JP2005501516A

JP2005501516A - Protein, polynucleotide encoding the protein, and methods of use thereof

Info

Publication number: JP2005501516A
Application number: JP2002568741A
Authority: JP
Inventors: ムラリダラパディガル，; ジョンピー．，ザセカンドアルソブルック，; スティーブンディー．コールマン，; キンバリーエイ．スパイテク，; フェレンクボルドッグ，; コリンエイ．エム．ヴァーネット，; リリ，; サレシュシェノイ，; ステイシーキャスマン，; シャオジアグオ，; シュロミットエディンガー，; ジョンマックドウガル，; ウリエルエム．マルヤンカー，; ミーラパッツラジャン，; リチャードエイ．シムケッツ，; キャロルペナ，; ヴェリザートチャーネヴ，; ブライアンディー．ザーフーセン，; イサベルミレット，; チャールズイー．ミラー，
Original assignee: キュラジェンコーポレイション
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2005-01-20
Also published as: EP1370659A2; CA2434690A1

Abstract

新規のポリペプチドをコードする核酸配列が、本明細書中で開示される。これらの核酸配列によりコードされるポリペプチドおよびこのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに上記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の誘導体、改変体、変異体、またはフラグメントもまた開示される。本発明はさらに、これらの新規のヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つに関与する障害を診断、処置、および予防するための治療方法、診断方法、および研究方法を開示する。本発明はまた、新規のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、抗体ならびにこのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための組換え方法、およびこれらを使用するための方法に関する。Nucleic acid sequences encoding novel polypeptides are disclosed herein. Also disclosed are polypeptides encoded by these nucleic acid sequences and antibodies that immunospecifically bind to the polypeptides, as well as derivatives, variants, variants, or fragments of the polypeptides, polynucleotides, or antibodies. The present invention further discloses therapeutic, diagnostic, and research methods for diagnosing, treating, and preventing disorders involving any one of these novel human nucleic acids and proteins. The present invention also includes vectors containing nucleic acid sequences encoding novel polypeptides, host cells containing such vectors, antibodies and recombinant methods for producing the polypeptides and polynucleotides, and uses thereof. Concerning the method.

Description

【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびにベクター、宿主細胞、抗体ならびにこのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための組換え方法、およびこれらを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、以下のタンパク質ファミリーの新たなメンバーであるタンパク質をコードする核酸に一部基づく：フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）、セクレチンレセプター前駆体、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ１、プロスタシン（ｐｒｏｓｔａｓｉｎ）、リソソーム酸リパーゼ（ｌｙｓｏｓｏｍａｌａｃｉｄｌｉｐａｓｅ）、トリプターゼ４、Ｐ４５０、ミツグミン（ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ）２９、マイクロモル濃度の（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ１、Ｐ２Ｘ２Ｃ、ＤＩＡＢＬＯ、ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質、Ｂ７−Ｈ２Ｂ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、リンパ球抗原前駆体、ペプシノゲンＣ、およびＡＬＲ。より詳細には、本発明は、新規のポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、組換え方法に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、新規のポリペプチドをコードする核酸配列の発見に一部は基づく。この新規な核酸およびポリペプチドを、本明細書において、ＮＯＶＸ、またはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３、ＮＯＶ４、ＮＯＶ５、ＮＯＶ６、ＮＯＶ７、ＮＯＶ８、ＮＯＶ９、ＮＯＶ１０、ＮＯＶ１１、ＮＯＶ１２、ＮＯＶ１３、ＮＯＶ１４、ＮＯＶ１５、ＮＯＶ１６、ＮＯＶ１７、およびＮＯＶ１８の核酸およびポリペプチドと称する。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、相同体（ホモログ）、類似体（アナログ）、およびフラグメントを、本明細書において以降は、総称して「ＮＯＶＸ」核酸配列または「ＮＯＶＸ」ポリペプチド配列と称する。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供し、これは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする、単離された核酸を包含する。例えば、この核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし得る。この核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のいずれかの核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの相補体）もまた、本発明に含まれる。実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００６】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００７】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１以上の容器に、この薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を含む。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法を包含し、この方法は、ＮＯＶＸ核酸を含む細胞を、このＤＮＡによってコードされるＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することによる。所望の場合、次いで、このＮＯＶＸポリペプチドを回収し得る。
【０００９】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を包含する。この方法において、サンプルを、このポリペプチドに選択的に結合する化合物と、このポリペプチドとこの化合物との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる。この複合体は、存在するならば、検出され、それによって、このサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドを同定する。
【００１０】
本発明はまた、ＮＯＶＸの発現に基づいて特定の細胞型または組織型を同定するための方法を包含する。
【００１１】
サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた本発明に包含され、この方法は、このサンプルに、ＮＯＶＸ核酸プローブまたはプライマーを接触させ、そしてこの核酸プローブまたはプライマーが、このサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子に結合したか否かを検出することによる。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供し、この方法は、このＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルに、このＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物を、このポリペプチドの活性を調節するに十分な量で接触させることによる。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖質、脂質または他の有機分子（炭素含有）または無機分子）であり得る。
【００１３】
以下を含む障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における治療剤の使用もまた、本発明の範囲内にある：例えば、外傷、再生（インビトロおよびインビボ）、ウィルス／細菌／寄生生物感染フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、光線性角化症、挫瘡、発毛障害、脱毛症（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、内分泌障害、結合組織障害（例えば、重症新生児マルファン症候群、優性水晶体転位、家族制上行大動脈動脈瘤、マルファン症候群の孤立性骨格機構（ｉｓｏｌａｔｅｄｓｋｅｌｅｔａｌｆｅａｔｕｒｅｓ）、Ｓｈｐｒｉｎｔｚｅｎ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ症候群、遺伝性皮膚症、拘縮クモ指症、炎症性障害（例えば、変形性関節症および慢性関節リウマチ）、炎症性腸疾患、クローン病；免疫学的障害、ＡＩＤＳ；癌（肺癌、結腸癌、新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌、白血病または膵臓癌が挙げられるが、これらに限定されない）；血液障害；喘息；乾癬；血管障害、高血圧、皮膚障害、アルポート症候群を含む腎障害、免疫学的障害、組織損傷、線維症障害、骨疾患、ＶＩ型エーレルス−ダンロー症候群、ＶＩＩ型エーレルス−ダンロー症候群、ＩＶ型エーレルス−ダンロー症候群、Ｓ−関連（Ｓ−ｌｉｎｋｅｄ）弛緩性皮膚およびＶ型エーレルス−ダンロー症候群、骨形成不全症、神経学的疾患、脳および／または脳脊髄炎のような自己免疫障害、神経変性障害、免疫障害、造血障害、筋肉障害、炎症および創傷治癒、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）、疼痛、急性心不全、低血圧、高血圧、残尿、骨粗鬆症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、良性前立腺肥大、先天性多発性関節拘縮症、骨形成不全、円錐角膜、側弯症、十二指腸閉鎖症，食道閉鎖症、腸異常回転、膵炎、肥満、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、神経保護、受精能重症筋無力症、糖尿病、肥満、増殖障害および生殖障害、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫欠損、対宿主性移植片、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、子宮内膜症、口内乾燥症、潰瘍、肝硬変、移植、憩室性疾患、ヒルシュスプルング病、虫垂炎、関節炎、強直性脊椎炎、腱炎、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎症、エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、食欲不振、過食症、精神異常（ｐｓｙｃｈｏｔｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（不安を含む）、精神分裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常（例えば、ハンティングトン病）および／または他の病状および障害など。
【００１４】
治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ特異的抗体、あるいはそれらの生物学的に活性な誘導体またはフラグメントであり得る。
【００１５】
例えば、本発明の組成物は、上に開示された疾患および障害ならびに／または他の病状および障害などに罹患した患者の処置のために有効性を有する。このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶＸは、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、上に開示された疾患および障害ならびに／または他の病状および障害などに罹患した患者の処置に対する効力を有する。
【００１６】
本発明はさらに、例えば、上に開示された疾患および障害ならびに／または他の病状および障害などを含む障害または症候群のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を包含する。この方法は、試験化合物をＮＯＶＸポリペプチドと接触させる工程、およびこの試験化合物がこのＮＯＶＸポリペプチドに結合するか否かを決定する工程を包含する。ＮＯＶＸポリペプチドへの試験化合物の結合は、この試験化合物が、前述の障害または症候群に対する活性のモジュレーターあるいは前述の障害または症候群に対する潜在性または素因のモジュレーターであることを示す。
【００１７】
また、本発明の範囲内には、前述の障害または症候群についての危険性の増大した試験動物に対して、試験化合物を投与することによって、以下を含む障害もしくは症候群の活性のモジュレーター、または以下を含む障害もしくは症候群の潜伏もしくは素因のモジュレーターについてスクリーニングする方法が含まれる：例えば、上に開示された疾患および障害ならびに／または他の病状および障害など。試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性を、この試験動物において測定し、同様に、コントロール動物（これは、ＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現し、かつ障害または症候群についての危険性を増大していない）におけるこのタンパク質の発現または活性を測定する。次いで、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した、試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物が、障害または症候群の潜伏のモジュレーターであることを示す。
【００１８】
なお別の局面では、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸またはその両方のレベルの変化に関連した疾患の存在または素因を決定するための方法を含む。この方法は、この被験体由来の試験サンプル中におけるＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、およびこの試験サンプル中におけるこのポリペプチドの量をコントロールサンプル中に存在するＮＯＶＸポリペプチドの量と比較する工程、を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、以下が挙げられる：上に開示された疾患および障害ならびに／または他の病状および障害など。また、本発明の新規なポリペプチドの発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングするための方法および癌の病期を決定するための方法において使用され得る。
【００１９】
さらなる局面では、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するに十分な量において、被験体（例えば、ヒト被験体）にＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を投与することによって、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態では、この障害としては、以下が挙げられる：例えば、上に開示された疾患および障害ならびに／または他の病状および障害など。
【００２０】
なお別の局面では、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流エフェクターを同定する方法において使用され得る。これらの技術としては、ツーハイブリッド系、アフィニティ精製、抗体または他の特異的な相互作用分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法における使用のための新規なＮＯＶＸ物質に免疫特異的に結合する抗体の生成に有用である。これらのＮＯＶＸ抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されるＮＯＶＸタンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として使用され得る。これらのＮＯＶＸタンパク質は、種々のヒト障害の機能的な分析のためのアッセイ系において使用され得、これが、疾患の病理の理解において、そして種々の障害のための新しい薬物標的の開発において助けとなる。
【００２２】
本明細書で同定されたＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸタンパク質は、以下に示すような種々の病態および障害（ただしこれに限定されない）に関連する潜在的な治療適用において有用であり得る。本発明の潜在的な治療適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療標的、診断標的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予測マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、検索ツール、本明細書に規定される組織および細胞（ただしこれに限定されない）からなる全ての組織および細胞型のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【００２３】
他に規定されない限り、本明細書中において使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書中で引用されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が制御する。さらに、物質、方法および実施例は例示のみであり、限定されることは意図されない。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。新規な核酸配列およびそれらがコードするポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、集合的に「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表Ａは、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドのまとめを提供する。
【００２５】
【表１】

ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の適用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドは、先に記載されたタンパク質に対するドメインおよび配列の関連性の存在に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００２６】
ＮＯＶ１は、フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）ファミリーのタンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１核酸、ＮＯＶ１ポリペプチド、ＮＯＶ１抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：軟骨および靱帯への損傷の修復；関節修復、他の疾患、障害および状態などへの治療適用。
【００２７】
フィブロモジュリンは、Ｉ型コラーゲン原線維およびＩＩ型コラーゲン原線維と相互作用する能力およびインビトロでの原線維発生を阻害する能力によって、細胞外マトリクスの構築に関与することが示唆されている。
【００２８】
ＮＯＶ２は、セクレチンレセプター前駆体様ファミリーのタンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ２の核酸、ポリペプチド、抗体、および関連化合物は、例えば、以下に関与する治療適用および診断適用において有用である：発達障害、ＭＨＣＩＩ疾患およびＭＨＣＩＩＩ疾患（免疫疾患）、味覚検出能力障害および嗅覚検出能力障害、バーキットリンパ腫、皮質神経性疾患、シグナル伝達経路障害、網膜疾患（光受容に関する網膜疾患を含む）、細胞増殖速度障害；細胞形状障害、摂食障害；摂食の調節；過食に起因する潜在的肥満；飢餓に起因する潜在的障害（食欲（ａｐｅｔｉｔｅ）の欠乏）、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）、疼痛、癌（新生物；腺腫；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌が挙げられるが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、残尿、骨粗鬆症、クローン病；多発性硬化症；およびオールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病性疾患および神経学的疾患（不安、精神分裂病、躁病性鬱病、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）低リン酸血症のくる病、常染色体優性の（２）脳梁先端の（ａｃｒｏｃａｌｌｏｓａｌ）症候群およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）を含む）ならびに／または、他の病態および障害などの処置。
【００２９】
セクレチンは、消化管ホルモンの歴史において独自の地位を占有している。なぜなら、セクレチンは、ＢａｙｌｉｓｓおよびＳｔａｒｌｉｎｇ（１９０２）によって、十二指腸の粘膜において最初に発見されたからである。この２７アミノ酸ペプチドが、膵臓による重炭酸塩、酵素、およびカリウムイオンの分泌を刺激する。
【００３０】
ＮＯＶ３は、Ｂ７−Ｈ２様タンパク質に相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ３の核酸およびポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：脳障害（てんかんを含む）摂食障害、精神分裂病、ＡＤＤ、および癌；心臓病；炎症および自己免疫障害（クローン病を含む）、ＩＢＤ、アレルギー、慢性関節リウマチおよび変形性関節症、炎症性皮膚障害、アレルギー、血液障害；乾癬結腸癌、白血病、ＡＩＤＳ；視床障害；代謝障害（糖尿病および肥満を含む）；肺疾患（例えば、喘息、気腫、嚢胞性線維症および癌）；膵臓障害（膵臓機能不全および膵臓癌を含む）；および前立腺障害（前立腺癌を含む）、ならびに他の疾患、障害、および状態。
【００３１】
Ｂ７ファミリーリガンドとそれらのレセプターとの間の同時刺激の相互作用は、Ｔ細胞の増殖、分化および死において重要な役割を果たす。特異的抗体またはその天然のリガンド（Ｂ７−１およびＢ７−２）のいずれかによる、Ｔ細胞の同時刺激物質ＣＤ２８との関与は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の抗原特異的増殖を増加させ、サイトカインの産生を増強し、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の成熟を誘導し、そしてＴ細胞の生存を促進する。
【００３２】
ＮＯＶ４は、Ｂ７−Ｈ１様タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ４の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：脳障害（てんかんを含む）、摂食障害、精神分裂病、ＡＤＤ、および癌；心臓病；炎症および自己免疫障害（クローン病を含む）、ＩＢＤ、アレルギー、慢性関節リウマチおよび変形性関節症、炎症性皮膚障害、血液障害；乾癬結腸癌、白血病、ＡＩＤＳ；視床障害；代謝障害（糖尿病および肥満を含む）；肺疾患（例えば、喘息、気腫、嚢胞性線維症および癌）；膵臓障害（膵臓機能不全および癌を含む）；および前立腺障害（前立腺癌を含む）ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００３３】
いくつかの最近の研究は、Ｂ７ＲＰ−１（Ｂ７関連タンパク質−１）、Ｂ７−１、およびＢ７−２のようなＢ７ファミリーメンバーの、抗原レセプター（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）およびＩＣＯＳ（誘導性同時刺激分子（ＩｎｄｕｃｉｂｌｅＣｏ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ））との同時刺激相互作用の重要性を立証している。これらのタンパク質相互作用は、正常Ｔ細胞の活性化および増殖、Ｂ細胞刺激および抗体産生、免疫グロブリンクラススイッチ、インターロイキン産生、および胚中心形成に重要であることが示されている。
【００３４】
ＮＯＶ５は、プロスタシン（ｐｒｏｓｔａｓｉｎ）タンパク質ファミリーに対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ５の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室管（Ａ−Ｖ）欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００３５】
ヒト精液は、種々のタンパク質分解性酵素（前立腺特異抗原（ＯＭＩＭ番号１７６８２０）およびアクロシン（ＯＭＩＭ番号１０２４８０）を含む）を含む。これらの酵素は、射精後のタンパク質加水分解および精液の凝固および液化に関与しており（Ｙｕら（１９９５））、最初にＹｕら（１９９４）によって精液から単離された４０−ｋＤのタンパク質の一部のアミノ酸配列が得られた。セリンプロテアーゼ−８（遺伝子記号＝ＰＲＳＳ８）と名付けられたこのタンパク質は、命名者等にプロスタシン（ｐｒｏｓｔａｓｉｎ）と呼ばれた。その前駆体プロプロスタシン（ｐｒｏｐｒｏｓｔａｓｉｎ）は、残基１２と残基１３との間で切断されて、１２アミノ酸の軽鎖および２９９アミノ酸の重鎖を生じ、これらは、ジスルフィド結合を介して結合する。予測されるアミノ酸配列は、ヒトアクロシン、血清カリクレイン（ＯＭＩＭ番号２２９０００）、およびヘプシン（ｈｅｐｓｉｎ）（ＯＭＩＭ番号１４２４４０）に対して３４％と４２％との間で同一である。
【００３６】
ＮＯＶ６は、リソソーム酸リパーゼファミリーのタンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ６の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、ウォルマン病およびコレステリルエステル貯蔵病に関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３７】
リソソーム酸リパーゼＡ（ＬＩＰＡ）（おそらく対立遺伝子のウォルマン病およびコレステロールエステル貯蔵病において欠損している酵素（ＯＭＩＭ番号２７８０００））は、第１０番染色体上に位置する。リパーゼＡおよびリパーゼＢの明確な反応速度論的特性および物理学的特性は、Ｗａｒｎｅｒら（１９８０）によって定義された。彼らは、ＬＩＰＢについての天然の基質が未知であること、そしてＬＩＰＢがリソソームの加水分解酵素であることは明らかではないことを述べた。ＬＩＰＡは、コレステロールを放出することにより、細胞代謝において重要な役割を果たし得る。遊離したコレステロールは、さらなるコレステロールの合成を抑制し、細胞内のコレステロールのエステル化を刺激する。
【００３８】
ＮＯＶ７は、トリプターゼ４に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ７の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室管（Ａ−Ｖ）欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、移植、受精能、子宮内膜症、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００３９】
ヒトトリプターゼは、構造的に独特で、かつマスト細胞に特異的なトリプシン様セリンプロテアーゼである。最近の生物学的研究および免疫学的研究は、多数のアレルギー状態および炎症状態（鼻炎、結膜炎、そして最も顕著には喘息が挙げられる）の病態における媒介物としての、トリプターゼに関連する。増大するデータの主部はさらに、特定の胃腸障害、皮膚障害、および心血管障害などにもトリプターゼを関連付ける。しかし、強力で選択的なトリプターゼインヒビターの最近の有効性は、重要な治療標的としてもこのプロテアーゼの検証を促進している。
【００４０】
ＮＯＶ８は、Ｐ４５０ファミリーのタンパク質に対して相同性である。本発明に従うＮＯＶ８の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、特定の病態および障害の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である。なぜなら、本発明のＮＯＶ８タンパク質は、多くの組織において遍在的に発現されているからである。
【００４１】
このＰ４５０遺伝子スーパーファミリーは、生物学的に多様なオキシダーゼ酵素のクラスであり；このクラスのメンバーは、生物全てにおいて見出される。Ｐ４５０タンパク質は、ヒトにおいて臨床的および毒物学的に重要であり；それらは、薬物および生体異物化合物の代謝において、ならびにコレステロール、ステロイド、および他の脂質の合成において重要な酵素である。いくつかのＰ４５０遺伝子の誘導はまた、いくつかの型の癌に対する危険因子であり得る。この機能の多様性は、ヌクレオチド配列およびタンパク質配列の多様性において反映され；現在、記載される、１００を越えるヒトＰ４５０形態が存在する。多くのシトクロムＰ４５０遺伝子の対立遺伝子形態は、量的に異なる薬物代謝速度を引き起こすと同定されており、従って、安全かつ効果的なヒト薬学的治療の開発を検討することは重要である。例えば、Ｅ．Ｔａｎａｋａ，ＪＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２４：３２３−３２９，１９９９での総説を参照のこと。
【００４２】
ＮＯＶ９は、ミツグミン（ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ）２９タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ９の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：ヴィスコット−オールドリッチ症候群、オールドリッチ症候群、湿疹−血小板減少免疫不全症候群、血小板減少症、夜盲症、筋萎縮性側索硬化症、バッテン病、セロイド脂褐素症、レット症候群、ピック病（葉性萎縮症（ｌｏｂａｒａｔｒｏｐｈｙ））、心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室管（Ａ−Ｖ）欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００４３】
ミツグミン２９は、骨格筋細胞および腎尿細管細胞における特定化した小胞体系形成に関与する。その細胞下分布およびタンパク質構造は、ミツグミン２９が、Ｔ−尿細管と接合部のＳＲ膜との間の情報伝達に関与していることを示唆する。
【００４４】
ＮＯＶ１０は、マイクロモルのカルシウムに活性化される中性プロテアーゼ１ファミリーのタンパク質のメンバーに対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１０の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、高カルシウム血症、潰瘍、子宮内膜症、受精能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全、移植、対宿主性移植片病、乾癬、光線性角化症、結節硬化症、挫瘡、発毛／脱毛症、脱毛症（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、内分泌障害、血友病、リンパ水腫、ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００４５】
本明細書中に記載される、予想される配列は、カルパインプロテアーゼファミリーに属する。カルパインまたはカルシウム活性化中性プロテアーゼは、非リソソームの細胞内システインプロテアーゼ（Ｒｉｃｈａｒｄら）である。カルパインは、カルシウムによって調節される、多くの重要な細胞性機能に関連する細胞内プロテアーゼである。
【００４６】
ＮＯＶ１１は、Ｐ２Ｘ２Ｃ様タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１１の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、疼痛に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である。なぜなら、感覚ニューロンのＰ２Ｘレセプターの活性化は、インビボで疼痛モデル（ラットの後ろ足および膝関節の調製物を含む）ならびに炎症性モデルにおいて、立証されている。ＣＮＳにおけるＰ２Ｘ４および／またはＰ２Ｘ６レセプターはまた、疼痛経路に関与していると思われる。感覚神経上の非侵害受容性のＰ２レセプターは、迷走神経の求心性神経線維および遠心性神経線維を含む、反射活性を起こす心臓および肺の筋肉内および感覚神経終末に存在する（ＢｒＪＡｎａｅｓｔｈ２０００Ａｐｒ；８４（４）：４７６−８８）。本発明の組成物はまた、糖尿病、肥満、Ｘ症候群、ならびに他の疾患、障害、および状態などに罹患している患者の処置に効力を有し得る。
【００４７】
ＮＯＶ１２は、ＤＩＡＢＬＯ様タンパク質に関する。従って、本発明に従うＮＯＶ１２の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：癌、外傷、細菌感染およびウイルス感染、再生（インビトロおよびインビボで）、受精能、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、結節硬化症、内分泌障害、アルツハイマー病、発作、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００４８】
このＤＩＡＢＬＯタンパク質（低いｐＩを有するＩＡＰ結合タンパク質を指示する）は、カスパーゼ（１）に対するＩＡＰ（アポトーシスタンパク質のインヒビター）の阻害効果を排除することにより、アポトーシスにおける重要な機能を果たす。このタンパク質はまた、第２のミトコンドリア由来のカスパーゼの活性化因子について、Ｓｍａｃとして公知である。ＤＩＡＢＬＯ／Ｓｍａｃは、通常、ミトコンドリアのタンパク質であるが、細胞がアポトーシスを起こす場合、サイトゾル中に放出される。ミトコンドリアの、そのシグナルペプチドの取り込みおよび切断は、ＤＩＡＢＬＯ／Ｓｍａｃがそのアポトーシス活性を得るために必要とされる。さらに、ＤＩＡＢＬＯ／Ｓｍａｃの過剰発現は、アポトーシス刺激（２）に対する細胞の感受性を増大させることが示されている。
【００４９】
ＮＯＶ１３は、ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１３の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室性（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、受精能、子宮内膜症、口内乾燥症、肝硬変、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全、対宿主性移植片病、リンパ水腫、血友病、凝固能亢進、アルツハイマー病、発作、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、全身性エリテマトーデス、喘息、気腫、強皮症、ＡＲＤＳ、乾癬、光線性角化症、挫瘡、発毛／脱毛症、脱毛症（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、内分泌障害、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、レッシュ−ナイハン症候群ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００５０】
ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、マウスおよびヒトの間で、種を越えて高度に保存されている。このタンパク質は、膜に結合すると予測される。主要配列における高度な保存は、重要な生物学的機能を有するが、現在のところ未知であることを示す。このＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質はまた、植物の接着分子と相同性を示し、このことは、ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質が、細胞相互作用および細胞遊走に関与する細胞接着分子であるようであることを示唆する。
【００５１】
ＮＯＶ１４は、Ｂ７−Ｈ２Ｂタンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１４の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：脳障害（てんかん、摂食障害、精神分裂病、ＡＤＤ、および癌を含む）；心臓病；炎症および自己免疫障害（クローン病、ＩＢＤ、アレルギー、慢性関節リウマチおよび変形性関節症、炎症性皮膚障害、アレルギー、血液障害を含む）；乾癬結腸癌、白血病ＡＩＤＳ；視床障害；代謝障害（糖尿病および肥満を含む）；肺疾患（例えば、喘息、気腫、嚢胞性線維症、および癌）；膵臓障害（膵臓機能不全および癌を含む）；および前立腺障害（前立腺癌を含む）ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００５２】
Ｂ７ファミリーリガンドとそれらのレセプターとの間の共刺激相互作用は、Ｔ細胞の増殖、分化、および死において重要な役割を果たす。特異的抗体またはその天然リガンドＢ７−１およびＢ７−２のいずれかによるＴ細胞の同時刺激物質ＣＤ２８の会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の抗原特異的増殖を増大させ、サイトカイン産生を増強し、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の成熟を誘導し、そしてＴ細胞の生存を促進する。しかし、活性化されたＴ細胞上のＢ７−１およびＢ７−２の相同ＣＴＬＡ−４レセプターを介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、インターロイキン（ＩＬ）−２産生、および細胞周期の進行を阻害するネガティブなシグナルを送達すると考えられる。
【００５３】
ＮＯＶ１５は、ガラクトシルトランスフェラーゼ様タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１５の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：プロテオデルマタン硫酸、ＰＤＳの不完全な生合成、デルマタン硫酸の不完全な生合成プロテオグリカンキシロシルタンパク質４−β−ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損症ｘｇｐｔ欠損症ガラクトシルトランスフェラーゼＩ欠損症、エーレルス−ダンロー症候群、心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室管（Ａ−Ｖ）欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、子宮内膜症、受精能、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００５４】
この酵素ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）は、ガラクトースβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンの産生のためにＵＤＰガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンが関与する反応を触媒する。このガラクトシルトランスフェラーゼ酵素はまた、調節タンパク質α−ラクトアルブミンとヘテロダイマーを形成して、ラクトースシンテターゼ（ＥＣ２．４．１．２２）を形成する。生合成の役割に加え、ガラクトシルトランスフェラーゼは、それらが細胞間認識および／または接着において機能し得る形質膜の成分であり得る。
【００５５】
ＮＯＶ１６は、リンパ球抗原前駆体様タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１６の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：癌、外傷、再生、ウイルス感染／細菌感染／寄生虫感染。
【００５６】
ＮＯＶ１７は、ペプシノゲンＣ様タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１７の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：潰瘍，高血圧（ＳｃａｎｄＪＣｌｉｎＬａｂＩｎｖｅｓｔＳｕｐｐｌ１９９２；２１０：１１１−９）、胃粘膜の炎症および萎縮症ならびに他の疾患、障害、および状態など。ＰＧＣ遺伝子多型は、胃潰瘍に関連しており、そして胃潰瘍に対する遺伝性素因の亜臨床的なマーカであり得る（ＮｉｐｐｏｎＲｉｎｓｈｏ１９９６Ａｐｒ；５４（４）：１１４９−５４）。ペプシノゲンＡ（ＰＧＡ）およびペプシノゲンＣ（ＰＧＣ）の血清定量は、胃粘膜の炎症および萎縮症を示し得る。身体胃粘膜は、ＰＧＡおよびＰＧＣの両方を産生するが、洞粘膜はＰＧＣのみを発現する。従って、主に洞に関する疾患（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染）は、主に血清ＰＧＡよりも血清ＰＧＣの変化によって示される。同意の下で、洞粘膜を、重篤な炎症を引き起こす、より病原性のｃａｇＡ陽性Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株によって感染させた場合、血清ＰＧＣの顕著な増加を引き起こす（ＲｅｃｅｎｔｉＰｒｏｇＭｅｄ１９９９Ｊｕｎ；９０（６）：３４２−６）。
【００５７】
胃のアスパラギン酸プロテイナーゼ（ペプシンＡ、ペプシンＢ、ガストリクシン／ペプシノゲンＣおよびキモシン）は、不活性な前駆体（チモーゲンとして公知）として胃粘膜で合成される。胃のチモーゲン各々は、不活性形態を安定化させるように働き、そして活性部位への基質の移行を防止するプロセグメント（すなわち、活性酵素のＮ末端の付加残基）を含む。食物摂取の際、各々のチモーゲンが胃管腔内に放出され、そして酸性胃液中で活性酵素への変換を受ける。
【００５８】
ＮＯＶ１８は、ＡＬＲ様タンパク質に対して相同性である。従って、本発明に従うＮＯＶ１８の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、例えば、以下に罹患している患者の処置に関与する治療適用および診断適用において有用である：癌（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、転座関連白血病、ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【００５９】
このＡＬＬ−１遺伝子は、染色体転座または内部再配列を介するヒト急性白血病に関する。ＡＬＬ−１は、ショウジョウバエのトリソラックス（ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）のヒトホモログである。このトリソラックスは、トリソラックスグループ（ｔｒｘ−Ｇ）遺伝子のメンバーであり、ポリコーム（Ｐｏｌｙｃｏｍｂ）グループ（Ｐｃ−Ｇ）遺伝子と一緒になって、ショウジョウバエの体構造（ｂｏｄｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を決定するために、それぞれ、ポジティブ調節因子およびネガティブ調節因子として働く。ＡＬＬ−１関連タンパク質であるＡＬＲは、ＳＥＴドメイン、５つのＰＨＤフィンガー、潜在的なジンクフィンガー、および疎水性残基（大部分がロイシン）によって中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ）されるグルタミンの非常に長い連続（ｒｕｎ）を含む５２６２アミノ酸の巨大な長いタンパク質をコードする。
【００６０】
ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸ活性またはＮＯＶＸ機能を阻害または増大させる分子についてスクリーニングするために使用され得る。詳細には、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、例えば、神経発生、細胞分化、細胞増殖、造血、創傷治癒および新脈管形成を調節または阻害する低分子の同定のために、標的として使用され得る。
【００６１】
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドについてのさらなる有用性は、本明細書中に開示される。
【００６２】
（ＮＯＶ１）
本発明の１つのＮＯＶＸタンパク質（本明細書中でＮＯＶ１と呼ばれる）は、４つのフィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）様タンパク質を含む。これらの開示されるタンパク質は、ＮＯＶ１ａ、ＮＯＶ１ｂ、ＮＯＶ１ｃおよびＮＯＶ１ｄと名付けられている。
【００６３】
（ＮＯＶ１ａ）
開示されるＮＯＶ１ａ（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ−５６２０１−０１と示される）は、新規のフィブロモジュリン様タンパク質をコードしており、そして１４５５ヌクレオチドの配列（配列番号１）を含み、表１Ａに示される。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１９７〜１９９のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１４４５〜１４４７のＴＧＡ終止コドンで終わることが同定された。推定非翻訳領域は、表１Ａにおいて下線を付しており、そして開始コドンおよび終止コドンを太字にしている。
【００６４】
【表１Ａ】

開示されるＮＯＶ１ａ核酸配列は、第１番染色体に位置し、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＦＩＢＲ｜ａｃｃ：Ｘ７２９１３．１ｍＲＮＡ（フィブロモジュリンについてのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ遺伝子）に対して１０６１塩基のうち１０５０塩基（９８％）の同一性を有する（Ｅ＝２．０ｅ^−２４６）。
【００６５】
ＮＯＶ１ａポリペプチド（配列番号２）は、４１６アミノ酸残基長であり、そして１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｂに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ａは、シグナルペプチドを有し、そして０．５５００の確実性でリソソーム（管腔）に局在する可能性があることが予測される。代替の実施形態において、ＮＯＶ１ａポリペプチドは、０．３７００の確実度で細胞外部に、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在される。ＳｉｇｎａｌＰによって、ＮＯＶ１ａペプチドについての可能性のある切断部位は、アミノ酸１８位と１９位との間（すなわち、配列ＳＱＡ−ＱＹのダッシュ線）であると予想される。
【００６６】
【表１Ｂ】

ＮＯＶ１ａアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ０６８２８タンパク質（フィブロモジュリン前駆体（ＦＭ）（５９ＫＤＡのコラーゲン結合タンパク質））（３７６アミノ酸残基）に対して３５３アミノ酸残基のうち３３６アミノ酸残基（９５％）の同一性を、そして３５３アミノ酸残基のうち３３８アミノ酸残基（９５％）の類似性を有する（Ｅ＝３．９ｅ^−１８４）。
【００６７】
ＮＯＶ１ａについて見出される、起こり得る小さなヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を表１Ｃに列挙する。
【００６８】
【表１Ｃ】

（ＮＯＶ１ｂ）
開示されるＮＯＶ１ｂ（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２０１−０２と示される）は、９６５ヌクレオチドの配列（配列番号３）を含み、表１Ｄに示される。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド５７〜５９のＡＴＧコドンで始まり、ヌクレオチド９６３〜９６５のＴＧＡコドンで終わることが同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調している。推定非翻訳領域には、下線を付している。
【００６９】
【表１Ｄ】

開示されるＮＯＶ１ｂ核酸配列は、第１番染色体に位置し、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＦＩＢＲ｜ａｃｃ：Ｘ７２９１３．１ｍＲＮＡ（フィブロモジュリンについてのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ遺伝子）に対して６１３塩基のうち６１３塩基（１００％）の同一性を有する（Ｅ＝２．７ｅ^−２１１）。
【００７０】
このＮＯＶ１ｂポリペプチド（配列番号４）は、３０２アミノ酸残基長であり、そして１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｅに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ｂが、シグナルペプチドを有し、そして０．４５９５の確実性でリソソーム（管腔）に局在する可能性があることが予測される。代替の実施形態において、ＮＯＶ１ｂポリペプチドは、０．３７００の確実度で細胞外部に、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在される。ＳｉｇｎａｌＰによって、ＮＯＶ１ｂペプチドについての可能性のある切断部位は、アミノ酸１８位と１９位との間（すなわち、配列ＳＱＡ−ＱＹのダッシュ線）であると予想される。
【００７１】
【表１Ｅ】

ＮＯＶ１ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ０６８２８タンパク質（フィブロモジュリン前駆体（ＦＭ）（５９ＫＤＡのコラーゲン結合タンパク質））（３７６アミノ酸残基）に対して２１７アミノ酸残基のうち２０７アミノ酸残基（９５％）の同一性を、そして２１７アミノ酸残基のうち２０９アミノ酸残基（９６％）の類似性を有する（Ｅ＝７．２ｅ^−１０５）。
【００７２】
（ＮＯＶ１ｃ）
開示されるＮＯＶ１ｃ（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２０１−０４と示される）は、１１３９ヌクレオチドの配列（配列番号５）を含み、表ｌＦに示される。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド５７〜５９のＡＴＧコドンで始まり、ヌクレオチド１１３７〜１１３９のＴＧＡコドンで終わることが同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調している。推定非翻訳領域には、下線を付している。
【００７３】
【表１Ｆ】

ＮＯＶ１ｃの核酸配列は、第１番染色体に位置し、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＦＩＢＲ｜ａｃｃ：Ｘ７２９１３．１ｍＲＮＡ（フィブロモジュリンについてのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ遺伝子）に対して１０６５塩基のうち１０３６塩基（９７％）の同一性を有する（Ｅ＝９．４ｅ^−２２０）。
【００７４】
ＮＯＶ１ｃポリペプチド（配列番号６）は、３６０アミノ酸残基長であり、そして１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｇに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ｃが、シグナルペプチドを有し、そして０．５３０５の確実性でリソソーム（管腔）に局在する可能性があることが予測される。代替の実施形態において、ＮＯＶ１ｃポリペプチドは、０．３７００の確実度で細胞外部に、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在される。ＳｉｇｎａｌＰによって、ＮＯＶ１ｃペプチドについての可能性のある切断部位は、アミノ酸１８位と１９位との間（すなわち、配列ＳＱＡ−ＱＹのダッシュ線）であると予想される。
【００７５】
【表１Ｇ】

ＮＯＶ１ｃアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ０６８２８タンパク質（フィブロモジュリン前駆体（ＦＭ）（５９ＫＤＡのコラーゲン結合タンパク質））（３７６アミノ酸残基）に対して３７６アミノ酸残基のうち３６０アミノ酸残基の同一性（９５％）を、そして３７６アミノ酸残基のうち３６０アミノ酸残基の類似性（９５％）を有する（Ｅ＝１．４ｅ^−１９５）。
【００７６】
ＮＯＶ１ｃは、少なくとも以下の組織で発現される：大動脈、骨髄（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）、脳、軟骨、蝸牛、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ組織、乳腺／乳房、筋肉、卵巣、膵臓、上皮小体、耳下腺の唾液腺、胎盤、前立腺、網膜、唾液腺、皮膚、脊髄（ｓｐｉｎａｌｃｈｏｒｄ）、胃、精巣、甲状腺、子宮、生物全体。
【００７７】
（ＮＯＶ１ｄ）
開示されるＮＯＶ１ｄ（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２０１−０１；アセンブリー２２４７０００３３と示される）は、１０５３ヌクレオチド配列（配列番号７）を含み、表１Ｈに示される。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＧＧＡコドンで始まり、そしてヌクレオチド１０５１〜１０５３のＧＡＧコドンで終わることが同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調している。
【００７８】
【表１Ｈ】

ＮＯＶ１ｄポリペプチド（配列番号８）は、３６０アミノ酸残基長であり、そして１文字アミノ酸コードを用いて表１Ｉに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ１ｃが、シグナルペプチドを有し、そして０．５３０５の確実性でリソソーム（管腔）に局在する可能性があることが予測される。代替の実施形態において、ＮＯＶ１ｄポリペプチドは、０．３７００の確実度で細胞外部に、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在される。ＳｉｇｎａｌＰによって、ＮＯＶ１ｄペプチドについての可能性のある切断部位は、アミノ酸１８位と１９位との間（すなわち、配列ＳＱＡ−ＱＹのダッシュ線）であると予想される。
【００７９】
【表１Ｉ】

ＮＯＶ１ｄは、少なくとも以下の組織で発現される：大動脈、骨髄（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）、脳、軟骨、蝸牛、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ組織、乳腺／乳房、筋肉、卵巣、膵臓、上皮小体、耳下腺の唾液腺、胎盤、前立腺、網膜、唾液腺、皮膚、脊髄（ｓｐｉｎａｌｃｈｏｒｄ）、胃、精巣、甲状腺、子宮、生体全体。発現情報は、ＮＯＶ１ｄの配列の誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）に含まれる配列の組織供給源に由来する。
【００８０】
ＮＯＶ１ａ、ＮＯＶ１ｂ、ＮＯＶｌｃおよびＮＯＶ１ｄは、表１Ｊでのアミノ酸アラインメントに示されるように、非常に厳密に相同である。
【００８１】
【表１Ｊ】

上記ＮＯＶ１タンパク質のいずれかに対する相同性は、上記に示されるように互いに相同な範囲で、他のＮＯＶ１タンパク質によって共有される。ＮＯＶ１に対するいずれの参照も、他に記載されない限り、概して、それらＮＯＶ１タンパク質の両方に言及すると仮定される。
【００８２】
ＮＯＶ１ａはまた、表１Ｋに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列に相同性を有する。
【００８３】
【表１Ｋ】

これらの配列の相同性は、表１Ｌに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。
【００８４】
【表１Ｌ】

表１Ｍおよび１Ｎは、ＮＯＶ１に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記述を列挙する。この結果は、ＮＯＶ１配列が、これらのドメインを含むことが知られている他のタンパク質の特性に類似する特性を有することを示す。
【００８５】
【表１Ｍ】

