JP2005503432A - Sphingolipid - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a compound represented by the general formula (I) having a defined meaning, and a pharmaceutical composition containing the compound. The compound represented by the formula (I) is an inhibitor of various lipid-related enzymes. The compounds can be used to reduce sphingolipid accumulation and can therefore be used to treat lipid accumulation disorders. The compounds of formula (I) can also be used for the treatment of cancerous diseases and for the killing of wild type and drug resistant cancer cells.

Description

は、グルコスフィンゴリピドの阻害剤であることが示された［Ｖｕｎｎａｍ ＆ Ｒａｄｉｎ Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄ，２６，２６５（１９８０）］。
【００１１】
アシルフェニルアミノアルコール（ＭＡＰＰ）：
【化２】

は、セラミダーゼを阻害して、細胞増殖の阻害を生じることが示された［Ｂｉｅｌａｗｓｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２６４６−１２６５４（１９９６）］。
【００１２】
ｐ−ニトロフェニル−アミノ−プロパンジオールのエステル：
【化３】

は、細胞分化を阻害することが示された［Ｂｉｅｌａｗｓｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１８４９３−１８４９７（１９９２）］。
【００１３】
スフィンゴリピドの他の非天然誘導体は、細胞増殖及び分化に影響を及ぼす。例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシンは、細胞増殖を阻害することが示された［Ｅｎｄｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，１６１３−１６１８（１９９１）］。アミド基が−ＮＨ−（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３：ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨＮＨ［（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３］−ＣＨ_２ＯＨにより置換されているＣ_８セラミドは、アポトーシスを誘導した［Ｋａｒａｓａｖｖａｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６，７２９−７３１（１９９６）］。
ヘキサデシルホスホコリンは、セラミド媒介アポトーシスを誘導した［Ｗｉｅｄｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１１０２５−１１０３１（１９９８）］。
【００１４】
本発明の目的は、スフィンゴリピドの代謝を調節することができる新規な治療用化合物を提供することである。
本発明の更なる目的は、望ましくない細胞を殺傷するのに用いることができる新規な治療用化合物を提供することである。
本発明のこれらの及び他の目的は、記載が進行するにつれてさらに明らかになるであろう。
【発明の要旨】
【００１５】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【化４】

［式中、Ｒは、場合によりヒドロキシル基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル鎖又はアルケニル鎖、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍＣＨ＝ＣＨ−基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ基（ｍは、０又は１〜２０の整数である）、場合によりニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−アルキル基、スルホニルアミド−アルキル基、式
【化５】

（ｎは、１〜２０の整数である）で表される基、又は−ＮＨ−アダマンタン基により置換されているフェニル基、−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ基、−ＮＨ−ＦＭＯＣ基、又はＮＨ−ＣＢＺ基であり；
Ｘは、水素原子又は−ＯＲ_４基（Ｒ_４は、水素原子又は、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のＣ_１〜Ｃ_６アルキル鎖又はアルケニル鎖である）であり；
Ｙは、−ＮＨ_２基、ＮＨＲ^ｘ基（Ｒ^ｘは、水素原子、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状のアルキル鎖又はアルケニル鎖である）、アミノ保護基、式
【化６】

で表される基、式
【化７】

で表される基、−ＮＨ（ＳＯ_２）Ｒ_１基、−ＮＲ_１Ｒ_２基、−Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３基（Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、同一であるか又は異なっていることがあり、それぞれＣ_１−６アルキル基又はＣ_１−６アルケニル基である）、式
【化８】

（ｎは、０又は１〜２０の整数である）で表される基、−ＮＨ−アダマンタン基、式
【化９】

（式中、「ポリマー」は、１０^３ダルトンから１０^６ダルトンの分子量を有する天然又は合成の生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ポリマーである）で表される基であり；
Ｚは、水素原子、−ＯＨ基、モノ−又はジサッカライド、モノサッカライドスルフェート及びコリンホスフェートであるが；
但し、Ｒが、アルキル基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍＣＨ＝ＣＨ−基、フェニル基又はニトロフェニル基である場合に、Ｙは、ＮＨ_２基であることができず；そしてＲ_１がメチル基であり、ＲがＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍＣＨ＝ＣＨ−基であり、そしてＺが−ＯＨ基である場合に、Ｙは、−ＮＲ_１Ｒ_２基、−Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３基又はＮＨＲ_４基（Ｒ_４は、オクチル基である）であることができない］
で表される化合物、及びその異性体及び薬剤学的に許容することができる塩に関する。
【００１６】
本発明は、式中の置換基が請求項１に定義した意味を有する式（Ｉ）で表される化合物を活性成分として含む医薬組成物、及び場合により薬剤学的に許容することができる担体、佐剤及び希釈剤を更に含む医薬組成物にも関する。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、スフィンゴリピドの蓄積を低減するのに用いることができ、そして従って、脂質蓄積症、例えば、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィー、ファブリー病及びファーバー病の治療に用いることができる。
式（Ｉ）で表される新規化合物は、酸性、中性及びアルカリ性のスフィンゴミエリナーゼ、酸性、中性及びアルカリ性のセラミダーゼ、α−ガラクトシルシンテターゼ、セラミドシンテターゼ、スフィンゴミエリンシンテターゼ及びグリコセラミドシンテターゼの阻害剤として用いることができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、癌性疾病の治療に、野生型及び薬剤耐性癌細胞の殺傷にも用いることができる。
本発明の医薬組成物は、寄生生物、ウイルス、細菌、真菌類及びプリオンの疾病の治療にも用いることができる。
別の観点において、本発明は、脂質蓄積症又は癌性疾病の治療が必要な患者において前記脂質蓄積症又は癌性疾病を治療する方法であって、式（Ｉ）で表される化合物又は前記化合物を含む医薬組成物の治療上有効量を前記患者に投与することを含む前記治療方法を提供する。
《図面の簡単な説明》
【００１９】
図１−細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果
増加する濃度のＡＤ−２６４６の存在下に、ＨＬ６０細胞生存性を試験した。
略語：Ｖｉａ（生存）、Ｃ（細胞）、Ｃｏｎｔｒ（対照）、Ｉｎｈｉ（阻害剤）、Ｃｏｎｃ（濃度）。
図２−ＴＳＵ−ＰＲ細胞へのＡＤ−２６４６の細胞毒性効果
ＡＤ−２６４６の細胞毒性効果を、増加する濃度のＡＤ−２６４６を用いて２日間にわたり試験した。全タンパク質量を測定した。略語：Ｐｒｏｔ（タンパク質）。
図３−スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＳＰＭ）
ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）−Ｃ３−セラミド２．５μＭの存在下に、増加する濃度のＡＤ−２６４６と共に、ＨＬ６０細胞を３時間インキュベートした。抽出後、リピドを薄層クロマトグラフィープレート上にアプライし、そしてボディピー−Ｃ３−スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）の蛍光を定量した。
図４−スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＧＣ）
ボディピー−Ｃ３−セラミド２．５μＭの存在下に、増加する濃度のＡＤ−２６４６と共に、ＨＬ６０細胞を３時間インキュベートした。抽出後、リピドを薄層クロマトグラフィープレート上にアプライし、そしてボディピー−Ｃ３−セレブロシド（ＧＣ）の蛍光を定量した。
図５−ＡＤ−２６４６はＴＳＵ−ＰＲ１細胞におけるＳＰＭ合成を阻害する
増加する濃度のＡＤ−２６４６の存在下に、ＴＳＵ−ＰＲ１細胞を３日間インキュベートし、ボディピー−Ｃ３−スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）の蛍光を定量した。
図６−本発明の化合物によるスフィンゴリピド代謝の阻害
ＨＬ６０細胞を、種々の化合物ＡＤ−２６７２、ＡＤ−２６７３及びＡＤ−２６７４（それぞれ５μＭ及び１０μＭ）と共にインキュベートした。Ｂｏｄ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ３−ＧＣの合成への前記種々の化合物の効果を試験した。ＳＰＭ及びＧＣの相対量をプレートの蛍光像に示す。
略語：Ｃｏｎｔ（対照）
【００２０】
スフィンゴリピドの代謝を調節することができる物質の調査において、本発明者らは、一般式（Ｉ）：
【化１０】

［式中、Ｒは、場合によりヒドロキシル基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル鎖又はアルケニル鎖、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍＣＨ＝ＣＨ−基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍ基（ｍは、０又は１〜２０の整数である）、場合によりニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−アルキル基、スルホニルアミドアルキル基、式
【化１１】

（ｎは、１〜２０の整数である）で表される基、ＮＨ−アダマンタン基、又は−ＮＨ−ｔ−ＢＯＣ基により置換されているフェニル基、−ＮＨ−ＦＭＯＣ基又はＮＨ−ＣＢＺ基であり；
Ｘは、水素原子又は−ＯＲ_４基（Ｒ_４は、水素原子、又は、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状の、飽和又は不飽和のＣ_１〜Ｃ_６アルキル鎖又はアルケニル鎖である）であり；
Ｙは、−ＮＨ_２基、ＮＨＲ^ｘ基（Ｒ^ｘは、水素原子、場合によりヒドロキシ基によって置換されていることのある、直鎖状又は分枝状のアルキル鎖又はアルケニル鎖である）、アミノ保護基、式
【化１２】

で表される基、式
【化１３】

で表される基、−ＮＨ（ＳＯ_２）Ｒ_１基、−ＮＲ_１Ｒ_２基、−Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３基（Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、同一であるか又は異なっていることがあり、それぞれＣ_１−６アルキル基又はＣ_１−６アルケニル基である）、式
【化１４】

（ｎは、０又は１〜２０の整数である）で表される基、−ＮＨ−アダマンタン基、式
【化１５】

（式中、「ポリマー」は、１０^３ダルトンから１０^６ダルトンの分子量を有する天然又は合成の生体適合性ポリマーである）で表される基であり；
Ｚは、水素原子、−ＯＨ基、モノ−又はジサッカライド、モノサッカライドスルフェート及びコリンホスフェートであるが；
但し、Ｒが、アルキル鎖又はアルケニル鎖、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍＣＨ＝ＣＨ−基、フェニル基又はニトロフェニル基である場合に、Ｙは、ＮＨ_２基であることができず；そしてＲ_１がメチル基であり、ＲがＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｍＣＨ＝ＣＨ−基であり、そしてＺが−ＯＨ基である場合に、Ｙは、−ＮＲ_１Ｒ_２基、−Ｎ^＋Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３基又はＮＨＲ４基（Ｒ_４は、オクチル基である）であることができない］
を有する一連の新規化合物、及びその異性体及び薬剤学的に許容することができる塩を合成した。
【００２１】
式（Ｉ）で表される好ましい化合物は、式中のＲがアミノフェニル基又はニトロフェニル基である化合物である。
式中のＹが−ＮＨ_２基、ＮＨＲ^ｘ基である式（Ｉ）で表される化合物、とりわけ、式中のＲ^ｘがアルキル鎖である化合物も好ましい。
アミノ保護基は、当業者に公知の任意の適切なアミノ保護基、とりわけ、ＢＯＣ（第三級ブチルオキシカルボニル）、ＦＭＯＣ（フルオレニルメトキシカルボニル）又はＣＢＺ（ベンジルオキシカルボニル）であることができる。
【００２２】
一部の特定のとりわけ好ましい化合物を以下に列挙する。アルキル鎖又はアルケニル鎖の長さを変化させることができることに留意されたい。アダマンチル部分を含む化合物は、この基の大きさ及び立体配置によりその化合物は細胞膜中に留められ、この膜内の酵素に影響を及ぼすことができるので、有利であることができる。
【００２３】
他の好ましい化合物は、式中のＹが式
【化１６】

（式中、「ポリマー」は分子量１０^３〜１０^６を有する天然又は合成の生体適合性ポリマー、例えば、へパリン、ヒアルロン酸、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、コンドロイチンスルフェート、デルマタンスルフェート、ポリエチレングリコール、ペプチド又はタンパク質である）で表される基である化合物であることができる。本発明の前記高分子化合物は、細胞膜を透過して細胞に入ることができないので、外側の細胞膜又は細胞外周囲でのみ阻害することができる。
【００２４】
一部の特定の好ましい化合物は、式
【化１７】

