JP2005513479A

JP2005513479A - 質量分析用のプローブ

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Publication number: JP2005513479A
Application number: JP2003555205A
Authority: JP
Inventors: クープマンジェンス−オリヴァー; エムブラックバーンジョナサン
Original assignee: センスプロテオミックリミテッド
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2005-05-12
Also published as: CA2477563A1; US7057165B2; AU2002366875A1; EP1464069A2; US20050196791A1; WO2003054543A3; US20030173513A1; AU2002366875B2; AU2002366875A2; JP2009300449A; WO2003054543A2

Abstract

本発明は、レーザー脱離／イオン化質量分析、より詳細にはMALDIMSによって、１種又はそれ以上の検体、詳細にはタンパク質、あるいは該タンパク質と結合するか、それとも相互作用することが可能な化合物を分析するためのプローブに関し；本発明は、また、タンパク質マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイを製造する方法及びタンパク質マイクロアレイを分析する方法にも関する。前記プローブは、電気伝導性のターゲット表面を支持体上に有する支持体を含み、前記ターゲット表面は、１種又はそれ以上の検体捕捉部分を示す複数の別個のターゲット領域を有するマイクロアレイを含むことを特徴とする。各別個のターゲット領域は、1000μm²より小さい面積、より好ましくは500μm²より小さい面積、さらにより好ましくは100μm²より小さい面積を有する。

Description

本発明は、レーザー脱離／イオン化質量分析、より詳細にはMALDI MSによって、１種又はそれ以上の検体、詳細にはタンパク質、あるいは該タンパク質と結合するか、それとも相互作用することが可能な化合物を分析するためのプローブに関し；本発明は、また、タンパク質マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイを製造する方法及びタンパク質マイクロアレイを分析する方法にも関する。

そのような質量分析プローブは、該プローブ上にマイクロアレイが作られているものであり、該プローブによって、検体（例えば、タンパク質、薬剤、薬剤候補、炭水化物、DNA、RNA又は他の試験分子）の脱離及びイオン化によって、標識がない状態で、タンパク質−小分子の相互作用を取り調べることが可能になる。前記プローブ及び方法は、特に、薬剤発見の過程、例えばヒット・シリーズ（hit series）の評価、誘導最適化、トキシコゲノミクスによる予測及び代謝産物プロファイリングに有用である。

病気の過程及び薬剤効果の分析は、伝統的にゲノミクスに重点を置いており、その一方でプロテオミクス、すなわちゲノムの発現した断片の研究では、タンパク質及びその相互作用のより直接的な分析を行う。プロテオミクスは、最初は、全ての細胞、組織、器官、もしくは生体のタンパク質発現又はその断片の定量的かつ定性的な研究であった。多くの場合、プロテオミクスは、異なる条件にさらされた同様の生物由来のサンプル同士を比較すること、又は病変組織と非病変組織を比較することを必要とする。プロテオミクスのゲノミクスより優れた利点の一つは、プロテオミクスによって、タンパク質の定量的な同定及び分析が可能になることであり；それに対して、ゲノミクスは、タンパク質に翻訳されるｍRNAを基に、タンパク質の存在を予測することができるのみである。さらに、プロテオミクスは、タンパク質の翻訳後修飾を同定することができ、従って、単にタンパク質の存在について説明するだけでなく、タンパク質の活性について決定することができる。

プロテオミクスにおける従来の分析方法は、タンパク質の分離を目的とする二次元ゲル電気泳動の後にタンパク質のタンパク質分解による消化と質量分析による分析をすることを基にしている。もう一つの方法として、エドマン分解を、分離後のタンパク質同定に用いることができる。しかしながら、両方法は、その高発現タンパク質への偏向と破壊的な分離方法により制限を受ける。したがって、同位体コード・アフィニティー・タグ（isotope coded affinity tag，ICAT，Gygiら 1999）、タンデム・アフィニティー・タンパク質精製（tandem affinity protein purification，TAP，Gavinら 2002）及びタンパク質マイクロアレイ（McBeathとSchreiber，2000）などの二次元ゲル電気泳動の必要がないプロテオミクスの方法が好評を博している。さらに、これらの新しい方法によって、プロテオミクスの範囲が、データの収集及び目録を作ることから分子間の関係を決めることができる段階まで広がり；これは、機能プロテオミクスと呼ばれている。

タンパク質マイクロアレイは、最も一般的には、例えば、小型化したELISA形式においてタンパク質の発現レベルを監視するのに使用することができる固定化した抗体を収集したものという形を取っている（Schweitzerら 2002）。タンパク質マイクロアレイを使用して、固定化したタンパク質の存在量を単に分析するだけでなく、その機能を分析することは、ある程度注目されており、最近の例として、一組の酵母キナーゼ内の基質特異性の分析（Zhuら 2000）と、酵母タンパク質のプロテオーム−スケールで収集したものの中にあるカルモジュリン結合タンパク質及びリン脂質結合タンパク質の同定（Zhuら 2001）がある。

現在まで、タンパク質マイクロアレイは、質量分析によってではなく、高感度化学発光（enhanced chemo-luminescense，ECL）、蛍光標識もしくは放射性標識によって、又は抗体による検出システムによって分析されている。従って、タンパク質マイクロアレイを分析する現在の方法は、適切な標識リガンドの有効性によって制限されている。使用に成功している標識リガンドの例として、蛍光標識抗体と放射標識又は蛍光標識した小分子のリガンドが挙げられる。しかしながら、多くの場合、分子量が1000Daより小さい薬剤様小分子にとって、放射標識も蛍光標識も望ましくなく；放射標識は、健康及び安全の理由のために不評であり、フルオロフォアを小分子内に導入すると、予測できない様態で構造活性のプロファイルが著しく混乱する。従って、マイクロアレイの形式で相互作用を検出する標識のない方法は大きな前進となり、その方法によって、標識化合物が利用できないか、又は標識によってリガンドの性質が変化する範囲まで適用範囲が大幅に広がることは明らかである。これは、特に、薬剤発見の初期段階において有用であり、該初期段階では、多数の化合物をタンパク質に対してスクリーニングする。

現在利用できる標識のない検出方法のうち、質量分析は、所与のリガンドの存在のみならず、同一性も決定することが可能であるという独特の利点を有している。しかしながら、MALDI MSに適合するタンパク質マイクロアレイの開発は、タンパク質マイクロアレイを形成する既存の方法がMALDIターゲット上へ容易に移行しないので、複雑である。このことが問題である理由はいくつかあり、特にプローブ表面の特殊化した性質と、反応緩衝液中に存在する塩が検出方法を妨害する可能性である。さらに、本技術分野で既知であるMALDIの手法は、検体のイオン化を促進するために、典型的には、酸性エネルギー吸収分子又は“マトリックス”と水溶性の検体の共結晶化を必要とする（KarasとHillenkamp，1988）。MALDIにおいて検体とマトリックスを共結晶化する方法は、本技術分野において既知であり、典型的には、結晶化の進行が不均質なものとなり、異なる量のマトリックスと検体をそれぞれ含む、別個の、空間的に分離した結晶を生成する。結果として、個々の結晶が、MALDIによって分析するのに不十分な検体を含んでいるのが多くの場合見られる。言いかえると、このことによって、良い検体のシグナルを得るために、所与のターゲット領域内の多数の（すなわち、10−100又はそれ以上の）別個の位置のサンプルを取るアナライザが必要となり；これは、“スウィート・スポット（sweet spot）の探索”とも呼ばれ、本技術分野で既知であるMALDI MSによる方法によって通常取り調べることができる個々のターゲット領域の大きさに著しく低い制限を課す。実際に、ターゲット領域の面積は、一般的にはせいぜい0.5mm²である。

MALDI MSに適合するタンパク質マイクロアレイを生成するためには、ターゲット領域の小型化と配列したタンパク質の機能分析を可能にする、上述した先行技術の欠点を解決することが必要である。

質量分析用の検体のアフィニティー・キャプチャーの例が現在までにいくつか述べられている。しかしながら、これらの例は、MALDIターゲットの表面上に固定化した、単一の抗体、ニトリロ酢酸、陰イオン交換体もしくは陽イオン交換体の使用、又はビーズ系のアフィニティー・キャプチャー試薬の使用に関するものである（Hutchens とYip，1993，BrockmanとOrlando 1995，Wangら 2001）。しかしながら、これらの方法はすべて、１又はそれ以上の以下に記載する制限を受け、該制限は：
ａ）検体又はおとりをプローブ上へアミンによりカップリングするので、一部又はすべての生物活性を損失する；
ｂ）検体と表面との特異性が低く、そのため、いくつかの検体が表面に非特異的に結合する（例えば、イオン交換の表面）；
ｃ）検体の表面への親和性が低く、そのため、どの洗浄手段においても表面から検体が浸出する（例えば、イオン交換表面及びニトリロ酢酸の表面）；
ｄ）アフィニティー・キャプチャーの表面が非特異的なタンパク質への抵抗性を欠き、そのため、タンパク質マイクロアレイの分析を妨害する非特異的なタンパク質の結合が高レベルで生じる；
ｅ）限られた数のアフィニティー・キャプチャー・タンパク質しか利用できない、
というものである。

