JP2006121948A - Recombinant virus - Google Patents
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
本発明は、リバースジェネティックスの技法により作出したマトリックスタンパク質遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを工業スケールで産生することを可能にする産生法に関するものであり、並びに、安全で、かつ高い免疫原性を保持した生の狂犬病ウイルスワクチンに関する。 The present invention relates to a production method that makes it possible to produce a matrix protein gene-deficient recombinant rabies virus produced by a reverse genetics technique on an industrial scale, and to maintain safety and high immunogenicity. Related to a live rabies virus vaccine.
狂犬病は、狂犬病ウイルスを保有するイヌ、ネコ、コウモリなどの野生動物に咬まれたり、引っ掻かれたりして発症する人獣共通感染症の１つであり、ワクチン接種により効果的に予防できるウイルス性疾患の１つである。それにも関わらず、１８８５年のパスツールによる最初のワクチン開発から１００年以上経過した現在でもなお、ヒトおよび動物における狂犬病の発生が数多く報告されており、ごく一部の国においてこのウイルス感染症が根絶されているに過ぎない。世界保健機関（WHO）によると、狂犬病が原因で死亡する人の数は、世界中で毎年４０，０００から６０，０００人にのぼると推計されており（http://www.who.int/GlobalAtlas/InteractiveMap/rmm/default.asp）、特にアジアやアフリカなどの発展途上国において多く報告されている。また近年、狂犬病が一度根絶された地域においても、アライグマやコウモリなどの野生動物を宿主とする狂犬病の存在が確認されている。 Rabies is a common zoonotic disease that occurs when bitten or scratched by wild animals such as dogs, cats, and bats that possess rabies virus, and can be effectively prevented by vaccination. It is one of the sex diseases. Nevertheless, there are still many reports of rabies outbreaks in humans and animals, and more than 100 years have passed since the first vaccine development by Pasteur in 1885. It has only been eradicated. According to the World Health Organization (WHO), the number of people who die from rabies is estimated to be 40,000 to 60,000 people worldwide every year (http://www.who.int/ GlobalAtlas / InteractiveMap / rmm / default.asp), especially in developing countries such as Asia and Africa. In recent years, even in areas where rabies has been eradicated, the existence of rabies with wild animals such as raccoons and bats as the host has been confirmed.
従来、狂犬病に対しては不活化ウイルスワクチンが用いられているが、不活化ウイルスワクチン、特に組織培養から得られる不活化ウイルスワクチンは、多量のウイルス抗原を必要とするために製造コストが高く、狂犬病の発生が多く報告されているアジアやアフリカなどの発展途上国においては特に、ヒトおよび動物に使用するには高価なワクチンである。 Conventionally, inactivated virus vaccines have been used for rabies, but inactivated virus vaccines, particularly inactivated virus vaccines obtained from tissue culture, require a large amount of virus antigens, and are expensive to produce. This is an expensive vaccine for use in humans and animals, particularly in developing countries such as Asia and Africa where rabies is frequently reported.
また、狂犬病ウイルスに感染した動物の神経組織由来の不活化ウイルスワクチン（例えばSemple rabies vaccine）は、前記組織培養から得られる不活化ウイルスワクチンに比較して、より低いコストで製造することができるが、接種された動物において自己免疫性脳脊髄炎を引き起こすなどの重篤な副作用のおそれがあり、安全性に難点がある。 Further, an inactivated virus vaccine derived from the nervous tissue of an animal infected with rabies virus (eg, Semple rabies vaccine) can be produced at a lower cost compared to an inactivated virus vaccine obtained from the tissue culture. There is a risk of serious side effects such as causing autoimmune encephalomyelitis in the inoculated animal, and there is a difficulty in safety.
更に、不活化ウイルスワクチンの接種は注射接種によるため注射針の付いた注射器が必要で、注射器および注射針の不足が深刻な国々においては、ワクチン接種を広範に行うのを妨げる一因ともなっており、ニードルフリー（needle-free）接種の実現が望まれるところである。 Furthermore, inoculation with inactivated virus vaccine is an injection, so a syringe with a needle is necessary, and in countries where the shortage of syringes and needles is serious, it is a factor that hinders vaccination. Realization of needle-free inoculation is desired.
一方、弱毒化狂犬病ウイルスワクチンは、不活化ウイルスワクチンに比較してより低いコストで製造することができ、またウイルスが不活化されていないため、経口接種などの注射器を使わない方法によってもウイルス中和抗体の産生を促すことが可能である。しかしながら、弱毒化ウイルスワクチンを接種された動物においては、残存するウイルス毒性、あるいは動物の体内においてウイルス増殖の際に起こる病原性復帰突然変異により、狂犬病を発症することもあり、これが通常弱毒化ウイルスワクチンではなく不活化ウイルスワクチンが用いられる主たる要因となっている。 On the other hand, attenuated rabies virus vaccines can be manufactured at a lower cost compared to inactivated virus vaccines, and since the viruses are not inactivated, they can also be used in the virus by methods such as oral inoculation. It is possible to promote the production of Japanese antibodies. However, in animals vaccinated with attenuated virus, rabies may develop due to residual viral virulence or pathogenic reverse mutations that occur during virus propagation in the animal, which is usually attenuated virus. This is a major factor in the use of inactivated virus vaccines rather than vaccines.
Conzelmannは、狂犬病ウイルスSAD B19株の核タンパク質（Nタンパク質）、リン酸化タンパク質（Pタンパク質）、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質（Lタンパク質）をそれぞれ発現することが可能なヘルパープラスミドベクターをコトランスフェクション（co-transfection）し、更に、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを発現することが可能な組換えワクシニアウイルスを感染させたBHK-21（baby hamster kidney）細胞に狂犬病ウイルスの全長cDNAを組込んだプラスミドベクターをトランスフェクションで導入することにより、成熟した組換え狂犬病ウイルスを作出することができるとしている（米国特許6,033,886号）。 Conzelmann co-transfected a helper plasmid vector capable of expressing the rabies virus SAD B19 strain nucleoprotein (N protein), phosphorylated protein (P protein), and RNA-dependent RNA polymerase protein (L protein), respectively ( co-transfection) and a plasmid vector in which a full-length cDNA of rabies virus is incorporated into BHK-21 (baby hamster kidney) cells infected with a recombinant vaccinia virus capable of expressing bacteriophage T7 RNA polymerase. By introducing by transfection, it is possible to produce a mature recombinant rabies virus (US Pat. No. 6,033,886).
また、全長のウイルスcDNAゲノムの代わりにマトリックスタンパク質（Mタンパク質）遺伝子（M遺伝子）を欠損させたウイルスcDNAゲノムを用いる場合、上記の系に加えてMタンパク質をコードするヘルパープラスミドベクターをコトランスフェクションすることにより、Mタンパク質が補足された、成熟した組換えM遺伝子欠損狂犬病ウイルスを作出することができると予想している（米国特許6,033,886号）。 If a viral cDNA genome lacking the matrix protein (M protein) gene (M gene) is used instead of the full-length viral cDNA genome, a helper plasmid vector encoding the M protein is cotransfected in addition to the above system. By doing so, it is expected that a mature recombinant M gene-deficient rabies virus supplemented with M protein can be produced (US Pat. No. 6,033,886).
しかしながら、実際には、Mタンパク質発現ヘルパープラスミドベクターを導入した細胞系にM遺伝子欠損狂犬病ウイルスcDNAゲノムを組込んだプラスミドベクターを導入しても、外来性のMタンパク質が補足されたM遺伝子欠損狂犬病ウイルスのウイルス粒子は得られず、Conzelmannも含めて、M遺伝子欠損狂犬病ウイルスのウイルス粒子の産生に実際に成功した例は未だない。 In reality, however, even when a plasmid vector incorporating the M gene-deficient rabies virus cDNA genome is introduced into a cell line into which an M protein expression helper plasmid vector has been introduced, an M gene-deficient rabies supplemented with an exogenous M protein. Viral virions are not available, and there are no successful examples, including Conzelmann, of producing M gene-deficient rabies virus virions.
このようにM遺伝子欠損狂犬病ウイルスのウイルス粒子が得られない原因の詳細は不明であるが、平均的な効率が30%程度と言われるトランスフェクションの効率の低さやそれぞれのトランスフェクションによる各組換えタンパク質の発現効率の低さの影響が大きいと考えられる。 The details of the reason why virus particles of M gene-deficient rabies virus cannot be obtained in this way are unknown, but the average efficiency is about 30% and the low transfection efficiency and each recombination caused by each transfection. The effect of low protein expression efficiency is considered to be large.
更には、上記のようなリバースジェネティックスの系でＭ遺伝子欠損狂犬病ウイルスを調製する時、外来的に補足するMタンパク質が細胞毒性を示し、宿主とするMタンパク質発現細胞の増殖が妨げられることも、Ｍ遺伝子欠損狂犬病ウイルスの産生効率を低下させる一因となっている。 Furthermore, when preparing an M gene-deficient rabies virus in the reverse genetics system as described above, the M protein supplemented exogenously exhibits cytotoxicity, and the growth of M protein-expressing cells as a host may be hindered. This contributes to a decrease in the production efficiency of M gene-deficient rabies virus.
一方、上記のようなＭ遺伝子欠損ウイルスを調製するリバースジェネティックスの系におけるＭタンパク質の発現効率の低さ、Ｍタンパク質の示す細胞毒性およびそれに伴う細胞増殖性の低下については、これらの問題を解決することなしに、工業スケールでＭ遺伝子欠損狂犬病ウイルスを産生することは不可能である。 On the other hand, these problems are solved with respect to the low expression efficiency of M protein, the cytotoxicity of M protein and the accompanying decrease in cell proliferation in the reverse genetics system for preparing the M gene-deficient virus as described above. Without it, it is impossible to produce M gene-deficient rabies virus on an industrial scale.
また、一般的に、実験室レベルで使用する少量のＭ遺伝子欠損狂犬病ウイルスを調製する際には、上記のConzelmann（米国特許6,033,886号）やSchnellらのリバースジェネティックス法（M. J. Schnellら, 1994, EMBO Journal, 13: 4195-4203）が適用できる。しかしながら、Ｍ遺伝子欠損狂犬病ウイルスを工業レベルで大量に産生させる際には、外来タンパク質発現法としてのプラスミドベクターのトランスフェクションや組換えワクシニアウイルスの感染などは煩雑であり、かつ、これらの方法によるウイルス産生効率が不安定であることから、これらの方法は工業レベルでの製造法として適用できない。
本発明は、高度に弱毒化したM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを作出し、更に、作出したM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを増殖・産生させる方法、およびその増殖・産生法に用いるウイルス産生用細胞を提供し、加えて、産生させた組換え狂犬病ウイルス粒子を含む安全かつ高免疫原性のワクチンを提供することを目的とする。 The present invention produces a highly attenuated M gene-deficient recombinant rabies virus, a method for growing and producing the produced M gene-deficient recombinant rabies virus, and a virus-producing cell used in the method for the growth and production In addition, the present invention aims to provide a safe and highly immunogenic vaccine containing the produced recombinant rabies virus particles.
本発明は、更に、注射接種法に加えて経鼻経口接種法でも狂犬病予防に有効なウイルス中和抗体の産生を促すことができる組換え狂犬病ウイルスワクチンを提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a recombinant rabies virus vaccine capable of promoting production of virus neutralizing antibodies effective for rabies prevention not only by injection inoculation but also by nasal oral inoculation.
