JP2005503118A - 改変ペプチドリガンド - Google Patents

Abstract

本発明は、天然のペプチドに対し、対象において免疫応答を誘発する改変ペプチドリガンドを含む組成物を提供する。本発明はまた、T細胞集団、およびT細胞の実質的に精製された集団を生じさせる方法を提供する。改変ペプチドリガンドは、対応する天然のエピトープに対する免疫応答を誘導または増加させる方法を含む幅広い種類の免疫調節的プロトコール、および望ましくない免疫応答を抑制または低下させる方法において、適用を見出す。

Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年2月14日に出願された米国仮特許出願第60/269,077号の合衆国法典35巻第119条(e)項下の恩典を主張し、その内容は、本開示へ参照として本明細書に組み入れられている。
【０００２】
技術分野
本発明は、抗原性エピトープの分野に関し、より詳細には、改変ペプチドリガンドおよび異なるT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞の別々の集団を刺激するためにこれらのリガンドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の分子により提示される、エピトープとしても知られている抗原決定基の認識は、哺乳動物の免疫応答の確立、維持、および実行において中心的役割を果たしている。体細胞および抗原提示白血球により発現された細胞表面MHC分子により提示されるエピトープのT細胞認識は、ウイルス、細菌、および寄生虫のような感染性生物体による侵入を制御するために機能する。さらに、細胞障害性Tリンパ球(CTL)は、特異的にある特定の癌細胞抗原を認識し、これらの抗原を発現している腫瘍細胞を溶解することができることが実証されている。なおさらに、不適当なT細胞活性化は、例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および喘息のようなある特定の衰弱させる自己免疫疾患において中心的役割を果たしていることが示されている。このように、MHC分子により提示される抗原性エピトープのT細胞認識は、多様な病理学的状態において免疫応答を仲介することの中心的役割を果たしている。
【０００４】
病理学的状態に関連する免疫応答の様々な局面を「調節する」ことを試みる免疫療法的ストラテジーが開発されてきた。これらの方法の多くは、同定および特徴付けられた腫瘍特異的抗原の使用に一部依存している。
【０００５】
一つのストラテジー的領域において、癌またはウイルス性感染細胞において発現された正常なまたは突然変異した細胞性抗原に対して向けられる抗体分子および体液性免疫応答の操作により、治療的および診断的薬剤が供給される。ワクチンは、抗体依存性細胞障害性、補体依存性細胞溶解、およびアポトーシスを生じる免疫療法のための、腫瘍特異的抗原に対して向けられる抗体を産生することができる(SinkovicsおよびHorvath(2000) Int. J. Oncol. 16(1):81-96; Weiner(1999) Semin. Oncol. 26:43-51)。腫瘍抗原特異的モノクローナル抗体由来の抗体免疫複合体は、細胞障害性薬剤および放射性核種の送達剤として、または診断的適用のための画像化剤として有用である(Roselliら、(1996) Anticancer Res. 16(4B):2187-2192; TrailおよびBianchi(1999) 11(5):584-588)。腫瘍抗原の特徴を模倣する抗イディオタイプ抗体を誘導するための抗腫瘍抗体であり、さらに、腫瘍に対する抗腫瘍体液性および細胞性免疫応答をさらに誘導する事ができる(Fagerbergら、(1995) 92(11):4773-4777)。
【０００６】
もう一つのストラテジー的領域において、抗原は、病原体に対するワクチン接種、癌性細胞への免疫応答の誘導、アレルギー性応答の低減、自己免疫疾患の結果として生じる自己抗原への免疫応答の低減、同種移植片拒絶の低減、および避妊を目的とする自己抗原への免疫応答の誘導の目的のために幅広く用いられてきた。
【０００７】
癌において、腫瘍特異的T細胞は、患者から由来することができ、細胞表面上に対応する腫瘍関連抗原を示す腫瘍細胞に結合および溶解させることができる。腫瘍特異的T細胞は、血液(末梢および単核細胞画分に見出されうる)、一次および二次リンパ組織（例えば脾臓）卵巣癌患者における腹水(腫瘍関連リンパ球または「TAL」)、または腫瘍自身内(腫瘍浸潤リンパ球または「TIL」)を含む、癌患者内のいつくかの部位に局在している。これらのT細胞集団のうち、TILが腫瘍抗原およびそれらのエピトープの同定において最も有用であった。
【０００８】
腫瘍特異的T細胞の特異性は、MHCクラスI、およびいくつかの細胞型においてはクラスII分子により腫瘍細胞の表面上に提示される短いアミノ酸配列を認識および結合するT細胞受容体(TCR)の能力に基づいている。簡単には、これらのアミノ酸結合配列(「リガンド」または「エピトープ」とも名付けられる)は、腫瘍または癌細胞において特有的にまたは異常的にのいずれかで発現される遺伝子によりコードされる細胞内タンパク質のタンパク質分解性分解から得られる。これらのエピトープを含むペプチドリガンドおよび細胞内タンパク質は、「腫瘍抗原」と呼ばれる。
【０００９】
腫瘍特異的T細胞の有用性により、いくつかの腫瘍抗原の同定が促進され、その抗原は癌ワクチン組成物に使用されたが、成功度合いは様々であった。タンパク質またはペプチド断片でのワクチン接種によりインビボで抗腫瘍応答を誘発するための試みは、しかしながら、しばしば不成功であり、それはおそらくタンパク質またはペプチド断片が細胞のサイトゾルに到達できず、それゆえ適切なプロセシングおよびエフェクター細胞への提示がなされないからである。腫瘍特異的T細胞の培養およびサブクローニングするための通常の方法は、当技術分野において知られている。一度強力な抗腫瘍T細胞集団が回収されたならば、それは、通常の、しかししばしば単調な、発現クローニング方法体系により、腫瘍抗原を同定するために用いられうる。Kawakami Y.ら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(9):3515-3519。しかしながら、インビトロで腫瘍特異的T細胞を生じさせるために発現クローニングを用いる多数の試みの結果は、しかしながらこの方法体系が信頼できないことを示唆している。
【００１０】
既知の病原体または腫瘍関連抗原を必要とする異なる方法において、天然のエピトープを同定しようと試みる方法が開発されている。例えば、推定のエピトープは、特定のHLA対立遺伝子に関連しているアミノ酸残基の「モチーフ」または定義されたパターンを含むアミノ酸配列についてその遺伝子(抗原)の配列をスキャンするコンピューターを用いて予測することができる。例えば、Englehard, V. H., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:181; Rammenesee, H.ら、(1993) Annu. Rev. Immunol. 11:213を参照されたい。その「予測された」エピトープ配列は、その後、合成され、試験されうる。多くのエピトープ配列が、完全長タンパク質配列を「モチーフ」によりスキャンすることから「予測されて」きたが、標準的な機能アッセイ法において試験すると、これらの「予測された」エピトープのほとんど大部分は、免疫原性ではない。他の技術として、例えば、ペプチド溶出およびそれに続くデータベース検索(Hunt, D. F.ら、(1992) Science 255:1261; Udaka, K.ら、(1992) Cell 69:989)；複合体抗原混合物からの抗原の単離および同定(Van de Wal, Y.ら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10050; Lamb, J.ら、(1987) Immunology 60:1)；発現ライブラリーのスクリーニングおよびその後のデータベース検索(Boon, T.ら、(1994) Annu. Rev. Immunol. 12:337; Neophytou, P. I.ら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2014; Gavin, M. A.ら、(1994) Eur. J. Immunol. 24:2124)；コンビナトリアルライブラリーのペプチド位置スキャニング(Gundlach, B. J.ら、(1996) J. Immunol. Meth. 192:149; Blake, J.ら、(1996) J. Exp. Med. 184:121; Hiemstra, H. S.ら、(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10313; Hemmer, B.ら、(1997) J. Exp. Med. 185:1651)などが含まれる。
【００１１】
より最近では、コンビナトリアルペプチドおよび非ペプチド化学方法体系がT細胞エピトープを決定するための追加的なツールを提供している。そのように典型的に決定されたエピトープは、必ずしも絶対的な同一性ではないが、定義可能な配列類似性(例えば、同一のアミノ酸に加えて保存された置換)をもつという点で、天然のエピトープを「模倣する」。エピトープ擬態は、既知のエピトープの配列を直接的に改変することにより設計される、またはランダム化された分子ライブラリーを用いてその天然の抗原を同定するためのデータベース検索により、新規に定義されうる(Gavin, M. A.ら、(1994) Eur. J. Immunol. 24:2124; Blake, H.ら、(1996) J. Exp. Med. 184:121; Chen, Y. Z.ら、(1996) J. Immunol. 157:3783; Strausbauch, M. A.ら、(1998) Intl. Immunol. 10:421)。
【００１２】
既知の抗原ポリペプチドのT細胞エピトープを同定することはしばしば可能であるが、同様のことが新規の天然抗原およびエピトープの同定に有効ではない。通常の方法体系の適用では、新規の抗原および/またはそれらのエピトープの同定に付随したかなりの複雑性および可変性に取り組むおよび/または克服するためには不十分であった。そのような問題が当業者に課題を示し続けている。
【００１３】
興味深いことに、天然のエピトープの有効性をそれらの配列を変化させる単一のまたは複数のアミノ酸置換を導入することにより向上させることが可能であることがまた示されている(Valmoriら、(2000) J. Immunol. 164(2):1125-1131)。このことより、免疫原性改変のエピトープの産生は大きな関心対象であり、癌を含む様々な適応症の治療に有望であることが示唆されている。
【００１４】
このように、さらなる治療的効果のあるワクチンに対する必要性が存在している。本発明は、この必要性を満たし、関連した利点を提供する。
【発明の開示】
【００１５】
開示の説明
本発明は、その天然リガンドに対する免疫応答を活性化するために、天然のリガンド、例えば、腫瘍またはウイルス抗原を提示している対象に対する投与のための改変ペプチド種を選択するための方法を提供する。その改変されたペプチド種は、天然または同種のリガンドに対する免疫応答(T細胞またはB細胞)を活性化するために設計および選択される。
【００１６】
複数または多数の改変ペプチド種が作製され免疫応答を活性化する能力についてスクリーニングされる。改変ペプチドの集団は、その後、T細胞の集団を活性化する能力についてさらにアッセイされ、その集団の少なくとも2メンバーが別々のT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞を産生する。一つの局面において、改変ペプチドは、お互いに異なるT細胞クローンを活性化するそれぞれの能力に基づき選択される。さらなる局面において、改変ペプチドは、CTLの異なる亜集団を活性化する能力に基づき選択される。
【００１７】
ペプチドの様々な組み合わせが選択されうる。例えば、少なくとも2つの改変ペプチドもしくは少なくとも3つ、または少なくとも2つから6つまでの改変ペプチドが選択される。
【００１８】
改変ペプチドが選択され、担体、例えば、対象への投与のための薬学的に許容される担体に結合されうる。または、そのペプチドは宿主細胞に存在する。その宿主細胞は、担体、例えば、薬学的に許容される担体と結合されうる。
【００１９】
そのペプチドをコードするポリヌクレオチドが、単独で、または担体、例えば薬学的に許容される担体と組み合わせて、さらに提供される。そのポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞もさらに本発明により提供される。ベクターおよび宿主細胞は、薬学的に許容される担体のような担体と結合されうる。
【００２０】
本発明の組成物は、対象において免疫応答を調節するために有用である。もう一つの局面において、それらは、ナイーブの免疫エフェクター細胞を教育するために有用である。免疫エフェクター細胞集団の組み合わせは本発明によりさらに提供される。一つの態様において、それらは、担体、例えば、薬学的に許容される担体と結合される。
【００２１】
本発明はまた、天然のリガンドに対する免疫応答を活性化するまたは誘導するための対象へのその組成物の投与を提供する。
【００２２】
発明を実施するための様式
一般的技術
本発明の実施は、特に明示しない限り、当技術分野の範囲内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の通常の技術を使用するものである。そのような技術は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版(Sambrookら、1989)；「Oligonucleotide Synthesis」（M. J. Gait編、1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney編、1987)；シリーズ「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」(D. M. Weir & C. C. Blackwell編)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J. M. Miller & M. P. Calos編、1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987および定期的更新)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994)；「Current Protocols in Immunology」(J. E. Coliganら編、1991)のような文献に完全に説明されている。
【００２３】
定義
本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」は、その文脈が明らかに別なように指図しない限りは、複数の言及も含む。例えば、「一つの細胞」という用語は、それの混合物を含む複数の細胞を含む。
【００２４】
本明細書に用いられる場合、「含む」という用語は、その組成物および方法がその列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味するものとする。組成物および方法を定義するために用いられる場合の「本質的に〜からなる」は、その組み合わせに対して何らかの本質的重要性をもつ他の要素を除外することを意味するものとする。従って、本質的に、本明細書に定義されている要素からなる組成物は、単離および精製方法からの微量夾雑物ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤などのような薬学的に許容される担体を除外しないことになる。「からなる」とは、微量より多い他の成分の要素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法段階を除外することを意味するものとする。これらの変化用語のそれぞれにより定義される態様は、本発明の範囲内である。
【００２５】
「免疫応答」は、外来の物質に対するリンパ球の抗原特異的応答を広く指す。免疫応答を誘発することができるいずれの物質も「免疫原性」であると言われ、「免疫原」と呼ばれる。すべての免疫原は抗原であるが、すべての抗原が免疫原性ではない。本発明の免疫応答は、体液性または細胞性でありうる。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、用語「リガンド」とは、もう一つの分子上の特定の部位(すなわち、「リガンド部位」)に結合する任意の分子を指す。例えば、リガンドは、一つの態様において、免疫エフェクター細胞との反応において、タンパク質の特異性を与えうる。それは、免疫エフェクター細胞上の相補的結合部位(すなわち、受容体)に直接的に結合する、そのタンパク質内にあるリガンド部位(すなわち、エピトープ、決定基)である。
【００２７】
好ましい態様において、本発明のリガンドは、B細胞受容体(BCR)またはT細胞受容体(TCR)のような免疫エフェクター細胞上にある抗原決定基またはエピトープに結合する。リガンドは、抗原、ペプチド、タンパク質、または本発明のエピトープでありうる。一つの態様において、本発明のリガンドは、B細胞上の受容体に結合する。一つの態様において、本発明のリガンドは、長さが約4個から約8個のアミノ酸である。
【００２８】
さらなる態様において、本発明のリガンドは、MHCクラスI分子に結合する。一つの態様において、本発明のリガンドは、長さが約7個から約11個のアミノ酸である。
【００２９】
なおさらなる態様において、本発明のリガンドは、MHCクラスII分子に結合する。一つの態様において、本発明のリガンドは、長さが約10個から約20個のアミノ酸である。
【００３０】
本明細書に記載されるたいていの局面において、「リガンド」は、抗原またはその抗原のエピトープの断片である。それの例には、限定されるものではないが、腫瘍抗原およびウイルス性抗原を含む。
【００３１】
「天然の」または「同種の」または「野生型の」リガンドは、リガンド部位を含むポリペプチドであり、天然の生物学的源から単離され、かつ免疫系により認識されうるまたはされえない。
【００３２】
「改変ペプチド」は、対応する同種の天然のまたは「野生型の」リガンドのものとは異なる一次配列を有するリガンドである。改変リガンドはまた、非天然の、修飾された、および/または合成のリガンド、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらをコードする遺伝子をも示す。改変ペプチドは、限定されるものではないが、合成的または組換え方法を含む様々な方法により作製されうり、限定されるものではないが、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋結合、アシル化、タンパク質分解性切断、抗体分子、膜分子、または他のリガンドへの連結により、翻訳の間または翻訳後に差別的に改変されている抗原ペプチドを含む。(Fergusonら、(1988) Ann. Rev. Biochem. 57:285-320)。
【００３３】
用語「腫瘍関連抗原」または「TAA」とは、腫瘍に関連しているまたは特異的であり、MHC分子によりT細胞へ提示される抗原ペプチドを指す。既知のTAAの例には、gp100、MART、およびMAGEが含まれる。
【００３４】
用語「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」とは、T細胞への抗原提示および急速な移植片拒絶に必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトにおいて、MHCは、「ヒト白血球抗原」または「HLA」複合体としても知られている。MHCによりコードされるタンパク質は「MHC分子」として知られており、クラスIおよびクラスII MHC分子へ分類される。クラスI MHCは、β2-ミクログロブリンに非共有結合的に連結されたMHCにおいてコードされるα鎖から構成される膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスI MHC分子は、ほとんどすべての有核細胞により発現され、CD8⁺ T細胞への抗原提示において機能することが示されている。クラスI分子は、ヒトにおいて、HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cを含む。クラスII MHC分子もまた、非共有結合的に結合されたα鎖およびβ鎖からなる膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスII MHC分子は、CD4⁺ T細胞において機能することが知られており、ヒトにおいては、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DRを含む。好ましい態様において、本発明の組成物およびリガンドは、任意のHLA型のMHC分子と複合体を形成することができる。当業者はHLAの血清型および遺伝子型に熟知している。以下を参照されたい：bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/hla_coefficient_viewing_page。Rammensee, H. G., Bachmann, J.およびStevanovic, S. MHC Ligands and Peptide Motifs(1997)Chapman & Hall Publishers; Schreuder, G. M. Th.ら、The HLA Dictionary(1999)Tissue Antigens 54:409-437。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「抗原提示マトリックス」とは、抗原がT細胞の表面上のT細胞抗原受容体により結合されうるような状態で抗原を提示することができる分子を指す。抗原提示マトリックスは、抗原提示細胞(APC)の表面上、APCの小胞標本上、またはビーズもしくはプレートのような固体支持体上の合成マトリックスの形でありうる。合成抗原提示マトリックスの例は、β2-ミクログロブリンと複合体形成した精製されたMHCクラスI分子、そのような精製されたMHCクラスI分子の多量体、精製されたMHCクラスII分子、または固体支持体に付着したそれらの機能的部分である。