従って、既存の方法では、マイクロアレイにしたタンパク質の機能分析に適したMALDI MSに適合するマイクロアレイの形で多数の様々な精製タンパク質の固定化をすることができない。

本発明の主要な目的は、レーザー脱離／イオン化質量分析、特にマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（matrix assisted laser desorption/ionisation，MALDI）を用いて取り調べることができる、タンパク質マイクロアレイ（アレイではない）を製造するためのプローブの開発である。

本発明は、また、レーザー脱離／イオン化質量分析、特にマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（matrix assisted laser desorption/ionisation，MALDI）を用いて取り調べることができる、そのようなプローブ、タンパク質マイクロアレイの製造をもたらす方法、並びにそのようなプローブ又はタンパク質マイクロアレイを分析する方法にも関する。

そのようなプローブの開発につながる大きな進展の一部は、本出願人の同時係属出願である国際公開第01/57198号に記載されており、従って、本明細書では深く取り扱わない。

MALDI MSに適合するタンパク質マイクロアレイを生成するためには、ターゲット領域の小型化と配列したタンパク質の機能分析を可能にする、上述した先行技術の欠点を解決することが必要とする。

本明細書に記載されているプローブは、レーザー脱離／イオン化質量分析、例えばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（matrix assisted laser desorption/ionisation，MALDI）による分析においてターゲットの役割を果たすことが可能な支持体である。前記プローブは、検体をガス状のイオンへ変換して分析を可能にするように、検体、例えばタンパク質をそのような処理過程の間保有し、先行技術のレーザー脱離／イオン化・飛行時間（time-of-flight，TOF）質量分析計で見られるイオン光学アセンブリのリペラ・レンズ（repeller lens）と相互に作用する。例えば、本発明のプローブを、本技術分野で既知であるMALDI分析用のターゲットから得てもよく、該ターゲットは、高親和性のタンパク質結合部分、例えばストレプトアビジン、アビジン又はニュートラビジン（neutravidin）分子が、後の分析のために、ビオチニル化したタンパク質を結合するプローブ表面上に存在するように処理されている。例えば、従来のガラス又は金のMALDIターゲットを使用してもよい。

本明細書に記載されているマイクロアレイとは、個々のターゲット領域、すなわちレーザーによって探索される個々の領域の大きさが、マイクロメーター又はそれより下のオーダーであるアレイである。一方、大きさの上端である約1000ミクロメータの直径において、それらは肉眼で見ることができ、前記大きさの下端では、個々のターゲット領域は、肉眼によって明確に見分けられない。

前記アレイを、典型的にはいくつかの行と列を有するマトリックスに配列する。一般的に、プローブ表面上にこれらの別個の領域が高密度であることが、ハイスループット・スクリーニングを容易にするので望ましいが、個々のターゲット領域の数は、何をスクリーニングするかによって決まる。典型的には、プローブは、少なくとも10個以上、より好ましくは少なくとも100個以上、より好ましくは少なくとも1000個以上、10,000個又はそれ以上の、そのプローブ上に製造されたターゲット領域を有する（典型的には、プローブ表面は、プローブ全体を使用する必要性はないが、約10,000mm²の面積を有し、Brukerのプローブは、10292mm²の面積を有しており、マイクロアレイを、そのプローブ上における１種又はそれ以上のマトリックスに加えることができる）。所与のマトリックスにおける実際の密度は、個々のターゲット領域（典型的には、スポットとしてプリントされている）の大きさと隣接したスポット間の間隔によって決まる。従って、個々のターゲット領域は、典型的には、どのマトリックス内でも、1mm²当たりの個々のターゲット領域が１を超えるという密度で存在する。

検体捕捉部分は、スクリーニングする成分を捕捉する部分である。例えば、小分子が表面に結合するアレイを有し、したがって、タンパク質をスクリーニングすることは可能であるが、捕捉する成分は、本質的に違いはないが、タンパク質であるのが好ましい。

本明細書で使用するタンパク質という用語は、タンパク質全体及びそのサブユニットもしくはドメインを含めて用いられる。

本明細書で使用する融合タンパク質は、タグ、例えば、その融合タンパク質に付けるビオチン化コンセンサス配列又はフレオマイシン／ゼオシン耐性結合タンパク質を有するタンパク質のことを指すのに用いられる。

リンカー分子は、その名の通りに機能する分子である。それは、異なる分子の間に架橋を形成させる官能基を有する分子である。

本発明の第一の態様によれば、レーザー脱離／イオン化質量分析計と共に使用するために、支持体上に電気伝導性のターゲット表面を有する該支持体を含むプローブが提供され、前記ターゲット表面は、１種又はそれ以上の検体捕捉部分を示す複数の別個のターゲット領域を有するマイクロアレイを含むことを特徴とする。

そのようなプローブを開発することによって、ハイスループット・スクリーニングを行うことが可能になり、複数のタンパク質の相互作用を調べることが可能になる。

MALDIターゲット上に形成したタンパク質アレイの“小型化”を可能にするもう一つの重要な成果は、国際公開第01/57198号に記載されている本出願人のCOVET技術を用いることによる。簡単に言うと、この技術を用いることで、cDNAライブラリー発現タンパク質から作り出すことができ、該cDNAライブラリー発現タンパク質は、高い親和性で、かつマイクロアレイ表面上に特定の方向で該タンパク質を捕捉するために使用することができる“配列タグ”を保有する。このことによって、最初に、表面からのタンパク質の浸出を回避するように、タンパク質、例えばタンパク質ライブラリーを安定して固定化することができ、第二に、融合タンパク質を表面上に方向付けて固定化することによって、最大限の生物活性が確保される。

本発明のさらにもう一つの重要な態様は、現在のタンパク質マイクロアレイと比較した場合、電気伝導性の表面を有するそのようなプローブを提供することである。プローブがMALDI MS分析を受ける場合、半導体の表面を含むこのような表面は重要である。支持体を、全体として電気伝導性の材料（本明細書において、この用語は、半導体材料を含めて用いられる）で作成したとき、任意の適切な金属、例えば銀、白金、イリジウム、ウォルフラム、銅、コバルト、ニッケル及び鉄、若しくはそれらの混合物、又は半導体、例えばケイ素、グラファイト若しくはゲルマニウムを用いることができるが、硬質の支持体、例えばガラスを、例えば金などの電気伝導性材料で被覆することが好ましい。

プローブ又はタンパク質マイクロアレイを、例えば標準サイズの顕微鏡スライドグラス上に製造した場合、それをアダプターに載せることができ、該アダプターは、それを質量分析計に運ぶものである。そのようなアダプターは、本出願人の同時係属出願である英国特許出願216387.1号に記載されている。

さらに重要な成果は、本明細書に記載されている特定の用途と関係なく見られるものであり、本出願人が、非特異的なタンパク質の結合によって生じる問題を解決するという点である。本出願人は、プローブ表面上への非特異的なタンパク質の結合に抵抗する層を提供することによってこの特有の問題を解決した。より詳細には、マイクロアレイの表面を、タンパク質を忌避する分子の層を封入することによって修飾する。例えばポリエチレングリコール含むこのようなタンパク質忌避分子を、例えば、ガラス又は金の表面に容易に結合し、そのアミノ又はカルボキシルの側鎖を用いて、それらがプローブ表面から手を伸ばすようにタンパク質忌避分子を結合することができるポリアミノ酸などのリンカーを介してプローブ表面に結合させてもよい。当業者であれば、他の機能を有する分子を用いることができることを理解できる。検体結合部分を、それが表面から伸びる位置に組み込むことが好ましい。好ましいタンパク質結合部分として、例えば、ビオチン、ビオチン−ニュートラビジン（neutravidin）及びブレオマイシンが挙げられ、これらとその他の部分を、リンカー分子上のこれらの官能基を介して、及び／又はタンパク質忌避分子上の官能基を介してのいずれかによって層内へ組み込むことができる。典型的には、アフィニティー・キャプチャー部分を、前記タンパク質忌避分子と比較して小さい比率（典型的には20％以下）で組み込む。

このようにして、本出願人は、タンパク質捕捉部分を、均一な、空間的に定められた配列でのみならず、特異的な様式で親和性が高い結合を可能にする方法で導入することができた。生じた表面は、プローブ上の生物高分子の捕捉に対する選択性を備え、該表面では、誘導体化していないガラス又は金属の表面上に通常見られる形式である非特異的な結合が減少し、さらに、捕捉した生物高分子の均一な分布と一様な方向がもたらされる。

