JP2006246744A - Gene introduction method, gene targeting method and method for producing transgenic plant - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
【課題】 第１の目的は、より効率的で、ジーンサイレンシングの抑制が可能な植物の遺伝子導入方法の提供であり、第２の目的は、相同的組換え効率が向上したジーンターゲッティング方法の提供である。
【解決手段】 前記第１の目的を達成するために、本発明の遺伝子導入方法は、ＤＮＡ複製に伴うヌクレオソーム形成反応に関与する因子をコードする１又は２以上の遺伝子が機能発現抑制される植物の変異体を準備し、前記変異体に外来遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入して、外来遺伝子導入変異体を得ることを含む方法である。前記第２の目的を達成するために、本発明のジーンターゲッティング方法は、標的遺伝子及び/又は該標的遺伝子に隣接する領域と相同な部分と外来遺伝子とを含むポリヌクレオチドを、前記植物の変異体に、本発明の遺伝子導入方法を用いて導入し、相同的組換えによる外来遺伝子導入変異体を得ることを含む方法である。
【選択図】なし
PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a plant gene introduction method that is more efficient and capable of suppressing gene silencing, and the second object is to provide a gene targeting method with improved homologous recombination efficiency. Is an offer.
[MEANS FOR SOLVING PROBLEMS] To achieve the first object, the gene introduction method of the present invention is a plant in which the expression of one or more genes encoding a factor involved in a nucleosome formation reaction accompanying DNA replication is suppressed. And preparing a foreign gene-introduced mutant by introducing a polynucleotide containing a foreign gene into the mutant. In order to achieve the second object, the gene targeting method of the present invention uses a target gene and / or a polynucleotide containing a part homologous to a region adjacent to the target gene and a foreign gene as a mutant of the plant. The method further comprises introducing the gene using the gene introduction method of the present invention to obtain a foreign gene introduction mutant by homologous recombination.
[Selection figure] None
Description
本発明は、遺伝子導入方法、ジーンターゲッティング方法及びトランスジェニック植物の製造方法に関する。 The present invention relates to a gene introduction method, a gene targeting method, and a method for producing a transgenic plant.
植物に外来遺伝子を導入する方法としては、大きく分けて２つの方法がある。第１の方法は、物理的に植物細胞の一部に穴を空け、この穴から植物細胞に遺伝子を導入する直接的・物理的方法であり、第２の方法は、微生物やウイルスの遺伝子導入能力を利用した間接的・生物的方法である。 There are roughly two methods for introducing foreign genes into plants. The first method is a direct / physical method in which a hole is physically made in a part of a plant cell, and a gene is introduced into the plant cell from this hole, and the second method is a gene introduction of a microorganism or virus. It is an indirect and biological method that uses the ability.
前記第１の方法としては、例えば、パーティクルガン法（特許文献１参照）、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。前記パーティクルガン法は、微小な金属粒子に外来の遺伝子を付着しておき、この金属粒子を空気銃で植物細胞に打ち込み遺伝子を導入する方法である。前記第２の方法としては、アグロバクテリウム法（特許文献２〜６参照）、ウイルスベクター法（特許文献７〜８参照）等が挙げられる。前記アグロバクテリウム法は、土壌細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓが植物に感染するときにプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域と呼ばれる部分を植物染色体に挿入する仕組みを利用して遺伝子を導入する方法である。前記ウイルスベクター法は、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ブロモモザイクウイルス（ＢＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）等の植物ＲＮＡウイルスを改変して作製されたベクターを用いて外来遺伝子を導入する方法である。 Examples of the first method include a particle gun method (see Patent Document 1), a polyethylene glycol method (PEG method), an electroporation method, and the like. The particle gun method is a method in which a foreign gene is attached to minute metal particles, the metal particles are driven into a plant cell with an air gun, and the gene is introduced. Examples of the second method include an Agrobacterium method (see Patent Documents 2 to 6), a virus vector method (see Patent Documents 7 to 8), and the like. The Agrobacterium method is a method for introducing a gene using a mechanism for inserting a portion called a T-DNA region on a plasmid into a plant chromosome when the soil bacterium Agrobacterium tumefaciens infects a plant. The viral vector method is, for example, a method of introducing a foreign gene using a vector prepared by modifying a plant RNA virus such as tobacco mosaic virus (TMV), bromo mosaic virus (BMV), or cucumber mosaic virus (CMV). It is.
これらの遺伝子導入技術によれば、交雑育種では付与することが困難な有用な形質が付与されたトランスジェニック植物を効率的に製造することができる。トランスジェニック植物の製造技術を、食糧用植物、飼料用植物、観賞用植物、環境用植物、実験用植物、資源用植物等に利用することは、農業、商業、工業を含む産業一般において、重要な意義がある。 According to these gene introduction techniques, a transgenic plant having a useful trait that is difficult to impart by cross breeding can be efficiently produced. The use of transgenic plant production technology for food plants, feed plants, ornamental plants, environmental plants, experimental plants, resource plants, etc. is important in general industries including agriculture, commerce, and industry. There is significant significance.
トランスジェニック植物の実用化への技術的問題点としては、次の３つの問題が挙げられる。第１の問題は、植物の遺伝子導入効率の低さである。すなわち、動物細胞の場合と異なり、植物細胞への外来遺伝子の導入効率が低いという問題がある。この問題を解決すべく、上述したように、様々な物理的、生物的な遺伝子導入方法が開発されている。しかし、植物においては、さらなる第２の問題がある。すなわち、外来遺伝子を植物のゲノムに導入できたとしても、導入した遺伝子の発現が、いわゆるジーンサイレンシングにより低下するという問題である。この問題を解決すべく、例えば、特殊なプロモーター配列を使用する方法（特許文献９参照）や、エキソヌクレアーゼ遺伝子を導入する方法（特許文献１０参照）等が開発されている。 The following three problems are listed as technical problems for the practical application of transgenic plants. The first problem is the low gene transfer efficiency of plants. That is, unlike the case of animal cells, there is a problem that the efficiency of introducing foreign genes into plant cells is low. In order to solve this problem, various physical and biological gene transfer methods have been developed as described above. However, there is an additional second problem in plants. That is, even if a foreign gene can be introduced into the genome of a plant, the expression of the introduced gene is reduced by so-called gene silencing. In order to solve this problem, for example, a method using a special promoter sequence (see Patent Document 9), a method for introducing an exonuclease gene (see Patent Document 10), and the like have been developed.
トランスジェニック植物の実用化への第３の問題は、相同的組換え効率の低さである。特に、高等植物においては、導入された外来遺伝子の相同的組換え効率が低く、ジーンターゲッティングが困難であるという問題がある。植物における相同的組換えを向上させる従来法は、幾つか知られている。例えば、植物細胞内で、微生物のＤＮＡ複製・修復・組換えに関与するタンパク質を発現させることで相同的組換え効率を向上させる方法がある。具体的には、大腸菌のＲｅｃＡ遺伝子（特許文献１１、非特許文献１参照）、ＲｕｖＣ遺伝子、ＲｅｃＱ遺伝子（特許文献１２参照）、酵母菌のＲａｄ５２遺伝子（特許文献１３参照）、ＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子、アカパンカビのＵＶＤＥ遺伝子（特許文献１４参照）等の発現により、シロイヌナズナにおける相同的組換えの向上が図れることが開示されている。また、タバコにおける相同的組換えが、ＰＡＲＰ阻害物質を用いることにより増加できることがわかっている（非特許文献２参照）。さらに、遺伝子の組み込みが相同的組換え又は非相同的組換えのいずれによるものであるかの選択を、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを利用して容易に可能とする方法も開示されいる（特許文献１５参照）。 The third problem for the practical application of transgenic plants is low homologous recombination efficiency. Particularly in higher plants, there is a problem that homologous recombination efficiency of the introduced foreign gene is low and gene targeting is difficult. Several conventional methods for improving homologous recombination in plants are known. For example, there is a method for improving homologous recombination efficiency by expressing a protein involved in microbial DNA replication / repair / recombination in plant cells. Specifically, RecA gene of Escherichia coli (see Patent Document 11 and Non-patent Document 1), RuvC gene, RecQ gene (see Patent Document 12), Rad52 gene of yeast (see Patent Document 13), HO endonuclease gene, It is disclosed that the homologous recombination in Arabidopsis thaliana can be improved by the expression of the I-SceI endonuclease gene, the red mold UVDE gene (see Patent Document 14) and the like. Moreover, it has been found that homologous recombination in tobacco can be increased by using a PARP inhibitor (see Non-Patent Document 2). Furthermore, a method is also disclosed that makes it possible to easily select whether gene integration is by homologous recombination or non-homologous recombination using a positive selection marker and a negative selection marker (patent). Reference 15).
