JP2005531496A

JP2005531496A - 新規なペプチド誘導体、その製造、ならびにその治療的および化粧的用途

Info

Publication number: JP2005531496A
Application number: JP2003564078A
Authority: JP
Inventors: アンヌ‐マリー、ピネル
Original assignee: Institut Europeen de Biologie Cellulaire
Current assignee: Institut Europeen de Biologie Cellulaire
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2023-01-31
Also published as: US7268108B2; CA2474719A1; AU2003222347A1; KR20040105709A; FR2835528B1; US20050187164A1; WO2003064458A2; FR2835528A1; WO2003064458A3; JP4237067B2; EP1470157A2; WO2003064458A8

Abstract

本発明は、式（Ｉ）：
Ｒ−Ｖ^１−Ａｌａ^２−Ｈｉｓ^３−Ｘ^４−Ｙ^５−Ｔｒｐ^６−ＮＨ_２
［式中、
Ｒは水素原子、またはベンゾイル基、トシル基、ベンゼンスルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基もしくはピリジンプロピオニル基から選択される保護基を表し、
Ｖは、ノルロイシン、ノルバリンおよび２−Ｎ−Ｍｅ−ノルロイシンから選択される、天然または非天然のアミノ酸を表し、
Ｘは、Ｌ型またはＤ型の、フェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ベンゾチエニルアラニン、４，４’−ビフェニルアラニン、３，３−ジフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、インダニルグリシン、４−メチルフェニルアラニン、チエニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、ハロゲノフェニルアラニンから選択される、芳香族の特徴を有する天然または非天然アミノ酸を表し、
Ｙは、アルギニン、リシンまたはオルニチンから選択される、塩基性の特徴を有する、Ｌ型天然アミノ酸を表す］
のペプチド、その光学異性体またはジアステレオ異性体、およびラセミ混合物を含むその混合物に関する。本発明はまた、その製造法および治療薬または化粧品の分野でのその用途に関する。

Description

発明の背景

本発明は、α−ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）の末梢作用を再生する偽ペプチド誘導体、その製造、ならびにその治療的および化粧的用途に関する。

α−ＭＳＨは、本来ヒトの身体で作られる物質であり、極めて多くの生理活性、すなわち解熱活性、抗炎症活性および色素沈着活性を有することが知られている。

メディエーターとして、α−ＭＳＨには特異的レセプターがあり、そのうちの５つがすでに文献に記載され、各々７つの膜貫通ドメインを有する。皮膚において、上述の活性は「メラノコルチン−１」レセプター（ＭＣ−１ｒ）と関係がある。このレベルで、α−ＭＳＨの結合は、それ自体がアデニリルシクラーゼを刺激して、環状アデノシン１リン酸（またはｃＡＭＰ）を産生するＧタンパク質（Ｇγ型のα−サブユニットを提示）の活性化を誘発する。

ｃＡＭＰの産生はＡ型タンパク質キナーゼの活性化を誘発し、それがリン酸化によって、その細胞の遺伝子のＤＮＡのｃＡＭＰ応答エレメント（またはＣＲＥＢ）と結合可能なタンパク質を活性化させる。この結果、次いで標的細胞上でその効果を発揮するメディエーターが発現する。

哺乳類では、皮膚および毛髪の着色は色素、すなわちメラニンという一般的なカテゴリーによるものである。これらのメラニンは、表皮の基底膜レベルおよび毛嚢内に位置する細胞であるメラノサイトによって、皮膚で産生される。メラニン合成は酵素チロシナーゼの活性によって制御される。この酵素の産生（同じく関連酵素、すなわちＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の産生も）こそが、α−ＭＳＨとその受容体であるＭＣ−１との結合によって刺激される。

チロシナーゼによるメラニンの産生は、細胞小器官であるプレメラノソームで行われる。それがメラニンで満たされると、これらの細胞小器官はメラノソームと呼ばれるようになり、メラノサイトの樹状突起から近接細胞であるケラチノサイトへ移行する。このようにメラニンは表皮内に分散され、表皮の日焼けや保護をもたらしている。

そのフリーラジカル除去特性および太陽光線吸収特性で知られている天然色素のメラニンは、皮膚の生理的保護剤である。ヒトでこの色素の産生を刺激できる利用可能な化合物は、皮膚化粧品学においては存在しない。

