JP2006094733A - Cancer detection method - Google Patents
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Abstract
【課題】 胃癌及び口腔扁平上皮癌において精度の高い検出方法を提供する。
【解決手段】 ヒト被験者由来細胞染色体の特定の領域におけるDNAコピー数の増加及び／または減少を検出することを特徴とする、in vitroにおける胃癌及び口腔扁平上皮癌の検出方法。
【選択図】 なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a highly accurate detection method for gastric cancer and oral squamous cell carcinoma.
A method for detecting gastric cancer and oral squamous cell carcinoma in vitro, comprising detecting an increase and / or decrease in DNA copy number in a specific region of a cell chromosome derived from a human subject.
[Selection figure] None
Description
本発明は、胃癌及び／または口腔扁平上皮癌の検出方法に関し、特に被験者由来の細胞の染色体における特定の領域のコピー数の変化を検出することを特徴とする該方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting gastric cancer and / or oral squamous cell carcinoma, and more particularly, to a method for detecting a copy number change in a specific region in a chromosome of a cell derived from a subject.
社会の高齢化が着実に進行しつつある中で、死亡原因第１位の疾病である癌においては、的確な診断技術並びに優れた医療技術の開発が急務となっている。 With the aging of society steadily progressing, the development of accurate diagnostic techniques and excellent medical techniques is urgently needed for cancer, which is the leading cause of death.
胃癌及び／または口腔扁平上皮癌に関しては、腫瘍の疑いのある被験者について、組織形態学に基づいた病理検査を行っている。病理検査では、癌組織の切片標本を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色や、各種免疫染色法等を用いて顕微鏡で観察する。そして、細胞や核の形態、染色の濃淡等に基づいて、癌か良性腫瘍か否か、あるいは進行度などを評価している。 Regarding gastric cancer and / or oral squamous cell carcinoma, a pathological examination based on histomorphology is performed on a subject suspected of having a tumor. In the pathological examination, a specimen of cancer tissue is prepared and observed with a microscope using hematoxylin / eosin staining, various immunostaining methods, and the like. Then, based on the morphology of cells and nuclei, the intensity of staining, etc., whether or not it is a cancer or a benign tumor, or the degree of progression is evaluated.
近年の医学・生物学研究の進歩によって、癌の発生・進展のメカニズムが分子レベルで解明されつつある。それに伴って、癌は様々な要因によってゲノムDNAレベルで不可逆的な異常を生じ、その異常が複数積み重なって悪性形質を発現していることが明らかとなってきた。これは、個々の癌で生じているゲノム異常を全染色体にわたって詳細に解析することが可能となれば、癌の多様な悪性形質、いわば癌の個性を的確に把握しうる、ゲノム情報に基づいた客観的指標が得られることを期待させるものである。 Recent advances in medical and biological research are elucidating the mechanism of cancer development and progression at the molecular level. Along with this, it has been clarified that cancers cause irreversible abnormalities at the genomic DNA level due to various factors, and a plurality of such abnormalities are accumulated to express malignant traits. This is based on genome information that can accurately understand various malignant traits of cancer, in other words, individuality of cancer, if it is possible to analyze in detail the genomic abnormalities occurring in individual cancers across all chromosomes. It is expected to obtain an objective index.
近年、Kallioniemi-A らによって染色体CGH法（conparative genomic hybridization法、比較ゲノムハイブリダイゼーション法）が開発された（非特許文献１参照）。染色体CGH法は癌細胞のゲノム増幅・欠失異常領域を一度の実験操作で、また特異的DNAプローブやPCR（polymerase chain reaction）プライマーを必要とすることなく、全染色体にわたってスクリーニングすることが可能な方法である。また最近になって、アレイCGH法という優れた染色体異常解析技術が開発された。これはスライドガラス上にヒトゲノムDNA断片（BACクローン）を高密度にスポットしたゲノムDNAアレイ（BACアレイ）を作製し、このアレイに対して蛍光標識した癌細胞DNAと正常DNAを競合ハイブリダイズさせ、スポット毎の蛍光シグナルを解析することで、癌細胞で生じている染色体コピー数の増加・欠失領域を同定するものである。 Recently, Kallioniemi-A et al. Developed a chromosomal CGH method (comparative genomic hybridization, comparative genomic hybridization) (see Non-Patent Document 1). Chromosome CGH method enables screening of all abnormal chromosome amplification / deletion regions in cancer cells in a single experiment, and without the need for specific DNA probes or PCR (polymerase chain reaction) primers. Is the method. Recently, an excellent chromosomal aberration analysis technique called the array CGH method has been developed. This creates a genomic DNA array (BAC array) in which human genomic DNA fragments (BAC clones) are spotted at high density on a slide glass, and competitively hybridizes fluorescently labeled cancer cell DNA and normal DNA to this array, By analyzing the fluorescent signal for each spot, an increase / deletion region of the chromosomal copy number occurring in the cancer cell is identified.
組織形態学に基づいた病理検査は病理医の経験に大きく依存した主観的方法である。更に、タンパク質の発現の検出や、mRNAの発現を検出するcDNAアレイを用いた検出では、患者の体調やサンプル採取の時間帯等によって変動が大きく、一定した結果が得られないことが多かった。 Histopathology based on histomorphology is a subjective method that relies heavily on pathologist experience. Furthermore, detection of protein expression or detection using a cDNA array that detects mRNA expression has a large variation depending on the patient's physical condition, time zone of sample collection, etc., and a constant result is often not obtained.
これまでの種々の研究によれば、癌の種類、すなわち発生臓器、組織、細胞の違いによってゲノム異常のパターンは異なるうえ、逆にある種の異常を有していたとしても、それが癌化の原因となるか否かは往々にして臓器、組織、細胞によって異なることも明らかとなっている。したがって、癌の種類ごとに多症例かつ詳細な分子レベルの解析、そして各検体のゲノム異常とその臨床情報との関連解析が必要である。 According to various studies so far, the pattern of genomic abnormalities differs depending on the type of cancer, that is, the organs, tissues, and cells of the cancer, and conversely, even if there are certain abnormalities, they are cancerous. It has also become clear that whether or not it causes this often varies with organs, tissues, and cells. Therefore, it is necessary to analyze many cases and detailed molecular level for each type of cancer, and to analyze the relationship between the genomic abnormality of each specimen and its clinical information.
本発明者等は、胃癌及び口腔扁平上皮癌に特徴的なゲノム上のコピー数異常領域を見出し、それらの領域における異常の有無を検出することによる癌の診断方法の確立を検討し、染色体CGH法に比べて精度・異常検出解像度が大きく向上し、染色体CGH法では検出が困難であった微細領域に生じる異常をも検出することが可能なアレイCGH法を用いて解析を行った。アレイCGH法は、癌細胞で生じるゲノムコピー数異常領域を、ゲノム全体にわたって、簡便かつ詳細に解析しうる。 The present inventors have found a copy number abnormality region on the genome that is characteristic of gastric cancer and oral squamous cell carcinoma, and examined the establishment of a method for diagnosing cancer by detecting the presence or absence of abnormality in those regions. The analysis was performed using the array CGH method, which greatly improved the accuracy and resolution of abnormality detection, and was able to detect abnormalities in fine regions that were difficult to detect with the chromosomal CGH method. The array CGH method can easily and in detail analyze the genome copy number abnormal region generated in cancer cells over the entire genome.
本発明者等は、アレイCGH法により、ゲノムDNAを用い、多数の癌臨床摘出検体について全染色体にわたる異常領域解析を行った。具体的には、ヒトゲノムのBACライブラリーにより構成されたDNAマイクロアレイを用いて胃癌及び口腔扁平上皮癌患者から得られたサンプル及び正常サンプルを比較し、各染色体における増幅・欠失等の変化を解析し、正常サンプルと比較して癌患者由来サンプルで統計的に有意なゲノム異常領域を見いだすことに成功し、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention performed an abnormal region analysis over all the chromosomes of a large number of cancer clinically isolated specimens using genomic DNA by the array CGH method. Specifically, samples obtained from patients with gastric cancer and oral squamous cell carcinoma were compared with normal samples using a DNA microarray constructed from the BAC library of the human genome, and changes such as amplification and deletion in each chromosome were analyzed. As a result, the present inventors have succeeded in finding a statistically significant genomic abnormality region in a cancer patient-derived sample as compared with a normal sample, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）ヒト被験者由来の細胞の染色体における、7p15-21、8q21-23、13q22、20p12、及び20q13領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の増加、及び／または1p32-ter、17p12-13、19p13.3、及び22q23領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の減少を検出することを特徴とする、in vitroにおける胃癌の検出方法。
That is, the present invention provides the following (1) to (11).
(1) Increase in DNA copy number in at least a part of one or more regions selected from 7p15-21, 8q21-23, 13q22, 20p12, and 20q13 regions in the chromosome of cells derived from human subjects, and / or 1p32 A method for detecting gastric cancer in vitro, comprising detecting a decrease in DNA copy number in at least a part of one or more regions selected from the -ter, 17p12-13, 19p13.3, and 22q23 regions.