非特異的なタンパク質を忌避する役割を果たす成分分子として、一般的に、本質的に親水性である分子が挙げられる。そのような分子として、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリウレタン及びポリアクリルアミドなどの重合体、並びに自己組織化膜（self assembled monolayers，SAM）が挙げられる。前記重合体は、１又はそれ以上の官能基の側鎖を含むことが好ましく、該官能基の側鎖を介して、タンパク質捕捉部分を付着させることができる。ポリエチレングリコールの場合、官能基はヒドロキシル基である。例えばSAMの場合のように、非特異的なタンパク質を忌避する役割を果たす分子を表面へ直接結合させてもよく、又はリンカーを介してそれを付着させてもよい。リンカーは、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸又はそれらの混合物などのポリアミノ酸であるのが特に好ましい。これらは、アミノ側鎖又はカルボキシ側鎖を有し、該側鎖を介して、非特異的なタンパク質を忌避する役割を果たす分子を付着させることができ、さらに該側鎖を用いて、タンパク質捕捉部分を付着させることができる。もう一つの方法として、又はそれに加えて、タンパク質捕捉部分を、非特異的なタンパク質を忌避する役割を果たす成分分子を介して付着させることができる。図７には、そのような分子の結合が図示されており、ランダムなカップリングを生じる現在の抗体結合技術を用いて達成されたものと、この規則正しいカップリングによって達成することができる、決められた方向を対比している。

好ましい実施態様において、プローブは、タンパク質捕捉部分であるとき、ビオチン結合剤、例えば、ニュートラビジン（neutravidin）、アビジン若しくはストレプトアビジン、又はブレオマイシン耐性タンパク質結合剤、例えばブレオマイシンのどちらかを有する。前記タンパク質は、プローブに結合して、高親和性のタグ、例えばビオチン又はゼオシン耐性タンパク質（zeocin resistant protein、ZRP）を捕捉表面上に発現する融合タンパク質を含む、複数の細菌、酵母、sf9又は哺乳類の細胞溶解物をプリントすることによって、タンパク質マイクロアレイを作成する。タンパク質は、cDNAライブラリーの発現から得られ、各個々のクローンのＣ末端に、及び／又はＮ末端上にコンセンサス配列を用いてタグを付け、該コンセンサス配列は、通常ならタンパク質を忌避する分子の存在下でさえも、タンパク質を高親和性で認識することができるようにするものである。組換えて、タグを付けたタンパク質のみ捕捉表面を認識することができ、前記溶解物由来の他のタンパク質は、タンパク質を忌避する表面に結合せず、層に存在するタンパク質結合部分に対して高い親和性を有していないので、洗い流すことができる。

本発明の別の態様は、所与の細胞又は組織のタイプの完全なタンパク質補体、又はその重要な断片を、本発明によるプローブ又はタンパク質マイクロアレイを用いて調査することである。

本発明の更なる態様によれば、レーザー脱離／イオン化質量分析計と共に使用するために、タンパク質マイクロアレイを製造する方法が提供され、該方法は、本発明のプローブを用意し、別個のターゲット領域内のタンパク質捕捉部分に位置を合わせて、タンパク質を沈着させることを含む

もう一つの態様によれば、本発明は、前記プローブとタンパク質マイクロアレイを利用して、様々な反応を分析し、かつスクリーニングするものである。

レーザー脱離／イオン化質量分析による分析方法の一つは、
ａ）本発明のプローブを用意する工程と；
ｂ）前記プローブを、１種又はそれ以上のタンパク質と接触させる工程と；
ｃ）前記プローブの表面上におけるタンパク質のレーザー脱離／イオン化質量分析を行う工程を含む。

一つの実施態様において、前記方法は、工程ｂ）とｃ）の間に、洗浄することによって前記プローブから非結合分子を除去する工程をさらに含む。

別の実施態様では、１種又はそれ以上のタンパク質が、タンパク質の混合物中に含まれている。

さらにもう一つの実施態様において、該実施態様は、前記プローブの表面上のタンパク質を同定する方法であって、該方法は、
ｄ）前記タンパク質分子の質量を測定する工程と；
ｅ）さらに、プローブ又はプローブ表面上で前記タンパク質の反復したサンプルの消化を行う工程と；
ｆ）工程ｅ）より生じたペプチドのレーザー脱離／イオン化質量分析を行って、前記タンパク質を同定する工程をさらに含む。

別の実施態様において、前記プローブ表面上のタンパク質の機能及び前記タンパク質と相互作用する分子を分析する方法があり、該方法は、
ｃ）前記プローブ表面上のタンパク質を、１種又はそれ以上の試験分子と接触させる工程と；
ｄ）前記プローブ表面から結合していない試験分子を除去する工程と；
ｅ）前記タンパク質、及び前記タンパク質との相互作用を介して前記プローブ表面上に特異的に保持されている任意の分子のレーザー脱離／イオン化質量分析を行って、前記タンパク質及び／又は試験分子の同一性を決定する工程をさらに含む。

前記試験分子は、小分子、タンパク質又は核酸、例えばDNA若しくはRNAであってもよい。

もう一つの実施態様において、前記プローブ表面上のタンパク質及び前記タンパク質と相互作用する分子の機能を分析する方法があり、該方法は、
ｃ）前記プローブ表面上のタンパク質を、１種又はそれ以上の試験基質と接触させる工程と；
ｄ）前記タンパク質及び試験基質のレーザー脱離／イオン化質量分析を行って、前記タンパク質による前記試験基質の触媒反応の生成物の存在及び／又は同一性を決定する工程という他の及び／又は追加の工程を含む。

一つの実施態様において、高親和性のタグを発現するようにクローニングされているcDNAライブラリーを発現し、各クローンを発現した後、タグを付けたライブラリータンパク質をタンパク質親和性部分によって捕捉し、マイクロアレイ上で乾燥し、生物由来又は化学由来のタンパク質分解物質で薄く覆い、切断して断片にし、グリコールなどの蒸発しない物質を加えた非水溶性溶媒中で製造したエネルギー吸収マトリックス分子で薄く覆う。前記エネルギー吸収分子を、新しい剤型で、例えば数ナノリットルの容積でタンパク質マイクロアレイに塗布して、微結晶の連続した層を形成する。

エネルギー吸収分子をこのような方法で使用することは、本発明のさらに別の、かつ独立した態様である。

本発明のもう一つの態様によれば、エネルギー吸収マトリックス分子、非水溶性溶媒及び蒸発しない物質を含む溶液が提供される。

本発明のもう一つの態様によれば、タンパク質を変性させ、従って、表面上において、結合していない状態にある変性したタンパク質を残すタンパク質捕捉部分から該タンパク質を解放する方法で、エネルギー吸収分子を沈着させる本発明のプローブを分析する方法が提供される。

前記エネルギー吸収分子は、タンパク質捕捉部分及び捕捉したタンパク質に位置を合わせて、別個の場所に結晶の均一な層を形成する。

前記結晶の均一な層は、個々の結晶が、100倍の倍率で目に見えず、目に見える隙間が全くないほど十分に連続している。その層は、100倍の倍率で結晶の大きさに明らかな差異が全くないほど十分に一様な奥行きも有している。

前記エネルギー吸収分子を、非水溶性溶媒中で表面上に沈着させ、非水溶性溶媒を蒸発して除く。前記非水溶性溶媒は、例えば、アセトン又はブタノンなどの有機溶媒であるのが好ましい。前記非水溶性溶媒は、前記エネルギー吸収分子の結晶化が前記プローブ上で生じるように蒸発の割合を制御する調節剤を含むことが好ましい。適した調節剤として、グリセロール、ポリエチレングリコール及びチオグリセロールが挙げられる。前記エネルギー吸収分子を、80-99.9％、好ましくは99％の有機溶媒、例えばアセトンと、20-0.1％、好ましくは1％の調節剤、例えばグリセロールの混合物中で沈着させるのが好ましい。典型的なエネルギー吸収分子として、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、ゲンチシン酸、ニフィジン（nifidine）、コハク酸、１，８，９−アントラセントリオール、３−インドールアクリル酸、２−（ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、４−ニトロアニリン及びそれらの組み合わせの結晶が挙げられる。

前記エネルギー吸収分子を、タンパク質に位置を合わせて沈着させ、各タンパク質のスポットを、スポットが同様の大きさである前記エネルギー吸収分子で薄く覆うのが好ましい。

前記タンパク質マイクロアレイのもう一つの用途は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸及びタンパク質小分子の相互作用の質量分析による平行分析である。

本発明のさらに別の態様は、プローブ上で小分子化合物のライブラリーをスクリーニングして、プロテオームから得られるタンパク質への薬剤様小分子の結合を検出するその実用性であり、前記小分子は、放射標識又は蛍光標識などの標識を有さない。

マイクロアレイ上で高密度の個々のサンプルを得るためには、前記エネルギー吸収分子を、表面上に微結晶状に配置する必要がある。マトリックスは、結晶の間に大きな隙間がない平坦な結晶の均一な層を形成し、非常に少ない量でマイクロアレイ上に沈着することができる。