さらに、α−ＭＳＨの抗炎症作用のメカニズムは完全には解明されていないが、多くの実験的事実を集めると、結果としてα−ＭＳＨはＭＣ−１受容体と結合することによってＮＯＳｉ（またはＮＯＳ_２）およびＮＦＫＢの誘発を阻害し、ｍＲＮＡの発現、次に抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を誘発する。このサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αまたはγＩＮＦなどの炎症性サイトカインの放出を阻害する。

ケラチノサイトは、表皮細胞集団の９５％を占めているが、ＩＬ−１の貯蔵所であると考えられ、それらの細胞表面にＭＣ−１受容体を有する。従って、α−ＭＳＨとこれらの受容体との結合は、局所的な炎症現象の調節を可能にする。

α−ＭＳＨは、式：アセチル−Ｓｅｒ¹−Ｔｙｒ^２−Ｓｅｒ^３−Ｍｅｔ^４−Ｇｌｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｐｈｅ^７−Ａｒｇ^８−Ｔｒｐ^９−Ｇｌｙ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｐｒｏ^１２−Ｖａｌ^１３−ＮＨ_２（式中、Ｓｅｒ＝セリン、Ｔｙｒ＝チロシン、Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ａｒｇ＝アルギニン、Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｇｌｙ＝グリシン、Ｌｙｓ＝リシン、Ｐｒｏ＝プロリン、およびＶａｌ＝バリン）というトリデカ（１３）ペプチドである。非常に多くの科学的研究によってα−ＭＳＨの有効配列が確立されたが、それは便宜上メラノトロピン作用に関するヘプタペプチド４〜１０(Haskell-Luevano et al. J. Med. Chem. 1997, 40, 2133-2139)および抗炎症作用に関するトリペプチド１１〜１３ (Hiltz M. E. and Lipton J. M. Peptides 1990, 11, 979-982)であるとされている。

さらに、最近の研究により、様々な著者が環化構造を開示する特許を出願するに至っている(Hrubyら、米国特許第５，６７４，８３９号および同第６，０５４，５５６号)。

従って、本発明の目的は、メラノトロピン活性および／または抗炎症活性、抗アレルギー活性を示す小さな直鎖状の偽ペプチド化合物を提供することにある。

より詳細には、本発明は、式（Ｉ）に相当する新規なペプチドに関する：
Ｒ−Ｖ^１−Ａｌａ^２−Ｈｉｓ^３−Ｘ^４−Ｙ^５−Ｔｒｐ^６−ＮＨ_２（Ｉ）
［式中、
Ｒは、水素原子、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、ベンゼンスルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基もしくはピリジンプロピオニル基から選択される保護基を表し、
Ｖは、ノルロイシン、ノルバリンおよび２−Ｎ−Ｍｅ−ノルロイシンから選択される、天然または非天然のＬ型アミノ酸を表し、
Ｘは、フェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ベンゾチエニルアラニン、４，４’−ビフェニルアラニン、３，３−ジフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、インダニルグリシン、４−メチルフェニルアラニン、チエニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、およびハロゲンがフェニル基に対してメタ、オルトもしくはパラの位置の塩素、臭素、ヨウ素もしくはフッ素原子であり得るハロフェニルアラニンから選択される、芳香族性の、天然または非天然のＬ型またはＤ型アミノ酸を表し、
Ｙは、アルギニン、リシンまたはオルニチンから選択される、塩基性の天然Ｌ型アミノ酸を表す］。

式（Ｉ）のペプチド中のそれぞれ２、３、および６位のアミノ酸Ａｌａ、ＨｉｓおよびＴｒｐはＬ型である。

式（Ｉ）のペプチドは１以上の不斉炭素原子を含んでもよい。それらは鏡像異性体またはジアステレオ異性体の形態で存在してもよい。これらの鏡像異性体およびジアステレオ異性体、ならびにラセミ混合物を含むその混合物も、本発明に包含される。

これらの新規なペプチドは、皮膚または粘膜での色素沈着の刺激に関しておよび／または局所的な炎症現象の制限に関して活性を有する。

特に、本発明によるペプチドは、アトピー性皮膚炎、乾癬、白斑、紅斑、炎症性脱毛症、湿疹または喘息などの、細胞レベルで起こり、天然メディエーターを模倣する化合物の直接的介入によって緩和され得る病態の予防および／または治療に有用である。

よって、本発明によるペプチドは、スキンケアという点から非常な技術革新となる。

従って、本発明はまた、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する医薬品の製造のための１以上の式（Ｉ）のペプチドの使用、ならびにメラノトロピン活性を有する化粧品の製造のための式（Ｉ）の１以上のペプチドの使用にも関する。