（２）PCK1、TREM1、TBRG4、VSX1、OTOR、CDS2、PCDH8、SOCS-1、TG、PTPN1、MOZ、NOV、WISP1、TOP1、BCR、及びEXT1遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅及び／またはLIS1、DSCR1、KIAA0179、TTY1、RAB1、FHIT、RGS、KDR、DCC、ETS2/E2、GSTT1、SPON2、WHSC1、TXK、NPM1、APC、MLF2、FGF7、MATK、ADMTS1、DSCR6、及びBCK10遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の欠失を検出する、上記（１）記載の検出方法。 (2) Amplification and / or amplification of one or more genes selected from PCK1, TREM1, TBRG4, VSX1, OTOR, CDS2, PCDH8, SOCS-1, TG, PTPN1, MOZ, NOV, WISP1, TOP1, BCR, and EXT1 genes Or selected from LIS1, DSCR1, KIAA0179, TTY1, RAB1, FHIT, RGS, KDR, DCC, ETS2 / E2, GSTT1, SPON2, WHSC1, TXK, NPM1, APC, MLF2, FGF7, MATK, ADMTS1, DSCR6, and BCK10 genes The detection method according to (1) above, wherein a deletion of one or more genes is detected.
（３）ヒト被験者由来の細胞の染色体における、5p13.1-p12、11q13.3、20q11.2、5p13、8q24.2-q24.3、9q34.1、5p13.2、8q24.11-q24.13、8q24.1-q24.3、9q34.1、9q34.3、20q12-q13.1、20q13.1-q13.2、9q34、11q13、11q13.3、20p12.1-p11.23、22q11.21、5q31.1、5q31-32、8q24.3、9qq34、11p15.5-p15.4、11p12-p11、11p11.2、11q13.1、及び11q13.5-q14領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の増加、及び／または18q21、18q21.1、7q33-q35、18q21.3、3p26-p24、4q12-13、4q21、4q25-q27、18q21.3、21q22.1、2q34-q35、3q24、3p14.2、4q11-q12、4q21-q25、7q36、18q21.1、21q21.2、8p11.2-p11.1、1q25、3p25、3p21-p14、4p16.3、4p12、4q26-q27、8q22、10p12、10p11.2、13q22、15q15-q21.1、及び16q12.1領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の減少を検出することを特徴とする、in vitroにおける口腔扁平上皮癌の検出方法。 (3) 5p13.1-p12, 11q13.3, 20q11.2, 5p13, 8q24.2-q24.3, 9q34.1, 5p13.2, 8q24.11-q24. 13, 8q24.1-q24.3, 9q34.1, 9q34.3, 20q12-q13.1, 20q13.1-q13.2, 9q34, 11q13, 11q13.3, 20p12.1-p11.23, 22q11. One or more selected from 21, 5q31.1, 5q31-32, 8q24.3, 9qq34, 11p15.5-p15.4, 11p12-p11, 11p11.2, 11q13.1, and 11q13.5-q14 regions Increased DNA copy number in at least part of the region and / or 18q21, 18q21.1, 7q33-q35, 18q21.3, 3p26-p24, 4q12-13, 4q21, 4q25-q27, 18q21.3, 21q22.1 , 2q34-q35, 3q24, 3p14.2, 4q11-q12, 4q21-q25, 7q36, 18q21.1, 21q21.2, 8p11.2-p11.1, 1q25, 3p25, 3p21-p14, 4p16.3, 4p12 Detecting a decrease in DNA copy number in at least a portion of one or more regions selected from 4q26-q27, 8q22, 10p12, 10p11.2, 13q22, 15q15-q21.1, and 16q12.1 regions To detect oral squamous cell carcinoma in vitro Law.
（４）GDNF、FGF4、DNMT3B、SKP2、DAB2、TG、VAV2、RAD1、EXT1、WISP1、ABL1、NPDC1、TOP1、PTPN1、PAEP、CST6、CCND1、JAG1、PNUTL1、CSF2、PDGFRB、NDRG1、RPL7A、ILK、EXT2、KAI1、BAD、RIN1、GARP遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅及び／またはMBD1、MBD2、POLI、TIM1、DCC、FVT1、BCL2、LMCD1、IGFBP7、FGF5、PITX、SERPINB3、TIAM1、BARD1、RARB、FHIT、KDR、IBSP、SHH、SMAD4、ADAMTS1、FGFR1、TPR、PPARG、Wnt-5a、SPON2、PTTG2、IL2、CTSB、MLLT10、ITGB1、DACH、FGF7、PLK遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の欠失を検出する、上記（３）記載の検出方法。 (4) GDNF, FGF4, DNMT3B, SKP2, DAB2, TG, VAV2, RAD1, EXT1, WISP1, ABL1, NPDC1, TOP1, PTPN1, PAEP, CST6, CCND1, JAG1, PNUTL1, CSF2, PDGFRB, NDRG1, RPL7A, ILK Amplification of one or more genes selected from EXT2, KAI1, BAD, RIN1, and GARP genes and / or MBD1, MBD2, POLI, TIM1, DCC, FVT1, BCL2, LMCD1, IGFBP7, FGF5, PITX, SERPINB3, TIAM1, One or more selected from BARD1, RARB, FHIT, KDR, IBSP, SHH, SMAD4, ADAMTS1, FGFR1, TPR, PPARG, Wnt-5a, SPON2, PTTG2, IL2, CTSB, MLLT10, ITGB1, DACH, FGF7, and PLK genes The detection method according to (3), wherein the deletion of the gene is detected.
（５）DNAコピー数の増加及び／または欠失を、BAC（Bacterial Artificial chromosome）クローンとのハイブリダイゼーション、FISH法、LOH法、定量PCR法、またはサザンブロット法によって検出する、上記（１）〜（４）のいずれか記載の方法。 (5) The increase and / or deletion of DNA copy number is detected by hybridization with a BAC (Bacterial Artificial chromosome) clone, FISH method, LOH method, quantitative PCR method, or Southern blot method, (1) to The method according to any one of (4).
（６）DNAコピー数の増加及び／または欠失を、BACアレイとのハイブリダイゼーションによって検出する、上記（５）記載の方法。
（７）試験サンプル中のDNAを標識する、上記（６）記載の方法。
(6) The method according to (5) above, wherein the increase and / or deletion of the DNA copy number is detected by hybridization with a BAC array.
(7) The method according to (6) above, wherein the DNA in the test sample is labeled.
（８）ヒト染色体7p15-21、8q21-23、13q22、20p12、20q13、1p32-ter、17p12-13、19p13.3、及び22q23領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブを含む、胃癌の検出のためのキット。 (8) At least a part of the nucleotide sequence of one or more regions selected from human chromosomes 7p15-21, 8q21-23, 13q22, 20p12, 20q13, 1p32-ter, 17p12-13, 19p13.3, and 22q23 A kit for the detection of gastric cancer, comprising one or more probes having complementary base sequences.
（９）ヒト染色体5p13.1-p12、11q13.3、20q11.2、5p13、8q24.2-q24.3、9q34.1、5p13.2、8q24.11-q24.13、8q24.1-q24.3、9q34.1、9q34.3、20q12-q13.1、20q13.1-q13.2、9q34、11q13、11q13.3、20p12.1-p11.23、22q11.21、5q31.1、5q31-32、8q24.3、9qq34、11p15.5-p15.4、11p12-p11、11p11.2、11q13.1、11q13.5-q14、18q21、18q21.1、7q33-q35、18q21.3、3p26-p24、4q12-13、4q21、4q25-q27、18q21.3、21q22.1、2q34-q35、3q24、3p14.2、4q11-q12、4q21-q25、7q36、18q21.1、21q21.2、8p11.2-p11.1、1q25、3p25、3p21-p14、4p16.3、4p12、4q26-q27、8q22、10p12、10p11.2、13q22、15q15-q21.1、及び16q12.1領域から選ばれる１以上の染色体領域の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブを含む、口腔扁平上皮癌の検出のためのキット。 (9) Human chromosome 5p13.1-p12, 11q13.3, 20q11.2, 5p13, 8q24.2-q24.3, 9q34.1, 5p13.2, 8q24.11-q24.13, 8q24.1-q24 .3, 9q34.1, 9q34.3, 20q12-q13.1, 20q13.1-q13.2, 9q34, 11q13, 11q13.3, 20p12.1-p11.23, 22q11.21, 5q31.1, 5q31 -32, 8q24.3, 9qq34, 11p15.5-p15.4, 11p12-p11, 11p11.2, 11q13.1, 11q13.5-q14, 18q21, 18q21.1, 7q33-q35, 18q21.3, 3p26 -p24, 4q12-13, 4q21, 4q25-q27, 18q21.3, 21q22.1, 2q34-q35, 3q24, 3p14.2, 4q11-q12, 4q21-q25, 7q36, 18q21.1, 21q21.2, 8p11 .2-p11.1, 1q25, 3p25, 3p21-p14, 4p16.3, 4p12, 4q26-q27, 8q22, 10p12, 10p11.2, 13q22, 15q15-q21.1, and 1 selected from 16q12.1 region A kit for detecting oral squamous cell carcinoma comprising one or more probes having a base sequence complementary to at least a part of the base sequence of the chromosomal region.
（１０）上記１種以上のプローブが支持体上に固定されたものである、上記（８）または（９）記載のキット。
（１１）更に標識剤を含む、上記（８）〜（１０）のいずれか記載のキット。
(10) The kit according to (8) or (9) above, wherein the one or more probes are fixed on a support.
(11) The kit according to any one of (8) to (10), further comprising a labeling agent.
本発明によって、従来行われていた病理学的検査に比べ、より客観的な情報を提供することが可能であり、癌の的確な診断に大きく寄与するものと考えられる。本発明を用い、従来法に比べてより的確な癌の診断が可能となり、医学的・社会的に多くの恩恵を与えることになると期待される。 According to the present invention, it is possible to provide more objective information as compared with a pathological examination performed conventionally, and it is considered that the present invention greatly contributes to an accurate diagnosis of cancer. By using the present invention, it is expected that cancer can be diagnosed more accurately than conventional methods, and that many medical and social benefits will be provided.