【００３６】
用語「抗原提示細胞(APC)」とは1つまたは複数の抗原を提示するまたはプロセシングする、およびリンパ球活性化のために必要とされる共刺激分子と共に細胞表面上にペプチド-MHC複合体の形でそれらの断片を示す事ができる細胞のクラスを指す。細胞の多くの型がT細胞認識のためにそれらの細胞表面上に抗原を提示する能力がありうるが、プロフェッショナルAPCのみが十分な量で抗原を提示し、さらにT細胞を活性化し、その抗原に対する細胞溶解性T細胞応答を惹起する事ができる。APCは、マクロファージ、B細胞および樹状細胞(DC)；または天然に存在する、もしくはβ2-ミクログロブリンと複合体形成した精製されたMHCクラスI分子のような合成の他の分子のような無傷の細胞全体でありうる。
【００３７】
用語「樹状細胞(DC)」とは、様々なリンパ性および非リンパ性組織に見出される形態学的に類似した細胞型の種々の集団を指す(Steinman(1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296)。樹状細胞は、生物体において最も効力のあるかつ好ましいAPCを構成する。樹状細胞の、すべてではないにしても、サブセットは、骨髄前駆細胞に由来し、末梢血液中を少数で巡回し、未成熟のランゲルハンス細胞または末期的に分化した成熟細胞のいずれかとして現れる。樹状細胞は単球と区別できるが、別個の表現型を有する。例えば、特定の分化性マーカー、CD14抗原は、樹状細胞に見出されないが、単球に含まれている。また、単球は強力に食作用を行う細胞であるのに対して、成熟の樹状細胞は食作用性ではない。DCがT細胞の活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを供給することが示されている。
【００３８】
「抗原提示細胞補充因子」または「APC補充因子」という用語は、抗原提示細胞を補充する事ができる無傷の細胞全体および他の分子の両方を含む。適するAPC補充因子の例は、インターロイキン4(IL-4)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、セプラゲル(Sepragel)、およびマクロファージ炎症タンパク質3アルファ(MIP3α)のような分子を含む。これらは、イムネックス(Immunex)、シェーリングプラウ(Schering-Plough)、ジェンザイム(Genzyme)、およびR&Dシステムズ(R&D Systems)(Minneapolis, MN)から入手可能である。それらはまた、Current Protocols In Molecular Biology(F. M. Ausubelら編、(1987))に開示される方法を用いて組換えにより作製されうる。上記の因子と同じ生物学的活性をもつペプチド、タンパク質、および化合物は本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
用語「免疫エフェクター細胞」とは、リガンド（例えば抗原）に結合し、それにより免疫応答を媒介する事ができる細胞を指す。これらの細胞は、限定されるものではないが、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞、ならびに細胞障害性Tリンパ球(CTL)、例えば、CTL系、CTLクローン、および腫瘍、炎症性、または他の侵入物からのCTLを含む。MHC:リガンド複合体によるT細胞受容体(TCR)の生産的結合は、T細胞増殖およびそれらの子孫の武装したエフェクターT細胞への分化を導く。武装したエフェクターT細胞の子孫は、その後、その表面上に特定の抗原を示しているいずれの標的細胞にも作用することができる。エフェクターT細胞は、様々な機能を媒介することができる。一連の重要な機能は、CD8⁺ CTLによる感染細胞の死滅およびT_H1細胞によるマクロファージの活性化であり、共に細胞性免疫を構成している。エフェクターT細胞のもう一つの機能は、抗体の異なる型を産生するためのT_H2およびT_H1細胞の両方によるB細胞の活性であり、このようにして体液性免疫応答を起こす。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、用語「免疫エフェクター分子」とは、抗原特異的結合の可能な分子を指し、抗体、T細胞抗原受容体、ならびにMHCクラスIおよびクラスII分子を含む。
【００４１】
「ナイーブ」免疫エフェクター細胞は、その細胞を活性化できる抗原に曝されたことがない免疫エフェクター細胞である。ナイーブ免疫エフェクター細胞の活性化は、増殖および抗原特異的に武装したエフェクターT細胞へ分化するために、プロフェッショナルAPC上のペプチド：MHC複合体の認識およびAPCによる共刺激シグナルの同時の送達の両方を必要とする。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語「教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞」とは、特定の抗原に以前に遭遇したことがある、上記で定義されているような免疫エフェクター細胞である。そのナイーブの相当するものとは対照的に、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化は、共刺激シグナルを必要とせず、活性化にペプチド：MHC複合体で十分である。
【００４３】
T細胞に関して用いられる場合、「活性化された」とは、その細胞がもはやG_０期ではなく、細胞毒、サイトカイン、および細胞型(例えば、CD8⁺またはCD4⁺)に特有の他の関連した膜結合タンパク質の1つまたは複数を産生し始め、その表面上に特定の抗原を示しているいずれの標的細胞をも認識および結合し、そのエフェクター分子を放出できることを意味する。
【００４４】
本発明に関して、用語「認識された」とは、免疫応答を惹起する、リガンドによる免疫エフェクター細胞のエピトープまたは抗原決定基の生産的結合を指す。「交差反応性」という用語は、同種の天然リガンドに機能的に重複するまたは収束する特定の性質をもつ本発明の改変リガンドを記載するために用いられる。より詳細には、天然リガンドおよび/または天然リガンド特異的免疫エフェクター細胞の免疫原性の性質が、その改変されたリガンドによりある程度まで共有され、その改変リガンドにより、改変リガンドおよび/または改変リガンド特異的免疫エフェクター細胞集団は「交差反応性」となる。本発明の目的のために、交差反応性は、以下の複数のレベルで現される：(i)T細胞レベルにおいて、すなわち、本発明の改変リガンドがTCRに結合し、「リガンド特異的」エフェクター機能を有するT細胞を活性化し、加えてそれが天然のリガンドを示している細胞を効果的に標的化および溶解することができる；および(ii)抗体レベルにおいて、例えば、「抗」-改変リガンド抗体は天然のリガンドを検出、認識、および結合することができ、免疫応答におけるエフェクター機構を惹起し、最後には、結果として宿主からのその天然のリガンドは排除される。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、用語「対象において免疫応答を誘導すること」とは、当技術分野においてよく理解されている用語であり、対象へ標的リガンドを導入した後に、対象への標的リガンドの導入前の免疫応答(もしあれば)と比較して、標的リガンドに対する免疫応答において、少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも約5倍、より好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約100倍、よりいっそう好ましくは少なくとも約500倍、よりいっそう好ましくは少なくとも約1000倍、またはより多くの増加が検出されうるまたは測定されうることを意味する。標的リガンドに対する免疫応答は、限定されるものではないが、リガンド特異的(またはエピトープ特異的)抗体の産生、および標的リガンドに特異的に結合する分子をその表面上に発現する免疫細胞の産生を含む。
【００４６】
「共刺激分子」は、抗原提示細胞の表面上に発現される受容体-リガンドの対とエフェクター細胞との相互作用に関与している。過去数年間にわたり蓄積された研究により、休止T細胞はサイトカイン遺伝子発現の誘導および増殖のために少なくとも2つのシグナルを必要とすることが納得のゆくように実証された(Schwartz R. H. (1990) Science 248:1349-1356およびJenkins M. K. (1992) Immunol. Today 13:69-73)。特異性を与える1つのシグナルは、TCR/CD3複合体と適切なMHC/ペプチド複合体との相互作用により発生されうる。第二のシグナルは、抗原特異的ではなく、「共刺激」シグナルと呼ばれる。このシグナルは、初めは、マクロファージおよび樹状細胞、いわゆる「プロフェッショナル」APCのような骨髄由来の補助細胞により供給される活性として定義された。いくつかの分子が共刺激活性を高めることを示された。これらは、熱安定抗原(HSA)(Liu Y.ら、(1992) J. Exp. Med. 175:437-445)、コンドロイチン硫酸修飾化MHCインバリアント鎖(Ii-CS)(Naujokas M. F.ら、(1993) Cell 74:257-268)、細胞内接着分子1(ICAM-1)(Van Seventer G. A. (1990) J. Immunol. 144:4579-4586)、B7-1、およびB7-2/B70(Schwartz R. H. (1992) Cell 71:1065-1068)である。これらの分子はそれぞれ、T細胞上でそれらの標的リガンドと相互作用することにより共刺激を補助するために出現する。共刺激分子は、ナイーブのT細胞の完全な活性化を達成させるために、正常な生理学的状態下で必要な共刺激シグナルを媒介する。1つの典型的な受容体-リガンドの対は、APCの表面上のB7共刺激分子とT細胞上のそれと対応する受容体CD28またはCTLA-4である(Freemanら、(1993) Science 262:909-911; Youngら、(1992) J. Clin. Invest. 90:229; およびNabaviら、(1992) Nature 360:266-268)。他の重要な共刺激分子は、CD40、CD54、CD80、およびCD86である。「共刺激分子」という用語は、T細胞の表面上でTCRにより結合されたペプチド/MHC複合体と共に作用する場合、そのペプチドを結合しているT細胞の活性化を達成する共刺激効果を供給するいずれの単一の分子または分子の組み合わせも含む。その用語は、このように、B7、またはペプチド/MHC複合体と共に同種のリガンドへ結合し、その結果として、T細胞の表面上のTCRがそのペプチドに特異的に結合する場合、T細胞の活性化を生じる、APCのような抗原提示マトリックス上の他の共刺激分子、それらの断片(単独、別の分子との複合体形成、または融合タンパク質の一部として)を含む。共刺激分子は、例えば、ベックマンコールター社(Beckman Coulter, Inc.)(Fullerton, CA)を含む、様々な供給元から市販されている。いつも明確に述べられているわけではないが、野生型または精製された共刺激分子と類似した生物学的活性をもつ分子(例えば、組換えにより作製されたまたはそれらの突然変異タンパク質)は、本発明の精神および範囲内で用いられることが意図されている。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「固相支持体」または「固体支持体」は、交換可能に用いられるが、支持体の特定の型に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、当業者には公知である。固相支持体は、シリカゲル、樹脂、誘導化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルを含む。本明細書で用いられる場合、「固体支持体」はまた、合成抗原提示マトリックス、細胞、およびリポソームを含む。適する固相支持体は、所望の最終用途および様々なプロトコールに対する適合性に基づき選択されうる。例えば、ペプチド合成について、固相支持体は、ポリスチレン(例えば、バケム社(Bachem Inc.)、ペニンシュララボラトリーズ(Peninsula Laboratories)などから入手されるPAM-樹脂)、POLYHIPE(登録商標)樹脂(アミノテック(Aminotech)、カナダから入手)、ポリアミド樹脂(ペニンシュララボラトリーズから入手)、ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレン樹脂(TentaGel(登録商標)、ラップポリマー(Rapp Polymere)、チュービンゲン、ドイツ)、またはポリジメチルアクリルアミド樹脂(ミリゲン/バイオサーチ(Milligen/Biosearch)、カリフォルニアから入手)のような樹脂を指しうる。
【００４８】
「免疫応答を調節する」という用語は、免疫応答の誘導(増加、誘発)；および免疫応答を低下させること(抑制)を含む。免疫調節方法(またはプロトコール)とは、対象において免疫応答を調節する方法である。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、用語「サイトカイン」とは、例えば、成長または増殖の誘導を含め、細胞において様々な効果を発揮する多数の因子のいずれか一つを指す。本発明の実施において、単独または組み合わせて使用されうるサイトカインの非限定的例として、インターロイキン2(IL-2)、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン12(IL-12)、G-CSF、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン1アルファ(IL-1α)、インターロイキン11(IL-11)、MIP-11、白血病抑制因子(LIF)、c-キットリガンド、トロンボポエチン(TPO)、およびflt3リガンドを含む。本発明はまた、1つまたは複数のサイトカインが培地から特異的に排除されている培養条件も含む。サイトカインは、例えば、ジェンザイム(Framingham, MA)、ジェネンテック(Genentech)(South San Francisco, CA)、アムジェン(Amgen)(Thousand Oaks, CA)、R&Dシステムズ(Minneapolis, MN)、およびイムネックス(Seattle, WA)のようないくつかの小売り業者から市販されている。いつも明確に述べられているわけではないが、野生型または精製されたサイトカインと類似した生物学的活性をもつ分子(例えば、組換えにより作製されたまたはそれらの突然変異タンパク質)は、本発明の精神および範囲内で用いられることが意図されている。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」とは、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指すために交換可能に用いられる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体を含みうる。ヌクレオチドは、任意の3次元構造をもちうり、既知または未知の任意の機能を果たしうる。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換え型ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマーを含む。核酸分子はまた、修飾された核酸分子も含みうる。
【００５１】
用語「ペプチド」または「ポリペプチド」とは、4個またはより多くのサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド様物質の化合物を指すために交換可能に用いられる。サブユニットは、ペプチド結合により連結されうる。もう一つの態様において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル結合などにより連結されうる。本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」とは、グリシンおよびD型またはL型の両方の光学異性体を含む、天然および/または非天然もしくは合成のいずれかのアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド様物質を指す。本発明のポリペプチドは、抗体に対する最小限のエピトープと同様に小さく、例えば、約4個から約8個のアミノ酸を有するか、または単独でもしくは他のタンパク質と組み合わせて、完全長タンパク質と同程度の長さでありうる。好ましい態様において、本発明の1つまたは複数のポリペプチドは、同じ配列の繰り返しとして、または異なる配列の組み合わせとしてのいずれかで結合されうる。
【００５２】
用語「遺伝子改変された」とは、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型をもまた改変する外来の遺伝子または核酸配列を含むことおよび/または発現することを意味する。換言すれば、それは、細胞の内因性ヌクレオチドへの任意の付加、欠失、または破壊を指す。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNA由来である場合には、適切な真核生物の宿主が選択されているならば、発現はそのmRNAのスプライシングを含みうる。発現に必要とされる調節要素は、RNAポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌の発現ベクターは、lacプロモーターのようなプロモーターならびに転写開始のためのシャイン-ダルガノ(Shine-Dalgano)配列および開始コドンAUGを含む(Sambrookら、(1989)前記)。同様に、真核生物の発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIのための異種または同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、およびリボソームの脱離のための終止コドンを含む。そのようなベクターは、商業的に入手できる、または当技術分野においてよく知られた方法、例えば、一般的にベクターを構築するための下記の方法に記載されている配列により構築されうる。
【００５４】
「転写制御下」は、当技術分野においてよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常ではDNA配列の転写が、転写の開始に寄与するまたは転写を促進する要素に配列が機能的に連結していることに依存していることを意味する。「機能的に連結された」とは、要素がそれらが機能できるような配置にある並置を指す。
【００５５】
「遺伝子送達媒体」は、挿入されるポリヌクレオチドを宿主細胞へ運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達媒体の例は、リポソーム、天然のポリマーおよび合成ポリマーを含む、生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工のウイルスのエンベロープ；金属粒子；および細菌、バキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌のベクター、ならびに様々な真核生物および原核生物の宿主における発現のために記載されてきた当技術分野で典型的に使用される他の組換え媒体であり、簡単なタンパク質発現のためにはもちろん、遺伝子治療のためにも使用されうる。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、「遺伝子送達」、「遺伝子移入」などは、導入に用いられる方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチド(時折「導入遺伝子)と呼ばれる)の宿主細胞への導入を指す用語である。そのような方法は、ベクター媒介遺伝子移入(例えば、ウイルス感染/トランスフェクション、または様々な他のタンパク質を主材料とするもしくは脂質を主材料とする遺伝子送達複合体による)のような様々な周知の技術、加えて「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術(エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために使用される様々な他の技術のような)を含む。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定的にまたは一過性に維持されうる。安定的維持は、典型的には、導入されるポリヌクレオチドが宿主細胞に適合性のある複製開始点を含むかまたは染色体外のレプリコン(例えば、プラスミド)もしくは核もしくはミトコンドリアの染色体のような宿主細胞のレプリコンへ統合されるかのいずれかを必要とする。当技術分野において公知であり、本明細書に記載されているが、多数のベクターが、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介できることがわかっている。
【００５７】
「ウイルスのベクター」は、インビボ、エキソビボ、またはインビトロのいずれかにおいて宿主細胞へ送達されるポリヌクレオチドを含む組換えにより作製されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスのベクターの例は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどを含む。遺伝子移入がレトロウイルスベクターにより媒介される局面において、ベクター構築物は、レトロウイルスのゲノムまたはそれらの部分、および治療的な遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書で用いられる場合、「レトロウイルス媒介の遺伝子移入」または「レトロウイルスの形質導入」は、同じ意味をもち、ウイルスが細胞へ入りかつ宿主細胞のゲノムへそのゲノムを組み込むことによって、遺伝子または核酸配列が宿主細胞へ安定的に移入される過程を指す。ウイルスは、その感染の通常の機構により宿主細胞へ入ることができる、または細胞へ入るために、それが異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合するように改変されうる。本明細書で用いられる場合、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様の侵入機構を通して、外因性核酸を細胞へ導入できるウイルス粒子を指す。