本発明による式（Ｉ）の化合物としては、以下のように定義される好ましい化合物が挙げられる：
Ｒは、アセチル基、ベンゼンスルホニル基、トシル基またはピリジンプロピオニル基から選択される保護基を表し、
Ｖは、ノルロイシンおよび２−Ｎ−Ｍｅ−ノルロイシンから選択される、天然または非天然のＬ型アミノ酸を表し、
Ｘは、フェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、チエニルアラニン、またはｐ−ニトロフェニルアラニンから選択される、Ｄ型またはＬ型の、芳香族性の、天然または非天然のアミノ酸を表し、
Ｙは、アルギニンまたはリシンから選択される塩基性の天然Ｌ型アミノ酸を表す。

式（Ｉ）のペプチド中のそれぞれ２、３、および６位のアラニン、ヒスチジンおよびトリプトファンはＬ型である。

本発明によれば、一般式（Ｉ）の化合物は、当業者に公知の種々の方法に従い、特に溶液中または固相支持体上での化学合成法により製造できる。樹脂を用いた支持体上での合成が特に好適である。用いることのできる樹脂としては、Ｒｉｎｋアミド型の樹脂（または４−（２’−４’−ジメトキシフェニル−ｆｍｏｃ−アミノエチル）−フェノキシ樹脂）(H. Rink, Tetrahedron Let., 1987, 28, 3787)およびＭＢＨＡ樹脂（または４−メチル-ベンズヒドリルアミン樹脂）(G. R. Matsueda et al. Peptides, 1981, 2, 45)が挙げられる。

出発生成物は保護されたアミノ酸である。保護基は主要なアミン官能基上のアセチル（Ａｃ）基または９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基であってよく、側鎖の官能基上のtert−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、トリチル（Ｔｒｔ）基、または２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）基であり得る。洗浄、カップリングおよび脱保護技術は当業者には周知である。例えば、それらはFmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach: W. C. Chan and P. D. White (Oxford University Press)またはChemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins-Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt (CRC Press Boca Raton, N. Y.)に記載されている。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例１：表中の化合物１
（Ｒ＝Ａｃ、Ｖ＝Ｎｌｅ、Ｘ＝ＤＰｈｅ、Ｙ＝Ａｒｇ、Ｌ型のＡｌａ^２、Ｈｉｓ^３およびＴｒｐ^６）
このペプチドを、Ｒｉｎｋアミド型樹脂を用いた固相合成法により合成する。この樹脂の官能基化は０．３〜０．６ｍｍｏｌ／樹脂ｇの間である。

まず、Ｒｉｎｋアミド型樹脂を、ＤＭＦで洗浄（２回）して準備した後、下記の通り脱保護を行う。カップリングさせる各アミノ酸に対し、アミノ酸のカップリング、樹脂の洗浄、そのアミノ酸の主鎖のアミン官能基の脱保護、そして再び樹脂の洗浄からなる手順を繰り返す。

カップリング：２当量のＢＯＰ（またはＨＢＴＵ）、２当量のＤＩＥＡ（またはＮＭＭ）および２当量のＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨをＤＭＦ中で２時間。
洗浄：ＤＭＦで２回、メタノールで１回、ジクロロメタンで２回、およびＤＭＦで１回洗浄。
脱保護：２％エタノールを含む８０／２０のＤＭＦ／ピペリジン混合物（フリーラジカル除去剤）、３分間を１回、その後７分間。
洗浄：（上に同じ）。

種々のアミノ酸カップリングの後、２％のエタンジオールを含む５０／５０のＴＦＡ／ジクロロメタン混合物を１時間３０分間用いてペプチドを樹脂から切り離す。

ジクロロメタンおよびＴＦＡは窒素流下で蒸発させた後、ジエチルエーテルでの沈殿、Ｃ１８逆相カラムを用いる分取液体クロマトグラフィーによる精製を行う。

Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２の合成は、下記の保護されたアミノ酸（Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ）を用いて行う：
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−ＤＰｈｅ−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；
Ａｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ。

略語：
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル；
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；
ＢＯＰ：１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；
ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン。