本発明は、ヒト被験者由来の細胞の染色体における、7p15-21、8q21-23、13q22、20p12、及び20q13領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の増加、及び／または1p32-ter、17p12-13、19p13.3、及び22q23領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の減少を検出することを特徴とする、in vitroにおける胃癌の検出方法を提供する。 The present invention provides an increase in DNA copy number in at least a portion of one or more regions selected from the 7p15-21, 8q21-23, 13q22, 20p12, and 20q13 regions in the chromosome of cells derived from human subjects, and / or A method for detecting gastric cancer in vitro, comprising detecting a decrease in DNA copy number in at least a part of one or more regions selected from 1p32-ter, 17p12-13, 19p13.3, and 22q23 regions provide.
本発明はまた、ヒト被験者由来の細胞の染色体における、5p13.1-p12、11q13.3、20q11.2、5p13、8q24.2-q24.3、9q34.1、5p13.2、8q24.11-q24.13、8q24.1-q24.3、9q34.1、9q34.3、20q12-q13.1、20q13.1-q13.2、9q34、11q13、11q13.3、20p12.1-p11.23、22q11.21、5q31.1、5q31-32、8q24.3、9qq34、11p15.5-p15.4、11p12-p11、11p11.2、11q13.1、及び11q13.5-q14領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の増加、及び／または18q21、18q21.1、7q33-q35、18q21.3、3p26-p24、4q12-13、4q21、4q25-q27、18q21.3、21q22.1、2q34-q35、3q24、3p14.2、4q11-q12、4q21-q25、7q36、18q21.1、21q21.2、8p11.2-p11.1、1q25、3p25、3p21-p14、4p16.3、4p12、4q26-q27、8q22、10p12、10p11.2、13q22、15q15-q21.1、及び16q12.1領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の減少を検出することを特徴とする、in vitroにおける口腔扁平上皮癌の検出方法を提供する。 The present invention also provides 5p13.1-p12, 11q13.3, 20q11.2, 5p13, 8q24.2-q24.3, 9q34.1, 5p13.2, 8q24.11- in the chromosome of cells derived from human subjects. q24.13, 8q24.1-q24.3, 9q34.1, 9q34.3, 20q12-q13.1, 20q13.1-q13.2, 9q34, 11q13, 11q13.3, 20p12.1-p11.23, 1 selected from 22q11.21, 5q31.1, 5q31-32, 8q24.3, 9qq34, 11p15.5-p15.4, 11p12-p11, 11p11.2, 11q13.1, and 11q13.5-q14 regions Increase in DNA copy number in at least a portion of these regions and / or 18q21, 18q21.1, 7q33-q35, 18q21.3, 3p26-p24, 4q12-13, 4q21, 4q25-q27, 18q21.3, 21q22 .1, 2q34-q35, 3q24, 3p14.2, 4q11-q12, 4q21-q25, 7q36, 18q21.1, 21q21.2, 8p11.2-p11.1, 1q25, 3p25, 3p21-p14, 4p16.3 Detecting a decrease in DNA copy number in at least a portion of one or more regions selected from 4p12, 4q26-q27, 8q22, 10p12, 10p11.2, 13q22, 15q15-q21.1, and 16q12.1 regions In vitro oral squamous cell carcinoma characterized by Provide a detection method.
本発明の方法は、上記の領域のいずれか１つの増加または減少を検出すれば良いが、精度を高めるためには、２つ以上、３つ以上、好ましくは５つ以上、より好ましくは１０個以上の領域の増加及び／または減少を検出すれば良い。 The method of the present invention only needs to detect an increase or decrease in any one of the above-mentioned areas, but in order to increase accuracy, two or more, three or more, preferably five or more, more preferably ten. What is necessary is just to detect the increase and / or decrease of the above area | region.
本発明の方法において、サンプルとして適当な細胞は胃または口腔扁平上皮細胞である。口腔扁平上皮細胞の例としては、舌、歯肉、軟口蓋、口床（mouth floor）等が挙げられる。 In the method of the present invention, a cell suitable as a sample is a stomach or oral squamous cell. Examples of oral squamous epithelial cells include tongue, gingiva, soft palate, mouth floor and the like.
本発明の方法は、上記染色体領域における少なくとも一部の増加及び／または減少を検出することを特徴とする。本明細書において、「少なくとも一部」とは、15bp以上、好ましくは60bp以上、より好ましくは1kb以上、更に好ましくは100kb以上の連続した配列をいう。 The method of the present invention is characterized by detecting at least a partial increase and / or decrease in the chromosomal region. In this specification, “at least a part” refers to a continuous sequence of 15 bp or more, preferably 60 bp or more, more preferably 1 kb or more, and still more preferably 100 kb or more.
ゲノムDNAで生じているコピー数の変化（増加及び欠失）を検出する方法としては、BAC（Bacterial Artificial chromosome）クローンへのテストDNAと対照（正常）DNAの競合ハイブリダイゼーション、あるいは２枚のアレイスライドを使用しての同時ハイブリダイゼーション、FISH（fluorescence in situ hybridization）法、ISH（in situ hybridization）法、定量的PCRによる方法、LOH（loss of heterozygosity）法、サザンブロット法の他、当分野において使用される種々の方法が挙げられ、特に限定するものではない。 Methods for detecting copy number changes (increases and deletions) in genomic DNA include competitive hybridization of test DNA and control (normal) DNA to BAC (Bacterial Artificial chromosome) clones, or two arrays. In addition to simultaneous hybridization using slides, FISH (fluorescence in situ hybridization) method, ISH (in situ hybridization) method, quantitative PCR method, LOH (loss of heterozygosity) method, Southern blot method, The various methods used are mentioned, It does not specifically limit.
FISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）法は、間期細胞核あるいは分裂期染色体展開標本に対し、蛍光標識したプローブDNA（調べたいゲノム領域に相当するDNA配列を有するBACクローン、PCR産物など）をハイブリダイズさせ、それにより得られる蛍光シグナルの数量を蛍光顕微鏡下で計数する手法である。サンプルとしては癌組織病理切片、組織塊を分散処理して調製した細胞などを用い、一般的なFISH法に準じてハイブリダイゼーションを行えばよい。請求項に記しているゲノム領域に相当するDNA配列を蛍光標識したDNAプローブを調製し、サンプル標本に対してハイブリダイゼーションを行い、その後蛍光顕微鏡により蛍光色素のシグナルスポットを計数する。調べたい対象領域と同一染色体上のセントロメア近傍領域（αサテライト配列）に対するプローブを異なる蛍光で標識し、同時にハイブリダイゼーションを行うと、コピー数異常をより正確に評価することが可能となる。 The FISH (fluorescence in situ hybridization) method hybridizes fluorescently labeled probe DNA (such as BAC clones and PCR products having a DNA sequence corresponding to the genomic region to be examined) to interphase cell nuclei or chromosomally expanded specimens. And the number of fluorescent signals obtained thereby is counted under a fluorescent microscope. As a sample, a cancer tissue pathological section, a cell prepared by dispersing a tissue mass, or the like may be used, and hybridization may be performed according to a general FISH method. A DNA probe fluorescently labeled with a DNA sequence corresponding to the genomic region described in the claims is prepared, hybridization is performed on the sample specimen, and then the signal spot of the fluorescent dye is counted with a fluorescence microscope. If a probe for a region near the centromere (α satellite sequence) on the same chromosome as the target region to be examined is labeled with different fluorescence and simultaneously hybridized, copy number abnormality can be more accurately evaluated.
また、BACクローンとのハイブリダイゼーションによって検出する場合、300〜2500個のBACクローンを支持体上に固定したアレイが市販されており（例えばMacrogen社製またはSpectral Genomics社製）、これを利用することが好適である。 In addition, when detecting by hybridization with BAC clones, an array in which 300 to 2500 BAC clones are immobilized on a support is commercially available (for example, manufactured by Macrogen or Spectral Genomics). Is preferred.
国際ヒトゲノム配列決定プロジェクトの一環として、ゲノムDNA断片（鎖長100〜300Kb）をBAC（bacterial artificial chromosome）ベクターにクローン化したヒトゲノムBACライブラリが構築された。ライブラリを構成する各クローンは、ゲノム地図上の位置が確定され（マッピング）、そのDNA配列および、どのような遺伝子がコードされているかといった情報をインターネット上で公開された公的ゲノムデータベース（米国NCBI、米国UCSC等のWebサイトなど）から容易に得ることができるようになっている。ヒトBACライブラリはいくつかの研究グループにより構築され、RPCI（Roswell Park Cancer Institute）ヒトゲノムBACライブラリ、Caltech（California Institute of Technology）ヒトBACライブラリ等がある。韓国Macrogen社でも独自にヒトBACライブラリを構築している。 As part of the international human genome sequencing project, a human genome BAC library was constructed by cloning genomic DNA fragments (chain length 100-300Kb) into BAC (bacterial artificial chromosome) vectors. The clones that make up the library have been determined (mapped) on the genome map, and their DNA sequences and information such as what genes are encoded are published on the public genome database (NCBI, USA). , And websites such as UCSC in the United States). Human BAC libraries have been constructed by several research groups, including RPCI (Roswell Park Cancer Institute) human genome BAC library, Caltech (California Institute of Technology) human BAC library, and the like. Korean Macrogen is also building its own human BAC library.