本発明は、リバースジェネティックスの技法を駆使してM遺伝子を欠損した組換え狂犬病ウイルスを作出し、更に、そのM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスの工業スケールでの産生を可能にすることを特徴とする。 The present invention is characterized by producing a recombinant rabies virus deficient in the M gene using reverse genetics techniques, and further enabling production of the M gene-deficient recombinant rabies virus on an industrial scale. To do.
すなわち本発明は、リバースジェネティックスの技法により作出したマトリックスタンパク質（Ｍタンパク質）遺伝子を欠損し高度に弱毒化した組換え狂犬病ウイルスを、Ｍタンパク質を恒常的かつ細胞構成的に発現・産生することが可能な狂犬病ウイルス感受性細胞を使用して感染・増殖させる、Ｍ遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルス粒子の増殖・産生法を提供するものである。 That is, the present invention can express a recombinant rabies virus that is deficient in the matrix protein (M protein) gene produced by the reverse genetics technique and is highly attenuated, and expresses and produces the M protein constitutively and in a cellular configuration. The present invention provides a method for growing and producing M gene-deficient recombinant rabies virus particles that are infected and propagated using possible rabies virus sensitive cells.
また本発明は、前記のウイルス粒子増殖・産生法に使用する狂犬病ウイルス感受性細胞が、Mタンパク質発現能を欠いたM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスの成熟に必要なMタンパク質を補足する（complementation）細胞であって、更に、そのMタンパク質の恒常的かつ細胞構成的な発現（constitutive expression）を人為的に制御でき、Mタンパク質による細胞毒性を極力低下させることができる細胞を提供する。 The present invention also provides a cell in which the rabies virus-susceptible cell used in the above-mentioned virus particle growth / production method supplements an M protein necessary for maturation of an M gene-deficient recombinant rabies virus lacking the ability to express M protein. Furthermore, the present invention provides a cell capable of artificially controlling the constitutive and constitutive expression of the M protein and reducing the cytotoxicity of the M protein as much as possible.
本発明はまた、リバースジェネティックスの技法により作出したＭ遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを用いることにより、外来性Ｍタンパク質を補足しない限り接種動物体内で子孫ウイルスを複製しないことから安全で、かつ高い免疫原性を保持した生の狂犬病ウイルスワクチンを提供することを特徴とする。 The present invention also uses M gene-deficient recombinant rabies virus produced by the reverse genetics technique, so that the progeny virus is not replicated in the inoculated animal unless supplemented with foreign M protein. Providing a live rabies virus vaccine that retains its originality.
本発明は更に、本発明の産生法により得られる組換え狂犬病ウイルスを含むワクチン、特に注射接種用、経口接種用および経鼻接種用ワクチンを提供することを特徴とする。 The present invention is further characterized by providing a vaccine containing the recombinant rabies virus obtained by the production method of the present invention, particularly a vaccine for injection, oral and nasal vaccination.
本発明は、ウイルス粒子の成熟に不可欠であるが細胞毒性を示す狂犬病ウイルスMタンパク質を必要時、すなわち成熟ウイルス粒子を産生する時にのみ発現させることが可能な細胞を作出し、その細胞にリバースジェネティックスの技法を駆使することにより作出したM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを感染させることで、外来性のMタンパク質が補足（complementation）されたM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを工業スケールで大量に増殖・産生することができる。 The present invention creates a cell capable of expressing a rabies virus M protein that is essential for maturation of virus particles but exhibits cytotoxicity only when it is necessary, that is, when producing mature virus particles. Infecting the M gene-deficient recombinant rabies virus, which was created by using this technique, the M gene-deficient recombinant rabies virus supplemented with exogenous M protein was proliferated and mass-produced on an industrial scale. Can be produced.
本発明では、M遺伝子を欠損させた組換えウイルスを用いることにより、ウイルスが生体に感染はするが複製能を有しない（replication-incompetent）ことから安全であり、かつ、Mタンパク質以外のウイルス抗原を産生することが可能なことから、抗原発現能を欠く不活化ウイルスに比べより高い免疫原性を保持した、生の狂犬病ウイルスのワクチンを提供することができる。 In the present invention, by using a recombinant virus deficient in the M gene, the virus infects the living body, but is safe from replication-incompetent, and is a virus antigen other than the M protein. Therefore, it is possible to provide a live rabies virus vaccine that retains higher immunogenicity than an inactivated virus lacking the ability to express an antigen.
本発明の組換え狂犬病ウイルスワクチンは、ウイルスが不活化されていないため、注射接種に加えて経鼻接種および経口接種によってもウイルス中和抗体の産生を促すことが可能である。したがって、ワクチン接種に注射器および注射針が必要ないニードルフリー（needle-free）接種が実現され、また、野生動物への効果的かつ安全な投与を行うことができる。 In the recombinant rabies virus vaccine of the present invention, since the virus is not inactivated, production of virus neutralizing antibodies can be promoted not only by injection inoculation but also by nasal inoculation and oral inoculation. Therefore, needle-free inoculation that does not require a syringe and needle for vaccination is realized, and effective and safe administration to wild animals can be performed.
狂犬病ウイルス（Rabies virus, RV）は、ラブドウイルスファミリー（Rhabdoviridae）に属する一本鎖のマイナス鎖RNAゲノムを有するウイルスであり、ヒトを含む哺乳動物において重篤な神経疾患や死を引き起こす。 Rabies virus (RV) is a virus having a single-stranded minus-strand RNA genome belonging to the Rhabdoviridae family, and causes serious neurological diseases and death in mammals including humans.
狂犬病ウイルスは、およそ１２，０００塩基から成る非分節型のマイナス鎖RNAウイルスであって、図１に示すように、Nタンパク質（核タンパク質）、Pタンパク質（リン酸化タンパク質）、Mタンパク質（マトリックスタンパク質）、Gタンパク質（外被タンパク質）、Lタンパク質（RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質）の５つの構造タンパク質からなっている。Mタンパク質およびGタンパク質は、宿主細胞膜由来の脂質二重層と共にウイルスの裏打ち構造（マトリックス）およびエンベロープをそれぞれ形成するものであり、また、Nタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質およびウイルスゲノムRNAは、成熟ウイルス粒子（ビリオン）においてウイルスのエンベロープによりコートされるリボ核タンパク質複合体（ribonucleoprotein complex）を構成している。 The rabies virus is a non-segmented negative-strand RNA virus consisting of approximately 12,000 bases. As shown in FIG. 1, N protein (nucleoprotein), P protein (phosphorylated protein), M protein (matrix protein) ), G protein (coating protein), and L protein (RNA-dependent RNA polymerase protein). M protein and G protein form the virus lining structure (matrix) and envelope with the lipid bilayer derived from the host cell membrane, respectively, and N protein, P protein, L protein and viral genomic RNA are mature viruses It constitutes a ribonucleoprotein complex that is coated with the viral envelope in the particles (virions).
狂犬病ウイルスのMタンパク質は、上述のように、宿主細胞膜由来の脂質二重層と共にウイルスのマトリックスを形成するものであり、ウイルスの粒子形成および出芽に重要な役割を担っている。すなわち、M遺伝子を欠損したウイルス粒子は、細胞に感染した場合に、抗原性の高いウイルスタンパク質であるGタンパク質などは産生するが粒子形成に必須なMタンパク質を産生し得ないため、仮に外来的にMタンパク質が補足（complementation）されて成熟した完全粒子になったとしても、ウイルス複製能を欠き、子孫ウイルスを産生しない。 As described above, the M protein of rabies virus forms a viral matrix together with a lipid bilayer derived from the host cell membrane, and plays an important role in virus particle formation and budding. In other words, viral particles lacking the M gene produce G protein, which is a highly antigenic viral protein, when cells are infected, but cannot produce M protein essential for particle formation. Even if the M protein is complemented to a mature complete particle, it lacks the ability to replicate viruses and does not produce progeny virus.
換言すれば、M遺伝子欠損ウイルス粒子は、感染性を保持するがウイルス複製能を欠き、またそのために病原性を有しない、不完全粒子である。また、M遺伝子欠損ウイルス粒子は、生体内でウイルス抗原タンパク質を産生するので、生体内でウイルス抗原タンパク質を産生しない不活化ウイルスワクチンに比べて免疫効果が高い。したがって、M遺伝子欠損ウイルス粒子は、不活化ウイルスワクチンに比べ免疫効果が高く、かつ安全な狂犬病ワクチンとして応用可能であると考えられる。そこで、本発明者らは、M遺伝子を欠損し、複製能を欠いた狂犬病ウイルス粒子をリバースジェネティックスの系により作出し、更に、その複製能欠損粒子を工業スケールで大量に増殖させるために必要な、Mタンパク質を恒常的かつ細胞構成的に発現する細胞をも樹立したものである。 In other words, M gene-deficient virions are incomplete particles that retain infectivity but lack the ability to replicate viruses and are therefore not pathogenic. Moreover, since the M gene-deficient virus particles produce virus antigen proteins in vivo, they have a higher immune effect than inactivated virus vaccines that do not produce virus antigen proteins in vivo. Therefore, it is considered that M gene-deficient virus particles have a higher immune effect than inactivated virus vaccines and can be applied as a safe rabies vaccine. Therefore, the present inventors created a rabies virus particle lacking the M gene and lacking the replication ability using a reverse genetics system, and further required to proliferate the replication ability-deficient particles in large quantities on an industrial scale. In addition, cells that constantly and structurally express the M protein have also been established.
Mタンパク質以外の他のウイルスタンパク質もまた、狂犬病ウイルスの複製およびワクチン効果の発揮のために重要な役割を担っている。すなわち、Gタンパク質は、狂犬病ウイルスに対する中和抗体などの宿主防御応答の誘導ならびに宿主細胞の受容体への結合など、狂犬病ウイルスの免疫原性や病原性において主要な役割を担っている（N. Ito ら, 2001, J. Virol. 75:9121-9128）。一方、Nタンパク質、Pタンパク質およびLタンパク質は、ウイルスRNAゲノムの複製およびウイルス遺伝子の転写に必要である。 Other viral proteins besides the M protein also play an important role for the replication of the rabies virus and exerting the vaccine effect. That is, G protein plays a major role in the immunogenicity and pathogenicity of rabies virus, such as induction of host defense responses such as neutralizing antibodies against rabies virus and binding to host cell receptors (N. Ito et al., 2001, J. Virol. 75: 9121-9128). On the other hand, N protein, P protein, and L protein are necessary for viral RNA genome replication and viral gene transcription.
本明細書において“高度に弱毒化した狂犬病ウイルス”とは、それを接種した動物において如何なる病原性も示さず、例えば成体マウスおよび哺乳マウスにおいて無発病性である、安全性の高い狂犬病ウイルスを指す。本発明では、弱毒化されたウイルス株をさらにM遺伝子欠損とすることにより、複製能を消失させ、“高度に弱毒化した狂犬病ウイルス”を調製するものである。本明細書では、“高度に弱毒化した狂犬病ウイルス”を調製するために、弱毒化された株の一例としてRC-HL株を用いたが、本発明の狂犬病ウイルスはこの株に限定されるものではない。 As used herein, “highly attenuated rabies virus” refers to a highly safe rabies virus that does not show any pathogenicity in animals inoculated with it, eg, is not pathogenic in adult and suckling mice. . In the present invention, the attenuated virus strain is further made to have an M gene deficiency, thereby eliminating the replication ability and preparing a “highly attenuated rabies virus”. In this specification, the RC-HL strain was used as an example of the attenuated strain to prepare “highly attenuated rabies virus”, but the rabies virus of the present invention is limited to this strain. is not.