（ＡＤ−２６６５と称する）、式
【化１８】

（ＡＤ−２６８７と称する）、式
【化１９】

（ＡＤ−２６４６と称する）、式
【化２０】

（ＡＤ−２６７２と称する）、式
【化２１】

（ＡＤ−２７５４と称する）、式
【化２２】

（ＡＤ−２６７３と称する）、式
【化２３】

（ＡＤ−２１４４と称する）で表される化合物である。
【００２５】
下記の実施例に示すように、本発明の新規な合成化合物は、スフィンゴリピドの分解並びに生合成を阻害することができる。従って、これらの化合物は、リピドーシス、とりわけ、罹患した患者の器官にスフィンゴリピドが蓄積する遺伝的な脂質蓄積症、例えば、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィー、ファブリー病及びファーバー病の治療に用いることができる。脂質蓄積症の治療用の医薬組成物も、本発明の範囲内にある。
【００２６】
本発明の化合物を単独で又は他の抗癌剤と組合わせて使用することにより、薬物感受性細胞及び薬物耐性細胞を含む種々の細胞の殺傷にも至った。従って、本発明は、活性成分として本発明の化合物を、場合により少なくとも１種の他の抗癌剤と組み合わせて含有する、癌性疾病の治療のための医薬組成物にも関する。
なお、更に、本発明の化合物は、寄生生物の疾病、例えば、マラリア及びリーシュマニアの治療に用いることができる。前記寄生生物の疾病の治療のための医薬組成物も、本発明の範囲内にある。
【００２７】
本発明の化合物は、一般に、医薬組成物の形態で提供される。前記組成物は、注射による又は経口摂取による使用のためのものである。
本発明の医薬組成物は、一般に、緩衝剤、医薬組成物の浸透圧を調節する剤、及び、例えば、医薬組成物に風味、色、潤滑等を付与する目的で、場合により、当業者に公知の１種又はそれ以上の担体、賦形剤及び／又は添加剤を含んでいる。
【００２８】
それぞれの担体は、他の成分と適合性でありそして治療されるべき患者に対して有害でないという意味において薬剤学的及び生理学的のいずれについても許容することができるものでなければならない。製剤は、直腸投与、鼻投与に適した製剤を含んでいるが、好ましい製剤は、筋肉内投与、皮膚内投与、皮下的投与及びとりわけ静脈内投与を含む、経口的投与又は非経口的投与に向けられたものである。製剤は、便利には、単位投与量型で提供することができ、そして製薬業において公知の任意の方法により製造することができる。
【００２９】
担体は、デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、例えば、微晶質セルロース、キサンタンガムなどを含んでいることができる。潤滑剤は、硬化ヒマシ油などを含んでいることができる。
好ましい緩衝剤は、リン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）であり、前記水溶液は浸透圧に関しても調節されている。
【００３０】
本明細書中で用いる「薬剤学的に許容することができる担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤などを含んでいる。薬剤学的な活性物質に対する前記媒体及び剤の使用は、当業者に周知である。任意の通常の媒体又は剤が活性成分と適合性でない場合以外は、治療用組成物におけるそれの使用は考慮される。
【００３１】
好ましい医薬製剤は、好ましくは、静脈注射を含む注射による投与に対して用いられる。
本発明の組成物は、種々の方法で投与することができる。限定的でない例によれば、本組成物は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射により投与することができる。例えば、静脈内投与が有利である。
【００３２】
注射用に適した医薬形態は、滅菌の注射可能な溶液又は分散液の即時製剤に対する、滅菌の水溶液又は分散液及び滅菌の粉末を含んでいる。全ての場合に、前記形態は、滅菌されていなければならず、そして容易な注射針通過性が存在する程度まで流動性がなければならない。前記形態は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、そして微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコ−ル、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンを用いることにより、分散液の場合には必要な粒度の維持により、及び界面活性剤を用いることにより維持することができる。
【００３３】
微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合に、等張剤、例えば、砂糖又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンの組成物における使用により達成することができる。
【００３４】
滅菌の注射可能な溶液は、前記列挙した種々の他の成分を有する適切な溶媒中に必要量の活性成分を加え、必要により、続いてろ過滅菌を行うことにより調製する。一般に、分散液は、基本的な分散媒体及び前記列挙した他の成分からの必要な成分を含有する滅菌担体中に種々の滅菌した活性成分を加えることにより調製する。
滅菌した注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合に、好ましい製造方法は、活性成分に任意の追加の所望成分を加えた予め滅菌ろ過した溶液から、前記活性成分に任意の追加の所望成分を加えた粉末を生じる真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
【００３５】
経口投与に対して、本発明の組成物は、処理されるべき患者用の栄養供給材料又は給水と混合することができる。しかしながら、有効な組成物は、栄養供給材料又は水と混合することができ又は別々に患者に供給することができると考えられる。
医薬組成物の調製は当業者に周知であり、そして多くの論文及び教科書に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編集，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，イーストン，ペンシルバニア州，１９９０，及びとりわけその１５２１〜１７１２頁を参照されたい。
【００３６】
添加剤は、細胞膜全体にわたる活性成分の吸収を高めるようにも設計することができる。前記剤は、一般に、本発明の分子の細胞吸収を高める剤である。例えば、本発明の化合物は、リポソーム内に封入されていることができる。リポソームの、例えば、特定のトランスフェクション試薬を用いた、調製及び使用は、当業者に周知である。リポソームを得る他の方法は、センダイウイルス又は他のウイルスの使用を含んでいる。
【００３７】
前記リピド剤は、細胞によって吸収された活性化合物の安定性を改善することもできる。
活性剤の量は変化させることができる。その量は、一般に、疾病、疾病の状態、患者の年齢、体重及び性別に依存しており、そして主治医により決定されるはずである。
本発明は、脂質蓄積症、癌性疾病又は寄生生物疾病の治療方法又は予防方法であって、本発明の化合物又は医薬組成物又は任意のその好ましい態様物を、前記治療又は予防が必要な患者に投与することを含む前記治療方法又は予防方法にも関する。
【００３８】
分子生物学の技術分野の多数の方法の詳細は、当業者に周知であるので、本明細書中では示さない。前記方法は、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲクローニング、ｃＤＮＡの発現、組換え体タンパク質又はペプチドの分析、細菌及び酵母細胞の形質転換、哺乳類細胞のトランスフェクションなどを含んでいる。前記方法を記載する教科書は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＩＳＢＮ：０８７９６９３０９６，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌによる，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８８，及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌらによる（編集）第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；ＩＳＢＮ：０４７１１３７８１２，１９９５である。これらの出版物の全体を、参考までに本明細書に引用する。さらに、多数の免疫学的技術が当業者に周知であるので、それぞれの例における技術の詳細は本明細書中に記載しない。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら（編集），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．，ニューヨーク，ニューヨーク州を参照されたい。
【００３９】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる語、及びその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」は、記載した整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群の除外を意味するものでないことを理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いる、単一形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に他の意味に解すべき場合を除き、複数の対象を含んでいる。
【００４０】
開示しそして記載した本発明は、本明細書に開示のプロセス工程及び材料がある程度変化することができるので、本明細書に開示の特定の実施例、プロセス工程、及び材料に限定されるものでないことを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定されるものであるから、本明細書に用いた用語は、特定の態様のみを記載する目的で用いるものであり限定されることを意図するものでないことを理解されたい。
【００４１】
従って、以下の実施例は、本発明の観点を実施することにおける、本発明により用いられる技術の代表に過ぎない。これらの技術は本発明の実施に対する好ましい態様の典型であるが、本発明の開示内容に照らして、当業者が、本発明の精神及び意図した範囲から逸脱することなく多くの変形を行うことができることが認識されるであろうことを理解されたい。
【実施例】
【００４２】
《実験手順》
細胞系
ＨＬ６０：ヒト白血病細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）
ＴＳＵ−ＰＲ１：前立腺癌細胞（ＡＴＣＣで入手可能）
ＭＣＦ７−ＡｄｒＲ：ヒト乳癌細胞、薬物耐性（ＡＴＣＣで入手可能）
ＭＣＦ７−ＮＣｉ：ヒト乳癌細胞、薬物感受性（ＡＴＣＣで入手可能）
Ｕ９３７：骨髄性白血病細胞（ＡＴＣＣで入手可能）
【００４３】
《実施例１：化合物の合成》
《１．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−ヘキシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５９３）の調製》
丸底フラスコ中のメタノール５０ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール２ｇを溶解した。磁気的攪拌した溶液に、０．１Ｎ−ＨＣｌ（５ｍＬ）、続いてヘキシルアルデヒド（ヘキサナール）２ｇを添加した。この混合物を３０分間攪拌した後、３時間かけて数回に分けてＮａＢＨ_４１ｇを添加した。この混合物を一晩攪拌下におき、その溶液を分液漏斗に移し、Ｈ_２Ｏ１００ｍＬ及びジクロロメタン１００ｍＬを添加し、そしてその溶媒混合物を振盪した。その下相を収集し、その水性メタノール相をジクロロメタン：メタノール（３：１）５０ｍＬで２回抽出し、その３回分の下方相を一緒にし、そしてＨ_２Ｏ７５ｍＬで振盪した。その有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。小容量のジクロロメタン：メタノール（１：１）中にその残さを溶解し、そして５０×２ｃｍのシリカゲルカラム上にロードした。増加する量のメタノールを含有するジクロロメタンで、標記化合物を溶離した。収量：１．２ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝２９６。
【００４４】
《２．（２Ｓ，３Ｒ）２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５１６）の調製》
メタノール１５０ｍＬ中に（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール５ｇを溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ１００ｍｇを添加し、そしてその溶液を室温においてハイドロジェネーター中で５０Ｐｓｉで６時間水素化した。ろ過により触媒を除去し、そしてその溶液を蒸発乾固した。その乾燥化合物を更に精製することなく合成に用いた。収量：５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝１８３。
【００４５】
《３．（２Ｓ，３Ｓ）−２−（Ｎ−オクチルアミン）−１−（４−Ｎ−オクチルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６７０）の調製》
丸底フラスコ中のメタノール：水（１：１）１００ｍＬ中に（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５１６に記載したとおりに調製）３ｇを溶解した。この溶液を磁気的に攪拌し、そしてオクチルアルデヒド（オクタナール）１ｍＬを、続いて酢酸１ｍＬを添加した。この溶液を１５分間攪拌し、そして２時間をかけて少しずつナトリウムシアノボロハイドライドＮａＣＮＢＨ_３１ｇを添加した。この溶液をさらに３時間攪拌し、次いで分液漏斗に移し、そして水１００ｍＬ、及びジクロロメタン５０ｍＬ及びメタノール２５ｍＬを加えた。振盪後、その下相を収集し、そして上方の水性メタノール相をＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ（３：１）５０ｍＬで２回抽出した。一緒にした有機相をＨ_２Ｏ１００ｍＬで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で２時間乾燥し、ろ過し、そしてその溶液を蒸発乾固した。最小量のジクロロメタン：エタノール（１：１）中にその残さを溶解し、そして２×５０ｃｍのシリカゲル上にロードした。ジクロロメタン中の増加する量のメタノールでカラムを溶離した。収量：２．１ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝４０７。
【００４６】
《４．（２Ｒ，３Ｒ）−２−ＢＯＣアミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５０２）の調製》
ジクロロメタン：メタノール（２：１）１００ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール８ｇを溶解し、そして同じ溶媒混合物５０ｍＬ中に溶解したＢＯＣ無水物６ｇを加えた。２５０ｍＬ容エルレンマイヤー中に、この溶液を入れ、そして３０分間攪拌すると、溶液は透明になった。次いで、さらに１２時間攪拌に付した。その溶液を蒸発乾固し、そしてその残さを水１００ｍＬ及びイソプロパノール１００ｍＬ中に溶解し、次いで分液漏斗に移してヘプタン１００ｍＬで洗浄した。そのヘプタン相を取り出し、そして追加量のヘプタン６０ｍＬを加えた。各相を混合し、そしてヘプタン相を取り出した。その水相を、ジクロロメタン１００ｍＬで抽出した。そのジクロロメタン相を、ＭｇＳＯ_４５ｇ上で２時間乾燥し、次いでろ過し、そして蒸発乾固した。更に精製することなく、標記化合物を用いた。収量８ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝３１３。
【００４７】
《５．（２Ｒ，３Ｓ）−２−ＢＯＣ−アミノ−１−（４−Ｎ−ヘキサデカノイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５２２）の調製》
ＡＤ２５０２の調製（４）に記載したとおりに、２Ｒ，３Ｓ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール４ｇにＢＯＣを結合した。ＡＤ２５１６（２）に記載したとおりに、そのＢＯＣ誘導体２ｇを水素により還元した。その生成物、すなわち、それぞれのアミノフェニル誘導体１ｇを、ＥＤＡＣ１ｇの添加により、ジクロロメタン：メタノール（２：１）５０ｍＬ中のヘキサデカン酸１ｇと反応させた。その反応混合物を一晩攪拌し、蒸発乾固し、ジクロロメタン−メタノール（１：１）４ｍＬ中にその残さを溶解し、そしてジクロロメタン中に調製した５０×１．５ｃｍのシリカゲルカラム上にロードした。ジクロロメタン及び増加する量のメタノールの混合物で、標記化合物を溶離した。全収量：４．５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝５２１。
【００４８】
《６．（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−Ｎ−ブチロイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６０２）の調製》