所望のペプチドを得、その分析的結果を下表に示す。

実施例２：表中の化合物２
（Ｒ＝Ａｃ、Ｖ＝Ｎｌｅ、Ｘ＝ＤＰｈｅ、Ｙ＝Ｌｙｓ、Ｌ型のＡｌａ^２、Ｈｉｓ^３およびＴｒｐ^６）
このペプチドを、Ｒｉｎｋアミド型樹脂を用いた固相合成法により合成する。この樹脂の官能基化は０．３〜０．６ｍｍｏｌ／樹脂ｇの間である。

実施例１に記載した手順と同様にして合成を行う。合成に使用するアミノ酸は以下の通りである：
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−ＤＰｈｅ−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；
Ａｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ。

このペプチドの分析的特性を下表に示す。

下表は本発明によるいくつかの化合物の化学構造を示し、それらの分析的結果およびｇ／モルで表したそれらの分子量（ＭＭ）を併記したものである。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析および質量分析（ＭＳ）による分析を本発明による各化合物について行った。

ＨＰＬＣ：
固定相：Ｃ１８逆相カラム、寸法は４．６×５０ｍｍ、３．５μｍ；
移動相：水（０．１％ＴＦＡを含む）およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）からなる２元混合物；
方法：１２分かけて０％〜８０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）のグラジェント；
検出波長：２１４ｎｍ。

表中、純度を精製前の粗生成物のピーク表面積に対する相対パーセンテージとして表し、保持時間（Ｒ．Ｔ．）を分で表している。

Ｍ．Ｓ：
コーン電圧９Ｖ、イオン源温度１２０℃およびスキャン時間６秒の、正のエレクトロスプレー。

表で分子イオンの値［Ｍ＋Ｈ］^＋および、場合によっては、二重荷電イオン［Ｍ＋２Ｈ］^２＋を報告する。

表中：
ＡＣはアセチル基を表し、
ＢｚｌＳＯ_２はベンゼンスルホニル基を表し、
ＰｙｒＰｒｏｐはピリジンプロピオニル基を表し、
Ｔｏｓはトシル基を表し、
ＤＨｏｍｏＰｈｅはＤ型のホモフェニルアラニンを表し、
ＤＴｈｉはＤ型のチエニルアラニンを表し、
ＤｐＮＯ_２ＰｈｅはＤ型のｐ−ニトロフェニルアラニンを表し、
Ｌ２，ＮａｐはＬ型の２−ナフチルアラニンを表し、
ＤＰｈｅはＤ型のフェニルアラニンを表し、
ＮｌｅはＬ型のノルロイシンを表し、
ＮＭｅ−ＮｌｅはＬ型の２−Ｎ−Ｍｅ−ノルロイシンを表す。

これらの化合物については、実施例１に記載したようにＲｉｎｋアミド型樹脂を用いた支持体上での合成を行うことができる。

このアミノ酸を、側鎖に保護を施した形態で（必要に応じて主要なアミン官能基をＦｍｏｃ基で保護すればよい）導入する。これらの合成に用いる分子は、その位置によって以下のようなものとする：
Ｔｒｐ^６：Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；
Ｙ^５：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ；
Ｘ^４：Ｆｍｏｃ−ＤＰｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ｐＮＯ_２Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＤＴｈｉ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ２、Ｎａｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＤＨｏｍｏＰｈｅ−ＯＨ；
Ｈｉｓ^３：Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ；
Ａｌａ^２：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；
Ａｌａ^１：Ａｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ、アセチル保護以外の末端保護の場合はＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ。

この場合、末端保護（Ｒ）は、脱保護段階の後、次の試薬：塩化ベンゼンスルホニル、塩化ピリジンプロピオニルおよび塩化トシルを用い、カップリングにより導入する。

本発明によるペプチドは、好適な毒性試験および負荷試験によりそれらが無害であることが確認された後に、その効果を判断する薬理試験を行った。

１．表中のペプチドのＭＣｌ−ｒレセプターに対する親和性を、in vitroで、メラノサイト系統上でｃＡＭＰの産生によって実証した。

α−ＭＳＨと比較した場合の、in vitroで維持したメラノサイトによるアデニリルシクラーゼの活性化に及ぼす本発明によるペプチドの効果の判定は、特にBeavo J. A. et al. Mol. Pharmacol., 6(6), 597-603, 1970およびMontague W. Cook J. R., Biochem J., 122(1), 1971に記載の方法論を用いて行った。メラニン合成能のあるマウスメラノサイト（Ｓ９１Cloudman株）を用いる。