RC-HL株は、弱毒化された培養細胞順化狂犬病ウイルス株の１つであって、日本においては動物用不活化狂犬病ウイルスワクチンの種ウイルスとして使われている。RC-HL株は致死性の感染を引き起こさず、例えば成体マウスにおいて大脳内接種後に発生する一過性の体重減少などの軽い症状が見られるのみである（図４A参照）。他の弱毒化株の中には、哺乳マウスの脳や神経芽腫細胞株NA細胞において数代継代することにより、より病原性の高い変異体に変換（病原性復帰突然変異）しうるものもあるが、これとは対照的に、RC-HL株は哺乳マウスの脳において22代継代した後においても安定である。 The RC-HL strain is one of the attenuated cultured cell-adapted rabies virus strains, and is used as a seed virus for inactivated rabies virus vaccine for animals in Japan. The RC-HL strain does not cause a lethal infection, and only mild symptoms such as transient weight loss that occurs after intracerebral inoculation are observed in adult mice (see FIG. 4A). Some other attenuated strains can be transformed into more pathogenic variants (pathogenic backmutation) by several passages in the mammalian mouse brain or neuroblastoma cell line NA cells In contrast, the RC-HL strain is stable after 22 passages in the mammalian mouse brain.
本発明では、M遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを調製するために必要なM遺伝子欠損ウイルスゲノムのcDNAを組み込んだプラスミドベクター（以下pRC-HLΔMという。）を以下のように構築した。図１にpRC-HLΔMの作出の概略図を示す。なお、図1においては、狂犬病ウイルスがマイナス鎖のRNAゲノムを有することから、cDNAゲノムの表示は左端を3'末端および右端を5'末端とした。 In the present invention, a plasmid vector (hereinafter referred to as pRC-HLΔM) in which cDNA of an M gene-deficient virus genome necessary for preparing an M gene-deficient recombinant rabies virus was constructed was constructed as follows. FIG. 1 shows a schematic diagram of the production of pRC-HLΔM. In FIG. 1, since the rabies virus has a minus-strand RNA genome, the left end of the cDNA genome is represented as the 3 ′ end and the right end is represented as the 5 ′ end.
まず、通常のクローニング技術を用いて、図１に示した狂犬病ウイルスRC-HL株の全長cDNAゲノムを組み込んだプラスミドpRC-HL(+)から、P遺伝子後半とM遺伝子をコードする遺伝子領域に相当するSpe I−Sac II遺伝子断片（塩基番号1,959〜3,118）を欠失させる。 First, using the normal cloning technique, it corresponds to the gene region encoding the latter half of the P gene and the M gene from the plasmid pRC-HL (+) incorporating the full-length cDNA genome of the rabies virus RC-HL strain shown in FIG. The Spe I-Sac II gene fragment (base numbers 1,959 to 3,118) to be deleted is deleted.
一方、pRC-HL(+) DNAを鋳型とした一般的なPCR (polymerase chain reaction)によって、Ｐ遺伝子領域内のSpe I認識部位からP遺伝子5'末端までの遺伝子領域を、Ｐ遺伝子領域内Spe I認識部位近傍の塩基配列を含むセンスプライマーとＰ遺伝子5'末端近傍の塩基配列の5'末端にSac II認識部位を附加したアンチセンスプライマーとを用いて増幅する。
On the other hand, a general PCR (polymerase chain reaction) using pRC-HL (+) DNA as a template, the gene region from the Spe I recognition site in the P gene region to the
このように増幅した遺伝子断片は、制限酵素Spe I及びSac IIで消化した後、上述のSpe I−Sac II遺伝子断片を欠損させたpRC-HL(+)のSpe I−Sac II消化部位にT4 Ligaseを用いて連結・組み込み、M遺伝子領域だけが欠損した狂犬病ウイルスcDNAゲノムを含有するプラスミドベクターpRC-HLΔMを作出する。 The gene fragment thus amplified was digested with restriction enzymes Spe I and Sac II, and then T4 was added to the Spe I-Sac II digestion site of pRC-HL (+) from which the above-mentioned Spe I-Sac II gene fragment was deleted. Ligase is used to create a plasmid vector pRC-HLΔM containing the rabies virus cDNA genome, which is ligated and integrated, and lacks only the M gene region.
また、このようにして作出したpRC-HLΔMを外来的にMタンパク質を補足できる系に導入することで、M遺伝子が欠損したウイルスゲノムを有する組換え狂犬病ウイルス（以下、RC-HLΔMという。）を増殖・産生させることができる。 In addition, pRC-HLΔM produced in this way is introduced into a system that can supplement M protein exogenously, so that a recombinant rabies virus having a viral genome lacking the M gene (hereinafter referred to as RC-HLΔM). Can be grown and produced.
上述のように作出したM遺伝子欠損狂犬病ウイルスcDNAゲノムを含有するpRC-HLΔM由来の組換えウイルスRC-HLΔMは、M遺伝子を欠損しているため、感染性を保持するが複製に必須なMタンパク質を産生できない不完全粒子であって、例えば、成体マウスおよび哺乳マウスに接種しても完全に無発病性であった（図４A、B）。このことから、RC-HLウイルスからM遺伝子を欠損させることにより、より安全なウイルスが得られることが示される。 Recombinant virus RC-HLΔM derived from pRC-HLΔM containing the M gene-deficient rabies virus cDNA genome produced as described above is an M protein that retains infectivity but is essential for replication because it lacks the M gene. Incomplete particles that cannot produce, for example, were completely disease-free when inoculated into adult and suckling mice (FIGS. 4A, B). This indicates that a safer virus can be obtained by deleting the M gene from the RC-HL virus.
また、狂犬病ウイルスを含む非分節型マイナス鎖RNAウイルスの間では、それぞれでウイルスゲノムの塩基配列が大きく異なることから、遺伝子相同組換えが起きることはなく、したがって、欠損したM遺伝子を再獲得することはない。また、RC-HLΔMを生ウイルスワクチンとして接種した動物は狂犬病ウイルスの感染を防御することができるため、RC-HLΔMが野外の狂犬病ウイルスからM遺伝子を再獲得するような遺伝子相同組換えが起こることは考えられない。したがって、RC-HLΔMが再び複製能を獲得することは考えられず、M遺伝子欠損狂犬病ウイルスRC-HLΔMが、弱毒化されたRC-HL株が本来持つ非病原性に加えて、極めて高い安全性を有することが強く示唆される。 In addition, the homologous recombination does not occur between the non-segmented negative-strand RNA viruses, including rabies virus, because the nucleotide sequences of the virus genomes differ greatly from each other. Therefore, the missing M gene is reacquired. There is nothing. In addition, since animals vaccinated with RC-HLΔM as a live virus vaccine can protect against rabies virus infection, gene homologous recombination occurs in which RC-HLΔM reacquires the M gene from the field rabies virus. Is unthinkable. Therefore, it is unlikely that RC-HLΔM will regain replication ability, and the M gene-deficient rabies virus RC-HLΔM is extremely safe in addition to the non-pathogenicity inherent in the attenuated RC-HL strain. It is strongly suggested to have
本明細書において“リバースジェネティックス（reverse genetics）”とは、RNAウイルスのcDNAゲノムから人工的にウイルスを作出する遺伝子工学技術を指す。 As used herein, “reverse genetics” refers to a genetic engineering technique for artificially creating a virus from the cDNA genome of an RNA virus.
本発明では、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを恒常的に発現する狂犬病ウイルス感受性細胞に、M遺伝子を欠損した狂犬病ウイルスcDNAフルゲノムを含有するプラスミドベクターpRC-HLΔM、ならびにMタンパク質発現ベクター、Nタンパク質発現ベクター、Pタンパク質発現ベクターおよびLタンパク質発現ベクターをコトランスフェクションするリバースジェネティックスの技法により、外来性Mタンパク質が補足されたM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルス（RC-HLΔM）を実際に作製することに、初めて成功した。 In the present invention, a plasmid vector pRC-HLΔM containing a rabies virus cDNA full genome lacking the M gene in a rabies virus sensitive cell that constantly expresses bacteriophage T7 RNA polymerase, as well as an M protein expression vector, an N protein expression vector, For the first time to actually produce M gene-deficient recombinant rabies virus (RC-HLΔM) supplemented with foreign M protein by reverse genetics technique that co-transfects P protein expression vector and L protein expression vector Successful.
本発明では、更に、上記のリバースジェネティックスの技法を用いて得られたRC-HLΔMのビリオンをオリジナル・ストックとして、Mタンパク質を恒常的かつ細胞構成的に発現する狂犬病ウイルス感受性のウイルス産生用細胞に感染させることにより、M遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスRC-HLΔMを工業的に大量増殖・製造することに、初めて成功した。 In the present invention, furthermore, a rabies virus-sensitive cell for virus production that expresses the M protein constitutively and constitutively using the RC-HLΔM virion obtained by the above reverse genetics technique as an original stock. Succeeded in industrially proliferating and producing the M gene-deficient recombinant rabies virus RC-HLΔM industrially for the first time.
上記のように調製したM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスRC-HLΔMについて、親ウイルス株であるrRC-HLを比較対照として、確かにM遺伝子欠損ウイルスであるかどうか、およびその生物学的特性はどうであるかを比較検討した。 The M gene-deficient recombinant rabies virus RC-HLΔM prepared as described above was compared with the parental virus strain rRC-HL as a comparative control, and whether it was indeed an M gene-deficient virus and its biological characteristics. We compared whether it was.
rRC-HL株とは、弱毒化された培養細胞順化狂犬病ウイルス株であるRC-HL株のリバースジェネティックスの技法による組換えウイルス株であり、野生型RC-HL株とほぼ同様の生物学的特性を有する感染性狂犬病ウイルスである（N. Ito ら, 2001. J. Virol. 75:9121-28）。 The rRC-HL strain is a recombinant virus strain using the reverse genetics technique of the RC-HL strain, which is an attenuated cultured cell-adapted rabies virus strain, and has almost the same biology as the wild-type RC-HL strain. It is an infectious rabies virus with special characteristics (N. Ito et al., 2001. J. Virol. 75: 9121-28).
まず、上記のように調製したM遺伝子欠損狂犬病ウイルスRC-HLΔMが確かにM遺伝子欠損ウイルスであるか、Mタンパク質以外のウイルスタンパク質を産生するか否か、ならびにこのウイルスが複製し子孫ウイルスを産生するか否かは、後述のように、それぞれ逆転写PCR（RT-PCR）、間接螢光抗体法（IFA、indirect immunofluorescence assay）およびウエスタン・ブロット法により確認できる（図2A、2B、2Cおよび2D）。 First, the M gene-deficient rabies virus RC-HLΔM prepared as described above is indeed an M gene-deficient virus, whether it produces viral proteins other than M protein, and this virus replicates to produce progeny viruses. Whether or not to do so can be confirmed by reverse transcription PCR (RT-PCR), indirect immunofluorescence assay (IFA) and Western blotting, respectively, as described below (FIGS. 2A, 2B, 2C and 2D). ).