【００８６】
【表１Ｎ】

ロイシンリッチリピートのＮ末端ドメイン（Ａｃｃｎｏ．ｇｎｌ｜Ｐｆａｍ｜ｐｆａｍ０１４６２）は、配列ドメインＬＲＲＮＴによって示される。ロイシンリッチリピートｐｆａｍ００５６０は、多くのタンパク質中に存在する、多様な機能および細胞位置を有する短い配列のモチーフである。ロイシンリッチリピートは、システインリッチなドメインにしばしば隣接される。このドメインは、しばしば、直列なロイシンリッチリピートのＮ末端に見出される。
【００８７】
このフィブロモジュリン前駆体（５９ｋｄのコラーゲン結合タンパク質）は、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンに結合し、そして筋原線維形成速度に作用する。このフィブロモジュリン前駆体はまた、ケラタン硫酸鎖に結合し、そして低分子の間質性プロテオグリカンファミリーに属する。このタンパク質はまた、１０個繰り返されるロイシンリッチな（ｌｒｒ）セグメントを含む。
【００８８】
フィブロモジュリンは、低分子の間質性プロテオグリカンファミリー（デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）（ＤＣＮ；ＯＭＩＭ１２５２５５）、ビグリカン（ＢＧＮ；ＯＭＩＭ３０１８７０）、およびルミカン（ｌｕｍｉｃａｎ）（ＬＤＣ；ＯＭＩＭ６００６１６）も含む）のメンバーである。これらのプロテオグリカンのコアタンパク質は、ジスルフィド結合した末端ドメインによって挟まれたロイシンリッチリピートからなる中心部からなり、ロイシンリッチなドメイン内に４つ以下のケラタン硫酸鎖を有するフィブロモジュリンのコアタンパク質と構造的に関連する。フィブロモジュリンは広い組織分布を示し、関節の軟骨、腱、および靱帯において最大量が観察される。フィブロモジュリンは、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲン筋原線維と相互作用し、そしてインビトロでの原線維発生を阻害する能力によって、細胞外マトリクスのアセンブリーに関与することが示唆されている。
【００８９】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１タンパク質およびＮＯＶ１核酸についてのそのタンパク質の類似性情報、発現パターン、細胞局在、およびマッピング位置は、このＮＯＶ１が、糖タンパク質ファミリーに特徴的な重要な構造および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、そして研究道具として有用である。これらは、核酸またはタンパク質の特異的または選択的な診断マーカーおよび／または予後マーカーとして（ここで、その核酸またはタンパク質の存在および量が評価される）役立つことを含む。これらはまた、以下のような潜在的な治療適用を含む：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療標的、診断標的、薬剤標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する薬剤、ならびに（ｖｉ）生物学的防御手段。
【００９０】
本発明の核酸およびタンパク質は、種々の疾患および障害の診断および／または処置における適用を有する。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：軟骨および靱帯への損傷の修復；関節修復、ならびに他の疾患、障害、および状態への治療適用。
【００９１】
本発明のフィブロモジュリン様タンパク質をコードする新規の核酸、またはそのフラグメントは、診断適用において有用であり、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価されるべきである。これらの物質はさらに、治療方法または診断方法における使用のために、本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項に記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されるＮＯＶ１タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ１エピトープは、アミノ酸約３０〜３２である。別の実施形態において、企図されるＮＯＶ１エピトープは、アミノ酸約４５〜４９である。他の特定の実施形態において、企図されるＮＯＶ１エピトープは、アミノ酸約６５〜８０、１０５〜１２０、１４０〜１５０、１５５〜１８０、１９０〜１９２、１９８〜２００、２１０〜２１５、２２０〜２２５、２３０〜２５０および２８０〜３００である。
【００９２】
（ＮＯＶ２）
ＮＯＶ２は、３つの新規のセクレチンレセプター前駆体様タンパク質を含む。これらの開示されるタンパク質は、ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂ、およびＮＯＶ２ｃと名付けられている。
【００９３】
（ＮＯＶ２ａ）
開示されるＮＯＶ２ａ核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２１３−０１と示される）は、新規のセクレチンレセプター前駆体様タンパク質をコードしており、１２８０ヌクレオチドの配列（配列番号９）を含み、表２Ａに示される。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＣＴコドンで始まり、そしてヌクレオチド１２６４〜１２６６のＴＧＡコドンで終わることが同定された。推定非翻訳領域は、表２Ａにおいて下線を付しており、そして開始コドンおよび終止コドンを太字にしている。
【００９４】
【表２Ａ】

ＮＯＶ２ａの核酸配列は、第２番染色体ｑｌ４．１に位置し、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ１３９８９｜ａｃｃ：Ｕｌ３９８９．１ｍＲＮＡ（ヒトセクレチンレセプターｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ）に対して９３２塩基のうち８６８塩基（９３％）の同一性を有する（Ｅ＝２．５ｅ^−１７６）。
【００９５】
ＮＯＶ２ａポリペプチド（配列番号１０）は、４２１アミノ酸残基長であり、そして１文字アミノ酸コードを用いて表２Ｂに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ２ａが、０．６０００の確実性で形質膜に局在する可能性があることが予測される。代替の実施形態において、ＮＯＶ２ａポリペプチドは、０．４０００の確実度でゴルジ体に、０．３０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．３０００の確実度でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在される。
【００９６】
【表２Ｂ】

ＮＯＶ２ａアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ４７８７２タンパク質（セクレチンレセプター前駆体（ＳＣＴ−Ｒ））（４４０アミノ酸残基）に対して４２１アミノ酸残基のうち４１６アミノ酸残基（９８％）の同一性を、そして４２１アミノ酸残基のうち４１６アミノ酸残基（９８％）の類似性を有する（Ｅ＝３．７ｅ^−２２７）。
【００９７】
ＮＯＶ２ａは、少なくとも以下の組織で発現される：膵臓、肺。この情報は、本発明に含まれる配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源が挙げられるが、これに限定されない）を決定することによって導かれる。
【００９８】
ＮＯＶ２ａについて見出される、起こり得る小さなヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を表２Ｃに列挙する。
【００９９】
【表２Ｃ】

（ＮＯＶ２ｂ）
開示されるＮＯＶ２ｂ核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２１３−０２と示される）は、７８９ヌクレオチドの配列（配列番号１１）を含み、表２Ｄに示される。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド７６〜７８のＡＴＧコドンで始まり、そしてヌクレオチド５５９〜５６１のＴＧＡコドンで終わることが同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調している。開始コドンから上流および終止コドンから下流に見出される推定非翻訳領域には、下線を付している。
【０１００】
【表２Ｄ】

ＮＯＶ２ｂの核酸配列は、第２番染色体ｑｌ４．１に位置し、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ２８２８１｜ａｃｃ：Ｕ２８２８１．１ｍＲＮＡ（ヒトセクレチンレセプターｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ）に対して５２６塩基のうち４７２塩基（８９％）の同一性を有する（Ｅ＝４．１ｅ^−１１８）。
【０１０１】
ＮＯＶ２ｂポリペプチド（配列番号１２）は、１６１アミノ酸残基長であり、そして１文字アミノ酸コードを用いて表２Ｅに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ２ｂが、シグナルペプチドを有し、そして０．４６００の確実度で形質膜に局在する可能性があることが予測される。代替の実施形態において、ＮＯＶ２ｂポリペプチドは、０．２５４３の確実度でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在される。ＳｉｇｎａｌＰによって、ＮＯＶ２ｂペプチドについての可能性のある切断部位は、アミノ酸６１位と６２位との間（すなわち、配列ＬＨＣ−ＴＲのダッシュ線）であると予想される。
【０１０２】
【表２Ｅ】

ＮＯＶ２ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ４７８７２タンパク質（セクレチンレセプター前駆体（ＳＣＴ−Ｒ））（４４０アミノ酸残基）に対して９２アミノ酸残基のうち８２アミノ酸残基（８９％）の同一性を、そして９２アミノ酸残基のうち８４アミノ酸残基（９１％）の類似性を有する（Ｅ＝９．６ｅ^−８１）。
【０１０３】
ＮＯＶ２ｂは、少なくとも以下の組織で発現される：膵臓、肺。発現情報は、ＮＯＶ２ｂの配列の誘導に含まれる配列の組織供給源に由来した。
【０１０４】
（ＮＯＶ２ｃ）
開示されるＮＯＶ２ｃ核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２１３−０３と示される）は、１６３３ヌクレオチドの配列（配列番号１３）を含み、表２Ｆに示される。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１０９〜１１１のＡＴＧコドンで始まり、そしてヌクレオチド９７９〜９８１のＴＡＡコドンで終わることが同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調している。推定非翻訳領域には、下線を付しており、開始コドンから上流および終止コドンから下流に見出される。
【０１０５】
【表２Ｆ】

ＮＯＶ２ｃの核酸配列は、第２番染色体ｑｌ４．１に位置し、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ２８２８１｜ａｃｃ：Ｕ２８２８１．１ｍＲＮＡ（ヒトセクレチンレセプターｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ）に対して９６１塩基のうち９６０塩基（９９％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１０６】
ＮＯＶ２ｃポリペプチド（配列番号１４）は、２９０アミノ酸残基長であり、そして１文字アミノ酸コードを用いて表２Ｇに示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシーの結果によって、ＮＯＶ２ｃが、シグナルペプチドを有し、そして０．４６００の確実度で形質膜に細胞外で局在する可能性があることが予測される。代替の実施形態において、ＮＯＶ２ｃポリペプチドは、０．１５８９の確実度でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実度で小胞体（管腔）に局在される。ＳｉｇｎａｌＰによって、ＮＯＶ２ｃペプチドについての可能性のある切断部位は、配列ＴＧＡ−ＬＰのダッシュ線であるアミノ酸２７位と２８位との間であると予想される。
【０１０７】
【表２Ｇ】

ＮＯＶ２ｃアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ４７８７２タンパク質（セクレチンレセプター前駆体（ＳＣＴ−Ｒ））（４４０アミノ酸残基）に対して２８４アミノ酸残基のうち２８３アミノ酸残基（９９％）の同一性を、そして２８４アミノ酸残基のうち２８３アミノ酸残基（９９％）の類似性を有する（Ｅ＝１．５ｅ^−１５５）。
【０１０８】
ＮＯＶ２ｃは、少なくとも以下の組織で発現される：膵臓、肺。発現情報は、ＮＯＶ２ｃの配列の誘導に含まれる配列の組織供給源に由来する。
【０１０９】
ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂ、およびＮＯＶ２ｃは、表２Ｈでのアミノ酸アラインメントに示されるように、非常に厳密に相同である。
【０１１０】
【表２Ｈ】

上記ＮＯＶ２タンパク質のいずれかに対する相同性は、上記に示されるように互いに相同な範囲で、他のＮＯＶ２タンパク質によって共有される。ＮＯＶ２に対する任意の言及は、他に記載されない限り、概して、それらＮＯＶ２タンパク質の両方に言及すると仮定される。
【０１１１】
ＮＯＶ２ａはまた、表２Ｉに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列に相同性を有する。
【０１１２】
【表２Ｉ】

これらの配列の相同性は、表２Ｊに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。
【０１１３】
【表２Ｊ】

表２Ｋ、２Ｌ、および２Ｍは、ＮＯＶ２に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記述を列挙する。この結果は、ＮＯＶ２配列が、これらのドメインを含むことが知られている他のタンパク質の特性に類似する特性を有することを示す。
【０１１４】
【表２Ｋ】

【０１１５】
【表２Ｌ】

この細胞外ドメインは、恐らくジスルフィド結合のための４つの保存されたシステインを含有する。このドメインは、種々のホルモンレセプター中に見出される。これはリガンド結合ドメインであり得る。
【０１１６】
【表２Ｍ】

セレクチン（ＳＣＴ；ＯＭＩＭ番号１８２０９９）は、ＢａｙｌｉｓｓおよびＳｔａｒｌｉｎｇ（１９０２）により十二指腸粘膜において最初に発見されたことに起因して、胃腸ホルモンの歴史において、特有の位置を占める。この２７アミノ酸ペプチドは、膵臓による重炭酸塩、酵素およびカリウムイオンの分泌を刺激する。Ｉｓｈｉｈａｒａら（１９９１）は、ラットのセクレチンレセプターをコードするｃＤＮＡを単離した。このヌクレオチド配列は、このセクレチンレセプターが、４８，６９６の算出された分子量を有することを示した。このレセプターは、７つの推定の膜貫通セグメントを含有し、Ｇプロテイン結合レセプターのファミリーに属する。Ｇプロテイン結合レセプターとしては、パラチロイドホルモンレセプター（ＯＭＩＭ番号１６８４６８）、グルカゴン様レセプター（ＯＭＩＭ番号１３８０３２）、およびカルシトニンレセプター（ＯＭＩＭ番号１１４１３１）が挙げられる。
【０１１７】
Ｃｈｏｗ（１９９５）は、膵臓線癌細胞株ｃＤＮＡライブラリから単離したセクレチンレセプターｃＤＮＡが１，７１７ｂｐ長であり、そして４４０アミノ酸ポリペプチドをコードしたことを示した。ノーザンブロット分析によって、１．８ｋｂのｍＲＮＡが、ヒト膵臓および小腸中において検出されたが、一方でヒトの結腸、腎臓、および肺において弱いハイブリダイゼーションシグナルが検出された。
【０１１８】
本明細書中に開示されるＮＯＶ２タンパク質およびＮＯＶ２核酸は、それがセクレチンレセプター前駆体ファミリーに特徴的な重要な構造的機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用ならびに研究ツールとして有用である。これらには、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカー（ここでこの核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される）、ならびに以下のような潜在的治療適用としての役割を果たすものが挙げられる：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物（ｖｉ）生物学的防御手段。
【０１１９】
本発明の核酸およびタンパク質は、下記の種々の疾患および障害および／または他の病理に関与する潜在的診断適用および潜在的治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患する患者の処置に効力を有する：発達障害、ＭＨＣＩＩ疾患およびＭＨＣＩＩＩ疾患（免疫疾患）、味覚検出能力障害および嗅覚検出能力障害、バーキットリンパ腫、皮質神経性疾患、シグナル伝達経路障害、網膜疾患（光受容に関する網膜疾患を含む）、細胞増殖速度障害；細胞形状障害、摂食障害；摂食の調節；過食に起因する潜在的肥満；飢餓（食欲（ａｐｅｔｉｔｅ）の欠乏）、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）に起因する潜在的障害、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）、疼痛、癌（新生物；腺腫；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌が挙げられるが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、残尿、骨粗鬆症、クローン病；多発性硬化症；およびオールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病性障害および神経学的障害（不安、精神分裂病、躁病性鬱病、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）低リン酸血症のくる病、常染色体優性の（２）先端脳梁症候群およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）を含む）ならびに／あるいは他の病理および障害など。このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして用いられ得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物をスクリーニングするために用いられ得る。例えば、このＮＯＶ２タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてこのＮＯＶ２タンパク質は、それを必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非限定の例として、本発明の組成物は、細菌性感染、真菌性感染、寄生虫性感染、およびウイルス性感染（特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ節；前立腺癌；子宮癌を含むが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、残尿、骨粗鬆症、クローン病；多発性硬化症およびオールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、および精神病性障害および神経学的障害（不安感、精神分裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆、重症性精神遅滞およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）ならびに／あるいは他の病理および障害の処置に効力を有する。本発明のＮＯＶ２タンパク質をコードする新規の核酸、およびＮＯＶタンパク質、あるいはそれらのフラグメントは、診断適用にさらに有用であり得る（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）。これらの物質は、心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心臓欠損、大動脈狭窄、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、房室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植；結腸癌、結腸直腸癌；６型家族性ノンポリポーシス（ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ）；食道癌；肝芽腫；低ベータリポ蛋白血症家族性２；肺癌、骨幹端軟骨形成不全、ＭｕｒｋＪａｎｓｅｎ型；卵巣癌、類内膜癌型；毛質腫；偽ツェルヴェーガー症候群ならびに他の疾患、障害、および状態などの治療的方法または診断的方法における使用のための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製にさらに有用である。
【０１２０】
本発明のセクレチンレセプター前駆体様タンパク質をコードする新規核酸（またはそのフラグメント）は、診断適用（ここでこの核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）に有用である。これらの材料は、治療的方法または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて当該分野において公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ２タンパク質は、複数の親水性領域を有し、それらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ２エピトープは、ほぼアミノ酸１０〜アミノ酸２５である。別の実施形態において、意図されるＮＯＶ２エピトープは、ほぼアミノ酸７０からアミノ酸８０である。代替的実施形態において、意図されるＮＯＶ２エピトープとしては、ほぼアミノ酸１００〜アミノ酸１２０、ほぼアミノ酸１６０〜アミノ酸１７０、ほぼアミノ酸２３０〜アミノ酸２３５、ほぼアミノ酸２５５〜アミノ酸２６０、ほぼアミノ酸３１０〜アミノ酸３２０、ほぼアミノ酸３７０〜アミノ酸３８０、およびほぼアミノ酸４００〜アミノ酸４０５が挙げられる。
【０１２１】
（ＮＯＶ３）
ＮＯＶ３には、２つの新規Ｂ７−Ｈ２様タンパク質が挙げられる。開示されたタンパク質は、ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂと名づけられている。
【０１２２】
（ＮＯＶ３ａ）
開示されるＮＯＶ３ａ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５５７９０−０３として示される）は、新規Ｂ７−Ｈ２様タンパク質をコードし、そして表３Ａに示される１４４９ヌクレオチドの配列（配列番号１５）を含む。ヌクレオチド２〜４のＡＴＧコドンで開始し、ヌクレオチド９０８〜９１０のＴＧＡコドンで終結する成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームを同定した。終止コドンの下流および開始コドンの上流の推定の非翻訳領域を、表３Ａ中に下線し、そして開始コドンおよび終止コドンを太字にした。
【０１２３】
【表３Ａ】

第２１染色体にマップされる本発明のＮＯＶ３ａの核酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ２８９０２８｜ａｃｃ：ＡＦ２８９０２８．１ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ膜貫通タンパク質Ｂ７−Ｈ２ＩＣＯＳリガンドｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して１４４９塩基のうち１４４８塩基（９９％）が同一である（Ｅ＝０．０）。
【０１２４】
ＮＯＶ３ａポリペプチド（配列番号：１６）は、３０２アミノ酸残基長であり、そして表３Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。シグナルＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーは、ＮＯＶ３ａがシグナルペプチドを有し、そして０．４６００の確かさで原形質膜に局在化されている可能性があると予想する。代替的な実施形態において、ＮＯＶ３ａポリペプチドは、０．２０００の確かさでリソソーム（内腔）に配置されるか、０．１０００の確かさで小胞体（膜）に配置されるか、または０．１０００の確かさで小胞体（内腔）に配置される。シグナルＰは、アミノ酸位置１８と１９との間（すなわち、配列ＬＲＡ−ＤＴのダッシュ）のＮＯＶ３ａペプチドの可能性のある切断部位を予想する。
【０１２５】
【表３Ｂ】

ＮＯＶ３ａアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の３０２アミノ酸の残基ｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＧ０１１７６タンパク質（膜貫通タンパク質Ｂ７−Ｈ２ＩＣＯＳリガンド）に対して、３０２アミノ酸残基のうち３０２（１００％）が同一であり、そして３０２アミノ酸残基のうち３０２（１００％）が類似である（Ｅ＝４．０ｅ^１６１）。
【０１２６】
ＮＯＶ３ａは、少なくとも以下の組織で発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。発現情報は、ＮＯＶ３ａの配列の誘導に含まれた配列の組織情報に由来した。
【０１２７】
ＮＯＶ３ａについて見出される可能な小ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を、表３Ｃおよび表３Ｄに列挙する。
【０１２８】
【表３Ｃ】

【０１２９】
【表３Ｄ】

（ＮＯＶ３ｂ）
開示されるＮＯＶ３ｂ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号．ＣＧ５５７９０−０４として示される）は、新規Ｂ７−Ｈ２−様タンパク質（これは、表３Ｅに示される８２５０ヌクレオチド配列（配列番号１７）を含む）をコードする。ヌクレオチド４〜６のＡＴＧコドンで開始し、ヌクレオチド１４２０〜１４２２の終止コドンで終結する成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームを同定した。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンは、太字で強調した。推定の非翻訳領域は、下線され、開始コドンの上流および終止コドンの下流に見出される。
【０１３０】
【表３Ｅ】

ＮＯＶ３ｂポリペプチド（配列番号１８）は、４７３アミノ酸残基長であり、そして表３Ｆにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。
【０１３１】
【表３Ｆ】

ＮＯＶ３ａとＮＯＶ３ｂとは、表３Ｇのアミノ酸アラインメントに示されるように、非常に近い相同性を有する。
【０１３２】
【表３Ｇ】

上記ＮＯＶ３タンパク質のいずれかに対する相同性は、上に示されるようにそれらがお互いに相同である範囲で、他のＮＯＶ３タンパク質によって共有される。ＮＯＶ３に対する任意の参照は、他に示されない限り、両方のＮＯＶ３タンパク質を一般に示すことが想定される。
【０１３３】
ＮＯＶ３ａはまた、表３Ｈに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０１３４】
【表３Ｈ】

これらの配列の相同性は、表３Ｉに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。
【０１３５】
【表３Ｉ】

表３Ｊは、ＮＯＶ３に対するドメイン分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ３配列が、これらのドメインを有することが知られている他のタンパク質の特性に類似する特性を含むことを示す。
【０１３６】
【表３Ｊ】

