate.
本発明のポリペプチドとして、具体的には、オガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株から単離された、配列表の配列番号１に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい例として挙げられる。配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知の酵素（Ｌ−１）と比較して分子量が異なり、新規の酵素である（実施例２参照）。 Specifically, the polypeptide of the present invention is a sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, isolated from the Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain. A preferred example is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the column table. The polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing is a novel enzyme having a molecular weight different from that of the known enzyme (L-1) (see Example 2).
また、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の相同性を有し、かつ、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと機能的に同等であり、本発明に含まれる。 Further, it has a homology of a certain value or more with a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and asymmetrically reduces ethyl 2-formylhexanoate, (R) -2- A polypeptide having an activity to produce ethyl hydroxymethylhexanoate is functionally equivalent to the polypeptide and is included in the present invention.
ここで配列の相同性は、例えば、相同性検索プログラムＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なポリペプチドとしては、当該ポリペプチドとの相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるポリペプチドを挙げることができる。 Here, the sequence homology is, for example, when the two amino acid sequences are compared and analyzed using the homology search program FASTA (WR Pearson & DJ Lipman PNAS (1988) 85: 2444-2448). Represented by value. As a polypeptide equivalent to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a polypeptide having a homology with the polypeptide of 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more Can be mentioned.
このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを、適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。また、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。 In such a polypeptide, for example, a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is linked to an appropriate vector. Then, it is obtained by introducing into a suitable host cell and expressing. Further, for example, according to a known method described in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1989) or the like, substitution or insertion of an amino acid into a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing It can also be obtained by causing deletions or additions.
本発明のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で当該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。 The vector used for introducing the DNA of the present invention into a host microorganism and expressing it in the introduced host microorganism is not particularly limited as long as it can express the gene encoded by the DNA in an appropriate host microorganism. Not. Examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）が好適に使用できる。 Such vectors usually contain regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter and the like, and are operably linked to the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector containing a unit. For example, pUCNT (WO94 / 03613) can be preferably used.
ここで用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。 As used herein, the term “regulatory element” refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
ここで用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。 As used herein, the term “operably linked” means that a gene is operably linked to various regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate gene expression. It is well known to those skilled in the art that the type and kind of the control factor can vary depending on the host.
本発明の発現ベクターの例としては、公知のプラスミドｐＵＣＮＴに、配列番号１に示すＤＮＡを導入した、ｐＮＴＯＦ（実施例５）を挙げることができる。 Examples of the expression vector of the present invention include pNTOF (Example 5) in which the DNA shown in SEQ ID NO: 1 is introduced into a known plasmid pUCNT.
本発明のＤＮＡを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。 Examples of the host cell into which the vector containing the DNA of the present invention is introduced include bacteria, yeast, filamentous fungi, plant cells, animal cells, and the like. Bacteria are preferred from the introduction and expression efficiency, and Escherichia coli is particularly preferred. A vector containing the DNA of the present invention can be introduced into a host cell by a known method. When E. coli is used as the host cell, for example, commercially available E. coli. By using an E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.), the vector can be introduced into a host cell.
本発明の形質転換体の例としては、前述のプラスミドｐＮＴＯＦを導入したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）が挙げられる。この形質転換体は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２３０の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている。 As an example of the transformant of the present invention, E. coli into which the aforementioned plasmid pNTOF has been introduced. coli HB101 (pNTOF). This transformant has a deposit number of FERM BP-10230, and is dated February 9, 2005, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-11-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-8566) 6).