RT-PCRは、以下のようにして行うことができる。すなわち、RC-HLΔMのウイルス・ストックからゲノムRNAを抽出し、それを鋳型として、ポジティブセンス・プライマーを用いてcDNAを合成した。次いで、このcDNAを鋳型とし、ポジティブセンス・ プライマーおよびネガティブセンス・プライマーを用いたPCRを実施する。続いて、このようにして増幅するM遺伝子近傍のcDNA断片をアガロースゲル電気泳動で解析することで、RC-HLΔMがM遺伝子を欠損したウイルスであるか否かを確認できる。上記のようなRCRを行った結果、RC-HLΔMのウイルス・ストックから増幅されたM遺伝子領域のDNA断片は450 bp (base pairs、塩基対)であり、このウイルスがM遺伝子を欠損していることが確認された（図2B）。 RT-PCR can be performed as follows. That is, genomic RNA was extracted from a virus stock of RC-HLΔM, and cDNA was synthesized using it as a template using a positive sense primer. Next, PCR is carried out using this cDNA as a template and using a positive sense primer and a negative sense primer. Subsequently, by analyzing the cDNA fragment in the vicinity of the M gene thus amplified by agarose gel electrophoresis, it can be confirmed whether or not RC-HLΔM is a virus lacking the M gene. As a result of RCR as described above, the DNA fragment of the M gene region amplified from RC-HLΔM virus stock is 450 bp (base pairs), and this virus lacks the M gene. (Figure 2B).
RC-HLΔMが複製し子孫ウイルスを産生するか否かは、RC-HLΔMを感染させた細胞をIFAで螢光標識することにより調べることができる（N. Minamotoら, 1994, Microbiol.Immunol. 38:449-55）。すなわち、まず、RC-HLΔMおよびrRC-HLをマウス神経芽腫細胞株NA細胞に接種して培養した後、各々の感染細胞を固定する。続いて、固定した細胞に抗Nタンパク質モノクローナル抗体（N-MAb）を作用させ、螢光標識した二次抗体との反応で感染細胞を螢光標識した後に螢光顕微鏡観察下でウイルス抗原を検出することにより、RC-HLΔMが複製し子孫ウイルスを産生しているか否かを調べることができる。このようなIFAを行った結果、RC-HLΔMを感染させたNA細胞では、感染したRC-HLΔM由来の僅かのNタンパク質しか検出されず、このウイルスが感染性を保持しているものの複製能を持たないことが確認された（図2D）。 Whether RC-HLΔM replicates to produce progeny virus can be examined by fluorescently labeling cells infected with RC-HLΔM with IFA (N. Minamoto et al., 1994, Microbiol. Immunol. 38). : 449-55). That is, first, RC-HLΔM and rRC-HL are inoculated into a mouse neuroblastoma cell line NA cell and cultured, and then each infected cell is fixed. Subsequently, anti-N protein monoclonal antibody (N-MAb) is allowed to act on the fixed cells, and the infected cells are fluorescently labeled by reaction with a fluorescently labeled secondary antibody, and then the virus antigen is detected under a fluorescent microscope. By doing so, it is possible to examine whether RC-HLΔM is replicating and producing a progeny virus. As a result of such IFA, in the NA cells infected with RC-HLΔM, only a few N proteins derived from the infected RC-HLΔM were detected, and the replication ability of this virus while retaining infectivity was detected. It was confirmed that it does not have (Fig. 2D).
また、RC-HLΔMが複製能を有するか否かは、組織培養プレートの各培養ウェルに単層に増殖させたBHK細胞を用いた一般的なフォーカス・アッセイでRC-HLΔMのウイルス力価を測定することにより確認することができる。このようなウイルス力価測定を行った結果、RC-HLΔMのウイルス力価は検出限界以下であり、このウイルスが複製能を有しないことが再度確認された。 In addition, whether RC-HLΔM has replication ability was determined by measuring the virus titer of RC-HLΔM using a general focus assay using BHK cells grown in a monolayer in each culture well of the tissue culture plate. This can be confirmed. As a result of such virus titer measurement, the virus titer of RC-HLΔM was below the detection limit, and it was confirmed again that this virus has no replication ability.
一方、RC-HLΔMがNタンパク質あるいはMタンパク質を産生するか否かについては、抗Nタンパク質モノクローナル抗体（N-MAb）あるいは抗Mタンパク質モノクローナル抗体（M-MAb）を用いた一般的なウエスタン・ブロット法で調べることができる。すなわち、RC-HLΔMを感染させたNA細胞から調製した細胞全タンパク質を一般的なウエスタン・ブロット法で解析することで、RC-HLΔM感染細胞において、Mタンパク質やNタンパク質が産生されているか否かを調べることができる。 On the other hand, whether or not RC-HLΔM produces N protein or M protein is determined by general Western blot using anti-N protein monoclonal antibody (N-MAb) or anti-M protein monoclonal antibody (M-MAb). Can be examined by law. That is, whether or not M protein or N protein is produced in RC-HLΔM-infected cells by analyzing the total cellular protein prepared from NA cells infected with RC-HLΔM using a general Western blot method. Can be examined.
本発明において、このような方法を実施した結果、RC-HLΔMは、Mタンパク質を発現しないがNタンパク質を発現していることが明らかになり、狂犬病ウイルスワクチンとして重要な免疫原性を担うNタンパク質の発現能を保持していることが示された。また、一方で、Mタンパク質の発現が検出されなかったことから、感染後に細胞内で複製せず、生ウイルスワクチンとしての安全性を備えていることも明らかになった。 As a result of carrying out such a method in the present invention, it became clear that RC-HLΔM does not express M protein but expresses N protein, and N protein responsible for important immunogenicity as a rabies virus vaccine It was shown to retain the expression ability of. On the other hand, since the expression of M protein was not detected, it was revealed that the protein was not replicated in the cell after infection and had safety as a live virus vaccine.
M遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスRC-HLΔMは、前述したように、Mタンパク質発現ベクターを狂犬病ウイルス感受性細胞にトランスフェクションし、外来性のMタンパク質を発現させた細胞にRC-HLΔMを感染させることにより得ることができる。しかしながら、Mタンパク質発現ベクターによるトランスフェクションの工程にはMタンパク質の発現効率の低さや不安定さが伴い、また非常に煩雑な作業の実施が必要であり、その上、製造コストが高騰することから、ワクチン用ウイルスを工業レベルで増殖・製造する工程として適用することはできない。 As described above, the M gene-deficient recombinant rabies virus RC-HLΔM is obtained by transfecting a rabies virus-sensitive cell with an M protein expression vector and infecting cells expressing foreign M protein with RC-HLΔM. Obtainable. However, the M protein expression vector transfection process involves low efficiency and instability in the expression of M protein, and requires very complicated operations. In addition, the production cost increases. It cannot be applied as a process for growing and producing vaccine viruses at an industrial level.
したがって、本発明においては、工業的に用いることが可能な、RC-HLΔMを大量に生産するための産生用細胞として、Mタンパク質を恒常的かつ細胞構成的に発現する細胞を構築する。加えて、その産生用細胞には、細胞に対して毒性を示すMタンパク質の発現を人為的に制御できるシステムも導入する。これにより、ワクチン用ウイルス、すなわちRC-HLΔMを増殖・製造する工程において、ウイルス産生用細胞にMタンパク質発現ベクターをトランスフェクションする必要がなくなり、RC-HLΔM をMタンパク質恒常発現細胞に感染させるだけで、M遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスRC-HLΔMを効率よく安価に増殖・製造することができる。 Therefore, in the present invention, cells that constantly and structurally express M protein are constructed as production cells for mass production of RC-HLΔM that can be used industrially. In addition, a system capable of artificially controlling the expression of M protein, which is toxic to cells, is introduced into the production cells. This eliminates the need to transfect the virus-producing cells with the M protein expression vector in the process of growing and producing the vaccine virus, namely RC-HLΔM, and only infects the RC-HLΔM with M protein constant expression cells. Therefore, the M gene-deficient recombinant rabies virus RC-HLΔM can be proliferated and produced efficiently and inexpensively.
本明細書において“Mタンパク質を恒常的かつ細胞構成的に発現（constitutive expression）する”とは、Mタンパク質を常時安定的に発現することを指す。本発明では、Mタンパク質を恒常的かつ細胞構成的に発現させることができることから、M遺伝子欠損組換えウイルスを調製するために、Mタンパク質発現ベクターをウイルス産生用細胞にトランスフェクションして細胞にMタンパク質を発現させる工程を毎回行う必要がなくなる。 In the present specification, “constitutive expression of M protein” means that M protein is always stably expressed. In the present invention, since the M protein can be expressed constitutively and in a cell constitutive manner, in order to prepare an M gene-deficient recombinant virus, the M protein expression vector is transfected into a virus-producing cell and M There is no need to perform the protein expression step each time.
具体的には、上記のトランスフェクション法により得られた、外来性Mタンパク質が補足されたM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスをオリジナル・ストックとしておき、外来因子（例えば薬剤など）によりMタンパク質の発現を人為的に制御することが可能なMタンパク質発現制御系を導入した細胞を用いて、当該ウイルスの工業的増殖・製造を実現する。 Specifically, M gene-deficient recombinant rabies virus supplemented with exogenous M protein obtained by the transfection method described above is used as an original stock, and expression of M protein by a foreign factor (such as a drug) is performed. Industrial growth and production of the virus is achieved using cells that have introduced an M protein expression control system that can be artificially controlled.
狂犬病ウイルスのMタンパク質が高い細胞毒性を有することは知られており、Mタンパク質を発現させ続けると、最終的に細胞にアポトーシスを引き起こしてしまう。このため本発明者らは、外来因子（例えば薬剤など）の添加によりMタンパク質の発現を人為的に制御することが可能な細胞系を構築し、必要時にのみMタンパク質を人為的に発現させて、Mタンパク質による細胞毒性を低減するものである。また、そのようなMタンパク質の発現を人為的に制御可能な細胞の作出・導入によって、上述のように、M遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスの工業レベルでの増殖・産生を実現するものである。 It is known that the M protein of rabies virus has high cytotoxicity, and if the M protein is continuously expressed, it eventually causes apoptosis in the cells. For this reason, the present inventors constructed a cell line capable of artificially controlling the expression of M protein by the addition of a foreign factor (for example, a drug), and artificially expressed the M protein only when necessary. , Which reduces the cytotoxicity caused by the M protein. In addition, as described above, the production and introduction of cells capable of artificially controlling the expression of such M protein realizes the proliferation and production of the M gene-deficient recombinant rabies virus at the industrial level.
本発明では、外来因子（例えば薬剤など）の添加により制御可能なMタンパク質発現制御系の一例として、GeneSwitch（商標）システム（Invitrogen社製）を用い、合成ステロイドホルモンであるミフェプリストン（mifepriston）によりMタンパク質発現を人為的に制御可能なBHK細胞系を構築した。 In the present invention, as an example of an M protein expression control system that can be controlled by the addition of a foreign factor (for example, a drug), the GeneSwitch ™ system (manufactured by Invitrogen) is used, and mifepriston, a synthetic steroid hormone, is used. A BHK cell line that can artificially control M protein expression was constructed.