Ｂ７ファミリーリガンドとそれらのレセプターとの間の同時刺激相互作用は、Ｔ細胞の増殖、分化および死に重要な役割を果たす。特異的抗体またはその天然のリガンドＢ７−１およびＢ７−２のいずれかによるＴ細胞同時刺激因子ＣＤ２８の連動は、抗原特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を増加させ、サイトカインの産生を増大させ、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の成熟を誘導し、そしてＴ細胞の生存を促進する。しかし、活性化Ｔ細胞上のＢ７−１およびＢ７−２の相同ＣＴＬＡ−４レセプターを介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、インターロイキン（ＩＬ）−２産生、および細胞周期の進行を阻害するネガティブなシグナルを伝達すると考えられている。Ｂ７−１とＢ７−２とは、それらのアミノ酸においてたった約２０％の相同性を共有するが、これらは、類似の３次構造および同時刺激機能を有する。最近の研究は、このＢ７−ＣＤ２８ファミリーの他のメンバーもまた、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の調節に関与し得ることを示す。新規メンバーのうちの１つは、誘導性同時刺激因子（ＩＣＯＳ）（ＣＤ２８様レセプター）である。ヒトＩＣＯＳに対するＦ４４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、最適な用量の抗ＣＤ３抗体の存在下で、Ｔ細胞増殖を同時刺激し、そして複数のサイトカイン（ＩＬ−１０、インターフェロン−、およびＩＬ４を含むがＩＬ−２を含まない）の分泌を増加させる。
【０１３７】
別の新規Ｂ７ファミリーメンバーは、マウスＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１である。Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に結合せず、そして抗原性シグナルの存在下でＴ細胞増殖を同時刺激し得ない。Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１の表面発現は、３Ｔ３線維芽細胞株中の腫瘍壊死因子によってアップレギュレートされ、そしてＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の増加もまた、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）に曝された非リンパ組織において観察されることが示された。Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１は、マウスＣＲＰ−１（ヒトＩＣＯＳのマウスホモログ）についてのリガンドであることが示されている。トランスジェニックマウスにおけるＢ７ＲＰ−１融合タンパク質の発現は、複数のリンパ様器官の過形成を導き、そしてＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１融合タンパク質でのマウスの処置は、オキサゾリン誘導接触過敏性を増加させた。ヒトＢ７ファミリーの新規メンバー（Ｂ７−Ｈ１）が、最近報告された。Ｂ７−Ｈ１は、ＩｇＶ様およびＩｇＣ様の細胞外ドメインにおいて、Ｂ７−１およびＢ７−２と約２０％同一なアミノ酸配列を共有するが、細胞質ドメインにおいては、Ｂ７−１およびＢ７−２とより大きく異なる。それらの間のアミノ酸の同一性が３０％未満であるので、Ｂ７−Ｈ１は、マウスＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１のヒトホモログではないようである。さらに、Ｂ７−ＨＩは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、およびＩＣＯＳに結合しない。Ｂ７−Ｈｌの表面発現は、大多数の活性化ＣＤ１４^＋マクロファージおよび一部の活性化Ｔ細胞に検出され得る。
【０１３８】
Ｂ７−Ｈ１は、最適下限の用量の抗−ＣＤ３ｍＡｂの存在下で、Ｔ細胞応答を同時刺激し、同種異系混合リンパ球応答を増強し、そしてＴ細胞からのＩＬ−１０の分泌を優先的に誘導する。ＮＣＢＩデータベース中でＢ７−１、Ｂ７−２、およびＢ７−ＨｌのＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインと相同性を共有する分子を検索し、続いてクローニングし、そして配列決定することによって、Ｂ７−Ｈ２（Ｂ７ホモログ２）とし称される新規のＢ７様遺伝子を同定した。Ｂ７−１、Ｂ７−２、およびＢ７−Ｈｌに対する全体的構造類似性に加えて、Ｂ７−Ｈ２は、ＩＣＯＳに結合し、そしてヒトＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を同時刺激する。Ｂ７−Ｈ２タンパク質の細胞表面発現は、単球由来の未成熟樹状細胞において検出される。可溶性Ｂ７−Ｈ２および免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質（Ｂ７−Ｈ２Ｉｇ）は、活性化Ｔ細胞と結合するが、休止Ｔ細胞とは結合せず、そしてこの結合は、誘導性同時刺激因子Ｉｇ（ＩＣＯＳＩｇ）によって排除されるが、ＣＴＬＡ４Ｉｇによって排除されない。さらに、ＩＣＯＳＩｇは、Ｂ７−Ｈ２遺伝子を用いてトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞を染色する。ＣＤ３の最適下の架橋によって、Ｂ７−Ｈ２ＩｇによるＴ細胞増殖の同時刺激は、用量依存的であり、そしてインターロイキン（ＩＬ）−２の分泌に相関するが、最適なＣＤ３ライゲーションは、ＩＬ−１０産生を、優先的に刺激する。この結果は、Ｂ７−Ｈ２がＩＣＯＳＴ細胞分子の推定リガンドであることを示す（Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２８０８−２８１３）ＰＭＩＤ：１１０２３５１５，ＵＩ：２０４７７８４６）。
【０１３９】
Ｔ細胞特異的細胞表面レセプターＣＤ２８およびＣＴＬＡ４は、免疫系の重要な調節因子である。ＣＤ２８は、効果的な抗原特異的免疫応答に必須のＴ細胞機能を強力に増強し、そしてＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８媒介シグナルを相殺し、従って、それが無ければ致命的であるリンパ系の過剰刺激を防ぐ。活性化ヒトＴ細胞に対するモノクローナル抗体を作製することによって、ＩＣＯＳと表される「誘導性同時刺激因子」の分子のこのファミリーの別のメンバーが、同定されている。ＩＣＯＳ特異的モノクローナル抗体は、休止ヒト末梢血Ｔ細胞と反応しないが、Ｔ細胞抗原レセプター複合体の刺激によって活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球を染色した。免疫沈降は、ＩＣＯＳ抗原を、５５〜６０ｋＤの見かけの相対分子量を有するジスルフィド結合した二量体として規定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質精製は、ＩＣＯＳが、翻訳後修飾においてのみ異なる２つの鎖を有するホモ二量体タンパク質として、細胞表面上で発現されることを示した。２，６４１塩基対の全長ＩＣＯＳｃＤＮＡを、ＭＯＬＴ−４ＶＴリンパ芽球ｃＤＮＡライブラリからクローン化した。ノーザン分析は、活性化ヒトＴ細胞中に、約２．８ｋｂ長の単一のＩＣＯＳｍＲＮＡ種を明らかにした。ＩＣＯＳｍＲＮＡのオープンリーディングフレームは、１９９アミノ酸のタンパク質をコードする。ＩＣＯＳアミノ酸配列は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４と、各々、２４％および１７％の同一性を共有する。予想される成熟ＩＣＯＳは、４２位および１０９位に保存されたシステイン残基によって安定化された、単一の免疫グロブリンＶ様ドメイン；約２３アミノ酸の膜貫通領域；および３５アミノ酸の細胞質テイルからなるＩ型膜貫通分子である。それは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に対する近い構造的類似性を示す。ＣＤ２８の１４１位に配置されたシステイン残基（ＣＴＬＡ４においても見出される）は、明らかに、これらのタンパク質のホモ二量体鎖の間のジスルフィド架橋の形成に関与し、そして、これはまた、ＩＣＯＳにおいて、１３６位に見出される。ＩＣＯＳは、有効性においてＣＤ２８と一致し、そして外部抗原に対する全ての基本的なＴ細胞応答（すなわち増殖、リンホカインの分泌、細胞−細胞相互作用を媒介する分子のアップレギュレーション、およびＢ細胞による抗体分泌のための効果的な補助）を増強する。構成的に発現されたＣＤ２８とは異なり、ＩＣＯＳは、新たにＴ細胞表面上で誘導されなくてはならず、そしてインターロイキン−２（ＩＬ２）の産生をアップレギュレートしないが、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）（Ｂ細胞分化因子）の合成を過剰誘導する。インビボで、ＩＣＯＳは、扁桃のＴ細胞上で高度に発現され、これらは、Ｔ細胞胚中心の先端の明領域（ｌｉｇｈｔｚｏｎｅ）（末端Ｂ細胞の成熟の部位）においてＢ細胞に密接に会合している。
【０１４０】
Ｉｃｏｓ欠損マウスが作製されており、そしてＩｃｏｓの不存在が、Ｔ細胞の発達を損なわないことが決定されている。しかし、増殖およびＩＬ２産生に関するＴ細胞活性化は、損なわれた。分化したＩｃｏｓ−／−細胞は、ＩＦＮＧを産生し得たが、ＩＬ４もＩＬ２も産生し得なかった。インビボ免疫はまた、ＩＬ２およびＩＬ４の産生の欠損ならびに血清ＩｇＧ１およびＩｇＥの減少を明らかにした。アレルギーモデルを用いて、ＩｃｏｓがＴｈ２細胞分化には必要とされないが、ＩＬ４およびＩＬ１３の産生を調節することが見出されている。多発性硬化症の実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）モデルを用いて、Ｉｃｏｓ−／−マウスが、野生型マウス（ＥＡＥ耐性に関するもの以外の遺伝的バックグラウンドは、等しく有する）と比較して強力に増強された疾患を発症することが見出されている。ノックアウトマウスおよび野生型マウス由来の脾細胞は、検出不可能なレベルのＩＬ４ならびに同様のレベルのＩＬＩ０およびＩＦＮＧを産生したが；しかし、Ｉｃｏｓ−／−マウス由来細胞は、ＩＬ１３を産生せず、一方で、野生型マウスは、豊富な量を産生する。ＩＣＯＳが、ＩＬ１３の誘導を介して、炎症性疾患に対する保護において重要な負の調節因子の役割を有し得ると結論付けられている。
【０１４１】
Ｉｃｏｓ欠損マウスは、野生型マウスと比較して、同様の基底レベルのＩｇＭ、わずかに増加したレベルのＩｇＧ３、ならびに減少したレベルのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＥを有したことが見出されている。免疫されたノックアウトマウスおよび野生型マウスはまた、高度に炎症性の完全フロインドアジュバントの存在下である場合を除いて、同様のレベルのＩｇＭ特異的抗体を有するが、ＩｇＧ１特異的抗体およびＩｇＧ２ａ特異的抗体を減少させそして胚中心の形成を減少させた。ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチングは、ＣＤ４０の刺激によって、Ｉｃｏｓ−／−マウスにおいて回復した。
【０１４２】
Ｉｃｏｓ欠損マウス由来の細胞における減少したＴ細胞増殖が、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ２５、およびＣＤ６９の発現の顕著な減少と関連していたことが見出されている。Ｂ細胞活性化およびＴ細胞非依存性抗体応答は、Ｉｃｏｓノックアウトマウスにおいて損なわれなかった。基底レベルのＩｇＧ１のみが、Ｉｃｏｓ−／−マウスにおいて、有意に減少したことが見出されているが；これらは、免疫後、血清ＩｇＧ１レベルおよび血清ＩｇＧ２ａレベルが減少し、そしてＩｇＥレベルが、検出不可能であったことと一致した。ＥＬＩＳＡアッセイは、このクラススイッチングの減損が、減少したＩＬ４産生と関連するが、ＩＦＮＧ産生と関連しないことを示した。免疫組織化学分析は、胚中心形成もまた、Ｃｄ４０ｌｇまたはＣｄ２８が欠損したマウスにおけるように、Ｉｃｏｓノックアウトマウスにおいても減少することを決定した。
【０１４３】
本明細書中に開示されるＮＯＶ３タンパク質およびＮＯＶ３核酸に関するタンパク質類似性情報、発現パターン、細胞局在、およびマップ位置は、それが、免疫グロブリンドメイン含有タンパク質ファミリーに特徴的な重要な構造的機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。したがって、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断適用および潜在的治療適用において、ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断および／または予後マーカーとしての役割を果たすことを含む（ここで、この核酸またはこのタンパク質の存在または量が評価される）。これらはまた、以下のような潜在的な治療適用を含む：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）に有用な核酸、（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する薬剤、ならびに（ｖｉ）生物学的保護手段。
【０１４４】
本発明の核酸およびタンパク質は、種々の疾患および障害の診断および／または処置における適用を有する。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置について効力を有し得る：てんかんを含む脳障害、摂食障害、精神分裂病、ＡＤＤおよび癌；心臓疾患；炎症性障害およびクローン病を含む自己免疫疾患、ＩＢＤ、アレルギー、リウマチ性および変形性関節症、炎症性皮膚障害、アレルギー、血液障害；乾癬、結腸癌、白血病、ＡＩＤＳ；視床障害；代謝障害（糖尿病および肥満を含む）；肺疾患（例えば、喘息、気腫、嚢胞性線維症および癌）；膵臓障害（膵臓機能不全および膵臓癌を含む）；および前立腺障害（前立腺癌を含む）、ならびに他の疾患、障害、および状態。
【０１４５】
本発明のＢ７−Ｈ２様タンパク質をコードする新規核酸、またはそのフラグメントは、診断適用において有用である（ここでこの核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）。これらの物質は、治療的方法または診断的方法における使用のための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて当該分野において公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、それらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ３エピトープは、ほぼアミノ酸２０〜アミノ酸２５である。別の実施形態において、意図されるＮＯＶ３エピトープは、ほぼアミノ酸４０からアミノ酸４２である。他の特定の実施形態において、意図されるＮＯＶ３エピトープは、ほぼアミノ酸４８〜アミノ酸５５、ほぼアミノ酸６０〜アミノ酸７５、ほぼアミノ酸９０〜アミノ酸１２０、ほぼアミノ酸１４５〜アミノ酸１８０、ほぼアミノ酸２３０〜アミノ酸２５０およびほぼアミノ酸２７０〜アミノ酸２９０である。
【０１４６】
（ＮＯＶ４）
ＮＯＶ４は、２つの新規Ｂ７−Ｈ１様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ４ａおよびＮＯＶ４ｂと名づけられている。
【０１４７】
（ＮＯＶ４ａ）
開示されるＮＯＶ４ａ核酸（ＣＧ５６１１０−０１と称される）は、新規Ｂ７−Ｈ１様タンパク質をコードし、４５８２ヌクレオチド配列（配列番号１９）を含み、表４Ａに示される。ヌクレオチド１０〜１２のＡＴＧコドンで始まりヌクレオチド８８７〜８８９のＴＡＡコドンで終了する、成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームが、同定された。終止コドンから下流および開始コドンから上流の推定非翻訳領域は、表４Ａにおいて下線を付してあり、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字になっている。
【０１４８】
【表４Ａ】

第９染色体マップされたＮＯＶ４ａの核酸配列は、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ３１７０８８｜ａｃｃ：ＡＦ３１７０８８．１ｍＲＮＡ（ＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓＢ７−Ｈ１タンパク質ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して８７３塩基のうち６７２塩基（７６％）が同一である（Ｅ＝８．５ｅ^−１０６）。
【０１４９】
ＮＯＶ４ａポリペプチド（配列番号２０）は２９０アミノ酸残基長であり、そして表４Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。シグナルＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーは、ＮＯＶ４ａがシグナルペプチドを有し、そして０．４６００の確かさで原形質膜に局在化されている可能性があると予想する。代替的な実施形態において、ＮＯＶ４ａポリペプチドは、０．１０００の確かさで小胞体（膜）に配置されるか、０．１０００の確かさで小胞体（内腔）に配置されるか、または０．１０００の確かさで細胞の外側に配置される。シグナルＰは、アミノ酸位置１８と１９との間（すなわち、配列ＬＮＡ−ＦＴのダッシュ）のＮＯＶ４ａペプチドの可能性のある切断部位を予想する。
【０１５０】
【表４Ｂ】

ＮＯＶ４ａアミノ酸配列は、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）由来の２９０アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＧ１８５０９タンパク質（ＰＤ−１リガンド前駆体）に対して、２９０アミノ酸残基のうち２０２（６９％）が同一であり、そして２９０アミノ酸残基のうち２３６（８１％）が類似である（Ｅ＝３．０ｅ^−１１６）。
【０１５１】
ＮＯＶ４ａは、少なくとも以下の組織で発現される：ＬＰＳ処理した樹状細胞、ＬＰＳ処理した単球およびマクロファージ、脳、頸部、卵巣、下垂体、胎盤、子宮、器官全体。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公共のＥＳＴ供給源、文献供給源および／またはＲＡＣＥ供給源が挙げられるが、これらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することにより得た。
【０１５２】
ＮＯＶ４ａについて見出される可能な小ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）を表４Ｃに列挙する。
【０１５３】
【表４Ｃ】

（ＮＯＶ４ｂ）
開示されるＮＯＶ４ｂ核酸（ＣＧ５６１１０−０４として示される）（これはＮＯＶ４ａのスプライシング改変体である）は、表４Ｄに示される７４５ヌクレオチド配列（配列番号２１）を含む。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧコドンで始まりヌクレオチド５３５〜５３７のＴＡＧコドンで終了する、成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームが、同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンは、太字で強調されている。推定非翻訳領域は下線を付してあり、そして開始コドンの上流および終止コドンの下流に見出される。
【０１５４】
【表４Ｄ】

第９染色体にマップされるＮＯＶ４ｂの核酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ２３３５１６｜ａｃｃ：ＡＦ２３３５１６．１ｍＲＮＡ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＰＤ−１リガンド前駆体ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して５３０塩基のうち５３０塩基（１００％）が同一である（Ｅ＝２．８ｅ^−１６０）。
【０１５５】
ＮＯＶ４ｂポリペプチド（配列番号２２）は、１７８アミノ酸残基長であり、そして表４Ｅにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。シグナルＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーは、ＮＯＶ４ｂがシグナルペプチドを有し、そして０．４１８０の確かさで細胞の外側に局在化されている可能性があると予想する。他の実施形態において、ＮＯＶ４ｂは、０．１０００の確かさで小胞体（膜）リソソーム（内腔）に配置されるか、または０．１０００の確かさでマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在する。ＮＯＶ４ｂペプチドについての最も可能性がある切断部位は、アミノ酸位置１８と１９との間（ＬＮＡ−ＦＴのダッシュ）である。
【０１５６】
【表４Ｅ】

ＮＯＶ４ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の２９０アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＮＺＱ７タンパク質（Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−１リガンド前駆体））に対して、１７７アミノ酸残基のうち１７７（１００％）が同一であり、そして１７７アミノ酸残基のうち１７７（１００％）が類似である（Ｅ＝１．８ｅ^−９２）。
【０１５７】
ＮＯＶ４ｂは、少なくとも以下の組織において発現される：哺乳動物組織、子宮。発現情報は、ＮＯＶ４ｂの配列の誘導に含まれる配列の組織供給源から得た。
【０１５８】
ＮＯＶ４ａおよびＮＯＶ４ｂは、表４Ｆのアミノ酸アラインメントに示されるように非常に密接に相同である。
【０１５９】
【表４Ｆ】

任意の上記ＮＯＶ４タンパク質のいずれかに対する相同性は、上に示されるようにそれらが互いに相同である範囲で他のＮＯＶ４タンパク質によって共有される。ＮＯＶ４に対する任意の参照は、他に示されない限り、両方のＮＯＶ４タンパク質を一般に示すことが想定される。
【０１６０】
ＮＯＶ４ａはまた、表４Ｇに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０１６１】
【表４Ｇ】

これらの配列の相同性は、表４Ｈに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。
【０１６２】
【表４Ｈ】

表４Ｉおよび４Ｊは、ＮＯＶ４に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ４配列が、これらのドメインを含むことが知られている他のタンパク質の特性と類似した特性を有することを示す。
【０１６３】
【表４Ｉ】