【００５８】
レトロウイルスは、それらの遺伝的情報をRNAの形で所有している；しかしながら、いったんウイルスが細胞に感染すれば、そのRNAはDNAの形へ逆転写され、感染した細胞のゲノムDNAへと統合される。組み込まれたDNAの形は、プロウイルスと呼ばれる。
【００５９】
遺伝子移入が、アデノウイルス(Ad)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)のようなDNAウイルスベクターにより媒介される局面において、ベクター構築物は、ウイルスのゲノムまたはそれらの部分、および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス(Ad)は、相対的によく特徴付けられた、50を超える血清型を含む、ウイルスの同種グループである。例えば、国際公開公報第95/27071号を参照されたい。Adは増殖させるのが容易であり、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換え型Ad-由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび発生についての可能性を低下させるものもまた、構築されている。国際公開公報第95/00655号および第95/11984号を参照されたい。野生型AAVは、宿主細胞のゲノムへ組み込む高い感染性および特異性をもつ。HermonatおよびMuzyczka(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470およびLebkowskiら、(1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996を参照されたい。セムリキ森林熱ウイルス基盤のベクターおよびシンドビスウイルス基盤のベクターのようなアルファウイルスベクターもまた、遺伝子治療および免疫療法における使用のために開発されてきた。SchlesingerおよびDubensky(1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439およびZaksら、(1999) Nat. Med. 7:823-827を参照されたい。
【００６０】
プロモーターおよびポリヌクレオチドが機能的に連結されうるクローニング部位の両方を含むベクターは当技術分野においてよく知られている。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボにおいてRNAを転写する能力があり、ストラテジーン(Stratagene)(La Jolla, CA)およびプロメガバイオテック(Promega Biotech)(Madison, WI)のような供給元から市販されている。発現および/またはインビトロでの転写を最適化するために、そのクローンの5'および/または3'の非翻訳部分を除去、付加、または改変し、余分の不適当な代替の翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳のいずれかのレベルにおいて、発現を妨げうるまたは低下させうる他の配列を削除することが必要である場合がある。または、発現を高めるためにコンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの5'に隣接して挿入することができる。
【００６１】
遺伝子送達媒体もまた、DNA/リポソーム複合体を含むいくつかの非ウイルスのベクター、および標的化されたウイルスタンパク質-DNA複合体をを含む。標的化する抗体またはその断片も含むリポソームは、本発明の方法において使用されうる。細胞への送達を高めるために、本発明の核酸またはタンパク質は、細胞表面抗原、例えば、TCR、CD3、またはCD4に結合する抗体またはそれの結合断片に結合されうる。
【００６２】
「ハイブリダイゼーション」は、1つまたは複数のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン-クリック型塩基対、フーグスティーン型結合により、または任意の他の配列特異的様式において生じうる。複合体は、二重構造を形成する2本の鎖、多重鎖複合体を形成する3本またはより多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズしている鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、PCR反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より広い過程における段階を構成しうる。
【００６３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下のものを含む：約25℃〜約37℃のインキュベーション温度；約6 X SSC〜約10 X SSCのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約0 %〜約25 %のホルムアミド濃度；および約6 X SSCの洗浄溶液。中位のハイブリダイゼーション条件の例は以下のものを含む：約40℃〜約50℃のインキュベーション温度；約9 X SSC〜約2 X SSCの緩衝液濃度；約30 %〜約50 %のホルムアミド濃度；および約5 X SSC〜約2 X SSCの洗浄溶液。高いストリンジェント性の条件の例は以下のものを含む：約55℃〜約68℃のインキュベーション温度；約1 X SSC〜約0.1 X SSCの緩衝液濃度；約55 %〜約75 %のホルムアミド濃度；および約1 X SSC、約0.1 X SSC、または脱イオン水の洗浄溶液。一般的に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、1回、2回、またはより多くの洗浄段階を含めて、5分から24時間までであり、洗浄のインキュベーション時間は、約1分、2分、または15分である。SSCは、0.15 M NaClおよび15 mM クエン酸の緩衝液である。他の緩衝液系を用いるSSCの等価物が使用されうることは理解されている。
【００６４】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域(またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域)はもう一つの配列に対して「配列同一性」のある一定のパーセンテージ(例えば、80 %、85 %、90 %または95 %)をもち、これは整列した場合そのパーセンテージの塩基(またはアミノ酸)がその2つの配列を比較した際同じであることを意味する。この整列化およびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols In Molecular Biology(F. M. Ausubelら編、1987) Supplement 30, セクション 7.7.18, Table 7.7.1に記載されているものを用いて決定されうる。好ましくは、デフォルトパラメーターがアラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するBLASTである。特に、好ましいプログラムは以下のデフォルトパラメーターを使用するBLASTNおよびBLASTPである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝60；期待値＝10；行列＝BLOSUM62；記述＝50配列；分類＝HIGH SCORE；データベース＝非冗長、GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻訳 + SwissProtein + SPupdate + PIR。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットアドレスにおいて見出されうる：www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「インビボ」遺伝子送達、遺伝子移入、遺伝子治療などは、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物のような生物体の身体への、直接的な外因性ポリヌクレオチドを含むベクターの導入であり、それによりその外因性ポリヌクレオチドがインビボでそのような生物体の細胞へ導入されることを指す用語である。
【００６６】
「インビトロ」は、宿主対象の身体の外側を意味し、エキソビボを含む。
【００６７】
用語「単離された」とは、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれの断片が天然において通常結合している、細胞およびそうでないものの構成物から分離されたことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドは、染色体において通常結合している5'配列および3'配列から分離されたものである。当業者にとって明らかではあるが、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれの断片は、天然に存在するそれに相当するものと区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれの断片は、容量あたりの分子の濃度または数が、天然に存在するそれに相当するもののそれより「濃縮された」ものより大きい、または「分離された」ものより小さいという点において、天然に存在するそれに相当するものから区別できる。その一次配列においてまたは例えば、それのグリコシル化パターンにより天然に存在する相当するものと異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれの断片は、それが天然に存在するそれに相当するものと、それの一次構造によりまたはグリコシル化パターンのような別の特徴により区別できることから、その単離された形で存在する必要がない。本明細書に開示されている本発明のそれぞれについて、明確に述べてはいないが、下記に開示されている組成物のそれぞれについての上記の態様のすべてが、適切な条件下で、本発明により提供されていることは理解されるべきである。このように、天然に存在しないポリヌクレオチドは、単離された天然に存在するポリヌクレオチドとは異なる態様として提供される。細菌の細胞において産生されたタンパク質は、それが天然で産生されている真核細胞から単離された天然に存在するタンパク質とは異なる態様として提供される。
【００６８】
「宿主細胞」、「標的細胞」、または「レシピエント細胞」は、ベクターまたは外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および/またはタンパク質の組み込みに対するレシピエントであることができるまたはレシピエントになっている任意の個々の細胞または細胞培養物を含むものとする。それはまた、単細胞の子孫を含むものとし、その子孫は、自然の、偶発的な、または意図的な突然変異のために、必ずしも最初の親細胞と完全に同一(形態学的においてまたはゲノムもしくはDNA全量において)である必要はない。細胞は原核または真核でありうり、限定されるものではないが、細菌の細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、サル、またはヒトを含む。
【００６９】
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定されるものではないが、マウス、サル、ヒト、飼育動物、競技用動物、およびペットを含む。
【００７０】
「対照」は、比較の目的のために実験において使用される代替の対象または試料である。対照は「陽性」または「陰性」でありうる。例えば、実験の目的が遺伝子の変化した発現レベルと特定の型の癌との相関を測定することである場合、一般的には、陽性対照(そのような変化をもち、その疾患に特有な症候群を現している、対照または対照からの試料)、および陰性対照(その変化した発現およびその疾患の臨床的症候群を欠く対照または対照からの試料)を使用することが好ましい。
【００７１】
交換可能に、かつ単数形または複数形のいずれかにおいて用いられる、用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」とは、宿主の生物体に対して病的にさせる悪性の形質転換を受けた細胞を指す。一次癌細胞(すなわち、悪性形質転換の部位近くから得られる細胞)は、十分に確立された技術、特に組織学的検査により非癌性細胞と容易に識別されうる。本明細書で用いられる場合、癌細胞の定義は、一次癌細胞だけでなく、癌細胞祖先由来のいずれの細胞も含む。これは、転移した癌細胞、ならびに癌細胞由来のインビトロでの培養および細胞系を含む。通常、固体腫瘍として現れる癌の型を指している場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍集団に基づいて検出可能なものである；例えば、CATスキャン、磁気共鳴画像法(MRI)、X線、超音波、または触診のような方法による。生化学的または免疫学的所見のみではこの定義を満たすのに不十分である可能性がある。
【００７２】
「抑制している」腫瘍増殖は、本明細書に記載されている教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞への接触無しでの増殖と比較して短縮されている増殖期を意味する。腫瘍細胞増殖は、限定されるものではないが、腫瘍サイズの測定、³H-チミジン組み込みアッセイ法を用いた腫瘍細胞が増殖しているかどうかの決定、または腫瘍細胞の計数を含む、当技術分野において公知のいずれの方法によっても評価されうる。「抑制している」腫瘍細胞増殖は、次の状態：速度が落ちている、遅れている、のいずれかまたはすべてを意味し、「抑制している」腫瘍増殖は、腫瘍増殖を停止している場合の短縮されている増殖期、加えて腫瘍縮小を意味する。
【００７３】
用語「培養すること」とは、様々な種類の培地上または培地中において細胞または生物体のインビトロでの増殖を指す。培養で増殖した細胞の子孫はその親細胞と完全には一致(形態学的に、遺伝子的に、または表現型的に)しない場合があることが理解される。「拡大した(expanded)」とは、細胞のいずれの増殖および/または分裂をも意味する。
【００７４】
「組成物」は、活性のある薬剤、および不活性(例えば、検出可能な薬剤または標識)、またはアジュバントのような活性のある、別の化合物または組成物の組み合わせを意味するものとする。活性のある薬剤と結合された付加的なアミノ酸は、活性のあるまたは不活性でありうり、安定性、標的化、増強された免疫原性などを与える配列を含みうる。
【００７５】
「薬学的組成物」とは、その組成物をインビトロ、インビボ、またはエキソビボでの診断的または治療的使用のために適するようにする、不活性または活性のある担体との活性のある薬剤の組み合わせを含むものとする。
【００７６】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水、水、および油/水または水/油の乳濁液のような乳濁液のような標準の薬学的担体のいずれでも、ならびに様々な型の湿潤剤を含む。組成物はまた、安定化剤および保存剤も含みうる。担体、安定化剤、およびアジュバントの例として、Martin Remington's Pharm. Sci., 第15版(Mack Publ. Co., Easton (1975))を参照されたい。
【００７７】
「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与、適用、または投与量において投与されうる。
【００７８】
「ペプチド」という用語は、2個またはより多くのサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド様物質の化合物を指すためにその最も広い意味において用いられる。サブユニットはペプチド結合により連結されうる。もう一つの態様において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル結合などにより連結されうる。本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」とは、グリシンおよびD型またはL型の両方の光学異性体を含む、天然のおよび/または非天然のもしくは合成のいずれかのアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド様物質を指す。3個またはより多くのアミノ酸のペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合には、一般に、オリゴペプチドと呼ばれる。そのペプチド鎖が長い場合には、そのペプチドは、一般に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。本明細書を通して、ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸の番号付けは、アミノ末端からカルボキシ末端までである。
【００７９】
用語「配列モチーフ」とは、分子のグループ内に存在するパターンを指す。例えば、一つの態様において、本発明は、ペプチド間の配列モチーフの同定を提供する。この態様において、典型的パターンは、疎水性、親水性、塩基性、酸性などのような特徴的なアミノ酸残基により同定されうる。
【００８０】
「異常型ペプチドリガンド」とは、機能に関して定義される、すなわち、それらは、その親の抗原より、抗原特異的T細胞クローンのより強い刺激物質である。免疫優性のT細胞エピトープに対するT細胞寛容は、寛容化する抗原の異常型の交差反応性ペプチド類似体での免疫化により克服されうる。
【００８１】
各リンパ球は、可変の受容体遺伝子セグメントのランダムな組換えおよび異なる可変鎖の対形成により生じた、単一の特異性の細胞表面抗原受容体を所有する。この過程により、身体における何百万というリンパ球が何百万という異なる抗原受容体特異性を集合的にもつことが保証される。これは、個体の抗原受容体レパートリーを構成している。
【００８２】
個体の生涯の間、特異性を有する抗原に遭遇する(すなわち、結合する)それらのリンパ球のみが、「活性化」されて増殖および分裂し、その受容体のすべてが同じ抗原に結合する同一の子孫のクローンを生じさせることになる。抗原特異性は、このように子孫が増殖しエフェクター細胞へ分化することで維持される。
【００８３】
各リンパ球は異なる抗原結合特異性をもつため、任意の与えられた抗原へ結合および応答できるリンパ球の画分は非常に少ない。疾患/感染を制御するために十分な特異的なエフェクターリンパ球を生じさせるために、活性化されたリンパ球は、その子孫が最終的にエフェクター細胞へ分化する前に増殖しなければならない(すなわち、クローン拡大)。
【００８４】
Tリンパ球レパートリー内の多様性は、T細胞受容体(TCR)再編成の分布を分析することにより推定されうる。
【００８５】
MHC：ペプチド複合体の特異的なT細胞の認識は、可変領域(V)、多様領域(D；β鎖のみ)、接合(J)領域、および定常(C)領域をもつ固有のα鎖およびβ鎖から構成される膜結合性ヘテロ二量体である、TCRにより媒介される。いくつかの因子が、TCR遺伝子の再編成の間に生じた多数の可能なV(D)Jの組み合わせ、V(D)J接合部に導入されたランダムな突然変異またはヌクレオチドの付加、および別々に再編成されたα鎖およびβ鎖のランダムな対形成のような、TCRレパートリー多様性に寄与している。個々のV遺伝子の選択およびV(D)J接合配列によりコードされる相補性決定領域3(CDR3)の構造がTCR特異性の重要な決定子であると考えられている。
【００８６】
本発明は、天然のリガンド、例えば、腫瘍またはウイルスの抗原を提示している対象へ、その天然のリガンドに対する免疫応答を活性化することを目的として投与するための改変ペプチド種を選択するための方法を提供する。改変ペプチド種を製造および単離する様々な方法が知られており、本発明はいずれの一つの方法にも限定されない。改変ペプチド種は、天然または同種のリガンドに対する免疫応答(T細胞またはB細胞)を活性化するために設計および選択される。多くの天然のリガンドは、自己寛容または末梢寛容のために免疫応答を活性化しないものである。一つの局面において、本方法は、寛容を破るための方法および組成物を提供する。
【００８７】
複数または多数の改変ペプチド種が製造され免疫応答を活性化する能力についてスクリーニングされる。スクリーニングは、例は本明細書に記載されているが、インビトロでのスクリーニングが可能であり、またはインビボでのスクリーニングを含みうる。インビトロでのスクリーニングにおいて使用される細胞試料は、対象から直接的に採取されうる、または対象もしくは市販されているものから培養されうる。改変ペプチドの集団は、その後、T細胞集団を活性化する能力についてさらにアッセイされ、その集団の少なくとも2つのメンバーが別々のT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞を産生させる。スクリーニングはインビトロおよびインビボでのアッセイ法を含む。T細胞またはそれのクローンのVβ配列を決定する方法は、当技術分野において知られている。McMahan, C. J.およびFink, P. J. (2000) J. of Immun. 165:6902-6907; Kusaka, S.ら、(2000) J. of Immun. 164:2240-2247; およびKalergis, A. M.ら、(1999) J. of Immun. 162:7263-7270を参照されたい。インビトロでのスクリーニングにおいて使用される細胞試料は、対象から直接的に採取されうる、または対象もしくは市販されているものから培養されうる。
【００８８】
T細胞受容体ドメインおよびB細胞受容体ドメインは共通の祖先を共有している。T細胞受容体は、酸性アルファ(α)鎖および塩基性ベータ(β)鎖から構成されている。T細胞受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。β鎖は、可変(Vβ)領域および定常(Cβ)領域を含む。アルファ鎖およびベータ鎖は異なり、異なる遺伝子によりコードされている。T細胞受容体についての遺伝子のコード化における再編成は、それぞれのT細胞クローンに特有なものである。