しかしながら、これらの従来技術を踏まえても、トランスジェニック植物の製造技術については、より効率的で、ジーンサイレンシングの抑制解除も可能な遺伝子導入方法についての新たな技術や、相同的組換え効率が向上したジーンターゲッティング方法についての新たな技術が望まれている。 However, even in light of these conventional technologies, the transgenic plant production technology is more efficient, and there are new technologies for gene transfer methods that can cancel gene silencing suppression and homologous recombination efficiency. New techniques for improved gene targeting methods are desired.
そこで、本発明は、より効率的で、ジーンサイレンシングの抑制解除が可能な植物の遺伝子導入方法の提供を第１の目的とし、相同的組換え効率が向上したジーンターゲッティング方法の提供を第２の目的とする。 Accordingly, the first object of the present invention is to provide a plant gene introduction method that is more efficient and capable of releasing suppression of gene silencing, and secondly to provide a gene targeting method with improved homologous recombination efficiency. The purpose.
前記第１の目的を達成するために、本発明の遺伝子導入方法は、植物に外来遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、ＤＮＡ複製に伴うヌクレオソーム形成反応に関与する因子をコードする１又は２以上の遺伝子が機能発現抑制される植物の変異体を準備する準備工程と、前記変異体に外来遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入して、外来遺伝子導入変異体を得る遺伝子導入工程とを含む遺伝子導入方法である。 In order to achieve the first object, the gene introduction method of the present invention is a gene introduction method for introducing a foreign gene into a plant, which encodes a factor involved in a nucleosome formation reaction associated with DNA replication. Gene introduction comprising a preparatory step of preparing a plant mutant in which the expression of the above gene is suppressed, and a gene introduction step of obtaining a foreign gene-introduced mutant by introducing a polynucleotide containing the foreign gene into the mutant Is the method.
前記第２の目的を達成するために、本発明のジーンターゲッティング方法は、植物ゲノムの標的遺伝子の遺伝子座に、相同的組換えにより外来遺伝子を組込むジーンターゲッティング方法であって、標的遺伝子及び/又は該標的遺伝子に隣接する領域と相同な部分と外来遺伝子とを含むポリヌクレオチドを調製するポリヌクレオチド調製工程と、本発明の遺伝子導入方法により、前記ポリヌクレオチドを前記植物の変異体に相同的組換えにより導入して外来遺伝子導入変異体又は外来遺伝子導入植物を得る遺伝子導入工程とを含むジーンターゲッティング方法である。 In order to achieve the second object, the gene targeting method of the present invention is a gene targeting method for incorporating a foreign gene into a target gene locus of a plant genome by homologous recombination, wherein the target gene and / or Homologous recombination of the polynucleotide to the mutant of the plant by a polynucleotide preparation step for preparing a polynucleotide comprising a portion homologous to a region adjacent to the target gene and a foreign gene, and the gene introduction method of the present invention And a gene introduction step of obtaining an exogenous gene introduction mutant or an exogenous gene introduction plant by introducing by the above.
本発明の遺伝子導入方法よれば、非相同的組換えによる導入効率が向上した外来遺伝子の導入により、例えば、非相同的組換えによる外来遺伝子導入トランスジェニック植物を効率よく製造できる。また、本発明の遺伝子導入方法によれば、植物ゲノムにランダムに挿入された外来遺伝子のジーンサイレンシングが、脱抑制される。 According to the gene introduction method of the present invention, for example, a foreign gene-introduced transgenic plant by non-homologous recombination can be efficiently produced by introduction of a foreign gene with improved introduction efficiency by non-homologous recombination. Moreover, according to the gene introduction method of the present invention, gene silencing of a foreign gene randomly inserted into a plant genome is derepressed.
本発明のジーンターゲッティング方法によれば、相同的組換えによる導入効率が向上した外来遺伝子の導入により、例えば、外来遺伝子導入トランスジェニック植物を効率よく製造できる。この相同組換えによる外来遺伝子導入トランスジェニック植物の製造方法であれば、植物ゲノム上の標的遺伝子に外来遺伝子が挿入されるから、ランダムに挿入される非相同的組換えに比べ、予測不能な危険を回避でき、人体や自然環境に対する安全性が向上する。 According to the gene targeting method of the present invention, for example, a foreign gene-introduced transgenic plant can be efficiently produced by introducing a foreign gene with improved introduction efficiency by homologous recombination. In this method of producing a transgenic plant by introduction of a foreign gene by homologous recombination, the foreign gene is inserted into the target gene on the plant genome, and therefore unpredictable risk compared to randomly inserted non-homologous recombination. Can be avoided, and safety to the human body and the natural environment is improved.
また、本発明の方法に使用する植物の変異体は、ヌクレオソーム形成に関する因子をコードする遺伝子が機能発現抑制された変異体であるから、本発明のトランスジェニック植物は、直接的にＤＮＡ複製、複製、組換え等に関わる因子の変異体を用いる他の方法を用いる場合に比べて、遺伝情報そのものに変異が蓄積されるおそれが低いと考えられる。なぜなら、ヌクレオソーム形成反応に関与する因子は、遺伝子の塩基配列そのものに影響を与える因子ではなく、ＤＮＡの修飾、ヒストンの修飾、クロマチンの構造等といった、いわゆるエピジェネティックなクロマチン情報に関与する因子だからである。したがって、本発明によれば、ヒトや自然環境に対して安全性がさらにより一層向上し、例えば、食糧用、飼料用、観賞用、環境用、実験用、資源用等の実用的な目的に使用可能なトランスジェニック植物、及び、その効率的な製造方法を提供できる。 Moreover, since the mutant of the plant used in the method of the present invention is a mutant in which the gene encoding a factor relating to nucleosome formation is suppressed in its function, the transgenic plant of the present invention directly replicates and replicates DNA. Compared with the case of using other methods using mutants of factors involved in recombination and the like, it is considered that there is a low possibility that mutations are accumulated in genetic information itself. This is because the factors involved in the nucleosome formation reaction are not factors that affect the base sequence of the gene itself, but are factors involved in so-called epigenetic chromatin information such as DNA modification, histone modification, and chromatin structure. is there. Therefore, according to the present invention, safety against humans and the natural environment is further improved. For practical purposes such as food, feed, ornamental use, environmental use, experimental use, and resource use. The transgenic plant which can be used and its efficient manufacturing method can be provided.
本発明の遺伝子導入方法は、変異体の準備工程及び外来遺伝子導入変異体を得る遺伝子導入工程に加え、さらに、前記外来遺伝子導入変異体から、前記変異体における遺伝子の機能発現抑制を除去し、外来遺伝子導入植物を得る抑制除去工程を含むことが好ましい。前記抑制除去工程は、前記外来遺伝子導入変異体を野生型植物と交配させることにより、機能発現抑制の原因となる遺伝子変異を野生型に戻す工程であることが好ましい。 In addition to the mutant preparation step and the gene introduction step of obtaining a foreign gene introduction mutant, the gene introduction method of the present invention further removes suppression of functional expression of the gene in the mutant from the foreign gene introduction mutant, It is preferable to include a suppression and removal step of obtaining a foreign gene-transferred plant. The suppression removal step is preferably a step of returning the gene mutation causing the suppression of function expression to the wild type by crossing the foreign gene introduction mutant with the wild type plant.
前記変異体において機能発現抑制される１又は２以上の遺伝子は、ＣＡＦ−１の３つのサブユニットをコードする遺伝子のオーソロガス遺伝子、及び、ＡＳＦ１遺伝子のオーソロガス遺伝子から選択される１又は２以上の遺伝子であることが好ましい。 The one or more genes whose functional expression is suppressed in the mutant is one or more genes selected from the orthologous gene of the gene encoding three subunits of CAF-1 and the orthologous gene of the ASF1 gene It is preferable that
前記変異体において、前記遺伝子の機能発現抑制は、前記遺伝子の変異、前記遺伝子産物のドミナントネガティブ変異体の発現、又は、前記遺伝子に対するＲＮＡ干渉によりもたらされることが好ましい。 In the mutant, suppression of the functional expression of the gene is preferably caused by mutation of the gene, expression of a dominant negative mutant of the gene product, or RNA interference with the gene.
前記ポリヌクレオチドの導入は、エレクトロポレーション、粒子打ち込み、ウイルス感染、及び、アグロバクテリウム感染から選択される手段により行われることが好ましい。 The introduction of the polynucleotide is preferably performed by means selected from electroporation, particle implantation, virus infection, and Agrobacterium infection.
前記植物は、食糧用植物、飼料用植物、観賞用植物、環境用植物、実験用植物及び資源用植物から選択される植物であることが好ましい。 The plant is preferably a plant selected from food plants, feed plants, ornamental plants, environmental plants, experimental plants and resource plants.