【０１６４】
【表４Ｊ】

Ｂ７−１またはＢ７−２によるＣＴＬＡ４の連動は、一方で、増殖およびインターロイキン−２（ＩＬ２）産生を阻害し得る。ＣＤ２８関連分子ＩＣＯＳに対する抗体は、Ｔ細胞増殖を刺激し得、そしてＩＬ１０およびＩＬ４の産生を誘導し得る。Ｂ７−１ホモログおよびＢ７−２ホモログについてＥＳＴデータベースを検索し、次いで胎盤ｃＤＮＡライブラリをＲＴ−ＰＣＲすることにより、Ｄｏｎｇら（１９９９）は、Ｂ７Ｈｌ（Ｂ７ホモログ−１）をコードするｃＤＮＡを得た。配列分析は、この２９０アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質（これは、Ｂ７−１およびＢ７−２に対して、各々、２０％および１５％同一である）が、免疫グロブリンＶ様ドメインおよび免疫グロブリンＣ様ドメインならびに３０アミノ酸の細胞質テイルを有すると予想した。ノーザンブロット分析は、心臓、骨格筋、胎盤、および肺において、最も豊富に４．１ｋｂおよび７．２ｋｂのＢ７Ｈ１転写物を検出し、胸腺、脾臓、腎臓、および肝臓において、弱い発現でこれらの転写物を検出し、そして脳、結腸、および小腸においては、発現が検出されなかった。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析は、単球画分でのＢ７Ｈ１発現、およびＴ細胞およびＢ細胞での弱い発現を実証した。活性化は、Ｔ細胞および単球の両方での発現を有意に増加させ、Ｂ細胞ではより低い程度で発現を増加させた。結合分析は、Ｂ７Ｈ１と、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ４、またはＣＤ２８との間の相互作用を実証しなかった。Ｂ７Ｈ１存在下でのＴ細胞の刺激は、ＩＬ２依存性の様式で、増殖ならびにＩＬ１０およびγインターフェロン（ＩＦＮＧ）の優先的産生を増加させたが、ＩＬ４の優先的産生は増加させなかった。
【０１６５】
Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）もまた、Ｂ７Ｈ１をクローン化した、彼らは、それを、「プログラム細胞死−１（ＰＤＣＤ１またはＰＤ１）リガンド−１」すなわちＰＤＬ１と称した。マウスＰｄｌ１は、ヒトタンパク質に対して７０％同一である。フローサイトメトリー分析およびＢＩＡｃｏｒｅ分析ＰＤＬＩがＰＤＣＤ１に結合するが、構造的に類似のＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳタンパク質には結合しないことを決定した。ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションは、ＰＤＬ１が、ＩＦＮＧを用いた処理によって単球においてアップレギュレートされ、そして他の活性化因子と共にＩＦＮＧで処理することによって樹状細胞およびケラチノサイトにおいてアップレギュレートされることを示した。樹状細胞において、Ｂ７−１およびＢ７−２が、ＰＤＬ１と平行して、アップレギュレートされた。ＰＤＬ１の発現はまた、表面のＩｇ架橋により活性化されたＢ細胞において、アップレギュレートされた。ＰＤＬ１の存在下でのヒトＴ細胞およびマウスＰｄｃｄｌ＋／＋Ｔ細胞の活性化は、恐らくＰＤＣＤ１上の細胞質免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）の存在に起因して、増殖およびサイトカイン分泌の減少を導いた。
【０１６６】
ＰＣＲおよび体細胞ハイブリッド分析によって、Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）は、第９染色体にＰＤＬＩをマッピングした。Ｓｃｏｔｔ（２０００）は、Ｂ７Ｈ１配列（ＧｅｎＢａｎｋＧＥＮＢＡＮＫＡＦ１７７９３７）と第９染色体クローンＲＰ１１−５７４Ｆ１１（ＧｅｎＢａｎｋＧＥＮＢＡＮＫＡＬ１６２２５３）との間の配列類似性に基いて、Ｂ７ＨＩ遺伝子を第９染色体にマッピングした。
【０１６７】
Ｒｅｎｎｅｒｔら（１９９７）ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ９，８０５−１３：Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）は、抗原提示細胞上で発現される遺伝的および構造的に関連する分子である。これらの両方は、ＣＤ２８に結合して、Ｔリンパ球を同時刺激し、増殖およびサイトカイン産生を生じる。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に結合するＢ７−１およびＢ７−２の細胞外部分は、Ｉｇ可変（Ｖ）ドメイン配列およびＩｇ定常（Ｃ）ドメイン配列に関連する。最近の報告は、インビボで生じ、かつ機能が未知であるＢ７タンパク質のスプライシング改変体形態を記載している。ここで本発明者らは、Ｉｇ様細胞外ドメインまたはＩｇＦｃテイルに結合された個々のＩｇＶドメインもしくはＩｇＣドメインの両方のうちいずれかを含む可溶性組換え形態のＢ７−１およびＢ７−２を記載する。可溶性Ｂ７−１およびＢ７−２は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に結合し、そして効果的にＴリンパ球を同時刺激して、それらの増殖およびサイトカインの分泌を生じる。さらに、Ｂ７−２のＩｇＶドメインは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に結合し、これらのレセプターへの結合についてＢ７−１およびＢ７−２と競合し、Ｔリンパ球を同時刺激する。架橋された可溶性Ｂ７−２ｖは、最も可能性のある試験された同時刺激分子であり、そして架橋された可溶性のＢ７−１タンパク質またはＢ７−２タンパク質よりも約１／１００倍低い濃度で活性であった。トシル活性化ビーズに結合された場合、Ｂ７−２ｖは、複数回のＴ細胞の増殖を支持し得た。これらのデータは、天然に存在する改変体の記載を補って、Ｔ細胞のインビボでの同時刺激が、可溶性形態または短縮形態のＢ７タンパク質によって調製され得ることを示唆する。
【０１６８】
いくつかの最近の研究は、Ｂ７ファミリーメンバー様Ｂ７ＲＰ−Ｉ（Ｂ７関連タンパク質−１）、Ｂ７−１、およびＢ７−２と、抗原レセプター（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）およびＩＣＯＳ（誘導性同時刺激分子））との同時刺激相互作用の重要性を実証する。これらのタンパク質相互作用が、正常なＴ細胞の活性化および増殖、Ｂ細胞の刺激および抗体産生、免疫グロブリンクラススイッチング、インターロイキン産生、ならびに胚中心形成のために必須であることが示されてきた。これらの事象が、適切な体液性免疫応答を媒介するのに必須の段階を構成するので、これらの調節は、多くの種類の免疫系障害についての潜在的な治療として作用し得る（Ｄｏｎｇ，Ｃ．，ら、ＩＣＯＳｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒＴ−ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．４０９，９７−１０１（２００１）；ＭｃＡｄａｍ，Ａ．Ｊ．，ら．ＩＣＯＳｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｆｏｒＣＤ４０−ｍｅｄｉａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｃｌａｓｓｓｗｉｔｃｈｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ．４０９，１０２−１０５（２００１）；Ｔａｆｔｕｉｒｉ，Ａ．，ら．ＩＣＯＳｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｅｆｆｅｃｔｉｖｅＴ−ｈｅｌｐｅｒ−ｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４０９，１０５−１０９（２００１）；Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｓ．Ｋ．，ら．Ｔ−ｃｅｌｌｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈＢ７ＲＰ−１ａｎｄＩＣＯＳ．Ｎａｔｕｒｅ．４０２，８２７−９３２（１９９９））。
【０１６９】
Ｂ７ファミリーメンバーであるＢ７−１およびＢ７−２は、ＣＤ２８と相互作用し、そして抗原特異的体液性免疫応答および細胞媒介免疫応答の開始において必須のＴ細胞同時刺激経路を構成する。ここで本発明者らは、Ｂ７−Ｈｌと呼ばれるＢ７ファミリーの第３のメンバーを記載する。これは、ＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球Ａ４またはＩＣＯＳ（誘導性同時刺激因子）に結合しない。Ｂ７−Ｈ１同時刺激されたＴ細胞のライゲーションは、ポリクローナル刺激剤および同種異系の抗原に応答し、そして優先的に、インターロイキン−１０の産生を刺激した。少量で産生されるが、インターロイキン−２は、Ｂ７−Ｈ１同時刺激の効果のために必要であった。従って、本発明者らの研究は、細胞媒介免疫応答の負の調節に関与し得るこれまで未知であった同時刺激因子分子を規定する。ＰＭＩＤ：１０５８１０７７，ＵＩ：２００４８１５４
同時刺激は、Ｔ細胞活性化に必須である。抗原提示細胞上で、重要な因子が、Ｂ７遺伝子の拡張されたファミリーにおいて見出され、この拡張されたファミリーは、ｃｄ８０、ｃｄ８６、Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１およびＢ７−Ｈｌを含む。ｃｄ８０およびｃｄ８６は、Ｔ細胞上でＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に結合するタンパク質をコードする。強力なＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を用いてこの経路を遮断することは、治療薬剤としての能力を促進することを示す。ｃｄ８０およびｃｄ８６経路は、主に、未処理Ｔ細胞上で作用するが、Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１およびＢ７−Ｈ１は、抗原を受けたリンパ球上でそれらの効果を発揮するようである。ＰＭＩＤ：１１０２９３８８，ＵＩ：２０４８５７１７。
【０１７０】
抗原存在下でのＢ７−１（ＣＤ８０；ＯＭＩＭ＃１１２２０３）またはＢ７−２（ＣＤ８６；ＯＭＩＭ＃６０１０２０）によるＣＤ２８（ＯＭＩＭ＃１８６７６０）の連動は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、エフェクターＴ細胞の分化、およびＢＣＬ−Ｘ（ＯＭＩＭ＃６０００３９）（Ｔ細胞生存のプロモーター）の誘導を促進する。一方、Ｂ７−１またはＢ７−２によるＣＴＬＡ４（ＯＭＩＭ＃１２３８９０）の連動は、増殖およびインターロイキン−２（ＩＬ２；ＯＭＩＭ＃１４７６８０）産生を阻害し得る。ＣＤ２８関連分子ＩＣＯＳ（ＯＭＩＭ＃６０４５５８）に対する抗体は、Ｔ細胞増殖を刺激し得、そしてＩＬ１０（ＯＭＩＭ＃１２４０９２）およびＩＬ４（ＯＭＩＭ＃１４７７８０）の産生を誘導し得る。Ｂ７−１ホモログおよびＢ７−２ホモログについてＥＳＴデータベースを検索し、次いで胎盤ｃＤＮＡライブラリのＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、Ｄｏｎｇら（１９９９）は、Ｂ７−Ｈｌ（Ｂ７ホモログ−１）をコードするｃＤＮＡを得た。配列分析は、２９０アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質（これらは、Ｂ７−１およびＢ７−２に対して各々、２０％および１５％同一である）は、免疫グロブリンＶ様ドメインおよび免疫グロブリンＣ様ドメインならびに３０アミノ酸の胞質テイルを有することを予想した。ノーザンブロット分析は、心臓、骨格筋、胎盤、および肺において、最も豊富に４．１ｋｂおよび７．２ｋｂのＢ７−Ｈ１転写物を検出し、胸腺、脾臓、腎臓、および肝臓において、弱い発現でこれらの転写物を検出し、そして脳、結腸、および小腸においては、発現が検出されなかった。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析は、単球画分でのＢ７−Ｈ１発現、ならびにＴ細胞およびＢ細胞での弱い発現を実証した。活性化は、Ｔ細胞および単球の両方での発現を有意に増加させ、Ｂ細胞ではより低い程度で発現を増加させた。結合分析は、Ｂ７−Ｈ１と、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ４、またはＣＤ２８との間の相互作用を実証しなかった。Ｂ７−Ｈ１存在下でのＴ細胞の刺激は、ＩＬ２依存性の様式で、増殖ならびにＩＬ１０およびγインターフェロン（ＩＦＮＧ；ＯＭＩＭ＃１４７５７０）の優先的産生を増加させたが、ＩＬ４の優先的産生は増加させなかった。
【０１７１】
本明細書中に開示されるＮＯＶ４タンパク質およびＮＯＶ４核酸に関するタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、それが、Ｂ７ファミリーに特徴的な重要な構造的機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。したがって、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断適用および潜在的治療適用において、ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断および／または予後マーカーの役割を果たすことを含む（ここで、この核酸またはこのタンパク質の存在または量が評価される）。これらはまた、以下のような潜在的な治療適用を含む：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）に有用な核酸、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物、および（ｖｉ）生物学的保護手段。
【０１７２】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／あるいは他の病理に関連する潜在的な診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置について効力を有する：てんかんを含む脳障害、摂食障害、精神分裂病、ＡＤＤ、および癌；心臓疾患；炎症性障害およびクローン病を含む自己免疫疾患、ＩＢＤ、アレルギー、リウマチ様および変形性関節症、炎症性皮膚障害、アレルギー、血液障害；乾癬、結腸癌、白血病、ＡＩＤＳ；視床障害；代謝障害（糖尿病および肥満を含む）；肺疾患（例えば、喘息、気腫、嚢胞性線維症および癌）；膵臓障害（膵臓機能不全および膵臓癌を含む）；および前立腺障害（前立腺癌を含む）、免疫媒介性の病因、Ｔ細胞媒介性疾患、多発性硬化症、結腸炎、癌、外傷、再生（インビトロおよびインビボ）、ウイルス感染／細菌感染／寄生生物感染、ならびに他の疾患、障害、および状態など。
【０１７３】
これらの物質は、治療方法または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、親水性チャートからの予測を用いて当該分野において公知の方法に従って作製される。開示されるＮＯＶ４タンパク質は、複数の親水性領域を有し、それらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ４エピトープは、ほぼアミノ酸４０〜アミノ酸４５である。別の実施形態において、意図されるＮＯＶ４エピトープは、ほぼアミノ酸５２からアミノ酸５５である。他の特定の実施形態において、意図されるＮＯＶ４エピトープは、ほぼアミノ酸６０〜アミノ酸６８、ほぼアミノ酸７０〜アミノ酸９０、ほぼアミノ酸１１０〜アミノ酸１１２、ほぼアミノ酸１３０〜アミノ酸１４０、ほぼアミノ酸１４２〜アミノ酸１４５、ほぼアミノ酸１５０〜アミノ酸１５５、ほぼアミノ酸１５７〜アミノ酸１６０、ほぼアミノ酸１７５〜アミノ酸１９０、ほぼアミノ酸２２０〜アミノ酸２４０、およびほぼアミノ酸２６０〜アミノ酸２８０である。
【０１７４】
（ＮＯＶ５）
ＮＯＶ５は、２つの新規プロスタシン様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂと呼ばれる。
【０１７５】
（ＮＯＶ５ａ）
開示されるＮＯＶ５ａ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５６１４２−０１と称される）は、新規プロスタシン様タンパク質をコードし、８６６ヌクレオチド配列（配列番号２３）を含み、表５Ａに示される。ヌクレオチド１９〜２１のＡＴＧコドンで始まりヌクレオチド８２０〜８２２のＴＧＡコドンで終了する、オープンリーディングフレームが、同定された。終止コドンから下流および開始コドンから上流の推定非翻訳領域は、表２Ａにおいて下線を付してあり、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字になっている。
【０１７６】
【表５Ａ】

第１６染色体にマップされるＮＯＶ５ａの核酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１７５５２２｜ａｃｃ：ＡＦｌ７５５２２．１ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ膜貫通トリプターゼｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して６３９塩基のうち４２１塩基（６５％）が同一である（Ｅ＝１．２ｅ^−３０）。
【０１７７】
ＮＯＶ５ａポリペプチド（配列番号２５）は２６７アミノ酸残基長であり、そして表５Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。シグナルＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーは、ＮＯＶ５ａがシグナルペプチドを有し、そして０．６９０２の確かさで細胞外に局在化されている可能性があると予想する。代替的な実施形態において、ＮＯＶ５ａポリペプチドは、０．１０００の確かさで小胞体（膜）に配置されるか、０．１０００の確かさで小胞体（内腔）に配置されるか、または０．１０００の確かさでリソソーム（内腔）に配置される。シグナルＰは、アミノ酸位置１８と１９との間（すなわち、配列ＡＣＧ−ＱＰのダッシュ）のＮＯＶ５ａペプチド可能性のある切断部位を予想する。
【０１７８】
【表５Ｂ】

ＮＯＶ５ａアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）由来３４２アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＧ３２６４１タンパク質（ＰＲＯＳＴＡＳＩＮ）タンパク質に対して、２０１アミノ酸残基のうち９３（４６％）が同一であり、そして２０１アミノ酸残基のうち１２５（６２％）が類似である（Ｅ＝１．２ｅ^−４５）
ＮＯＶ５ａは、少なくとも以下の組織で発現される：子宮内膜癌組織。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公共のＥＳＴ供給源、文献供給源および／またはＲＡＣＥ供給源が挙げられるが、これらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することにより得た。
【０１７９】
ＮＯＶ５ａについて見出される可能な小ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を表５に列挙する。
【０１８０】
【表５Ｃ】

（ＮＯＶ５ｂ）
開示されるＮＯＶ５ｂ核酸（ＣｕｒａＧｅｎＣＧ５６１４２−０２として示される）は、新規プロススタチン様タンパク質をコードし、そして表５Ｄに示される１０２０ヌクレオチド配列（配列番号２５）を含む。ヌクレオチド９１〜９３のＡＴＧコドンで始まりヌクレオチド９３１〜９３３のＴＡＡコドンで終了する、成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームが、同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンは、太字で強調されている。推定非翻訳領域は下線を付してあり、そして開始コドンの上流および終止コドンの下流に見出される。
【０１８１】
【表５Ｄ】

第１６染色体にマップされるＮＯＶ５ｂの核酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＡ３０６５９３｜ａｃｃ：ＡＪ３０６５９３．１ｍＲＮＡ（マラプシン（ｍａｒａｐｓｉｎ）（ＭＰＮ遺伝子）についてのＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍＲＮＡ）に対して８６３塩基のうち５６１塩基（６５％）が同一である（Ｅ＝４．８ｅ^−４７）。
【０１８２】
ＮＯＶ５ｂポリペプチド（配列番号：２６）は、２８０アミノ酸残基長であり、そして表５Ｅにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。シグナルＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーは、ＮＯＶ５ｂがシグナルペプチドを有し、そして０．８２００の確かさで小胞体（膜）に局在化されている可能性があると予想する。代替的な実施形態において、ＮＯＶ５ｂポリペプチドは、０．１９００の確かさで原形質膜に配置されるか、０．１０００の確かさで小胞体（内腔）に配置されるか、または０．１０００の確かさで細胞の外側に配置される。シグナルＰは、アミノ酸位置２２と２３との間（すなわち、配列ＴＱＧ−ＲＫのダッシュ）のＮＯＶ５ｂペプチドの可能性のある切断部位を予想する。
【０１８３】
【表５Ｅ】

ＮＯＶ５ｂアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）由来の３４２アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＥＳ８７タンパク質（ＰＲＯＳＴＡＴＩＮ）に対して、２７６アミノ酸残基のうち１３２（４７％）が同一であり、そして２７６アミノ酸残基のうち１７２（６２％）が類似である（Ｅ＝６．９ｅ^−６７）。
【０１８４】
ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂは、表５Ｆのアミノ酸アラインメントに示されるように、非常に密接に相同である。
【０１８５】
【表５Ｆ】

上記ＮＯＶ５タンパク質のいずれかに対する相同性は、上に示されるようにそれらが互いに相同である範囲で他のＮＯＶ５タンパク質によって共有される。ＮＯＶ５に対する任意の参照は、他に示されない限り、両方のＮＯＶ５タンパク質を一般に示すことが想定される。
【０１８６】
ＮＯＶ５ａはまた、表５Ｇに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０１８７】
【表５Ｇ】

これらの配列の相同性は、表５Ｈに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。
【０１８８】
【表５Ｈ】

本明細書中に開示されるＮＯＶ５タンパク質およびＮＯＶ５核酸に関するタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、このファミリーに特徴的な重要な構造的機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断適用および潜在的治療適用において、ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカー（ここで、この核酸またはこのタンパク質の存在または量が評価される）ならびに以下のような潜在的な治療適用を役割を果たす：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）に有用な核酸、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する薬剤、および（ｖｉ）生物学的保護手段。
【０１８９】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下の記載される種々の疾患および障害ならびに／あるいは他の病理に関連する潜在的な診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置について効力を有する：心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心臓欠損、大動脈狭窄、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、癌、外傷、再生（インビボおよびインビトロ）、ウイルス感染／細菌感染／寄生生物感染、心筋症、アテローム硬化症、高血圧、先天性心障害、大動脈狭窄、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、動脈瘤、線維筋性形成異常、発作、貧血、出血障害、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵臓炎、上皮小体機能亢進、上皮小体機能低下、ＳＩＤＳ、子宮内膜症、受胎能、口内乾燥、高カルシウム血症、潰瘍、肝硬変、炎症性腸疾患、憩室性疾患、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、血友病、凝固能亢進性症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫欠損、対宿主性移植片病、毛細血管拡張性運動失調、血友病、リンパ水腫、扁桃炎、骨粗鬆症、関節炎、強直性脊椎炎、脊柱側弯症、腱炎、筋ジストロフィー、レッシュ−ナイハン症候群、重症筋無力症、歯科疾患および感染、アルツハイマー病、結節硬化、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、嗜癖、不安、疼痛、神経保護（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）、成長障害および生殖障害（ｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、分泌不全、全身性エリテマトーデス、喘息、気腫、ＡＲＤＳ、咽頭炎、喉頭炎、聴覚障害、耳鳴、乾癬、光線性角化症、結節硬化、挫瘡、髪の成長、アロペシア（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、膀胱炎、失禁、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡネフロパシー、膀胱尿管逆流、緑内障、失明、および甲状腺機能低下性心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁障害、結節硬化、強皮症、肥満症、移植ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０１９０】
本発明のプロスタシン様タンパク質をコードする新規核酸、またはそのフラグメントは、診断適用（ここでこの核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）に有用である。これらの物質は、治療方法または診断方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、親水性チャートからの予測を用いて当該分野において公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ５タンパク質は、複数の親水性領域を有し、それらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ５エピトープは、ほぼアミノ酸３０〜アミノ酸３５である。別の実施形態において、意図されるＮＯＶ５エピトープは、ほぼアミノ酸４０〜アミノ酸４５である。他の特定の実施形態において、意図されるＮＯＶ５エピトープは、ほぼアミノ酸７０〜アミノ酸８０、ほぼアミノ酸９５〜アミノ酸１０５、ほぼアミノ酸１１０〜アミノ酸１１５、ほぼアミノ酸１４０〜アミノ酸１５０、ほぼアミノ酸１６０〜アミノ酸１７０、ほぼアミノ酸１７５〜アミノ酸１８０、ほぼアミノ酸１９０〜アミノ酸１９５、ほぼアミノ酸２２０〜アミノ酸２２５、ほぼアミノ酸２３０〜アミノ酸２４０、ほぼアミノ酸２４５〜アミノ酸２４８、ほぼアミノ酸２４９〜アミノ酸２５２、およびほぼアミノ酸２６０〜アミノ酸２６２である。
【０１９１】
（ＮＯＶ６）
ＮＯＶ６は、３つの新規リソソーム酸性リパーゼ様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ６ａおよびＮＯＶ６ｂと呼ばれる。
【０１９２】
（ＮＯＶ６ａ）
開示されるＮＯＶ６ａ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５０１５９−０１と称される）は、新規リソソーム酸性リパーゼ様タンパク質をコードし、１２６７ヌクレオチド配列（配列番号２７）を含み、表６Ａに示される。ヌクレオチド９〜１０のＡＴＧコドンで始まりヌクレオチド１１２７〜１１２９のＴＡＡコドンで終了する、成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームが、同定された。終止コドンから下流および開始コドンから上流の推定非翻訳領域は、表６Ａにおいて下線を付してあり、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字になっている。
【０１９３】
【表６Ａ】