水溶性の溶媒内でマトリックスと検体を共結晶化する先行技術と対照的に、本出願人は、二つの別個の工程を使用し、該二つの別個の工程では、最初にタンパク質を水溶性の溶媒中で沈着させ、次に、エネルギー吸収分子を、プローブ上で非水溶性溶媒から結晶化するように沈着させる。これは、タンパク質を、生物学的な形態で沈着させるという利点を有している。しかしながら、非水溶性溶媒を用いてエネルギー吸収分子を送達することによって、微結晶の均一な層を形成させる。これは、二つの利点を有している。第一に、均一な層を形成することは、前記均一な層は、エネルギー吸収分子の存在下で、タンパク質を保証するので、スウィート・スポット（sweet spot）を探索する必要がないことを意味しており、第二に、前記層の均等な性質により、より正確な測定がもたらされる。

本発明の別の態様は、マイクロアレイ上に存在するタンパク質に結合する小分子のオートメーション化した分析である。データベース内に保存されている小分子イオンの分子量を、化合物ライブラリーの測定された分子量と比較し、その結果、前記小分子とアレイ内のタンパク質間の関係を決めることができる。

本発明の種々の態様について、以下の図及び実施例を参照しながら説明するが、これらは例示に過ぎない。

図１ａは、本発明の一態様の結晶表面を、先行技術の方法を実施することで得られたものと比較した、Bruker Autoflex質量分析計のフレックスコントロール（flexcontrol）・ツールから得られた６つのスクリーンショットを示す。前記６つのスクリーンショットは、異なる２つの方法で製造した３種の異なるマトリックスを示す。
左側は（上から下に向かって）：
i） α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸と；
ii）シナピン酸と；
iii）ゲンチシン酸である。
すべて、99％アセトン、１％グリセロール（容積／容積）の溶液中で製造した。
右側は（上から下に向かって）、上記と同じマトリックスであり、すなわち
iv）α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸と；
v）シナピン酸と；
vi）ゲンチシン酸である。
これらは、先行技術のように水溶性の溶媒で製造した。

図１ｂは、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の結晶の顕微鏡写真を示す。マトリックスを、99％アセトン、１％グリセロールの溶液に溶解し、金で被覆したスライド上へ、アフィニティー・キャプチャーの表面を用いて配列した。プリントする密度は、スポットの中心からスポットの中心まで、562マイクロメーターである。

図２ａは、アフィニティー・キャプチャーの表面上での1500フェムトグラムのインシュリン−ビオチンの捕捉を示すタンパク質マイクロアレイから得られたマススペクトルを示す。ビオチン化の程度の違いにより、３つのインシュリン−ビオチンのピークが見られる。３個までのビオチン分子が、6000ダルトンの範囲内でインシュリン上に見られた。２つの別のピークが、7300ダルトンと14600ダルトンにおいて見られ、ニュートラビジン（Neutravidin）の[MH]⁺と[MH]²⁺として割り当てられた。

図２ｂは、アフィニティー・キャプチャー表面上での15フェムトグラムのインシュリン−ビオチンの捕捉を示すタンパク質マイクロアレイから得られたマススペクトルを示す。２つのインシュリン−ビオチンのピークが、6000ダルトンの範囲内で見られる。２つの別のピークが、7300ダルトンと14600ダルトンにおいて見られ、ニュートラビジン（Neutravidin）の[MH]⁺と[MH]²⁺として割り当てられた。

図３ａは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）アフィニティー・キャプチャーの表面上での質量分析計によるシクロスポリンの検出を示す。シクロスポリンを、1205ダルトンにおいて検出し、ニュートラビジン（Neutravidin）の[MH]⁺と[MH]²⁺のピークは、7310と14652ダルトンに存在した。

図３ｂは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上での質量分析計によるケトコナゾールの検出を示す。ケトコナゾールを、534ダルトンにおいて検出し、ニュートラビジン（Neutravidin）の[MH]⁺と[MH]²⁺のピークは、7225と14501ダルトンに存在していた。

図３ｃは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上での質量分析計によるキニジンの検出を示す。キニジンを、327ダルトンにおいて検出し、ニュートラビジン（Neutravidin）の[MH]⁺と[MH]²⁺のピークは、7310と14652ダルトンに存在した。

図４ａは、ADP及びATPの検出を示す。pH7.4の25mM重炭酸アンモニウム内で、ADP、クレアチンリン酸及びクレアチンリン酸キナーゼからATPを酵素的に合成した。[ADP]^-を、427.6ダルトンにおいて検出し、[ADP+Na]^-を、449.6ダルトンにおいて検出した。クレアチンリン酸キナーゼの反応の生成物を、507.6、529.6、551.6及び573.8において検出し、それぞれ、[ATP]^-並びに３種のATPのナトリウム付加体である[ATP Na]^-、[ATP Na₂]^-及び[ATP Na₃]^-の予想される分子量と良く適合していた。基質であるADPもしくはクレアチンリン酸又は酵素であるクレアチンリン酸キナーゼのどれか一つを除外したコントロールの反応は、ATPのピークを示さなかった。

図４ｂは、ジベンジルフルオレシン（dibenzylfluorescine，DBF）の、ヒトのチトクロームp450による酸化生成物を検出するMALDIマススペクトルを示す。チトクロームP450でDBFを酸化し、準安定性の酸化生成物を530ダルトンにおいて検出した。酸化ジベンジルフルオレシン更なる分子イオンを、２つのモノベンジルフルオレシン誘導体を示す477及び461ダルトンにおいて検出した。

図５は、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）で被覆した金のターゲット上にあるビオチン化した72ｋDaのポリペプチドの捕捉を示す。前記タンパク質を、200マイクロリットルのEsherichia coli培養液内で発現し、細菌を、リゾチームとDNaseで処理して溶解した。生じた細菌溶解物を、アフィニティー・キャプチャーの表面上にスポットし、4時間インキュベートした。次に、前記プローブを、1mM Tris-HCl pH7.5，0.1％Triton溶液で洗浄し、続いて、脱塩と界面活性剤の除去のため、1mM Tris-HCl pH7.5溶液で２回洗浄した。次に、前記プローブ・ターゲットを窒素下で乾燥し、エネルギー吸収マトリックス（アセトンに溶解したα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）で薄く覆った。低いレーザー・パワーで、遅延抽出技術（delayed extraction technique）を用いて、リニア・モードでマススペクトルを得た。

図６は、Escherichia coliで発現した遺伝子組換えSchistosoma mansoniグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＢＣＣＰ融合タンパク質の同定を示す。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを、プローブ上の粗製の細菌溶解物から、アフィニティー・キャプチャー重合体を用いて捕捉した。前記捕捉した検体をプローブ上で洗浄し、消化し、アセトンに溶解したエネルギー吸収マトリックスで薄く覆い、MALDI TOF質量分析計によって分析した。生じたペプチドの質量を、タンパク質のフィンガープリント分析に用い、融合タンパク質を、Schistosoma japonicum由来グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとして同定した。

図７は、プローブ、例えばMALDIターゲット、マイクロプレート又は顕微鏡スライドグラス上でのタンパク質のランダムなカップリング及び方向付けられたカップリングを示す。

図８には、ポリ−Ｌ−リジン・ポリエチレングリコール・ビオチン重合体（PEG−PLL−ビオチン）のバイオセンサーへの結合が示されている。結合の後、ニュートラビジン（neutravidin）及びビオチンのタグを付けたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST−BCCP）を含むE. coli由来のタンパク質溶解物を各工程の洗浄期間後に表面に添加した。

図９ａ及び図９ｂには、異なった形の固定化したレクチン上の糖タンパク質フェチュインのマススペクトルが示されている。（ａ）ビオチン化ピーナッツ・レクチンを、糖タンパク質フェチュインを捕捉するために、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（neutravidin）の表面上に固定化した。レクチンの[M+H]⁺、[2M+H]⁺の分子イオンピークが25774及び51461ダルトンにおいて見られ、ニュートラビジン（neutravidin）の[M+H]⁺の分子イオンは、14300ダルトンにおいて見られた。前記糖タンパク質の分子イオンから成るピークは、40136及び42731ダルトンにおいて見られた。（ｂ）ビオチン化小麦胚芽アグルチニンを、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（neutravidin）の表面上に固定化し、糖タンパク質フェチュインを特異的に捕捉するために用いた。レクチンの[M+H]⁺、[2M+H]⁺の分子イオンが17709及び35584ダルトンにおいて見られ、ニュートラビジン（neutravidin）の[M+H]⁺、[2M+H]⁺の分子イオンは、14300及び28600ダルトンにおいて見られた。前記糖タンパク質フェチュインの[M+H]⁺の分子イオンは、44163ダルトンにおいて見られ、25943ダルトン及び32158ダルトンにおける２つのピークは、前記糖タンパク質に特有のものであり、最もあり得る崩壊生成物を表す。