アレイCGH法は異常の有無を調べたいゲノム領域に相当するDNA配列（BACクローン、PCR産物、合成オリゴDNAなど）（以後プローブDNAと呼ぶ）を固相（スライドグラス、ガラスや金属、樹脂性の板状チップ、マイクロビーズ、繊維状担体など）に共有結合や非共有結合等により固定化したもの（以後プローブアレイと呼ぶ）を用いる。例えばアミノシランで表面をコーティングしたスライドガラス上に、精製したBACクローンDNAをクローンごとにスポットして固定化したものを用いることができる。DNAはBACベクターにゲノムDNAが挿入されたもの、それを超音波等でさらに短いDNAに断片化したもの、PCR等によりBACクローンDNAの一部あるいは全体を増幅させたものなどが考えられる。BACマイクロアレイは市販のものを入手することも可能である（例えば、Macrogen社のGenomArray(商標)、米国Spectral Genomics社のSpectralChip（商標）等）。 In the array CGH method, a DNA sequence (BAC clone, PCR product, synthetic oligo DNA, etc.) (hereinafter referred to as probe DNA) corresponding to the genomic region to be examined for the presence of an abnormality (hereinafter referred to as probe DNA) is a solid phase (slide glass, glass, metal, resinous). A plate chip (microchip, microbead, fibrous carrier, etc.) immobilized by covalent bonding or non-covalent bonding (hereinafter referred to as probe array) is used. For example, it is possible to use a purified BAC clone DNA spot-fixed for each clone on a glass slide whose surface is coated with aminosilane. The DNA may be one obtained by inserting genomic DNA into a BAC vector, one obtained by fragmenting it into shorter DNA with ultrasound or the like, or one obtained by amplifying a part or the whole of BAC clone DNA by PCR or the like. Commercially available BAC microarrays are also available (for example, GenogenArray (trademark) from Macrogen, SpectralChip (trademark) from Spectral Genomics, USA).
アレイCGH法を用いる場合、調べたい対象の癌細胞由来DNA（テストDNA）および対照として正常細胞由来DNA（対照DNA）を用いる。癌細胞DNAは手術摘出腫瘍組織、病理組織切片、生検（バイオプシー）により得た組織などから一般的な手法により抽出精製する。例えば市販のDNA精製キットなどが簡便である。RNAやたんぱく質などの夾雑物はできるだけ除去することが望ましい。また、癌組織内に混在する正常間質細胞等をマイクロダイセクション法などで除いたほうが異常領域の検出感度が高くなる。得られるDNAが微量の場合には、PCR法などで増幅してから用いることも可能である。使用するDNA量としては、アレイの大きさや実験形態にもよるが、スライドグラス上の22mm x 40mmのエリアにアレイ化されていて、蛍光標識法を適用する場合、0.1〜1.0μgのDNAを用いるのが適当である。 When using the array CGH method, a cancer cell-derived DNA (test DNA) to be examined and a normal cell-derived DNA (control DNA) are used as a control. Cancer cell DNA is extracted and purified by a general technique from surgically removed tumor tissue, pathological tissue section, tissue obtained by biopsy (biopsy), and the like. For example, a commercially available DNA purification kit is convenient. It is desirable to remove impurities such as RNA and proteins as much as possible. Moreover, the detection sensitivity of an abnormal area | region becomes higher when the normal stromal cell etc. which are mixed in a cancer tissue are removed by the microdissection method etc. When the amount of DNA obtained is small, it can be used after being amplified by PCR or the like. The amount of DNA to be used depends on the size of the array and the type of experiment, but is arrayed in a 22 mm x 40 mm area on a slide glass, and 0.1 to 1.0 μg of DNA is used when applying the fluorescent labeling method. Is appropriate.
検出のために、テストDNAおよび対照DNAに対して、それぞれ異なる標識物質により標識を行う。蛍光色素による直接標識、放射性同位元素、間接標識のための試薬、異なる物理的・光学的特性を有する粒子などを用いることができる。蛍光による直接標識法では、サンプルDNAをテンプレートとしてrandom primer法やnick translation法を用いれば、蛍光標識テストDNAおよび蛍光標識対照DNAを合成できる。Cy3-dCTPあるいはCy5-dCTPなどの蛍光標識核酸を用いてrandom primer法をを適用した場合、鎖長100〜500bpのCy5標識テストDNAおよびCy3標識対照DNAを得ることができる。 For detection, the test DNA and the control DNA are labeled with different labeling substances. Direct labeling with a fluorescent dye, radioisotope, reagent for indirect labeling, particles having different physical and optical properties, and the like can be used. In the direct labeling method using fluorescence, a fluorescently labeled test DNA and a fluorescently labeled control DNA can be synthesized by using a random primer method or a nick translation method with a sample DNA as a template. When the random primer method is applied using a fluorescently labeled nucleic acid such as Cy3-dCTP or Cy5-dCTP, a Cy5-labeled test DNA and a Cy3-labeled control DNA having a chain length of 100 to 500 bp can be obtained.
標識テストDNAおよび対照DNA溶液に、繰り返し配列をブロックするためCot-1 DNA（50〜100μg）等を加え、エタノール沈殿法などによってDNAに取り込まれなかった標識分子等を除去する。精製された標識DNAおよびCot-1 DNAの混合物はハイブリダイゼーション溶液に溶解する。ハイブリダイゼーション溶液の1例としては、50%ホルムアミド/2xSSC（2xSSC: 2倍濃度の標準クエン酸緩衝液）/10%硫酸デキストラン/4% SDS (SDS: ドデシル硫酸ナトリウム)/100mg/ml 酵母tRNA, pH 7.0がある。標識DNAを溶解したハイブリダイゼーション溶液はDNAを単鎖化するために加熱（上記ハイブリダイゼーション液を使用した場合70℃ｘ10分間）し、その後37℃で60分間インキュベートすることで、サンプルDNA中の非特異的な繰り返し配列をCot-1 DNAでブロックする。 Cot-1 DNA (50-100 μg) or the like is added to the labeled test DNA and control DNA solutions to block the repeated sequences, and the labeled molecules that have not been incorporated into the DNA are removed by ethanol precipitation or the like. The mixture of purified labeled DNA and Cot-1 DNA is dissolved in the hybridization solution. One example of a hybridization solution is 50% formamide / 2xSSC (2xSSC: 2-fold standard citrate buffer) / 10% dextran sulfate / 4% SDS (SDS: sodium dodecyl sulfate) / 100 mg / ml yeast tRNA, There is pH 7.0. The hybridization solution in which the labeled DNA is dissolved is heated to form a single strand of DNA (70 ° C x 10 minutes when the above hybridization solution is used), and then incubated at 37 ° C for 60 minutes, so that Block specific repetitive sequences with Cot-1 DNA.
一方、プローブアレイについては、用いたプローブDNAがあらかじめ1本鎖あるいは単鎖化されている場合はそのままハイブリダイゼーションに供し、2本鎖の状態であれば、沸騰水中に1分程度加熱するなどにより単鎖化後、乾燥させてからハイブリダイゼーションに供する。 On the other hand, for the probe array, if the probe DNA used is single-stranded or single-stranded in advance, it is subjected to hybridization as it is, and if double-stranded, it is heated in boiling water for about 1 minute. After single strand formation, it is dried and then subjected to hybridization.
スライドグラス等の担体への標識DNAの吸着を抑制するために、サケ精子由来DNA(10mg/ml)を含むハイブリダイゼーション溶液に30分程度さらした後、精製水で洗浄し、直ちに乾燥させておくとよい。 In order to suppress the adsorption of labeled DNA to a carrier such as a slide glass, the sample is exposed to a hybridization solution containing salmon sperm-derived DNA (10 mg / ml) for about 30 minutes, washed with purified water, and immediately dried. Good.
続いてプローブアレイに対して標識DNAを接触させ、ハイブリダイゼーション反応を行う。上記ハイブリダイゼーション溶液を使用する場合、37℃で24時間から48時間反応させるのが適当であるが、実施形態によって最適な条件を決定したほうがよい。スライドグラスにスポットされたプローブアレイの場合、ハイブリダイゼーション溶液を滴下後カバーグラス等をかけ、湿潤条件下でハイブリダイゼーションを行う。スライドグラスアレイでのハイブリダイゼーション用の市販装置を用いるのもよい。 Subsequently, the labeled DNA is brought into contact with the probe array to perform a hybridization reaction. When the above hybridization solution is used, it is appropriate to react at 37 ° C. for 24 to 48 hours. However, it is better to determine optimum conditions depending on the embodiment. In the case of a probe array spotted on a slide glass, the hybridization solution is dropped, and then a cover glass or the like is applied to perform hybridization under wet conditions. A commercially available apparatus for hybridization on a slide glass array may be used.
インキュベート後にアレイを洗浄し、特異的なプローブDNAと標識サンプルDNAの結合を残し、非特異的なハイブリダイゼーション、あるいは吸着しているDNAをプローブDNAから除く。スライドグラスタイプのBACアレイであれば、45℃に加温した50%ホルムアミド/2xSSC, pH7に15分、0.1%SDS/2xSSC, pH7に30分浸漬し、続いて室温の0.1%NP40/0.1Mリン酸緩衝液, pH7に15分、2xSSC, pH7に5分浸漬後、エタノールで濯いで乾燥させるとよい。 After the incubation, the array is washed to leave the binding between the specific probe DNA and the labeled sample DNA, and nonspecific hybridization or adsorbed DNA is removed from the probe DNA. For a slide glass type BAC array, immerse in 50% formamide / 2xSSC, pH 7 heated to 45 ° C for 15 minutes, 0.1% SDS / 2xSSC, pH 7 for 30 minutes, and then 0.1% NP40 / 0.1M at room temperature After dipping in phosphate buffer, pH 7 for 15 minutes and 2xSSC, pH 7 for 5 minutes, rinse with ethanol and dry.
もしサンプルDNAの標識に間接法を適用しているのであれば、続いて蛍光標識されたアフィニティ分子を結合させるなどの処理を行う。 If the indirect method is applied to the labeling of the sample DNA, processing such as binding of a fluorescently labeled affinity molecule is subsequently performed.