本発明においては、本発明のポリペプチドを、カルボニル基を有する化合物と、ＮＡＤＰＨ等の補酵素の存在下、接触させて反応させることにより、当該カルボニル基を有する化合物を不斉的に還元し、光学活性アルコール類を製造することができる。この時、当該反応の進行に伴い、ＮＡＤＰＨ等の補酵素は酸化型に変換される。しかし、この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて当該反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。上記本発明のポリペプチド及び補酵素再生能を有するポリペプチドは、そのまま用いても良いし、公知の手段で固定化したものであってもよい。 In the present invention, by reacting the polypeptide of the present invention with a compound having a carbonyl group in the presence of a coenzyme such as NADPH, the compound having the carbonyl group is asymmetrically reduced, Optically active alcohols can be produced. At this time, as the reaction proceeds, a coenzyme such as NADPH is converted to an oxidized form. However, a polypeptide having the ability to convert this oxidized coenzyme into a reduced form (hereinafter referred to as coenzyme regeneration ability) and a compound serving as a substrate for the polypeptide coexist with the polypeptide of the present invention. By performing this reaction, the amount of expensive coenzyme used can be greatly reduced. Examples of the polypeptide having coenzyme regeneration ability include hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase. Preferably, glucose dehydrogenase is used. The polypeptide of the present invention and the polypeptide having coenzyme regeneration ability may be used as they are, or may be immobilized by known means.
また、本発明のポリペプチドのかわりに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。とりわけ、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製・添加する必要がなく、光学活性アルコール類の製造をより効率良く行うことができる。 In addition, optically active alcohols can be produced in the same manner by using a transformant containing DNA encoding the polypeptide instead of the polypeptide of the present invention. In addition, optically active alcohols can be produced in the same manner using a transformant containing both a DNA encoding the polypeptide of the present invention and a DNA encoding a polypeptide having coenzyme regeneration ability. it can. In particular, when a transformant containing both a DNA encoding the polypeptide of the present invention and a DNA encoding a polypeptide having a coenzyme regeneration ability is used, an enzyme for regenerating the coenzyme is separately provided. There is no need to prepare and add, and optically active alcohols can be produced more efficiently.
なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体、若しくは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、菌体を含む培養液や培養菌体は言うまでもなく、その処理物としても光学活性アルコール類の製造に使用することができる。ここで言う「形質転換体の処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。 A transformant containing DNA encoding the polypeptide of the present invention, or a transformant containing both DNA encoding the polypeptide of the present invention and DNA encoding a polypeptide having a coenzyme regeneration ability, Needless to say, the culture solution containing the microbial cells and the cultured microbial cells can be used for the production of optically active alcohols. The term “transformed product” as used herein refers to, for example, cells treated with a surfactant or an organic solvent, dried cells, disrupted cells, crude cell extracts, and the like by known means. It means something fixed.
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。 A transformant containing both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding the polypeptide having a coenzyme regeneration ability has a DNA encoding the polypeptide of the present invention and a coenzyme regeneration ability. In addition to incorporating both of the DNAs encoding the polypeptides having the same into the same vector and introducing it into a host cell, these two types of DNA are incorporated into two different vectors of different incompatibility groups, They can also be obtained by introducing these two vectors into the same host cell.
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターの例としては、前記発現ベクターｐＮＴＯＦにバシラス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、ｐＮＴＯＦＧ１（実施例６）が挙げられる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、当該ベクターでＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）が挙げられる。この形質転換体は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２３１の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている。 As an example of a vector in which both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding the polypeptide having coenzyme regeneration ability are incorporated, the expression vector pNTOF contains a Bacillus megaterium-derived glucose dehydrogenase gene. The introduced pNTOFG1 (Example 6) can be mentioned. Examples of transformants containing both the DNA encoding the polypeptide of the present invention and the DNA encoding a polypeptide having coenzyme regeneration ability include E. obtained by transforming E. coli HB101. coli HB101 (pNTOFG1). This transformant has a deposit number of FERM BP-10231, and is dated February 9, 2005, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-11-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-8566) 6).
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体の培養や本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。 Culture of a transformant containing DNA encoding the polypeptide of the present invention and culture of a transformant containing both DNA encoding the polypeptide of the present invention and DNA encoding a polypeptide having a coenzyme regeneration ability include: As long as they grow, it can be carried out using a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like.