図１０ａは、ローダミン−ラクトース誘導体のArachis hypogea由来レクチンへの特異的な結合を示す。（ａ）PEG−PLL−ニュートラビジン（neutravidin）Arachis hypogeaの表面を、1mMのラクトース−ローダミン抱合体で薄く覆い、1mMのTris-HCl.pH7.5で３回洗浄し、アセトンに溶解した、エネルギーを吸収するα−シアノヒドロキシ桂皮酸の溶液で薄く覆った。その後のMALDI MS分析では、ラクトース−ローダミンの[MH]⁺に適合する830.32ダルトンの分子イオンが示された。

図１０ｂは、実験において用いるラクトース−ローダミン抱合体のMALDI MS分析を示す。前記ラクトース−ローダミンの分子イオンに加えて、834ダルトンにおいてナトリウム付加体の分子イオンも検出した。

図１０ｃにおいて、固定化したFK506結合タンパク質を有するPEG−PLL−ニュートラビジン（neutravidin）の表面を、1mMのラクトース−ローダミン抱合体で薄く覆い、1mMのTris-HCl.pH7.5で３回洗浄し、アセトンに溶解したエネルギー吸収マトリックス分子で薄く覆った。MALDI MS分析では、ラクトース−ローダミンの分子イオンは全く示されなかった。

表１は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ消化のタンパク質フィンガープリント分析によって３種のタンパク質に割り当てることができるペプチドの分子量を示す。前記ペプチドの分子量を用いて、質量精度が50ppmであるMASCOTサーチ・エンジンを用いるNCBI nrデータベースを検索した。一致したタンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、アビジン及びトリプシンであった。

１．本発明の一態様によるプローブの製造。
１．１金で被覆したスライドグラス及びMALDIプローブの清浄。
金で被覆した顕微鏡スライドグラスを含むプローブ又はMALDIプローブを、アセトン、アセトニトリル、２回蒸留した水の順に洗浄することで使用前に完全に清浄にし、窒素下で乾燥した。

１．２タンパク質結合部分を組み込むタンパク質が結合しない層の製造及び沈着
１．２．１ PEG−PLL誘導体の合成
PEG−PLL−ビオチン：
平均サイズが17-30ｋDaである100mgのポリ−Ｌ−リジン（Sigma，Dorest，UK）を、109mgのmPEG-SPA（Shearwater Corporation，Huntsville，Alabama）及び1.1mgのビオチンPEG-CO-NHSと、100mMの炭酸緩衝液pH9中で30分間反応させた。1mMのTris-HCl pH7.5中で一晩透析することによって反応を終了した。この反応から生じた生成物を、1％PEG−PLL−ビオチン（1％PEG誘導体がビオチン頭部基を含んでいる）と呼び、その他に、リガンドの割合が小さいものをいくつか合成した（1％、2％、10％及び20％）。

PEG−PLL−ブレオマイシン：
10mgのブレオマイシンＢ６（Calbiochem）を、1mlのアセトンに溶解し、7.5mgのEDCとNHSをそれぞれ添加した。反応のpHを、HClでpH3に調整した。別の反応では、99mgのポリ−Ｌ−リジンを、11mgのDVS-PEG-CO-NHS及び100mgのmPEG-CO-NHSと、100mMの炭酸緩衝液 pH9中で反応させた。20分後、両反応を混合し、必要なときにはpHをpH9に調整した。多量の1mMのTris-HCl pH7.5緩衝液に対して一晩透析することによってPEG−PLL−ブレオマイシンの合成を完了した。この合成の生成物を、10％PEG−PLL−ブレオマイシンと呼び、これは、約10％のPEG側鎖がブレオマイシンと置換されていることを示している。

新たに製造したアフィニティー・キャプチャー重合体、例えば1％PEG−PLL−ビオチン又は10％PEG−PLL−ブレオマイシンＢ６をプローブ上へ沈着させた。次に、表面を、Nescoフィルムで覆って、タンパク質捕捉部分をプローブの上に均一に分散させた。30分後、プローブを、1mMのTris-HCl pH7.5で洗浄し、窒素下で乾燥した。PEG−PLL−ブレオマイシンＢ６の表面は使える状態であった。

１．３他のタンパク質捕捉部分の必要に応じた添加
前記PLL−PEG−ビオチンは、0.5mg/mlのニュートラビジン（neutravidin）を、湿度の高い部屋内で、室温で１時間、添加することによって、ビオチンに結合したニュートラビジン（neutravidin）分子を有する。次に、プローブを洗浄緩衝液で濯ぎ、窒素下で乾燥する前に、十分な脱塩緩衝液で２回洗浄した。前記表面は、適切なアフィニティー・タグ、例えばビオチン又はフレオマイシン／ゼオシン耐性結合タンパク質を持つ高分子の高い特異性を有するアフィニティー・キャプチャーとしていつでも使用することができる。

２．本発明の一態様によるタンパク質マイクロアレイの製造。
２．１タグを付けたタンパク質の製造
心臓、肝臓又は胸部の組織から精製したmRNAを、既知の技術を用いてcDNAに翻訳した。前記cDNAの３’末端を、DNAの一本鎖を消化する３’−５’一本鎖エキソヌクレアーゼに接触させた。時間、温度及び塩濃度などのパラメータを操作することによって反応を制御した。次に、残存するDNAの一本鎖領域を、グリーン・ビーンズ・ヌクレア−ゼなどの一本鎖ヌクレア−ゼによって除去して平滑末端を残した。次に、生じた切断二本鎖DNAを、cDNA合成の際に導入したcDNAの５’末端部位を有するレア−カット制限酵素（rare-cutting restriction enzyme）で消化した。次に、生じたcDNA断片を、溶解度のマーカーをコードするDNAタグにライゲーションした。この事例では、このライゲーションは、前記cDNA断片を、タグの３’をcDNA断片に提供するベクターにライゲーションすることで成し遂げられた。転写は、クローニングしたcDNAの上流から開始し、前記cDNAと下流のタグを通って進行する。インフレームに、及び終止コドンを欠いてライゲーションされた場合、生じた翻訳生成物は、融合タンパク質の溶解度を知らせるタグと融合した前記クローニングしたcDNA由来のポリペプチド配列から構成される。この技術は、単一のcDNAとコレクションの両方に使用することができる。

本明細書に記載したベクターの種類は、ビオチンカルボキシル・キャリアタンパク質（Biotin Carboxyl Carrier Protein，BCCP）及びmycタグと融合したゼオシン結合タンパク質（zeocin binding protein，ZBP）をコードするタグを含む。本出願人は、BCCPのビオチン化とゼオシンに対する耐性を与えるZBPの能力の両方が融合タンパク質の溶解度に依存していることを明らかにした。さらに、クローニングしたcDNAのすぐ上流には、FLAG等の小さいタグがコードされている。生じた発現融合タンパク質は、品質管理の目的で、Ｎ末端とＣ末端にタグを含む。生じた修飾したcDNAライブラリーを、E.coliに形質転換し、ゼオシンもしくは類似物質のいずれかにより選択するか、又はBCCPのビオチン化について詳しく調べると、可溶型融合タンパク質を発現するポジティブ・クローンが同定される。

２．２タンパク質の結合
一実験において、ヒト肝臓cDNAがこの方法論の対象となり、生じたライブラリーをE.coliで発現した。可溶型融合タンパク質を発現する約5,000のクローンを、クローン的に単離し、個別に発酵させた。前記細胞を溶解し、生じた可溶性のビオチン化タンパク質を、ストレプトアビジンで被覆した表面上で、単一工程で捕捉し、精製した。数千のメンバーから構成されるタンパク質マイクロアレイを製造し、これは、回収の時の発現した肝臓の補体を示すものである。

３．本発明の一態様によるタンパク質アレイの分析。
３．１エネルギー吸収分子の結晶の製造
タンパク質マイクロアレイを薄く覆うエネルギー吸収分子の溶液を、以下に示すようにして製造した。i）からiii）までとvii）は、本発明の一態様による調整物であるが、iv）からvi）までは、先行技術の方法により製造した比較調整物である。

i）α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（Sigma，Dorset，UK）の飽和量を、アセトンに溶解し、300ナノリットルの溶液を用いて検体を薄く覆った。

ii）飽和量のシナピン酸（Sigma，Dorset，UK）をアセトンに溶解し、300ナノリットルの溶液を用いて検体を薄く覆った。

iii）飽和量のゲンチシン酸（Sigma，Dorset，UK）をアセトンに溶解し、300ナノリットルの溶液を用いて検体を薄く覆った。

iv）10mg/mlのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（Sigma，Dorset，UK）を、本技術分野で知られているように、50％（容積／容積）アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸に溶解し、300ナノリットルの溶液を用いてプローブ上の検体を薄く覆った。

v）飽和量のシナピン酸（Sigma，Dorset，UK）を、ddH₂Oに溶解し、300ナノリットルの溶液を用いて検体を薄く覆った。

vi）飽和量のゲンチシン酸（Sigma，Dorset，UK）を、ddH₂Oに溶解し、300ナノリットルの溶液を用いて検体を薄く覆った。

vii）飽和量のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（Sigma，Dorset，UK）を、99％アセトン（容積／容積）、1％グリセロールに溶解した。次に、3ナノリットルのマトリックス製剤を、検体を含むプローブ上へ移した。