各プローブDNAにハイブリダイズしたテストDNA由来のシグナルと対照DNA由来のシグナルの定量的検出を行う。スライドグラスタイプのBACアレイに対し蛍光標識DNAをハイブリダイズさせた場合であれば、レーザースキャナーやCCDカメラなどの定量的検出装置により各プローブ由来DNAの蛍光イメージを取得すればよい。マイクロビーズを担体に用いるのであればフローサイトメーターなどで検出することができる。 Quantitative detection of signals derived from test DNA and control DNA hybridized to each probe DNA is performed. When fluorescently labeled DNA is hybridized to a slide glass type BAC array, a fluorescent image of each probe-derived DNA may be obtained by a quantitative detection device such as a laser scanner or a CCD camera. If microbeads are used as a carrier, they can be detected with a flow cytometer or the like.
各プローブDNAに相当するゲノム領域において、癌細胞でコピー数増加（増幅）が生じていればテストDNAが対照DNAに比べ相対的に多くハイブリダイズし、一方、癌細胞でコピー数減少（欠失）が生じていれば、対照DNAがテストDNAに比べ相対的に多くハイブリダイズすることになる。したがって、アレイ上のプローブDNAごとに、テストDNA由来シグナルと対照DNA由来シグナルの強度を比較することにより、各プローブDNAに相当するゲノム領域において、癌細胞でコピー数増加が生じているか、減少しているか、正常レベルであるのかを判定することができる。 In the genomic region corresponding to each probe DNA, if copy number increase (amplification) occurs in cancer cells, test DNA hybridizes relatively more than control DNA, while copy number decreases (deletion) in cancer cells. ), The control DNA will hybridize relatively more than the test DNA. Therefore, for each probe DNA on the array, by comparing the intensity of the signal derived from the test DNA and the signal derived from the control DNA, there is an increase or decrease in copy number in cancer cells in the genomic region corresponding to each probe DNA. It is possible to determine whether it is normal or normal.
本発明の方法を用い、被験者由来の細胞の染色体において、7p15-21、8q21-23、13q22、20p12、及び20q13領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の増加、及び／または1p32-ter、17p12-13、19p13.3、及び22q23領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の減少が検出された場合に、胃癌の可能性が高いと評価することができる。 An increase in DNA copy number in at least a portion of one or more regions selected from the 7p15-21, 8q21-23, 13q22, 20p12, and 20q13 regions in the chromosome of a subject-derived cell using the method of the present invention; and Evaluation of a high possibility of gastric cancer when a decrease in DNA copy number is detected in at least part of one or more regions selected from 1p32-ter, 17p12-13, 19p13.3, and 22q23 regions can do.
また、被験者由来の細胞の染色体において、5p13.1-p12、11q13.3、20q11.2、5p13、8q24.2-q24.3、9q34.1、5p13.2、8q24.11-q24.13、8q24.1-q24.3、9q34.1、9q34.3、20q12-q13.1、20q13.1-q13.2、9q34、11q13、11q13.3、20p12.1-p11.23、22q11.21、5q31.1、5q31-32、8q24.3、9qq34、11p15.5-p15.4、11p12-p11、11p11.2、11q13.1、及び11q13.5-q14領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の増加、及び／または18q21、18q21.1、7q33-q35、18q21.3、3p26-p24、4q12-13、4q21、4q25-q27、18q21.3、21q22.1、2q34-q35、3q24、3p14.2、4q11-q12、4q21-q25、7q36、18q21.1、21q21.2、8p11.2-p11.1、1q25、3p25、3p21-p14、4p16.3、4p12、4q26-q27、8q22、10p12、10p11.2、13q22、15q15-q21.1、及び16q12.1領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部におけるDNAコピー数の減少が検出された場合に、口腔扁平上皮癌の可能性が高いと評価することができる。 Also, in the chromosome of the subject-derived cell, 5p13.1-p12, 11q13.3, 20q11.2, 5p13, 8q24.2-q24.3, 9q34.1, 5p13.2, 8q24.11-q24.13, 8q24.1-q24.3, 9q34.1, 9q34.3, 20q12-q13.1, 20q13.1-q13.2, 9q34, 11q13, 11q13.3, 20p12.1-p11.23, 22q11.21, One or more regions selected from 5q31.1, 5q31-32, 8q24.3, 9qq34, 11p15.5-p15.4, 11p12-p11, 11p11.2, 11q13.1, and 11q13.5-q14 Increase in DNA copy number at least in part and / or 18q21, 18q21.1, 7q33-q35, 18q21.3, 3p26-p24, 4q12-13, 4q21, 4q25-q27, 18q21.3, 21q22.1, 2q34 -q35, 3q24, 3p14.2, 4q11-q12, 4q21-q25, 7q36, 18q21.1, 21q21.2, 8p11.2-p11.1, 1q25, 3p25, 3p21-p14, 4p16.3, 4p12, 4q26 When a decrease in DNA copy number is detected in at least a portion of one or more regions selected from -q27, 8q22, 10p12, 10p11.2, 13q22, 15q15-q21.1, and 16q12.1 regions, It can be evaluated that the possibility of squamous cell carcinoma is high That.
更に、これらの領域に含まれる個々の遺伝子のコピー数の変化を検出しても良い。
具体的には、胃癌の検出のためには、PCK1、TREM1、TBRG4、VSX1、OTOR、CDS2、PCDH8、SOCS-1、TG、PTPN1、MOZ、NOV、WISP1、TOP1、BCR、及びEXT1遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅及び／またはLIS1、DSCR1、KIAA0179、TTY1、RAB1、FHIT、RGS、KDR、DCC、ETS2/E2、GSTT1、SPON2、WHSC1、TXK、NPM1、APC、MLF2、FGF7、MATK、ADMTS1、DSCR6、BCK10遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の欠失を検出することが好ましい。
Further, changes in the copy number of individual genes contained in these regions may be detected.
Specifically, for gastric cancer detection, select from PCK1, TREM1, TBRG4, VSX1, OTOR, CDS2, PCDH8, SOCS-1, TG, PTPN1, MOZ, NOV, WISP1, TOP1, BCR, and EXT1 genes Amplification and / or LIS1, DSCR1, KIAA0179, TTY1, RAB1, FHIT, RGS, KDR, DCC, ETS2 / E2, GSTT1, SPON2, WHSC1, TXK, NPM1, APC, MLF2, FGF7, MATK It is preferable to detect the deletion of one or more genes selected from ADMTS1, DSCR6, and BCK10 genes.
また、口腔扁平上皮癌の検出のためには、GDNF、FGF4、DNMT3B、SKP2、DAB2、TG、VAV2、RAD1、EXT1、WISP1、ABL1、NPDC1、TOP1、PTPN1、PAEP、CST6、CCND1、JAG1、PNUTL1、CSF2、PDGFRB、NDRG1、RPL7A、ILK、EXT2、KAI1、BAD、RIN1、GARP遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅及び／またはMBD1、MBD2、POLI、TIM1、DCC、FVT1、BCL2、LMCD1、IGFBP7、FGF5、PITX、SERPINB3、TIAM1、BARD1、RARB、FHIT、KDR、IBSP、SHH、SMAD4、ADAMTS1、FGFR1、TPR、PPARG、Wnt-5a、SPON2、PTTG2、IL2、CTSB、MLLT10、ITGB1、DACH、FGF7、PLK遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の欠失を検出することが好ましい。 For detection of oral squamous cell carcinoma, GDNF, FGF4, DNMT3B, SKP2, DAB2, TG, VAV2, RAD1, EXT1, WISP1, ABL1, NPDC1, TOP1, PTPN1, PAEP, CST6, CCND1, JAG1, PNUTL1 , CSF2, PDGFRB, NDRG1, RPL7A, ILK, EXT2, KAI1, BAD, RIN1, amplification of one or more genes selected from GARP genes and / or MBD1, MBD2, POLI, TIM1, DCC, FVT1, BCL2, LMCD1, IGFBP7, FGF5, PITX, SERPINB3, TIAM1, BARD1, RARB, FHIT, KDR, IBSP, SHH, SMAD4, ADAMTS1, FGFR1, TPR, PPARG, Wnt-5a, SPON2, PTTG2, IL2, CTSB, MLLT10, ITGB1, DACH, It is preferable to detect the deletion of one or more genes selected from FGF7 and PLK genes.
上記の遺伝子のコピー数の変化を検出する場合、１以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上の遺伝子のコピー数の変化（増幅または減少）を検出する。 When detecting a change in the copy number of the above gene, a change (amplification or decrease) in the copy number of the gene of 1 or more, preferably 5 or more, more preferably 10 or more is detected.
本発明の一態様として、BACマイクロアレイ（GenomArray(商標)、韓国マクロジェン社）を用いる。その結果、図４に示すように、正常細胞と比較して、コピー数増加あるいは欠失を生じるゲノム領域がかなりの割合で存在することが判明した。これらの異常のそれぞれが、発癌及び／または癌患者における種々の症状と関連することが予想される。 As one embodiment of the present invention, a BAC microarray (GenomArray ™, Korea Macrogen) is used. As a result, as shown in FIG. 4, it was found that there is a considerable proportion of genomic regions that cause copy number increase or deletion compared to normal cells. Each of these abnormalities is expected to be associated with various symptoms in carcinogenesis and / or cancer patients.
本発明はまた、ヒト染色体7p15-21、8q21-23、13q22、20p12、20q13、1p32-ter、17p12-13、19p13.3、及び22q23領域から選択される１以上の領域の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブを含む、胃癌の検出のためのキットを提供する。 The present invention also provides at least a partial base of one or more regions selected from human chromosome 7p15-21, 8q21-23, 13q22, 20p12, 20q13, 1p32-ter, 17p12-13, 19p13.3, and 22q23 regions A kit for detection of gastric cancer comprising one or more probes having a base sequence complementary to the sequence is provided.