本発明の第１のトランスジェニック植物の製造方法は、本発明の遺伝子導入方法を用いて、外来遺伝子を非相同的組換えにより植物のゲノムに組込む工程を含むトランスジェニック植物の製造方法である。 The first method for producing a transgenic plant of the present invention is a method for producing a transgenic plant comprising the step of incorporating a foreign gene into the genome of a plant by non-homologous recombination using the gene introduction method of the present invention.
本発明の第２のトランスジェニック植物の製造方法は、本発明のジーンターゲッティング方法を用いて、外来遺伝子を相同的組換えにより植物のゲノムに組込む工程を含むトランスジェニック植物の製造方法である。 The second method for producing a transgenic plant of the present invention is a method for producing a transgenic plant comprising the step of incorporating a foreign gene into the genome of a plant by homologous recombination using the gene targeting method of the present invention.
本発明の第１のトランスジェニック植物は、前記本発明の第１のトランスジェニック植物の製造方法により製造された非相同的組換えによる外来遺伝子導入トランスジェニック植物である。 The first transgenic plant of the present invention is a foreign gene-introduced transgenic plant by non-homologous recombination produced by the method for producing the first transgenic plant of the present invention.
本発明の第２のトランスジェニック植物は、前記本発明の第２のトランスジェニック植物の製造方法により製造された相同的組換えによる外来遺伝子導入トランスジェニック植物である。 The second transgenic plant of the present invention is a foreign gene-introduced transgenic plant by homologous recombination produced by the method for producing the second transgenic plant of the present invention.
本発明の変異体は、本発明の遺伝子導入方法、本発明のジーンターゲッティング方法、又は、本発明のトランスジェニック植物の製造方法に用いる植物の変異体であって、ＤＮＡ複製にともなうヌクレオソーム形成反応に関与する因子をコードする１又は２以上の遺伝子が機能発現抑制される植物の変異体である。 The mutant of the present invention is a plant mutant used in the gene introduction method of the present invention, the gene targeting method of the present invention, or the method of producing a transgenic plant of the present invention, and is used for a nucleosome formation reaction accompanying DNA replication. It is a mutant of a plant in which the expression of one or more genes encoding factors involved is suppressed.
本発明の変異体において機能発現抑制される１又は２以上の遺伝子は、ＣＡＦ−１の３つのサブユニットをコードする遺伝子のオーソロガス遺伝子、及び、ＡＳＦ１遺伝子のオーソロガス遺伝子から選択される１又は２以上の遺伝子であることが好ましい。 The one or more genes whose functional expression is suppressed in the mutant of the present invention is one or more selected from the orthologous gene of the gene encoding three subunits of CAF-1 and the orthologous gene of the ASF1 gene Preferably, the gene is
本発明の変異体の遺伝子の機能発現抑制は、前記遺伝子の変異、前記遺伝子産物のドミナントネガティブ変異体の発現、又は、前記遺伝子に対するＲＮＡ干渉によりもたらされることが好ましい。 The suppression of the functional expression of the gene of the mutant of the present invention is preferably brought about by mutation of the gene, expression of a dominant negative mutant of the gene product, or RNA interference with the gene.
本発明の変異体の植物は、食糧用植物、飼料用植物、観賞用植物、環境用植物、実験用植物及び資源用植物から選択される植物であることが好ましい。 The mutant plant of the present invention is preferably a plant selected from food plants, feed plants, ornamental plants, environmental plants, laboratory plants and resource plants.
本発明の変異体の具体例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の変異体であって、ＡＳＦ１ａ遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ０７８３３９）及びＡＳＦ１ｂ遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ０７８３４０）が機能発現抑制される変異体が挙げられ、その他の例として、シロイヌナズナの変異体であって、ＦＡＳ１遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ０２７２２９）、ＦＡＳ２遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ０２７２３０）及び、ＭＳＩ１（アクセッション番号：ＮＭ＿１２５２０８）の少なくとも一つの遺伝子が機能発現抑制される変異体が挙げられる。 As a specific example of the mutant of the present invention, there is a mutant of Arabidopsis thaliana in which the function expression of the ASF1a gene (accession number: AB078339) and the ASF1b gene (accession number: AB078340) is suppressed. As another example, a mutant of Arabidopsis thaliana, at least one gene of FAS1 gene (accession number: AB0272229), FAS2 gene (accession number: AB027230), and MSI1 (accession number: NM — 125208) Are mutants whose functional expression is suppressed.
本発明において、「ＤＮＡ複製に伴うヌクレオソーム形成反応に伴う因子」とは、細胞の染色体ＤＮＡ複製過程において、複製ＤＮＡを速やかにヌクレオソームに変換する真核生物に普遍的な反応に関る因子群をいう。同因子群は、ＤＮＡ複製装置（Shibahara 及び Stillman Cell 96: 575-85, 1999）やチェックポイント (Takamiら under revision in MCB) と機能的にリンクし、ＤＮＡの修飾、ヒストンの修飾、クロマチン構造等の塩基配列以外の情報（いわゆる、エピジェネティックなクロマチン修飾情報）の安定的な維持にも関与することが最近の研究により明らかにされている（Kayaら Cell, 104, 131-142, 2001、Onoら in preparation）。前記因子の具体例としては、ＣＡＦ−１、ＡＳＦ１等のヒストン結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、今後、ＣＡＦ−１と協同してＤＮＡ複製に伴うヌクレオソーム形成反応に関ることが示される因子を含む。これらの因子の候補としては、例えば、ｔｏｕｓｌｅｄ、ＰＣＮＡ、ＴｏｐｏＩ、ＴｏｐｏＩＩ、ＡＣＦ等が予想される。 In the present invention, “factors associated with nucleosome formation reaction accompanying DNA replication” means a group of factors involved in a universal reaction in eukaryotes that rapidly convert replicated DNA into nucleosomes in the chromosomal DNA replication process of cells. Say. This group of factors is functionally linked to DNA replication devices (Shibahara and Stillman Cell 96: 575-85, 1999) and checkpoints (Takami et al. Under revision in MCB) to modify DNA, modify histones, chromatin structures, etc. Recent studies have revealed that it is also involved in the stable maintenance of information other than the base sequence of the DNA (so-called epigenetic chromatin modification information) (Kaya et al. Cell, 104, 131-142, 2001, Ono In preparation). Specific examples of the factor include histone-binding proteins such as CAF-1 and ASF1, but are not limited to these. In the future, it will be related to the nucleosome formation reaction accompanying DNA replication in cooperation with CAF-1. It includes factors that are shown to be As candidates for these factors, for example, tousled, PCNA, TopoI, TopoII, ACF and the like are expected.
ＣＡＦ−１（クロマチンアセンブリーファクター１）タンパク質は、ヒト細胞の核抽出物から、新規に合成されたＤＮＡのヌクレオソームアセンブリーを促進する活性を指標に精製されたタンパク質である（Kaufmanら (1995) Cell, 81, 1105-1114.、Smithら(1989) Cell, 58, 15-25.）。ＣＡＦ−１タンパク質は、ｐ１５０、ｐ６０、ｐ４８といった３つのサブユニットからなる複合体であり、酵母からヒトの広範な生物種で保存され、さらに、シロイヌナズナにおいても保存されている（Kayaら Cell 104: 131-42, 2001）。シロイヌナズナのＣＡＦ−１タンパク質のオーソログは、それぞれ、ＦＡＳ１（アクセッション番号：ＡＢ０２７２２９）、ＦＡＳ２（アクセッション番号：ＡＢ０２７２３０）及び、ＭＳＩ１（アクセッション番号：ＮＭ＿１２５２０８）と呼ばれる。 CAF-1 (chromatin assembly factor 1) protein is a protein purified from nuclear extracts of human cells using the activity of promoting nucleosome assembly of newly synthesized DNA as an index (Kaufman et al. (1995). Cell, 81, 1105-1114., Smith et al. (1989) Cell, 58, 15-25.). The CAF-1 protein is a complex composed of three subunits such as p150, p60, and p48, and is conserved in a wide variety of organisms from yeast to humans, and is also conserved in Arabidopsis (Kaya et al. Cell 104: 131-42, 2001). The orthologs of the CAF-1 protein of Arabidopsis are called FAS1 (accession number: AB027229), FAS2 (accession number: AB027230), and MSI1 (accession number: NM — 125208), respectively.