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ジクロロメタン（１：１）１０ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−ＢＯＣ−アミノ−１−（４−Ｎ−ブチロイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ヘキサデカン酸の代わりに酪酸を用いて、化合物ＡＤ−２５２２の調製に記載したとおりに調製）を溶解した。２０ｍＬ容スクリューキャップ付きの試験管に、その混合物を移し、そして時折攪拌しながら３７℃に２時間保ち、次いでラタベイパー（ｒａｔａｖａｐｏｒ）中で蒸発乾固し、そしてジクロロメタン及び増加する量のメタノールで溶離するシリカゲルカラムを用いてその残さを精製した。収量：１．２ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝３５３。
【００４９】
《７．２−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ−１−（４−Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−３−プロパノール（ＡＤ−２６８７）の調製》
ＡＤ−２６０２の調製（６）に記載したとおりに、相当する出発材料から２−アミノ−１−（４−Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−３−プロパノール２ｇを調製した。スクリューキャップ付きの圧力ガラス管中のメタノール２０ｍＬ中に、その化合物を溶解した。ＣＨ_３Ｉ４ｍＬ、続いて炭酸ナトリウム１ｇを添加した。その圧力ガラス管を密封し、そして８０℃の加熱浴中に１２時間浸漬した。その管を冷却して開けた。その溶液を丸底フラスコに移し、そして蒸発乾固した。最小量のジクロロメタン：メタノール（１：１）中にその残さを溶解し、シリカゲルカラム上にロードし、そしてジクロロメタン及び増加するメタノールの溶液で溶離した。収量：１．６ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝４０８。
【００５０】
《８．スフィンゴシル−Ｎ−ブチルスルホンアミド（ＡＤ−２２０８−Ｂ）の調製》
２５ｍＬ容三角フラスコ中のジクロロメタン：メタノール（２：１）１０ｍＬ中に、スフィンゴシン２００ｍｇを溶解した。ブチルスルホニルクロライド２００μＬを添加し、そしてその溶液を１０分間攪拌した。次いで、１時間かけてトリエチルアミン３００μＬを５０μＬずつ添加し、そしてその溶液を一晩攪拌した。その溶液を２５０ｍＬ容分液漏斗に移し、ジクロロメタン５０ｍＬ、メタノール１５ｍＬ及び水２５ｍＬの混合物を添加し、そしてその溶液を分液漏斗中で振盪した。０．１Ｎ−ＨＣｌ（２５ｍＬ）、次いで水で、その有機相を洗浄し、そしてＭｇＳＯ_４上で乾燥した。それをろ過し、蒸発乾固し、ジクロロメタン−メタノール１ｍＬ中にその残さを溶解し、そして小型のシリカゲルカラム上にロードした。ジクロロメタン中の増加する比率のメタノールで、標記生成物を溶離した。収量：１５０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．主要Ｉ^＋＝４２０。
【００５１】
《９．スフィンゴシルホスホリルコリン−Ｎ−エチルチオ尿素（ＡＤ−２２０９）の調製》
２５ｍＬ容の三角フラスコ中のメタノール：水（２：１）１０ｍＬ中に、スフィンゴシルホスホリルコリン１００ｍｇを溶解した。攪拌しながらその溶液に、第三級ブチルイソチオシアネート１００ｍｇを添加した。その溶液を１０分間攪拌し、次いで１Ｎ炭酸水素ナトリウム２．５ｍＬを添加した。その溶液を４８時間にわたり攪拌に付し、分液漏斗に移し、そしてジクロロメタン８０ｍＬ、メタノール３０ｍＬ及び水４０ｍＬを添加した。その有機相を水４０ｍＬで洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。展開用にジクロロメタン：メタノール：水（６５：３５：５）を用いた調製用ＴＬＣにより、標記化合物を精製した。紫外線ランプにより、標記生成物を含有するシリカスポットを見つけ、削り取り、そして小型カラムにおいてジクロロメタン：メタノール：水（１：２：１）で溶離した。収量：８０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝５７４。
【００５２】
《１０．Ｌ−エリスロスフィンゴシル−Ｎ−ドデシル（ＡＤ−２７５４）の調製》
マグネチックスターラー及び還流冷却器を備えた５０ｍＬ容丸底フラスコ中のメタノール３０ｍＬ中に、合成Ｌ−エリスロスフィンゴシン１００ｍｇを溶解した。ドデシルブロマイド２００ｍｇ、続いて炭酸ナトリウム３００ｍｇを添加した。そのフラスコを水浴中で加熱し、そしてその溶液を２４時間にわたり還流した。２５０ｍＬ容分液漏斗に、その溶液を移し、ジクロロメタン５０ｍＬ及び水３０ｍＬを添加し、そして下方の有機相を収集し、そして０．５Ｎ−ＨＣｌ（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで水２５ｍＬで２回洗浄した。その有機相を、ＭｇＳＯ_４２ｇ上で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。ジクロロメタン：メタノール（１：１）１ｍＬ中に、その残さを溶解し、小型のシリカゲルカラム上にロードし、そして増加する比率のメタノール及びジクロロメタンで標記生成物を溶離した。収量：７０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝４６８。
【００５３】
《１１．Ｌ−エリスロスフィンゴシルホスホリルコリン−Ｎ−ヘキシル（ＡＤ−２１４４）》
１００ｍＬ容三角フラスコ中のメタノール：水（１：１）２５ｍＬ中に、スフィンゴシルホスホリルコリン１００ｍｇを溶解した。マグネチックスターラーによりその溶液を攪拌し、そしてヘキサナール１００ｍｇ及び酢酸２５０μＬを添加した。その混合物を２０分間攪拌し、そしてＮａＣＮＢＨ_３１００ｍｇを添加した。室温で一晩攪拌した後、溶媒を蒸発乾固し、そしてその残さを洗浄してＡＤ−２２０９（９）の調製において実施したとおりに精製した。収量：６５ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｎａ^＋＝５６２。
【００５４】
《１２．Ｄ，Ｌ−１，３−ジヒドロキシ−２−［アミノ（Ｎ−ＦＭＯＣプロピル−３−アミン）］−オクタデカン（ＡＤ−２７５１）》
メタノール：水（１：１）５０ｍＬ中に、ＤＬ−１，３−ジヒドロキシ−２−アミノオクタデカン３００ｍｇを溶解した。ＦＭＯＣβ−アラニナル（Ｎ−ＦＭＯＣ３アミノプロパナール）１００ｍｇ、続いて酢酸０．５ｍＬを添加した。その溶液を２０分間攪拌し、そして１時間かけて少しずつＮａＣＮＢＨ_３２００ｍｇを添加した。その混合物を５時間攪拌に付し、蒸発乾固し、最小量のジクロロメタン：メタノール（２：１）中に再溶解し、そして増加する比率のメタノール及びジクロロメタンを用いてシリカゲルカラム上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：２００ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝５８１。
【００５５】
《１３．Ｄ，Ｌ−１，３−ジヒドロキシ−２−［アミノ（３−アミノプロピル）］−オクタデカン（ＡＤ−２７５２）》
メタノール４ｍＬ及びピペリジン１ｍＬ中に、Ｄ，Ｌ−１，３−ジヒドロキシ−２−［アミノ（Ｎ−ＦＭＯＣプロピル−３−アミン）］オクタデカン５０ｍｇを溶解した。その混合物を３０分間攪拌し、次いで窒素流下に蒸発乾固した。ジクロロメタン：メタノール：水酸化：アンモニウム：水（８０：２０：１：１）の溶液で展開する調製用薄層クロマトグラフィーシリカプレートを用いて、標記生成物を精製した。標記生成物（ＵＶランプにより確認）を削り取り、そしてジクロロメタン：メタノール：水（１：２：１）を用いて小型カラム中のシリカゲルから溶離した。収量：３０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝３５９。
【００５６】
《１４．（２Ｒ，３Ｓ）−２−ＢＯＣ−アミノ−１−［４−Ｎ−（ドデカノイル−１２−Ｎ−ＢＯＣ−アミン）−フェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６２０）］
ＡＤ−２５０２（４）の調製において実施したとおりに、（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール３ｇにＢＯＣを結合した。ＡＤ−２５１６（２）の調製に記載したとおりに水素により、そのＢＯＣ誘導体３ｇを還元した。ＥＤＡＣ５００ｍｇの添加により、ジクロロメタン：メタノール（２：１）５０ｍＬ中のＢＯＣ１２アミノドデカン酸１ｇと、その生成物２ｇとを反応させた。その混合物を一晩攪拌し、蒸発乾固し、そしてＡＤ−２６８７（７）に記載したとおりに精製した。全収量：２．５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝６７３。
【００５７】
《１５．（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５１６Ｂ）》
ＡＤ−２５１６（２）の調製において実施したとおりに、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール５ｇの水素化により標記化合物を調製した。収量：４．９ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝１８３。
【００５８】
《１６．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−ヘキシルアミン）−１−（４−Ｎ−ヘキシルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６６５）》
ＡＤ−２５９３（１）の調製において実施したとおりに、ヘキサナール２ｇと（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール１ｇとを反応させ、そして同様の手順により精製した。標記化合物を分光光度計により定量したところ、ピーク２５５ｎｍ及びモル吸光係数１６．６光学密度単位／μｍｏｌ／ｍＬを与え
た。収量：８００ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝３５１。
【００５９】
《１７．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６４６）》
エタノール１００ｍＬ中に、（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール３ｇを溶解し、テトラデシルブロマイド４ｍＬ、続いてジイソプロピルエチルアミン５ｍＬを添加した。還流冷却器を備えた２５０ｍＬ容丸底フラスコ中で、２４時間にわたり還流温度まで、その混合物を加熱し、そしてマグネチックスターラーで攪拌した。その溶液を蒸発乾固し、ジクロロメタン：メタノール（２：１）２００ｍＬ中に溶解し、５００ｍＬ容分液漏斗に移し、そして０．２Ｎ−ＨＣｌ（７５ｍＬ）で洗浄した。相を分離し、そして０．１Ｎ−ＨＣｌ（７５ｍＬ）及びメタノール１５ｍＬでその有機相を再度洗浄した。その有機相を分離し、そして硫酸マグネシウム５ｇ上で乾燥し、ろ過し、そして蒸発乾固した。最小量の温エーテル中に、得られた油状体を溶解し、そして−２０℃に一晩放置して結晶化した。低温で結晶をろ過し、そしてＨ_２Ｏ３％を含有する熱エーテルから再結晶化させた。収量は３．６ｇ。標記化合物を分光光度計により定量したところ、ピーク２７０ｎｍを与えた。そのモル吸光係数は７．８４光学密度単位／μｍｏｌ／ｍＬであった。Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝４０９。
ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ_３）０．８８，ｔ（３Ｈ）；１．２６，ｍ（２２Ｈ）；１．４８，ｍ（２Ｈ）；２．５４，ｍ（１Ｈ）；２．７３，ｍ（２Ｈ）；３．３０，ブロードｓ（３Ｈ）；７．６，ｄ（２Ｈ）；８．２，ｄ（２Ｈ）。
【００６０】
《１８．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６７２）》
ＡＤ−２５１６（２）の調製において実施したとおりに、（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６４４）２ｇを水素化した。ジクロロメタン中の増加する濃度のメタノールで溶離するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより、得られた油状体を精製した。収量：１．５ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝３７８。
【００６１】
《１９．（２Ｒ，３Ｒ）−２アミノ−１−（Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６７３）》
ＡＤ−２６０２の調製（６）に記載したのと同じプロトコルを用いて、（２Ｒ，３Ｒ）−２（Ｎ−ｔＢＯＣアミノ）−１−（Ｎ−ドデカノイルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２５８２）２ｇから標記化合物を調製した。全収量：１．３ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝３６５。
【００６２】
２０．同じ手順により、２Ｓ，３Ｓ相当体を調製し、ＡＤ−２６７４と命名した。
【００６３】
《２１．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミン）−１−（Ｎ−テトラデカノイル−４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６８７）》
（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール５ｇからＡＤ−２６８７の調製（７）に記載したとおりに調製した（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６６７）３ｇからＡＤ−２５１６の調製（２）に記載したとおりに調製した（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミン）−１−（４−アミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ２６７１）２ｇから標記化合物を調製した。収量：２ｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝４３６。
【００６４】
《２２．（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−アダマンチルアセトアミド−フェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２７５４）》
ＥＤＣ１００ｍｇの添加により、ジクロロメタン−メタノール（１：１）１０ｍＬ中の１−アダマンタン酢酸（１−ａｄａｍａｎｔａｎｅ ａｃｅｔｉｃ）１００ｍｇと、化合物ＡＤ−２６７２（１００ｍｇ）とを反応させた。その反応混合物をマグネチックスターラーで一晩攪拌した。その溶液を蒸発乾固し、そしてジクロロメタン１ｍＬ及びメタノール０．５ｍＬの混合物中に、得られた油状体を溶解した。その溶液を２５×１ｃｍのシリカゲルカラム上にロードした。増加する量のメタノールを含有するジクロロメタンで標記化合物を溶離した。収量：９０ｍｇ；Ｍ．Ｓ．Ｉ^＋＝５５５。
【００６５】
《実施例２》
《細胞生存性への化合物ＡＤ２６４６の効果》
細胞死亡率（生細胞計数）及び／又は全タンパク質量を測定することにより、細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果を分析した。６−又は２４−ウェル・ディッシュ中の増加する濃度の（２Ｒ，３Ｒ）−２−（Ｎ−テトラデシルアミン）−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６４６）と共に、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＭＰＩ中で増殖させたＨＬ６０細胞をインキュベートした。ジメチルホルムアミド（ＤＭＳＯ）中の溶液として、この溶媒の濃度が培養基の容量の０．１％を超えないことを確認しながら、標記化合物を添加した。２日後、細胞を収集し、生理的食塩水で２回洗浄し、トリパンブルーで処理し、そして生存している（ブルーでない）細胞の数を計数した。図１は、ＩＣ５０値５μＭを示している。
【００６６】
次に、ＡＤ−２６４６化合物の観察された殺傷効果の動態（ｋｉｎｅｔｉｃ）を試験した。４０μＭのＡＤ−２６４６と共に、１時間、３時間、５時間及び７時間にわたりＨＬ６０細胞をインキュベートした。１時間後すでに、生存細胞数の６０％の減少を観察した。
【００６７】
細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果は、さらに、全タンパク質含量を定量したときに支持された。種々の濃度のＡＤ−２６４６と共に、前記のとおりに、ＨＬ６０細胞をインキュベートした。２日後、細胞を収集し、生理的食塩水で２回洗浄し、分散し、プローブ−ソニケーターでショートパルシングした後に前記細胞のタンパク質含量をブラッドフォード法により定量した。生細胞計数結果と同様に、タンパク質測定はＩＣ５０値５μＭを示した。
【００６８】
ＡＤ−２６４６化合物が、他の化合物と協同して、細胞生存性及び全タンパク質含量へのその効果を媒介することができるかどうかを分析するために、次に、標記化合物とタキソールとの協同効果を評価した。タキソール２ｎｇの存在下又は非存在下に４μＭのＡＤ２６４６と共に２日間、ＨＬ６０細胞をインキュベートした。表１に示すように、両方の化合物の協同作用により、２つの各化合物間の相乗作用を示す、全タンパク質量の有意な減少を生じた。
【００６９】
【表１】