形質転換体中の本発明のポリペプチドの還元活性は、前述の単離されたポリペプチドの活性測定方法と同様にして算出することが出来る。また、形質転換体中の補酵素再生能を有するポリペプチドの活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、１００ｍＭのグルコース、２ｍＭの補酵素ＮＡＤＰまたはＮＡＤ、および酵素を添加し、２５℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度から算出できる。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰまたはＮＡＤを、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨに還元する活性を１ｕｎｉｔと定義する。 The reducing activity of the polypeptide of the present invention in the transformant can be calculated in the same manner as the method for measuring the activity of the isolated polypeptide described above. Moreover, the activity of the polypeptide having a coenzyme regeneration ability in the transformant can be measured by a conventional method. For example, the activity of glucose dehydrogenase is obtained by adding 100 mM glucose, 2 mM coenzyme NADP or NAD, and an enzyme to 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and reacting at 25 ° C. for 1 minute. Of the absorbance at a wavelength of 340 nm. Under this reaction condition, the activity of reducing 1 μmol of NADP or NAD to NADPH or NADH per minute is defined as 1 unit.
本発明のポリペプチド、又は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体のいずれかを用いた光学活性アルコール類の製造は、適当な溶媒中に、基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、及び、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を添加し、ｐＨ調整下、攪拌することにより実施できる。 Polypeptides of the present invention, or the preparation of optically active alcohols using any of transformants containing DNA encoding the polypeptide, in a suitable solvent a compound having a carbonyl group as a substrate, NADPH And the like, and a transformant containing the polypeptide of the present invention or a DNA encoding the polypeptide, and stirring under pH adjustment.
一方、本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて反応を行う場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、グルコース）をさらに添加する。なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体、または、その処理物を用いる場合は、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）を別途添加する必要はない。 On the other hand, when the reaction is performed by combining the polypeptide of the present invention with a polypeptide having coenzyme regeneration ability, the reaction composition includes a polypeptide having coenzyme regeneration ability (for example, glucose dehydrogenase) and its substrate. Further, a compound (for example, glucose) is added. When using a transformant containing both a DNA encoding the polypeptide of the present invention and a DNA encoding a polypeptide having coenzyme regeneration ability (for example, glucose dehydrogenase), or a processed product thereof, There is no need to separately add a polypeptide having coenzyme regeneration ability (for example, glucose dehydrogenase).
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。 For the reaction, an aqueous solvent may be used, or an aqueous and organic solvent may be mixed and used. Examples of the organic solvent include toluene, ethyl acetate, n-butyl acetate, hexane, isopropanol, diisopropyl ether, methanol, acetone, dimethyl sulfoxide and the like. The reaction is carried out at a temperature of 10 ° C. to 70 ° C., and the pH of the reaction solution is maintained at 4-10. The reaction can be carried out batchwise or continuously. In the case of a batch system, the reaction substrate is added at a feed concentration of 0.1% to 70% (w / v).
本発明の還元反応の基質となるカルボニル基を有する化合物としては、例えば、下記一般式（３）： Examples of the compound having a carbonyl group serving as a substrate for the reduction reaction of the present invention include the following general formula (3):
上述の反応条件において、前記一般式（３）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を基質とした場合、下記一般式（４）： In the above reaction conditions, when the 2-formyl acetate derivative represented by the general formula (3) is used as a substrate, the following general formula (4):
反応で生じた光学活性アルコール類は、常法により精製できる。例えば、反応で生じた光学活性アルコール類を含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、または、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製できる。 The optically active alcohol produced by the reaction can be purified by a conventional method. For example, a reaction solution containing optically active alcohols generated in the reaction is extracted with an organic solvent such as ethyl acetate and toluene, and the organic solvent is distilled off under reduced pressure, followed by distillation, recrystallization, chromatography, etc. It can purify | clean by processing.