ＡＳＦ１（アンチ−サイレンシングファンクション１）タンパク質は、Ｓ期後半で発現される酵母の遺伝子産物であって、過剰発現により、位置依存性のジーンサイレンシングの抑制解除を引き起こすものとして同定されたが、その後、ＣＡＦ−１による複製に伴うヌクレオソーム形成反応を促進する活性を有するヒストンＨ３及びＨ４結合タンパク質として、再同定されたタンパク質である（Tylerら Nature 402; 555-560, 1999）。ＡＳＦ１タンパク質は、ＣＡＦ−１のｐ６０サブユニットと相互作用する。ＡＳＦ１タンパク質は、ＣＡＦ−１と同様に、酵母からヒトまで保存されているが、シロイヌナズナのＡＳＦ１オーソログは、遺伝子重複により、ＡｔＡＳＦ１ａ（アクセッション番号：ＡＢ０７８３３９）及びＡｔＡＳＦ１ｂ（アクセッション番号：ＡＢ０７８３４０）の２つが存在する（本発明では、それぞれ、ＡＳＦ１ａ及びＡＳＦ１ｂという）。シロイヌナズナＡＳＦ１オーソロガス遺伝子であるＡＳＦ１ａ及びＡＳＦ１ｂ遺伝子は、本発明者らが、初めて単離した遺伝子である。 The ASF1 (anti-silencing function 1) protein was a yeast gene product expressed in the late S phase, and was identified as an overexpression that caused derepression of position-dependent gene silencing, Subsequently, it was re-identified as a histone H3 and H4 binding protein having the activity of promoting the nucleosome formation reaction accompanying replication by CAF-1 (Tyler et al. Nature 402; 555-560, 1999). The ASF1 protein interacts with the p60 subunit of CAF-1. The ASF1 protein, like CAF-1, is conserved from yeast to human. However, the ASF1 ortholog of Arabidopsis thaliana has two genes, AtASF1a (accession number: AB078339) and AtASF1b (accession number: AB078340), due to gene duplication. (In the present invention, they are referred to as ASF1a and ASF1b, respectively). The ASF1a and ASF1b genes, which are Arabidopsis ASF1 orthologous genes, are genes that the present inventors have isolated for the first time.
これらのＤＮＡ複製に伴うヌクレオソーム形成反応に伴う因子については、様々な研究がされ、次第にその機能が明らかになりつつある。しかし、これらの因子の機能を阻害すると、遺伝子導入頻度が上昇し、ジーンサイレンシングが解除されること、加えて、相同的組換え頻度が上昇することについては、先行技術により、何ら開示も示唆もされていない。 Various studies have been conducted on the factors involved in the nucleosome formation reaction associated with these DNA replications, and their functions are gradually becoming apparent. However, if the function of these factors is inhibited, the gene transfer frequency increases, gene silencing is released, and in addition, the homologous recombination frequency increases. It has not been done.
本発明において、遺伝子が「機能発現抑制」されるとは、前記遺伝子配列の変異、転写阻害、翻訳阻害、タンパク質の活性化阻害等により、前記遺伝子及び遺伝子産物の機能発現が阻害されることを含む。本発明における「機能発現抑制」は、本来植物ゲノムに存在する遺伝子についてものもであって、植物へ導入された外来遺伝子のジーンサイレンシングとは異なるものを意味する。特定の遺伝子の機能発現を抑制する方法は、特に制限されず従来公知の方法を適用できる。例えば、該遺伝子配列に置換・欠失・付加（挿入）等の変異を導入して、完全なタンパク質の合成を阻害する方法、転写促進因子を阻害若しくは転写抑制因子を活性化することで、該遺伝子の転写を阻害する方法、ＲＮＡ干渉を利用してタンパク質の合成を阻害する方法、該遺伝子産物のドミナントネガティブ変異体を過剰発現させる方法等が挙げられる。前記遺伝子配列に変異を導入する方法としては、例えば、宿主植物にＴ−ＤＮＡやトランスポゾンが挿入されたトランスジェニック植物ライブラリーを作製し、あるいは、既存の変異体ライブラリーをスクリーニングし、目的とする遺伝子座に前記Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンが挿入された変異体をスクリーニングする方法が挙げられる。前記ＲＮＡ干渉の方法としては、例えば、アンチセンスＲＮＡ、短い阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等を利用する方法が挙げられる。ある遺伝子が「機能発現抑制される変異体」とは、上述の方法により、安定して又は一時的に、その遺伝子の機能発現が抑制された植物個体、植物組織又は植物細胞をいう。 In the present invention, “functional expression suppression” means that the functional expression of the gene and gene product is inhibited by mutation of the gene sequence, transcription inhibition, translation inhibition, protein activation inhibition, etc. Including. “Functional expression suppression” in the present invention also refers to a gene originally present in a plant genome, and is different from gene silencing of a foreign gene introduced into a plant. A method for suppressing the functional expression of a specific gene is not particularly limited, and a conventionally known method can be applied. For example, by introducing mutations such as substitution / deletion / addition (insertion) into the gene sequence to inhibit complete protein synthesis, by inhibiting transcription promoters or activating transcriptional repressors, Examples thereof include a method of inhibiting gene transcription, a method of inhibiting protein synthesis using RNA interference, and a method of overexpressing a dominant negative mutant of the gene product. Examples of methods for introducing mutations into the gene sequence include preparing a transgenic plant library in which T-DNA or transposon is inserted into a host plant, or screening an existing mutant library for the purpose. Examples thereof include a method of screening for a mutant in which the T-DNA or transposon is inserted at the gene locus. Examples of the RNA interference method include methods using antisense RNA, short inhibitory RNA (siRNA), micro RNA (miRNA) and the like. A “variant whose function expression is suppressed” refers to a plant individual, plant tissue or plant cell in which the function expression of the gene is stably or temporarily suppressed by the above-described method.
本発明において、「外来遺伝子」は、特に制限されず、宿主植物変異体に導入する任意の遺伝子をいう。前記外来遺伝子は、宿主植物を形質転換するための遺伝子、宿主植物細胞内で動作可能に連結したプロモーター及びターミネーター等を含むことができる。前記外来遺伝子は、選択マーカー遺伝子又は選択マーカー遺伝子発現カセットであってもよい。また、本発明において、「遺伝子」とは、生体機能と関連するＤＮＡの任意の断片をいい、例えば、遺伝子は遺伝子発現に必要なコーディング配列、発現調節配列等を含む。 In the present invention, the “foreign gene” is not particularly limited and refers to an arbitrary gene to be introduced into a host plant mutant. The foreign gene can include a gene for transforming the host plant, a promoter and a terminator operably linked in the host plant cell, and the like. The foreign gene may be a selectable marker gene or a selectable marker gene expression cassette. In the present invention, “gene” refers to any fragment of DNA associated with biological functions. For example, a gene includes a coding sequence necessary for gene expression, an expression regulatory sequence, and the like.
本発明において、「外来遺伝子を含むポリヌクレオチド」とは、特に制限されないが、例えば、前記外来遺伝子が組込まれたベクターであって、例えば、従来公知のウイルスベクター、Ｔｉプラスミド、バイナリーベクター等を使用して調製できる。前記ポリヌクレオチドは、前記外来遺伝子とは別に、適宜、選択マーカーを含んでもよい。なお、前記ヌクレオチドは、外来遺伝子そのものであってもよい。 In the present invention, the term “polynucleotide containing a foreign gene” is not particularly limited. For example, a vector in which the foreign gene is incorporated, for example, a conventionally known viral vector, Ti plasmid, binary vector, or the like is used. Can be prepared. The polynucleotide may contain a selection marker as appropriate, separately from the foreign gene. The nucleotide may be a foreign gene itself.
本発明において、「ジーンターゲッティング」とは、植物のゲノム上の標的遺伝子の遺伝子座に、相同的組換えを介して外来遺伝子を導入することをいう。 In the present invention, “gene targeting” refers to introducing a foreign gene into a target gene locus on the genome of a plant via homologous recombination.
本発明において、「トランスジェニック植物」は、遺伝子導入により植物のゲノムに組込まれた外来遺伝子を保持する植物細胞、植物組織又は植物個体をいう。外来遺伝子の組込みは、ランダムでも、相同的組換えによってもよいが、好ましくは、相同的組換えにより外来遺伝子が組込まれたトランスジェニック植物が好ましい。人体や環境に対する安全性が向上するからである。 In the present invention, a “transgenic plant” refers to a plant cell, plant tissue, or plant individual that retains a foreign gene integrated into the plant genome by gene transfer. The integration of the foreign gene may be random or by homologous recombination, but preferably a transgenic plant into which the foreign gene has been integrated by homologous recombination. This is because safety to the human body and the environment is improved.
本発明において、「オーソロガス遺伝子」は、異なる種における対応する遺伝子をいう。また、オーソロガス遺伝子又はタンパク質を、単にオーソログともいう。あるタンパク質に対応する異なる種におけるオーソログは、例えば、前記タンパク質のアミノ酸配列や塩基配列との相同性を指標に決定することができる。すなわち、前記異なる種の遺伝子のうち、最も高い相同性を示す遺伝子を、オーソロガス遺伝子として決定できる。ここで、相同性とは、２本以上の配列間の同一性又は類似性のことをいう。 In the present invention, “orthologous gene” refers to a corresponding gene in a different species. An orthologous gene or protein is also simply referred to as an ortholog. Orthologs in different species corresponding to a certain protein can be determined using, for example, homology with the amino acid sequence or base sequence of the protein as an index. That is, the gene showing the highest homology among the genes of the different species can be determined as an orthologous gene. Here, homology refers to identity or similarity between two or more sequences.