【００７０】
《異なる細胞系へのＡＤ−２６４６の効果》
細胞生存性へのＡＤ−２６４６化合物効果の一般性を評価するために、前記開示したのと同じ方法に他の細胞系を付した。
増加する濃度のＡＤ−２６４６と共に２日間、ＴＳＵ−ＰＲ１細胞（前立腺癌細胞）をインキュベートした。図２に示したタンパク質含量測定値は、ＩＣ５０値６〜７μＭで細胞が殺傷されたことを示している。
《実施例３》
《細胞生存性への種々の化合物の効果》
次いで、細胞の全タンパク質量を測定することにより、細胞生存性への本発明の種々の化合物の効果を評価した。増加する濃度の本発明の種々の化合物の存在下に２日間、種々の細胞系をインキュベートした。その結果を表２に要約する。
【００７１】
【表２】

【００７２】
《実施例４》
《種々の化合物のアポトーシス効果》
観察された細胞生存性への効果がアポトーシスの誘導に関連しているかどうかを調べるために、次に、本発明のいくつかの化合物のアポトーシス効果を試験した。
５μＭのＡＤ−２６７２及びＡＤ−２６６５の非存在下又は存在下に２４時間にわたり、骨髄性白血病Ｕ９３７細胞をインキュベートした。次いで、細胞を収集し、そしてＤＥＶＤアーゼ、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）３活性を定量するキットを用いて、アポトーシスを起こした細胞の百分率を測定した。ＡＤ−２６７２と共にインキュベートしてアポトーシスを起こした細胞の数は、対照細胞においてアポトーシスを起こした細胞の６倍を超えた。ＡＤ−２６６５と共にインキュベートした細胞は、対照細胞における数の２．８倍を超えた。
【００７３】
さらに、フローサイトメトリー法を用いて、ＨＬ６０細胞に対して、３つの異なる化合物のアポトーシス効果を試験した。ＡＤ−２６４６、ＡＤ−２６６５又はＡＤ−２６８７と共に３時間及び２４時間及び増加する化合物濃度で、細胞をインキュベートし、収集し、そして洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、５％トリトンで処理し、そして０．１％クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中のヨウ化プロピジウム０．５％ｍｇで染色した。ベクトン・ディキンソン・蛍光活性化セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いて分析を実施した。
【００７４】
低濃度のＡＤ−２６４６化合物（１０μＭ）での３時間のインキュベーションの結果は、１２％のアポトーシスを起こした細胞を示し、２０μＭで細胞の１８％がアポトーシスを起こし、そして４０μＭで細胞の２６％がアポトーシスを起こした。より長い時間（２４時間）にわたるインキュベーションは、低濃度（１０μＭ）ですでに約５０％のアポトーシスを起こした細胞を示した。
【００７５】
同様に、ＡＤ−２６６５を用いた３時間の処理は，低濃度（１０μＭ）において約８％の細胞がアポトーシスを起こしたが、２０μＭにおいてこの値は２６％まで増加した。１０μＭで２４時間のインキュベーション後、細胞の２５％がすでにアポトーシスを起こした。
【００７６】
ＡＤ−２６８７を用いた場合、１５μＭで３時間のインキュベーション後、細胞の９％のみがアポトーシスを起こしたが、低濃度（２．５μＭ）で２４時間のインキュベーション後、５０％に近い細胞がアポトーシスを起こした。
４０μＭのＡＤ−２６４６又はＡＤ−２６６５による短時間（３０分間）処理後、細胞の５％のみがアポトーシスを起こした。
【００７７】
《実施例５》
《スフィンゴリピド代謝への種々の化合物の効果》
発明の背景に述べたように、アポトーシスにおけるセラミドの効果は十分に証明されている。従って、本発明の種々の化合物の観察されたアポトーシス効果がスフィンゴリピド代謝に関与しているかもしれないという可能性を、次に試験した。
【００７８】
スフィンゴリピド代謝への種々の化合物の効果を試験するために、ジメチルスルホキシド中の溶液（最終容量の０．１％ＤＭＳＯを超えない）として培養基に添加したボディピー−Ｃ３−セラミド２．５μＭの存在下に、増加する濃度の本発明の種々の化合物と共に種々の細胞系をインキュベートした。３時間後、細胞及び培地を収集し、そして遠心分離した。次いで、酢酸２％を含有するクロロホルム−メタノール（１：１、容量比）で細胞を抽出し、そして等しい容量のクロロホルム−メタノール（１：１、容量比）で培地を振盪した。遠心分離により相を分離し、そして下方のクロロホルム相を収集した。溶媒を蒸発させ、そして濃縮部分を用いて、薄層クロマトグラフィーシリカゲルプレート（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）４８６５−８２１）にアプライした。
【００７９】
以下のように、プレートを展開した：培地に対して：クロロホルム−メタノール−Ｈ_２Ｏ（容量比で７５：２５：４）中で。細胞に対して：最初に、クロロホルム−メタノール（９：１）でプレートを展開し、次いで乾燥し、クロロホルム−メタノール：Ｈ_２Ｏ（６５：３５：４）中で再度実施した。
【００８０】
ボディピー−Ｃ３−セラミドの標準物質：マーカーとして、ボディピー−Ｃ３−グルコシルセラミド（Ｂｏｄ３−ＧＣ）及びボディピー−Ｃ３−スフィンゴミエリン（Ｂｏｄ３−ＳＰＭ）を用いた。フジ（Ｆｕｊｉ）ＦＬＡ−２０００スキャナーを用いて、各Ｂｏｄ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ３−ＧＣスポットの蛍光を定量した。
概して言えば、Ｂｏｄ３−ＳＰＭが細胞及び培地の両方に存在していたのに対して、Ｂｏｄ３−ＧＣは実際には細胞中にのみ存在していたという結果が示された。
【００８１】
表３に示すように、種々の濃度のＡＤ−２６４６を用いたＨＬ６０細胞のインキュベーションは、ＩＣ５０値約６μＭ（図３）で、Ｂｏｄ３−ＳＰＭの低減を生じ、一方、Ｂｏｄ３−ＧＣ低減のＩＣ５０は約１２μＭ（図４）であった。
ＴＳＵ−ＰＲ１前立腺癌細胞を用いて、スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果をさらに調べた。結果は、Ｂｏｄ３−ＳＰＭの低減がＩＣ５０値約５μＭを有していることを示した（図５）。
【００８２】
【表３】

【００８３】
次に、Ｂｏｄ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ３−ＧＣの合成への種々の化合物の効果の比較を試験した。それぞれ５μＭ及び１０μＭの、種々の化合物ＡＤ−２６７２、ＡＤ−２６７３及びＡＤ−２６７４と共にＨＬ６０細胞をインキュベートした。
図６は、ＡＤ−２６７２がＢｏｄ３−ＳＰＭの量を大きく低減させるがＢｏｄ３−ＧＣの量についてはそうでないことを示す蛍光像である。対照的に、ＡＤ−２６７３及びＡＤ−２６７４は１０μＭで、Ｂｏｄ３−ＳＰＭの低い阻害を示すが、Ｂｏｄ３−ＧＣの量のはるかに大きな低減を示す。
【００８４】
《スフィンゴリピドの代謝への細胞の薬物感受性の効果》
Ｂｏｄ−Ｃ３−セラミドと共に、乳癌細胞、ＭＣＦ−ＮＣｉ（薬物感受性）及びＭＣＤ−ＡｄｒＲ（アドリアマイシン耐性）を１時間、２時間、４時間及び８時間インキュベートし、そしてそれぞれの細胞及び培地中のＢｏｄ−Ｃ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ−Ｃ３−ＧＣを定量した。薬物耐性細胞において、細胞中のＢｏｄ−Ｃ３−ＳＰＭ及びＢｏｄ−Ｃ３−ＧＣは、それぞれ、培地中の量の３〜４倍及び６倍を超えていた。驚くべきことに、アドリアマイシン耐性細胞中の各値は、有意に異なっており、薬物耐性細胞培地中に分泌されたＢｏｄ−Ｃ３−ＳＰＭ並びにＢｏｄ−Ｃ３−ＧＣの量は、その薬物感受性相当物により分泌されたそれらの量より５〜９倍まで高くなった。
【００８５】
《実施例６》
《スフィンゴミエリナーゼへのＡＤ−２１４４の阻害効果》
Ｎ−ヘキシル−スフィンゴシルホスホリルコリン（ＡＤ−２１４４）を、酸性（すなわち、約ｐＨ５で至適の）スフィンゴミエリナーゼ又は中性（約ｐＨ７．４で至適ｐＨの）スフィンゴミエリナーゼへのその阻害効果に関して試験した。この目的のために、酵素供給源として、ＨＬ６０白血病細胞の超音波処理物（ｓｏｎｉｃａｔｅ）を用いた。容量１００μＬ中の蛍光性及び非蛍光性のスフィンゴミエリン（ボディピー−Ｃ１２−ＳＰＭ：ＳＰＭ，１：１９）、緩衝液及び０．２５％トリトン−Ｘ１００の混合物により、増加する濃度のＡＤ−２１４４を分散させた。酸性スフィンゴミエリナーゼに対して、０．４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い；中性スフィンゴミエリナーゼに対して、０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）及び５ｍＭ塩化マグネシウムを用いた。これらの分散液１００μＬに対して、ＨＬ６０細胞超音波処理物１００μＬを添加した。インキュベーションを２〜３時間行った後、クロロホルム：メタノール（２：１）０．８ｍＬを添加し、攪拌し、そして下方のクロロホルム相を収集し、乾燥し、そして薄層クロマトグラフィープレートにアプライした。クロロホルム及びメタノール（８７：３）の混合物中でプレートを展開した。その生成物、すなわち、ボディピー−Ｃ１２−セラミドの蛍光を定量した。
【００８６】
酸性スフィンゴミエリナーゼ並びに中性スフィンゴミエリナーゼについて：３００μＭのＡＤ−２１４４で、ボディピー−Ｃ１２−セラミドにおいて６０％を超える量の低減があった。表４は、ＡＤ−２１４４化合物によるボディピー−Ｃ１２−セラミドの低減を示している。
【００８７】
【表４】

【００８８】
《実施例７》
《ＡＤ−２６４６のインビボ毒性》
前記実施例に示したように、ＡＤ−２６４６化合物は、アポトーシスを起こす機構を誘導することによる有意な特異的細胞死亡率を示す。このアポトーシス現象は、おそらく、スフィンゴリピド代謝の阻害により媒介されるものであろう。特異的な抗増殖性薬剤としての前記化合物の潜在的用途を評価するために、インビボ毒性試験をマウスで実施した。
【００８９】
各群５匹のスイスマウスの６群に、それぞれ容量１００μＬ中の種々の濃度のＡＤ−２６４６の溶液を腹腔内に注射した。１日目、２日目、３日目及び４日目に注射を実施し、そしてマウスの生存率を試験した（表５）。
表５に示すように、極めての高濃度のＡＤ−２６４６のみが毒性であった。
【表５】