【００８９】
一つの局面において、改変ペプチドは、お互いに異なるT細胞クローンを活性化するそれぞれの能力に基づいて選択される。さらなる局面において、改変ペプチドは、CTLの異なる亜集団を活性化する能力に基づいて選択される。上記のように、本発明は、この選択段階のためのインビトロおよびインビボでのスクリーニング方法を含む。
【００９０】
さらなる局面において、ペプチドは、免疫応答を活性化する、および単一の対象においてまたは対象の集団において、別々のT細胞Vβ組換え、T細胞クローン、またはCTLを活性化する能力に基づいている。または、改変ペプチドは、集団を構成する対象の大部分において別々のT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞集団を活性化する能力に基づいて選択される。局面において、対象は、HLA-A2のような所定のHLA-型を有する。
【００９１】
ペプチドの様々な組み合わせが選択されうる。例えば、少なくとも2つの改変ペプチドもしくは少なくとも3つ、または少なくとも2つ〜6つの改変ペプチドが選択される。
【００９２】
改変ペプチドは選択され、担体、例えば、対象への投与のための薬学的に許容される担体中に混合されうる。または、そのペプチドは、宿主細胞に存在する。その宿主細胞は、担体、例えば、薬学的に許容される担体に結合されうる。
【００９３】
そのペプチドをコードするポリヌクレオチドが、単独でまたは担体、例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせて、さらに提供される。そのポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞が本発明により、なおさらに提供される。上記のように、ベクターおよび宿主細胞は、薬学的に許容される担体のような担体に結合されうる。
【００９４】
本発明の組成物は、対象において免疫応答を調節するために有用である。もう一つの局面において、それらは、ナイーブの免疫エフェクター細胞を教育するために有用である。免疫エフェクター細胞集団の組み合わせが本発明によりさらに提供される。一つの局面において、それらは、担体、例えば、薬学的に許容される担体と結合される。
【００９５】
本発明の組成物は、対象において、天然のリガンドに対する免疫応答を調節する、または代わりとして活性化するもしくは誘導することができる。それゆえに、本発明はまた、その天然のリガンドに対する免疫応答を活性化するまたは誘導するための対象へのその組成物の投与を提供する。
【００９６】
一つの局面において、本発明は、天然のリガンドを提示している対象において免疫応答を誘発するための方法を提供する。その方法は、対象において第一の改変ペプチドにより教育された免疫エフェクター細胞の第一の集団を活性化し、その後、その対象においてその第一の改変ペプチドとは異なる改変ペプチドにより教育された免疫エフェクター細胞の第二の集団を活性化することを必要とし、それにより、その活性化された免疫エフェクター細胞集団のそれぞれは：(i)その天然の抗原エピトープに対して免疫応答を誘発する；および(ii)その対象において、異なる別々のT細胞受容体Vβの組換えを有する。その方法は、免疫エフェクター細胞の第一の集団および免疫エフェクター細胞の第二の集団を用いて天然のリガンドに対する免疫応答を誘発するための手段を提供し、第一のエフェクター細胞集団のT細胞受容体Vβの組換えは第二のエフェクター細胞集団のT細胞受容体Vβの組換えと異なることから、各集団はお互いなお別々の天然抗原に特異的に反応する。
【００９７】
一つの局面において、方法は、第一および第二の改変ペプチドまたは「収束性改変ペプチド」(本明細書に定義されているような)の有効量を対象へ送達することを必要とする。リガンドは、ペプチドとして、またはそのペプチドをコードするポリヌクレオチドとして送達されうる。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているように、送達されうる。リガンドおよび/またはポリペプチドは、宿主細胞、例えば、樹状細胞(DC)のような抗原提示細胞において送達されうる。さらなる局面において、サイトカインおよび/または共刺激分子の有効量が対象に投与される。
【００９８】
または、活性化は、それぞれ第一および第二の改変ペプチドの存在下でそれを費やして教育された第一および第二の免疫エフェクター細胞の有効量を送達することにより達成されうる。
【００９９】
天然のリガンドは、限定されるものではないが、抗原エピトープ、ヒト腫瘍抗原エピトープ、およびウイルス抗原エピトープでありうる。本発明はまた、ヒトの患者のような対象の治療を選択するための方法を提供する。この方法は、対象においてその天然のリガンドを特異的に認識する改変リガンドの選択を可能にする。
【０１００】
選択されたペプチド種は、対象へ送達され、選択されたペプチド種の送達により、天然のリガンドに対する免疫応答が活性化される。一つの局面において、各ペプチド種は個別に投与される。もう一つの局面において、選択されたペプチド種は同時投与される。さらなる局面において、選択された改変リガンドは、天然のペプチド種の投与またはより少ない改変ペプチド種の投与と比較して、対象において天然のリガンドに対して異常な免疫応答を活性化できる。
【０１０１】
一つの局面において、方法は、第一および第二の改変リガンドまたは「収束性改変リガンド」(本明細書に定義されているような)の有効量を対象へ送達することを必要とする。リガンドは、ペプチドとして、またはそのペプチドをコードするポリヌクレオチドとして送達されうる。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているように送達されうる。さらなる局面において、サイトカインおよび/または共刺激分子の有効量が対象に投与される。なおさらなる局面において、ペプチドおよび/またはポリヌクレオチドは、宿主細胞内に送達され、次いで対象へ投与される。
【０１０２】
本発明はまた、単一の同種の天然のリガンドに方向づけられる選択された複数の機能的収束性異常型ペプチドを含む組成物を提供し、その選択は多数のT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞レパートリーを集合的に刺激する機能的収束性異常型ペプチドリガンドを含む。換言すれば、本発明の組成物は、少なくとも2つの単離された改変リガンド種を含み、該種のそれぞれが、同じ同種の天然のリガンドに対する免疫応答を誘発する；および該天然リガンドに対する細胞障害性Tリンパ球(CTL)の異なる亜集団を活性化する能力を特徴とする。換言すれば、各種は、CTLの異なるクローン集団を活性化する。単離されたリガンド種は、その天然リガンドに選択的に結合する能力を保持すると同時にその対象における混合されたVβ使用T細胞レパートリーを誘発するように前もって選択される。さらなる局面において、2個から100個までの改変ペプチド種が組成物に含まれる。または、少なくとも3個の異なる改変ペプチドリガンド種が組成物に含まれる。リガンド種は、限定されるものではないが、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または自己抗原を含む。
【０１０３】
一つの態様において、組成物は、許容される担体または希釈液を含み、ペプチドは、連続的アミノ酸として、または代わりとして、そのペプチドをコードするポリヌクレオチドとして送達されうる。もう一つの態様において、改変ペプチドリガンドは、該天然のヒトのリガンドに自然につながっている1つまたは複数のアミノ酸に共有結合的に連結される。
【０１０４】
本発明によりまた、第一の改変リガンド種は第一のT細胞を活性化し、第二の改変リガンド種は第二のT細胞を活性化し、該第一のT細胞のT細胞受容体Vβの組換えは該第二のT細胞のT細胞受容体Vβの組換えとは異なる、単一の同種の天然リガンドに方向づけられる改変ペプチドまたは改変ペプチドリガンド；および改変リガンドのそれぞれの対象への同時投与のための使用説明書を含むキットが提供され、該リガンドは単独でまたは組み合わせてパッケージングされ、該リガンドのそれぞれは、脊椎動物の対象において異なるT細胞受容体Vβレパートリーを誘発する能力を特徴としている。キットは、ペプチドもしくはそのペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに/またはそのペプチドの作製のためのポリヌクレオチドおよび/もしくはアミノ酸配列を含む。一つの局面において、使用説明書は、さらに、該対象により誘発されるT細胞受容体Vβレパートリーの測定について提供する。さらなる局面において、その測定は、該同時投与の前および/または後に行われる。
【０１０５】
以下の実施例は、例証するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【０１０６】
改変ペプチドリガンドを設計するための方法
改変ペプチドリガンドは、当技術分野において公知の任意の方法を用いて同定される天然ペプチドのエピトープに基づいて設計されうる。以下は、そのような方法の非限定的実施例を提供している。さらに、いずれの以下の方法の改変または組み合わせも使用されうる。
【０１０７】
抗原提示細胞からMHC分子を単離およびアッセイすることを含む方法は、そのMHC分子に結合しているペプチドを同定するために使用されうる。ChiczおよびUrban (1994) Immunol. Today 1-5:155-160。バクテリオファージ「ファージディスプレー」ライブラリーもまた構築されうる。その「ファージ法」(ScottおよびSmith (1990) Science 249:386-390; Cwirlaら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Devlinら、(1990) Scinece 249:404-406)を用いて、非常に大きなライブラリーが構築されうる(10⁶-10⁸化学的実体)。使用されうるペプチドのエピトープを同定するための他の方法は、主として化学的方法を含み、ゲイセン(Geysen)法(Geysenら、(1986) Molecular Immunology 23:709-715; Geysenら、(1987) J. Immunologic Method 102:259-274; およびFodorら、(1991) Science 251:767-773の方法)がその例である。Furkaら、(1988) 14 th International Congress of Biochemistry, 5巻 要約 FR:013; Furka (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493。Houghton(1986年12月発行の米国特許第4,631,211号)およびRutterら、(1991年4月23日発行の米国特許第5,101,175号)は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験されうるペプチドの混合物を作製するための方法を記載している。使用されうる他の方法は、合成ライブラリーの使用を含み(Needelsら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-10704; Ohlmeyerら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Lamら、国際公開公報第92/00252号、それぞれは参照として本明細書に完全に組み入れられている)、および同様のものが受容体リガンドについてスクリーニングするために使用されうる。cDNAサブトラクションまたはディファレンシャルディスプレーに基づく技術は、文献に詳細に記載されており、これらも使用されうる。例えば、Hedrickら、(1984) Nature 308:149;およびLianおよびPardee(1992) Science 257:967を参照されたい。ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクション法、および逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析法(Alwineら、(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350; Zinnら、(1983) Cell 34:865; Veresら、(1987) Science 237:415)と同様に、発現配列タグ(EST)法は、遺伝子探索のための価値ある道具である(Adamsら、(1991) Science 252:1651)。使用されうるもう一つの技術は、「ペップスキャン(pepscan)」技術(Van der Zee(1989) Eur. J. Immunol. 19:43-47)であり、数ダースのペプチドが96ウェルマイクロタイタープレートパターンに整列したポリエチレンロッド上に同時に合成され、各ピンの位置がその上に合成履歴を明らかにする点において、索引付きライブラリーに類似している。ペプチドは、その後、固体支持体から化学的に切断され、抗原提示のために照射された同系の胸腺細胞へ供給される。クローニングされたCTL系は、その後³H-チミジン組み込みによりモニターされる増幅アッセイ法において反応性について試験される。
【０１０８】
SPHEREは、国際公開公報第97/35035号に記載されている。この方法は、ポリスチレンビーズ上に合成されるコンビナトリアルペプチドライブラリーを利用しており、各ビーズは、別々の一定分量においてそのビーズから化学的に遊離されうる固有のペプチドの純粋な集団を含む。プールされたビーズのアレイから遊離したペプチドは、例えば、対象となるT細胞を活性化できるペプチドのプールを同定するための³H-チミジン組み込み法(CD4⁺またはCD8⁺ T細胞用)、⁵¹Cr-遊離アッセイ法(CTL用)、またはIL-2産生法(CD4⁺ T細胞用)を含む、T細胞活性化を検出するための方法を用いてスクリーニングされる。反復のペプチドのプール/遊離のストラテジーを利用することにより、少ない日数で10⁷個より多くのペプチドをスクリーニングすることが可能である。その対応する陽性のビーズ(> 100 ピコモル)上に残留するペプチドの分析により、そのエピトープ配列の迅速かつ明白な同定が可能になる。
【０１０９】
CTLに結合するペプチドを同定するためのアッセイ法の簡単な概観は以下のとおりである：大まかにいうと、ウェルあたり1000個のビーズを含有する10個の96ウェルプレートは、10⁶個のビーズの収容能力をもつことになる；ウェルあたり100個のビーズを含有する10個の96ウェルプレートは、10⁵個のビーズの収容能力をもつことになる。スクリーニングあたり必要とされるCTL細胞の数と手動で行う操作の量の両方を最小限にするために、溶離されたペプチドは、任意の所望の複雑性をもつウェルを生じるためにさらにプールされうる。例えば、可溶性ライブラリーを用いる実験に基づき、2 X 10⁶個くらい少量のCTL細胞で、96ウェルプレート(ウェルあたり10,000個のペプチド)において10⁷個のペプチドをスクリーニングすることが可能である。ビーズからある割合のペプチドを切断した後、それらをガンマ照射された里親APCおよびクローニングされたCTL系と共にインキュベートし、³H-チミジン組み込み法により測定された陽性のウェルをさらに試験する。または、上記で指摘されているように、サイトカイン産生法または細胞溶解性⁵¹Cr-放出アッセイ法が使用されうる。Coulieら、(1992) Int. J. Cancer 50:289-291。各陽性のウェルからのビーズは分離され、各ビーズからの追加の割合のペプチドを利用して、前のように個別にアッセイされる。陽性の個々のビーズは、その後、その反応性アミノ酸配列を同定して、解読される。すべての陽性の分析により、試験されたCTLクローンを刺激する保存的に置換されたエピトープの部分的側面が与えられることになる。この点において、そのペプチドは再合成されて再試験されうる。また、第二のライブラリー(最小限の複雑性の)が、特定のCTLにより寛容となっている完全な一連の誘導体を列挙するために、すべての保存的置換の表示をもって合成されうる。複数のCTL(同じMHC拘束性の)を同時にスクリーニングすることにより、交差反応するエピトープについての研究が大いに促進される。
【０１１０】
CD8⁺ MHCクラスI拘束性CTLエピトープの同定のための記載されている方法は、CD4⁺ MHCクラスII拘束性CD4⁺ T細胞エピトープの同定に適用されうる。この場合、MHCクラスII対立遺伝子特異的ライブラリーは、ハプロタイプ特異的アンカー残基が適切な位置で表示されるように合成される。MHCクラスIIアグレトープ（agretopic）のモチーフは、共通の対立遺伝子について同定された。Rammensee(1995) Curr. Opin. Immunol. 7:85-96; Altuviaら、(1994) Mol. Immunol. 24:375-379; Reayら (1994) J. Immunol. 152:3946-3957; Verreckら (1994) Eur. J. Immunol. 24:375-379; SinigagliaおよびHammer (1994) Curr. Opin. Immunol. 6:52-56; RotzschkeおよびFalk (1994) Curr. Opin. Immunol. 6:45-51。そのペプチドの全長は、12個〜20個のアミノ酸残基であると思われ、前に記載されている方法は、ライブラリーの複雑性を限定するために使用されうる。
【０１１１】
改変ペプチドリガンドの作製
本発明の方法に従って使用されるペプチドは、多数の通常の方法のいずれか一つにおいて得られうる。それらは一般的に短い配列であるため、それらは標準的技術を使用する化学的合成により調製されうる。特に便利であるのは、固相ペプチド合成技術である。使用に必要とされる試薬と同様に自動ペプチド合成機は市販されている。または、ペプチドは、天然に存在するタンパク質の酵素的消化または切断により調製されうる。ペプチドはまた、当業者に公知の組換え技術を用いて調製されうる。
【０１１２】
一つの態様において、本発明の単離された改変ペプチドリガンドは、適当な固体合成方法を用いて合成されうる。StewardおよびYoung編、(1968)「Solid Phase Peptide Synthesis」Freemantle, San Francisco, Calif。好ましい方法は、メリフィールド（Merrifield)法である。Merrifield(1967) Recent progress in Hormone Res. 23:451。これらのペプチドの抗原活性は、例えば、本明細書に記載されているアッセイ法を用いて、便利に試験されうる。
【０１１３】
いったん、単離された本発明のペプチドが得られたならば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度を含む標準的方法により、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的技術により精製されうる。免疫アフィニティクロマトグラフィーについて、エピトープは、そのペプチドまたは本発明の関連ペプチドに対して産生し、固定の支持体に付着した抗体を含むアフィニティカラムにそれを結合することにより単離されうる。
【０１１４】
または、ヘキサ-ヒス(hexa-His)(インビトロジェン(Invitrogen))、マルトース結合ドメイン(ニューイングランドバイオラブズ(New England Biolabs))、インフルエンザ被膜配列(Kolodziejら、(1991) Methods Enzymol. 194:508-509)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼのようなアフィニティタグを適当なアフィニティカラムを通しての通過による簡単な精製を可能にするために本発明のペプチドに付着させることができる。単離されたペプチドはまた、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびX線結晶学のような技術を用いて、物理的に特徴付けられうる。
【０１１５】
ペプチド製剤
本発明の改変ペプチドリガンドは、様々な製剤形態において使用されうり、その製剤形態は意図された使用に依存して変わりうる。それらは、様々な他の分子と、共有結合的にまたは非共有結合的に連結され(複合体形成され)、その分子の性質はその特定の目的に依存して変わりうる。例えば、本発明の改変ペプチドリガンドは、限定されるものではないが、天然および合成のポリマー、タンパク質、多糖類、ポリ(アミノ酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、および脂質を含む、高分子担体に共有結合的にまたは非共有結合的に複合体形成されうる。ペプチドは、リポソームへの導入のために、脂肪酸に結合されうる。米国特許第5,837,249号。改変ペプチドリガンドは、固体支持体と共有結合的にまたは非共有結合的に複合体形成されうり、その固体支持体の種類は当技術分野において知られている。改変ペプチドリガンドはまた、より詳細に下に記載されているが、共刺激分子含有または非含有の抗原提示マトリックスに結合されうる。
【０１１６】
タンパク質担体の例には、限定されるものではないが、スーパー抗原、血清アルブミン、破傷風毒素、卵白アルブミン、チログロブリン、ミオグロブリン、および免疫グロブリンを含む。
【０１１７】
ペプチド-タンパク質担体ポリマーは、カルボジイミドのような通常の架橋剤を使用して形成されうる。カルボジイミドの例は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド(CMC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、および1-エチル-3-(4-アゾニア-44-ジメチルペンチル)カルボジイミドである。
【０１１８】