本発明において、２本のポリヌクレオチド配列が「相同」であるとは、植物細胞内において、相同組換えが起こりうる程度の相同性を有することをいう。また、遺伝子のポリヌクレオチド配列、又は、タンパク質のアミノ酸配列が「相同」であるとは、その機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。例えば、遺伝子塩基配列に、点変異、欠失又は付加による相違があるとしても、これらが前記遺伝子の機能に影響を与えないならば、両者は相同であるといえる。相違する塩基数としては、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個又は１個である。また、２つ以上の配列において、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは約９９％の同一性を示す場合、これらは相同であるといえる。また、２つのポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする場合には、両者は相同といえる。前記ストリンジェントな条件としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。前記Ｔｍは、例えば、下記式により求められる。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ+］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
上記式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である。
In the present invention, that two polynucleotide sequences are “homologous” means that they have homology to such an extent that homologous recombination can occur in plant cells. Further, the phrase “homologous” in the polynucleotide sequence of a gene or the amino acid sequence of a protein means that the gene sequence is sufficiently similar to maintain its function. For example, even if there are differences due to point mutations, deletions or additions in the gene base sequence, they can be said to be homologous if they do not affect the function of the gene. The number of different bases is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 to 2, or 1. Also, at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or about 99% identity in two or more sequences These are said to be homologous. When two polynucleotides hybridize under stringent conditions, they can be said to be homologous. The stringent conditions are not particularly limited. For example, in a solution containing 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt, 0.01% denatured salmon sperm nucleic acid, a temperature of [Tm−25 ° C.] And conditions for keeping the temperature overnight. The Tm is obtained by the following formula, for example.
Tm = 81.5-16.6 (log 10 [Na + ]) + 0.41 (% G + C) − (600 / N)
In the above formula, N is the chain length of the oligonucleotide probe, and% G + C is the content of guanine and cytosine residues in the oligonucleotide probe primer.
本発明において、同一性及び類似性は、２以上の塩基配列又はアミノ酸配列間で、これらの配列を比較して決定される関係を参照する。同一性が、アライメントされた場合の同一文字列の割合を示すのに対し、類似性は、同一文字に加え、同類置換された文字も含む。同一性及び類似性は、従来公知の様々なコンピュータープログラムにより、容易に決定できる。 In the present invention, identity and similarity refer to a relationship determined by comparing these sequences between two or more base sequences or amino acid sequences. Whereas the identity indicates the ratio of the same character string when aligned, the similarity includes not only the same character but also a similarly substituted character. Identity and similarity can be easily determined by various computer programs known in the art.
本発明において、「植物」は、特に制限されず、例えば、食糧用、飼料用、観賞用、環境用、実験用および資源用等に用いられる植物を使用できる。また、宿主植物は、例えば、種子植物であって、裸子植物であってもよく、被子植物であってもよい。また、宿主植物は、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。食糧用、飼料用植物としては、例えば、コムギ、オオムギ、モロコシ、キビ、ライムギ、ライコムギ、トウモロコシ、コメ、オートムギ、サトウキビ等の単子葉植物、ナタネ、コショウソウ、シロイヌナズナ、キャベツ又はキャノーラ等のアブラナ科、ダイズ、アルファルファ、エンドウ、インゲンマメ又は落花生等のマメ科、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナス又はコショウ等のナス科、ヒマワリ、レタス又はキンセンカ属等のキク科、メロン、カボチャ又はズッキーニ等のウリ科、及び、ニンジン等のセリ科等の双子葉植物を含む。観賞用植物としては、バラ等のバラ科、シャクナゲ、アザレア等のツツジ科、ショウジョウソウ及びクロトン等のトウダイグサ科、セキチク等のナデシコ科、ペチュニア等のナス科、アフリカスミレ等のゲスネリア属、ホウセンカ等のツリフネソウ科、ラン等のラン科、グラジオラス、アヤメ、フリージア、クロッカス等のアヤメ科、マリーゴールド等のキク科、ゼラニウム等のフウロソウ科、ドラセナ等のユリ科、イチジク等のクワ科を含む。環境用・資源用植物としては、各種樹木が挙げられ、実験用植物としては、シロイヌナズナ等が挙げられる。また、本発明において、「植物」は、植物個体のほか、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等の植物細胞や植物組織を含む。 In the present invention, the “plant” is not particularly limited, and for example, a plant used for food, feed, ornamental use, environment use, experiment use and resource use can be used. The host plant is, for example, a seed plant, and may be a gymnosperm or an angiosperm. The host plant may be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant. Examples of plants for food and feed include, for example, monocotyledonous plants such as wheat, barley, sorghum, millet, rye, triticale, corn, rice, oats, sugar cane, rapeseed, rapeseed, Arabidopsis, cabbage or canola Legumes such as soybean, alfalfa, peas, kidney beans or peanuts, potatoes, tobacco, tomatoes, eggplants such as eggplant or pepper, asteraceae such as sunflower, lettuce or calendula, cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, And dicotyledonous plants such as celery family such as carrot. Ornamental plants include roses such as roses, rhododendrons such as rhododendrons and azaleas, euphorbiaceae such as drosophila and croton, radishs such as redwood, solanaceae such as petunias, genus genus such as African violets, , Such as orchidaceae such as orchid, orchidaceae such as gladiolus, iris, freesia, crocus, asteraceae such as marigold, auraceae such as geranium, lilyaceae such as dracaena, mulberry such as figs. Examples of environmental and resource plants include various trees, and examples of experimental plants include Arabidopsis thaliana. In the present invention, the “plant” includes plant cells such as seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts and the like in addition to individual plants.
本発明の遺伝子導入方法の植物の変異体の準備工程における前記変異体として、本発明の植物の変異体を使用できる。本発明の植物の変異体を製造する方法は、特に制限されず、例えば、前述の遺伝子の機能発現を抑制できる方法を用いて製造できる。 The plant mutant of the present invention can be used as the mutant in the plant mutant preparation step of the gene introduction method of the present invention. The method for producing the plant mutant of the present invention is not particularly limited, and for example, it can be produced using a method capable of suppressing the functional expression of the aforementioned gene.
本発明の遺伝子導入方法の遺伝子導入工程は、大きく２つの段階に分けることができる。まず、外来遺伝子を前記変異体に導入する第１段階と、前記外来遺伝子が導入された宿主変異体細胞を選別し、個体へ再分化させる第２段階である。前記第１段階における遺伝子導入手段は、特に制限されず、従来公知の方法、例えば、パーティクルガン法等の直接的・物理的手段や、アグロバクテリウム法等の間接的・生物的手段を用いることができる。一旦、外来遺伝子が導入された変異体細胞が得られれば、次の第２段階において、その細胞から植物変異体を再生させ、有性生殖又は無性生殖により、子孫を得ることが可能となる。また、前記変異体における遺伝子の機能発現抑制が一時的なものである場合には、前記変異体は、自然に野生型に戻るから、前記第２段階で、外来遺伝子が導入された植物を得ることもできる。 The gene introduction process of the gene introduction method of the present invention can be roughly divided into two stages. First, a first step of introducing a foreign gene into the mutant and a second step of selecting a host mutant cell into which the foreign gene has been introduced and redifferentiating it into an individual. The gene introduction means in the first step is not particularly limited, and a conventionally known method, for example, direct / physical means such as a particle gun method or indirect / biological means such as an Agrobacterium method is used. Can do. Once a mutant cell into which a foreign gene has been introduced is obtained, a plant mutant can be regenerated from the cell in the next second stage, and offspring can be obtained by sexual reproduction or asexual reproduction. . In addition, when the suppression of gene function expression in the mutant is temporary, the mutant naturally returns to the wild type, and thus a plant into which the foreign gene has been introduced is obtained in the second stage. You can also.
しかし、前記変異体における遺伝子の機能発現抑制が、例えば、遺伝子配列の変異等によるものである場合には、本発明の遺伝子導入方法は、前記準備工程、遺伝子導入工程に続く第３の工程として、さらに、前記遺伝子導入工程で得た外来遺伝子導入変異体から、前記遺伝子の機能発現抑制を除去する除去工程を含むことが好ましい。この除去工程により、野生型のバックグラウンドを有する前記外来遺伝子導入トランスジェニック植物を得ることができる。前記機能発現抑制を除去し野生型のバックグラウンドに戻す方法としては、例えば、外来遺伝子が導入された変異体と、野生型株との戻し交雑が挙げられ、その方法は、従来公知の方法を採用できる。 However, in the case where the suppression of the functional expression of the gene in the mutant is due to, for example, mutation of the gene sequence, the gene introduction method of the present invention is a third step following the preparation step and the gene introduction step. Furthermore, it is preferable that the method further includes a removal step of removing suppression of functional expression of the gene from the foreign gene introduction mutant obtained in the gene introduction step. By this removal step, the exogenous transgenic transgenic plant having a wild-type background can be obtained. Examples of the method for removing the suppression of functional expression and returning to the wild type background include backcrossing between a mutant into which a foreign gene has been introduced and a wild type strain. Can be adopted.