【００９０】
《実施例８》
２倍に連続希釈した０及び増加する濃度の（２Ｓ，３Ｒ）−２Ｎ−アミノヘキシル−１−（４−Ｎ−ヘキシルアミノフェニル）−１，３−プロパンジオール（ＡＤ−２６６３）を含有する９６ウェルプレート中の培地１００μＬ（２０％ＦＳＣ、１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培養基）に、各容量１００μＬ中の２×１０^５個のリーシュマニア・メジャー・プロマスティゴート（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）細胞を添加した。インキュベーション（３時間、２７℃）後、顕微鏡下にニューランダー（Ｎｅｕｌａｎｄｅｒ）セルカウンターで各ウェルからのアリコートについて計数することにより細胞数を測定した。細胞低減のＩＣ５０は７μＭであった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】細胞生存性へのＡＤ−２６４６の効果を示すものである。
【図２】ＴＳＵ−ＰＲ細胞へのＡＤ−２６４６の細胞毒性効果を示すものである。
【図３】スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＳＰＭ）を示すものである。
【図４】スフィンゴリピド代謝へのＡＤ−２６４６の効果（ＧＣ）を示すものである。
【図５】ＡＤ−２６４６がＴＳＵ−ＰＲ１細胞におけるＳＰＭ合成を阻害することを示すものである。
【図６】本発明の化合物によるスフィンゴリピド代謝の阻害を示すものである。BACKGROUND OF THE INVENTION
[0001]
Sphingolipid (SL) consists of a group of lipids with ceramides, ie N-acylsphingosines, as basic groups. There are two main types of SL: phospho SL and glyco SL. The former has one major component, sphingomyelin (ceramide-phosphorylcholine), whereas glycosphingolipids comprise a broad group. They are derived from monohexosylceramides (ceramide β-glucose and ceramide β-galactose) to oligohexosylceramides (ie, di- and trihexosylceramides) as well as sialic acids. It extends to many gangliosides composed of xoxosylceramide. SL is actually present in all cell types and tissues and is particularly abundant in the nervous system. The relative composition of SL may change with age; thus, it has been shown that the ratio of sphingomyelin to lectin increases with age.
[0002]
Glycosphingolipids have a high binding capacity and act as specific receptors for a number of external factors such as lectins, toxins, hormones and viruses. Illustratively, vibrio cholerae toxin binds to GM1-ganglioside and Shigella dysenteriae verotoxin binds to globotriaosyl ceramide.
[0003]
During the past decade, research on sphingolipids has increased significantly due to the discovery that members of the sphingolipid group are involved in signal transduction processes [Recently, Levade et al., Biochim. Biophys. Acta, 1438, 1-17 (1999); Mathias et al., Biochem. J. et al. 335, 465-480 (1998); Perry et al., Biochim. Biophys. Acta, 1436, 233-243 (1998); Riboni et al., Prog. Lipid Res. 36, 153-195 (1997)]. The most studied compound is ceramide which has been shown to play a role in regulating key processes such as growth inhibition, differentiation and apoptosis [Hannun et al., Biochim. Biophys. Acta, 1154, 223-236; Hannun et al., Trends Cell Biol. 10, 73-80 (2001); Higgins et al., Trends Biochem. Sci. 17, 18-21 (1992)]. SPM is generally considered the primary metabolic source of ceramide. It should be noted that the production of ceramide at a specific location in the cell (eg, a membrane) makes the cell appropriate for mediating the cell's signaling process. Increased de novo synthesis of ceramide has also been described as a potential source for signal transduction [Bose et al., Cell, 82, 405-414, (1995)]. Thus, while major efforts have been directed to regulating the production of intracellular ceramide by sphingomyelinase, which is mostly a neutral membrane-bound enzyme, acidic enzymes have also been implicated. Nevertheless, regulation of biosynthetic mechanisms, such as reducing the conversion of ceramide to SPM or glycolipid, and in parallel, reducing the hydrolysis of ceramide by ceramidase will also increase the concentration of ceramide in cells. It should be emphasized.
[0004]
The role of sphingolipids in signal transduction [L. Riboni et al., Prog. Lipid Res. 36, 153-195 (1997) and A.I. Gomez-Munoz, Biochim. Biophys. Acta, 1391, 32-109 (1998)] has been extensively studied and has been proposed to act via the “sphingomyelin cycle”. According to this hypothesis, binding a specific extracellular ligand to its receptor activates plasma membrane-bound sphingomyelinase, producing ceramide that acts as a mediator of the intracellular effects of the ligand. A number of publications describe and emphasize the role of ceramide in apoptotic cell kill and the effect of ceramide on responses to important cellular events such as proliferation, differentiation and stress conditions. Short chain, cell permeable (eg C₂Or C₆Also particularly interesting is the report that ceramide causes a biological response leading to cell killing. Other studies with ceramide precursors, ie sphingosine, have shown its effect on cell growth and viability. Furthermore, sphingosine has been shown to inhibit protein kinase C and increase the intracellular concentration of calcium ions. It has been shown that phosphorylated forms of sphingosine, ie sphingosine-1-phosphate, are potential activators of phospholipase D. And di- or tri-methylated sphingosine has been shown to inhibit cancer cell growth [Endo et al., Cancer Research, 51, 1613-1618, (1981)].
[0005]
The involvement of ceramide and sphingolipid metabolism in cancer has been studied. Apoptosis induced by administration of various chemotherapeutic agents has been demonstrated to be mediated by ceramide [Strum et al., J. Biol. Biol. Chem. 269, 15493-15497 (1994); Maurer et al., J. MoI. Natl. Cancer Inst. 91, 1138-1146 (1999); Suzuki et al., Exp. Cell Res. 233, 41-47 (1997)]. Anthracyclines (eg, daunorubicin) have been shown to induce ceramide accumulation which subsequently leads to cancer cell death [Bose et al., Cell, 82, 405-414 (1995)]. The second direction of the study showed that drug-resistant cancer cells differ from drug-sensitive cancer cells in their sphingolipid metabolism. In this regard, the work of Cabot et al. [Lavie et al. Biol. Chem. 271, 19530-19536 (1996)], of particular interest, Cabot et al. Show that glucosylceramide, a direct metabolite of ceramide, is increased in several drug-resistant cells overexpressing the P-glycoprotein pump (Pgp). Prove that. Overexpression of this glycolipid-synthesizing enzyme, glucosylceramide synthetase (GCS), by retroviral expression systems resulted in conversion of doxorubicin-sensitive cells to resistant cells [Liu et al., J. Biol. Biol. Chem. 274, 1140-1146 (1999)]. Conversely, suppression of GCS expression by the antisense method increased sensitivity to doxorubicin. Cabot et al. Also have drug resistance modulators, such as tamoxifen, verapamil and cyclosporine analogs, PSC833, exerting their effects by inhibiting GCS [Cabot et al., FEBS Letters, 394, 129-131 (1996), FEBS Letters, 431. 185-199 (1998); Lavie et al. Biol. Chem. 272, 1682-1687 (1999); Lucci et al., Cancer, 86, 300-311 (1999)], proposed to cause an increase in cellular ceramide. Nicholson et al. [British J. et al. Cancer, 81, 423-430 (1989)], 1-phenyl-2-decanoyl-amino-3-morpholino-1-propanol, an inhibitor of GCS, has developed multidrug resistant cells. It was shown to kill preferentially compared to drug-sensitive counterparts.
Taken together, these studies suggest that metabolic mechanisms that reduce cellular ceramide content by converting ceramide to glucosylceramide in MDR cells make cells resistant to a range of chemotherapeutic agents.
[0006]
Hexadecylphosphocholine [HePC, Wieder et al. Biol. Chem. 273, 11025-11031, (1998)] is particularly interesting. This is an antiproliferative drug, currently used for the treatment of heterogeneous metastasis of breast cancer and has been shown to induce apoptosis at a concentration of 25 μM. The publication states that HePC, which inhibits phosphatidylcholine biosynthesis, exerts a secondary effect by reducing sphingomyelin biosynthesis and consequently increasing the amount of ceramide, and responsible for the pro-apoptotic properties of HePC Provides support that is probably the latter. In fact, the authors have shown that PC-induced apoptosis is blocked by Fumonisin B1, an inhibitor of ceramide synthesis. And short-chain, membrane-permeable ceramide further increased the apoptotic effect of HePC.
[0007]
Another major aspect of sphingolipid metabolism is hereditary lipid accumulation diseases such as Gaucher disease (β-glucosidase), Tay-Sachs disease (β-N-acetylhexosaminidase); Niemann-Pick disease ( Accumulation of sphingolipids in organs of patients suffering from acid sphingomyelinase), Krabbe disease (β-galactosidase), metachromatic leukodystrophy (arylsulfatase A), Fabry disease (ceramidase) and Faber disease (α-galactosidase) is there. Each of these diseases is due to a mutation in the gene encoding the lysosomal sphingolipid hydrolase (indicated in parentheses). As a result, the activity of each hydrolase is considerably reduced, resulting in the accumulation of each sphingolipid in the patient's organ.
[0008]
When metabolic disorders occur, metabolic deficiencies and accumulation of the corresponding sphingolipids become lifelong phenomena. Three treatment forms continue to be used or considered. 1. Enzyme replacement therapy, in which the enzyme involved is purified and injected into the patient throughout the patient's death; this approach is currently β-glucosidase purified from human placenta or alternatively a recombinant form of the enzyme Has been applied to patients with Gaucher's disease. 2. Gene therapy in which the gene encoding the normal enzyme is cloned and administered to the patient; this is currently in the planning stage. 3. Infusion of an inhibitor of sphingolipid biosynthesis that accumulates in a disease into a patient, the objective is to reduce the amount of sphingolipid that accumulates in the organ of the patient. This approach is currently in clinical trials for patients with Gaucher disease in several medical centers [Cox et al., The Lancet, 355, 1481-1485 (2000)].
[0009]
Sphingolipid has the following general structural formula:
CH₃(CH₂)₁₂-CH = CH-CHOH-CHNH [COR₁] -CH₂OR₂
(Wherein R₁Is CH₃(CH₂)_14-22R and R₂Can be a hydrogen atom, phosphorylcholine; glucose, galactose or oligosaccharide)
have.
R in the formula, which is a precursor of sphingolipid₂Ceramide, where is a hydrogen atom, is a bioeffector molecule that affects cell differentiation, apoptosis and growth inhibition.
[0010]
CH₃(CH₂)₁₂Several non-natural analogs of ceramide have been synthesized that have a phenyl group instead of a —CH═CH residue.
For example, the compound PDMP:
[Chemical 1]

Has been shown to be an inhibitor of glucosphingolipid [Vunnam & Radin Chem. Phys. Lipid, 26, 265 (1980)].
[0011]
Acylphenylamino alcohol (MAPP):
[Chemical formula 2]

Have been shown to inhibit ceramidase resulting in inhibition of cell proliferation [Bielawska et al., J. Biol. Biol. Chem. 271, 12646-12654 (1996)].
[0012]
Esters of p-nitrophenyl-amino-propanediol:
[Chemical Formula 3]

Have been shown to inhibit cell differentiation [Bielawska et al., J. Biol. Biol. Chem. 267, 18493-18497 (1992)].
[0013]
Other non-natural derivatives of sphingolipid affect cell proliferation and differentiation. For example, N, N, N-trimethylsphingosine has been shown to inhibit cell proliferation [Endo et al., Cancer Research, 51, 1613-1618 (1991)]. The amide group is —NH— (CH₂)₇CH₃: CH₃(CH₂)₁₂-CH = CH-CHOH-CHNH [(CH₂)₇CH₃] -CH₂C substituted by OH₈Ceramide induced apoptosis [Karasavvas et al., Eur. J. et al. Biochem. 236, 729-731 (1996)].
Hexadecylphosphocholine induced ceramide-mediated apoptosis [Wieder et al., J. Biol. Biol. Chem. 273, 11025-11031 (1998)].
[0014]
The object of the present invention is to provide novel therapeutic compounds capable of modulating sphingolipid metabolism.
It is a further object of the present invention to provide novel therapeutic compounds that can be used to kill unwanted cells.
These and other objects of the invention will become more apparent as the description proceeds.
SUMMARY OF THE INVENTION
[0015]
The present invention is directed to general formula (I):
[Formula 4]

[Wherein R is a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl or alkenyl chain, CH, optionally substituted by a hydroxyl group, CH₃(CH₂)_mCH = CH- group, CH₃(CH₂)_mA group (m is 0 or an integer from 1 to 20), optionally a nitro group, amino group, alkylamino group, acylamino group, —NHC (S) NH-alkyl group, sulfonylamido-alkyl group, formula
[Chemical formula 5]

A group represented by (n is an integer of 1 to 20), or a phenyl group, -NH-t-BOC group, -NH-FMOC group, or NH-CBZ substituted by a -NH-adamantane group A group;
X is a hydrogen atom or -OR₄Group (R₄Is a linear or branched, saturated or unsaturated C, optionally substituted by a hydrogen atom or optionally a hydroxy group₁~ C₆An alkyl chain or an alkenyl chain);
Y is -NH₂Group, NHR^xGroup (R^xIs a hydrogen atom, a linear or branched alkyl or alkenyl chain optionally substituted by a hydroxy group), an amino protecting group, a formula
[Chemical 6]

Group represented by
[Chemical 7]

A group represented by the formula: —NH (SO₂) R₁Group, -NR₁R₂Group, -N⁺R₁R₂R₃Group (R₁, R₂And R₃May be the same or different and each C_1-6Alkyl group or C_1-6An alkenyl group), formula
[Chemical 8]

A group represented by (n is an integer of 0 or 1 to 20), -NH-adamantane group, formula
[Chemical 9]

(Wherein “polymer” is 10³10 from Dalton⁶A group represented by a natural or synthetic biocompatible polymer having a molecular weight of Daltons;
Z is a hydrogen atom, -OH group, mono- or disaccharide, monosaccharide sulfate and choline phosphate;
Where R is an alkyl group, CH₃(CH₂)_mY is NH when CH = CH-, phenyl or nitrophenyl.₂Cannot be a group; and R₁Is a methyl group and R is CH₃(CH₂)_mWhen CH═CH— and Z is —OH, then Y is —NR₁R₂Group, -N⁺R₁R₂R₃Group or NHR₄Group (R₄Cannot be an octyl group)]
And the isomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
[0016]
The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a compound of the formula (I) in which the substituents in the formula have the meaning as defined in claim 1, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier And a pharmaceutical composition further comprising an adjuvant and a diluent.
[0017]
The pharmaceutical composition of the present invention can be used to reduce the accumulation of sphingolipids and therefore lipid accumulation diseases such as Gaucher disease, Tay-Sachs disease, Niemann-Pick disease, Krabbe disease, metachromatic It can be used to treat leukodystrophy, Fabry disease and Faber disease.
Novel compounds represented by formula (I) are inhibitors of acidic, neutral and alkaline sphingomyelinase, acidic, neutral and alkaline ceramidase, α-galactosyl synthetase, ceramide synthetase, sphingomyelin synthetase and glycoceramide synthetase Can be used as
[0018]
The pharmaceutical composition of the present invention can also be used for the treatment of cancerous diseases and the killing of wild type and drug resistant cancer cells.
The pharmaceutical composition of the present invention can also be used for the treatment of diseases of parasites, viruses, bacteria, fungi and prions.
In another aspect, the present invention provides a method for treating a lipid storage disease or cancerous disease in a patient in need of treatment for a lipid storage disease or cancerous disease, comprising the compound represented by formula (I) or the above The method of treatment comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising the compound.
<Brief description of drawings>
[0019]
Figure 1-Effect of AD-2646 on cell viability
HL60 cell viability was tested in the presence of increasing concentrations of AD-2646.
Abbreviations: Via (survival), C (cell), Contr (control), Inhi (inhibitor), Conc (concentration).
Figure 2-Cytotoxic effect of AD-2646 on TSU-PR cells
The cytotoxic effect of AD-2646 was tested over 2 days with increasing concentrations of AD-2646. Total protein was measured. Abbreviation: Prot (protein).
Figure 3-Effect of AD-2646 on sphingolipid metabolism (SPM)
HL60 cells were incubated for 3 hours with increasing concentrations of AD-2646 in the presence of Bodipy-C3-ceramide 2.5 μM. After extraction, the lipid was applied onto a thin layer chromatography plate and the fluorescence of body pea-C3-sphingomyelin (SPM) was quantified.
Figure 4-Effect of AD-2646 on sphingolipid metabolism (GC)
HL60 cells were incubated for 3 hours with increasing concentrations of AD-2646 in the presence of 2.5 μM body pea-C3-ceramide. After extraction, the lipid was applied onto a thin layer chromatography plate and the fluorescence of body pea-C3-cerebroside (GC) was quantified.
Fig. 5-AD-2646 inhibits SPM synthesis in TSU-PR1 cells
TSU-PR1 cells were incubated for 3 days in the presence of increasing concentrations of AD-2646 and the fluorescence of body pea-C3-sphingomyelin (SPM) was quantified.
FIG. 6-Inhibition of sphingolipid metabolism by compounds of the present invention
HL60 cells were incubated with various compounds AD-2672, AD-2673 and AD-2675 (5 μM and 10 μM, respectively). The effect of the various compounds on the synthesis of Bod3-SPM and Bod3-GC was tested. The relative amounts of SPM and GC are shown in the fluorescence image of the plate.
Abbreviation: Cont (control)
[0020]
In the search for substances that can regulate the metabolism of sphingolipid, we have the general formula (I):
Embedded image

[Wherein R is a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl or alkenyl chain, CH, optionally substituted by a hydroxyl group, CH₃(CH₂)_mCH = CH- group, CH₃(CH₂)_mA group (m is 0 or an integer from 1 to 20), optionally a nitro group, amino group, alkylamino group, acylamino group, -NHC (S) NH-alkyl group, sulfonylamidoalkyl group, formula
Embedded image

(N is an integer of 1 to 20) Yes;
X is a hydrogen atom or -OR₄Group (R₄Is a straight or branched, saturated or unsaturated C, optionally substituted by a hydrogen atom or optionally a hydroxy group₁~ C₆An alkyl chain or an alkenyl chain);
Y is -NH₂Group, NHR^xGroup (R^xIs a hydrogen atom, a linear or branched alkyl or alkenyl chain optionally substituted by a hydroxy group), an amino protecting group, a formula
Embedded image