他の適する架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒド、および無水コハク酸である。一般的に、ホモ二機能性アルデヒド、ホモ二機能性エポキシド、ホモ二機能性イミドエステル、ホモ二機能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二機能性マレイミド、ホモ二機能性ハロゲン化アルキル、ホモ二機能性ピリジルジスルフィド、ホモ二機能性ハロゲン化アリール、ホモ二機能性ヒドラジド、ホモ二機能性ジアゾニウム誘導体、およびホモ二機能性光反応性化合物を含む複数のホモ二機能性試薬のいずれも使用されうる。また、ヘテロ二機能性化合物、例えば、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有する化合物、アミン反応性基および光反応性基を有する化合物、ならびにカルボニル反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有する化合物も含まれる。
【０１１９】
そのようなホモ二機能性架橋剤の詳細な例には、二機能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、ジスクシンイミジルスベリン酸エステル、およびジスクシンイミジル酒石酸エステル；二機能性イミドエステル ジメチルアジピミデート、ジメチルピメルイミデート、およびジメチルスベルイミデート；二機能性スルフヒドリル反応性架橋剤 1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン、ビスマレイミドヘキサン、およびビス-N-マレイミド-1,8-オクタン；二機能性ハロゲン化アリール 1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンおよび4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロフェニルスルフォン；ビス-[b(4-アジドサリシルアミド)エチル]ジスルフィドのような二機能性光反応性剤；二機能性アルデヒド ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびアジプアルデヒド；1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルのような二機能性エポキシド、二機能性ヒドラジド アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、およびコハク酸ジヒドラジド；二機能性ジアゾニウム o-トルイジン、ジアゾ化およびビス-ジアゾ化ベンジジン；二機能性ハロゲン化アルキル N1N'-エチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、N1N'-ヘキサメチレン-ビス(ヨードアセタミド)、N1N'-ウンデカメチレン-ビス(ヨードアセタミド)、加えて、それぞれ、ala'-ジヨード-p-キシレンスルホン酸およびトリ(2-クロロエチル)アミンのようなハロゲン化ベンジルおよびハロマスタードを含む。
【０１２０】
タンパク質のペプチドとの結合をもたらすために使用されうる他の一般的なヘテロ二機能性架橋剤の例は、限定されるものではないが、SMCCスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、SIAB(N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート)、SMPB(スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート)、GMBS(N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル)、MPBH(4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド)、M2C2H(4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシル-ヒドラジド)、SMPT(スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン)、およびSPDP(N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)を含む。
【０１２１】
架橋は、還元アミノ化によりカルボニル基をアミン基へまたはヒドラジド基へ結合することにより達成されうる。
【０１２２】
改変ペプチドリガンドはまた、滅菌溶液または水溶液、薬学的に許容される担体、懸濁液および乳濁液のような様々な液相担体に混合されうる。非水性溶媒の例は、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油を含む。抗体を調製するために使用される場合、担体はまた、特異的免疫応答を非特異的に増大させるのに有用であるアジュバントを含みうる。当業者は、容易に、アジュバントが必要とされているかどうかを決定し、それを選択することができる。しかしながら、例示のみを目的として、適するアジュバントは、限定されるものではないが、フロイントの完全および不完全、ミネラル塩、およびポリヌクレオチドを含む。
【０１２３】
改変ペプチドリガンドをコードする配列を含むポリヌクレオチド
本発明はさらに、改変ペプチドリガンドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書に用いられる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、DNA、RNA、および核酸様物質を含む。本発明のリガンドをコードするポリヌクレオチド配列またはそれらの相補体に加えて、本発明はまた、アンチセンスポリヌクレオチド鎖、例えば、これらの配列またはそれらの相補体に対するアンチセンスRNAを提供する。既知の配列およびVander Krolら、(1988) BioTechniques 6:958に記載されている方法体系を用いてアンチセンスRNAを得ることができる。
【０１２４】
ポリヌクレオチドは、核酸および/または細胞におけるその遺伝子の発現の検出のために、検出可能なマーカー、例えば、酵素標識または放射線同位元素に結合されうる。幅広い種類の適切な検出可能なマーカーが当技術分野において知られており、検出可能なシグナルを与える事が可能な、蛍光性、放射性、酵素、またはアビジン/ビオチンのような他のリガンドを含む。好ましい態様において、放射性または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはペルオキシダーゼのような酵素タグの使用が望まれる可能性が高いものと思われる。酵素タグの場合、相補的な核酸を含む試料を用いた特異的なハイブリダイゼーションを同定するために、人間の目に見えるまたは分光光度的に見える手段を供給するために使用されうる比色指標物質は知られている。簡単には、本発明は、標的の一本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチド(またはそれの対応する相補体)の10個のヌクレオチドのうち少なくとも4個、およびより好ましくは少なくとも5個または6個、および最も好ましくは少なくとも10個である標識された一本鎖ポリヌクレオチド(プローブ)とを、相補的な一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件(好ましくは中位にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件)下、またはより好ましくは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させることにより、一本鎖ポリヌクレオチドまたはその相補体を検出するための方法をさらに提供する。ハイブリダイズされたポリヌクレオチド対は、ハイブリダイズされていない一本鎖ポリヌクレオチドから分離される。そのハイブイリダイズされたポリヌクレオチド対は、当業者によく知られており、例えば、Sambrookら、(1989)前記に示されている方法を用いて検出される。
【０１２５】
本発明のポリヌクレオチドは、PCRを用いて複製されうる。PCRテクノロジーは、米国特許第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号、および第4,683,202号の主題であり、PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION(Mullisら編、Birkhauser Press, Boston(1994))およびそこに引用されている参照文献に記載されている。
【０１２６】
または、当業者は、本明細書に提供されている配列および市販のDNA合成機を用いてそのDNAを複製することができる。従って、本発明はまた、そのポリヌクレオチドの直鎖状配列、適切なプライマー分子、酵素のような化学物質、および複製のための使用説明書を提供することにより本発明のポリヌクレオチドを得る、ならびにそのポリヌクレオチドを得るために正しい方向にそのヌクレオチドを化学的に複製または連結する方法を提供する。分離した態様において、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。またさらに、当業者は、複製および増幅のために、そのポリヌクレオチドを適する複製ベクターへ挿入し、そのベクターを適する宿主細胞（原核細胞または真核細胞）へ挿入することができる。そのように増幅されたDNAは、当業者に周知の方法によりその細胞から単離されうる。この方法によりポリヌクレオチドを得るための工程は、そのようにして得られたポリヌクレオチドと同様に、本明細書にさらに提供されている。
【０１２７】
RNAは、最初にDNAポリヌクレオチドを適する宿主細胞へ挿入することにより得られうる。そのDNAは、任意の適切な方法、例えば、適切な遺伝子送達媒体(例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター)の使用または電気穿孔法により、挿入されうる。その細胞が複製して、そのDNAがRNAへと転写される場合；そのRNAは、その後、当業者に周知の方法、例えば、Sambrookら、(1989)前記に示されるような方法を用いて、単離されうる。例えば、mRNAは、Sambrookら、(1989)前記の手順に従って様々な溶解性酵素または化学的溶液を用いて単離される、または製造会社により提供されている添付の使用説明書に従って核酸結合樹脂により抽出されうる。
【０１２８】
「完全に整合された」プローブは特異的なハイブリダイゼーションに必要ではないことは、当技術分野において知られている。少数の塩基の置換、欠失、または挿入により生じたプローブ配列における微小な変化は、そのハイブリダイゼーションの特異性に影響を及ぼさない。一般的に、20 %くらいの塩基対ミスマッチ(最適に整列させた場合)は、許容されうる。好ましくは、前述のmRNAを検出するために有用なプローブは、匹敵する大きさの相同的領域に少なくとも約80 %同一である。より好ましくは、そのプローブは、相同的領域のアラインメント後の対応する遺伝子配列に85 %同一である；いっそうより好ましくは、90 %の同一性を示す。
【０１２９】
これらのプローブは、これらの細胞を含む様々な細胞または組織を検出するまたはモニターするためにラジオアッセイ法(例えば、サザンおよびノーザンブロット分析)において使用されうる。プローブはまた、固体支持体または本発明の1つもしくは複数のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現の検出のための高処理量のスクリーニングアッセイ法において使用されるチップのようなアレイに付着されうる。
【０１３０】
本発明はさらに、RNA転写のプロモーター、加えてDNAまたはRNAの複製および/または一過性もしくは安定的発現のための他の調節配列に機能的に連結された単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いられる場合、用語「機能的に連結された」とは、そのプロモーターがそのDNA分子からRNAの転写を命令するような様式に位置されていることを意味する。そのようなプロモーターの例は、SP6、T4、およびT7である。特定の態様において、細胞特異的プロモーターは、挿入されたポリヌクレオチドの細胞特異的発現のために使用される。プロモーターまたはプロモーター/エンハンサーを、終止コドン、選択マーカー配列、および挿入されたDNA断片がプロモーターに機能的に連結されたクローニング部位と共に含むベクターは当技術分野においてよく知られており、市販されている。一般的な方法体系およびクローニングストラテジーについては、「Gene Expression Technology」(Goeddel編、Academic Press, Inc. (1991))およびそこに引用されている参照文献、ならびに様々な適するベクターに関する地図、機能的性質、商業的供給業者、およびGenEMBLアクセッション番号の参照を含んでいる「Vectors: Essential Data Series」(GacesaおよびRamji編、John Wiley & Sons, N.Y. (1994))を参照されたい。好ましくは、これらのベクターは、インビトロまたはインビボでRNAを転写する事ができる。
【０１３１】
改変ペプチドリガンドをコードするポリヌクレオチドを含む送達媒体
本発明はまた、(インビボ、エキソビボ、またはインビトロのいずれであろうと)本発明のポリヌクレオチドの細胞への送達のために適した送達媒体を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、クローニングまたは発現ベクター内に含まれうる。これらのベクター(特に発現ベクター)は、次に、多数の形態のいずれか、例えば、細胞への送達および/または侵入を容易にするような形態をとるように操作できる。
【０１３２】
これらの核酸を含む発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを生成するための宿主ベクター系を得るために有用である。それは、これらの発現ベクターがその宿主生物体においてエピソームとしてまたは染色体DNAの統合された部分としてのいずれかで複製可能でなければならないことを意味している。適する発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、コスミドなどを含む、プラスミド、ウイルスベクターを含む。アデノウイルスのベクターは、インビトロおよびインビボ両方におけるそれらの高レベルの発現および効率的な細胞の形質転換から、インビボにおける組織への遺伝子の導入に特に有用である。核酸が適する宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞およびその宿主細胞の複製へ挿入される場合、そのタンパク質が組換えにより生成されうる。適する宿主細胞は、ベクターに依存するものであり、哺乳動物細胞、動物細胞、ヒトの細胞、サルの細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および周知の方法を用いて構築された細菌の細胞を含みうる。Sambrookら、(1989)前記を参照。外因性核酸の細胞への挿入のためのウイルスのベクターの使用に加えて、その核酸は、細菌細胞のための形質転換；哺乳動物細胞のためのリン酸カルシウム沈澱を用いるトランスフェクション；またはDEAE-デキストラン；電気穿孔法；またはマイクロインジェクションのような当技術分野において周知の方法により宿主細胞へ挿入されうる。この方法体系についてはSambrookら、(1989)前記を参照。このように、本発明はまた、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、動物細胞(ラットまたはマウス)、ヒトの細胞、または細菌細胞のような原核細胞を提供する。
【０１３３】
そのベクターがインビボまたはエキソビボでの遺伝子治療のために使用される場合、複製-無能力のレトロウイルスまたはアデノウイルスのベクターのような薬学的に許容されるベクターが好ましい。本発明の核酸を含む薬学的に許容されるベクターは、その挿入されたポリヌクレオチドの一過性または安定的発現のためにさらに改変されうる。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容されるベクター」という用語は、限定されるものではないが、選択的に標的化してその核酸を分裂細胞へ導入できるベクターまたは送達媒体を含む。そのようなベクターの例は、ウイルスのタンパク質を産生することについてのそれの無能力により定義される「複製-無能力の」ベクターであり、感染した宿主細胞でのそのベクターの蔓延を排除する。複製-無能力のレトロウイルスのベクターの例は、LNL6である。Millerら、(1989) BioTechniques 7:980-990。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介型遺伝子移入のために複製-無能力のレトロウイルスを使用する方法体系は十分に確立されている。Correllら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8912; Bordignon (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8912-8952; Culver (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3155;およびRill (1991) Blood 79(10):2694-2700。
【０１３４】
一般的に、本発明に使用される細胞の遺伝子改変は、本発明の1つまたは複数の改変ペプチドリガンドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターを導入することにより達成される。ウイルス系に加えて非ウイルス系も含む様々な異なる遺伝子移入ベクターが使用されうる。
【０１３５】
本発明のポリヌクレオチドの送達のための幅広い種類の非ウイルスの媒体は、当技術分野において知られており、本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、裸のDNAとして細胞へ送達されうる。国際公開公報第97/40163号。または、本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、陽イオン脂質；天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む、生体適合性のポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工のウイルスのエンベロープ；金属粒子；および細菌を含む様々な物質(送達形態)と様々な方法で結合した細胞へ送達されうる。送達媒体は微粒子の形をとりうる。これらの様々な物質の混合物または複合体もまた、送達媒体として使用されうる。本発明のポリヌクレオチドは、これらの様々な送達形態と非共有結合的にまたは共有結合的に結合されうる。
【０１３６】
非ウイルスのベクターの範疇には、原核生物のプラスミドおよび真核生物のプラスミドが含まれる。そこに本発明のポリヌクレオチドをクローニングしている非ウイルスのベクター(すなわち、クローニングおよび発現ベクター)は、本発明のポリヌクレオチドの供給源に加えて、組換え型ポリペプチドの発現のために使用されうる。クローニングベクターは、それらが含むポリヌクレオチドの複製コピーを得るため、または将来の回収のためにそのポリヌクレオチドを保管場所に蓄える手段として使用されうる。発現ベクター(およびこれらの発現ベクターを含む宿主細胞)は、それらが含むポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドを得るために使用されうる。それらはまた、その発現ベクターにおいてコードされているポリペプチドにより免疫応答を誘発するためのような、個体において、機能的に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現することが望ましいところに使用されうる。適するクローニングおよび発現ベクターは、当技術分野において公知のいずれをも含み、例えば、細菌、哺乳動物、酵母、および昆虫の発現系における使用のためのものを含む。特定のベクターおよび適する宿主細胞は当技術分野において知られており、本明細書で詳細に記載される必要はない。例えば、GacesaおよびRamji, Vectors, John Wiley & Sons (1994)を参照されたい。
【０１３７】
クローニングおよび発現ベクターは、典型的には、選択マーカー(例えば、そのベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子)を含むが、そのようなマーカー遺伝子は、宿主細胞へ同時導入された別のポリヌクレオチド配列上に所有されうる。選択遺伝子が導入された宿主細胞のみが、選択的条件下で生存および/または増殖する。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートなどに対する耐性を与える；(b)栄養要求性欠乏を補完する；または(c)複合培地から得られない不可欠な栄養分を供給するタンパク質をコードする。その適切なマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞に依存するものであり、異なる宿主に対する適当な遺伝子は当技術分野において知られている。クローニングおよび発現ベクターはまた、典型的には、宿主により認識される複製系を含む。
【０１３８】
適するクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築されうる、または当技術分野において入手可能な多数のクローニングベクターから選択されうる。その選択されるクローニングベクターは、使用される予定の宿主細胞により変わりうるが、有用なクローニングベクターは、一般的に、自己複製可能なものであり、特定の制限エンドヌクレアーゼについての単一の標的を有しうる、および/またはそのベクターを含むクローンの選択に使用されうるマーカーに対する遺伝子を所有しうる。適する例には、プラスミドおよび細菌のウイルスが含まれ、例えば、pUC18、pUC19、ブルースクリプト(Bluescript)(例えば、pBS SK+)およびその誘導物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、ならびにpSA3およびpAT28のようなシャトルベクターである。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、バイオラッド(BioRad)、ストラテジーン、およびインビトロジェン(Invitrogen)のような商業的販売会社から入手可能である。