本発明は更に、ヒト染色体5p13.1-p12、11q13.3、20q11.2、5p13、8q24.2-q24.3、9q34.1、5p13.2、8q24.11-q24.13、8q24.1-q24.3、9q34.1、9q34.3、20q12-q13.1、20q13.1-q13.2、9q34、11q13、11q13.3、20p12.1-p11.23、22q11.21、5q31.1、5q31-32、8q24.3、9qq34、11p15.5-p15.4、11p12-p11、11p11.2、11q13.1、11q13.5-q14、18q21、18q21.1、7q33-q35、18q21.3、3p26-p24、4q12-13、4q21、4q25-q27、18q21.3、21q22.1、2q34-q35、3q24、3p14.2、4q11-q12、4q21-q25、7q36、18q21.1、21q21.2、8p11.2-p11.1、1q25、3p25、3p21-p14、4p16.3、4p12、4q26-q27、8q22、10p12、10p11.2、13q22、15q15-q21.1、及び16q12.1領域から選ばれる１以上の染色体領域の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブを含む、口腔扁平上皮癌の検出のためのキットを提供する。 The present invention further relates to human chromosomes 5p13.1-p12, 11q13.3, 20q11.2, 5p13, 8q24.2-q24.3, 9q34.1, 5p13.2, 8q24.11-q24.13, 8q24.1. -q24.3, 9q34.1, 9q34.3, 20q12-q13.1, 20q13.1-q13.2, 9q34, 11q13, 11q13.3, 20p12.1-p11.23, 22q11.21, 5q31.1 , 5q31-32, 8q24.3, 9qq34, 11p15.5-p15.4, 11p12-p11, 11p11.2, 11q13.1, 11q13.5-q14, 18q21, 18q21.1, 7q33-q35, 18q21.3 , 3p26-p24, 4q12-13, 4q21, 4q25-q27, 18q21.3, 21q22.1, 2q34-q35, 3q24, 3p14.2, 4q11-q12, 4q21-q25, 7q36, 18q21.1, 21q21.2 , 8p11.2-p11.1, 1q25, 3p25, 3p21-p14, 4p16.3, 4p12, 4q26-q27, 8q22, 10p12, 10p11.2, 13q22, 15q15-q21.1, and 16q12.1 regions A kit for detecting oral squamous cell carcinoma comprising at least one probe having a base sequence complementary to at least a part of the base sequence of one or more chromosomal regions.
該キットは、上記本発明の方法において好適に使用することができる。プローブの長さは、15bp以上であれば良いが、好ましくは60bp以上、より好ましくは1kb以上、更に好ましくは100kb以上である。 The kit can be suitably used in the above-described method of the present invention. The length of the probe may be 15 bp or more, preferably 60 bp or more, more preferably 1 kb or more, and still more preferably 100 kb or more.
本発明のキットは、上記１種以上のプローブが支持体上に固定された、例えばアレイとすることができる。 The kit of the present invention may be, for example, an array in which the one or more types of probes are fixed on a support.
キットには更に、上記以外の領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する対照プローブを含ませることができる。また、検出のための蛍光色素等の標識剤を含んでいても良い。キットにはその他、対照サンプルとなる正常ヒト由来DNA、サンプル中のDNAとプローブとの反応のために必要な緩衝液、洗浄液等を適宜含ませることができる。 The kit can further include a control probe having a base sequence complementary to the base sequence of the region other than the above. Further, a labeling agent such as a fluorescent dye for detection may be included. In addition to the above, normal human-derived DNA as a control sample, a buffer solution necessary for the reaction between the DNA in the sample and the probe, a washing solution, and the like can be appropriately included in the kit.
また、本発明のキットには、検出対象の胃癌及び／または口腔扁平上皮癌である場合に該キットを用いて得られる検出パターンの表示を、例えば説明書において含ませることができる。検出パターンは、例えば図４に示すような異常プロファイルでも良く、あるいはアレイ上で蛍光標識を用いて競合ハイブリダイゼーションまたは同時ハイブリダイゼーションを行った際に得られるスポットの発色を示すものであっても良い。 In addition, in the kit of the present invention, in the case of gastric cancer and / or oral squamous cell carcinoma to be detected, display of a detection pattern obtained by using the kit can be included in, for example, an instruction manual. The detection pattern may be, for example, an abnormal profile as shown in FIG. 4, or may indicate the color development of a spot obtained when competitive hybridization or simultaneous hybridization is performed on the array using a fluorescent label. .
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these examples.
染色体CGH解析
104例の胃癌（gastric adenocarcinoma）患者から採取した胃癌細胞サンプルを用い、染色体CGH解析を行った。その結果、DNAコピー数異常を呈した染色体領域は以下の通りであった。結果を図１に示す。
Chromosome CGH analysis
Chromosome CGH analysis was performed using gastric cancer cell samples collected from 104 gastric adenocarcinoma patients. As a result, the chromosomal regions exhibiting abnormal DNA copy numbers were as follows. The results are shown in FIG.
コピー数増加：7p15-21、8q21-23、13q22、20p12、及び20q13領域
コピー数減少：1p32-ter、17p12-13、19p13.3、及び22q23領域
最も頻度が高かったのは、コピー数増加に関しては8q21-23（68%）、コピー数減少に関しては19p13.3（54%）であった。
Copy number increase: 7p15-21, 8q21-23, 13q22, 20p12, and 20q13 areas Copy number decrease: 1p32-ter, 17p12-13, 19p13.3, and 22q23 areas Was 8q21-23 (68%) and 19p13.3 (54%) in terms of copy number reduction.
DNA 倍数性（ploidy）解析
レーザー走査サイトメトリー（Laser scanning cytometry：LSC）を用いて胃癌細胞サンプルを解析し、以下の式：
DAN指標（DI）＝腫瘍細胞の各DNA含量（G1/0相）／正常細胞の核DNA含量（G1/0相）
で定義されるDIに基づいて胃癌患者を２つの群に分類した。
（１）1.0＜DI≦1.2の場合：DNA二倍体（diploid）腫瘍群（41検体）
この群の腫瘍は、組織病理学的には拡散（diffuse）型に相当し、細胞間で染色体数の変動がない31検体と、変動の見られる10検体が含まれる。
（２）1.2＜DIの場合：DNA異倍体（aneuploid）腫瘍群（66検体）
この群の腫瘍は、組織病理学的には腸（intestinal）型に相当し、染色体数の変動がない3検体と、変動の見られる63検体が含まれる。
DNA ploidy analysis Gastric cancer cell samples are analyzed using laser scanning cytometry (LSC) and the following formula:
DAN index (DI) = tumor cell DNA content (G1 / 0 phase) / normal cell nuclear DNA content (G1 / 0 phase)
Gastric cancer patients were classified into two groups based on the DI defined in.
(1) If 1.0 <DI ≤ 1.2: DNA diploid tumor group (41 specimens)
This group of tumors is histopathologically equivalent to a diffuse type, and includes 31 specimens in which the number of chromosomes does not vary between cells and 10 specimens in which there are fluctuations.
(2) If 1.2 <DI: DNA aneuploid tumor group (66 specimens)
This group of tumors is histopathologically equivalent to the intestinal type and includes three specimens with no change in the number of chromosomes and 63 specimens with changes.
上記２群のそれぞれについて、実施例１と同様の染色体CGH解析を行った。その結果を図２及び３に示す。二倍体腫瘍群では、コピー数異常（増幅及び欠失の双方）を示した染色体領域の数は5.95±4.34であり、異倍体腫瘍群では15.11±8.64であった。このことから、二倍体腫瘍群では、異倍体腫瘍群と比較して、DNAコピー数異常を呈する染色体領域が有意に少ないことが示される。 Chromosome CGH analysis similar to that in Example 1 was performed for each of the two groups. The results are shown in FIGS. In the diploid tumor group, the number of chromosomal regions exhibiting copy number abnormalities (both amplification and deletion) was 5.95 ± 4.34, and in the aneuploid tumor group was 15.11 ± 8.64. This indicates that the diploid tumor group has significantly fewer chromosomal regions exhibiting DNA copy number abnormalities than the aneuploid tumor group.
また、高頻度に異常が見られた領域中、7p15-21、20p12、20q13の増加は二倍体腫瘍群で有意に出現していた。 In addition, 7p15-21, 20p12, and 20q13 increased significantly in the diploid tumor group in the region where abnormalities were frequently observed.
BACマイクロアレイ（Macrogen社）を用いたアレイCGH法による胃癌ゲノム異常の解析
大学病院にてインフォームドコンセントのもと患者から提供を受けた胃癌手術摘出検体104症例を解析サンプルとして用いた。
Analysis of gastric cancer genome abnormality by array CGH method using BAC microarray (Macrogen) 104 gastric cancer surgical specimens provided from patients under informed consent were used as analysis samples.