GeneSwitchシステムは、２種類のベクター（pGene/V5-His発現ベクターとpSwitch調節ベクター）を用いて発現を強力にコントロールする系であり、インデューサーとしてミフェプリストンが存在する条件下では目的タンパク質を発現するが、ミフェプリストン非存在下では目的タンパク質を全く発現しない。すなわち、インデューサーとしてのミフェプリストン非存在下ではpSwitchから発現された調節タンパク質はpGene/V5-Hisのプロモーターと結合できず遺伝子の転写が起こらないが、ミフェプリストンを添加すると上記プロモーターと結合して調節タンパク質の立体構造が変化し、ハイブリッド調節タンパク質（ミフェプリストン／調節タンパク質複合体）がpGene/V5-HisのGal4 DNA結合部位と結合して転写が誘導されるものである。 The GeneSwitch system is a system that strongly controls expression using two types of vectors (pGene / V5-His expression vector and pSwitch regulatory vector), and expresses the target protein in the presence of mifepristone as an inducer. However, the target protein is not expressed at all in the absence of mifepristone. That is, in the absence of mifepristone as an inducer, the regulatory protein expressed from pSwitch cannot bind to the pGene / V5-His promoter and transcription of the gene does not occur, but when mifepristone is added, it binds to the above promoter Thus, the three-dimensional structure of the regulatory protein changes, and the hybrid regulatory protein (mifepristone / regulatory protein complex) binds to the Gal4 DNA binding site of pGene / V5-His to induce transcription.
狂犬病ウイルスのMタンパク質の発現をミフェプリストンの添加により誘導できる細胞は、GeneSwitchシステムの取扱説明書に記載された方法に従い、BHK細胞を用いて作出することができ、また、M遺伝子を組み込んだpGene/V5-His発現ベクターとpSwitch調節ベクターが導入された細胞は、抗生物質Zeocinに耐性を示す細胞としてクローニングできる。 Cells that can induce the expression of M protein of rabies virus by the addition of mifepristone can be generated using BHK cells according to the method described in the instruction manual of GeneSwitch system, and the M gene is incorporated. Cells introduced with the pGene / V5-His expression vector and the pSwitch regulatory vector can be cloned as cells resistant to the antibiotic Zeocin.
このような方法で作出・クローニングした細胞の中から、Mタンパク質の発現を人為的に制御可能な、最も大量にRC-HLΔMを産生する細胞を選択し、BHK/RM-23細胞と名付けた。 The cells that produced RC-HLΔM in the largest amount capable of artificially controlling the expression of M protein were selected from the cells produced and cloned by such a method and named BHK / RM-23 cells.
BHK/RM-23細胞におけるミフェプリストン添加によるMタンパク質の発現誘導は、上記同様の一般的なウエスタン・ブロット法およびIFAにより確認できる。すなわち、ミフェプリストン存在下および非存在下で培養したBHK/RM-23細胞について、抗Mタンパク質モノクローナル抗体（M-MAb）を用いたウエスタン・ブロット法およびIFAを行い、Mタンパク質が検出できるか否かで、Mタンパク質発現の誘導を確認することができる。以上のようなウエスタン・ブロット法およびIFAを実施した結果、ミフェプリストンの添加によるBHK/RM-23細胞からの効率的なMタンパク質の発現誘導が確認された（図3A、3B）。 Induction of M protein expression by addition of mifepristone in BHK / RM-23 cells can be confirmed by the same general Western blotting method and IFA as described above. In other words, is it possible to detect M protein by performing Western blotting and IFA using anti-M protein monoclonal antibody (M-MAb) on BHK / RM-23 cells cultured in the presence and absence of mifepristone? No, the induction of M protein expression can be confirmed. As a result of Western blotting and IFA as described above, efficient induction of M protein expression from BHK / RM-23 cells by the addition of mifepristone was confirmed (FIGS. 3A and 3B).
本発明のMタンパク質誘導発現システムは、前記GeneSwitchシステム（Invitrogen社製）には限定されず、例えば他の薬剤などでMタンパク質発現を制御できるすべての系を含む。 The M protein induced expression system of the present invention is not limited to the GeneSwitch system (manufactured by Invitrogen), and includes all systems that can control M protein expression with other drugs, for example.
RC-HLΔMの免疫原性は、1.0×105フォーカス形成単位（FFU）のRC-HLΔMおよびUV不活化RC-HL（比較対照）をそれぞれマウスに筋肉内接種もしくは経鼻接種し、各々のマウスの血中ウイルス中和抗体(VNA)を測定することで確認することができる。 The immunogenicity of RC-HLΔM was determined by inoculating the mice intramuscularly or intranasally with 1.0 × 10 5 focus-forming units (FFU) RC-HLΔM and UV-inactivated RC-HL (comparative control). This can be confirmed by measuring the virus neutralizing antibody (VNA) in blood.
血中VNAの力価は以下の方法で測定できる。すなわち、ウイルス接種マウスから調製した血清を階段希釈し、その分液をrRC-HLと混合し、インキュベーションする。その後、ウイルス血清混合液を、組織培養マイクロタイタープレートの各ウェル中でBHK細胞懸濁液と混合し、インキュベーションする。数日後、細胞変性効果を顕微鏡観察し、50%以上のウェルにおいて細胞変性効果を阻害する血清の最も高い希釈倍数の逆数として血中ウイルス中和抗体価を算出することができる。 The titer of blood VNA can be measured by the following method. That is, serum prepared from virus-inoculated mice is serially diluted, and the aliquot is mixed with rRC-HL and incubated. The viral serum mixture is then mixed with the BHK cell suspension in each well of a tissue culture microtiter plate and incubated. Several days later, the cytopathic effect is observed with a microscope, and the virus neutralizing antibody titer in blood can be calculated as the reciprocal of the highest dilution of serum that inhibits the cytopathic effect in 50% or more of the wells.
一方、RC-HLΔMの非病原性は、例えばマウスにRC-HLΔMを脳内接種し、ウイルス接種後のマウスの体重変化および生残率を求めることで確認できる。 On the other hand, the non-pathogenicity of RC-HLΔM can be confirmed, for example, by inoculating mice with RC-HLΔM in the brain and determining the weight change and survival rate of the mice after virus inoculation.
rRC-HLよびUV不活化RC-HLを比較対照として上記のような実験を行い、RC-HLΔMの免疫原性および病原性を検討した結果、RC-HLΔMは、筋肉内接種のみならず経鼻接種によっても血中に抗狂犬病ウイルス中和抗体を誘導しており、不活化ウイルスワクチンの接種では望めない経鼻接種による免疫誘導が可能であることが判明した（図5）。一方、RC-HLΔMは、それを大脳接種したマウスにおいて、一過性体重減少や生残率の低下などのいかなる臨床症状の異常も認められなかったことから、非病原性であり、高度に弱毒化した狂犬病ウイルスであることが確認された（図4）。 As a result of investigating the immunogenicity and pathogenicity of RC-HLΔM using rRC-HL and UV-inactivated RC-HL as comparative controls, RC-HLΔM was not only injected intramuscularly but also nasally. The anti-rabies virus neutralizing antibody was also induced in the blood by inoculation, and it was found that immunization induction by nasal inoculation that could not be expected with inactivated virus vaccine was possible (Fig. 5). On the other hand, RC-HLΔM is non-pathogenic and highly attenuated because no abnormalities in clinical symptoms such as transient weight loss and decreased survival rate were observed in mice inoculated with cerebrum. It was confirmed that the virus was transformed into rabies (Figure 4).
上述のように、Mタンパク質を外来的に補足したM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスは、M遺伝子を欠損させることにより複製能を失わせたものであるが、感染性を保持しており、感染した細胞内で抗原タンパク質を産生できる。したがって、生ウイルスワクチンとして動物に接種した場合、液性免疫のみならず細胞性免疫をも誘導することができる。一方、不活化ウイルスワクチンは、液性免疫を誘導することはできるが、感染した細胞内で抗原タンパク質を産生しないことから、細胞性免疫を誘導することはできない。以上のことから、液性免疫および細胞性免疫の両方を誘導することができるM遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、生ウイルスワクチン株として有用・優秀であることが示されている。 As mentioned above, M gene-deficient recombinant rabies virus supplemented with M protein exogenously has lost its replication ability by deleting the M gene, but retains infectivity and is infected Antigen proteins can be produced in cells. Therefore, when an animal is inoculated as a live virus vaccine, not only humoral immunity but also cellular immunity can be induced. On the other hand, inactivated virus vaccines can induce humoral immunity, but cannot induce cellular immunity because they do not produce antigenic proteins in infected cells. From the above, it has been shown that M gene-deficient rabies virus capable of inducing both humoral immunity and cellular immunity is useful and excellent as a live virus vaccine strain.
また、M遺伝子欠損狂犬病ウイルスRC-HLΔMは、不活化ウイルスワクチンの接種では認められなかった経鼻接種での免疫誘導能を有することが明らかになった（図5B）。この結果は、RC-HLΔMが、注射接種用のみならず、注射器を必要としない経鼻接種用や経口接種用などのワクチンとして適用できることを強く示唆している。 Moreover, it became clear that the M gene-deficient rabies virus RC-HLΔM has the ability to induce immunity by nasal inoculation that was not observed by inoculation with inactivated virus vaccine (FIG. 5B). This result strongly suggests that RC-HLΔM can be applied not only for injection vaccination but also as a vaccine for nasal vaccination and oral vaccination that does not require a syringe.
本発明者らは、本発明において、M遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスが、狂犬病ウイルスの新規の優れた候補ワクチンであり、また、安全かつ有効であって、注射器を使用しないワクチン接種（例えば経口接種、経鼻接種）にも利用できることを実証するものである。また、このM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスを抗原とする生ワクチンは、ウイルスの不活化工程やアジュバントの添加を必要としないことから、不活化ワクチンよりも安価に生産することができる。更に、不活化ワクチンに比べて安価であることに加えて、ワクチン接種に注射器を必要としないことから、発展途上国における狂犬病の予防にも有用である。 In the present invention, the present inventors have confirmed that the M gene-deficient recombinant rabies virus is a novel excellent candidate vaccine for rabies virus, and is safe and effective, and does not use a syringe (for example, oral inoculation). It is proved that it can be used for nasal injection. In addition, a live vaccine using the M gene-deficient recombinant rabies virus as an antigen does not require a virus inactivation step or addition of an adjuvant, and therefore can be produced at a lower cost than an inactivated vaccine. Furthermore, in addition to being cheaper than inactivated vaccines, it does not require a syringe for vaccination and is therefore useful for the prevention of rabies in developing countries.
一般に、生ワクチンの剤型としては、そのままウイルス液として用いる液状製剤、あるいは、安定剤（ゼラチン、ペプトン、NZアミンなど）を添加して凍結乾燥し、添付されている溶解液（生理食塩水など）で用時溶解して用いる凍結乾燥製剤がある。長期間安定的にウイルスを保存できるという観点から、通常、凍結乾燥製剤を用時調製して用いることが多い。 In general, the dosage form of a live vaccine is a liquid preparation used as a virus solution as it is, or a stabilizer (gelatin, peptone, NZ amine, etc.) is added and lyophilized, and the attached solution (physiological saline, etc.) ) And lyophilized preparations to be used at the time of use. From the standpoint that viruses can be stored stably for a long period of time, a freeze-dried preparation is usually prepared and used in many cases.
上述のように、本発明のワクチンは、狂犬病ウイルスのMタンパク質を、人為的な発現制御システムの下で恒常的かつ細胞構成的に発現・産生することが可能な狂犬病ウイルス感受性細胞を使用する、本発明のウイルス粒子の増殖・産生法による組換え狂犬病ウイルス粒子を含むものである。 As described above, the vaccine of the present invention uses rabies virus-sensitive cells capable of expressing and producing the rabies virus M protein constitutively and constitutively under an artificial expression control system. It includes recombinant rabies virus particles produced by the virus particle propagation and production method of the present invention.