【０１３９】
発現ベクターは、一般的に、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターのような適する転写制御要素に機能的に連結される。発現(すなわち、翻訳)のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンのような、1つまたは複数の翻訳制御要素が、通常、必要とされる。シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列もまた、機能的に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが細胞膜を通過および/もしくは細胞膜に留まる、または細胞から分泌されることを可能にするために含まれうる。酵母、トリ、および哺乳動物の細胞を含む真核細胞における発現に適する複数の発現ベクターが当技術分野において知られている。哺乳動物の発現ベクターの例には、細菌においてそのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列、および真核細胞において発現される1つまたは複数の真核生物の転写ユニットの両方が含まれる。真核細胞のトランスフェクションに適する哺乳動物の発現ベクターの例には、pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pRSVneo、およびpHyg由来のベクターが含まれる。または、ウシのパピローマウイルス(BPV-1)、エプスタイン-バールウイルス(pHEB、pREP由来ベクター)のようなウイルスの誘導物が、哺乳動物細胞における発現に使用されうる。酵母系のための発現ベクターの例には、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、YES2、およびYRP17が含まれるが、S. セレビシエ(S. cerevisiae)への構築物の導入に有用なクローニングおよび発現媒体である。Broachら、(1983)「Experimental Manipulation of Gene Expression」、M. Inouye編、Academic Press. p. 83。昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクターには、pVL由来ベクター(pVL1392、pVL1393、およびpVL941のような)、pAcUW由来ベクター、およびpBlueBac由来ベクターが含まれる。
【０１４０】
ウイルスのベクターには、限定されるものではないが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルスに基づいているもののようなDNAウイルスベクター；ならびに、限定されるものではないが、レトロウイルスベクターを含むRNAウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルスを含む。Naldiniら、(1996) Science 272:263-267。
【０１４１】
レトロウイルスのゲノムの一部として本発明のポリヌクレオチドを含む複製欠損レトロウイルスベクターは使用されうる。そのようなベクターは詳細に記載されている。(Millerら、(1990) Mol. Cell Biol. 10:4239; Kolberg, R. (1992) J. NIH Res. 4:43; Cornettaら、(1991) Hum. Gene Therapy 2:215)。
【０１４２】
本発明の遺伝子改変において有用なアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのベクターは、当技術分野においてすでに教えられている方法に従って作製されうる。(例えばKarlssonら、(1986) EMBO 5:2377; Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzcyzka (1992) Current Top. Mirobiol. Immunol. 158:97-129; 「Gene Targeting: A Practical Approach」(1992) A. L. Joyner編、Oxford University Press, NYを参照されたい)。いくつかの異なる方法が実行可能である。
【０１４３】
本発明の方法において使用されうるウイルスベクターを記載する追加的な参照文献は、以下のものを含む：Horwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B.ら(編)「Virology」、2巻、Raven Press New York, pp. 1679-1721, 1990; Graham, F.ら、pp. 109-128「Methods In Molecular Biology」、7巻：「Gene Transfer And Expression Protocols」、Murray, E.(編)、Humana Press, Clifton, N. J. (1991); Millerら、(1995) FASEB Journal 9:190-199, Schreier (1994) Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159; SchneiderおよびFrench (1993) Circulation 88:1937-1942; Curielら、(1992) Human Gene Therapy 3:147-154; Grahamら、国際公開公報第95/00655号(1995年1月5日); Falck-Pedersen 国際公開公報第95/16772号(1995年6月22日); Denefleら、国際公開公報第95/23867号(1995年9月8日); Haddadaら、国際公開公報第94/26914号(1994年11月24日); Perricaudetら、国際公開公報第95/02697号(1995年1月26日);およびZhangら、国際公開公報第95/25071号(1995年10月12日)。
【０１４４】
DCまたは他のAPCの形質導入の効率は、発現している腫瘍抗原に対して特異的な蛍光性抗体を用いる免疫蛍光法により評価できる(Kimら、(1997) J. Immunother. 20:276-286)。または、その抗体は、その基質との反応で着色された生成物を生じさせる酵素(例えば、HRP)に結合させることができる。APCにより発現されている抗原性ポリペプチドの実際の量は、ELISAにより評価できる。
【０１４５】
インビボでのDCまたは他のAPCの形質導入は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮膚の送達を含む異なる経路を通して、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの投与により達成されうる。使用されうる一つの方法は、約1 x 10¹⁰〜1 x 10¹² i.u.の全投与量を用いる複数部位でのAdベクターの皮膚送達である。インビボでの形質導入のレベルは、APCマーカーおよび発現しているそのペプチドのエピトープに対して向けられる抗体で同時染色することによりおおよそ評価できる。染色工程は、投与部位からの生検試料においてまたは流入領域リンパ節もしくはAPC(特にDC)が転移した可能性がある他の器官からの細胞において行われうる。Condonら、(1996) Nature Med. 2:1122-1128; Wanら、(1997) Human Gene Therapy 8:1355-1363。注入部位または形質導入されたAPCが転移した可能性がある他の器官において発現している抗原の量は、組織ホモジネートでのELISAにより評価できる。
【０１４６】
APCはまた、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈澱、または陽イオン脂質/プラスミドDNA複合体のような非ウイルスの遺伝子送達方法により、インビトロ/エキソビボで形質導入されうる。Arthurら、(1997) Cancer Gene Therapy 4:17-25。形質導入されたAPCは、その後、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内の送達経路を通して、宿主へ投与されうる。
【０１４７】
インビボでのDCまたは他のAPCの形質導入は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮膚の投与経路を通して送達される陽イオン脂質/プラスミドDNA複合体の投与により達成される可能性がある。裸のプラスミドDNAの皮膚への遺伝子銃送達または注射もまた、DCの形質導入を導く。Condonら、(1996) Nature Med. 2:1122-1128; Razら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523。プラスミドDNAの筋肉内送達もまた、免疫化のために使用されうる。Rosatoら、(1997) Human Gene Therapy 8:1451-1458。
【０１４８】
形質導入効率および導入遺伝子発現のレベルは、ウイルスベクターについて上に記載されているように評価できる。
【０１４９】
改変ペプチドリガンドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、そのポリヌクレオチドの組換えによる複製および本発明のペプチドの組換えによる産生に有用である。または、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、本明細書に記載される方法において、対象に免疫応答を誘導するために使用されうる。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドの組換えによる複製、および本発明のペプチドの組換えによる産生に適している宿主細胞は、原核生物または真核生物でありうる。宿主系は当技術分野において知られており、本明細書で詳細に記載される必要はない。原核生物の宿主は、細菌の細胞、例えば、大腸菌、枯草菌、および放線菌を含む。真核生物の宿主には、酵母、昆虫、トリ、植物、線虫(C. elegans)(またはネマトーダ（nematode）)、および哺乳動物細胞がある。これらの細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された通常の栄養培地において培養される。
【０１５１】
宿主細胞が抗原提示細胞である場合、それらは、養子免疫療法において有用となる腫瘍浸潤性リンパ球のような免疫エフェクター細胞の集団を拡大するために使用されうる。抗原提示細胞は、下により詳細に記載されている。
【０１５２】
改変ペプチドリガンドを提示する宿主細胞
本発明はさらに、改変ペプチドリガンドを含む単離された宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、これらの宿主細胞は、本発明の2つまたはより多くのペプチドを、MHC分子に関連してそのペプチドが免疫エフェクター細胞により認識されうるように、その細胞の表面上に提示している。MHC分子に関連して本発明のポリペプチドを提示している単離された宿主細胞は、さらに、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団を拡大および単離するために有用である。その免疫エフェクター細胞、例えば、細胞障害性Tリンパ球は、APCの表面上にMHC分子に関連してそのポリペプチドを提示している抗原提示細胞と共にナイーブ免疫エフェクター細胞を培養することにより産生される。その集団は、当技術分野において公知の方法、例えば、FACS分析またはFICOLL(商標)勾配を用いて精製できる。その免疫エフェクター細胞を発生および培養するための方法、加えてそれにより産生されるその集団もまた、本発明者の貢献および発明である。その細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、養子免疫療法において有用である。インビボでの投与前に、その免疫エフェクター細胞は細胞を標的化するそれらの能力についてインビトロでスクリーニングされる。
【０１５３】
これらの態様のいくつかにおいて、単離された宿主細胞はAPCである。APCは、限定されるものではないが、樹状細胞(DC)、単球/マクロファージ、Bリンパ球、または必要なMHC/共刺激分子を発現している他の細胞型を含む。
【０１５４】
いくつかの態様において、その免疫エフェクター細胞および/またはAPCは、遺伝子的に改変される。標準的遺伝子移入を用いて、共刺激分子および/または刺激性サイトカインをコードする遺伝子は、その免疫エフェクター細胞の拡大の前に、同時に、または後に挿入されうる。
【０１５５】
APCは、限定されるものではないが、末梢血単核細胞(PBMC)、全血または混合された集団を含むそれの画分、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、白血球除去血輸血により得られる細胞、リンパ節、例えば、腫瘍から排出しているリンパ節を含む、様々な源から得られうる。適する供与体は、免疫化された供与体、非免疫化(ナイーブ)供与体、処理されたまたは未処理の供与体を含む。「処理された」供与体は、1つまたは複数の生物学的変性剤に曝されたことがある供与体である。「未処理の」供与体は、1つまたは複数の生物学的変性剤に曝されたことがない。APCはまた、インビトロで、1つまたは複数の生物学的変性剤で処理されうる。
【０１５６】
APCは、一般的に生きているだけでなく、照射、ミトマイシンC処理、弱毒化、または化学的に固定することができる。さらに、APCは細胞全体である必要がない。その代わりとして、APCの小胞調製物が使用できる。
【０１５７】
APCは遺伝子的に改変されうる、すなわち、それらが通常発現しないもしくは通常より低いレベルで発現するポリペプチドまたはRNA分子を発現するように、組換え型ポリヌクレオチド構築物でトランスフェクションされうる。ポリヌクレオチドの例は、限定されるものではないが、MHC分子；B7のような共刺激分子；および本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするものを含む。
【０１５８】
通常、哺乳動物においてインビボでAPCとして機能しない細胞が、それらがAPCとして機能するように改変できる。幅広い種類の細胞が、適切に改変された場合、APCとして機能することができる。そのような細胞の例は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエまたはヨトウ虫（Spodoptera）；およびヒト細胞系T2のような里親細胞である。例えば、MHC分子のような1つまたは複数の抗原提示ポリペプチド、また選択的に、B7のようなアクセサリー分子の合成を命令する発現ベクターが、これらの抗原提示分子および、選択的に、アクセサリー分子またはそれらの機能的部分を細胞の表面上で発現するように、これらの細胞へ導入できる。または、それら自身を細胞膜へ挿入することができる抗原提示ポリペプチドおよびアクセサリー分子が使用できる。例えば、グリコシル-ホスファチジルイノシトール(GPI)修飾化ポリペプチドがそれ自身を細胞の膜へと挿入できる。Hiroseら、(1995) Methods Enzymol. 250:582-614;およびHuangら、(1994) Immunity 1:607-613。アクセサリー分子は、限定されるものではないが、CD28、CD80、またはCD86に対して特異的な抗体のような共刺激抗体；限定されるものではないが、B7.1およびB7.2を含む共刺激分子；ICAM-1およびLFA-3のような接着分子；およびFasリガンドおよびCD70のような生存分子を含む。例えば、国際公開公報第97/46256号を参照されたい。
【０１５９】
里親抗原提示細胞は、特に、APCとして有用である。里親APCは、ヒト細胞系174xCEM.T2由来であり、T2と呼ばれているが、内因性ペプチドと細胞表面MHCクラスI分子との結合を制限するその抗原プロセシング経路における突然変異を含んでいる。Zweerinkら、(1993) J. Immunol. 150:1763-1771。これは、MHCクラスI限定性CD8⁺ CTLへの抗原提示に必要とされる遺伝子TAP1、TAP2、LMP1、およびLMP2を包含するMHCクラスII領域における大きなホモ接合性欠失による。実際において、「空の(empty)」MHCクラスI分子のみがこれらの細胞表面上に提示される。培地へ添加された外因性ペプチドは、もしそのペプチドがその対立遺伝子特異的結合モチーフを含むならば、これらのMHC分子に結合する。これらのT2細胞は、本明細書において、「里親」APCと呼ばれる。それらは、本抗原に対する本発明に関連して使用されうる。
【０１６０】
特定の組換え型MHC対立遺伝子によるT2細胞の形質導入は、MHC制限特性の再方向付けを可能にする。その組換え型対立遺伝子に合わせて作製されたライブラリーは、そのアンカー残基が内因性対立遺伝子への効率的な結合を妨げるため、それらにより優先的に提示されるものと思われる。
【０１６１】
MHC分子の高レベルの発現により、APCがCTLにとってより認識しやすくなる。強力な転写プロモーター(例えば、CMVプロモーター)を用いてT2細胞において対象となるMHC対立遺伝子を発現することは、結果として、より反応性の高いAPCを生じる(おそらく、その細胞表面上における反応性MHC-ペプチド複合体のより高い濃度による)。
【０１６２】
以下は、APCの単離のための2つの基本的方法の簡単な説明である。これらの方法は、(1)血液から骨髄前駆細胞(CD34⁺)を単離する段階およびAPCへ分化させるためにそれらを刺激する段階；または(2)末梢血から前コミットメントされた(precommitted)APCを収集する段階を含む。第一の方法において、患者は、末梢血における循環しているCD34⁺幹細胞の数を増加させるためにGM-CSFのようなサイトカインで処理されなければならない。
【０１６３】
APCを単離するための第二の方法は、血液中にすでに循環している比較的多数の前コミットメントされたAPCを収集することができる。ヒト末梢血からコミットメントされたAPCを単離するための以前の技術は、メトリズアミド(metrizamide)勾配および付着/非付着段階(Freudenthalら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-7702)；パーコール勾配分離(Mehta-Damaniら、(1994) J. Immunol. 153:996-1003)；ならびに蛍光活性化細胞選別技術(Thomasら、(1993) J. Immunol. 151:6840-6852)のような物理的工程の組み合わせを含んでいた。
【０１６４】
大量の細胞をお互いに分離するための一つの技術は、向流遠心エルトリエーション(CCE)として知られている。この技術において、細胞は、遠心分離と、流出速度において一定に増加している洗浄の緩衝液の流れとに同時にかけられる。その緩衝液の一定に増加している向流の流れが、主として細胞の大きさに基づいている分別的細胞分離へと導く。
【０１６５】
本発明の一つの局面において、APCは、マウス、サル、またはヒトのような哺乳動物の白血球画分から単離されうる前コミットメントされたまたは成熟の樹状細胞である(例えば、国際公開公報第96/23060号を参照)。白血球画分は、哺乳動物の末梢血からでありうる。この方法は、以下の段階を含む：(a)白血球除去血輸血のような当技術分野において公知の方法により哺乳動物源から得られる白血球画分を供給する段階；(b)段階(a)の白血球画分を向流遠心エルトリエーションにより4つまたはより多くの細画分へと分離する段階、(c)細胞をカルシウムイオノフォア、GM-CSFおよびIL-13またはGM-CSFおよびIL-4に接触させることにより、段階(b)からの1つまたは複数の画分における単球の樹状細胞への転換を刺激する段階、(d)段階(c)からの樹状細胞濃縮画分を同定する段階、ならびに(e)段階(d)の濃縮された画分を、好ましくは約4℃で、収集する段階。樹状細胞濃縮画分を同定するための一つの方法は、蛍光活性化細胞選別によるものである。白血球画分は、組換え型(rh)rhIL-12、rhGM-CSF、またはrhIL-4のような他のサイトカインの存在下でカルシウムイオノフォアで処理されうる。白血球画分の細胞は、緩衝液中で洗浄され、分離段階の前に、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺を含まない培養液に懸濁される。白血球画分は、白血球除去血輸血により得られる。樹状細胞は、次のマーカー：HLA-DR、HLA-DQ、またはB7.2の少なくとも1つの存在、および次のマーカー：CD3、CD14、CD16、56、57、およびCD19、20が同時に存在しないことにより、同定できる。これらの細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体は市販されている。
【０１６６】
より詳細には、この方法は、白血球除去血輸血からの白血球および血小板の濃縮された収集物を集めることを必要とし、これはその後さらに向流遠心エルトリエーション(CCE)により分画される。Abrahamsenら、(1991) J. Clin. Apheresis 6:48-53。細胞試料を特定のエルトリエーションローターに置く。ローターをその後、一定の速度、例えば、3000 rpmで回転させる。いったん、ローターが所望の速度に到達したならば、加圧空気を用いて、細胞の流出速度を調節する。エルトリエーター中の細胞は、遠心分離と、流出速度において一定に増加している洗浄の緩衝液の流れとに同時にかけられる。これが結果として、主として（しかし排他的にではなく）細胞の大きさでの違いに基づいた分別的細胞分離を生じる。
【０１６７】
APC、より詳細には、DCの収集および培養物中でのそれらの成功した活性化の確認の品質管理は、単球と樹状細胞亜集団の両方、加えて可能性のある夾雑物のTリンパ球をモニターする同時多色FACS分析技術に依存している。それは、DCが次のマーカー：CD3(T細胞)；CD14(単球)；CD16、56、57(NK/LAK細胞)；CD19、20(B細胞)を発現しないという事実に基づいている。同時に、DCは、血液中を循環している際に、大量のHLA-DR、有意のHLA-DQおよびB7.2(しかし、B7.1は、ほとんどまたは全くない)を発現している(さらに、それらは、単球および好中球によっても発現されている骨髄マーカー、Leu M7およびM9を発現している)。