３．２エネルギー吸収マトリックス分子を微結晶化する一般的な方法
上記３．１に記載した通りに製造したエネルギー吸収分子の３例を、タンパク質マイクロアレイ上に配列し、倍率100倍での様子を図１ａに示した。アセトンに溶解したマトリックスi）、ii）及びiii）は、現在、本技術分野で用いられている水溶性のマトリックスであるiv）、ｖ）及びvi）の製剤と比較して、非常に均一な結晶の形成を示した。

図１ａを参照すると、左手側のスライドは、アセトンに溶解した製剤を示し、右手側には、水溶性のマトリックス製剤が示されている。

例示されている新しいマトリックス製剤は、プローブ表面上の空間をより効率的に使用することを可能にするので、タンパク質マイクロアレイ（図１ｂ参照）を生成するのに重要であることが判明し、前記新しいマトリックス製剤は、質量の精度をより高める平面度を向上させ、さらに、プローブ上に沈着することができるマトリックスの量を増加させて、検体の密度を高くする必要性を満たす。

図１ｂは、本発明の一態様によるプローブを示し、その上にタンパク質が捕捉され（従って、タンパク質のマイクロアレイを形成し）、本発明の更なる態様によるエネルギー吸収マトリックスによって薄く覆われている。α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のマトリックスを99％（容積／容積）アセトン、１％（容積／容積）グリセロールに溶解し、金で被覆した顕微鏡スライド上に配列した。溶媒を蒸発させた後、マトリックスの結晶を形成した。水溶液の沈着によって形成された結晶と対照的に、マトリックスの非水溶性溶媒製剤は非常に均一かつ平坦な結晶の層を生じた。このため、スポットを調べる分析者が、“スポット”内の検体を“見つける”ことができ、その結果、前記スポットをより小さくし、生じた高い空間密度のために、マイクロアレイの小型化と製造を可能にし、該高い空間密度は、水溶性のマトリックス製剤を用いて作り出すことができなかったものである。このことは、質量分析に適合するタンパク質マイクロアレイの作成において重要な成果である。

４．MALDIの対象となるタンパク質アレイと種々の使用方法。
４．１十分に純粋なタグを付けた生物高分子の表面捕捉
種々のタグを付けたタンパク質のアフィニティー・キャプチャーについて、タンパク質捕捉部分として、例えばPEG−PLL−ビオチン又はPEG−PLL−ブレオマイシンＢ６を用いて説明する。

図２ａ及びｂは、1500及び15フェムトグラムのビオチンのタグを付けたインシュリンの捕捉をそれぞれ示すタンパク質マイクロアレイから得られたマススペクトルを示す。ビオチンのタグを付けたインシュリンを、金で被覆した顕微鏡スライドグラス上のアフィニティー・キャプチャーの表面上へ、３ナノリットルの容積で、300マイクロメータのピン（Q-Array，Genetix，New Milton，UK）を用いて配列した。金で被覆したPEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面を、１mMのTris-HCl pH7.5で３回洗浄し、窒素の流れの下で乾燥し、３ナノリットルの99％（容積／容積）アセトン、１％グリセロールに溶解したα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸で薄く覆い、その結果、半径約200マイクロメータのスポットが得られた。プローブを、質量分析計であるMALDI TOF質量分析計で分析した。ビオチン化の程度が異なるため、ビオチンのタグを付けたインシュリンのピークがいくつか見ることができる。更なるピークが、7300ダルトンと14600ダルトンにおいて二つ見られ、これらは、ニュートラビジンの[MH]⁺と[MH]²⁺である。

本実施例によって、本システムのタンパク質マイクロアレイの能力が示され、本技術分野において既知である、除去しなければガス状のイオンの形成を妨害する塩を除去するために、プローブ表面上に検体を固定化することの汎用性が示された。そのことによって、新しいマトリックス製剤と共に、質量分析用のタンパク質マイクロアレイを製造する可能性が示された。

４．２粗抽出物由来のプローブ表面上における組換えタンパク質の表面捕捉と検出
MALDIターゲット上のPLL−PEG−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面を、この場合は、E.coli由来のビオチンカルボキシル・キャリアタンパク質（Biotin carboxyl carrier protein、BCCP）の配列タグと共にヒト組換えタンパク質を発現するE.coli溶解液から得られた500ナノリットルのビオチン化タンパク質混合物で薄く覆った。前記タンパク質を表面上で２時間捕捉し、洗浄緩衝液で２回洗浄し、続いて脱塩緩衝液で２回洗浄し、300ナノリットルのエネルギー吸収マトリックス、すなわち飽和α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のアセトン溶液で薄く覆った。低いレーザー・パワーで遅延抽出技術（delayed extraction technique）を用いてリニアモードで得られたマススペクトルを、図５に図示する。この方法の利点は、サンプルを、タンパク質の複雑な混合物として利用することができ、洗浄後に、所定の分子しか残さないことである。第二に、検体を、マトリックスの添加によってアフィニティー・キャプチャーの表面から放出される前に、空間的に定められた位置に捕捉する。

４．３分解処理を用いた、プローブ上の組換えタンパク質の捕捉、検出及び同定
図６は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ビオチンカルボキシル・キャリアタンパク質（GST-BCCP）のペプチド・フィンガープリント分析を示す。融合タンパク質と細菌のタンパク質を含む細菌の粗製の溶解物を、予めPEG−PLL−ビオチンとニュートラビジン（neutravidin）で被覆したMALDIターゲット上に置いた。GSTのBCCP融合パートナーは、ビオチン化コンセンサス配列を、E.coli.で発現した際にビオチン化されるように含み、融合タンパク質は、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（neutravidin）の表面に特異的に結合させ、細菌のタンパク質は緩衝液で洗い流す。同定するために、表面に捕捉したタンパク質を、トリプシンで薄く覆うことによって消化し、MALDI MSで分析した。タンパク質フィンガープリント分析によって、Schistosoma mansoni由来のGSTに属する12のペプチド、ニュートラビジン（neutravidin）に属する４のペプチド、及びトリプシンに属する３のペプチドが明らかとなり（表１参照）、残存する一致しないペプチドを用いても細菌のタンパク質は全く同定されなかった。本実験によって、PEG−PLL−ビオチンとニュートラビジン（neutravidin）を用いて、MALDIターゲット上で、単一工程でタンパク質の粗混合物からタンパク質を精製することができることが明らかに示された。まとめると、本実験は、タンパク質マイクロアレイの製造への道を開き、その製造では、アレイ上のタンパク質の内容物が、最初に予め精製する工程を必要とすることなく細菌の発現システムから得られる。

図９ａは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上に捕捉した、ビオチン化したTriticum vulgaris由来のレクチン（WGA）のマススペクトルを示す。前記レクチンを、糖タンパク質のフェチュインで探索し、MALDIターゲットを洗浄し、脱塩した。前記マススペクトルは、14300及び28600ダルトンのニュートラビジン（neutravidin）の分子イオンを示し、前記レクチンは、17700及び35500に検出され、フェチュイン由来のピークは、44163において見られた。さらに、フェチュインがない場合に前記レクチンを分析した際には見られなかった２つのピークが、25943及び32158に存在し、それらは、フェチュイン調整物のゲル電気泳動分析においていくつかのバンドが観察されたので、レクチンの分解生成物を示す可能性がある。しかしながら、分子量が高い方のバンドは、タンパク質の主要な画分を示した。図９ｂには、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上に捕捉した、ビオチン化したArachis hypogeaのレクチンのMALDI TOFスペクトルが示されている。前記レクチンを、図９ａと同様のフェチュイン溶液で探索した。しかしながら、Arachis hypogea由来のレクチンは、Triticum vulgarisのレクチンと比べて、炭水化物に対して異なる結合親和性を有し、したがって、末端のシアル酸を有さない糖タンパク質の少量の画分を特異的に増やした。マススペクトルには、ニュートラビジン（neutravidin）に由来する14300のピークと、前記レクチンに由来する25774及び51461ダルトンのピークがあり、アシアロフェチュインに由来する二つのピークが、4及び13のシアル酸の基を失ったものと一致する40136及び42731に存在していた。先の二つの実験によって、質量分析によるタンパク質アレイ上でのタンパク質−糖タンパク質相互作用の検出及び分析が示された。

４．４タンパク質マイクロアレイ上での小分子の検出
PEG−PLL−ビオチン及びニュートラビジン（Neutravidin）の存在下における小分子の検出の可能性を明らかにするために、薬理学及び毒物学で用いられる３種の小分子をアレイ上に加えた。シクロスポリン、ケトコナゾール及びキニジンの分子をそれらの対応する分子量で同定した。