また本発明のワクチンは、注射接種用のみならず、経口接種用および経鼻接種用ワクチンとして用いることができるものである。 The vaccine of the present invention can be used not only for injection vaccination but also for oral and nasal vaccination.
（実験例）以下、実験例により本発明を更に詳しく説明する。 (Experimental Example) The present invention will be described in more detail with reference to experimental examples.
（１）RC-HLΔMの作出
公知の組換え狂犬病ウイルスを作製するためのリバースジェネティックスの技術（N. Itoら, 2003, Microbiol. Immuno. 47:613-617）によって、弱毒化した狂犬病ウイルスであるRC-HL株由来のM遺伝子欠損ゲノムプラスミドベクターpRC-HLΔMから、外来性Mタンパク質が補足されたM遺伝子欠損狂犬病ウイルスRC-HLΔMを産生させることができた。なお、RC-HL株由来のM遺伝子欠損ゲノムプラスミドベクター（pRC-HLΔM）は、平成16年9月30日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにより受託されている（pRC-HLΔM 受託番号 FERM P-20237）。
(1) Production of RC-HLΔM Using a reverse genetics technique (N. Ito et al., 2003, Microbiol. Immuno. 47: 613-617) to produce a known recombinant rabies virus, From an RC gene derived from a RC-HL strain, an M gene-deficient rabies virus RC-HLΔM supplemented with an exogenous M protein could be produced. The RC-HL strain-derived M gene-deficient genomic plasmid vector (pRC-HLΔM) was commissioned by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Center on September 30, 2004 (pRC- HLΔM accession number FERM P-20237).
以下に、M遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスの作出法を詳細に説明する。まず、PCRで増幅したM遺伝子断片をpcDNA4/TO（Invitrogen社製）にクローニングし、得られたMタンパク質発現プラスミドベクターをpRM4/TOと名付けた。 Below, the production method of the M gene-deficient recombinant rabies virus will be described in detail. First, the M gene fragment amplified by PCR was cloned into pcDNA4 / TO (Invitrogen), and the resulting M protein expression plasmid vector was named pRM4 / TO.
T7 RNAポリメラーゼを恒常的に発現するBHK (baby hamster kidney)細胞（BHK/T7-9細胞； N. Itoら, 2003, Micorbiol. Immunol. 47:613-617）（1.0×105 個）に、Nタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質の各々を発現するヘルパープラスミドベクター、上記pRM4/TO（0.2 μg）、およびM遺伝子欠損狂犬病ウイルスcDNAゲノムを組み込んだプラスミドベクターpRC-HLΔM（2 μg）を通常の技術（N. Itoら, 2003, Micorbiol. Immunol. 47:613-617）を用いてコトランスフェクションした。次いで、このコトランスフェクションから4日後に細胞を継代し、pRM4/TO（0.8 μg）を再度トランスフェクションした。本発明者らは、このような細胞継代およびトランスフェクションを3日に2回の頻度で繰り返した。その結果、細胞培養上清中に、外来性Mタンパク質が補足されたM遺伝子欠損組換え狂犬病ウイルスRC-HLΔMが得られた。 In BHK (baby hamster kidney) cells (BHK / T7-9 cells; N. Ito et al., 2003, Micorbiol. Immunol. 47: 613-617) (1.0 × 10 5 cells) that constantly express T7 RNA polymerase, Standard technology for helper plasmid vector expressing each of N protein, P protein, and L protein, pRM4 / TO (0.2 μg) and plasmid vector pRC-HLΔM (2 μg) incorporating M gene-deficient rabies virus cDNA genome (N. Ito et al., 2003, Micorbiol. Immunol. 47: 613-617). Cells were then passaged 4 days after this co-transfection and re-transfected with pRM4 / TO (0.8 μg). We repeated such cell passage and transfection at a frequency of twice every 3 days. As a result, M gene-deficient recombinant rabies virus RC-HLΔM supplemented with foreign M protein was obtained in the cell culture supernatant.
本発明者らは、上述のようにして得たRC-HLΔMを下記のBHK/RM-23を用いた大量増殖のためのオリジナル・ストックとして保存した。 The inventors stored RC-HLΔM obtained as described above as an original stock for mass growth using the following BHK / RM-23.
なお、ここで用いた細胞は、10%トリプトースリン酸ブロス（TPB）および5%ウシ胎仔血清（FCS）を添加したEagle基礎培地（MEM）を用いて培養した。 The cells used here were cultured using Eagle basal medium (MEM) supplemented with 10% tryptose phosphate broth (TPB) and 5% fetal calf serum (FCS).
（２）RC-HLΔMの特徴解析（RT-PCR）
RC-HLΔMがそのゲノム中にM遺伝子を有しないことを確認するために、それぞれM遺伝子の上流および下流の遺伝子領域にアニールするポジティブセンス・プライマーおよびネガティブセンス・プライマーを用いて、RT-PCRを行った（図2A）。比較例としてrRC-HＬを用いた。
(2) Characteristic analysis of RC-HLΔM (RT-PCR)
To confirm that RC-HLΔM does not have the M gene in its genome, RT-PCR was performed using positive and negative sense primers that anneal to the upstream and downstream gene regions of the M gene, respectively. Performed (Figure 2A). RRC-HL was used as a comparative example.
RT-PCRは、以下のようにして行った。すなわち、ISOGEN（Nippon Gene社製、日本）を用いてRC-HLΔMのウイルス・ストックからゲノムRNAを抽出し、それを鋳型として、RC-HLゲノムの塩基番号2,370から2,393までの領域にアニールするポジティブセンスDetRM(+)プライマー（5' ATC ATG CAA GAT GAT TTG AAT CGC 3'）（DDBJ/EMBL/GenBank受託番号：AB009663）およびReady-To-Go You-Prime First-Strand Beads（Pharmacia社製）を用いてcDNAを合成した。次いで、このcDNAを鋳型とし、DetRM(+) プライマーおよびRC-HLゲノムの塩基番号3,491から3,514までの領域にアニールするネガティブセンスDetRM(-)プライマー（5' TTT AAG TTC CAT GTA TGA GAA CCC 3'）を用いたPCRを実施した。続いて、このRT-PCRで増幅させたM遺伝子近傍のcDNA断片をアガロースゲル電気泳動で解析することで、RC-HLΔMがM遺伝子を欠損したウイルスであるか否かを確認した。なお、PCRのTaq DNAポリメラーゼにはTakara Ex Taq（宝酒造株式会社製、日本）を用いた。 RT-PCR was performed as follows. In other words, ISOGEN (Nippon Gene, Japan) is used to extract genomic RNA from RC-HLΔM virus stock and use it as a template to anneal to the region from base numbers 2,370 to 2,393 of the RC-HL genome. Sense DetRM (+) primer (5 'ATC ATG CAA GAT GAT TTG AAT CGC 3') (DDBJ / EMBL / GenBank accession number: AB009663) and Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads (Pharmacia) Was used to synthesize cDNA. Next, using this cDNA as a template, the negative sense DetRM (-) primer (5 'TTT AAG TTC CAT GTA TGA GAA CCC 3' anneals to the region from base numbers 3,491 to 3,514 of the RC-HL genome with the DetRM (+) primer. ) Was performed. Subsequently, the cDNA fragment near the M gene amplified by RT-PCR was analyzed by agarose gel electrophoresis to confirm whether RC-HLΔM was a virus lacking the M gene. Note that Takara Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) was used as the PCR Taq DNA polymerase.
rRC-HLのウイルス・ストックから抽出されたRNAを鋳型として用いて上記のRT-PCRを行ったところ、完全長のM遺伝子を含む、1,147塩基対（bp）のcDNA断片が得られた（図2B、レーン3）。これとは対照的に、RC-HLΔM由来のRNAについて同一のプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ、予想したとおり、より小さいサイズ（450 bp）のcDNA断片が得られた（図2B、レーン1）。逆転写（RT）段階を伴わないPCRによってはいかなる産物も得られず、このことは、上記のRT-PCRで増幅されたDNA断片がトランスフェクションに用いた完全長ゲノムプラスミドに由来するものではないことを示している（図2B、レーン2）。以上の結果より、RC-HLΔMゲノムは確かにM遺伝子欠損であることが証明された。 When the above RT-PCR was performed using RNA extracted from rRC-HL virus stock as a template, a 1,147 base pair (bp) cDNA fragment containing the full-length M gene was obtained (Fig. 2B, lane 3). In contrast, RT-PCR of RC-HLΔM-derived RNA using the same primers resulted in a smaller cDNA fragment (450 bp) as expected (Figure 2B, Lane 1). PCR without a reverse transcription (RT) step does not yield any product, and this does not mean that the above-mentioned RT-PCR amplified DNA fragment is derived from the full-length genomic plasmid used for transfection (Figure 2B, lane 2). From the above results, it was proved that the RC-HLΔM genome was indeed M gene-deficient.
（３）RC-HLΔMの特徴解析（IFA）
RC-HLΔMが複製して子孫ウイルスを産生するか否かは、RC-HLΔMを感染させた細胞をIFAで螢光標識することにより調べた（N. Minamotoら, 1994, Microbiol.Immunol. 38:449-55）。
(3) Feature analysis of RC-HLΔM (IFA)
Whether RC-HLΔM replicates to produce progeny virus was examined by fluorescently labeling cells infected with RC-HLΔM with IFA (N. Minamoto et al., 1994, Microbiol. Immunol. 38: 449-55).
すなわち、まず、RC-HLΔMおよびrRC-HLをM.O.I.（multiplicity of infection、感染価）0.01でマウス神経芽腫細胞株であるNA細胞に接種し、10%ウシ胎仔血清を含むEagle基礎培地中で培養した後、各々の感染細胞を2%ホルムアルデヒドで60分間、次いで100%メタノールで2分間固定した。続いて、固定した細胞に抗Nタンパク質モノクローナル抗体N-MAb 8-1を作用させ、螢光標識した二次抗体との反応で感染細胞を螢光標識した後に螢光顕微鏡観察下でウイルス抗原を検出することにより、RC-HLΔMが複製し子孫ウイルスを産生しているか否かを調べた。 Specifically, RC-HLΔM and rRC-HL are first inoculated into mouse neuroblastoma cell line NA cells at MOI (multiplicity of infection) 0.01 and cultured in Eagle's basal medium containing 10% fetal bovine serum. After that, each infected cell was fixed with 2% formaldehyde for 60 minutes and then with 100% methanol for 2 minutes. Subsequently, anti-N protein monoclonal antibody N-MAb 8-1 is allowed to act on the fixed cells, and the infected cells are fluorescently labeled by reaction with a fluorescently labeled secondary antibody. By detecting, it was investigated whether RC-HLΔM replicated and produced progeny virus.
上記のようなIFAを行った結果、rRC-HＬを感染させたNA細胞では、Nタンパク質は、2 dpi（days post-inoculation、接種後日数）においてフォーカスとして観察され、4 dpiにおいては広範囲で検出された（図2D、下段）。これとは対照的に、RC-HLΔMを感染させたNA細胞では、2 dpiおよび4 dpiの両方において、感染したRC-HLΔM由来の僅かのNタンパク質しか検出されず、このウイルスが感染性を保持しているものの複製能を持たないことが確認された（図2D、上段）。 As a result of IFA as described above, in NA cells infected with rRC-HL, N protein is observed as a focus at 2 dpi (days post-inoculation), and is widely detected at 4 dpi. (Figure 2D, bottom). In contrast, NA-cells infected with RC-HLΔM detected only a few N proteins from infected RC-HLΔM at both 2 and 4 dpi, and the virus remains infectious. It was confirmed that it had no replication ability (Fig. 2D, top).