【０１６８】
いったん収集されたならば、DC豊富/単球のAPC画分(通常150から190まで)は、将来の使用のためにプールおよび凍結保存できる、またはすぐに短期間培養に置くことができる。
【０１６９】
または、樹状細胞を上方制御すること(活性化すること)および単球を活性化された樹状細胞表現型へ転換することのための方法が報告されている。この方法は、カルシウムイオノフォアの培地への添加により単球が活性化された樹状細胞へと転換されることを含んでいる。カルシウムイオノフォアA23187を例えば24時間〜48時間の培養期間の初めに添加することにより、プールされた「単球プラスDC」画分の一様な活性化および樹状細胞表現型転換を生じた：特徴として、その活性化された集団は、一様にCD14(Leu M3)陰性になり、HLA-DR、HLA-DQ、ICAM-1、B7.1、およびB7.2を上方制御する。
【０１７０】
サイトカインの特定の組み合わせを使用して、カルシウムイオノフォアで達成される活性化/転換のために増幅する(または部分的に置換する)ことに成功している：これらのサイトカインは、限定されるものではないが、精製されたまたは組換え型ヒトの(「rh」)rhGM-CSF、rhIL-2、およびrhIL-4を含む。各サイトカインが単独で与えられる場合では、最適な上方制御のためには不十分である。
【０１７１】
抗原提示マトリックスによる改変ペプチドリガンドの提示
本発明の免疫調節的方法および診断的方法における使用のために、抗原提示マトリックスは、MHC分子に結合した本発明の収束性抗原ペプチドリガンドを提示する。いずれの公知の方法も抗原提示マトリックスによる提示を達成するために使用されうる。以下は、使用されうる方法の非限定的例である。
【０１７２】
改変ペプチドリガンドは、ポリペプチドもしくはペプチドとして、またはそのタンパク質/ペプチドをコードするcDNAの形において、抗原提示細胞へ送達されうる。
【０１７３】
本発明の合成抗原ペプチドエピトープをAPCへ送達するためのもう一つの方法は、パルスすることによる。パルスすることは、インビトロ/エキソビボで、APCを本発明の抗原ポリペプチドまたはペプチドに曝すことにより達成されうる。そのポリペプチドまたはペプチドは、およそ3時間に1 μm〜10 μmの濃度でAPCへ添加される。パルスされたAPCは、その後、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内の送達経路を通して宿主へ投与されうる。
【０１７４】
改変ペプチドリガンドはまた、例えば、ポリペプチドの一部としてまたは別の高分子と複合体形成されて、アジュバントを含有または含有せずに、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内または腹腔内の送達経路を通して、インビボで送達されうる。
【０１７５】
様々な他の技術が使用でき、以下のものを含む。Pagliaら、(1996) J. Exp. Med. 183:317-322は、インビトロでタンパク質全体とインキュベートされたAPCがMHCクラスI限定性CTLにより認識されること、およびこれらのAPCでの動物の免疫化により、インビボでの抗原特異的CTLの発生が導かれることを示した。さらに、DCのようなAPCの細胞質ゾルにおいて抗原の発現へと導くいくつかの異なる技術が記載されている。これらは、(1)腫瘍細胞から単離されたRNAのAPCへの導入、(2)抗原の内因性発現を誘導するための組換えベクターでのAPCの感染、および(3)リポソームを用いるDC細胞質ゾルへの腫瘍抗原の導入を含む。(Boczkowskiら、(1996) J. Exp. Med. 184:465-472; Rouseら、(1994) J. Virol. 68:5685-5689; およびNairら、(1992) J. Exp. Med. 175:609-612を参照)。
【０１７６】
使用されうるもう一つの方法は、「ペインティング(painting)」と名付けられる。グリコシル-ホスファチジルイノシトール(GPI)修飾化タンパク質が、精製後、それら自身をもとの細胞膜へ再組み込み可能なことが実証された。Hiroseら、(1995) Methods Enzymol. 250:582-614; Medofら、(1984）J. Exp. Med. 160:1558-1578; Medof (1996) FASEB J. 10:574-586; およびHuangら、(1994) Immunity 1:607-613は、CTLへの抗原提示のための、特異的な組成物のAPCを作製するためにこの性質を活用した。彼らは、β2-ミクログロブリンおよびそのHLA-A2.1対立遺伝子のための発現ベクターを考案した。そのタンパク質は、GPI修飾化を補助することが知られている、シュナイダーS2 ドロソフィラ メラノガスター(Drosophila melanogaster)細胞において発現される。精製後、そのタンパク質は、精製された抗原ペプチドと共にインキュベートされうり、結果として、それ自身を自家性細胞の膜へ効率的に挿入できる3分子複合体を生じた。本質において、これらのタンパク質混合物は、APC表面を「ペイント(paint)」するために使用され、その抗原ペプチドに対して特異的であるCTLクローンを刺激する能力を与えた。細胞コーティングは、速やかに起こり、タンパク質濃度依存性であることが示された。APCを作製するこの方法は、そのAPCへの遺伝子移入の必要性を回避し、細胞表面での抗原ペプチド濃度の制御を可能にする。
【０１７７】
免疫エフェクター細胞
本発明は、抗原特異的免疫エフェクター細胞の濃縮された集団の産生を刺激するために、APCを含む上記組成物を使用する。従って、本発明は、本発明の抗原ペプチドに特異的な教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の中に濃縮された細胞集団を提供する。これらの細胞は、天然の(内因性)抗原上の抗原決定基(エピトープ)と交差反応する(特異的に結合する)ことができる。いくつかの態様において、その天然の抗原は、腫瘍細胞の表面上にあり、本発明のその教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞は、その腫瘍細胞の増殖を抑制する。APCが使用される場合、抗原特異的免疫エフェクター細胞は、そのAPCを消費して拡大し、APCは培養中に死ぬ。ナイーブ免疫エフェクター細胞が他の細胞により教育される過程は、本質的に、Coulie(1997) Molec. Med. Today 3:261-268に記載されている。
【０１７８】
上記のように調製されたAPCは、ナイーブ免疫エフェクター細胞と混合される。好ましくは、その細胞は、サイトカイン、例えば、IL2の存在下で培養されうる。樹状細胞は、IL-12のような強力な免疫刺激性サイトカインを分泌するため、拡大の第一および次の回の間には、補足的なサイトカインを添加する必要がない場合がある。いずれにせよ、培養条件は、抗原特異的免疫エフェクター細胞がAPCより極めて高い割合で拡大する(すなわち、増殖する)ようなものである。APCおよび選択的なサイトカインの多数回の注入は、抗原特異的細胞の集団をさらに拡大するために行われうる。
【０１７９】
一つの態様において、免疫エフェクター細胞はT細胞である。分離した態様において、免疫エフェクター細胞は、例えば、IL-2、IL-11、またはIL-13をコードする導入遺伝子を用いた形質導入により遺伝子的に改変されうる。インビトロ、エキソビボ、およびインビボで導入遺伝子を導入するための方法は、当技術分野においてよく知られている。Sambrookら、(1989)前記を参照されたい。
【０１８０】
本発明の方法における使用に適したエフェクター細胞集団は、自家性または同種性でありうるが、好ましくは、自家性である。エフェクター細胞が同種性である場合、好ましくは、その細胞は、使用の前にアロ反応性細胞が枯渇している。これは、例えば、その同種のエフェクター細胞とレシピエントの細胞集団とを混合し、それらを適する時間インキュベートし、その後、CD69⁺細胞を枯渇させる、またはアロ反応性細胞を不活化する、またはそのアロ反応性細胞集団にアネルギーを導入することによることを含む、任意の公知の方法により達成されうる。
【０１８１】
ハイブリッドの免疫エフェクター細胞もまた使用されうる。免疫エフェクター細胞ハイブリッドは、当技術分野において知られており、様々な刊行物に記載されている。例えば、国際公開公報第98/46785号および第95/16775号を参照されたい。
【０１８２】
エフェクター細胞集団は、分離されていない細胞、すなわち、混合された集団、例えば、PBMC集団、全血などを含みうる。エフェクター細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づく陽性選択、細胞表面マーカーの発現に基づく陰性選択、インビトロもしくはインビボでの1つもしくは複数の抗原での刺激、インビトロもしくはインビボでの1つもしくは複数の生物学的変性剤での処理、1つもしくは複数の抗原もしくは生物学的変性剤での減算刺激、またはこれらのいくつかもしくはすべての組み合わせにより操作されうる。
【０１８３】
エフェクター細胞は、限定されるものではないが、PBMC、全血または混合された集団を含むそれらの画分、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、白血球除去血輸血により得られた細胞、生検組織、リンパ節、例えば、腫瘍から排出しているリンパ節を含む、様々な源から得られうる。適する供与体は、免疫化された供与体、非免疫化(ナイーブ)の供与体、処理されたまたは未処理の供与体を含む。「処理された」供与体は、1つまたは複数の生物学的変性剤に曝されたことがある供与体である。「未処理の」供与体は、1つまたは複数の生物学的変性剤に曝されたことがない。
【０１８４】
エフェクター細胞を培養および抽出する方法はよく知られている。例えば、エフェクター細胞は、白血球除去血輸血、連続的流動細胞分離機を使用する機械的除去療法により得られうる。例えば、リンパ球および単球は、限定されるものではないが、フィコール-ハイパクエ(Ficoll-Hypaque)(商標)勾配を通しての分離、パーコール勾配を通しての分離、またはエルトリエーションを含む、いずれの公知の方法によっても軟膜から単離されうる。フィコール-ハイパクエ(Ficoll-Hypaque)(商標)の濃度は、所望の集団、例えば、T細胞の中に濃縮された集団を得るために調整されうる。親和性に基づく他の方法が知られており、使用されうる。これらは、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)、細胞接着、磁気ビーズ分離などを含む。親和性に基づく方法は、細胞表面マーカーに対して特異的であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(マナッサス、MD)を含む様々な商業的供給源から入手可能である抗体またはそれらの部分を利用しうる。親和性に基づく方法は、または、細胞表面受容体のリガンドまたはリガンド類似体を利用できる。
【０１８５】
エフェクター細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づく1つまたは複数の分離プロトコールにかけられうる。例えば、細胞は、限定されるものではないが、CD2、CD3、CD4、CD8、TCR、CD45、CD45RO、CD45RA、CD11b、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD40Lのような「分化のクラスター(cluster of differentiation)」細胞表面マーカー；リンパ球活性化遺伝子3産物(LAG3)、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)、T1/ST2のようなリンパ球活性化に関連する他のマーカー；CCR3、CCR4、CXCR3、CCR5のようなケモカイン受容体；CD62L、CD44、CLAのようなホーミング受容体；CD146、a4b7、aEb7；CD25、CD69、およびOX40のような活性化マーカー；ならびにCD1により提示されるリポグリカンを含む、1つまたは複数の細胞表面ポリペプチドの発現を基礎とする陽性選択にかけられうる。エフェクター細胞集団は、非T細胞および/または特定のT細胞サブセットの枯渇についての陰性選択にかけられうる。陰性選択は、限定されるものではないが、CD19およびCD20のようなB細胞マーカー；単球マーカーCD14；NK細胞マーカーCD56を含む、様々な分子の細胞表面発現を基礎として行われうる。
【０１８６】
エフェクター細胞集団は、インビボまたはインビトロで、1つまたは複数の生物学的変性剤への曝露により操作されうる。適する生物学的変性剤は、限定されるものではないが、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-12、IFN-γのようなサイトカイン；植物性血球凝集素(PHA)、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、コンカナバリン-Aおよびイオノマイシンのようなホルボールエステルのような非特異的変性剤；抗CD2、抗CD3、抗IL2受容体、抗CD28のような細胞表面マーカーに特異的な抗体；例えば、リンフォタクチン(lymphotactin)を含むケモカインを含む。生物学的変性剤は、自然の源から得られる天然の要素、組換えDNA技術により作製される要素、化学的に合成されるポリペプチドもしくは他の分子、またはその天然の要素の機能的活性をもつ任意の誘導体でありうる。複数の生物学的変性剤が使用される場合には、その曝露は同時または逐次的でありうる。
【０１８７】
本発明は、抗原特異的細胞の中に濃縮されたT細胞でありうる、免疫エフェクター細胞を含む組成物を提供する。「濃縮された」とは、細胞集団が、最初の天然の細胞集団から、少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約500倍、およびいっそうより好ましくは少なくとも約5000倍またはより多く濃縮されていることを意味する。抗原特異的細胞を含む濃縮された細胞集団の割合は、実質的に、抗原特異的細胞の10 %未満から100 %までで変化しうる。細胞集団が少なくとも50 %、好ましくは少なくとも70 %、より好ましくは少なくとも80 %、およびいっそうより好ましくは少なくとも90 %の本発明のペプチドに特異的な抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む場合には、その時、その集団は、「実質的に純粋」であると言われる。抗原特異的であるパーセンテージは、例えば、そのエフェクター細胞集団(例えば、T細胞集団)が、本発明の抗原ペプチドを提示している抗原提示マトリックスにより攻撃される³H-チミジン取り込みアッセイ法により容易に測定されうる。
【０１８８】
本発明の組成物
本発明はまた、上に挙げられているペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原提示マトリックス、ベクター、細胞、抗体、およびそれらの断片、ならびに許容される固体または液体の担体のいずれかを含む組成物を提供する。その組成物が薬学的に使用される場合、それらは、診断的および治療的使用のために「薬学的に許容される担体」に結合される。これらの組成物はまた、本発明の診断的および免疫調節的方法のための薬剤の調製に使用されうる。
【０１８９】
本発明の方法
本発明は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、および宿主細胞(APCおよび教育された免疫エフェクター細胞を含む)、すなわち、免疫調節性薬剤を使用する診断的および免疫調節的方法を提供する。
【０１９０】
診断的方法
本発明は、本発明の改変ペプチドリガンドを使用する診断的方法を提供する。方法は、本発明の改変ペプチドリガンドに結合する抗原特異的CD4⁺またはCD8⁺のT細胞の存在を検出するために使用されうる。そのようなT細胞は、その合成ペプチドに対する天然の相当するものにも結合することが予想される。
【０１９１】
本発明の診断的方法は以下のことを含む：(1)本発明の改変ペプチドリガンドの有効性を予測するためのアッセイ法；(2)改変ペプチドリガンドおよび/または天然のそれに相当するものに特異的な免疫エフェクター細胞の前駆細胞頻度(すなわち、存在および数)を測定するためのアッセイ法；ならびに(3)一度でも本発明の免疫調節的方法において使用された、改変ペプチドリガンドの有効性を測定するためのアッセイ法。
【０１９２】
本発明の診断的方法は、一般的に、適する条件下において、改変ペプチドリガンドまたは天然のそれに相当するものと、CD4+またはCD8+T細胞のような免疫エフェクター細胞の表面上のTCRのような、免疫エフェクター分子との間に特異的な結合を生じさせるのに十分な時間の間行われる。「適する条件」および「十分な時間」とは、一般的に、特異的結合に適する条件および時間である。適する条件は、約4℃と約40℃との間、好ましくは約4℃と約37℃との間、緩衝液中においては、5と9との間のpH範囲内にある。様々な緩衝液は、当技術分野において知られており、本発明の診断的方法に使用されうり、限定されるものではないが、リン酸緩衝食塩水を含む。結合および応答のために十分な時間は、一般的に、試料の収束性抗原ペプチドリガンドへの曝露後、約1秒と約24時間の間である。
【０１９３】
いくつかの態様において、本発明は、改変ペプチドリガンドの有効性を予測するための診断的アッセイ法を提供する。これらの態様のいくつかにおいて、定義されたT細胞エピトープは、インビボでのワクチン試験の予測される有効性をあらかじめ測定するために腫瘍およびウイルス病原体を臨床的に特徴付けることに使用される。これは、刺激物質として、定義されたT細胞エピトープを用いる患者の末梢血単核細胞の簡単な増殖アッセイ法により達成されうる。応答を誘発する改変ペプチドリガンドは、その患者にとっての見込みのあるワクチン候補である。
【０１９４】
他の態様において、アッセイ法は、改変ペプチドリガンドおよび/または天然のそれに相当するものに特異的な休止(ナイーブ)免疫エフェクター細胞の、それゆえ活性化状態になる可能性をもつものの前駆細胞頻度(すなわち、存在および数)を測定するために提供される。これらの態様において、改変ペプチドリガンドに相当する天然のものをそれの表面上にもつ抗原提示細胞は、その天然のエピトープに特異的に結合する生物学的試料における免疫エフェクター細胞の存在を検出するために使用される。機能的アッセイ法は、その抗原特異的免疫エフェクター細胞を測定する(および定量する)ために使用される。実例的例として、PBMCが腫瘍をもつ対象から単離される。これらのPBMCの試料は、同じ対象からの腫瘍細胞と共に適する時間培養される。これらのPBMCの第二の試料は、適当なCAPでパルスされた代理APCと共に適する時間培養される。腫瘍細胞と代理APCの両方は、⁵¹Crを負荷される。腫瘍細胞および抗原でパルスされた代理APCからの⁵¹Cr放出量を比較することにより、腫瘍に対して特異的である免疫エフェクター細胞の前駆細胞頻度およびその改変ペプチドリガンドまたはそれらの対応する野生型抗原ペプチドに対して特異的である免疫エフェクター細胞の前駆細胞頻度を測定することができる。機能的アッセイ法は、限定されるものではないが、免疫エフェクター細胞増殖、サイトカイン産生、APCの特異的溶解を含む。
【０１９５】
他の態様において、本発明の改変ペプチドリガンドおよび/または天然のそれに相当するものへの免疫応答を調節することにおける、本発明の免疫調節的方法を含む免疫調節的方法の有効性は、本発明の診断的アッセイ法を用いて試験されうる。これらの診断的アッセイ法はまた、免疫治療的薬剤の有効性を評価するまたはモニターするために有用である。これらの態様のいくつかにおいて、その方法は、本発明の改変ペプチドリガンドへの曝露の結果として活性化状態またはアネルギーの状態になった、活性化されたCD4⁺またはCD8⁺のT細胞でありうる免疫エフェクター細胞の検出を可能にする。対象からの細胞を含む試料は、本発明の所与の改変ペプチドリガンドへの結合の結果として活性化状態またはアネルギーの状態になったCD4⁺またはCD8⁺のT細胞の存在について試験されうる。
【０１９６】
それらの意図される目的にとって有効なものとして本明細書に提供される薬剤は、本発明の免疫調節的方法で治療されうる疾患をもつ対象、またはそのような疾患にかかりやすいもしくは発生するリスクを負っている個体へ投与できる。薬剤がマウス、ラット、またはヒトの患者のような対象へ投与される場合、薬剤は、薬学的に許容される担体に添加され、対象へ全身にまたは局所的に投与される。治療量は、経験的に決定されうり、治療予定の病状または状態、治療予定の対象、ならびにその治療の効力および毒性によって変化するものである。
【０１９７】
本発明のペプチドまたは免疫エフェクター細胞の量は、それの予定される効果に部分的に依存して変化し、最終的には、医者または獣医者学の裁量にかかっている。考慮されるべき因子は、治療予定の状態、投与の経路、および製剤の性質、哺乳動物の体重、表面積、年齢、および一般的状態、ならびに投与されるその特定のペプチドを含む。本発明のペプチドの適する有効量は、一般的に、約0.0001 μmol/kg体重から約1000 μmol/kg体重までの範囲にある。全投与量は、1回の投与または複数回の投与、例えば、1日につき2回から6回までとして与えられうる。例えば、75 kgの哺乳動物(例えば、ヒト)に対する、投与量範囲は、約2.25 μmol/kg/日になり、典型的投与量は、ペプチド約100 μmolでありうる。別々の複数回の投与量が指示される場合には、治療は、典型的には、本発明のペプチドの25 μmolを1日につき4回までである。代替の管理的養生において、本発明のペプチドは、隔日にまたは週に1回もしくは2回与えることができる。本発明の免疫エフェクター細胞の適する有効量は、一般的に、投与あたり約10²細胞から約10⁹細胞までの範囲にある。細胞は一度投与され、続いて、疾患症状または腫瘍の大きさの縮小のような臨床的応答をモニターする。投与は、例えば、1ヶ月間を基礎として、必要に応じて繰り返されうる。当業者は、適切な管理的養生が医者または獣医者の裁量にかかるだろうことは理解しているものと思われる。