ｃＡＭＰ産生の後、供給業者の推奨に従ってＥＩＡ法（Amersham Pharmacia Biotech、バイオトラック(Biotrack)キット：ＲＰＮ２２５）を行った。本発明者らは、α−ＭＳＨ（１００％）と比較して、スクリーニングを行った種々の分子によって誘発される応答率（％）を求めた。全ての実験条件は２反復で行った。

チロシナーゼの産生における、１番のペプチドの作用およびα−ＭＳＨの作用を、in vitroで維持したヒトメラノサイトで実証した。チロシナーゼの産生は、抗ヒトチロシナーゼ抗体を用いたウェスタンブロット法によって、Ｍ４Ｂｅ系統上で追跡した。

２４時間の培養の後、α−ＭＳＨまたは１番のペプチドを終濃度１０^−７Ｍで細胞へ加える。２４時間後、これらの細胞を削り落として分離し、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４バッファー、ｐＨ６．８＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００＋１ｍＭＰＭＳＦ中に溶解した。種々のサンプル中のタンパク量を、ビシンコニン酸でアッセイすることによって測定した。１５％アクリルアミド／ビスアクリルアミド電気泳動ゲルに、ウェルあたり１００μｇのサンプルを添加した。これらのサンプルを３時間７０ｍＡで泳動させた。ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell、Ｐｒｏｔａｎ)への転写は、１０Ｖにて一晩行う。膜を、ｐＨ７．６（２００ｍＭＴｒｉｓ；１．３７ＭＮａＣｌ；１ＭＨＣｌ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ＋５％ＢＳＡのバッファーを用いて、３７℃で１時間ブロッキングした。まず、４℃で一晩、１／１０００に希釈した抗ヒトチロシナーゼヤギ抗体(Santa Cruz、ＳＣ−７８３３)に曝す。次に、周囲温度で１時間、１／１００００に希釈したペルオキシダーゼ結合抗ヤギ免疫グロブリン抗体(Sigma、Ａ８９１９)とともにインキュベーションを行う。チロシナーゼの存在は、ＥＣＬ検出キット(Amersham Pharmacia Biotech、ＲＰＮ２１０９)を用いて化学発光によって可視化し、それを図１／１に示すように、写真フィルム(Amersham Pharmacia Biotech、ＲＰＮ２１０３Ｋ)に露光した。

２．表中のペプチド１の局所投与によるメラニン刺激効果の二重盲試験を、ヒトについて行った。

１０ｐｐｍのペプチド１のゲルおよびそのプラセボを、１日２回、３週間、インフォームドコンセントを取得した１２名の正常なボランティアの前腕の内側へ塗布した。腕は太陽光に曝されないため、１６日目から２０日目まで１日１回、０．６ＭＥＤ（最小紅斑線量）の正確に較正した人工太陽光への暴露を行った。

最終の処置から２４時間後、処置領域の臨床評価を盲検にて行い、５段階の指標尺度に従って着色度を記録した。次いで、生成したメラニンを定量化するため、また処置の超微細構造的結果を評価するため、生検サンプルを採取した。

表皮のメラニンの定量化は、組織切片に対してＡｇＮＯ_３で標識した後、画像解析によって行った。デジタル処理の後（ソニーＣＣＤカメラ）、ＬｅｉｃａＱｕａｎｔｉｍｅｔを用いて、表皮の活性層だけを分析した（胚芽層から有棘層まで）。

メラノサイトおよびメラノソームの超微細構造分析は電子顕微鏡により行った。薄層切片に対して二重対照法を用い、次いでこの切片を１２０００倍までの範囲にわたる倍率で観察した（Ｊｅｏｌ１２００ＥＸ）。

プラセボと比較して、表中のペプチド１は、皮膚の５４％の褐色化（日焼け）において統計上有意な増加を誘発する（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。処置領域の臨床観察では不耐性の徴候は明らかではなかった。

プラセボと比較して、表中のペプチド１は、ボランティアの表皮中のメラニン量において統計上有意な増加（＋６８％、ｐ＜０．０１）を誘発する。フィッシャー検定による分散分析では、危険率１％未満の極めて有意な生成効果が明らかとなった。

個々の結果を比較するとさらに、この２つの方法間の優れた相関性が明らかとなった。

メラノサイトの超微細構造分析では、大きな細胞に関して、処置に対する相当な影響、つまり、ヘテロクロマチンをほとんど見られない発達した核、非常に豊富な細胞小器官およびユーメラノソームを含む樹状突起が明らかとなった。これらの徴候は全て、メラニン生合成（完全に生理的なものである）の強い活性を反映している。