Group represented by
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A group represented by the formula: —NH (SO₂) R₁Group, -NR₁R₂Group, -N⁺R₁R₂R₃Group (R₁, R₂And R₃May be the same or different and each C_1-6Alkyl group or C_1-6An alkenyl group), formula
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A group represented by (n is an integer of 0 or 1 to 20), -NH-adamantane group, formula
Embedded image

(Wherein “polymer” is 10³10 from Dalton⁶A natural or synthetic biocompatible polymer having a molecular weight of Dalton);
Z is a hydrogen atom, -OH group, mono- or disaccharide, monosaccharide sulfate and choline phosphate;
Where R is an alkyl chain or an alkenyl chain, CH₃(CH₂)_mY is NH when CH = CH-, phenyl or nitrophenyl.₂Cannot be a group; and R₁Is a methyl group and R is CH₃(CH₂)_mWhen CH═CH— and Z is —OH, then Y is —NR₁R₂Group, -N⁺R₁R₂R₃Group or NHR4 group (R₄Cannot be an octyl group)]
A series of novel compounds having and isomers and pharmaceutically acceptable salts were synthesized.
[0021]
A preferred compound represented by the formula (I) is a compound in which R is an aminophenyl group or a nitrophenyl group.
Y in the formula is —NH₂Group, NHR^xA group of compounds of formula (I), especially R in the formula^xAlso preferred are compounds wherein is an alkyl chain.
The amino protecting group can be any suitable amino protecting group known to those skilled in the art, in particular BOC (tertiary butyloxycarbonyl), FMOC (fluorenylmethoxycarbonyl) or CBZ (benzyloxycarbonyl). .
[0022]
Some specific particularly preferred compounds are listed below. Note that the length of the alkyl or alkenyl chain can be varied. A compound containing an adamantyl moiety can be advantageous because the size and configuration of the group allows the compound to remain in the cell membrane and affect the enzymes in the membrane.
[0023]
Other preferred compounds are those in which Y is
Embedded image

(Wherein “polymer” has a molecular weight of 10³-10⁶A natural or synthetic biocompatible polymer having, for example, heparin, hyaluronic acid, dextran, carboxymethylcellulose, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, polyethylene glycol, peptide or protein. Can be. Since the polymer compound of the present invention cannot permeate the cell membrane and enter the cell, it can be inhibited only at the outer cell membrane or the extracellular periphery.
[0024]
Some certain preferred compounds have the formula
Embedded image

(Referred to as AD-2665), formula
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(Referred to as AD-2687), formula
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(Referred to as AD-2646), formula
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(Referred to as AD-2672), formula
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(Referred to as AD-2754), formula
Embedded image