本発明のジーンターゲッティング方法は、ポリヌクレオチド調製工程で調製される標的遺伝子及び/又は該標的遺伝子に隣接する領域と相同な部分と外来遺伝子とを含む外来遺伝子を含むポリヌクレオチドを、本発明の遺伝子導入方法を用いて本発明の変異体に導入することで実施できる。前記相同な部分は、導入する外来遺伝子の両端に位置することが好ましい。相同的組換えが生じた細胞の選択を容易化するため、前記ポリヌクレオチドは、さらに、従来公知の２段階選択が可能な２つの選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。第１の選択マーカーは、前記ポリヌクレオチドがゲノムに組込まれたことを確認できるポジティブ選択マーカーであり、第２の選択マーカーは、非相同的組換えにより組込まれたものを排除できるネガティブ選択マーカーである。この場合、導入するポリヌクレオチドは、直線状であってもよく、環状であってもよい。また、前記ポジティブ選択マーカーは、外来遺伝子として使用できる。 The gene targeting method of the present invention comprises a target gene prepared in the polynucleotide preparation step and / or a polynucleotide comprising a foreign gene containing a foreign gene and a region homologous to a region adjacent to the target gene and the gene of the present invention. It can implement by introduce | transducing into the variant of this invention using the introduction method. The homologous part is preferably located at both ends of the foreign gene to be introduced. In order to facilitate selection of cells in which homologous recombination has occurred, it is preferable that the polynucleotide further includes two selectable marker genes capable of two-step selection known in the art. The first selectable marker is a positive selectable marker that can confirm that the polynucleotide has been integrated into the genome, and the second selectable marker is a negative selectable marker that can exclude those that have been integrated by non-homologous recombination. is there. In this case, the introduced polynucleotide may be linear or circular. The positive selection marker can be used as a foreign gene.
本発明の第１のトランスジェニック植物の製造方法は、本発明の遺伝子導入方法を用いて、外来遺伝子を非相同的組換えにより植物のゲノムに組込む工程を含む製造方法であって、本発明の第１のトランスジェニック植物である非相同的組換えによる外来遺伝子導入トランスジェニック植物を製造できる。 The first method for producing a transgenic plant of the present invention is a production method comprising the step of incorporating a foreign gene into a plant genome by non-homologous recombination using the gene introduction method of the present invention, A foreign transgenic transgenic plant by non-homologous recombination, which is the first transgenic plant, can be produced.
本発明の第２のトランスジェニック植物の製造方法は、本発明の遺伝子導入方法を用いて、外来遺伝子を相同的組換えにより植物のゲノムに組込む工程を含む製造方法であって、本発明の第２のトランスジェニック植物である相同的組換えによる外来遺伝子導入トランスジェニック植物を製造できる。 The second method for producing a transgenic plant of the present invention is a production method comprising the step of incorporating a foreign gene into the genome of a plant by homologous recombination using the gene introduction method of the present invention. It is possible to produce an exogenous transgenic transgenic plant by homologous recombination, which is two transgenic plants.
本発明のトランスジェニック植物のバックグラウンドは、本発明の変異体のものであってもよく、野生型に戻されたものであってもよい。また、本発明のトランスジェニック植物は、上記２つのいずれかで方法で製造されたトランスジェニック植物の子孫、クローン、並びに、これらから得られる繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を含む。 The background of the transgenic plant of the present invention may be that of the mutant of the present invention or may have been returned to the wild type. Moreover, the transgenic plant of the present invention is a progeny, clone, and propagation material (eg, seed, fruit, cut ear, tuber, tuberous root) obtained from the transgenic plant produced by any of the above two methods. , Strains, callus, protoplasts, etc.).
植物としてシロイヌナズナを用いる場合、本発明の変異体の第１の好ましい態様は、２つのＡＳＦ１オーソロガス遺伝子、ＡＳＦ１ａ（アクセッション番号：ＡＢ０７８３３９）及びＡＳＦ１ｂ（アクセッション番号：ＡＢ０７８３４０）の両方の遺伝子の機能発現が抑制された２重変異体である。シロイヌナズナのＡＳＦ１オーソロガス遺伝子は、遺伝子重複した２つの遺伝子、ＡＳＦ１ａとＡＳＦ１ｂとが存在しており、本発明の変異体として用いるためには、どちらか一方の変異のみでは足りず、両遺伝子についての２重変異体とする必要がある。 When Arabidopsis thaliana is used as a plant, the first preferred embodiment of the mutant of the present invention is the functional expression of both of two ASF1 orthologous genes, ASF1a (accession number: AB078339) and ASF1b (accession number: AB078340). Is a double mutant in which is suppressed. The ASF1 orthologous gene of Arabidopsis thaliana has two genes, ASF1a and ASF1b, which are duplicated, and either one of the mutations is not sufficient for use as a mutant of the present invention. Must be a heavy mutant.
また、本発明の変異体の第２の好ましい態様は、ＣＡＦ−１オーソロガス遺伝子であるＦＡＳ１遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ０２７２２９）、ＦＡＳ２遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ０２７２３０）及び、ＭＳＩ１（アクセッション番号：ＮＭ＿１２５２０８）の少なくとも一つの遺伝子が機能発現抑制された変異体である。 Moreover, the 2nd preferable aspect of the variant of this invention is FAS1 gene (accession number: AB027229) which is a CAF-1 orthologous gene, FAS2 gene (accession number: AB027230), and MSI1 (accession number: NM_125208). ) Is a mutant whose function is suppressed.
さらに、その他の本発明の変異体の好ましい態様は、ＡＳＦ１ａ遺伝子又はＡＳＦ１ｂ遺伝子の機能発現抑制と、ＦＡＳ１遺伝子、ＦＡＳ２遺伝子及びＭＳＩ１遺伝子のいずれか１つの機能発現抑制との２重変異体である。 Furthermore, another preferred embodiment of the mutant of the present invention is a double mutant of suppressing the functional expression of the ASF1a gene or ASF1b gene and suppressing the functional expression of any one of the FAS1, FAS2 and MSI1 genes.
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。 The present invention will be further described with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
シロイヌナズナｆａｓ２変異体における導入遺伝子のサイレンシング脱抑制
高等植物における導入された遺伝子の発現は、多くの場合、転写後ジーンサイレンシング（ＰＴＧＳ）又は転写ジーンサイレンシング（ＴＧＳ）のいずれかにより抑制されている。トランスジェニックシロイヌナズナＬ５株は、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子が導入されているが、そのＧＵＳ遺伝子は、転写レベルでサイレンシングを受けており、野生型のバックグラウンドでは、ほとんどの場合検出されない。そこで、野生型Ｌ５株と、ｆａｓ２変異体又はｍｏｍ１変異体とを掛け合わせてＧＵＳ遺伝子の発現を確認した。前記ｍｏｍ１変異体は、対照であって、転写ジーンサイレンシング（ＴＧＳ）が欠損した変異体である。掛け合わせて得たＦ２及びＦ３世代の子孫のＬ５株ｆａｓ２ホモ接合体及びＬ５株ｍｏｍ１ホモ接合体について、ＧＵＳの発現を検出した。ＧＵＳ発現の検出は、従来公知の組織化学的染色により行った。
Inhibition of transgene silencing in Arabidopsis fas2 mutants Expression of introduced genes in higher plants is often suppressed by either post-transcriptional gene silencing (PTGS) or transcriptional gene silencing (TGS). Yes. The transgenic Arabidopsis thaliana L5 strain has a GUS (β-glucuronidase) gene introduced therein, but the GUS gene is silenced at the transcriptional level and is hardly detected in the wild type background. Therefore, the expression of the GUS gene was confirmed by crossing the wild type L5 strain with the fas2 mutant or the mom1 mutant. The mom1 mutant is a control mutant that lacks transcriptional gene silencing (TGS). Expression of GUS was detected in the L5 strain fas2 homozygote and L5 strain moml homozygote of the F2 and F3 generation progeny obtained by crossing. Detection of GUS expression was performed by conventionally known histochemical staining.