ケラチノサイト中のメラノソームの研究は、それらが細胞核の先端レベルで自然に堆積し、特有の「核パラソル（nuclear parasol)」を成すことを示す。

表中のペプチド１は、局所塗布すると、ヒトにおいて皮膚のメラニン生成を有意に促すことができることがわかった。さらに、これは局所レベルで完全に耐性であった。

３．抗炎症活性を次のように実証した。
皮膚上では、界面活性剤などの刺激物が、インターロイキン−１−α（ＩＬ−１α）などのサイトカインの細胞外発現により特徴づけられる炎症反応の原因となる。ＳＤＳで刺激したケラチノサイト培養モデルを用いて、表中のペプチド１の抗炎症能を評価した。

ＮＣＴＣ２５４４ヒトケラチノサイトを、濃度１０^−６Ｍで表中のペプチド１を含む培養中に７２時間置く。すすいだ後、濃度８５ｍｇ／ｌでＳＤＳを導入し、接触させたまま２４時間置く。

上清中の細胞外ＩＬ−１αレベルを、ＳＤＳの干渉がないことから選択された、ＥＬＩＳＡ法（Immunotech、０７５５）によって測定する。

ペプチド１は、ＳＤＳストレスを受けた培養ケラチノサイトによるＩＬ−１αの発現を約４２％減少させる。

４．ヒトにおいてin vivoで光に誘発される紅斑に及ぼす表中のペプチド１の効果を測定する。

フォトタイプクラスIIIおよびIV（明るいおよび中間）の、また個々の類型角度（Individual Typological Angle）（ＩＴＡ°）が５０〜２８°の１４名の正常な成人男女ボランティアから、本調査に参加することについてのインフォームドコンセントを取得した。

処置は、７５ｃｍ^２に２μｌ／ｃｍ^２の割合での１日２回２週間の前腕の内側への局所塗布からなる。調査中、腕は太陽光が当たらないよう保護する。

太陽光線は、２９０〜３９０ｍｍの範囲のＵＶＡおよびＵＶＢスペクトルを含む１５０Ｗキセノンアーク灯により当てる。２５％の等比級数的増加を有する６種類の光強度の線量を、液体ライトガイドを介して処置領域に適用する。

Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ（商標）ＣＲ３００を用いて比色分析測定を行う。非照射近傍領域に対して色度座標（Ｌ；ａ＆ｂ^＊）を求める。差異Δａ^＊が２．５より大きければ、正確にＭＥＤを定義することができる。

最終処置から２４時間後、処置領域および対照領域に各個体のＭＥＤが間に含まれるように算出した漸増線量のＵＶを照射する。２４時間後および７２時間後、照射した領域を比色分析測定によって評価する。

評価基準はＭＥＤ：紅斑を生じる最小量のＵＶＡおよびＵＶＢである。

ＭＥＤの統計上有意な増加が、表中のペプチド１による処理に見られる。

表中の１番のペプチドのゲルでの局所塗布により、過剰な太陽光線により生じる紅斑の出現に対する皮膚の抵抗性を増加させることができる。

従って、本発明によるペプチドは、抗炎症活性、抗アレルギー活性、およびメラノトロピン活性を有する。

従って、本発明によるペプチドは、アレルギー、特に皮膚アレルギー、炎症反応およびメラニン生成症状の治療を目的とする医薬品の調製に使用できる。従って、これらの医薬品は、治療薬中において、特にアトピー性皮膚炎、乾癬、白斑、紅斑、特に光誘発性の紅斑、炎症性脱毛症、湿疹、および喘息の予防／および治療においてその用途が見出される。

もう一つの態様によれば、本発明は、有効成分として本発明によるぺプチドを含んでなる医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、皮膚および粘膜への局所適用に特に好適である。

従って、これらの医薬組成物は、有効量の本発明によるペプチド、および１以上の好適な医薬用賦形剤を含む。

該賦形剤は、所望の剤形および投与様式に応じて選択される。

経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所、気管内、鼻腔内、経皮（パッチ）、または直腸投与のための、本発明による医薬組成物において、上記式（Ｉ）の有効成分あるいはその塩または水和物は、単位投与形で、通常の医薬用賦形剤の混合物として、上記症状または疾病の予防または治療のために動物またはヒトへ投与できる。好適な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒および経口溶液または懸濁液などの経口投与用形態、舌下、口内、気管内および鼻腔内投与形態、皮下、筋肉内または静脈内投与形態、および直腸投与形態を含む。局所適用には、本発明による化合物を、クリーム、軟膏、液体エアゾール、またはエアゾールスプレー（スプレー）、ゲル、ローションおよびパッチとして用いることができる。