（４）RC-HLΔMの特徴解析（ウイルス力価）
また、RC-HLΔMが複製能を有するか否かは、24ウェル組織培養プレートの各培養ウェルに単層に増殖させたBHK細胞を用いた一般的なフォーカス・アッセイでこのウイルスのウイルス力価を測定することにより確認した。このようなウイルス力価測定を行った結果、2 dpiおよび4 dpi におけるNA細胞の培養上清中におけるrRC-HLのウイルス力価は、それぞれ1.1×106 FFU/mlおよび1.5×108 FFU/mlであった。一方、RC-HLΔMに感染した細胞からの上清中におけるRC-HLΔMのウイルス力価は、2 dpiおよび4 dpiの両方において検出限界以下であり（<1.0×101 FFU/ml）、このウイルスが複製能を有しないことが再度確認された。
(4) Characteristic analysis of RC-HLΔM (virus titer)
In addition, whether or not RC-HLΔM has replication ability is determined by the virus titer of this virus in a general focus assay using BHK cells grown in a monolayer in each culture well of a 24-well tissue culture plate. This was confirmed by measuring. As a result of the virus titer measurement, the virus titer of rRC-HL in the culture supernatant of NA cells at 2 dpi and 4 dpi was 1.1 × 10 6 FFU / ml and 1.5 × 10 8 FFU / ml, respectively. ml. On the other hand, the virus titer of RC-HLΔM in the supernatant from cells infected with RC-HLΔM was below the detection limit at both 2 dpi and 4 dpi (<1.0 × 10 1 FFU / ml). Was again confirmed to have no replication ability.
（５）RC-HLΔMの特徴解析（ウエスタン・ブロット法）
一方、RC-HLΔMがNタンパク質またはMタンパク質を産生するか否かについては、抗Nタンパク質モノクローナル抗体N-MAb 8-1あるいは抗Mタンパク質モノクローナル抗体53-D-3-3を用いた一般的なウエスタン・ブロット法で調べた。すなわち、RC-HLΔMを感染させたNA細胞から調製した細胞全タンパク質を一般的なウエスタン・ブロット法で解析することにより、RC-HLΔM感染細胞においてNタンパク質およびMタンパク質が産生されているか否かを調べた。
(5) Characteristic analysis of RC-HLΔM (Western blot method)
On the other hand, whether RC-HLΔM produces N protein or M protein is generally determined using anti-N protein monoclonal antibody N-MAb 8-1 or anti-M protein monoclonal antibody 53-D-3-3. Investigated by Western blot. That is, by analyzing the total cellular protein prepared from NA cells infected with RC-HLΔM using a general Western blot method, it is determined whether or not N protein and M protein are produced in RC-HLΔM infected cells. Examined.
本発明において、このような方法の実験を実施した結果を図2Cに示す。レーン1から3まではNタンパク質を検出するために抗Nタンパク質モノクローナル抗体（N-MAb）を用いた場合を表し、レーン4から6まではMタンパク質を検出するために抗Mタンパク質モノクローナル抗体（M-MAb）を用いた場合を表している。抗原としては、RC-HLΔM感染NA細胞溶解物（レーン1および4）、rRC-HL感染NA細胞溶解物（レーン2および5）、Mock感染（ウイルス感染なし）NA細胞溶解物（レーン3および6）を用いた。
FIG. 2C shows the result of conducting an experiment of such a method in the present invention.
このウエスタン・ブロット法により、Nタンパク質が、rRC-HL感染細胞においてと同様に、RC-HLΔM感染細胞においても発現していることが示された（図2C、レーン1および2）。また、RC-HLΔM感染細胞においては、Gタンパク質の発現も検出された。しかしながら、RC-HLΔM感染細胞においては、rRC-HL感染細胞においてMタンパク質が発現しているのとは異なり（図2C、レーン5）、Mタンパク質コード遺伝子の欠如のためにMタンパク質は発現していなかった（図2C、レーン4）。以上の結果から、RC-HLΔMは、それを感染させた細胞において、少なくともNタンパク質を産生しているが、Mタンパク質を産生していないことが示された。
This Western blotting showed that N protein was expressed in RC-HLΔM-infected cells as well as in rRC-HL-infected cells (FIG. 2C,
（６）Mタンパク質発現細胞におけるRC-HLΔMの増殖性の検討
上述のGeneSwitch（商標）システムを用い、ミフェプリストンの添加によりMタンパク質の発現が制御可能な、RC-HL株由来Mタンパク質を持続的に発現するBHK細胞系を構築した。
(6) Examination of RC-HLΔM growth in M protein-expressing cells Using the above-mentioned GeneSwitch ™ system, sustained M-protein derived from RC-HL strain that can control M protein expression by adding mifepristone A BHK cell line that expresses naturally was constructed.
GeneSwitch（商標）システムを用いて作出・クローニングした細胞の中から最も大量にRC-HLΔMを産生する細胞の選択するために、ミフェプリストン（10nM）存在下で、各細胞クローンにRC-HLΔMを感染させ、3日間培養してウイルスを増殖させた後に、上述のNタンパク質モノクローナル抗体N-MAb 8-1を用いたIFAを実施し、螢光顕微鏡観察下で、最も多くのウイルス・フォーカスを形成する細胞クローンを選別した。このような方法を実施して得られた、Mタンパク質の発現を人為的に制御できる狂犬病ウイルス高産生性細胞クローンをBHK/RM-23細胞と名付けた。 Select RC-HLΔM for each cell clone in the presence of mifepristone (10 nM) in order to select the cells that produce the largest amount of RC-HLΔM from cells created and cloned using the GeneSwitch ™ system. After infecting and culturing for 3 days to propagate the virus, IFA using the above-mentioned N protein monoclonal antibody N-MAb 8-1 was performed, and the most virus focus was formed under fluorescent microscope observation Cell clones were selected. A rabies virus high-producing cell clone obtained by carrying out such a method and capable of artificially controlling the expression of M protein was named BHK / RM-23 cells.
一般的なウエスタン・ブロット法およびIFAにより、BHK/RM-23細胞におけるミフェプリストン添加によるMタンパク質の発現誘導を確認した。 M protein expression induction by adding mifepristone in BHK / RM-23 cells was confirmed by general Western blotting and IFA.
10 nMのミフェプリストン存在下および非存在下で培養したBHK/RM-23細胞について、抗Mタンパク質モノクローナル抗体を用いたウエスタン・ブロット法を行ったところ、ミフェプリストンを含有しない培地でBHK/RM-23細胞を培養した場合には、細胞におけるMタンパク質は検出されなかった（図3A、レーン1）。これとは対照的に、10 nMのミフェプリストンを含有する培地において培養した細胞では、発現したMタンパク質が検出された（図3A、レーン2）。なお、本実験には、rRC-HLを感染させたBHK細胞溶解物を陽性対照として用いた（図3A、レーン3）。 BHK / RM-23 cells cultured in the presence and absence of 10 nM mifepristone were subjected to Western blotting using anti-M protein monoclonal antibody. When RM-23 cells were cultured, M protein in the cells was not detected (FIG. 3A, lane 1). In contrast, expressed M protein was detected in cells cultured in media containing 10 nM mifepristone (FIG. 3A, lane 2). In this experiment, BHK cell lysate infected with rRC-HL was used as a positive control (FIG. 3A, lane 3).
一方、IFAを行った結果、ミフェプリストン非存在下でMタンパク質の発現が誘導されなかった場合には、RC-HLΔMの複製ウイルスは検出されなかった（図3B、左）。これとは対照的に、ミフェプリストン存在下でMタンパク質の発現が誘導された場合には、RC-HLΔM感染BHK/RM-23細胞は大きなフォーカスとして観察された（図3B、右）。 On the other hand, as a result of IFA, when M protein expression was not induced in the absence of mifepristone, no RC-HLΔM replicating virus was detected (FIG. 3B, left). In contrast, when M protein expression was induced in the presence of mifepristone, RC-HLΔM infected BHK / RM-23 cells were observed as a major focus (FIG. 3B, right).
以上の結果より、ミフェプリストンの添加により、BHK/RM-23細胞からの効率的なMタンパク質発現が誘導されることが確認された。 From the above results, it was confirmed that the addition of mifepristone induces efficient M protein expression from BHK / RM-23 cells.
BHK/RM-23細胞におけるRC-HLΔMの増殖を確認するために、RC-HLΔMをM.O.I. 0.01で細胞に接種した。培養上清中のウイルスは、3、5、7、9および11 dpiにおいて回収し、BHK細胞にて力価を測定した。その結果、培養液中の複製ウイルスの力価は、3 dpiにおいて8.6×102 FFU/mlであった。また、このウイルス力価は次第に増加し、11 dpiにおいては6.1×105 FFU/mlに達した（図3C）。 To confirm the growth of RC-HLΔM in BHK / RM-23 cells, the cells were inoculated with RC-HLΔM at MOI 0.01. Virus in the culture supernatant was collected at 3, 5, 7, 9 and 11 dpi, and titer was measured on BHK cells. As a result, the titer of the replicating virus in the culture was 8.6 × 10 2 FFU / ml at 3 dpi. The virus titer gradually increased and reached 6.1 × 10 5 FFU / ml at 11 dpi (FIG. 3C).
（７）RC-HLΔMの病原性の検討
RC-HLΔMの病原性が十分に低減されているかどうかを調べるために、RC-HLΔMおよびrRC-HＬを成体BALB/cマウス（メス、６週齢）（Nihon SLC社製、日本）および哺乳BALB/cマウス（２日齢）（Nihon SLC社製、日本）の大脳内に接種した。具体的には、１群4匹のBALB/cマウスに、10倍階段希釈したRC-HLΔMまたはrRC-HLのウイルス液を大脳内接種し、成体マウスについてはウイルス接種後の体重変化を、また、哺乳マウスについては各ウイルス接種群の50%致死量（LD50）を指標として、それぞれのウイルスの病原性を比較した。
(7) Examination of the pathogenicity of RC-HLΔM
In order to examine whether the pathogenicity of RC-HLΔM has been sufficiently reduced, RC-HLΔM and rRC-HL were treated with adult BALB / c mice (female, 6 weeks old) (Nihon SLC, Japan) and suckling BALB. / c mice (2 days old) (Nihon SLC, Japan) were inoculated into the cerebrum. Specifically, 4 BALB / c mice per group were inoculated intracerebrally with RC-HLΔM or rRC-HL virus diluted 10-fold in a stepwise fashion. In the case of suckling mice, the pathogenicity of each virus was compared using the 50% lethal dose (LD 50 ) of each virus-inoculated group as an index.