その結果、野生型Ｌ５株では、ＧＵＳの発現は、僅かな例外を除き、確認できなかった。その様子を図１Ａに示す。同図の囲みの写真は、ＧＵＳを発現した例外的な細胞の写真である。また、ｍｏｍ１ホモ接合体では、以前の報告にあるとおり、植物体全体で均一に発現していた（図示せず）。一方、ｆａｓ２ホモ接合体では、ＧＵＳの発現は確認されたものの、ｍｏｍ１ホモ接合体とは対照的に、発現している領域のサイズは非常に小さく、その領域のサイズや大きさは、ｆａｓ２ホモ接合体個体間でさまざまであった。その様子を図１Ｂ及びＣに示す。これらの結果は、ｆａｓ２変異体において、導入遺伝子のジーンサイレンシングが、偶発的に、抑制解除されていることを示す。 As a result, in the wild type L5 strain, the expression of GUS could not be confirmed with few exceptions. This is shown in FIG. 1A. The photograph in the box in the figure is a photograph of an exceptional cell expressing GUS. In addition, the mom1 homozygote was expressed uniformly throughout the whole plant as shown in the previous report (not shown). On the other hand, in the fas2 homozygote, although the expression of GUS was confirmed, in contrast to the mom1 homozygote, the size of the expressed region was very small, and the size and size of the region were the fas2 homozygote. It varied among zygotes. This is shown in FIGS. 1B and 1C. These results indicate that gene silencing of the transgene is accidentally derepressed in the fas2 mutant.
シロイヌナズナａｓｆ1ａ；ａｓｆ1ｂ変異体におけるジーンサイレンシングの脱抑制
１．シロイヌナズナのＡＳＦ１オーソログの同定と単離
ＡＳＦ１ファミリーのタンパク質は、酵母からヒトまでの様々な生物において保存されている。そこで、既知のＡＳＦ１の配列に基づき、データベースから、２種類のＡＳＦ１のシロイヌナズナ（arabidopsis）オーソログを予測した。第１染色体上の短い方のオーソログを、ＡｔＡＳＦ１ａと、第５染色体上の長い方のオーソログを、ＡｔＡＳＦ１ｂと命名し、以下、それぞれ、ＡＳＦ１ａ及びＡＳＦ１ｂと呼ぶ。
Derepression of gene silencing in Arabidopsis asf1a; asf1b mutants Identification and isolation of ASF1 orthologs of Arabidopsis ASF1 family of proteins are conserved in a variety of organisms, from yeast to humans. Thus, two types of ASF1 arabidopsis orthologs were predicted from the database based on the known ASF1 sequence. The shorter ortholog on the first chromosome is named AtASF1a and the longer ortholog on the fifth chromosome is named AtASF1b, and are hereinafter referred to as ASF1a and ASF1b, respectively.
データベースに基づき設計したプライマーを用いた逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＡＳＦ１ａ及びＡＳＦ１ｂのｃＤＮＡを単離した。単離したそれぞれのｃＤＮＡについて、ｃＤＮＡ末端の高速増幅法（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）を行い、５’及び３’非翻訳領域を決定した。その結果、前記ｃＤＮＡが、それぞれ、１９６アミノ酸（予測分子量２２.１ｋＤａ）のＯＲＦを含むＡＳＦ１ａの完全長ｃＤＮＡであること、及び、２１８アミノ酸（予測分子量２４.７ｋＤａ）のＯＲＦを含むＡＳＦ１ｂの完全長ｃＤＮＡであることを確認した。ＡＳＦ１ａ遺伝子及びＡＳＦ１ｂ遺伝子の配列を、それぞれ、配列番号１及び２に示す。 ASF1a and ASF1b cDNAs were isolated by reverse transcription PCR (RT-PCR) using primers designed based on the database. About each isolated cDNA, the cDNA end rapid amplification method (RACE-PCR) was performed, and 5 'and 3' untranslated region was determined. As a result, each of the cDNAs is a full-length cDNA of ASF1a containing an ORF of 196 amino acids (predicted molecular weight 22.1 kDa), and a full-length of ASF1b containing an ORF of 218 amino acids (predicted molecular weight 24.7 kDa). It was confirmed to be cDNA. The sequences of the ASF1a gene and the ASF1b gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
２．ＡＳＦ１の機能欠損変異体のスクリーニングと単離
シロイヌナズナにおけるＡＳＦ１の機能欠損変異体を得るため、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたトランスジェニック植物ライブラリーのＰＣＲを利用したスクリーニング及びデータベースサーチを行った。その結果、Ｔ−ＤＮＡがＡＳＦ１ａ遺伝子のゲノム領域に挿入されたａｓｆ１ａ−１変異体、及び、Ｔ−ＤＮＡがＡＳＦ１ｂ遺伝子のゲノム領域に挿入されたａｓｆ１ｂ−２変異体を単離した。それぞれの変異体におけるＴ−ＤＮＡのゲノムにおける挿入位置を、図２の模式図に示す。同図に示すとおり、ａｓｆ１ａ−１変異体において、Ｔ−ＤＮＡは、ＡＳＦ１ａ遺伝子のエキソン２とエキソン３との間に挿入されており、６０ｂｐのゲノムＤＮＡが欠失していた。また、ａｓｆ１ｂ−２変異体において、Ｔ−ＤＮＡは、ＡＳＦ１ｂ遺伝子のエキソン１とエキソン２との間に挿入されており、１２ｂｐのゲノムＤＮＡが欠失していた。ａｓｆ１ａ−１変異体は、ウィスコンシン大学のＡＫＦ（arabidopsis Knockout Facility）のライブラリーから単離した、Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｉｊａ（Ｗｓ）生態型シロイヌナズナにｐＤ９９１由来のＴ−ＤＮＡが挿入された変異体である。また、ａｓｆ１ｂ−２変異体は、かずさＤＮＡ研究所のライブラリーから単離した、Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）生態型シロイヌナズナにｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ由来のＴ−ＤＮＡが挿入された変異体である。本実施例で使用したａｓｆ１ａ及びａｓｆ１ｂ変異体は、これらのＦ２世代より後代のホモ接合変異体である。
2. Screening and isolation of ASF1 function-deficient mutants In order to obtain ASF1 function-deficient mutants in Arabidopsis thaliana, screening and database search using a transgenic plant library into which T-DNA had been inserted were performed. As a result, an asf1a-1 mutant in which T-DNA was inserted into the genomic region of the ASF1a gene and an asf1b-2 mutant in which T-DNA was inserted into the genomic region of the ASF1b gene were isolated. The insertion position in the genome of T-DNA in each mutant is shown in the schematic diagram of FIG. As shown in the figure, in the asf1a-1 mutant, T-DNA was inserted between exon 2 and exon 3 of the ASF1a gene, and 60 bp of genomic DNA was deleted. In the asf1b-2 mutant, T-DNA was inserted between exon 1 and exon 2 of the ASF1b gene, and 12 bp genomic DNA was deleted. The asf1a-1 mutant is a mutant in which T-DNA derived from pD991 is inserted into Wassilewskija (Ws) ecotype Arabidopsis thaliana isolated from the library of AKF (arabidopsis Knockout Facility) at the University of Wisconsin. The asf1b-2 mutant is a mutant in which T-DNA derived from pPCVICEn4HPT is inserted into Columbia (Col) ecotype Arabidopsis thaliana isolated from a library of Kazusa DNA Laboratory. The asf1a and asf1b mutants used in this example are homozygous mutants that are progenies of these F2 generations.
ＡＳＦ１ａ変異体では、ＡＳＦ１ａ遺伝子の全長ｃＤＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲにより確認でなかった。また、ＲＴ−ＰＣＲにより確認された不完全なエキソン１及びエキソン２は、微量であった。したがって、ａｓｆ１ａ変異体は、ＡＳＦ１ａ遺伝子が、機能を欠失しているか、又は、非常に弱くなっているＡＳＦ１ａの機能欠損変異体であることが示された。同様に、ＡＳＦ１ｂ変異体でも、ＡＳＦ１ｂ遺伝子の全長ｃＤＮＡが、ＲＴ-ＰＣＲによっては確認できず、ＲＴ-ＰＣＲにより確認された不完全なエキソン１は、微量であった。したがって、ａｓｆ１ｂ変異体は、ＡＳＦ１ｂ遺伝子が、機能を欠失しているか、又は、非常に弱くなっているＡＳＦ１ｂの機能欠損変異体であることが示された。 In the ASF1a mutant, the full-length cDNA of the ASF1a gene was not confirmed by RT-PCR. Moreover, the incomplete exon 1 and the exon 2 confirmed by RT-PCR were trace amounts. Therefore, it was shown that the asf1a mutant is a function-deficient mutant of ASF1a in which the ASF1a gene lacks function or is very weak. Similarly, even in the ASF1b mutant, the full-length cDNA of the ASF1b gene could not be confirmed by RT-PCR, and the incomplete exon 1 confirmed by RT-PCR was a trace amount. Therefore, it was shown that the asf1b mutant is a function-deficient mutant of ASF1b in which the ASF1b gene lacks function or is very weak.