第１０染色体にマップされるＮＯＶ６ａの核酸配列は、Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＮＬＩＰ｜ａｃｃ：Ｘ０２３０９．１ｍＲＮＡ（舌リパーゼについてのラットｍＲＮＡ）に対して８２０塩基のうち５４５塩基（６６％）が同一である（Ｅ＝２．５ｅ^−７１）。
【０１９４】
ＮＯＶ６ａポリペプチド（配列番号２８）は３７３アミノ酸残基長であり、そして表６Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。シグナルＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーの結果は、ＮＯＶ６ａがシグナルペプチドを有し、そして０．５５００の確かさでリソソーム（内腔）に局在化されている可能性があると予想する。代替的な実施形態において、ＮＯＶ６ａポリペプチドは、０．３７００の確かさで細胞外に配置されるか、０．２９６７の確かさでマイクロボディ（ペルオキシソーム）に配置されるか、または０．１０００の確かさで小胞体（膜）に配置される。シグナルＰは、アミノ酸位置１７と１８との間（すなわち、配列ＬＮＡ−ＧＧのダッシュ）のＮＯＶ６ａペプチドの可能性のある切断部位を予想する。
【０１９５】
【表６Ｂ】

ＮＯＶ６ａアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の３９９アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ１６５２９タンパク質（リソソーム酸性リパーゼ前駆体）に対して、２９７アミノ酸残基のうち１５２（５１％）が同一であり、そして２９７アミノ酸残基のうち２０１（６７％）が類似である（Ｅ＝６．２ｅ^−１０８）。
【０１９６】
ＮＯＶ６について見出される可能な小ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）を表６Ｃに列挙する。
【０１９７】
【表６Ｃ】

（ＮＯＶ６ｂ）
開示されるＮＯＶ６ｂ核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５０１５９−０２と称される）は、新規リソソーム酸性リパーゼ様タンパク質をコードし、そして表６Ｄに示す１２６７ヌクレオチドの配列（配列番号２９）を含む。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８〜１０のＡＴＧコドンで始まってヌクレオチド１１２６〜１１２８のＴＡＡコドンで終わると同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調する。推定非翻訳領域に下線を付し、そしてこれは、開始コドンの上流および終止コドンの下流に見出される。
【０１９８】
【表６Ｄ】

ＮＯＶ６ｂの核酸配列は、第１７染色体にマッピングされ、そしてＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＮＬＩＰ｜ａｃｃ：Ｘ０２３０９．１ｍＲＮＡ（舌リパーゼについてのラットｍＲＮＡ）に対して同一な５４５塩基（８２０塩基中；６６％）を有する（Ｅ＝２．５ｅ^−７１）。
【０１９９】
ＮＯＶ６ｂポリペプチド（配列番号３０）は３７３アミノ酸残基長であり、そしてこれを１文字アミノ酸コードを用いて表６Ｅに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはハイドロパシーの結果は、ＮＯＶ６ｂが、シグナルペプチドを有して、０．５５００の確実性でリソソーム（内腔）に局在するようであることを推測する。代替の実施形態では、ＮＯＶ６ｂポリペプチドは、０．３７００の確実性で細胞の外側に、０．２９６７の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、または０．１０００の確実性で小胞体（膜）に位置する。ＳｉｇｎａｌＰは、アミノ酸１７位と１８位との間にＮＯＶ６ｂペプチドについてありそうな切断部位（すなわち、配列ＬＮＡ−ＧＧにおけるダッシュ）を推測する。
【０２００】
【表６Ｅ】

ＮＯＶ６ｂのアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の３９９アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ１６５２９タンパク質（リソソームの酸性リパーゼ前駆体）に対して同一な１５２アミノ酸残基（２９７アミノ酸残基中；５１％）および類似な２０１アミノ酸残基（２９７アミノ酸残基中；６７％）を有する（Ｅ＝６．２ｅ^−１０８）。
【０２０１】
（ＮＯＶ６ｃ）
開示されるＮＯＶ６ｃ核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５０１５９−０４と称される）は、新規リソソーム酸性リパーゼ様タンパク質をコードし、そして表６Ｆに示す１１９５ヌクレオチドの配列（配列番号３０）を含む。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８〜１０のＡＴＧコドンで始まってヌクレオチド１１２６〜１１２８のＴＡＡコドンで終わると同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調する。推定非翻訳領域に下線を付し、そしてこれは、開始コドンの上流および終止コドンの下流に見出される。
【０２０２】
【表６Ｆ】

ＮＯＶ６ｃの核酸配列は、第１０染色体にマッピングされ、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ａ０１０４６｜ａｃｃ：Ａ０１０４６．１ｍＲＮＡ（ヒトの胃リパーゼについてのＨ．ｓａｐｉｅｎｓｍＲＮＡ）に対して同一な５５７塩基（８２７塩基中；６７％）を有する（Ｅ＝２．５ｅ^−７１）。
【０２０３】
ＮＯＶ６ｃポリペプチド（配列番号３０）は３４９アミノ酸残基長であり、そしてこれを１文字アミノ酸コードを用いて表６Ｇに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはハイドロパシーの結果は、ＮＯＶ６ｃが、シグナルペプチドを有して、０．８３０６の確実性でリソソーム（内腔）に局在するようであることを推測する。代替の実施形態では、ＮＯＶ６ｃポリペプチドは、０．３７００の確実性で細胞の外側に、０．２９４４の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、または０．１０００の確実性で小胞体（膜）に位置する。ＳｉｇｎａｌＰは、アミノ酸１７位と１８位との間にＮＯＶ６ｂペプチドについてありそうな切断部位（すなわち、配列ＬＮＡ−ＧＧにおけるダッシュ）を推測する。
【０２０４】
【表６Ｇ】

ＮＯＶ６ｃのアミノ酸配列は、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）由来の３９５アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｄ７９８タンパク質（２３１００５１Ｂ２１ＲＩＫタンパク質）に対して同一な１４３アミノ酸残基（２７８アミノ酸残基中；５１％）および類似な１８５アミノ酸残基（２７８アミノ酸残基中；６６％）を有する（Ｅ＝７．２ｅ^−９９）。
【０２０５】
ＮＯＶ６ｃは、少なくとも以下の組織において発現される：プールされた哺乳動物組織。発現情報は、ＮＯＶ６ｃ配列の誘導体化において含まれたこの配列の組織供給源から導かれた。
【０２０６】
ＮＯＶ６ａ、ＮＯＶ６ｂおよびＮＯＶ６ｃは、表６Ｈにおけるアミノ酸のアラインメントにおいて示されるように、非常に緊密に類似している。
【０２０７】
【表６Ｈ】

上記のＮＯＶ６タンパク質のいずれかに対する類似性は、上記に示したようなこれらが互いに類似する範囲で、他のＮＯＶ６タンパク質によって共有され得る。ＮＯＶ６に対する何らかの言及は、そうでないと示されない限り、ＮＯＶ６タンパク質の両方を一般に言及するとみなされる。
【０２０８】
ＮＯＶ６ａはまた、表６Ｉに列挙したＢＬＡＳＴＰデータに示されるようなアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２０９】
【表６Ｉ】

これらの配列の相同性を、表６Ｊに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図として示す。
【０２１０】
【表６Ｊ】

表６Ｋは、ＮＯＶ６に対するドメイン分析の結果からのドメインの説明を列挙する。これは、ＮＯＶ６配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特異性に類似した特性を有することを示す。
【０２１１】
【表６Ｋ】

ＬＩＰＢは、体細胞ハイブリッドの研究（ＶａｎＣｏｎｇら，１９８０）によって第１６染色体に割り当てられた。リソソーム酸性リパーゼ−Ａ（ＬＩＰＡ）は、おそらく対立遺伝子ウォルマン病およびコレステロールエステル貯蔵病において欠損している酵素である。リパーゼＡおよびリパーゼＢの異なった反応速度論的特性および物理的特性が、Ｗａｒｎｅｒら（１９８０）によって規定された。彼らは、ＬＩＰＳについての天然の基質が未知であること、およびＬＩＰＢがリソソームヒドロラーゼであるか明らかでないことを述べた。ＬＩＰＡは、コレステロールを遊離させることによって、細胞代謝において重要な役割を果たし得る。遊離したコレステロールは、さらなるコレステロール合成を抑制し、そして細胞内でのコレステロールのエステル化を刺激する。リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡまたはＬＡＬ）（さもなければ、酸性コレステリルエステルヒドロラーゼとして公知）は、第１０染色体上の遺伝子（ＬＩＰＡ）によってコードされる。
【０２１２】
２つの主な疾患（より重篤な乳児発症ウォルマン病およびより軽度の後期発症コレステリルエステル貯蔵病（ＣＥＳＤ））は、表面上、ＬＩＰＡ遺伝子の異なる部分における変異によって引き起こされる。Ｗｏｌｍａｎら（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ２８：７４２−７５７，１９６１）は、内臓の関与が重要な特徴であり、約３ヶ月齢で死が起こる３つの同胞を記載した。黄色腫変化が、肝臓、副腎、脾臓、リンパ節、骨髄、小腸、肺および胸腺において観察され、そしてわずかな変化が、皮膚、網膜および中枢神経系において見られた。副腎は石灰化した。死は、腸の関与から生じる小腸の吸収不良に起因すると考えられた。親（ペルシャ系ユダヤ人）は、いとこであった。血漿中の脂質は、正常であるか中程度に上昇していた。いくつかの特徴によって、この実体が、高コレステロール血症および高脂血症とは異なることが示唆された（参照のこと）。３つの症例（第一は米国由来）は、Ｃｒｏｃｋｅｒら（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ３５：６２７−６４０，１９６５）によって報告され、Ｃｒｏｃｋｅｒらは、民族性については何の情報も与えなかった。比較的非特異的な臨床像は、乏しい体重増加、嘔吐、下痢、異常な隆起を伴う増大する肝脾腫大、および２〜４ヶ月齢までの栄養欠損による死亡を含む。ニーマン−ピック病（２５７２００）においてのように、泡沫細胞は、骨髄において見出され、そして空胞のあるリンパ球は末梢血に見出される。副腎のびまん性斑点状カルシウム化は代表的である。播種性泡沫細胞浸潤が、多くの器官のいて見出される。コレステロールの大きな増大が器官において見出される。Ｋｏｎｎｏら（ＴｏｈｏｋｕＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９０：３７５−３８９，１９９６）は、３人の罹患同胞を有する日本人家族を報告した。Ｓｐｉｅｇｅｌ−Ａｄｏｌｆら（Ｃｏｎｆｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２８：３９９−４０６，１９６６）は、アメリカ人家族における３人の罹患同胞を報告した。
【０２１３】
ＰａｔｒｉｃｋおよびＬａｋｅ（Ｎａｔｕｒｅ２２２：１０６７−１０６８，１９６９）は、罹患者の組織中のリソソームにおいてトリグリセリドおよびコレステロールエステルの進行性蓄積を明らかにもたらす、酸性リパーゼ（コレステリルエステルヒドロラーゼ；ＥＣ３．１．１．１３）欠損を実証した。Ｌｏｕｇｈら（Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈ．８９：１０３−１１０，１９７０）は、カルシウム化副腎が生後５日目に実証されるギリシャ人家系の罹患した乳児を記載した。ＹｏｕｎｇおよびＰａｔｒｉｃｋ（Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．４５：６６４−６６８，１９７０）は、急性乳児形態においてと同じ生化学的変化および組織学的変化を有するが、発症がより遅く、劇症経過がずっと少ない、症例の経験についてコメントした。彼らの症例の１つは、８歳まで生存して良好であり、このことは、中程度の肝腫以外には臨床的異常がないことを示した。この同じ酵素は、全ての症例において欠損している。それゆえ、彼らは、全体のグループについて用語「酸性リパーゼ不全」を示唆し、ウォルマン病を急性乳児形態についての名称とすることを示唆した。ＢｕｒｔｏｎおよびＲｅｅｄ（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３３：２０３−２０８，１９８１）は、３人のウォルマン病患者および３人のコレステロールエステル貯蔵病患者の線維芽細胞中の、酸性リパーゼに対する抗体と交叉反応する物質を実証した。ＣＲＭの定量は、両方の細胞型における正常なレベルを示した。酵素活性は、ウォルマン病線維芽細胞において約２００倍減少し、そしてコレステロールエステル貯蔵病細胞において５０倍〜１００倍減少した。おそらく、コレステロールエステル貯蔵病は、ウォルマン病に対して対立遺伝子的な障害である（ＡｓｓｍａｎｎおよびＦｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ：Ａｃｉｄｌｉｐａｓｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｗｏｌｍａｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅａｎｄｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌｅｓｔｅｒｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｅａｓｅ），Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ｊ．Ｂ．；Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．；ＭｅｔａｂｏｌｉｃＢａｓｉｓｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄＤｉｓｅａｓｅ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（出版社）（第５版）１９８３．８０３−８１９頁）が、細胞融合研究のような実験は、発明者の知るところでは、この事実を確立するためには行われていない。ウォルマン病およびコレステリルエスエル貯蔵病の対立遺伝子的性質を支持するのは、可能な遺伝的複合物、すなわち、中間の重篤度の症例の出現である（ＳｃｈｍｉｔｚおよびＡｓｓｍａｎｎ：Ａｃｉｄｌｉｐａｓｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｗｏｌｍａｎｄｉｓｅａｓｅａｎｄｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌｅｓｔｅｒｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．；Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．；Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．；Ｖａｌｌｅ，Ｄ．：ＴｈｅＭｅｔａｂｏｌｉｃＢａｓｉｓｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄＤｉｓｅａｓｅ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（出版社）（第６版）１９８９．１６２３−１６４４頁）。
【０２１４】
ウォルマン病およびコレステリルエスエル貯蔵病の両方において、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら（Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３６０−３６８，１９８６）は、尿中に脱落した腎臓の尿細管細胞が、コレステリルエステルおよびトリアシルグリセロールを持っていること、ならびにＬＩＰＡがこれらの細胞で欠けていることを実証した。ＹｏｓｈｉｄａおよびＫｕｒｉｙａｍａ（Ｌａｂ．ＡｎｉｍａｌＳｃｉ．４０：４８６−４８９，１９９０）は、ラットにおけるリソソーム酸性リパーゼ欠損を記載した。Ｒｏｙｔｔａら（Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．４２：１−７，１９９２）は、オーランド諸島における罹患した１ヶ月齢の少女の症例（ウォルマン病の最初に公開されたスカンジナビア人例）を報告した。皮膚生検によって、１９５０年代の間に約３ヶ月齢で死亡したオーランド諸島の２人の同胞において見られた細胞質蓄積と同一の細胞質蓄積が示された。家系学的分析によって、２つの家族が、１７世紀の間の同じ制限された地域由来の先祖および共通の先祖を有することが示された。罹患した２人の同胞の親は、小さな島で生まれ、そして「多くの異なる方法で」互いに関連付けられた。Ｓｃｈｉｆｆら（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．４４：５３８−５４６，１９６８）は、１０代の兄弟および姉妹（彼らの肝臓は色がオレンジ色であった）における肝臓におけるコレステロールエステル貯蔵病を記載した。４人のより若い同胞は、より軽度の変化を示した。親は、関連することは知られていなかった。コレステロールエステルおよびトリグリセリドの組織蓄積は、この疾患およびウォルマン病の両方において生じる。化学的異常および酵素的異常は類似する。表現型的発現における顕著な差異は、説明されないが、ハーラー症候群とシャイエ症候群との間、乳児後期型異染性白質萎縮と成人型異染性白質萎縮との間、および古典的形態（Ａ型）のニーマン−ピック病と内臓形態（Ｂ型）のニーマン−ピック病との間の差異に匹敵する。これらの各々は、おそらく、一対の対立遺伝子障害である。
【０２１５】
ウォルマン病とは対照的に、コレステロールエステル貯蔵病は比較的良性である；しかし、１組の兄弟姉妹において、３人の姉妹は、急性肝不全によって、７歳、９歳および１７歳で死亡した（Ｂｅａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔ．９０：９１０−９１４，１９７７）。動脈にける中性脂肪およびコレステロールエステルの蓄積は、罹患者をアテローム性動脈硬化に罹患しやすくする。高コレステロール血症は、普通である。大肝腫および肝臓線維症は、食道静脈瘤をもたらし得る。ウォルマン病およびこの障害の両方において欠損している酵素である、リソソーム酸性リパーゼＡは、３つの酸性リパーゼアイソザイムのうちの１つである。リパーゼＢおよびリパーゼＣの役割は未知である。Ｂｅｓｌｅｙら（Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６：１９５−２０３，１９８４）は、アイルランドにおいて観察された最初の患者を報告した。次いで、肝腫および骨髄にシーブルー組織球を有する３９歳で、この患者は、２１歳から、全身の倦怠感および下痢の再発期間に罹っている。Ｄｅｓａｉら（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２６：６８９−６９８，１９８７）は、危険性のある胎児由来の培養羊膜細胞（ａｍｎｉｏｃｙｔｅ）において欠損したリソソーム酸性リパーゼ活性の実証によって、この障害の出生前診断を行った。１７週目の罹患した胎児におけるこの知見は、記載された。大リソソームコレステロールおよび脂質蓄積は、胎児の肝臓細胞、副腎細胞および合胞体層において実証された。特に注目されたのは、胎児副腎における広範囲の壊死の知見であった。副腎の壊死は、これらの患者において後に観察されたカルシウム化に先行し得る。Ｃａｇｌｅら（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２４：７１１−７２２，１９８６）は、ＣＥＳＤを有する患者は、肺高血圧症を発症する危険性があると結論した。このようなことは、１８歳で死亡した１５歳の患者において認められていた。ＤｉＢｉｓｃｅｇｌｉｅら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１１：７６４−７７２，１９９０）は、血清リポタンパク質濃度にも肝臓の組織病理にも、ロバスタチン（コレステロール低化剤）での処置の１２ヶ月以上後まで顕著な変化が見られないことを実証し得た。ＹｏｋｏｙａｍａおよびＭｃＣｏｙ（Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．１５：２９１−２９２，１９９２）は、組み合わせたコレスチラミンおよびロバスタチン治療を用いて何らかの改善を観察した。Ｋｏｃｈら（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．ＣｅｌｌＧｅｎｅｔ．２５：１７４，１９７９；Ｓｏｍａｔ．ＣｅｌｌＧｅｎｅｔ．７：３４５−３５８，１９８１）は、リソソーム酸性リパーゼＡを、ヒト−チャイニーズハムスター体細胞ハイブリッドによって、第１０染色体に割り当てた。ＧＯＴ１（１３８１８０）との密接な一致から判断して、これらの遺伝子座は、１０の長腕に共に近接し得る。リパーゼＡは、マウスにおいて第１９染色体によってコードされる（Ｋｏｃｈら，１９８１）。
【０２１６】
可溶性グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（１３８１８０）はまた、ヒトにおいて第１０ｑ染色体に、そしてマウスにおいて１９に存在する。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによって、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１５：２４５−２４７，１９９３）は、ＬＩＰＡ遺伝子座を１０ｑ２３．２−ｑ．２３．３にマッピングした。これは、１０ｑ２６．１での膵臓リパーゼ（２４６６００）についての遺伝子座とは明らかに別個であった。ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＳａｎｄｏ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２４７９−２２４８４，１９９１）は、２．６ｋｂのｃＤＮＡヌクレオチド配列から推定されたＬＡＬのアミノ酸配列が、ヒトの胃リパーゼ（これは、摂取されたトリグリセリドの十二指腸前分解に関与する）のアミノ酸配列と５８％同一であることを報告した。Ａｓｌａｎｉｄｉｓら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２０：３２９−３３１，１９９４）は、各エキソンにハイブリダイズするゲノムＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩフラグメントの大きさと一緒に、ＬＩＰＡ遺伝子（これは、１０個のエキソンからなる）のエキソン構造をまとめた。推定プロモーター領域のＤＮＡ配列が提示された。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：２７１８−２７２２，１９９４）は、ＬＩＰＡについての遺伝子を単離して配列決定した。彼らは、これが、ゲノムＤＮＡの３６ｋｂにわたって広がっていることを見出した。５−プライム隣接領域はＧＣリッチであり、そして「ハウスキーピング」遺伝子のプロモーターの特徴を有する。Ａｓｌａｎｉｄｉｓら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３３：８５−９３，１９９６）は、著しくより重篤な経過のウォルマン病が、残りの酵素活性が全くないＬＡＬの遺伝欠損によって引き起こされるという証拠を提供した。ＣＥＳＤ患者では、エキソン８スプライスドナー部位の−１位でのＧからＡへのトランジションが、この対立遺伝子から生じるｍＲＮＡの９７％においてエキソン８のスキップをもたらし、一方、３％が正確にスプライスされて全長ＬＡＬ酵素となった。
【０２１７】
Ｐａｇａｎｉら（Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．５：１６１１−１６１７，１９９６）は、３人の患者におけるＣＥＳＤの分子的基礎を記載した。彼らは、ＬＡＬｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの配列分析によって変異を同定した。この疾患の直接的原因としての変異の役割は、ＬＡＬ変異体でトランスフェクトした細胞由来の抽出物のＬＡＬ酵素活性を測定することによって確認された。３人のＣＥＳＤ患者は、複合ヘテロ接合体であることが見出された。Ｐａｇａｎｉら（１９９６）は、３つの異なるミスセンス変異、２つのスプライシング欠損およびｎｕｌｌ対立遺伝子を同定した。Ｄｕら（Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３４７−１３５４，１９９８）は、マウス遺伝子の破壊を標的化することにより生成されたｎｕｌｌ変異によるリソソーム酸性リパーゼ欠損のマウスモデルを生成した。ホモ接合体ノックアウトマウスは、Ｌｉｐ１のｍＲＮＡも、タンパク質も、酵素活性も生じなかった。このホモ接合性欠損マウスは、メンデル比で生まれ、誕生時は正常なようであり、そして成体への正常な発生に従った。しかし、トリグリセリドおよびコレステリルエステルの大蓄積は、いくつかの器官において生じた。２１日目までに、肝臓は、黄色から橙色を表し、そして正常より２倍まで大きくなった。蓄積したコレステリルエステルおよびトリグリセリドは、正常よりも約３０倍高かった。ヘテロ接合性マウスは、正常の約５０％の酵素活性を有し、そして脂質蓄積を示さなかった。雄性および雌性のホモ接合性欠損マウスは受精能があり、そして交配して子孫を生じ得た。このマウスモデルは、ヒトＣＥＳＤの表現型モデルであり、そしてヒトのウォルマン病の生化学的および組織病理学的模倣物である。対立遺伝子改変体（選択された例）。０００１コレステリルエステル貯蔵病［ＬＩＰＡ，ＬＥＵ１７９ＰＲＯ］。
【０２１８】
ＣＥＳＤに罹患した２人の小児がいる家族において、ＭａｓｌｅｎおよびＩｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ（ｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５３（補遺）：Ａ９２６，１９９３）は、父から遺伝した対立遺伝子における、アミノ酸２５４−２７７に対応する、７２ｂｐの欠失、および母から遺伝した対立遺伝子における、１７９位のロイシンについてのプロリンの置換をもたらす、６３９位でのＴからＣへのトランジションについての複合ヘテロ接合性を見出した。０００６ウォルマン病［ＬＩＰＡ，ＴＹＲ２２ＴＥＲ］。ウォルマン病を有する日本人患者においては、Ｆｕｊｉｙａｍａら（Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．８：３７７−３８０，１９９６）は、ＬＩＰＡ遺伝子のｔｙｒ２２からｔｅｒへの変異を同定した。この女性患者は、出生時に臍帯ヘルニア形成を有した。生後約３０日目に、この患者は、肝脾腫大ならびに下痢および嘔吐の頻繁なエピソードを伴う、腹部膨満を示した。腹部コンピュータ連動断層撮影は、大肝脾腫大およびカルシウム化を伴う副腎の腫脹を明らかにした。貧血および肝不全は、迅速に進行し、そしてこの患者は、１１４日目に死亡した。これらの患者は、いとこであった。姉は、類似の症状で生後８０日目に死亡した。
【０２１９】
本明細書中に開示されたＮＯＶ６のタンパク質および核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、細胞局在およびマップの位置は、ＮＯＶ６のリソソーム酸性リパーゼ様タンパク質が、リソソーム酸性リパーゼファミリーに特有の重要な構造的機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。それゆえ、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断および治療適用において、ならびに研究ツールとして有用である。これらとしては、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことが挙げられ、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらとしてはまた、以下のような潜在的治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する薬剤、ならびに（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０２２０】
本発明の核酸およびタンパク質は、種々の疾患および障害の診断および／または処置において適用を有する。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：重篤な乳児発症ウォルマン病およびより軽度の後期発症コレステリルエステル貯蔵病（ＣＥＳＤ）、肥満、糖尿病、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）症候群、および膵炎、ならびに他の疾患、障害および状態。本発明のポリドーム（ｐｏｌｙｄｏｍ）様タンパク質をコードする新規核酸またはそのフラグメントは、診断適用において有用であり、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。
【０２２１】
これらの物質は、治療方法または診断方法において使用するための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ６タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態では、意図されるＮＯＶ６エピトープは、約アミノ酸４０〜６０である。別の実施形態では、意図されるＮＯＶ６エピトープは、約アミノ酸７０〜８０である。他の特定の実施形態では、意図されるＮＯＶ６エピトープは、約アミノ酸９０〜９５、１１０〜１４０、１５０〜１５２、１５５〜１５７、２４０〜２５０、２７０〜２８０、３１０〜３１５および３２０〜３２５である。
【０２２２】
（ＮＯＶ７）
開示されるＮＯＶ７核酸（あるいは、本明細書中でＣＧ５６１４０−０１といわれる）は、新規トリプターゼ−４様タンパク質をコードし、そして表７Ａに示す１６０８ヌクレオチドの配列（配列番号３３）を含む。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧコドンで始まってヌクレオチド１２７９〜１２８１のＴＧＡコドンで終わると同定された。表７Ａにおいて推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０２２３】
【表７Ａ】