【０１９８】
インビボでの投与は、1回の投与量において、治療のコースを通じて連続的にまたは断続的に実施されうる。投与の最も効果のある手段および用量を決定する方法は、当業者によく知られており、治療に使用される組成物、治療の目的、治療予定の標的細胞、および治療予定の対象によって変化するものである。1回または複数回の投与は、治療している医者により選択される用量レベルおよびパターンで行われうる。適する投薬製剤およびその薬剤を投与する方法は、以下に見出すことができる。
【０１９９】
本発明の薬剤および組成物は、薬物の製造において、ならびに薬学的組成物中の活性成分のように通常の工程に従う投与によるヒトおよび他の動物の治療のために使用されうる。
【０２００】
より詳細には、本明細書で活性成分とも呼ばれる本発明の薬剤は、鼻、局所的(経皮的、エアゾール、頬、および舌下を含む)、非経口(皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む)、および肺を含むいずれの適する経路によっても治療のために投与されうる。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに治療予定の疾患または状態によって変化するものであることも理解されているものと思われる。
【０２０１】
V βレパートリーを決定するための方法
T細胞のVβ領域の配列を決定する様々な方法が、当技術分野において知られている。これらの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、細胞染色、およびフローサイトメトリーの改変型を使用する。そのような方法は、Lee, K-Hら、(1998) J. Immun. 161:4183-4194; Blattman, J. N.ら、(2000) J. Immun. 165:6081-6090; Ben-Nun, A.ら、(1991) PNAS 88:2466-2470; Henwood, J.ら、(1995) Human Immun. 42:301-306ならびにMcMahanおよびFink (2000) J. Immun. 165:6902-6907に記載される。
【０２０２】
癌治療および予防のためのワクチン
一つの態様において、本発明の免疫調節的方法は、癌治療のためのワクチンを含む。癌細胞は、免疫系により認識できる可能性がある多くの新しい抗原を含んでいる。エピトープが同定できる、敏速さがあれば、固形癌をもつ患者からTILを単離し、それらのMHC拘束性を決定し、反応性エピトープについての適切なライブラリーに対するこれらのCTLをアッセイすることにより、発症した個体のためにカスタムの抗癌ワクチンが作製されうる。これらのワクチンは、発症した個体のための治療、加えて再発(またはそれの家族性遺伝的素質を示す患者におけるその疾患の確立)に対する予防的治療の両方であると思われる。その癌に罹ったことがない個体への接種は、たとえ腫瘍抗原特異的CTL応答がまだ誘発されなかったとしても、予防的治療として極めて成功していると予想される。なぜなら、たいていの場合、高親和性ペプチドは免疫原性であると思われ、機能的T細胞レパートリーにおける穴は、存在したとしても、相対的にまれであることを示唆しているからである。Setteら、(1994) J. Immunol., 153:5586-5592。マウスにおいて、適当なエピトープでのワクチン接種は、確立された腫瘍を排除するだけでなく、別な方法で腫瘍細胞の致死量での接種後の腫瘍の再確立に対して有効である。Bystrynら、(1993)前記。
【０２０３】
ワクチンのアジュバントにおける最近の進歩により、免疫系に最大限の、強い衝撃を与えるようにペプチドを投与する効果的な手段が提供されている。Del-Giudice (1994) Experientia 50:1061-1066。これらのペプチドワクチンは、一般的に通常の治療に対して無応答性である転移性腫瘍の治療において大きな価値があるものと思われる。劣性発癌遺伝子のホモ接合の欠損から発生する腫瘍は、体液性(抗体)応答による排除を受けにくく、したがって細胞性のCTL応答を誘発することにより、より効果的に治療されるものと思われる。
【０２０４】
病原性生物体に起因する疾患のためのワクチン
本発明の改変ペプチドリガンドはまた、病原性生物体への免疫応答を誘導する(または増加する、または高める)ための方法において有用である。これらは、病原性ウイルス、細菌、および原生動物を含む。
【０２０５】
ウイルス感染は、免疫療法にとって理想的な候補である。ウイルス病原体への免疫学的応答が、AIDSを引き起こすHIVのようなレンチウイルスの場合のように、時々効果を有さない。自然突然変異の高い速度が、これらのウイルスを免疫系に対してつかまえにくくさせている。しかしながら、感染された細胞上に提示されるCTLエピトープの飽和している特性により、より効果的なワクチンの設計を可能にするであろう突然変異に対して主として不寛容である必須の遺伝子において異なる血清型間に共有される抗原が同定されるものと思われる。
【０２０６】
養子免疫療法
本発明の抗原特異的免疫エフェクター細胞の拡大された集団およびAPCは、養子免疫療法において、およびワクチンとしての使用を見出す。
【０２０７】
養子免疫療法は、一つの局面において、上記のように、ナイーブ免疫エフェクター細胞をAPCと共に培養することにより作製された教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の実質的に純粋な集団を対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、APCは樹状細胞である。
【０２０８】
一つの態様において、本明細書に記載される養子免疫療法は、自家性である。この場合、APCは、単一の対象から単離された親細胞を用いて作製される。拡大された集団はまた、その対象から単離されたT細胞を使用する。最後に、抗原特異的細胞の拡大された集団は同じ患者へ投与される。
【０２０９】
さらなる態様において、APCまたは免疫エフェクター細胞は、IL-2のような刺激性サイトカインまたは共刺激分子の有効量と共に投与される。
【０２１０】
以下の実施例は、例証することを意図されているが、本発明を限定するものではない。
【０２１１】
実施例
一連のアッセイ法は、天然のメラノーマ抗原gp100および改変ペプチドリガンドが正常な(健康な)供与体(指定されたHLA型の)から得られたT細胞を教育するよう行われた。教育されたT細胞は、その後、「教育している」改変ペプチドを示す標的細胞に加え、天然のペプチドを示す標的細胞の両方を認識および溶解するそれらの能力について評価された。
【０２１２】
その結果より、改変gp100ペプチドリガンドで教育されたT細胞は、その改変ペプチドを示す標的を溶解、および天然リガンドを示す標的を溶解することができたのに対して、天然gp100ペプチドリガンドで教育されたT細胞は、一般的に、その天然抗原を示す標的を溶解する能力において非効率であったことが示された。
【０２１３】
材料および方法
細胞系および試薬
TIL1520、TIL620-10、およびTIL1235は、M. ニシムラ(M. Nishimura)(NIH、外科部門)により豊富に供給された。このT細胞クローンは、10 %ヒトAB血清(シグマ(Sigma)、セントルイス、MO)、ペニシリン、ストレプトマイシン、および6000 IU/mlヒト組換え型IL-2(プロロイキン、カイロン(Chiron)、エメリービレ、CA)で追加されたAIM V培地(ギブコ(Gibco)、カールスバッド、CA)において維持された。A549およびT2細胞は、ATCCを通して得られ、それぞれ、DMEM/10 %FBSおよびRPMI1640/10 %FBS(JRHバイオサイエンス、レネクサ、TX))において維持された。
【０２１４】
ペプチドシーケンシング
ペプチドシーケンシングは、エドマン分解により行われた。
【０２１５】
ライブラリースクリーニング
スクリーニングは、通常の⁵¹Cr放出マイクロ細胞障害性アッセイ法に以下の改変を用いて、すべて同様に行われた。2 μl の放出されたペプチドはV底96ウェルプレートへ添加され、T2細胞は100 μl/ウェルの全容量において1000細胞/ウェルの密度で添加され、37℃/5 % CO₂で、60分間、インキュベートされた。100 μl RPMI1640/10 %ヒトAB血清中の1000T細胞が、その後、各ウェルへ添加され、プレートはインキュベーターへ4時間、戻された。上清は各ウェルから収集され(25 μl)、放出された⁵¹Crの量がヴァラッハトリルックスマイクロベータ(Wallach TriLux MicroBeta)プレートカウンター(ツールレウ(Turleu)、フィンランド)を用いて定量された。自発性⁵¹Cr放出はエフェクターT細胞の非存在下において測定され、全⁵¹Cr放出は0.1 %トリトンX-100で細胞を溶解することにより測定された。特異的溶解の割合は、以下の式に従って計算された：

【０２１６】
インビトロでの T 細胞教育の研究
正常な供与体の除去療法産物は、デーナ-ファーバーキャンサーリサーチインスティチュート(Dana-Farber Cancer Research Institute)(ボストン、MA)から得られた。PBMCは、フィコール(ナイコメッド(Nycomed)、オスロ、ノルウェー)での遠心分離により単離された。CD8⁺ T細胞は、製造会社の使用説明書に従い磁気ビーズ(ダイナル(Dynal)、オスロ、ノルウェー)を用いて単離された。自家性樹状細胞を発生させるために、単球がPBMCから単離され、前に記載されているように、GM-CSF(イミュネックス、シアトル、WA)およびIL-4(ペプロテック(PeproTech)、ロンドン、英国)で、6日間、処理された。T細胞/DC同時培養を確立する1日前に、そのDCは一晩、ペプチド(10 μg/ml)でパルスされ、続いて、前に単離されたCD8+ T細胞が10:1のT:DCで添加された。培養物は、ペプチドパルスされたDCで再刺激された。IL-2(50 IU/ml)は、8日目に導入され、必要とされる場合には3日〜4日間ごとに添加された。大量培養物は、5回目の再刺激の1週間後にアッセイされた。ペプチドパルスされたT2細胞標的は上記のように調製され、アデノウイルス感染された標的細胞は、CTLアッセイ法において使用される前に、指示されたMOIで48時間そのウイルスと共にインキュベートさせられた。すべての培養物は、指示されたE:Tで16時間、le+4 ⁵¹Cr標識化標的細胞を用いて、4連でアッセイされた。
【０２１７】
天然エピトープ特異的 CTL に特異的に反応する改変ペプチド
ペプチドのいくつかはその天然のエピトープとは異なるため、TIL1520とのそれの反応性が確認された。そのスクリーニングにおいて使用されるT細胞クローン(TIL1520)または関連性のないクローン(TIL1235)との⁵¹Cr放出アッセイ法におけるこれらのペプチドのいくつかの反応性。図1は、このアッセイ法の結果を示す。独立的に誘導されたgp100_209-217特異的TIL集団(TIL620-10)と反応する能力についてのその改変ペプチドの次のスクリーニングが行われた。このために、その改変ペプチドのサブセットがそれらの配列の多様性に関して選択され、⁵¹Cr放出アッセイ法においてTIL1520またはTIL620-10のいずれかとの反応性について試験された。この結果は図2に示され、そのペプチドがTIL620-10と等しく十分に反応することを示しており、遠い関連性のエピトープ模倣体でさえもこのアッセイ法においてその天然のエピトープと機能的に類似していることを意味している。
【０２１８】
強力な免疫原である改変ペプチドリガンド
ヒトメラノーマ抗原gp100の改変ペプチドリガンドを特徴付けるために、正常な供与体HLA-A2⁺ T細胞をインビトロで教育するそれらの相対的能力が試験された。これらのインビトロでのT細胞教育の研究は、天然のエピトープを提示する標的またはペプチド自身を提示する標的を溶解するようにT細胞を感作および拡大する改変ペプチドリガンドの能力を試験するように設計された。
【０２１９】
改変ペプチドはその天然のエピトープを認識するT細胞を生じさせる。正常な供与体T細胞は、改変ペプチドまたは野生型gp100_209-217ペプチドでパルスされた自家性樹状細胞によりインビトロで教育された。5週間の刺激後、大量のT細胞培養物は、その天然のペプチドでパルスされた⁵¹Cr標識化T2細胞を溶解するそれらの能力について試験された。すべてのアッセイ法について、全ペプチド濃度は一定に保たれ、ペプチドの組み合わせは、各個々のペプチドが別々に使用される場合と比較して、各個々のペプチドを2/3少なく含んだ。すべてのデータ点は4連の平均を表し、ペプチドを含まない等価量のDMSOでパルスされたT2細胞を用いて測定されたバックグラウンドの溶解は差し引かれた。
【０２２０】
結果より、天然エピトープは、このアッセイ法において反応性T細胞を誘発するのが相対的に乏しいが、改変ペプチドリガンドは、その野生型ペプチドに対して応答が不十分であるまたは少しもない個体においてさえ応答を誘発できることが示された。図3を参照されたい。これらの研究が合計20の正常な供与体を含むように拡張された場合、留意されるべきことだが、どの一つの改変ペプチドリガンドも各供与体において免疫原性ではないのに、差次的応答があり、おそらく異なる供与体依存性前駆細胞の頻度で、各改変ペプチドリガンドに優先的に刺激されたT細胞が異なる集団を表したことを示唆した。PCR分析による、インビトロで教育された正常な供与体T細胞の大量培養物内のT細胞受容体Vβ使用量の分析がこの発見を確認した。これはさらに、そのペプチドがもう一つのものと組み合わせて使用される場合に観察される、集団被覆度における顕著な増加により裏付けられた。
【０２２１】
自然にプロセシングおよび提示された天然エピトープに対して鋭敏な特異性を示す改変ペプチドに教育された T 細胞
改変ペプチド配列が天然のエピトープとは異なる場合において、これらのペプチドで教育されたT細胞の特異性が測定された。このために、インビトロで教育されたT細胞がHLA-A2^-およびgp100^-の両方であるヒト肺腫瘍細胞系(A549)に対する反応性について試験された。図4を参照されたい。
【０２２２】
HLA-A2 特異的様式において野生型 gp100 を発現している標的を溶解する改変ペプチドで教育された正常な供与体 T 細胞
正常な供与体T細胞は、改変ペプチドまたは野生型gp100_209-217ペプチドでパルスされた自家性樹状細胞によりインビトロで教育された。5週間の刺激後、大量のT細胞培養物は、HLA-A2および/またはgp100野生型タンパク質を発現しているアデノウイルスで感染された肺癌細胞系A549を溶解するそれらの能力について試験された。細胞は、25のMOIで48時間ウイルスに感染させられ、⁵¹Crで標識された。インビトロで教育された大量のT細胞培養物は、le+4標的を用いて、75:1のE:Tで添加された。パーセント特異的溶解は上記のように計算された。
【０２２３】
その細胞系が組換えアデノウイルス感染によりHLA-A2⁺またはgp100⁺へ変えられた場合、その改変ペプチドで教育された正常供与体T細胞はまだそれらを溶解しなかった。しかしながら、その細胞系がHLA-A2およびgp100の両方を発現するように二重に感染した場合、これらの実験において試験されたいずれの改変ペプチドで教育されたT細胞もその細胞を溶解した。これらのデータは、改変ペプチドが機能的に区別がつかないHLA限定性抗原特異的応答を生じることができ、天然抗原から自然にプロセシングおよび提示されたペプチドが腫瘍細胞にこれらのエフェクターによる溶解に対する感受性を与えることができることを実証している。
【０２２４】
前記の発明は、理解の明快さを目的として、例証および実施例を通してかなり詳細に記載されてきたが、ある特定の変化および改変が実施されるであろうことは当業者にとって明らかであるものと思われる。それゆえ、記載および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、発明の範囲は添付された特許請求の範囲により描写される。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】⁵¹Cr放出アッセイ法における改変ペプチドの反応性を示す。
【図２】さらなる⁵¹Cr放出アッセイ法においてスクリーニングされた場合の図1で同定されたペプチドの結果を示す。
【図３】天然リガンドは反応性T細胞を誘発する能力に相対的に乏しいが、その改変ペプチドは反応性T細胞を誘発したことを示す。
【図４】本発明の改変ペプチドで教育されたT細胞の特異性を測定するアッセイ法の結果を示す。
【０２２６】
すべての図面において、「SP」は選択された改変ペプチドを示し、例えば、SP1は改変ペプチド第1番である。

Claims (29)

1. 対象への投与のための改変ペプチド種を選択するための方法であり、対象が天然のリガンドを提示し、対象にとって天然リガンドに対する免疫応答の活性化が望ましい、以下の段階を含む方法：
   a. 天然リガンドへの免疫応答を誘発可能な複数の改変ペプチド種を同定する段階；
   b. 各改変ペプチドが別々のT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞の集団を活性化する、少なくとも2つの改変ペプチド種を選択する段階。
2. 選択された改変ペプチド種を対象へ投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
3. 所定のHLA型を有する対象の集団のメンバーへの投与のための改変ペプチド種を選択するための方法であり、集団が天然のリガンドを提示し、集団にとって天然リガンドに対する免疫応答の活性化が望ましい、以下の段階を含む方法：
   a. 天然リガンドへの免疫応答を誘発可能な複数の改変ペプチド種を同定する段階；および
   b. 2つまたはより多くの改変ペプチド種を選択する段階であり、各改変ペプチド種が集団の代表的な試料に別々のT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞を活性化する段階。
4. 選択された改変ペプチド種を前記メンバーへ投与する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
5. HLA型がHLA-A2である、請求項3記載の方法。
6. 少なくとも2つから6つまでの異なる改変ペプチド種を含む、請求項1または3記載の方法。
7. 少なくとも3つの異なる改変ペプチド種を含む、請求項1または3記載の方法。
8. 少なくとも1つの改変ペプチド種が天然のヒトのリガンドに自然に隣接している1個または複数個のアミノ酸に共有結合的に連結されている、請求項1または3記載の方法。
9. 天然のリガンドが哺乳動物の腫瘍エピトープである、請求項1または3記載の方法。
10. 天然のリガンドがヒトのウイルスの抗原である、請求項1または3記載の方法。
11. ヒトへの投与に適した薬学的に許容される担体における選択された改変ペプチドを製剤化する段階をさらに含む、請求項1または3記載の方法。
12. 単一の天然のリガンドに方向づけられる複数のペプチドリガンド種を含む組成物であり、少なくとも2つの改変ペプチド種が互いに異なるT細胞クローンを活性化し、各活性化されたT細胞クローンのT細胞受容体Vβの組換えが異なっている組成物。
13. 2つまたはより多くの改変ペプチド種を含む組成物であり、各該2つまたはより多くの種が同じ天然のリガンドに対して細胞障害性Tリンパ球(CTL)の異なる亜集団を活性化する能力を特徴とする組成物。
14. 少なくとも2つから6つまでの異なるペプチド種を含む、請求項12または13記載の組成物。
15. 少なくとも3つの異なるペプチド種を含む、請求項12または13記載の組成物。
16. 少なくとも1つのペプチド種が天然のヒトのリガンドに自然に隣接している1個または複数個のアミノ酸に共有結合的に連結されている、請求項12または13記載の組成物。
17. 改変ペプチド種が対象の選択された集団の1メンバーにおいて異なる亜集団を活性化する、請求項13記載の組成物。
18. 改変ペプチド種が対象の集団の2メンバーまたはより多くのメンバーにおいて異なる亜集団を活性化する、請求項13記載の組成物。
19. 天然のリガンドが哺乳動物の腫瘍エピトープである、請求項12または13記載の組成物。
20. 天然のリガンドがヒトのウイルスの抗原である、請求項12または13記載の組成物。
21. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項12または13記載の組成物。
22. 以下のものを含むキット：
    a. 単一の天然のリガンドに方向づけられる複数のペプチド種であり、
    i. 第一のペプチド種が第一のT細胞を活性化する、
    ii. 第二のペプチド種が第二のT細胞を活性化する、
    および該第一T細胞のT細胞受容体Vβの組換えが該第二T細胞のT細胞受容体Vβの組換えと異なる、複数のペプチド種；ならびに
    b. 各該ペプチドの同時投与のための使用説明書。
23. 選択されたペプチド種が組み合わせてパッケージングされている、請求項22記載のキット。
24. 複数のペプチドリガンド種の投与に対して陽性の治療的応答を示す対象を同定するための使用説明書をさらに含む、請求項22記載のキット。
25. 以下の段階を含む方法：
    a. 同じ天然のリガンドに対して免疫応答を誘発する能力を特徴とする複数の改変ペプチド種を同定する段階；
    b. 複数の試験対象において各同定された改変ペプチド種により活性化されたT細胞集団のT細胞受容体Vβの組換え特性を決定する段階；および
    c. 各改変ペプチド種が試験対象の大多数において別々のT細胞受容体Vβの組換えを有するT細胞集団を活性化する少なくとも2つまたはより多くの改変ペプチド種を選択する段階。
26. 少なくとも1つの選択された改変ペプチド種が天然の抗原以上のものである、請求項25記載の方法。
27. 選択された改変ペプチド種を天然の抗原を有する対象へ投与する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
28. 選択された改変ペプチド種を対象への投与に適した形にパッケージングする段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
29. 選択された改変ペプチド種が共にパッケージングされる、請求項26記載の方法。

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