RC-HLΔMの病原性を判断する指標の１つとして選択した、成体マウスにおけるウイルス接種後の体重変化については、Mock接種（ウイルス接種なし）マウスを対照として用いて調べた。1群4匹の成体マウスを用いてウイルス接種後の体重を経時的に測定し、平均値±標準偏差をグラフに示した（図4A）。この結果、1.0×105 FFUのrRC-HLを接種した成体マウスの体重は一過性に減少したが、これとは対照的に、1.0×105 FFUのRC-HLΔMを接種したマウスの体重は、Mock感染マウスの体重と同様に増加し続け、マウスは狂犬病の臨床兆候を全く示さなかった（図4A）。また、一方では、臨床症状を示さなかったRC-HLΔM接種マウスの血清で抗狂犬病ウイルス抗体が検出されたことから（後述）、これらのマウスが確かにRC-HLΔMに感染したことが実証された。 The change in body weight after virus inoculation in adult mice, which was selected as one of the indicators for determining the pathogenicity of RC-HLΔM, was examined using Mock-inoculated (no virus inoculation) mice as controls. Body weight after virus inoculation was measured over time using 4 adult mice per group, and the average value ± standard deviation was shown in the graph (FIG. 4A). As a result, the body weight of adult mice inoculated with 1.0 × 10 5 FFU of rRC-HL was transiently decreased, but in contrast, the body weight of mice inoculated with 1.0 × 10 5 FFU of RC-HLΔM Continued to increase, similar to the weight of Mock infected mice, and the mice showed no clinical signs of rabies (FIG. 4A). On the other hand, anti-rabies virus antibodies were detected in the serum of RC-HLΔM-inoculated mice that showed no clinical symptoms (described later), demonstrating that these mice were indeed infected with RC-HLΔM. .
RC-HLΔMの病原性を判断する別の指標として、哺乳マウス（２日齢）に対するRC-HLΔMの致死性について調べた。それぞれ0.1、1、10または10000 FFU のRC-HLΔMおよびrRC-HＬを哺乳マウスの大脳内に接種し、接種後の生残率を測定した。その結果、rRC-HＬは哺乳マウスに対して致死性の感染を引き起こした（LD50=1 FFU）が、RC-HLΔMは、10000 FFUの大脳内接種後においてでさえ、哺乳マウスを死亡させなかった（図4B）。なお、図中ntは、10000 FFU のrRC-HＬについて測定を行わなかったことを示す。 As another index for determining the pathogenicity of RC-HLΔM, lethality of RC-HLΔM to suckling mice (2 days old) was examined. 0.1, 1, 10 or 10000 FFU of RC-HLΔM and rRC-HL, respectively, were inoculated into the cerebrum of suckling mice, and the survival rate after inoculation was measured. As a result, rRC-HL caused lethal infection in suckling mice (LD 50 = 1 FFU), but RC-HLΔM did not kill sucking mice even after intracerebral inoculation of 10,000 FFU. (Fig. 4B). In the figure, nt indicates that measurement was not performed for 10000 FFU of rRC-HL.
以上の結果から、RC-HLΔMが成体マウスおよび哺乳マウスに対して非病原性であることが実証された。また、これらの結果と狂犬病ウイルスがマウスやイヌなど対して広い動物宿主域を示すウイルスであることを考えあわせると、RC-HLΔMがイヌに対しても病原性を示さない非病原性のウイルスであることを強く示唆する。 From the above results, it was demonstrated that RC-HLΔM is non-pathogenic to adult mice and suckling mice. In addition, considering these results and that rabies virus is a virus that exhibits a broad animal host range for mice and dogs, RC-HLΔM is a non-pathogenic virus that is not pathogenic to dogs. I strongly suggest that there is.
（８）RC-HLΔMの免疫原性の検討（注射接種）
不活化していないRC-HLΔMの免疫原性と不活化した親ウイルスRC-HL株の免疫原性を比較するために、1.0×105 FFUのRC-HLΔMまたは同量のUV不活化RC-HL株を成体BALB/cマウス（メス、６週齢）に筋肉内接種（i.m.）した。2週間後血清を回収し、狂犬病ウイルスに対するウイルス中和抗体（VNA）力価を以下のようにして測定した。
(8) Examination of immunogenicity of RC-HLΔM (injection)
To compare the immunogenicity of uninactivated RC-HLΔM with the immunogenicity of the inactivated parental virus RC-HL strain, 1.0 × 10 5 FFU of RC-HLΔM or the same amount of UV-inactivated RC- The HL strain was inoculated intramuscularly (im) into adult BALB / c mice (female, 6 weeks old). Two weeks later, serum was collected and the virus neutralizing antibody (VNA) titer against rabies virus was measured as follows.
すなわち、ウイルス接種マウスから調製した血清を2倍階段希釈し、56℃で30分間インキュベーションした後、その25μｌを等容量の200 TCID50のrRC-HLと混合し、さらに37℃で1時間インキュベーションした。その後、ウイルスと血清の混合液を、96ウェル組織培養マイクロタイタープレートの各ウェル中で100μｌのBHK細胞懸濁液（3×105/ml）と混合した。37℃で5日間インキュベーションした後、細胞変性効果を顕微鏡観察し、50%以上のウェルにおいて細胞変性効果を阻害する血清の最も高い希釈倍数の逆数として、血中ウイルス中和抗体価を算出した。 That is, serum prepared from a virus-inoculated mouse was serially diluted 2-fold and incubated at 56 ° C. for 30 minutes, then 25 μl was mixed with an equal volume of 200 TCID 50 rRC-HL and further incubated at 37 ° C. for 1 hour. . The virus and serum mixture was then mixed with 100 μl of BHK cell suspension (3 × 10 5 / ml) in each well of a 96 well tissue culture microtiter plate. After incubation at 37 ° C. for 5 days, cytopathic effect was observed with a microscope, and the virus neutralizing antibody titer in blood was calculated as the reciprocal of the highest dilution of serum that inhibits cytopathic effect in 50% or more of the wells.
図5Aには、測定値（抗体価）の幾何平均および標準偏差を示している。図5Aから明らかなように、UV不活化RC-HLは有効なVNA力価を誘導することができなかったが（VNA力価：<8）、これとは対照的に、RC-HLΔMは、ウイルス接種マウスに16から32倍の力価の血中VNA（幾何平均：22.6）を誘導した（図5A）。 FIG. 5A shows the geometric mean and standard deviation of measured values (antibody titers). As evident from FIG. 5A, UV-inactivated RC-HL was unable to induce an effective VNA titer (VNA titer: <8), in contrast to RC-HLΔM, Virus-inoculated mice were induced with blood VNA (geometric mean: 22.6) with a titer 16 to 32 times (Figure 5A).
また、RC-HLΔMを筋肉内接種したマウスの血中抗ウイルス抗体価を、IFAによって求めた。具体的には、2倍階段希釈したウイルス接種マウスの血清をNA細胞に感染させ、上記同様のIFAを行い、NA細胞が螢光標識された時の最大血清希釈倍数の逆数をIFA力価として算出した。その結果、RC-HLΔM接種マウスの血中IFA力価は、rRC-HLを筋肉内接種した場合に比べてわずかに低いものの、UV不活化RC-HLを筋肉内接種した場合よりも明らかに高い値を示した（図5B、左）。なお、図5Bには、得られたIFA力価（抗狂犬病ウイルス力価）の幾何平均および標準偏差を示し、図中のアスタリスク（＊）は、4匹のマウスのうち3匹のみが血清反応陽性（sero-positive）であったことを示している。 In addition, the antiviral antibody titer in the blood of mice inoculated intramuscularly with RC-HLΔM was determined by IFA. Specifically, the sera of virus-inoculated mice that were serially diluted two-fold were infected with NA cells, and IFA was performed in the same manner as described above. Calculated. As a result, the blood IFA titer of RC-HLΔM-inoculated mice was slightly lower than that obtained when intramuscularly inoculated with rRC-HL, but clearly higher than that obtained when intramuscularly inactivated with UV-inactivated RC-HL. Values are shown (Figure 5B, left). FIG. 5B shows the geometric mean and standard deviation of the obtained IFA titer (anti-rabies virus titer), and the asterisk (*) in the figure indicates that only 3 of 4 mice have a serum reaction. It shows that it was positive (sero-positive).
以上の結果、RC-HLΔMは、成体マウスに接種した場合、不活化ウイルスに比べて明らかに高い抗原性を示すことが明らかになった。 As a result of the above, it was revealed that RC-HLΔM is clearly higher in antigenicity than inactivated virus when inoculated into adult mice.
（９）RC-HLΔMの免疫原性の検討（経鼻接種）
RC-HLΔMが経鼻接種ワクチンとして有効であるかどうかを調べるために、1.0×105 FFUのRC-HLΔM、rRC-HL、またはUV不活化RC-HL（UV RC-HL）のそれぞれを、成体BALB/cマウス（メス、６週齢）に経鼻接種（i.n.）した。接種後14日目にマウスから血清を調製し、狂犬病ウイルスに対する血中抗体価を上記同様にIFA力価として求めた。その結果、RC-HLΔMを経鼻接種したマウスの血中IFA力価の幾何平均（538倍）は、rRC-HLを接種した場合（761倍）に比べてやや低い値であったが、RC-HLΔMが経鼻接種により抗狂犬病ウイルス抗体を効果的に誘導することが示された（図5B、右）。また、このようにRC-HLΔMの経鼻接種で誘導された抗狂犬病ウイルス抗体の力価は、このウイルスを筋肉内接種した場合に誘導された抗狂犬病ウイルス抗体の力価（IFA力価：113倍）より高かった（図5B、右）。一方、RC-HLΔMとは対照的に、UV不活化RC-HLを経鼻接種（i.n.）した場合には、抗狂犬病ウイルス抗体を誘導することはなかった（IFA力価<20）。なお、RC-HLΔMを経鼻接種したマウスの体重は減少しなかったが、rRC-HLを経鼻接種したマウスの体重は大脳内接種マウスの体重と同様に一過性に減少した（図4A参照）。以上の結果、本発明のRC-HLΔMが安全な経鼻接種ワクチンとして有効・有用であることが示された。
(9) Examination of immunogenicity of RC-HLΔM (nasal inoculation)
To examine whether RC-HLΔM is effective as a nasal vaccine, each of 1.0 × 10 5 FFU of RC-HLΔM, rRC-HL, or UV-inactivated RC-HL (UV RC-HL), Adult BALB / c mice (female, 6 weeks old) were nasally inoculated (in). On the 14th day after inoculation, serum was prepared from the mice, and the antibody titer in the blood against the rabies virus was determined as the IFA titer as described above. As a result, the geometric mean (538 times) of IFA titer in blood of mice nasally inoculated with RC-HLΔM was slightly lower than that with rRC-HL (761 times). -HLΔM was shown to effectively induce anti-rabies virus antibodies by nasal inoculation (Figure 5B, right). In addition, the titer of anti-rabies virus antibody induced by nasal inoculation of RC-HLΔM in this way is the titer of anti-rabies virus antibody induced by intramuscular inoculation of this virus (IFA titer: 113 (Figure 5B, right). On the other hand, in contrast to RC-HLΔM, anti-rabies virus antibody was not induced when nasally inoculated with UV-inactivated RC-HL (IFA titer <20). The body weight of mice nasally inoculated with RC-HLΔM did not decrease, but the weight of mice nasally inoculated with rRC-HL decreased transiently in the same manner as that of mice inoculated with cerebrum (FIG. 4A). reference). As a result, it was shown that RC-HLΔM of the present invention is effective and useful as a safe nasal vaccine.
Claims (4)
The vaccine according to claim 3, wherein the vaccine is for injection, oral and nasal vaccination.
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| JP2013106608A (en) * | 2011-10-25 | 2013-06-06 | Gifu Univ | Method for synthesis and proliferation of mutant rabies virus and rabies vaccine preparation |
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| JPH08168381A (en) * | 1994-07-18 | 1996-07-02 | Akzo Nobel Nv | Infectious non-segmented recombinant negative chain rna virus |
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2004
- 2004-10-27 JP JP2004312760A patent/JP2006121948A/en active Pending
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