ＮＯＶ７の核酸配列は、第１６染色体にマッピングされ、そしてこの発明は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０３１３２９｜ａｃｃ：ＡＢ０３１３２９．１ｍＲＮＡ（好塩基性セリンプロテアーゼについてのＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｅｓｐ−１ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して同一な５８７塩基（８５３塩基中；６８％）を有する（Ｅ＝５．７ｅ^−５８）。
【０２２４】
ＮＯＶ７ポリペプチド（配列番号３４）は４２６アミノ酸残基長であり、そしてこれを１文字アミノ酸コードを用いて表７Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはハイドロパシーの結果は、ＮＯＶ７が、シグナルペプチドを有して、０．５５００の確実性でリソソーム（内腔）に局在するようであることを推測する。代替の実施形態では、ＮＯＶ７ポリペプチドは、０．３７００の確実性で細胞の外側に、０．１９００の確実性で原形質膜に、または０．１０００の確実性で小胞体（膜）に位置する。ＳｉｇｎａｌＰは、アミノ酸１９位と２０位との間にＮＯＶ７ペプチドについてありそうな切断部位（すなわち、配列ＧＬＧ−ＫＰにおけるダッシュ）を推測する。
【０２２５】
【表７Ｂ】

ＮＯＶ７のアミノ酸配列は、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）由来の３０５アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＪＨＪ７タンパク質（トリプターゼ４）に対して同一な１０５アミノ酸残基（１９９アミノ酸残基中；５２％）および類似な１４０アミノ酸残基（１９９アミノ酸残基中；７０％）を有する（Ｅ＝６．５ｅ^−７３）。
【０２２６】
ＮＯＶ７は、少なくとも以下の組織で発現される：膵臓。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、ＰｕｂｌｉｃＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ供給源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明において含まれた配列の組織供給源を決定することによって導かれた。
【０２２７】
ＮＯＶ７はまた、表７Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２２８】
【表７Ｃ】

これらの配列の相同性を、表７Ｄに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図として示す。
【０２２９】
【表７Ｄ】

表７Ｅおよび表７Ｆは、ＮＯＶ７に対するドメイン分析の結果からのドメインの説明を記載する。これは、ＮＯＶ７配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似した特性を有することを示す。
【０２３０】
【表７Ｅ】

【０２３１】
【表７Ｆ】

ヒトトリプターゼは、構造的に独特でかつ肥満細胞特異的なトリプシン様セリンプロテアーゼである。近年の生物学的調査および免疫学的調査は、トリプターゼを、多数のアレルギー状態および炎症状態（鼻炎、結膜炎および最も顕著な喘息を含む）の病因の媒介因子と推定した。増え続ける一連のデータによってさらに、トリプターゼは、特定の胃腸障害、皮膚障害および心臓血管障害にも推定された。とはいえ、強力および選択的なトリプターゼインヒビターが近年入手可能であるので、重要な治療標的としてもこのプロテアーゼの確認が促進されている。本明細書では、本発明者らは、４つのクラスの選択的トリプターゼインヒビターの設計および効力を記載する。これらの選択的プロテアーゼのうちの、最初の３つの型は、合成物であり、そして４つ目は、天然起源のものである：１）ペプチド性インヒビター（例えば、ＡＰＣ−３６６）、２）二塩基性インヒビター（すなわち、ペンタミジン様）、３）Ｚｎ（２＋）媒介インヒビター（すなわち、ＢＡＢＩＭ様）、および４）ヘパリンアンタゴニスト（例えば、ラクトフェリン）。これらのインヒビターは、アレルギーヒツジの気道および皮膚において試験されている。アレルゲンチャレンジの３０分前、ならびに４時間後および２４時間後の、各構造クラス由来のトリプターゼインヒビターのエアゾール投与は、用量応答様式で、後期相気管支収縮および気道過反応をなくす。さらに、ＡＰＣ−３６６の皮内注射は、抗原に対する皮膚応答をブロックする。これらの研究は、喘息およびおそらく他のアレルギー性疾患の処置に関するトリプターゼインヒビターのさらなる研究についての必須の概念証明を提供する。喘息の処置について現在第ＩＩ相試験にある、第一世代トリプターゼインヒビターＡＰＣ−３６６を用いた臨床研究からの結果は、この疾患におけるトリプターゼの病理学的役割についてのさらなる支持を提供する。ＡｘｙｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．でのトリプターゼインヒビター設計の領域における顕著な進歩としては、新規な亜鉛媒介セリンプロテアーゼインヒビター技術（本明細書中に記載される）および独特のクラスの極めて強力かつ選択的な二塩基性トリプターゼインヒビターが見出されたことが挙げられる。独立して、４−アミジノフェニルピルビン酸と複合体化した、活性なトリプターゼテトラマーのＸ線結晶構造が報告されている。これらの知見は、構造的に新規なトリプターゼインヒビターの設計ならびに肥満細胞トリプターゼ媒介障害の処置のための新規な薬物の開発をさらに加速すると予想される。
【０２３２】
本明細書中に開示されるＮＯＶ７のタンパク質および核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップの位置は、これが、セリンプロテアーゼファミリーに特有の重要な構造的および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。それゆえ、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断適用および治療適用において、ならびに調査ツールとして有用である。これらとしては、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとしての役割（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである）、ならびに、例えば以下の潜在的治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０２３３】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理に関与する、潜在的診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：糖尿病、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心不全、大動脈狭窄、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化、強皮症、移植、受精能、子宮内膜症、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、ならびに他の同様の疾患、障害および状態。
【０２３４】
本発明の新規なトリプターゼ−４タンパク質をコードする新規な核酸またはそのフラグメントは、診断適用において有用であり、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ７タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態では、意図されるＮＯＶ７エピトープは、約アミノ酸１０〜１５である。別の実施形態では、意図されるＮＯＶ７エピトープは、約アミノ酸２０〜２５である。他の特定の実施形態では、意図されるＮＯＶ７エピトープは、約アミノ酸４０〜６０、７０〜８０、８０〜８５、１２０〜１６０、１８０〜２００、２２０〜２６０、２８０〜３００、３４０〜３６０および４２０〜４３０である。
【０２３５】
（ＮＯＶ８）
開示されるＮＯＶ８核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６１３４−０１と称される）は、新規Ｐ４５０様タンパク質をコードし、そして表８Ａに示す１５３９ヌクレオチドの配列（配列番号３５）を含む。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧコドンで始まってヌクレオチド１５３７〜１５３９のＴＡＡコドンで終わると同定された。開始コドンおよび終止コドンは、表８Ａにおいて太字である。
【０２３６】
【表８Ａ】

ＮＯＶ８の核酸配列は、第４染色体にマッピングされ、そしてＴｒｉｂｏｌｉｕｍｃａｓｔａｎｅｕｍ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ２５１５４８｜ａｃｃ：ＡＦ２５１５４８．１ｍＲＮＡ（ＴｒｉｂｏｌｉｕｍｃａｓｔａｎｅｕｍシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ４Ｑ４（ＣＹＰ４Ｑ４）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して同一な１５８塩基（２５２塩基中；６２％）を有する（Ｅ＝１．５ｅ^−０６）。
【０２３７】
ＮＯＶ８ポリペプチド（配列番号３６）は５１２アミノ酸残基長であり、そしてこれを１文字アミノ酸コードを用いて表８Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはハイドロパシーの結果は、ＮＯＶ８が、シグナルペプチドを有して、０．６０００の確実性で原形質膜に局在するようであることを推測する。代替の実施形態では、ＮＯＶ８ポリペプチドは、０．４０００の確実性でゴルジ体に、０．３１３１の確実性でミトコンドリア内膜腔に、または０．３０００の確実性で小胞体（膜）に位置する。ＳｉｇｎａｌＰは、アミノ酸３９位と４０位との間にＮＯＶ８ペプチドについてありそうな切断部位（すなわち、配列ＶＡＳ−ＹＡにおけるダッシュ）を推測する。
【０２３８】
【表８Ｂ】

ＮＯＶ８のアミノ酸配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）由来の５３５アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ９ＶＡ２７タンパク質（シトクロムＰ４５０４Ｃ３（ＥＣ１．１４．−．−）（ＣＹＰＩＶＣ３））に対して同一な５７アミノ酸残基（１３１アミノ酸残基中；４３％）および類似な７７アミノ酸残基（１３１アミノ酸残基中；５８％）を有する（Ｅ＝１．６ｅ^−４０）。
【０２３９】
ＮＯＶ８は、少なくとも以下の組織において発現される：肝臓、肺。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、ＰｕｂｌｉｃＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ供給源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明において含まれた配列の組織供給源を決定することによって導かれた。
【０２４０】
ＮＯＶ８はまた、表８Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２４１】
【表８Ｃ】

これらの配列の相同性を、表８Ｄに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図として示す。
【０２４２】
【表８Ｄ】

Ｐ４５０遺伝子スーパーファミリーは、生物学的に多様なクラスのオキシダーゼ酵素である；このクラスのメンバーは、全ての生物に見出される。Ｐ４５０タンパク質は、ヒトにおいて臨床的および毒物学的に重要である；これらは、薬物および生物異物化合物の代謝、ならびにコレステロール、ステロイドおよび他の脂質の合成において主な酵素である。いくつかのＰ４５０遺伝子の誘導はまた、いくつかの型の癌についての危険因子であり得る。この多様な機能は、ヌクレオチド配列およびタンパク質配列の多様性に反映される；現在、１００を超えるヒトＰ４５０形態が記載されている。対立遺伝子形態の多くのシトクロムＰ４５０遺伝子は、定量的に異なる速度の薬物代謝を引き起こすと同定されており、それゆえ、安全かつ有効なヒトの薬学的治療剤の開発を考慮する際に重要である。［Ｅ．Ｔａｎａｋａ，ＪＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２４：３２３−３２９，１９９９に概説される］。
【０２４３】
本明細書中に開示されるＮＯＶ８のタンパク質および核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップの位置は、これが、Ｐ４５０ファミリーに特有の重要な構造的および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。それゆえ、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断適用および治療適用において、ならびに調査ツールとして有用である。これらとしては、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとしての役割（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである）、ならびに、例えば以下の潜在的治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、ならびに（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０２４４】
本発明のＰ４５０様タンパク質をコードする新規な核酸またはそのフラグメントは、診断適用において有用であり、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ８タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態では、意図されるＮＯＶ８エピトープは、約アミノ酸２０〜２５である。別の実施形態では、意図されるＮＯＶ８エピトープは、約アミノ酸８０〜８５である。他の特定の実施形態では、意図されるＮＯＶ８エピトープは、約アミノ酸１１０〜１１５、１４０〜１４５、２０２〜２０５、２２０〜３２０、３３０〜３３５、３８０〜４０５、４２０〜４２５および４９０〜５００である。
【０２４５】
（ＮＯＶ９）
開示されるＮＯＶ９核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２０７−０１と称される）は、新規ミツグミン（ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ）２９様タンパク質をコードし、そして表９Ａに示す８１３ヌクレオチドの配列（配列番号３７）を含む。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１で始まってヌクレオチド８０５〜８０７のＴＡＡコドンで終わると同定された。終止コドンの下流の推定非翻訳領域に表９Ａにおいて下線を付し、そして終止コドンは太字である。
【０２４６】
【表９Ａ】

ＮＯＶ９の核酸配列は、第３染色体にマッピングされ、そしてＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ００４８１６｜ａｃｃ：ＡＢ００４８１６．１ｍＲＮＡ（ミツグミン２９についてのＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して同一な６０６塩基（６７６塩基中；８９％）を有する（Ｅ＝２．０ｅ^−１１６）。
【０２４７】
ＮＯＶ９ポリペプチド（配列番号３７）は２６８アミノ酸残基長であり、そしてこれを１文字アミノ酸コードを用いて表９Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはハイドロパシーの結果は、ＮＯＶ９が、シグナルペプチドを有して、０．６０００の確実性で原形質膜に局在するようであることを推測する。代替の実施形態では、ＮＯＶ９ポリペプチドは、０．４０００の確実性でゴルジ体に、０．３０００の確実性で小胞体（膜）に、または０．３０００の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に位置する。ＳｉｇｎａｌＰは、アミノ酸５０位と５１位との間にＮＯＶ９ペプチドについてありそうな切断部位（すなわち、配列ＳＣＧ−ＳＹにおけるダッシュ）を推測する。
【０２４８】
【表９Ｂ】

ＮＯＶ９のアミノ酸配列は、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ウサギ）由来の２６４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ６２６４６タンパク質（ミツグミン２９）に対して同一な２２３アミノ酸残基（２６８アミノ酸残基中；８３％）および類似な２３５アミノ酸残基（２６８アミノ酸残基中；８７％）を有する（Ｅ＝７．９ｅ^−１１５）。
【０２４９】
ＮＯＶ９は、少なくとも以下の組織で発現される：脳、骨格筋、心臓。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、ＰｕｂｌｉｃＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ供給源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明において含まれた配列の組織供給源を決定することによって導かれた。
【０２５０】
ＮＯＶ９についての見出された可能な小さなヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を表９Ｃに列挙する。
【０２５１】
【表９Ｃ】

ＮＯＶ９はまた、表９Ｄに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２５２】
【表９Ｄ】

これらの配列の相同性を、表９Ｅに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図として示す。
【０２５３】
【表９Ｅ】