(Referred to as AD-2673), formula
Embedded image

(Referred to as AD-2144).
[0025]
As shown in the examples below, the novel synthetic compounds of the present invention can inhibit sphingolipid degradation as well as biosynthesis. Thus, these compounds are subject to lipidosis, especially genetic lipid accumulation diseases where sphingolipid accumulates in the affected patient's organs, such as Gaucher disease, Tay-Sachs disease, Niemann-Pick disease, Krabbe disease, metachromatic It can be used to treat leukodystrophy, Fabry disease and Faber disease. Pharmaceutical compositions for the treatment of lipid storage disorders are also within the scope of the present invention.
[0026]
Use of the compounds of the present invention alone or in combination with other anticancer agents has led to the killing of various cells including drug sensitive cells and drug resistant cells. The present invention therefore also relates to a pharmaceutical composition for the treatment of cancerous diseases, comprising as an active ingredient a compound of the invention, optionally in combination with at least one other anticancer agent.
Still further, the compounds of the present invention can be used to treat parasitic diseases such as malaria and leishmania. Pharmaceutical compositions for the treatment of the parasitic diseases are also within the scope of the present invention.
[0027]
The compounds of the invention are generally provided in the form of pharmaceutical compositions. The composition is for use by injection or by ingestion.
The pharmaceutical composition of the present invention is generally a buffer, an agent that adjusts the osmotic pressure of the pharmaceutical composition, and, for example, for the purpose of imparting flavor, color, lubrication, etc. Contains one or more known carriers, excipients and / or additives.
[0028]
Each carrier must be both pharmaceutically and physiologically acceptable in the sense of being compatible with the other ingredients and not injurious to the patient to be treated. The formulations include those suitable for rectal and nasal administration, but preferred formulations are for oral or parenteral administration, including intramuscular, intradermal, subcutaneous and especially intravenous administration. Is directed. The formulations can conveniently be provided in unit dosage form and can be manufactured by any method known in the pharmaceutical industry.
[0029]
The carrier can include starch and derivatives thereof, cellulose and derivatives thereof such as microcrystalline cellulose, xanthan gum and the like. The lubricant can include hardened castor oil and the like.
A preferred buffer is a phosphate buffered saline solution (PBS), which is also adjusted for osmotic pressure.
[0030]
As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known to those skilled in the art. Except where any conventional vehicle or agent is incompatible with the active ingredient, its use in therapeutic compositions is contemplated.
[0031]
Preferred pharmaceutical formulations are preferably used for administration by injection, including intravenous injection.
The composition of the present invention can be administered in various ways. By way of non-limiting example, the composition can be administered by intravenous, intramuscular, or intraperitoneal injection. For example, intravenous administration is advantageous.
[0032]
Pharmaceutical forms suitable for injection include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. The form must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants.
[0033]
Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable compositions can be achieved by use in a composition of agents that delay absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
[0034]
Sterile injectable solutions are prepared by adding the required amount of the active ingredient in a suitable solvent having the various other ingredients listed above and, if necessary, subsequent filter sterilization. Generally, dispersions are prepared by adding the various sterilized active ingredients in a sterile carrier that contains the required ingredients from the basic dispersion medium and the other ingredients listed above.
In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred method of manufacture is to add any additional desired ingredients to the active ingredient from a pre-sterilized filtered solution with any additional desired ingredients added to the active ingredient. A vacuum drying method and a freeze drying method to produce a powder with added
[0035]
For oral administration, the composition of the invention can be mixed with a nutritional feed or water supply for the patient to be treated. However, it is contemplated that an effective composition can be mixed with a nutritional feed or water or can be separately supplied to a patient.
The preparation of pharmaceutical compositions is well known to those skilled in the art and is described in many articles and textbooks, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. et al. R. See Edit, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990, and especially pages 1521-1712 thereof.
[0036]
Additives can also be designed to increase the absorption of active ingredients across the cell membrane. The agent is generally an agent that enhances cellular absorption of the molecules of the invention. For example, the compound of the present invention can be encapsulated in liposomes. The preparation and use of liposomes, for example with certain transfection reagents, is well known to those skilled in the art. Other methods of obtaining liposomes include the use of Sendai virus or other viruses.
[0037]
Said lipid agent can also improve the stability of the active compound absorbed by the cells.
The amount of active agent can vary. The amount will generally depend on the disease, the condition of the disease, the age, weight and sex of the patient and should be determined by the attending physician.
The present invention relates to a method for treating or preventing lipid accumulation disease, cancerous disease or parasite disease, wherein the compound or pharmaceutical composition of the present invention or any preferred embodiment thereof is in need of the treatment or prevention. It also relates to the method of treatment or prophylaxis comprising administration to the above.
[0038]
Details of numerous methods in the field of molecular biology are well known to those skilled in the art and are not presented here. Such methods include site-directed mutagenesis, PCR cloning, cDNA expression, recombinant protein or peptide analysis, bacterial and yeast cell transformation, mammalian cell transfection, and the like. Textbooks describing the methods are described in, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; M.M. By Ausubel, ISBN: 047150338X, John Wiley & Sons, Inc. 1988, and Short Protocols in Molecular Biology, F.M. M.M. (Edited) 3rd edition by Ausubel et al., John Wiley &Sons; ISBN: 047137812, 1995. All of these publications are hereby incorporated by reference. Furthermore, since numerous immunological techniques are well known to those skilled in the art, the technical details in each example are not described herein. See, eg, Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Edit), John Wiley & Sons. Inc. See, New York, New York.
[0039]
Throughout the specification and claims, unless the context requires otherwise, the term “comprise” and variations thereof, eg, “comprises” and “including” It is to be understood that the inclusion of the described integers or steps or integers or groups of steps is not meant to imply the exclusion of any other integers or steps or integers or groups of steps.
As used herein and in the appended claims, the singular forms “a”, “an”, and “the” are understood to have other meanings clearly in the context. Except where it should, it includes multiple objects.
[0040]
The invention disclosed and described is not limited to the specific examples, process steps, and materials disclosed herein, as the process steps and materials disclosed herein may vary to some extent. Please understand that. Since the scope of the present invention is limited only by the appended claims and their equivalents, the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is limited. It should be understood that this is not intended.
[0041]
Accordingly, the following examples are merely representative of the techniques used by the present invention in practicing aspects of the present invention. While these techniques are representative of preferred embodiments for the practice of the present invention, many modifications may be made by those skilled in the art in light of the present disclosure without departing from the spirit and intended scope of the invention. It will be appreciated that it will be appreciated.
【Example】
[0042]
《Experimental procedure》
Cell line
HL60: human leukemia cell line (ATCC CCL-240)
TSU-PR1: Prostate cancer cells (available at ATCC)
MCF7-AdrR: human breast cancer cells, drug resistance (available at ATCC)
MCF7-NCi: human breast cancer cells, drug sensitivity (available at ATCC)
U937: Myeloid leukemia cells (available at ATCC)
[0043]
Example 1: Synthesis of compound
<< 1. Preparation of (2R, 3R) -2- (N-hexylamine) -1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol (AD-2593) >>
2 g of (2R, 3R) -2-amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol was dissolved in 50 mL of methanol in a round bottom flask. To the magnetically stirred solution was added 0.1 N HCl (5 mL) followed by 2 g of hexyl aldehyde (hexanal). The mixture was stirred for 30 minutes and then divided into several portions over 3 hours with NaBH.₄1 g was added. The mixture is left under stirring overnight, the solution is transferred to a separatory funnel and H₂100 mL of O and 100 mL of dichloromethane were added and the solvent mixture was shaken. The lower phase is collected, the aqueous methanol phase is extracted twice with 50 mL of dichloromethane: methanol (3: 1), the three lower phases are combined, and H₂Shake with 75 mL O. The organic phase is MgSO₄Dried, filtered and evaporated to dryness. The residue was dissolved in a small volume of dichloromethane: methanol (1: 1) and loaded onto a 50 × 2 cm silica gel column. The title compound was eluted with dichloromethane containing increasing amounts of methanol. Yield: 1.2 g; S. I⁺= 296.
[0044]
<< 2. Preparation of (2S, 3R) 2-amino-1- (4-aminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2516) >>
Dissolve 5 g of (2S, 3R) -2-amino-1- (4-aminophenyl) -1,3-propanediol in 150 mL of methanol, add 100 mg of 10% Pd / C and allow the solution to hydrolyze at room temperature. Hydrogenated at 50 Psi for 6 hours in the generator. The catalyst was removed by filtration and the solution was evaporated to dryness. The dried compound was used for synthesis without further purification. Yield: 5 g; S. I⁺= 183.
[0045]
<< 3. Preparation of (2S, 3S) -2- (N-octylamine) -1- (4-N-octylaminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2670) >>
(2S, 3S) -2-amino-1- (4-aminophenyl) -1,3-propanediol (as described in AD-2516) in 100 mL of methanol: water (1: 1) in a round bottom flask. Preparation) 3 g was dissolved. The solution was stirred magnetically and 1 mL of octylaldehyde (octanal) was added followed by 1 mL of acetic acid. The solution was stirred for 15 minutes and in portions over 2 hours sodium cyanoborohydride NaCNBH.₃1 g was added. The solution was stirred for an additional 3 hours, then transferred to a separatory funnel and 100 mL water and 50 mL dichloromethane and 25 mL methanol were added. After shaking, the lower phase is collected and the upper aqueous methanol phase is₂Cl₂Extracted twice with 50 mL of MeOH (3: 1). The combined organic phase is H₂Wash with 100 mL of O, MgSO₄Dry above for 2 hours, filter and evaporate the solution to dryness. The residue was dissolved in a minimum amount of dichloromethane: ethanol (1: 1) and loaded onto 2 × 50 cm silica gel. The column was eluted with increasing amounts of methanol in dichloromethane. Yield: 2.1 g; S. I⁺= 407.
[0046]
<< 4. Preparation of (2R, 3R) -2-BOC amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol (AD-2502) >>
Dissolve 8 g of (2R, 3R) -2-amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol in 100 mL of dichloromethane: methanol (2: 1) and dissolve in 50 mL of the same solvent mixture. 6 g of BOC anhydride was added. The solution became clear when the solution was placed in a 250 mL Erlenmeyer and stirred for 30 minutes. Then, it was further stirred for 12 hours. The solution was evaporated to dryness and the residue was dissolved in 100 mL water and 100 mL isopropanol, then transferred to a separatory funnel and washed with 100 mL heptane. The heptane phase was removed and an additional amount of 60 mL heptane was added. Each phase was mixed and the heptane phase was removed. The aqueous phase was extracted with 100 mL of dichloromethane. The dichloromethane phase is₄Dry over 5 g for 2 hours, then filter and evaporate to dryness. The title compound was used without further purification. Yield 8 g; S. I⁺= 313.
[0047]
<< 5. Preparation of (2R, 3S) -2-BOC-amino-1- (4-N-hexadecanoylaminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2522) >>
BOC was coupled to 4 g of 2R, 3S-2-amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol as described in Preparation (4) of AD2502. 2 g of the BOC derivative was reduced with hydrogen as described in AD2516 (2). The product, 1 g of each aminophenyl derivative, was reacted with 1 g of hexadecanoic acid in 50 mL of dichloromethane: methanol (2: 1) by addition of 1 g of EDAC. The reaction mixture was stirred overnight, evaporated to dryness, the residue was dissolved in 4 mL of dichloromethane-methanol (1: 1), and loaded onto a 50 × 1.5 cm silica gel column prepared in dichloromethane. The title compound was eluted with a mixture of dichloromethane and increasing amounts of methanol. Total yield: 4.5 g; S. I⁺= 521.
[0048]
<< 6. Preparation of (2R, 3R) -2-amino-1- (4-N-butyroylaminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2602) >>
(2R, 3R) -2-BOC-amino-1- (4-N-butyroylaminophenyl) -1,3-propanediol (hexadecane) in 10 mL of trifluoroacetic acid (TFA): dichloromethane (1: 1) Prepared as described in the preparation of compound AD-2522 using butyric acid instead of acid. Transfer the mixture to a test tube with a 20 mL screw cap and keep at 37 ° C for 2 hours with occasional stirring, then evaporate to dryness in a ratavavapor and elute with dichloromethane and increasing amounts of methanol. The residue was purified using a silica gel column. Yield: 1.2 g; S. I⁺= 353.
[0049]
<< Preparation of 2-N, N, N-trimethylamino-1- (4-N-dodecanoylaminophenyl) -3-propanol (AD-2687) >>
2-amino-1- (4-N-dodecanoylaminophenyl) -3-propanol 2 g was prepared from the corresponding starting material as described in preparation of AD-2602 (6). The compound was dissolved in 20 mL of methanol in a pressure glass tube with a screw cap. CH₃I4 mL was added followed by 1 g of sodium carbonate. The pressure glass tube was sealed and immersed in a heating bath at 80 ° C. for 12 hours. The tube was cooled and opened. The solution was transferred to a round bottom flask and evaporated to dryness. The residue was dissolved in a minimum amount of dichloromethane: methanol (1: 1), loaded onto a silica gel column and eluted with dichloromethane and increasing methanol solutions. Yield: 1.6 g; S. I⁺= 408.
[0050]
<< 8. Preparation of sphingosyl-N-butylsulfonamide (AD-2208-B) >>
200 mg of sphingosine was dissolved in 10 mL of dichloromethane: methanol (2: 1) in a 25 mL Erlenmeyer flask. 200 μL of butylsulfonyl chloride was added and the solution was stirred for 10 minutes. Then 300 μL of triethylamine was added in 50 μL portions over 1 hour and the solution was stirred overnight. The solution was transferred to a 250 mL separatory funnel, a mixture of 50 mL dichloromethane, 15 mL methanol and 25 mL water was added and the solution was shaken in a separatory funnel. Wash the organic phase with 0.1 N HCl (25 mL) then water and MgSO₄Dried on. It was filtered, evaporated to dryness, the residue was dissolved in 1 mL of dichloromethane-methanol and loaded onto a small silica gel column. The title product was eluted with increasing proportions of methanol in dichloromethane. Yield: 150 mg; S. Major I⁺= 420.
[0051]
<< 9. Preparation of sphingosylphosphorylcholine-N-ethylthiourea (AD-2209) >>
100 mg of sphingosylphosphorylcholine was dissolved in 10 mL of methanol: water (2: 1) in a 25 mL Erlenmeyer flask. To the solution with stirring, 100 mg of tertiary butyl isothiocyanate was added. The solution was stirred for 10 minutes and then 2.5 mL of 1N sodium bicarbonate was added. The solution was stirred for 48 hours, transferred to a separatory funnel, and 80 mL dichloromethane, 30 mL methanol and 40 mL water were added. The organic phase is washed with 40 mL water and then MgSO₄Dry above, filter and evaporate to dryness. The title compound was purified by preparative TLC using dichloromethane: methanol: water (65: 35: 5) for development. The silica spot containing the title product was found by a UV lamp, scraped and eluted in a small column with dichloromethane: methanol: water (1: 2: 1). Yield: 80 mg; S. I⁺= 574.
[0052]
<< 10. Preparation of L-erythrosphingosyl-N-dodecyl (AD-2754) >>
100 mg of synthetic L-erythrosphingosine was dissolved in 30 mL of methanol in a 50 mL round bottom flask equipped with a magnetic stirrer and reflux condenser. 200 mg dodecyl bromide was added followed by 300 mg sodium carbonate. The flask was heated in a water bath and the solution was refluxed for 24 hours. Transfer the solution to a 250 mL separatory funnel, add 50 mL dichloromethane and 30 mL water, and collect the lower organic phase and wash with 0.5 N HCl (25 mL), then wash twice with 25 mL water. did. The organic phase is MgSO₄Dry over 2 g, filter and evaporate to dryness. The residue was dissolved in 1 mL of dichloromethane: methanol (1: 1), loaded onto a small silica gel column and the title product eluted with increasing proportions of methanol and dichloromethane. Yield: 70 mg; S. I⁺= 468.
[0053]
<< 11. L-erythrosphingosylphosphorylcholine-N-hexyl (AD-2144) >>
100 mg of sphingosylphosphorylcholine was dissolved in 25 mL of methanol: water (1: 1) in a 100 mL Erlenmeyer flask. The solution was stirred with a magnetic stirrer and 100 mg of hexanal and 250 μL of acetic acid were added. The mixture was stirred for 20 minutes and NaCNBH₃100 mg was added. After stirring overnight at room temperature, the solvent was evaporated to dryness and the residue was washed and purified as done in the preparation of AD-2209 (9). Yield: 65 mg; S. Na⁺= 562.
[0054]
<< 12. D, L-1,3-dihydroxy-2- [amino (N-FMOC propyl-3-amine)]-octadecane (AD-2751) >>
In 50 mL of methanol: water (1: 1), 300 mg of DL-1,3-dihydroxy-2-aminooctadecane was dissolved. 100 mg FMOC β-alaninal (N-FMOC3 aminopropanal) was added followed by 0.5 mL acetic acid. The solution was stirred for 20 minutes and in portions over 1 hour NaCNBH₃200 mg was added. The mixture is stirred for 5 hours, evaporated to dryness, redissolved in a minimum amount of dichloromethane: methanol (2: 1) and column chromatographed on a silica gel column with increasing ratios of methanol and dichloromethane. Purified by chromatography. Yield: 200 mg; S. I⁺= 581.
[0055]
<< 13. D, L-1,3-dihydroxy-2- [amino (3-aminopropyl)]-octadecane (AD-2752) >>
In 4 mL of methanol and 1 mL of piperidine, 50 mg of D, L-1,3-dihydroxy-2- [amino (N-FMOC propyl-3-amine)] octadecane was dissolved. The mixture was stirred for 30 minutes and then evaporated to dryness under a stream of nitrogen. The title product was purified using preparative thin layer chromatography silica plates developed with a solution of dichloromethane: methanol: hydroxide: ammonium: water (80: 20: 1: 1). The title product (checked by UV lamp) was scraped and eluted from the silica gel in a small column with dichloromethane: methanol: water (1: 2: 1). Yield: 30 mg; S. I⁺= 359.
[0056]
<< 14. (2R, 3S) -2-BOC-amino-1- [4-N- (dodecanoyl-12-N-BOC-amine) -phenyl) -1,3-propanediol (AD-2620)]
BOC was coupled to 3 g of (2R, 3S) -2-amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol as performed in the preparation of AD-2502 (4). The 3 g of the BOC derivative was reduced with hydrogen as described in the preparation of AD-2516 (2). By adding 500 mg of EDAC, 1 g of BOC12 aminododecanoic acid in 50 mL of dichloromethane: methanol (2: 1) was reacted with 2 g of the product. The mixture was stirred overnight, evaporated to dryness and purified as described in AD-2687 (7). Total yield: 2.5 g; S. I⁺= 673.
[0057]
<< 15. (2R, 3R) -2-amino-1- (4-aminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2516B) >>
The title compound was prepared by hydrogenation of 5 g of (2R, 3R) -2-amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol as performed in the preparation of AD-2516 (2). Yield: 4.9 g; S. I⁺= 183.
[0058]
<< 16. (2R, 3R) -2- (N-hexylamine) -1- (4-N-hexylaminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2665) >>
As carried out in the preparation of AD-2593 (1), 2 g of hexanal and 1 g of (2R, 3R) -2-amino-1- (4-aminophenyl) -1,3-propanediol are reacted and the like Purified by the following procedure. Quantification of the title compound with a spectrophotometer gives a peak of 255 nm and a molar extinction coefficient of 16.6 optical density units / μmol / mL.
It was. Yield: 800 mg; S. I⁺= 351.
[0059]
<< 17. (2R, 3R) -2- (N-tetradecylamine) -1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol (AD-2646) >>
3 g of (2R, 3R) -2-amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol was dissolved in 100 mL of ethanol, and 4 mL of tetradecyl bromide was added, followed by 5 mL of diisopropylethylamine. The mixture was heated to reflux temperature for 24 hours in a 250 mL round bottom flask equipped with a reflux condenser and stirred with a magnetic stirrer. The solution was evaporated to dryness, dissolved in 200 mL dichloromethane: methanol (2: 1), transferred to a 500 mL separatory funnel and washed with 0.2 N HCl (75 mL). The phases were separated and the organic phase was washed again with 0.1 N HCl (75 mL) and 15 mL methanol. The organic phase was separated and dried over 5 g magnesium sulfate, filtered and evaporated to dryness. The resulting oil was dissolved in a minimum amount of warm ether and allowed to crystallize at -20 ° C overnight. Filter the crystals at low temperature and H₂Recrystallized from hot ether containing O3%. Yield 3.6g. The title compound was quantified with a spectrophotometer to give a peak of 270 nm. Its molar extinction coefficient was 7.84 optical density units / μmol / mL. M.M. S. I⁺= 409.
NMR: (CDCl₃) 0.88, t (3H); 1.26, m (22H); 1.48, m (2H); 2.54, m (1H); 2.73, m (2H); 3.30, Broad s (3H); 7.6, d (2H); 8.2, d (2H).
[0060]
<< 18. (2R, 3R) -2- (N-tetradecylamine) -1- (4-aminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2672) >>
(2R, 3R) -2- (N-tetradecylamine) -1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol (AD-2644) as performed in the preparation of AD-2516 (2). 2 g was hydrogenated. The resulting oil was purified by column chromatography on silica gel eluting with increasing concentrations of methanol in dichloromethane. Yield: 1.5 g; S. I⁺= 378.
[0061]
<< 19. (2R, 3R) -2amino-1- (N-dodecanoylaminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2673) >>
Using the same protocol described in the preparation of AD-2602 (6), (2R, 3R) -2 (N-tBOCamino) -1- (N-dodecanoylaminophenyl) -1,3-propanediol The title compound was prepared from 2 g of (AD-2582). Total yield: 1.3 g; S. I⁺= 365.
[0062]
20. A 2S, 3S equivalent was prepared by the same procedure and designated AD-2675.
[0063]
<< 21. (2R, 3R) -2- (N, N, N-trimethylamine) -1- (N-tetradecanoyl-4-aminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2687) >>
(2R, 3R) -2-Amino-1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol was prepared from 5 g as described in Preparation of AD-2687 (7) (2R, 3R) -2- Prepared from 3 g of (N, N, N-trimethylamine) -1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol (AD-2667) as described in Preparation (2) of AD-2516 (2R, The title compound was prepared from 2 g of 3R) -2- (N, N, N-trimethylamine) -1- (4-aminophenyl) -1,3-propanediol (AD2671). Yield: 2 g; S. I⁺= 436.
[0064]
<< 22. (2R, 3R) -2- (N-tetradecylamine) -1- (4-adamantylacetamido-phenyl) -1,3-propanediol (AD-2754) >>
Addition of 100 mg of EDC reacted 100 mg of 1-adamantane acetic acid in 10 mL of dichloromethane-methanol (1: 1) with compound AD-2672 (100 mg). The reaction mixture was stirred overnight with a magnetic stirrer. The solution was evaporated to dryness and the resulting oil was dissolved in a mixture of 1 mL dichloromethane and 0.5 mL methanol. The solution was loaded onto a 25 × 1 cm silica gel column. The title compound was eluted with dichloromethane containing increasing amounts of methanol. Yield: 90 mg; S. I⁺= 555.
[0065]
Example 2
<< Effect of Compound AD2646 on Cell Viability >>
The effect of AD-2646 on cell viability was analyzed by measuring cell mortality (live cell count) and / or total protein content. Increasing concentrations of (2R, 3R) -2- (N-tetradecylamine) -1- (4-nitrophenyl) -1,3-propanediol (AD-2646) in 6- or 24-well dishes In addition, HL60 cells grown in RMPI with 10% fetal calf serum were incubated. The title compound was added as a solution in dimethylformamide (DMSO), making sure that the concentration of this solvent did not exceed 0.1% of the culture medium volume. Two days later, the cells were harvested, washed twice with saline, treated with trypan blue, and the number of viable (not blue) cells was counted. FIG. 1 shows an IC50 value of 5 μM.
[0066]
Next, the kinetics of the observed killing effect of AD-2646 compound was tested. HL60 cells were incubated with 40 μM AD-2646 for 1, 3, 5 and 7 hours. Already after 1 hour, a 60% reduction in the number of viable cells was observed.
[0067]
The effect of AD-2646 on cell viability was further supported when total protein content was quantified. HL60 cells were incubated as described above with various concentrations of AD-2646. Two days later, the cells were collected, washed twice with physiological saline, dispersed, and after short pulsing with a probe-sonicator, the protein content of the cells was quantified by the Bradford method. Similar to the live cell count results, the protein measurement showed an IC50 value of 5 μM.
[0068]
To analyze whether the AD-2646 compound can cooperate with other compounds to mediate its effect on cell viability and total protein content, then the synergistic effect of the title compound and taxol. Evaluated. HL60 cells were incubated for 2 days with 4 μM AD2646 in the presence or absence of 2 ng taxol. As shown in Table 1, the synergistic action of both compounds resulted in a significant decrease in total protein content, indicating a synergistic effect between the two compounds.
[0069]
[Table 1]

[0070]
<< Effect of AD-2646 on different cell lines >>
To assess the generality of the AD-2646 compound effect on cell viability, other cell lines were subjected to the same method as disclosed above.
TSU-PR1 cells (prostate cancer cells) were incubated for 2 days with increasing concentrations of AD-2646. The protein content measurements shown in FIG. 2 indicate that the cells were killed with an IC50 value of 6-7 μM.
Example 3
<< Effects of various compounds on cell viability >>
The effect of various compounds of the invention on cell viability was then evaluated by measuring the total protein content of the cells. Various cell lines were incubated for 2 days in the presence of increasing concentrations of various compounds of the invention. The results are summarized in Table 2.
[0071]
[Table 2]