PEG−PLL−ビオチンで被覆したプローブを、ニュートラビジン（Neutravidin）溶液とインキュベートし、洗浄緩衝液（0.1％Triton X-100を有する1mM Tris-HCl pH7.5）と、脱塩緩衝液（1mM Tris-HCl pH7.5）で広範囲にわたって洗浄し、乾燥し、エネルギー吸収マトリックスで薄く覆い、次に、MALDI TOF質量分析によって分析した。

マススペクトル（図３ａ、３ｂ及び３ｃ）によって、ニュートラビジン（Neutravidin）の特異的な捕捉が示され、ニュートラビジンの（Neutravidin）[MH]⁺及び[MH]²⁺は、7310及び14652ダルトンにおいて見られた。

さらなる実施例におけるタンパク質への小分子の結合を、図１０ａ、ｂ及びｃに示す。ラクトース・ローダミン抱合体は、PEG−PLL−ニュートラビジン（Neutravidin）Arachis hypogeaレクチンの表面上に特異的に保持されたが、PEG−PLL−ニュートラビジン（Neutravidin）FK506結合タンパク質の表面上では検出できなかった。これは、小分子タンパク質相互作用の検出のもう一つの実施例である。ラクトースと、このレクチンの一定の結合は、ミリモルの範囲内であるので、前記実施例は驚くべきものであり、このことは、ローダミン部分の存在によって、小分子リガンドの親和性が上昇することを示唆している。

４．５タンパク質マイクロアレイ上での反応物質の検出
pH7.4の25mM重炭酸アンモニウム中で、ADP、クレアチンリン酸及びクレアチンリン酸キナーゼを反応させることにより、ATPを酵素的に合成した。[ADP]^-を、427.6ダルトンにおいて検出し、[ADP+Na]^-を、449.6ダルトンにおいて検出した（図４ａ参照）。クレアチンリン酸キナーゼ反応の生成物を、507.6、529.6、551.6及び573.8において検出し、それぞれ、[ATP]^-並びに３種のATPのナトリウム付加体である[ATP Na]^-、[ATP Na₂]^-及び[ATP Na₃]^-の予想される分子量と良く適合していた。

基質であるADPもしくはクレアチンリン酸又は酵素であるクレアチンリン酸キナーゼのどれか一つを除外したコントロールの反応は、ATPのピークを示さなかった。

４．６タンパク質マイクロアレイ上での反応物の検出
ヒトチトクロームP450酵素による薬剤様小分子の酸化は、そのような化合物の代謝において通常最初の段階である。本明細書では、チトクロームP450 3A4によるジベンジルフルオレシンの酸化について、MALDI MSで調査し、結果を図４ｂに図示した。ジベンジルフルオレシン（dibenzylfluorescine，DBF）の[MH]⁺を、513.795において検出し、準安定性の酸化生成物は530.069において見られ、これは、１つの酸素の付加を示している。生じた分子は、化学的に不安定であることが知られており、したがって、モノベンジルフルオレシン（monobenzylfluorescein，MBF）とその酸化生成物を、[MH]⁺は444.912、[MH+O]⁺は460.890、[MH+2O]は476.855ダルトンにおいて見ることができる。

本実験は、タンパク質アレイが、生物触媒反応を検出し、タンパク質アレイ上に捕捉した生物ポリペプチドの機能を決めるのに適していることを示す。

以下に記載した図のマススペクトルを、
１．Bruker Daltonic gold target #26993（図３ａ、３ｂ、３ｃ、４、５）
２．Bruker Daltonic glass target #26754（図６）
３．金で被覆した顕微鏡の30ｘ75mmのスライドグラスを得るために圧延した（milled out）Bruker Daltonic MTP 384 target（図２ａ、２ｂ）
で得た。

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図１ａは、本発明の一つの態様の結晶表面を、先行技術の方法を実施することで得られたものと比較した、Bruker Autoflex質量分析計のフレックスコントロール（flexcontrol）・ツールから得られた６つのスクリーンショットを示す図である。図１ｂは、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸結晶の顕微鏡写真を示す図である。図２ａは、アフィニティー・キャプチャーの表面上で1500フェムトグラムのインシュリン−ビオチンのキャプチャーを示すタンパク質マイクロアレイから得られたマススペクトルを示す図である。図２ｂは、アフィニティー・キャプチャー表面上での15フェムトグラムのインシュリン−ビオチンの捕捉を示すタンパク質マイクロアレイから得られたマススペクトルを示す図である。図３ａは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）アフィニティー・キャプチャーの表面上での質量分析計によるシクロスポリンの検出を示す図である。図３ｂは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上での質量分析計によるケトコナゾールの検出を示す図である。図３ｃは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上での質量分析計によるキニジンの検出を示す図である。図４ａは、ADP及びATPの検出を示す図である。図４ｂは、ジベンジルフルオレシン（dibenzylfluorescine，DBF）の、ヒトのチトクロームp450による酸化生成物を検出するMALDIマススペクトルを示す図である。図５は、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）で被覆した金のターゲット上にあるビオチン化した72ｋDaのポリペプチドの捕捉を示す図である。図６は、Escherichia coliで発現した遺伝子組換えSchistosoma mansoniグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＢＣＣＰ融合タンパク質の同定を示す図である。図７は、プローブ、例えばMALDIターゲット、マイクロプレート又は顕微鏡スライドグラス上でのタンパク質のランダムなカップリング及び方向付けられたカップリングを示す図である。図８は、ポリ−Ｌ−リジン・ポリエチレングリコール・ビオチン重合体（PEG−PLL−ビオチン）のバイオセンサーへの結合を示す図である。図９ａは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上に捕捉した、ビオチン化したTriticum vulgaris由来のレクチン（WGA）のマススペクトルを示す図である。図９ｂは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）の表面上に捕捉した、ビオチン化したArachis hypogeaのレクチンのMALDI TOFスペクトルを示す図である。図１０ａは、ローダミン−ラクトース誘導体のArachis hypogea由来レクチンへの特異的な結合を示す図である。図１０ｂは、実験において用いるラクトース−ローダミン抱合体のMALDI MS分析を示す図である。図１０ｃは、PEG−PLL−ビオチン・ニュートラビジン（Neutravidin）表面上に固定化し、ラクトース・ローダミンで探索したFK506結合タンパク質のマススペクトルを示す図である。