２−ホルミルへキサン酸エチル、および、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの定量は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＨＰ−５(ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ５％ ＰＨＭＥ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ)（φ０．３２ｍｍ×３０ｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、カラム温度：１２０℃、キャリアガス：ヘリウム（１２５ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行うことができる。さらに、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β（φ０．２５ｍｍ×６０ｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、カラム温度：１１０℃、キャリアガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行うことができる。 The amount of ethyl 2-formylhexanoate and ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate was determined by capillary gas chromatography (column: HP-5 (crosslinked 5% PHME Silicone) (φ0.32 mm × 30 m; Agilent Technologies, Inc.), column temperature: 120 ° C., carrier gas: helium (125 kPa), detection: FID). Further, the optical purity of ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate was measured by capillary gas chromatography (column: Cyclodex-β (φ0.25 mm × 60 m; manufactured by J & W Scientific), column temperature: 110 ° C., Carrier gas: helium (300 kPa), detection: FID) can be used.
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを始めとする、有用な光学活性アルコール類の優れた製造法が提供される。 As described above, according to the present invention, it is possible to efficiently produce the polypeptide of the present invention. By using this, useful is useful including ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate. An excellent method for producing optically active alcohols is provided.
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by these. Detailed operation methods relating to the recombinant DNA technology used in the following examples are described in the following documents:
Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),
Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience).
（実施例１）ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、オガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株より、２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。
(Example 1) Purification of Polypeptide According to the following method, ethyl 2-formylhexanoate was asymmetrically reduced from Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 (R) A polypeptide having activity to produce ethyl 2-hydroxymethylhexanoate was isolated and purified to a single species. Unless otherwise noted, purification operations were performed at 4 ° C.
２−ホルミルへキサン酸エチルに対する還元活性は、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質２−ホルミルへキサン酸エチルを終濃度１．０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度２.０ｍＭとなるよう溶解し、さらに粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行った際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を、１ｕｎｉｔと定義した。 The reduction activity for ethyl 2-formylhexanoate was determined by adding ethyl 2-formylhexanoate to a final concentration of 1 in 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.33% (v / v) dimethylsulfoxide. 0.0mM, coenzyme NADPH was dissolved to a final concentration of 2.0mM, and the reaction mixture was reacted at 30 ° C for 1 minute after addition of the crude enzyme solution. Calculated. Under these reaction conditions, the activity of oxidizing 1 μmol of NADPH to NADP per minute was defined as 1 unit.
（微生物の培養）
５００ｍｌ容坂口フラスコに、グルコース５％、ペプトン１％、酵母エキス１％、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）１滴からなる液体培地３０ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の培養液３００μｌを無菌的に接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。
(Microbial culture)
In a 500 ml Sakaguchi flask, 30 ml of a liquid medium comprising 5% glucose, 1% peptone, 1% yeast extract, and 1 drop of Adecanol LG-109 (manufactured by Nippon Oil & Fats) was prepared and steam sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. This medium was aseptically inoculated with 300 μl of the culture solution of Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain previously cultured in the same medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 72 hours. did.
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養方法で得られた培養液１２００ｍｌについて、遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ ｍｏｄｅｌ １１０７９００（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔ，ＩＮＣ．製）で破砕した後、破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液８０ｍｌを得た。
(Adjustment of cell-free extract)
About 1200 ml of the culture solution obtained by the above culture method, the cells were collected by centrifugation, and the cells were washed with 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). The cells were suspended in 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), crushed with BEAD-BEATER model 1107900 (Biospec Product, INC.), And then the cell residue was removed from the crushed material by centrifugation. 80 ml of cell-free extract was obtained.
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得られた無細胞抽出液８０ｍｌを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１夜透析し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（９５ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．５Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、終濃度が１．５Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し、１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
(DEAE-TOYOPEARL column chromatography)
80 ml of the cell-free extract obtained above was dialyzed overnight with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and DEAE-TOYOPEARL 650M (Tosoh Corporation) pre-equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Product) column (95 ml) to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a NaCl linear gradient (from 0 M to 0.5 M). The active fractions were collected, ammonium sulfate was dissolved to a final concentration of 1.5 M, and dialyzed overnight against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.5 M ammonium sulfate.