３．ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体の作製
上記Ｗｓ生態型のａｓｆ１ａ−１変異体及びＣｏｌ生態型のａｓｆ１ｂ−２変異体を用いて、これらの二重変異体を作製した。Ｗｓ型に３回バッククロスしたａｓｆ１ａ−１（ｗＢ３）ホモ変異体、又は、Ｗｓ型に３回バッククロスした後、さらにＣｏｌ型に３回バッククロスしたａｓｆ１ａ−１（ｃＢ３ｗＢ３）ホモ変異体と、Ｃｏｌ型に３回バッククロスしたａｓｆ１ｂ−２（ｗＢ３）ホモ変異体とを掛け合わせ、Ｆ２／Ｆ３世代で、Ｔ−ＤＮＡのホモ・ヘテロの遺伝子型をＰＣＲを用いて特定し、二重変異体を作製した。
3. Production of asf1a; asf1b mutant These double mutants were prepared using the Ws ecotype asf1a-1 mutant and the Col ecotype asf1b-2 mutant. An asf1a-1 (wB3) homo mutant backcrossed three times to the Ws type, or an asf1a-1 (cB3wB3) homo mutant back crossed three times to the Ws type and then back crossed three times to the Col type; Multiplying the Asf1b-2 (wB3) homozygous mutant backcrossed to the Col type three times, and using the PCR, the homozygous type of T-DNA was identified using PCR in the F2 / F3 generation. Was made.
４．ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体における部分的な転写ジーンサイレンシング（ＴＧＳ）の抑制解除
ＴＳＩ反復配列は、セントロメア近傍領域に位置する配列である。ＴＳＩ反復配列は、野生型シロイヌナズナにおいて、転写レベルでサイレンシングを受けているが、多くのＴＧＳ変異体において、活性化されて転写されている。前記ＴＧＳ変異体としては、例えば、前記ｍｏｍ１変異体、ｂｒｕ１変異体、ｄｄｍ１変異体が知られている。そこで、野生型、ａｓｆ１ａ変異体、ａｓｆ１ｂ変異体、及び、ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体について、ＴＳＩ反復配列の転写が行われているか否かを、総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを利用して確認したところ、ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体のみで、非常に弱い発現が認められた。次に、野生型、及び、ｄｄｍ１、ｆａｓ２、ａｓｆ１ａ、ａｓｆ１ｂ、ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂの各変異体の１５日目のシードリングから総ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ処理後、ＲＴ−ＰＣＲ（＋ＲＴ）又はＰＣＲ（−ＲＴ）にかけ、ＴＳＩ転写産物を検出した。その結果を図３Ａに示す。同図において、ＡＰ２は、増幅反応のコントロールである。
4). Derepression of partial transcriptional gene silencing (TGS) in asf1a; asf1b mutants. TSI repeats are sequences located in the region near the centromere. TSI repeats are silenced at the transcriptional level in wild-type Arabidopsis, but are activated and transcribed in many TGS variants. As the TGS mutant, for example, the mom1 mutant, bru1 mutant, and ddm1 mutant are known. Thus, when wild-type, asf1a mutant, asf1b mutant, and asf1a; asf1b mutant were confirmed by using RT-PCR of total RNA, whether or not TSI repetitive sequences were transcribed. Only asf1a; asf1b mutants showed very weak expression. Next, total RNA was prepared from seeding on day 15 of each mutant of wild type and ddm1, fas2, asf1a, asf1b, asf1a; asf1b, and after DNase treatment, RT-PCR (+ RT) or PCR ( -RT) to detect TSI transcripts. The result is shown in FIG. 3A. In the figure, AP2 is an amplification reaction control.
図３Ａに示すとおり、ｄｄｍ１及びｆａｓ２変異体の２つのシードリングからは、再現性をもってＴＳＩ転写産物が検出できた（図３レーン３〜６）。一方、野生型、ａｓｆ１ａ及びａｓｆ１ｂ変異体からは、シグナルが検出されなかった（図３レーン１，２及び７〜１０）。そして、ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体では、一方のシードリングからのみ、弱いシグナルが検出された。ＰＣＲ（−ＲＴ）ではシグナルが検出されないことから、このシグナルは、ゲノムＤＮＡの混入に由来するものではない。よって、ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体の一部では、転写ジーンサイレンシング（ＴＧＳ）の抑制解除が起きていることが確認された。 As shown in FIG. 3A, TSI transcripts were reproducibly detected from the two seedlings of ddm1 and fas2 mutants (FIGS. 3 lanes 3 to 6). On the other hand, no signal was detected from the wild type, asf1a and asf1b mutants (lanes 1, 2 and 7 to 10 in FIG. 3). In the asf1a; asf1b mutant, a weak signal was detected only from one seeding. Since no signal is detected in PCR (-RT), this signal does not originate from genomic DNA contamination. Therefore, it was confirmed that in some of the asf1a and asf1b mutants, suppression of transcription gene silencing (TGS) was canceled.
次に、ＴＳＩ配列が転写されるシードリング個体の割合が経時的に増加することを確認した。野生型、ｄｄｍ１、ｆａｓ２、及び、ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂの各変異体について、５日目又は１５日目のシードリングから総ＲＮＡを調製し、同様にＲＴ−ＰＣＲを利用して、ＴＳＩ配列の転写を確認した。その結果を図３Ｂに示す。図３に示すとおり、ａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体では、５日目のシードリングでは、ＴＳＩ配列の転写が確認されたのは、２２個体中１個体のみであったが、１５日目では、２２個体中５個体となった。このように経時的に、ＴＧＳの抑制解除の割合が増加する傾向は、ｆａｓ２及びａｓｆ１ａ；ａｓｆ１ｂ変異体で一致した。 Next, it was confirmed that the proportion of seeding individuals to which the TSI sequence was transcribed increased with time. For each of the wild type, ddm1, fas2, and asf1a; asf1b mutants, total RNA was prepared from seeding on day 5 or 15 and similarly, RT-PCR was used to transcribe the TSI sequence. confirmed. The result is shown in FIG. 3B. As shown in FIG. 3, in the asf1a; asf1b mutant, the transcription of the TSI sequence was confirmed only in 1 out of 22 individuals by seeding on the 5th day, but on the 15th day, 22 individuals were confirmed. It became 5 of them. Thus, the tendency that the rate of derepression of TGS increases with time was consistent in the fas2 and asf1a; asf1b mutants.
以上説明したとおり、本発明の方法によれば、導入効率が向上し、ジーンサイレンシングが脱抑制した植物の遺伝子導入方法が可能である。さらに、本発明によれば、植物のジーンターゲッティング方法が可能であり、より安全性の高いトランスジェニック植物の製造が可能である。したがって、本発明は、農業、商業、工業を含む幅広い産業分野において有用であり、とりわけ、遺伝子改変（ＧＭ）作物の開発分野において有用である。 As described above, according to the method of the present invention, a method for introducing a gene into a plant with improved introduction efficiency and de-inhibition of gene silencing is possible. Furthermore, according to the present invention, a plant gene targeting method is possible, and a safer transgenic plant can be produced. Therefore, the present invention is useful in a wide range of industrial fields including agriculture, commerce, and industry, and is particularly useful in the field of development of genetically modified (GM) crops.
Claims (17)
ＤＮＡ複製に伴うヌクレオソーム形成反応に関与する因子をコードする１又は２以上の遺伝子が機能発現抑制される植物の変異体を準備する準備工程と、
前記変異体に、外来遺伝子を含むポリヌクレオチドを導入して外来遺伝子導入変異体を得る遺伝子導入工程とを含む遺伝子導入方法。 A gene introduction method for introducing a foreign gene into a plant,
A preparation step of preparing a plant mutant in which the expression of one or more genes encoding a factor involved in a nucleosome formation reaction associated with DNA replication is suppressed,
A gene introduction method comprising introducing a polynucleotide containing a foreign gene into the mutant to obtain a foreign gene-introduced mutant.
標的遺伝子及び/又は該標的遺伝子に隣接する領域と相同な部分と外来遺伝子とを含むポリヌクレオチドを調製するポリヌクレオチド調製工程と、
請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子導入方法により、前記ポリヌクレオチドを前記植物の変異体に相同的組換えにより導入して外来遺伝子導入変異体又は外来遺伝子導入植物を得る遺伝子導入工程とを含むジーンターゲッティング方法。 A gene targeting method in which a foreign gene is incorporated by homologous recombination into a target gene locus of a plant genome,
A polynucleotide preparation step of preparing a polynucleotide comprising a target gene and / or a portion homologous to a region adjacent to the target gene and a foreign gene;
A gene introduction step for obtaining a foreign gene-introduced mutant or a foreign gene-introduced plant by introducing the polynucleotide into the plant mutant by homologous recombination by the gene introduction method according to any one of claims 1 to 7. Gene targeting method including.
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