Claims

電気伝導性のターゲット表面を支持体上に有する支持体を含む、レーザー脱離／イオン化質量分析計と共に使用するためのプローブであって、前記ターゲット表面は、１種又はそれ以上の検体捕捉部分を示す複数の別個のターゲット領域を有するマイクロアレイを含むことを特徴とする、プローブ。
前記支持体は、スライドグラス又はMALDIターゲットであることを特徴とする、請求項１記載のプローブ。
前記複数の別個のターゲット領域は、空間的に定められて配列されていることを特徴とする、請求項１又は２記載のプローブ。
各別個のターゲット領域は、1000μm²より小さい面積、より好ましくは500μm²より小さい面積、さらにより好ましくは100μm²より小さい面積を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプローブ。
各別個のターゲット領域は、785μm²より小さい面積、より好ましくは392μm²より小さい面積、さらにより好ましくは78μm²より小さい面積を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプローブ。
前記別個のターゲット領域は、実質的に円形であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプローブ。
前記別個のターゲット領域は、マトリックス内に配列されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプローブ。
前記ターゲットの表面上に複数のマトリックスがあることを特徴とする、請求項７記載のプローブ。
前記マトリックスは、少なくとも２行と２列の別個のターゲット領域を含むことを特徴とする、請求項７又は８記載のプローブ。
少なくとも10個、より好ましくは少なくとも100個、さらにより好ましくは少なくとも1000個、さらにより好ましくは10000個の別個のターゲット領域を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプローブ。
マトリックス内の隣接した別個のターゲット領域間の間隔が1mmより小さいことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプローブ。
前記電気伝導性の表面は、金属又は半導体を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプローブ。
前記金属は、金、銀、白金、イリジウム、鉄、ニッケル、コバルト、銅又はそれらの混合物もしくは合金から選択され、前記半導体は、ケイ素、グラファイト又はゲルマニウムから選択されることを特徴とする、請求項１２記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、タンパク質捕捉部分であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプローブ。
前記タンパク質捕捉部分は、抗体ではないことを特徴とする、請求項１４記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、小分子であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプローブ。
前記小分子は、2kDaより小さいこと、好ましくは1kDaより小さいこと、より好ましくは500Daより小さいことを特徴とする、請求項１６記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、別個のターゲット領域に均一に配置されていることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、別個のターゲット領域に決められた方向に配置されていることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、その結合パートナーに対する親和性が高いことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体捕捉部分とその結合パートナーとの間の結合親和性（Kd）は、少なくとも10^-7M、より好ましくは少なくとも10^-9M、より好ましくは少なくとも10^-12M、さらにより好ましくは少なくとも10^-15Mであることを特徴とする、請求項２０記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、前記電気伝導性のターゲット表面に直接付着していることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、前記電気伝導性のターゲット表面に間接的に付着していることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、１種又はそれ以上のリンカー分子を介して付着していることを特徴とする、請求項２３記載のプローブ。
前記リンカー分子は、ポリアミノ酸又はアルカンチオールを含むことを特徴とする、請求項２４記載のプローブ。
前記ポリアミノ酸は、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸又は前記３種のアミノ酸とその他の既知のアミノ酸との混合物であることを特徴とする、請求項２５記載のプローブ。
少なくとも１種のタンパク質捕捉部分が、ビオチン又はブレオマイシン耐性タンパク質を結合することを特徴とする、請求項１４記載のプローブ。
前記タンパク質捕捉部分は、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン（Neutravidin）又はブレオマイシンであることを特徴とする、請求項２７記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、非特異的なタンパク質の結合に通常なら十分抵抗性がある層に提供されることを特徴とする、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のプローブ。
非特異的なタンパク質の結合に通常なら十分抵抗性がある前記層は、前記層の、一般にタンパク質を忌避する性質を担う重合体又は、自己組織化膜（self assembled monolayers，SAM）を含むことを特徴とする、請求項２９記載のプローブ。
前記重合体は、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、PEG）、デキストラン、ポリウレタン又はポリアクリルアミドを含むことを特徴とする、請求項３０記載のプローブ。
前記重合体は、１種又はそれ以上のリンカー分子を介して前記プローブの表面に結合していることを特徴とする、請求項３１記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、前記重合体及び／又は前記リンカー分子を介して前記表面に付着していることを特徴とする、請求項３２記載のプローブ。
単一の一般的な検体捕捉部分が前記表面上に提供されていることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のプローブ。
複数の異なる検体捕捉部分が前記表面上に提供されていることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のプローブ。
捕捉した検体をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のプローブ。
前記捕捉した検体は、タンパク質を含むことを特徴とする、請求項３６記載のプローブ。
前記タンパク質は、融合タンパク質であることを特徴とする、請求項３７記載のプローブ。
前記融合タンパク質は、ビオチンカルボキシル・キャリアタンパク質（biotin carboxyl carrier protein，BCCP）を含むことを特徴とする、請求項３８記載のプローブ。
前記融合タンパクは、フレオマイシン／ゼオシン耐性タンパク質を含むことを特徴とする、請求項３８記載のプローブ。
前記捕捉した検体は、該検体に結合した更なる分子を有することを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載のプローブ。
前記更なる分子は、小分子、タンパク質又は核酸のいずれか一つであることを特徴とする、請求項４１記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、前記表面の十分全体にわたって均一に配置されていることを特徴とする、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体捕捉部分は、別個のターゲット領域のみに均一に配置されていることを特徴とする、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体は、前記表面上にプリントされていることを特徴とする、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載のプローブ。
前記検体は、インクジェット・プリント、圧電プリント又は接触プリントを用いてプリントされていることを特徴とする、請求項４５記載のプローブ。
前記接触プリントにおいて、スプリット・ピン、ソリッド・ピン（solid pin）又はホローピン（hollow pin）を用いて前記検体を塗布することを特徴とする、請求項４６記載のプローブ。
別個のターゲット領域の表面は、実質的に平面であることを特徴する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のプローブ。
前記別個のターゲット領域は、平底のウェルであることを特徴とする、請求項４８記載のプローブ。
1000μm²当たり、分子が10¹⁵個以下という濃度で、より好ましくは、1000μm²当たり、分子が10¹²個以下という濃度で、より好ましくは、1000μm²当たり、分子が10⁹個以下という濃度で、さらにより好ましくは、1000μm²当たり、分子が10⁶個以下という濃度で検体を結合することができる、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のプローブ。
レーザー脱離／イオン化質量分析計と共に使用するためのタンパク質マイクロアレイを製造する方法であって、該方法は、請求項１４記載のプローブを用意し、別個のターゲット領域内のタンパク質捕捉部分に位置を合わせてタンパク質を沈着させること含むことを特徴とする、タンパク質マイクロアレイを製造する方法。
請求項５１記載のタンパク質マイクロアレイを分析する方法であって、前記タンパク質マイクロアレイのレーザー脱離／イオン化質量分析を行うこと含むことを特徴とする、タンパク質マイクロアレイを分析する方法。
前記レーザー脱離／イオン化質量分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（MALDI）であることを特徴とする、請求項５２記載の方法。
エネルギー吸収分子を、表面全体にわたって沈着させるか、又はタンパク質が捕捉されている別個のターゲット領域に位置を合わせて沈着させることを特徴とする、請求項５３記載の方法。
エネルギー吸収分子を、タンパク質が捕捉されている別個のターゲット領域に位置を合わせて沈着させることを特徴とする、請求項５４記載の方法。
前記エネルギー吸収分子を、前記タンパク質を変性させ、従って、表面上で、タンパク質捕捉部分のすぐそばに変性したタンパク質を残す前記タンパク質捕捉部分から前記タンパク質を解放する方法で沈着させることを特徴とする、請求項５４又は５５記載の方法。
前記エネルギー吸収分子は、均一な層として、別個のターゲット領域に、前記タンパク質捕捉部分と捕捉したタンパク質に位置を合わせて存在することを特徴とする、請求項５４又は５５記載の方法。
前記均一な層は、個々の結晶が倍率100倍で目に見えず、隣接する結晶間に目に見える隙間が全くないほど十分に連続していることを特徴とする、請求項５７記載の方法。
前記均一な層は、倍率100倍で結晶の大きさに明らかな差異がないほど十分に一様な奥行きを有することを特徴とする、請求項５７又は５８記載の方法。
前記エネルギー吸収分子を、非水溶性溶媒中で表面上に沈着させ、該非水溶性溶媒を蒸発して取り除くことを特徴とする、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
前記非水溶性溶媒は、有機溶媒であることを特徴とする、請求項６０記載の方法。
前記有機溶媒は、アセトン又はブタノンであることを特徴とする、請求項６１記載の方法。
前記非水溶性溶媒は、前記エネルギー吸収分子を沈着させた後に前記非水溶性溶媒の蒸発が起きるように蒸発速度を制御する調節剤を含むことを特徴とする、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
蒸発速度を制御する前記調節剤は、グリセロール、ポリエチレングリコール又はチオグリセロールであることを特徴とする、請求項６３記載の方法。
前記エネルギー吸収分子を、80−99.9％、好ましくは99％の非水溶性溶媒、好ましくはアセトンと、20−0.1％、好ましくは1％の調節剤、好ましくはグリセロール（容積／容積）の混合物中で沈着させることを特徴とする、請求項５４〜６４のいずれか１項に記載の方法。
前記エネルギー吸収分子は、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、ゲンチシン酸、ニフィジン（nifidine）、コハク酸、１，８，９−アントラセントリオール、３−インドールアクリル酸、２−（ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、４−ニトロアニリン及びそれらの組み合わせの結晶を含むことを特徴とする、請求項５４〜６５のいずれか１項に記載の方法。
レーザー脱離／イオン化質量分析による分析方法であって、該方法は、
ａ）請求項１４記載のプローブを用意する工程と；
ｂ）前記プローブを、１種又はそれ以上のタンパク質と接触させる工程と；
ｃ）前記プローブの表面上におけるタンパク質のレーザー脱離／イオン化質量分析を行う工程を含むことを特徴とする、分析方法。
工程ｂ）とｃ）の間に、洗浄することによって、前記プローブから非結合分子を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６７記載の方法。
前記１種又はそれ以上のタンパク質は、タンパク質の混合物中に含まれていることを特徴とする、請求項６８記載の方法。
前記プローブの表面上のタンパク質を同定する方法であって、
ｄ）前記タンパク質分子の質量を測定する工程と；
ｅ）更なるプローブ又はプローブ表面上で前記タンパク質の反復したサンプルの消化を行う工程と；
ｆ）工程ｅ）より生じたペプチドのレーザー脱離／イオン化質量分析を行って、前記タンパク質を同定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
前記プローブ表面上のタンパク質の機能及び前記タンパク質と相互作用する分子を分析する方法であって、工程ｃ）の代わりに、
ｃ）前記プローブ表面上のタンパク質を、１種又はそれ以上の試験分子と接触させる工程と；
ｄ）前記プローブ表面から結合していない試験分子を除去する工程と；
ｅ）前記タンパク質及び任意の結合した分子のレーザー脱離／イオン化質量分析を行って、前記タンパク質及び／又は試験分子の同一性を決定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
前記試験分子は、小分子、タンパク質又は核酸であることを特徴とする、請求項７１記載の方法。
タンパク質の機能を分析する方法であって、
ｃ）前記プローブ表面上のタンパク質を、１種又はそれ以上の試験基質と接触させる工程と；
ｄ）前記タンパク質及び試験基質のレーザー脱離／イオン化質量分析を行って、前記タンパク質による前記試験基質の触媒反応の生成物の存在及び／又は同一性を決定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。