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４５ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１．５Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。
(Phenyl-TOYOPEARL column chromatography)
A phenyl-TOYOPEARL 650M (manufactured by Tosoh Corporation) column (45 ml) in which the active fraction obtained by DEAE-TOYOPEARL column chromatography was pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.5 M ammonium sulfate. ) To adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear ammonium sulfate gradient (from 1.5 M to 0 M). Active fractions were collected and dialyzed overnight against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0).
（２’，５’−ＡＤＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した２’，５’−ＡＤＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（２０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、ポリペプチドの精製標品を得た。
（実施例２）ポリペプチドの諸性質
実施例１で調製した精製ポリペプチドの酵素化学的性質について調べた。
(2 ′, 5′-ADP sepharose column chromatography)
An active fraction obtained by Phenyl-TOYOPEARL column chromatography was pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), 2 ′, 5′-ADP sepharose (manufactured by Amersham Biosciences) column (20 ml) And the active fraction was adsorbed. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a NaCl linear gradient (from 0 M to 1 M). The active fractions were collected and dialyzed overnight against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) to obtain a purified polypeptide preparation.
Example 2 Various Properties of Polypeptide Enzymatic chemical properties of the purified polypeptide prepared in Example 1 were examined.
（１）作用
ＮＡＤＰＨを補酵素として、２−ホルミルへキサン酸エチルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルへ還元した。
(1) Action With NADPH as a coenzyme, it acts on ethyl 2-formylhexanoate to give an optical purity of 99% e.e. e. Was reduced to ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate.
（２）分子量
溶離液として２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）による精製ポリペプチドのゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した分子量は約３６，０００であった。
(2) Molecular weight Result of gel filtration chromatography analysis of purified polypeptide using Superdex 200HR10 / 30 (Pharmacia Biotech) using 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 200 mM sodium chloride as eluent. The molecular weight calculated from the relative retention time with the standard protein was about 36,000.
（３）至適温度
作用至適温度を調べるため、２０〜７０℃における２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性を実施例１に記載した方法で測定した。その結果、至適温度は４５℃付近であった。
(3) Optimum temperature In order to investigate the optimum temperature of action, 2-formylhexanoic acid ethyl reduction activity at 20 to 70 ° C. was measured by the method described in Example 1. As a result, the optimum temperature was around 45 ° C.
（４）至適ｐＨ
作用至適ｐＨを調べるため、ｐＨ３．５〜９.０における２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性を実施例１に記載した方法で測定した。緩衝液として１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜５．５）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜７．５）、及び１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）を用いて、ｐＨ３．５〜９.０の範囲で活性を測定した。その結果、至適ｐＨは６．０であった。
(4) Optimum pH
In order to investigate the optimum pH of action, the ethyl 2-formylhexanoate reducing activity at pH 3.5 to 9.0 was measured by the method described in Example 1. Using 100 mM acetate buffer (pH 3.5 to 5.5), 100 mM phosphate buffer (pH 5.0 to 7.5), and 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0 to 9.0) as buffers. The activity was measured in the range of pH 3.5 to 9.0. As a result, the optimum pH was 6.0.
（実施例３）精製ポリペプチドを用いた（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの合成
実施例１で調製した精製ポリペプチド溶液に、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１００Ｕ、グルコース２０ｍｇ、ＮＡＤＰ１．０ｍｇ、各種２−ホルミルアルカン酸エチル誘導体２ｍｇを添加し、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、反応の進行をＴＬＣで確認した後、生成物の光学純度を測定した。その結果を表２に示した。
(Example 3) Synthesis of ethyl (R) -2-hydroxymethylalkanoate using purified polypeptide To the purified polypeptide solution prepared in Example 1, 100 U glucose dehydrogenase (Amano Enzyme), 20 mg glucose NADP 1.0 mg and various 2-formyl ethyl alkanoic acid derivatives 2 mg were added and stirred at 30 ° C. for 20 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate, the progress of the reaction was confirmed by TLC, and the optical purity of the product was measured. The results are shown in Table 2.