癌組織からゲノムDNAを抽出精製した。対照DNAとしてはヒト正常人胎盤由来DNA（Promega社）を用いた。蛍光標識DNAの調製にはrandom primer法を適用した。１症例の解析につき、癌組織DNA（テストDNA）および正常リンパ球由来DNA（対照DNA）を各0.5μg準備し、マイクロチューブ内に精製水にて21μlとなるよう調製した。これらDNA溶液に2.5x random primer溶液（Invitrogen社 BioPrime DNA Labeling Kit）20μlを加えて混合し、100℃にて5分間加熱後、直ちに氷上に移し、5分間冷却した。続いてdNTP溶液（Macrogen社 MacArray Kit、Solution A）5μl、テストDNAのチューブには1mM Cy5-dCTP（PerkinElmer社）を、対照DNAのチューブには1mM Cy3-dCTP（PerkinElmer社）を各3μl、Klenow Fragment（Invitrogen社 BioPrime DNA Labeling Kit）を1μl (40unit)添加混合した後、37℃のインキュベータ内にて遮光下、16時間インキュベートした。その後、0.5M EDTA溶液（Invitrogen社 BioPrime DNA Labeling Kit）を5μl添加して反応を停止させた。未反応のCyanine-dCTP等を除去するため、DNA精製カラム（Qiagen社 QiaQuick PCR Purification Kit）にDNAをトラップし、80μlのTE緩衝液にて溶出した。
Genomic DNA was extracted and purified from cancer tissue. As control DNA, human normal placenta-derived DNA (Promega) was used. The random primer method was applied to the preparation of fluorescently labeled DNA. For analysis of one case, 0.5 μg each of cancer tissue DNA (test DNA) and normal lymphocyte-derived DNA (control DNA) was prepared, and prepared in a microtube to 21 μl with purified water. To these DNA solutions, 20 μl of 2.5 × random primer solution (Invitrogen BioPrime DNA Labeling Kit) was added and mixed, heated at 100 ° C. for 5 minutes, immediately transferred to ice, and cooled for 5 minutes. Next, 5 μl of dNTP solution (Macrogen MacArray Kit, Solution A), 1 mM Cy5-dCTP (PerkinElmer) for the test DNA tube, and 3 μl each of 1 mM Cy3-dCTP (PerkinElmer) for the control DNA tube,
BACマイクロアレイとして、Macrogen社が独自に構築したヒトゲノムBACライブラリ由来のクローン1,440個が3スポットずつスライドグラス上に固定化されたものを使用した（MacArray Kit）。本BACアレイにスポットされたクローンは、すべて両端エンドシーケンスが決定され、ゲノム地図上にマップされている。さらにFISH法によっても染色体上の位置が確認されているとともに、重複してハイブリダイズする領域がないことも確認されている。各クローンは全ゲノム範囲にわたって位置するよう選択されており、平均約2.3Mbの解像度でコピー数異常領域をマッピングすることが可能である。 As the BAC microarray, 1,440 clones derived from the human genome BAC library independently constructed by Macrogen were immobilized on a slide glass in 3 spots (MacArray Kit). All clones spotted on this BAC array have both end sequences determined and mapped on the genome map. Furthermore, the position on the chromosome has been confirmed by the FISH method, and it has also been confirmed that there is no overlapping hybridizing region. Each clone is selected to be located over the entire genome range, and it is possible to map copy number abnormal regions with an average resolution of about 2.3 Mb.
蛍光標識したテストDNAおよび対照DNA 各80μlおよびCot-1 DNA(Macrogen社 solution B) 50μlを混合し、さらに3M酢酸ナトリウム 20μlおよび氷冷100%エタノール500μlを加えて混合撹拌した。冷凍庫（-25℃）にて60分間置いた後、遠心分離（13,000rpm x 20分）を行った。DNAのペレットを残して上清を除去し、氷冷70%エタノールを500μl加え再度遠心分離（13,000rpm x 5分間）を行った。DNAペレットを残して上清を除去した後、10分間風乾させた。得られたDNAペレットにyeast tRNA（Macrogen社 Solution D）14μlおよびハイブリダイゼーション溶液（Macrogen社 solution C）140μlを添加して遮光下30分間静置してDNAを緩やかに溶解させた。DNAを十分に撹拌溶解させた後、70℃の水浴中で15分間加熱することでDNAを単鎖化し、37℃のインキュベータ内で60分間静置することでCot-1による繰り返し配列のブロッキング反応を行った。 80 μl of each of the fluorescently labeled test DNA and control DNA and 50 μl of Cot-1 DNA (Macrogen solution B) were mixed, and further 20 μl of 3M sodium acetate and 500 μl of ice-cold 100% ethanol were added and stirred. After 60 minutes in a freezer (−25 ° C.), centrifugation (13,000 rpm × 20 minutes) was performed. The supernatant was removed leaving the DNA pellet, and 500 μl of ice-cold 70% ethanol was added and centrifuged again (13,000 rpm × 5 minutes). After removing the supernatant leaving the DNA pellet, it was air-dried for 10 minutes. To the obtained DNA pellet, 14 μl of yeast tRNA (Macrogen Solution D) and 140 μl of hybridization solution (Macrogen solution C) were added and allowed to stand for 30 minutes in the dark to gently dissolve the DNA. After sufficiently dissolving DNA with stirring, heat the DNA in a 70 ° C water bath for 15 minutes to make the DNA single-stranded, and leave it in a 37 ° C incubator for 60 minutes to block repeated sequences with Cot-1. Went.
一方、ハイブリダイゼーション溶液（Solution C）45μlにサケ精子DNA溶液（Macrogen社 Solution E）15μlを加えて混合し、70℃水浴中で10分間加熱後、氷上で5分間冷却し、ブロッキング溶液とした。BACマイクロアレイ（Macrogen社 MacArray Kit）上にブロッキング溶液55μlを滴下し、液がアレイ全体に行き渡るよう22x60mmのカバーグラスを載せ、室箱中にて30分間インキュベートした。その後カバーグラスを静かに外し、精製水中で10秒間浸漬し、再度新しい精製水に10秒間浸漬した後、100%イソプロパノールに浸漬し、スライド用遠心機にて乾燥させた。 Meanwhile, 15 μl of salmon sperm DNA solution (Macrogen Solution E) was added to 45 μl of the hybridization solution (Solution C), mixed, heated in a 70 ° C. water bath for 10 minutes, and then cooled on ice for 5 minutes to obtain a blocking solution. A blocking solution (55 μl) was dropped onto a BAC microarray (Macrogen MacArray Kit), a 22 × 60 mm cover glass was placed so that the solution could be spread over the entire array, and incubated in a chamber box for 30 minutes. Thereafter, the cover glass was gently removed, dipped in purified water for 10 seconds, dipped again in fresh purified water for 10 seconds, dipped in 100% isopropanol, and dried in a slide centrifuge.
44μlのハイブリダイゼーション溶液をBACマイクロアレイに滴下し、液がアレイ全体に行き渡るよう22x60mmのカバーグラスを載せ、48〜72時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、洗浄液1（50%ホルムアミド/2xSSC, pH7）にて46℃、5分間3回、洗浄液2（0.1% SDS/2xSSC, pH7）にて46℃、10分3回、洗浄液3（0.1%NP-40/0.1Mリン酸緩衝液, pH7）にて46℃、10分間3回、洗浄液4（2xSSC, pH7）にて46℃、2分間3回の洗浄操作を行った。その後、BACマイクロアレイを装置から外し、70%, 85%, 100%の各エタノールシリーズを満たした染色瓶に各1分間ずつ浸漬後、スライド用遠心機にて乾燥させた。 44 μl of the hybridization solution was dropped onto the BAC microarray, and a 22 × 60 mm cover glass was placed on the BAC microarray to allow the solution to spread throughout the array, and hybridization was performed for 48 to 72 hours. Washing after hybridization was performed 3 times for 5 minutes at 46 ° C in washing solution 1 (50% formamide / 2xSSC, pH7), 3 times for 10 minutes at 46 ° C in washing solution 2 (0.1% SDS / 2xSSC, pH7). 3 (0.1% NP-40 / 0.1M phosphate buffer, pH 7) was washed three times for 10 minutes at 46 ° C., and 3 times for 2 minutes with washing solution 4 (2 × SSC, pH 7) at 46 ° C. Thereafter, the BAC microarray was removed from the apparatus, immersed in a staining bottle filled with 70%, 85%, and 100% ethanol series for 1 minute each and then dried in a slide centrifuge.
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後のアレイはマイクロアレイ用スキャナにてスキャンし、テストDNAおよび対照DNA由来蛍光による画像を取得した。得られた画像データはアレイCGH解析用ソフトウェア（Macrogen社 MacViewer）により解析を行った。アレイスポットごとにCy3およびCy5の蛍光シグナルを測定し、データをノーマライズした後、log2(Cy5/Cy3)値をクローンごとにプロットした。 The array after hybridization and washing was scanned with a microarray scanner, and images from fluorescence derived from test DNA and control DNA were obtained. The obtained image data was analyzed by array CGH analysis software (Macrogen, MacViewer). After measuring fluorescence signals of Cy3 and Cy5 for each array spot and normalizing the data, log2 (Cy5 / Cy3) values were plotted for each clone.
同様にして合計104症例の胃細胞癌サンプルのゲノム異常プロファイルを解析し、BACクローンごとにコピー数異常の存在頻度を調べた。図４に示すように、多くの症例で共通してコピー数増加あるいは欠失を生じるゲノム領域が存在することが判明した。 Similarly, genome abnormality profiles of a total of 104 cases of gastric cell carcinoma samples were analyzed, and the frequency of copy number abnormality was examined for each BAC clone. As shown in FIG. 4, it was found that there are genomic regions that commonly cause copy number increase or deletion in many cases.
これらの高頻度に異常を生じるゲノム異常は、そこにコードされている遺伝子の発現レベルを変化させることなどにより、癌の悪性形質発現に重要な役割を果たしているものと考えられる。 These genomic abnormalities that cause abnormalities at a high frequency are considered to play an important role in the development of malignant phenotypes of cancer by changing the expression level of the gene encoded therein.