投与経路によらず、１日に投与する有効成分の用量は、１回以上の投与で、０．５ｍｇ／ｋｇに達し得る。

それより高いまたは低い用量が好適な特別な場合もあり、このような用量もまた本発明に属する。慣行に従い、各患者に好適な用量は、医師が投与方法ならびに患者の体重および応答によって決定する。

固体組成物を錠剤の形態に調製する場合、主要有効成分をゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガムなどの医薬用賦形剤と混合する。錠剤は、スクロースで、セルロース誘導体で、またはその他の物質でコーティングしてもよい。錠剤は、種々の技術、直接打錠法、乾式造粒法、湿式造粒法または熱融解によって製造できる。

ゲルカプセル製剤は、有効成分を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟カプセルまたは硬カプセルに注入することにより得られる。

非経口投与としては、薬理学的に適合する分散剤および／または湿潤剤、例えばプロピレングリコールまたはブチレングリコールを含む水性懸濁液、等張生理食塩水または滅菌注射水を用いてよい。

もう一つの態様によれば、本発明はまた、上述の病態の治療のための方法に関し、それは本発明によるペプチドまたはその医薬上許容される塩の投与を含む。

粘膜適用または局所適用できる式（Ｉ）の化合物を含んでなる化粧用組成物も本発明に包含され、さらには、メラノトロピン作用を有する化粧品の製造のための式（Ｉ）の化合物の使用も同様である。

最後の態様によれば、本発明は、局所適用のための本発明の式（Ｉ）のペプチドを含んでなる皮膚化粧用組成物に関し、それは溶液、ローション、エマルション、液体エアゾールまたはエアゾールスプレー（スプレー）、ゲルまたはクリームの形態であってよく、それは特に皮膚の太陽光暴露に備える薬剤、日焼け促進剤、白髪の着色剤、皮膚鎮静剤、抗紅斑剤として使用できる。

当然のことながら、上述のように本発明の主題である、本発明によるペプチドの混合物を含む医薬組成物、化粧品または皮膚化粧用組成物もまた、本発明に包含される。

５．ペプチド１による、正常な個体由来のＳＡＥＣ^１細胞の、または重篤な喘息に苦しむコルチコイド依存（cortico-dependant）患者由来の多核好中球および単球の刺激効果の、デキサメタゾンとの比較。

ａ）上皮細胞
ＳＡＥＣ（ヒト一次上皮培養細胞）；起原：正常な個体の小気管支、
フラスコ中で増殖させ、トリプシン処理を行い、ウェルへ移行（４８ウェルプレート）、
集密状態で、ウェル中で２４時間インキュベーション、
刺激を与えないか、ＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）＋表中の１番のペプチド１０^−５〜１０^−８Ｍ＋デキサメタゾン１０⁻⁷Ｍを加える、
上清を回収、−２０℃で保存、
ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−８をアッセイ。

ペプチド１によるＳＡＥＣ細胞の刺激効果を図２に表す（ＮＳ＝刺激なし、ＤＥＸ＝デキサメタゾン）。

ｂ）重篤な喘息に苦しむ８名のコルチコイド依存患者：
ヘパリン処理血液：３０ｍｌ、
パーコール勾配上（６２〜７２％）での分離、
単球および好中球＞生存能９５％＞９９％、
細胞を取り出し、ＲＰＭＩで洗浄、
１０^７細胞／ｍｌ、ウェル中で２４時間インキュベーション、
刺激を与えないか、１０^−６〜１０^−８Ｍの表中のペプチド１＋デキサメタゾン１０⁻⁷Ｍを加える、
上清を回収、−２０℃で保存、
ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−８をアッセイ。

ペプチド１によるコルチコイド依存性（ＣＤ）単球の刺激効果を図３に表す（ＮＳ＝刺激なし、ＤＥＸ＝デキサメタゾン）。

ペプチド１によるコルチコイド依存性（ＣＤ）多核好中球の刺激効果を図４に表す（ＮＳ＝刺激なし、ＤＥＸ＝デキサメタゾン）。

これらの結果から、表中のペプチド１の活性がデキサメタゾンより１０倍高いことがわかる。

^１ＳＡＥＣ：小気道上皮細胞（small Airway Epithelial Cell）。

化学発光によって可視化したチロシナーゼの存在を示す図である。ペプチド１によるＳＡＥＣ細胞の刺激効果を示す図である。ペプチド１によるコルチコイド依存性（ＣＤ）単球の刺激効果を示す図である。ペプチド１によるコルチコイド依存性（ＣＤ）多核好中球の刺激効果を示す図である。