２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：Ｃｙｃｌｏｄｅｘ−β（φ０．２５ｍｍ×６０ｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、カラム温度：１１０℃、キャリアガス：ヘリウム（３００ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。なお、得られた２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルは全てＲ体であった。 The optical purity of ethyl 2-hydroxymethylalkanoate was measured by capillary gas chromatography (column: Cyclodex-β (φ0.25 mm × 60 m; manufactured by J & W Scientific), column temperature: 110 ° C., carrier gas: helium (300 kPa). Detection: FID). In addition, all the obtained 2-hydroxymethyl alkanoic acid ethyl was R body.
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ポリペプチドを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列に基づき、該ポリペプチドをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５’−tayytnatgcaytggccngt−３’（配列表の配列番号３）、および、プライマー２：５’−tcytcnggrtcrttrtanac−３’（配列表の配列番号４）を合成した。
The purified polypeptide obtained in Example 1 was denatured in the presence of 8M urea, and then digested with Achromobacter-derived lysyl endopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The amino acid sequence of the obtained peptide fragment was It was determined with an ABI492 type protein sequencer (manufactured by PerkinElmer). Primer 1: 5′-tayytnatgcaytggccngt-3 ′ (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) for amplifying a part of the gene encoding the polypeptide by PCR based on the DNA sequence predicted from this amino acid sequence, and Primer 2: 5′-tcytcnggrtcrttrtanac-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) was synthesized.
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例１と同様に培養したオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の菌体からＶｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を解析した。その結果判明した塩基配列を、配列表の配列番号５に示した。
(Amplification of genes by PCR)
Chromosomal DNA according to the method of Visser et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)) from cells of Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain cultured in the same manner as in Example 1. Extracted. Next, PCR was performed using the DNA primers 1 and 2 prepared above and the obtained chromosomal DNA as a template. As a result, a DNA fragment of about 0.6 kbp, which is considered to be a part of the target gene, was amplified. PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual. This DNA fragment was cloned into the plasmid pT7Blue T-Vector (manufactured by Novagen), and ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (manufactured by Perkin Elmer) and ABI 373A enMerPer Ec The sequence was analyzed. The resulting base sequence is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
（ｉ−ＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＢｇｌIIで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988) ）により、上述の配列番号５に示す塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号１に示した。また、配列番号１に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示した。
(Determination of full-length sequence of target gene by i-PCR method)
The chromosomal DNA of the Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain prepared above was completely digested with the restriction enzyme BglII, and the resulting DNA fragment mixture was intramolecularly cyclized with T4 ligase. . Using this as a template, the entire base sequence of the gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 was determined by i-PCR (Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)). The result is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2.
（実施例５）発現ベクターの構築
プライマー３：５’−gggaattccatatgctttctatttgcac−３’（配列表の配列番号６）と、プライマー４：５’−atcgagctcttatcaagcctgaataatc−３’（配列表の配列番号７）を用い、実施例３で得たオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号1に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＳａｃＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＯＦを構築した。
(Example 5) Construction of expression vector Primer 3: 5'-gggaattccatatgctttctatttgcac-3 '(SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) and primer 4: 5'-atcgagctcttatcaagcctgaataatc-3' (SEQ ID NO: 7 in the sequence listing) were used. PCR was performed using the chromosomal DNA of Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 strain obtained in Example 3 as a template. As a result, a double-stranded DNA in which an NdeI recognition site was added to the start codon portion of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a SacI recognition site was added immediately after the termination codon was obtained. This DNA was digested with NdeI and SacI and inserted between the NdeI recognition site and the SacI recognition site downstream of the lac promoter of the plasmid pUCNT (WO94 / 03613) to construct a recombinant vector pNTOF.