アレイCGH解析の結果、実施例１の染色体CGHで確認された異常箇所と一致してDNAコピー数に異常が見られた。高頻度にコピー数の増加を呈した遺伝子として、PCK1、TREM1、TBRG4、VSX1、OTOR、CDS2、TG、PTPN1、MOZ、NOV、WISP1、TOP1、BCR、EXT1等があり、このうちTG、PTPN1、MOZ、NOV、WISP1、TOP1、BCR、EXT1は癌関連遺伝子として知られているものである。一方、高頻度にコピー数の減少を呈した遺伝子として、RRM、LIS1、PRY、XKRY、TTY1、RAB1、FHIT、RGS、KDR、DCC、ETS2/E2、GSTT1、SPON2、WHSC1、TXK、HPM1、APC、MLF2、FGF7、MATK等があった。 As a result of the array CGH analysis, an abnormality was observed in the DNA copy number in agreement with the abnormal part confirmed in the chromosome CGH of Example 1. Genes that frequently increased copy number include PCK1, TREM1, TBRG4, VSX1, OTOR, CDS2, TG, PTPN1, MOZ, NOV, WISP1, TOP1, BCR, EXT1, etc., of which TG, PTPN1, MOZ, NOV, WISP1, TOP1, BCR, and EXT1 are known as cancer-related genes. On the other hand, RRM, LIS1, PRY, XKRY, TTY1, RAB1, FHIT, RGS, KDR, DCC, ETS2 / E2, GSTT1, SPON2, WHSC1, TXK, HPM1, APC , MLF2, FGF7, MATK, etc.
DNAコピー数の増加及び減少を呈した遺伝子を、それぞれその遺伝子座と合わせて表２及び３に示す。 The genes exhibiting increases and decreases in DNA copy number are shown in Tables 2 and 3 together with their loci, respectively.
二倍体腫瘍群及び異倍体腫瘍群におけるアレイCGH解析
実施例２で分類した二倍体腫瘍群及び異倍体腫瘍群のそれぞれについて、実施例３と同様のアレイCGH解析を行った結果、二倍体腫瘍群でのDNAコピー数異常は、異倍体腫瘍群における異常に比較すると頻度が少なかった。結果を図５及び６に示す。
Array CGH analysis in diploid tumor group and aneuploid tumor group For each of the diploid tumor group and aneuploid tumor group classified in Example 2, the same array CGH analysis as in Example 3 was performed. Abnormal DNA copy number in the diploid tumor group was less frequent than in the diploid tumor group. The results are shown in FIGS.
また、図５の結果から明らかなように、二倍体腫瘍群において、20q11領域におけるコピー数増加、並びに12p13領域におけるコピー数減少が特徴的であった。この結果は、遺伝子としてはBCRのコピー数増加、及びMFL2のコピー数減少に相当する。 As is clear from the results of FIG. 5, the diploid tumor group was characterized by an increase in copy number in the 20q11 region and a decrease in copy number in the 12p13 region. This result corresponds to an increase in the BCR copy number and a decrease in the MFL2 copy number as a gene.
一方、図６の結果から明らかなように、異数性腫瘍群においては、20q11.21、20q11.21、20q12-q13、及び20q13領域におけるコピー数の増加が特徴的であった。この結果は、遺伝子としてはPYGB、DNMT3B、TOP1、及びPTPN1のコピー数の増加に相当する。 On the other hand, as apparent from the results of FIG. 6, the aneuploid tumor group was characterized by an increase in copy number in the 20q11.21, 20q11.21, 20q12-q13, and 20q13 regions. This result corresponds to an increase in the copy number of PYGB, DNMT3B, TOP1, and PTPN1 as genes.
高頻度異常発生群における染色体異常領域
実施例２において二倍体腫瘍群に分類された中で、更に細胞間で染色体数の変動が大きい腫瘍群（高頻度異常発生群、10検体）とそれ以外の群（31検体）に分類して染色体異常を再度検討した。その結果、以下の表２に示すように、高頻度異常発生群は異常箇所が非常に多く、特に5p21、6q22、8q21-23、11q14-22、及び20p12領域におけるコピー数の増加、12q24、16p13、16q23-24、19p13、19q13、及び22q13領域におけるコピー数の減少の頻度が極めて高かった（いずれも＞50%）。
Chromosome abnormality region in the high-frequency abnormality occurrence group In the diploid tumor group in Example 2, the tumor group (high-frequency abnormality occurrence group, 10 specimens) in which the variation in the number of chromosomes between cells is larger and the others Chromosome abnormalities were examined again by classifying them into groups (31 specimens). As a result, as shown in Table 2 below, the high frequency abnormality occurrence group has a large number of abnormalities, especially the increase in copy number in the 5p21, 6q22, 8q21-23, 11q14-22, and 20p12 regions, 12q24, 16p13 , 16q23-24, 19p13, 19q13, and 22q13 regions had a very high frequency of copy number reduction (all> 50%).
口腔扁平上皮癌細胞におけるBAC CGH
表５に示す種々の口腔扁平上皮癌細胞系を用い、マクロジェン社のBACクローンを用いて全染色体領域についてDNAコピー数の増幅・減少（欠失）の頻度を解析した。結果を図７及び８に示す。
BAC CGH in oral squamous cell carcinoma cells
Using various oral squamous cell carcinoma cell lines shown in Table 5, the frequency of DNA copy number amplification / reduction (deletion) was analyzed for all chromosomal regions using Macrogen BAC clones. The results are shown in FIGS.
上記の結果から、対照と比較して特に増幅の頻度が高かった領域は、5p13.1-p12、11q13.3、20q11.2、5p13、8q24.2-q24.3、9q34.1、5p13.2、8q24.11-q24.13、8q24.1-q24.3、9q34.1、9q34.3、20q12-q13.1、20q13.1-q13.2、9q34、11q13、11q13.3、20p12.1-p11.23、22q11.21、5q31.1、5q31-32、8q24.3、9qq34、11p15.5-p15.4、11p12-p11、11p11.2、11q13.1、及び11q13.5-q14領域であり、この領域には、GDNF、FGF4、DNMT3B、SKP2、DAB2、TG、VAV2、RAD1、EXT1、WISP1、ABL1、NPDC1、TOP1、PTPN1、PAEP、CST6、CCND1、JAG1、PNUTL1、CSF2、PDGFRB、NDRG1、RPL7A、ILK、EXT2、KAI1、BAD、RIN1、GARP遺伝子が含まれる。また、特に減少（欠失）の頻度が高かった領域は18q21、18q21.1、7q33-q35、18q21.3、3p26-p24、4q12-13、4q21、4q25-q27、18q21.3、21q22.1、2q34-q35、3q24、3p14.2、4q11-q12、4q21-q25、7q36、18q21.1、21q21.2、8p11.2-p11.1、1q25、3p25、3p21-p14、4p16.3、4p12、4q26-q27、8q22、10p12、10p11.2、13q22、15q15-q21.1、及び16q12.1領域であり、この領域にはMBD1、MBD2、POLI、TIM1、DCC、FVT1、BCL2、LMCD1、IGFBP7、FGF5、PITX、SERPINB3、TIAM1、BARD1、RARB、FHIT、KDR、IBSP、SHH、SMAD4、ADAMTS1、FGFR1、TPR、PPARG、Wnt-5a、SPON2、PTTG2、IL2、CTSB、MLLT10、ITGB1、DACH、FGF7、PLK遺伝子が含まれる。これらの遺伝子について、DNAの増幅頻度の高い順に表６に、欠失頻度の高い順に表７にまとめた。 From the above results, the regions where the frequency of amplification was particularly high compared to the control were 5p13.1-p12, 11q13.3, 20q11.2, 5p13, 8q24.2-q24.3, 9q34.1, 5p13. 2, 8q24.11-q24.13, 8q24.1-q24.3, 9q34.1, 9q34.3, 20q12-q13.1, 20q13.1-q13.2, 9q34, 11q13, 11q13.3, 20p12. 1-p11.23, 22q11.21, 5q31.1, 5q31-32, 8q24.3, 9qq34, 11p15.5-p15.4, 11p12-p11, 11p11.2, 11q13.1, and 11q13.5-q14 GDNF, FGF4, DNMT3B, SKP2, DAB2, TG, VAV2, RAD1, EXT1, WISP1, ABL1, NPDC1, TOP1, PTPN1, PAEP, CST6, CCND1, JAG1, PNUTL1, CSF2, PDGFRB , NDRG1, RPL7A, ILK, EXT2, KAI1, BAD, RIN1, and GARP genes. In addition, the areas with particularly high frequency of deletion (deletion) were 18q21, 18q21.1, 7q33-q35, 18q21.3, 3p26-p24, 4q12-13, 4q21, 4q25-q27, 18q21.3, 21q22.1 , 2q34-q35, 3q24, 3p14.2, 4q11-q12, 4q21-q25, 7q36, 18q21.1, 21q21.2, 8p11.2-p11.1, 1q25, 3p25, 3p21-p14, 4p16.3, 4p12 , 4q26-q27, 8q22, 10p12, 10p11.2, 13q22, 15q15-q21.1, and 16q12.1 regions, which are MBD1, MBD2, POLI, TIM1, DCC, FVT1, BCL2, LMCD1, IGFBP7 , FGF5, PITX, SERPINB3, TIAM1, BARD1, RARB, FHIT, KDR, IBSP, SHH, SMAD4, ADAMTS1, FGFR1, TPR, PPARG, Wnt-5a, SPON2, PTTG2, IL2, CTSB, MLLT10, ITGB1, DACH, FGF7 The PLK gene is included. These genes are summarized in Table 6 in descending order of DNA amplification frequency and in Table 7 in descending order of deletion frequency.
Claims (11)
Furthermore, the kit of any one of Claims 8-10 containing a labeling agent.
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