Claims

式（Ｉ）に相当するペプチド、その光学異性体またはジアステレオ異性体、およびラセミ混合物を含むその混合物：
Ｒ−Ｖ^１−Ａｌａ^２−Ｈｉｓ^３−Ｘ^４−Ｙ^５−Ｔｒｐ^６−ＮＨ_２（Ｉ）
［式中、
Ｒは、水素原子、またはアセチル基、ベンゾイル基、トシル基、ベンゼンスルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基もしくはピリジンプロピオニル基から選択される保護基を表し、
Ｖは、ノルロイシン、ノルバリンおよび２−Ｎ−Ｍｅ−ノルロイシンから選択される、天然または非天然のＬ型アミノ酸を表し、
Ｘは、フェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ベンゾチエニルアラニン、４，４’−ビフェニルアラニン、３，３−ジフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、インダニルグリシン、４−メチルフェニルアラニン、チエニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、およびハロゲンがフェニル基に対してメタ、オルトもしくはパラの位置の塩素、臭素、ヨウ素もしくはフッ素原子であり得るハロフェニルアラニンから選択される、芳香族性の、天然または非天然のＬ型またはＤ型アミノ酸を表し、
Ｙは、アルギニン、リシンまたはオルニチンから選択される、塩基性の天然Ｌ型アミノ酸を表し、
それぞれ２、３、および６位の各々のアミノ酸Ａｌａ、ＨｉｓおよびＴｒｐはＬ型である］。
Ｒが、アセチル基、ベンゼンスルホニル基またはピリジンプロピオニル基から選択される保護基を表し、
Ｖが、ノルロイシンおよび２−Ｎ−Ｍｅ−ノルロイシンから選択される、天然または非天然のＬ型アミノ酸を表し、
Ｘが、フェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、チエニルアラニンまたはｐ−ニトロフェニルアラニンから選択される、Ｄ型またはＬ型の、芳香族性の、天然または非天然のアミノ酸を表し、
Ｙが、アルギニンまたはリシンから選択される塩基性の天然Ｌ型アミノ酸を表し、
それぞれ２、３、および６位のアミノ酸Ａｌａ、ＨｉｓおよびＴｒｐがＬ型である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、その光学異性体またはジアステレオ異性体、およびラセミ混合物を含むその混合物。
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＴｈｉ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
ＢｚｌＳＯ_２−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
Ｔｏｓ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
ＢｚｌＳＯ_２−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
ＢｚｌＳＯ_２−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤｐＮＯ_２Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
ＢｚｌＳＯ_２−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＴｈｉ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤＴｈｉ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
ＰｙｒＰｒｏｐ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤｐＮＯ_２Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
ＰｙｒＰｒｏｐ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤｐＮＯ_２Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌ２，Ｎａｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
Ａｃ−ＭｅＮｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤｈｏｍｏＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＤｈｏｍｏＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２、
その光学異性体またはジアステレオ異性体、およびラセミ混合物を含むその混合物
から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
樹脂を用いた支持体上での合成によって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物からなる、医薬品。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を、好適な賦形剤と組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を含んでなる、粘膜または局所適用のための化粧品。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を含んでなる、メラノトロピン活性を有する化粧品。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を含んでなる、皮膚の太陽光暴露に備えるため、および皮膚の日焼けを促進するための薬剤、白髪染め剤、皮膚鎮静剤または抗紅斑剤である化粧品。
溶液、ローション、エマルション、液体エアゾールまたはエアゾールスプレー、ゲルまたはクリームの形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を含んでなる、局所適用のための皮膚化粧用組成物。
アレルギー、特に皮膚のアレルギー、炎症反応およびメラニン形成症状の予防および／または治療を目的とする医薬品の製造のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
前記医薬品が、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、白斑、紅斑、特に光誘発性の紅斑、炎症性脱毛症、または喘息の治療を目的とするものである、請求項１１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
メラノトロピン作用および抗紅斑作用を有する化粧品の製造のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。