（実施例６）グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む発現ベクターの構築
プライマー５：５’−atcgagctctaaggaggttaacaatgtataaagatttagaagg−３’（配列表の配列番号８）と、プライマー６：５’−gcgctgcagttatccgcgtcctgcttgga−３’（配列表の配列番号９）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＳａｃＩ切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後にＰｓｔＩ切断点が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＰｓｔＩで消化した。これを上記の組換えベクターｐＮＴＯＦのＳａｃＩ認識部位とＰｓｔＩ認識部位の間に挿入して、組み換えプラスミドｐＮＴＯＦＧ１を構築した。ｐＮＴＯＦＧ１の作製法および構造を図１に示す。
(Example 6) Construction of expression vector further containing glucose dehydrogenase gene Primer 5: 5'-atcgagctctaaggaggttaacaatgtataaagatttagaagg-3 '(SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) and primer 6: 5'-gcgctgcagttatccgcgtcctgcttgga-3' (sequence listing) PCR was performed using plasmid pGDK1 (Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)) as a template, and glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium IAM1030 strain (hereinafter referred to as “SEQ ID NO: 9”). A double-stranded DNA in which an Escherichia coli ribosome binding sequence is added 5 bases upstream from the start codon of the gene, a SacI breakpoint is added immediately before it, and a PstI breakpoint is added immediately after the stop codon. Acquired. The obtained DNA fragment was digested with SacI and PstI. This was inserted between the SacI recognition site and the PstI recognition site of the above recombinant vector pNTOF to construct a recombinant plasmid pNTOFG1. The preparation method and structure of pNTOFG1 are shown in FIG.
（実施例７）形質転換体の作製
実施例４で構築した組換えベクターｐＮＴＯＦを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）を得た。この形質転換体は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２３０の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている。
(Example 7) Production of transformant Using the recombinant vector pNTOF constructed in Example 4, E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed. coli HB101 (pNTOF) was obtained. This transformant has a deposit number of FERM BP-10230, and is dated February 9, 2005, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-11-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-8566) 6).
また、同様に、実施例５で構築した組換えベクターｐＮＴＯＦＧ１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）を得た。この形質転換体は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２３１の受託番号で、２００５年２月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている。 Similarly, using the recombinant vector pNTOFG1 constructed in Example 5, E. E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed. coli HB101 (pNTOFG1) was obtained. This transformant has a deposit number of FERM BP-10231, and is dated February 9, 2005, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-11-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-8566) 6).
（実施例８）形質転換体における遺伝子の発現
実施例７で得た２種の形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮＴを含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）６０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、６０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性、および、ＧＤＨ活性を測定したものを、表２に示した。実施例５で得られた２種の形質転換体のいずれにおいても、２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性の発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）では、ＧＤＨ活性の発現も認められた。２−ホルミルへキサン酸エチル還元活性は、実施例１に記載の方法で測定した。ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
(Example 8) Expression of gene in transformant Two types of transformants obtained in Example 7, and a transformant containing vector plasmid pUCNT, E. coli E. coli HB101 (pUCNT) is inoculated into 60 ml of 2 × YT medium (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0) containing 100 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. for 24 hours. Cultured with shaking for hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 60 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5). This was crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. Table 2 shows the cell-free extract obtained by measuring the ethyl 2-formylhexanoate reducing activity and the GDH activity. In any of the two types of transformants obtained in Example 5, expression of ethyl 2-formylhexanoate reducing activity was observed. In addition, E. coli containing the GDH gene. In E. coli HB101 (pNTOFG1), expression of GDH activity was also observed. The ethyl 2-formylhexanoate reducing activity was measured by the method described in Example 1. GDH activity was determined by adding 0.1 M glucose, 2 mM coenzyme NADP, and crude enzyme solution to 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), reacting at 25 ° C. for 1 minute, and increasing absorbance at a wavelength of 340 nm. Calculated. Under these reaction conditions, the enzyme activity for reducing 1 μmol of NADP to NADPH per minute was defined as 1 unit.