[0072]
Example 4
《Apoptotic effect of various compounds》
In order to investigate whether the observed effects on cell viability are related to the induction of apoptosis, the apoptotic effects of several compounds of the present invention were then tested.
Myeloid leukemia U937 cells were incubated for 24 hours in the absence or presence of 5 μM AD-2672 and AD-2665. Cells were then harvested and the percentage of cells undergoing apoptosis was determined using a kit that quantifies DEVDase, caspase 3 activity. The number of cells that were apoptotic when incubated with AD-2672 was more than 6 times that of apoptotic cells in control cells. Cells incubated with AD-2665 exceeded 2.8 times the number in control cells.
[0073]
In addition, the apoptotic effect of three different compounds was tested on HL60 cells using flow cytometry. Cells were incubated, harvested and washed at 3 and 24 hours and increasing compound concentrations with AD-2646, AD-2665 or AD-2687. The washed cells were then treated with 5% Triton and stained with 0.5% mg of propidium iodide in 0.1% sodium citrate (pH 7.4). Analysis was performed using a Becton Dickinson Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS).
[0074]
The results of a 3 hour incubation with a low concentration of AD-2646 compound (10 μM) show 12% apoptotic cells, 20 μM 18% of the cells and 40 μM 26% of the cells Apoptosis occurred. Incubation over a longer period (24 hours) showed cells that had already undergone about 50% apoptosis at low concentrations (10 μM).
[0075]
Similarly, treatment for 3 hours with AD-2665 resulted in apoptosis of approximately 8% of cells at low concentrations (10 μM), but this value increased to 26% at 20 μM. After 24 hours incubation at 10 μM, 25% of the cells were already apoptotic.
[0076]
With AD-2687, only 9% of the cells were apoptotic after 3 hours incubation at 15 μM, but close to 50% of the cells were apoptotic after 24 hours incubation at low concentration (2.5 μM). I woke up.
After a short time (30 minutes) treatment with 40 μM AD-2646 or AD-2665, only 5% of the cells were apoptotic.
[0077]
Example 5
<< Effects of various compounds on sphingolipid metabolism >>
As stated in the background of the invention, the effect of ceramide on apoptosis is well documented. Therefore, the possibility that the observed apoptotic effects of various compounds of the present invention may be involved in sphingolipid metabolism was next examined.
[0078]
In order to test the effect of various compounds on sphingolipid metabolism, in the presence of 2.5 μM body pea-C3-ceramide added to the culture medium as a solution in dimethyl sulfoxide (does not exceed 0.1% DMSO of the final volume). Various cell lines were incubated with increasing concentrations of various compounds of the invention. After 3 hours, cells and media were collected and centrifuged. The cells were then extracted with chloroform-methanol (1: 1, volume ratio) containing 2% acetic acid and the medium was shaken with an equal volume of chloroform-methanol (1: 1, volume ratio). The phases were separated by centrifugation and the lower chloroform phase was collected. The solvent was evaporated and the concentrated portion was applied to a thin layer chromatography silica gel plate (Whatman 4865-821).
[0079]
Plates were developed as follows: For medium: chloroform-methanol-H₂In O (75: 25: 4 by volume). For cells: first develop plate with chloroform-methanol (9: 1) then dry, chloroform-methanol: H₂Performed again in O (65: 35: 4).
[0080]
Body pea-C3-ceramide standard substances: body pea-C3-glucosylceramide (Bod3-GC) and body pea-C3-sphingomyelin (Bod3-SPM) were used as markers. The fluorescence of each Bod3-SPM and Bod3-GC spot was quantified using a Fuji FLA-2000 scanner.
Overall, the results showed that Bod3-SPM was present in both cells and media, whereas Bod3-GC was actually present only in the cells.
[0081]
As shown in Table 3, incubation of HL60 cells with various concentrations of AD-2646 resulted in a reduction in Bod3-SPM with an IC50 value of approximately 6 μM (FIG. 3), while an IC50 for Bod3-GC reduction was It was about 12 μM (FIG. 4).
The effect of AD-2646 on sphingolipid metabolism was further investigated using TSU-PR1 prostate cancer cells. The results showed that the reduction of Bod3-SPM had an IC50 value of about 5 μM (FIG. 5).
[0082]
[Table 3]

[0083]
Next, a comparison of the effects of various compounds on the synthesis of Bod3-SPM and Bod3-GC was tested. HL60 cells were incubated with various compounds AD-2672, AD-2673, and AD-2675, 5 μM and 10 μM, respectively.
FIG. 6 is a fluorescence image showing that AD-2672 greatly reduces the amount of Bod3-SPM but not the amount of Bod3-GC. In contrast, AD-2673 and AD-2675, at 10 μM, show low inhibition of Bod3-SPM, but a much greater reduction in the amount of Bod3-GC.
[0084]
《Effect of cellular drug sensitivity on sphingolipid metabolism》
Breast cancer cells, MCF-NCi (drug sensitive) and MCD-AdrR (adriamycin resistant) were incubated with Bod-C3-ceramide for 1, 2, 4 and 8 hours, and Bod- in each cell and medium. C3-SPM and Bod-C3-GC were quantified. In drug resistant cells, Bod-C3-SPM and Bod-C3-GC in the cells were 3-4 times and 6 times greater than the amount in the medium, respectively. Surprisingly, each value in adriamycin resistant cells is significantly different and the amount of Bod-C3-SPM and Bod-C3-GC secreted into the drug resistant cell medium depends on its drug sensitive counterparts. It was 5-9 times higher than their amount secreted.
[0085]
Example 6
<< Inhibitory effect of AD-2144 on sphingomyelinase >>
N-hexyl-sphingosylphosphorylcholine (AD-2144) has its inhibitory effect on acidic (ie, optimal at about pH 5) sphingomyelinase or neutral (optimal pH at about pH 7.4) sphingomyelinase Tested for. For this purpose, sonicated HL60 leukemia cells were used as enzyme source. Dispersing increasing concentrations of AD-2144 with a mixture of fluorescent and non-fluorescent sphingomyelin (Bodypy-C12-SPM: SPM, 1:19), buffer and 0.25% Triton-X100 in a volume of 100 μL I let you. For acidic sphingomyelinase, 0.4 M acetate buffer (pH 5.0) was used; for neutral sphingomyelinase, 0.2 M Tris buffer (pH 7.4) and 5 mM magnesium chloride were used. 100 μL of HL60 cell sonication product was added to 100 μL of these dispersions. After incubation for 2-3 hours, 0.8 mL of chloroform: methanol (2: 1) was added, stirred, and the lower chloroform phase was collected, dried and applied to a thin layer chromatography plate. Plates were developed in a mixture of chloroform and methanol (87: 3). The fluorescence of the product, namely body pea-C12-ceramide, was quantified.
[0086]
For acid sphingomyelinase as well as neutral sphingomyelinase: With 300 μM AD-2144, there was a reduction of over 60% in body pea-C12-ceramide. Table 4 shows the reduction of body pea-C12-ceramide by AD-2144 compounds.
[0087]
[Table 4]

[0088]
Example 7
In vivo toxicity of AD-2646
As shown in the previous examples, the AD-2646 compound exhibits significant specific cell mortality by inducing a mechanism that causes apoptosis. This apoptotic phenomenon is probably mediated by inhibition of sphingolipid metabolism. In order to evaluate the potential use of the compounds as specific antiproliferative agents, in vivo toxicity studies were performed in mice.
[0089]
Six groups of 5 Swiss mice in each group were injected intraperitoneally with solutions of various concentrations of AD-2646, each in a volume of 100 μL. Injections were performed on days 1, 2, 3, and 4 and mice were tested for survival (Table 5).
As shown in Table 5, only very high concentrations of AD-2646 were toxic.
[Table 5]

[0090]
Example 8
96 containing 0 and increasing concentrations of (2S, 3R) -2N-aminohexyl-1- (4-N-hexylaminophenyl) -1,3-propanediol (AD-2663) serially diluted 2-fold 100 μL of medium in a well plate (RPMI 1640 culture medium supplemented with 20% FSC, 1% penicillin and 1% streptomycin) in 2 × 10 2 in a volume of 100 μL.⁵Leishmania major promigote cells were added. Following incubation (3 hours, 27 ° C.), cell numbers were determined by counting for aliquots from each well under a microscope with a Neulander cell counter. The IC50 for cell reduction was 7 μM.
[Brief description of the drawings]
[0091]
FIG. 1 shows the effect of AD-2646 on cell viability.
FIG. 2 shows the cytotoxic effect of AD-2646 on TSU-PR cells.
FIG. 3 shows the effect (SPM) of AD-2646 on sphingolipid metabolism.
FIG. 4 shows the effect (GC) of AD-2646 on sphingolipid metabolism.
FIG. 5 shows that AD-2646 inhibits SPM synthesis in TSU-PR1 cells.
FIG. 6 shows the inhibition of sphingolipid metabolism by the compounds of the present invention.

Claims (21)

Formula (I):

[Wherein R is a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl or alkenyl chain, optionally substituted by a hydroxyl group, CH ₃ (CH ₂ ) _m CH═CH - _{group, CH} 3 (CH _{2) m} group (m is an integer of 0 or 1 to 20), optionally a nitro group, an amino group, an alkylamino group, an acylamino group, -NHC (S) NH- group Sulfonylamido-alkyl groups, formula

A group represented by (n is an integer of 1 to 20), or a phenyl group, -NH-t-BOC group, -NH-FMOC group, or NH-CBZ substituted by a -NH-adamantane group A group;
X is a hydrogen atom or —OR ₄ group (R ₄ is a hydrogen atom or a linear or branched, saturated or unsaturated C ₁ to C optionally substituted by a hydroxy group; be a C ₆ alkyl or alkenyl chain);
Y is a —NH ₂ group, a NHR ^x group (R ^x is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl chain or alkenyl chain, optionally substituted by a hydroxy group), amino Protecting group, formula

Group represented by

A group represented by the formula: —NH (SO ₂ ) R ₁ group, —NR ₁ R ₂ group, —N ⁺ R ₁ R ₂ R ₃ group (R ₁ , R ₂ and R ₃ are the same or different Each of which is a C _1-6 alkyl group or a C _1-6 alkenyl group), a formula

A group represented by (n is an integer of 0 or 1 to 20), -NH-adamantane group, formula

Wherein “polymer” is a natural or synthetic biocompatible polymer having a molecular weight of 10 ³ to 10 ⁶ daltons;
Z is a hydrogen atom, -OH group, mono- or disaccharide, monosaccharide sulfate and choline phosphate;
However, when R is an alkyl group, a CH ₃ (CH ₂ ) _m CH═CH— group, a phenyl group or a nitrophenyl group, Y cannot be an NH ₂ group; and R ₁ is methyl Y is a —NR ₁ R ₂ group, —N ⁺ R ₁ R ₂ R, when R is a group, R is a CH ₃ (CH ₂ ) _m CH═CH— group, and Z is an —OH group. ₃ groups or NHR ₄ groups (R ₄ is an octyl group)]
And the isomers and pharmaceutically acceptable salts thereof. The compound according to claim 1, wherein Y is a —NH ₂ group or a NHR ^x group. The compound according to claim 1 or 2, wherein R is a nitrophenyl group. The compound according to claim 1 or 2, wherein R is an aminophenyl group or an alkylaminophenyl group. The compound as described in any one of Claims 1-4 whose Z is -OH group. 6. A compound according to any one of claims 1 to 5, wherein the amino protecting group is selected from a tBOC group, an FMOC group and a CBZ group. formula

(Referred to as AD-2665), formula

(Referred to as AD-2687), formula

(Referred to as AD-2646), formula

(Referred to as AD-2672), formula

(Referred to as AD-2754), formula

(Referred to as AD-2673), formula

(Referred to as AD-2144)
The compound of Claim 1 which is a compound represented by these. The active ingredient comprises a compound of formula (I) in which the substituents in the formula have the meaning as defined in claim 1 and, optionally, a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant or diluent A pharmaceutical composition further comprising an agent. 9. A pharmaceutical composition according to claim 8 for reducing sphingolipid accumulation. 10. A pharmaceutical composition according to claim 9 for the treatment of lipid accumulation disease. The pharmaceutical composition according to claim 10, wherein the lipid accumulation disease is selected from Gaucher disease, Tay-Sachs disease, Niemann-Pick disease, Krabbe disease, metachromatic leucodystrophy, Fabry disease and Faber disease. Substituents in the formula as inhibitors of any one of acidic, neutral and alkaline sphingomyelinase, acidic, neutral and alkaline ceramidase, α-galactosyl synthetase, ceramide synthetase, sphingomyelin synthetase and glycoceramide synthetase Use of a compound of the formula (I) having the meaning as defined in claim 1. 9. A pharmaceutical composition according to claim 8 for the treatment of cancerous diseases. Use of a compound of formula (I) wherein the substituents in the formula have the meaning defined in claim 1 for killing wild-type and drug-resistant cancer cells. 15. Use according to claim 14 for selective killing of drug resistant cancer cells. 9. A pharmaceutical composition according to claim 8, for the treatment of diseases of parasites, viruses, bacteria, fungi and prions. The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the parasitic disease is malaria or leishmania. Use of a compound of the formula (I), wherein the substituent in the formula has the meaning defined in claim 1 as an antimalarial or anti-Leishmania agent. A method of treating lipid accumulation disease in a patient in need of treatment for lipid accumulation disease, wherein the substituent in the formula has the meaning as defined in claim 1 or the compound The method of treatment comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising. The method according to claim 19, wherein the lipid accumulation disease is selected from Gaucher disease, Tay-Sachs disease, Niemann-Pick disease, Krabbe disease, metachromatic leucodystrophy, Fabry disease and Faber disease. A method of treating a cancerous disease in a patient in need of treatment for a cancerous disease, wherein the substituent in the formula has the meaning defined in claim 1 or a compound of the formula (I) The method of treatment comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising.

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