実施例８と同様に調製したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦ）の無細胞抽出液１ｍｌに、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１００Ｕ、グルコース２０ｍｇ、ＮＡＤＰ１．０ｍｇ、２−ホルミルへキサン酸エチル１０ｍｇを添加し、３０℃で２０時間振とうした。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、抽出物を分析した。その結果、収率９９％で光学純度９９％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルが得られた。
２−ホルミルへキサン酸エチル、および、２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの定量は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＨＰ−５(ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ５％ ＰＨＭＥ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ)（φ０．３２ｍｍ×３０ｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、カラム温度：１２０℃、キャリアガス：ヘリウム（１２５ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。さらに、２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの光学純度の測定は、実施例３と同様の方法で行った。 The amount of ethyl 2-formylhexanoate and ethyl 2-hydroxymethylhexanoate was determined by capillary gas chromatography (column: HP-5 (crosslinked 5% PHME Silicone) (φ0.32 mm × 30 m; manufactured by Agilent Technologies). ), Column temperature: 120 ° C., carrier gas: helium (125 kPa), detection: FID). Furthermore, the optical purity of ethyl 2-hydroxymethylhexanoate was measured in the same manner as in Example 3.
（実施例１０）形質転換体を用いた（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルの合成
実施例８と同様に調製したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＦＧ１）の培養液１００ｍｌに、５５％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液８５ｍｌ、ＮＡＤＰ６ｍｇ、２−ホルミルへキサン酸エチル３０ｇを添加し、１０Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で３５時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、抽出物を実施例９と同様の方法で分析した。その結果、収率９６％で光学純度９９％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルが得られた。
(Example 10) Synthesis of ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate using transformants E. coli prepared in the same manner as in Example 8. 85 ml of 55% (w / v) glucose aqueous solution, 6 mg of NADP, and 30 g of ethyl 2-formylhexanoate were added to 100 ml of the culture solution of E. coli HB101 (pNTOFG1), and adjusted to pH 6.5 by dropwise addition of 10M sodium hydroxide. The mixture was stirred at 30 ° C. for 35 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate, and the extract was analyzed in the same manner as in Example 9. As a result, the yield was 96% and the optical purity was 99% e.e. e. Of (R) -2-hydroxymethylhexanoic acid was obtained.
（実施例１１）ポリペプチドの基質特異性
０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となるカルボニル化合物を終濃度１.０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度２.０ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例１で調製した精製ポリペプチドを適当量添加し、３０℃で１分間反応を行った。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これを２−ホルミルへキサン酸エチルに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表３に示した。表３から明らかなように本発明のポリペプチドは、広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。
(Example 11) Substrate specificity of polypeptide A 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.33% (v / v) dimethyl sulfoxide was added with a carbonyl compound serving as a substrate at a final concentration of 1.0 mM. The enzyme NADPH was dissolved to a final concentration of 2.0 mM. An appropriate amount of the purified polypeptide prepared in Example 1 was added thereto, and the reaction was performed at 30 ° C. for 1 minute. From the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm of the reaction solution, the reduction activity for each carbonyl compound was calculated and expressed as a relative value when the activity for ethyl 2-formylhexanoate was taken as 100%. It was. As is apparent from Table 3, the polypeptide of the present invention showed reducing activity against a wide range of carbonyl compounds.
Claims (15)
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、式(１)：
(A) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(B) hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the formula (1):
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記式(１)で表される２−ホルミルへキサン酸エチルを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルへキサン酸エチルを生成する活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(A) A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and asymmetrically forming ethyl 2-formylhexanoate represented by the formula (1) A polypeptide having an activity of reducing to produce ethyl (R) -2-hydroxymethylhexanoate represented by the formula (2).
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