シナプトフィシンおよびシナプトポーリン（ｓｙｎａｐｔｏｐｏｒｉｎ）は、関連する糖タンパク質である；これらは、特定のクラスの小さな神経分泌小胞の主な内在性膜タンパク質であるが、これらはまた、種々の非内分泌細胞においても見出され得る［１，２］。このポリペプチド鎖は、膜を４回貫通し、そしておそらく、イオンまたは溶媒のチャネルとして作用する。
【０２５４】
近年、骨格筋中の三つ組連結部に独特のミツグミン２９は、シナプトフィシンファミリーの新規メンバーとして同定された；このファミリーのメンバーは、４つの膜貫通セグメントのメンバーであり、そして細胞内小胞に分布する。マウスミツグミン２９のｃＤＮＡおよびこの遺伝子を含むゲノムＤＮＡは、単離されて分析されている。ミツグミン２９位は、エキソン−イントロン構成においてシナプトフィシン遺伝子に密接に関連するマウスの第３染色体Ｆ３−Ｈ２にマッピングされており、このことは、これらが、分子進化において密接な関連にあることを示す。ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションおよび免疫ブロット分析によって、ミツグミン２９が、骨格筋において豊富に発現され、そして腎臓においてより低いレベルで発現されることが明らかになった。免疫蛍光顕微鏡法によって、ミツグミン２９が、腎臓の近位細管細胞および遠位細管細胞の細胞質領域に特異的に存在することが実証された。得られた結果は、ミツグミン２９が、骨格筋および腎臓の細管細胞における特化した小胞体系の形成に関与することを示唆し得る。
【０２５５】
骨格筋では、興奮−収縮（Ｅ−Ｃ）カップリングは、陥入した表面膜（すなわち、横行（Ｔ型）細管）の分極シグナルの、筋小胞体（ＳＲ）からのＣａ２＋放出への変換を必要とする。シグナル伝達は、Ｔ型の細管とＳＲとの間の連結複合体（三つ組連結部と称される）で生じる。この連結複合体は、Ｅ−Ｃカップリングに必須の２つの成分（すなわち、Ｔ型の細管電圧センサーとしてのジヒドロピリジンレセプターおよびＳＲＣａ２＋放出チャネルとしてのリアノジンレセプター）を含む。しかし、この２つのレセプターの機能的発現は、培養細胞において、シグナル伝達系も、表面膜と細胞内膜との間の連結部も構成しないようであり、このことは、未だ未知のいくつかの分子が両方の機構に関与することを示唆した。さらに、三つ組連結部の形成の分子的基礎は、全体として未知である。それゆえ、この三つ組連結部に局在する成分を調べることが重要である。それゆえ、本発明者らは、骨格筋中の三つ組連結部由来の新規膜貫通タンパク質であるミツグミン２９の、モノクローナル抗体を用いた同定およびｃＤＮＡクローニングによる一次構造を報告する。このタンパク質は、シナプトフィシンファミリーのメンバーとアミノ酸配列が相同であり、そして特徴的構造特性を共有する。細胞内分布およびタンパク質構造は、ミツグミン２９が、Ｔ型の細管と連結部のＳＲ膜との連絡に関与することを示唆する。
【０２５６】
４つの膜貫通セグメントを有し、そして細胞内膜（シナプス小胞を含む）に基本的に分布する、シナプトフィシンファミリーのメンバーの生理学的役割は、今だに確立されていない。近年、ミツグミン２９（ＭＧ２９）は、骨格筋由来のシナプトフィシンファミリーの新規メンバーと同定された。ＭＧ２９は、細胞表面横行（Ｔ型）細管と筋小体（ＳＲ）との間の連結部膜複合体（三つ組連結部と呼ばれる）に発現され、ここで、脱分極シグナルが、ＳＲからのＣａ（２＋）放出へと変換される。この研究において、本発明者らは、ノックアウトマウスを作製することによって、ＭＧ２９の生物学的機能を調べた。ＭＧ２９欠損マウスは、正常な健康および生殖を示したが、体重がわずかに減少していた。三つ組連結部の膜の超微細構造異常（すなわち、膨張したＴ型細管、不規則なＳＲ構造および三つ組連結部の部分的誤形成）が、変異体マウス由来の骨格筋において検出された。変異体の筋肉では、明らかに正常な持続性筋強直緊張が観察され、一方、単収縮緊張はわずかに減少した。さらに、変異体筋肉は、Ｃａ（２＋）が存在しない条件下での単収縮緊張のより速い減少を示した。変異体筋肉の形態学的異常および機能的異常は、互いに関連するようであり、そしてＭＧ２９が膜構造の微妙な点および骨格筋三つ組連結部における有効な興奮−収縮カップリングの両方に必須であることを示す。本発明者らの結果はさらに、細胞表面と細胞内膜との間の連結部複合体の正確な形成におけるシナプトフィシンファミリーのメンバーとしてのＭＧ２９の役割を示す。
【０２５７】
本明細書中に開示されるＮＯＶ９のタンパク質および核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップの位置は、これが、ミツグミン２９ファミリーに特有の重要な構造的および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。それゆえ、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断適用および治療適用において、ならびに調査ツールとして有用である。これらとしては、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとしての役割（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである）、ならびに例えば以下の潜在的治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０２５８】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理に関与する、潜在的診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：ヴィスコット−オールドリッチ症候群、オールドリッチ症候群、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）−血小板減少−免疫不全症候群、血小板減少、夜盲、筋萎縮性側索硬化症、バッテン病、セロイド脂褐素症、レット症候群、ピック病（葉萎縮）、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠損、大動脈狭窄、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化、硬皮症、肥満、移植、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、癲癇、レッシュ−ノイハン症候群、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質萎縮、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、ならびに他の同様の疾患、障害および状態。本発明の核酸およびタンパク質は、以下の種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理に関与する、潜在的診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：糖尿病、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠損、大動脈狭窄、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化、硬皮症、移植、受精能、子宮内膜症、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、ならびに他の同様の疾患、障害および状態。
【０２５９】
本発明のミツグミン２９タンパク質をコードする新規な核酸、またはそのフラグメントは、診断適用において有用であり、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの物質は、治療方法または診断方法において使用するための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ９タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態では、意図されるＮＯＶ９エピトープは、約アミノ酸２０〜２５である。別の実施形態では、意図されるＮＯＶ９エピトープは、約アミノ酸３０〜３５である。他の特定の実施形態では、意図されるＮＯＶ９エピトープは、約アミノ酸６０〜６５、７５〜１０５、１４５〜１５５、１７０〜１７５、１８０〜１８５および２４０〜２６０である。
【０２６０】
（ＮＯＶ１０）
開示されるＮＯＶ１０核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６１２７−０１と称される）は、新規なマイクロモル濃度のカルシウムで活性化される中性プロテアーゼ１様タンパク質をコードし、そして表１０Ａに示す２５４２ヌクレオチドの配列（配列番号３９）を含む。成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２６０〜２６２のＡＴＧコドンで始まってヌクレオチド２３１８〜２３２０のＴＡＡコドンで終わると同定された。表１０Ａにおいては、終止コドンの下流の推定非翻訳領域および開始コドンの上流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンは太字である。
【０２６１】
【表１０Ａ】

ＮＯＶ１０の核酸配列は、第２染色体にマッピングされ、そしてＢｏｓｔａｕｒｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ２２１１２９｜ａｃｃ：ＡＦ２２１１２９．１ｍＲＮＡ（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓのマイクロモル濃度のカルシウム依存性中性プロテアーゼラージサブユニット（ＣＡＰＮ１）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して同一な５７４塩基（９０９塩基中；６３％）を有する（Ｅ＝１．４ｅ^−３１）。
【０２６２】
ＮＯＶ１０ポリペプチド（配列番号３９）は６８６アミノ酸残基長であり、そしてこれを１文字アミノ酸コードを用いて表１０Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはハイドロパシーの結果は、ＮＯＶ１０が、０．７４８０の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在するようであることを推測する。代替の実施形態では、ＮＯＶ１０ポリペプチドは、０．７０００の確実性で原形質膜に、０．２０００の確実性で小胞体（内腔）に、または０．１０００の確実性でミトコンドリア内膜に位置する。
【０２６３】
【表１０Ｂ】

ＮＯＶ１０のアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）由来の７０３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ６４６９８タンパク質（カルパイン、ラージ（触媒）サブユニット（ＥＣ３．４．２２．１．７）（カルシウム活性化中性プロテイナーゼ）（ＣＡＮＰ）（胃特異的カルシウム活性化中性プロテアーゼラージサブユニット）（ＮＣＬ２））に対して同一な１９４アミノ酸残基（５０３アミノ酸残基中；３８％）および類似な２５８アミノ酸残基（５０３アミノ酸残基中；５１％）を有する（Ｅ＝７．２ｅ^−８０）。
【０２６４】
ＮＯＶ１０は、少なくとも以下の組織において発現される：膵臓、結腸、皮膚、肺、胸部、子宮、胎盤、リンパ、白血球搬出、眼および骨髄。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、ＰｕｂｌｉｃＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ供給源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明において含まれた配列の組織供給源を決定することによって導かれた。
【０２６５】
ＮＯＶ１０はまた、表１０Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２６６】
【表１０Ｃ】

これらの配列の相同性を、表１０Ｄに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図として示す。
【０２６７】
【表１０Ｄ】

表１０Ｅおよび表１０Ｆは、ＮＯＶ１０に対するドメイン分析の結果からのドメインの説明を記載する。これは、ＮＯＶ１０配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似した特性を有することを示す。
【０２６８】
【表１０Ｅ】

【０２６９】
【表１０Ｆ】

本明細書に記載される推定配列は、カルパインプロテアーゼファミリーに属する。カルパイン（すなわち、カルシウム活性化中性プロテアーゼ）は、非リソソーム性細胞内システインプロテアーゼである（Ｒｉｃｈａｒｄら）。カルパインは、カルシウムによって調節される多くの重要な細胞機能に関与する、細胞内プロテアーゼである。哺乳動物カルパインとしては、２つの遍在性タンパク質ＣＡＰＮ１およびＣＡＰＮ２、ならびに２つの胃特異的タンパク質、ならびにＣＡＰＮ３（これは、筋肉特異的である）が挙げられる。これらの遍在性酵素は、共通のスモールサブユニットに会合した別個のラージサブユニットを有するヘテロダイマーからなり、これらの全ては異なる遺伝子によってコードされる。組織特異的ラージサブユニットとスモールサブユニットとの会合は、実証されていない。カルパインのラージサブユニットは、４つのドメインに細分され得る；ドメインＩおよびＩＩＩ（これらの機能は未知のままである）は、既知のタンパク質に相同性を示さない。しかし、前者は、タンパク質分解活性の調節に重要であり得る。ドメインＩＩは、他のシステインプロテアーゼとの類似性を示し、これらは、それらの活性部位でヒスチジン、システインおよびアスパラギン残基を共有する。ドメインＩＶは、潜在的カルシウム結合部位である４つのＥＦ−ハンド構造を含む。さらに、既知の相同性を有さない３つの独特の領域（すなわち、ＮＳ、ＩＳ１およびＩＳ２（後者は、核トランスロケーションシグナルを含む））は、筋肉特異的ＣＡＰＮタンパク質に存在する。これらの領域は、ＣＡＰＮ３の筋肉特異的機能に重要であり得る（Ｒｉｃｈａｒｄら）。
【０２７０】
ヒトカルパイン３遺伝子における欠損が、近位四肢筋肉に主に罹患する遺伝性疾患である、四肢の帯状筋ジストロフィー２Ａ型（ＬＧＭＤ２Ａ）の原因であることが以前に示された。カルパイン３の機能およびＬＧＭＤ２Ａの病態生理学的機構をより良く理解するために、そしてまた、治療研究に適切なモデルを開発するために、本発明者らは、遺伝子標的化によって、ｃａｐｎ３欠損マウスを作製した。ｃａｐｎ３欠損マウスは、完全に受精能があり、そして生存可能である。異種交配子孫における対立遺伝子の伝達は、メンデルの法則からの統計的に有意な離脱を実証した。ｃａｐｎ３欠損マウスは、特定の群の筋肉に影響を与える、軽度の進行性筋ジストロフィーを示す。筋障害の特徴の出現齢は、遺伝的背景によって変動し、このことは、モディファイヤ遺伝子の関与を示唆する。罹患した筋肉は、ＬＧＭＤ２Ａ患者において見られたようなＩκＢα／核因子κＢ経路のアポトーシス関連変動を表す。さらに、筋線維のエバンスブルー染色は、カルパイン３欠損に起因する病理学的プロセスが、膜の変化に関連することを明らかにする（Ｒｉｃｈａｒｄら）。
【０２７１】
近年、カルパインは、シェーグレン症候群（ＳＳ）の発症におけるα−ホドリンタンパク質分解および組織破壊の進行に関与することが示唆された（Ｈａｙａｓｈｉら）。ＳＳは、不充分な分泌に起因して口の渇きおよび眼の乾燥の症状となる、唾液腺および涙腺におけるびまん性リンパ球浸潤によって特徴付けられる自己免疫疾患である。免疫学的因子、遺伝的因子および環境因子の組合せが、唾液腺および涙腺における自己免疫傷害の発症において重要な役割を果たし得ることが仮定されているが、ヒトにおけるＳＳの疾患の病因についてはほとんど知られていない。１２０ｋＤａのα−ホドリンは、動物モデルおよびＳＳ患者の両方においてＳＳの発症における重要な自己抗原であるが、ＳＳにおける組織破壊をもたらすα−ホドリン切断の機構は不明のままである。ＳＳについてのマウスモデルの唾液腺から精製した組織浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、大きな比率のＦａｓリガンドを保有し、そして唾液腺管は、アポトーシスレセプターＦａｓを保有する。抗Ｆａｓ抗体誘導性アポトーシス唾液腺細胞は、インビトロで、１２０ｋＤａのフラグメントへの特異的α−ホドリン切断をもたらす。カルパインとカスパーゼインヒビターペプチドとの組合せとのプレインキュベーションは、１２０ｋＤａのα−ホドリン切断の阻害の原因であり得る。従って、カルパインおよびカスパーゼを含むアポトーシスプロテアーゼ活性における増大は、ＳＳの発症におけるα−ホドリンタンパク質分解および組織破壊の進行に関与し得る（Ｈａｙａｓｈｉら）。
【０２７２】
本明細書に記載される新規配列が、カルパインプロテアーゼに類似した有用な特性および機能を有すると予想される。なぜなら、カルパイン型システインプロテアーゼ（Ｃ２ファミリー）ドメインが存在し、そしてカルパインＩＩＩに対する相同性があるからである。
【０２７３】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１０のタンパク質および核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップの位置は、これが、システインプロテアーゼファミリーに特有の重要な構造的および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。それゆえ、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的診断適用および治療適用において、ならびに調査ツールとして有用である。これらとしては、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとしての役割（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである）、ならびに、例えば以下の潜在的治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０２７４】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害、ならびに／または他の病理に関与する、潜在的診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：糖尿病、フォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、高カルシウム血症、潰瘍、子宮内膜症、受精能、血友病、凝固能亢進症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全、移植、移植片対宿主病、乾癬、光線角化症、結節硬化、挫瘡、毛成長／喪失、アロペシア（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）、色素沈着障害、内分泌障害、血友病、リンパ浮腫（ｌｙｍｐｈａｅｄｅｍａ）、ならびに他の同様の疾患、障害および状態。
【０２７５】
本発明のマイクロモル濃度のカルシウム活性化中性プロテアーゼー１タンパク質をコードする新規核酸またはそのフラグメントは、診断適用において有用であり、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの物質は、治療方法または診断方法において使用するための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。開示されるＮＯＶ１０タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態では、意図されるＮＯＶ１０エピトープは、約アミノ酸５〜９０である。別の実施形態では、意図されるＮＯＶ１０エピトープは、約アミノ酸１０５〜１１０である。他の特定の実施形態では、意図されるＮＯＶ１０エピトープは、約アミノ酸１７０〜１８０、２３０〜３１０、３７０〜４００、４２０〜４３０、４５０〜４５５、４６０〜４６５、４８０〜４８５、５１０〜５１５、５７０〜５８０および６８０〜６９０である。
【０２７６】
（ＮＯＶ１１）
開示されるＮＯＶ１１核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６１７９−０１と称される）は、新規Ｐ２Ｘ２Ｃ様タンパク質をコードし、そして表１１Ａに示す１４２２ヌクレオチドの配列（配列番号４１）を含む。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まってヌクレオチド１４２０〜１４２２のＴＧＡコドンで終わると同定された。表１１Ａにおいて開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０２７７】
【表１１Ａ】

ＮＯＶ１１の核酸配列は、第１染色体にマッピングされ、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１９０８２４｜ａｃｃ：ＡＦ１９０８２４．１ｍＲＮＡ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＰ２Ｘ２Ｃレセプター（Ｐ２Ｘ２）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して同一な９９０塩基（９９１塩基中；９９％）を有する（Ｅ＝３．６ｅ^−２９５）。
【０２７８】
ＮＯＶ１１ポリペプチド（配列番号４２）は４７３アミノ酸残基長であり、そしてこれを１文字アミノ酸コードを用いて表１１Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはハイドロパシーの結果は、ＮＯＶ１１が、シグナルペプチドを有して、０．６５７７の確実性でミトコンドリア内膜に局在するようであることを推測する。代替の実施形態では、ＮＯＶ１１ポリペプチドは、０．６５００の確実性で原形質膜に、０．３５５６の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に、または０．３０００の確実性でゴルジ体に位置する。ＳｉｇｎａｌＰは、アミノ酸６８位と６９位との間にＮＯＶ１１ペプチドについてありそうな切断部位（すなわち、配列ＳＹＱ−ＥＳにおけるダッシュ）を推測する。
【０２７９】
【表１１Ｂ】

ＮＯＶ１１のアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の４４７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＵＨＤ６タンパク質（Ｐ２Ｘ２Ｃセプター）に対して同一な３３０アミノ酸残基（３３０アミノ酸残基中；１００％）および類似な３３０アミノ酸残基（３３０アミノ酸残基中；１００％）を有する（Ｅ＝８．７ｅ^−２４８）。
【０２８０】
ＮＯＶ１１は、少なくとも以下の組織で発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳；脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、骨髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、ＰｕｂｌｉｃＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ供給源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明において含まれた配列の組織供給源を決定することによって導かれた。
【０２８１】
ＮＯＶ１１について見出される可能な小さなヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を、表１１Ｃおよび表１１Ｄに列挙する。
【０２８２】
【表１１Ｃ】

【０２８３】
【表１１Ｄ】

ＮＯＶ１１はまた、表１１Ｅに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２８４】
【表１１Ｅ】

これらの配列の相同性を、表１１Ｆに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図として示す。
【０２８５】
【表１１Ｆ】

表１１Ｇは、ＮＯＶ１１に対するドメイン分析の結果からのドメインの説明を記載する。これは、ＮＯＶ１１配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似した特性を有することを示す。
【０２８６】
【表１１Ｇ】

Ｐ２Ｘレセプターは、細胞外アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）によってコントロールされる（ｇａｔｅｄ）膜イオンチャネルであり；ヌクレオチドはまた、７つの膜貫通Ｇタンパク質結合レセプター（Ｐ２Ｙ）のファミリーを活性化する。Ｐ２Ｘレセプターは、哺乳動物細胞上に広範に発現され、これらは３つのグループに広く分化され得る。第１のグループは、ＡＴＰおよびそのアナログのαβメチレンＡＴＰ（αβｍｅＡＴＰ）によって、ほとんど等しく十分に活性化され、一方、第２のグループは、αβｍｅＡＴＰによって活性化されない。アゴニストの適用が数秒より長く続く場合、チェネルの開口が細胞透過化処理および細胞溶解の後に続くという事実によって、レセプターの第３のグループ型（Ｐ２Ｚと名付けられる）は、区別される。Ｐ２Ｘレセプターサブユニットをコードする７つのｃＤＮＡは、クローン化された。非相同的系において個別に発現される場合、Ｐ２Ｘ１およびＰ２Ｘ３サブユニットは、ＡＴＰまたはαβｍｅＡＴＰによって活性化されたチャネルを形成し；一方、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ４およびＰ２Ｘ５は、ＡＴＰによって活性化されたチャネルを形成するが、αβｍｅＡＴＰでは形成しない。Ｐ２Ｘ６レセプターは迅速に発現せず、そしてＰ２Ｘ７レセプターは、Ｐ２Ｚに対するそれらの特性において密接に対応する。２つのサブユニットが共発現される場合、さらなる表現型が生産され得、これはヘテロ多量体化を示す。電気生理学的な実験で分離する平滑筋および神経は、Ｐ２Ｘレセプターの３つの異なる表現型を示した：（１）迅速な脱感作（最も代表的な平滑筋のβメチレンＡＴＰ感受性応答）；（２）非脱感作（ＰＣ１２フェオクロモサイトーマ細胞およびラット優性頚部神経節ニューロンに特徴的なα，βメチレンＡＴＰ非感受性応答）；および（３）非脱感作（感覚性ニューロンにおいて観察されるα，βメチレンＡＴＰ感受性応答）。
【０２８７】
これら全てのプリン受容体は、類似のカチオン性および高いＣａ２＋透過性、ならびにスラミン、Ｃｉｂａｃｒｏｎｂｌｕｅ、酸化ＡＴＰ、ピリドキサール−５−リン酸およびピリドキサルリン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホン酸による遮断に対する感受性を共有する。クローン化Ｐ２Ｘレセプター（ラットの精管およびＰＣ１２細胞由来）の２つの形態の非相同的発現は、互いのクローン化レセプターが著しい忠実度でネイティブな応答を再構成し得ることを示す。このような結果は、ホモオリゴマーのチャネルが、平滑筋、ＰＣ１２細胞およびいくつかのニューロン中でＰ２Ｘレセプターの単一サブユニットから形成され得ることを示唆する。ネイティブな細胞中で観察される第３の表現型は、クローン化レセプターのサブユニットの共アセンブリから生じ得る。しかし、共発現研究は、Ｐ２Ｘレセプターのこれら２つの形態が、ヘテロ多量体化しないことを示す。従って、非脱感作、感覚性ニューロンにおいて観察されるα，βメチレンＡＴＰ感受性応答は、異なるＰ２Ｘレセプターを生じるか、または１より多い異なるＰ２Ｘプリン受容体のヘテロ多量体化を生じる。
【０２８８】
現在公知である７つのＰ２ＸレセプターｃＤＮＡが存在する。６つのホモマー（Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ７）および３つのヘテロマー（Ｐ２Ｘ２／Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４／Ｐ２Ｘ６、Ｐ２Ｘ１／Ｐ２Ｘ５）のＰ２Ｘレセプターチャネルは、非相同的発現系において特徴付けられた。ホモマーのＰ２Ｘ１レセプターおよびＰ２Ｘ３レセプターは、それらの迅速な脱感作、αβメチレンＡＴＰのアゴニスト作用および２’，３’−Ｏ−（２，４，６−トリニトロフェニル）−ＡＴＰによるブロックによって容易に区別可能である。Ｐ２Ｘ２レセプターは、低いｐＨによるそれらの相乗作用におけるホモマー形態の間で、特有である。ホモマーのＰ２Ｘ４レセプターは、セラミンおよびピリドキサル５−リン酸−６−アゾ−２’，４’−ジスルホン酸による拮抗作用に対してわずかに感受性である。ホモマーのＰ２Ｘ７レセプターは、２’，３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰがＡＴＰより強力である形態のみである。ヘテロマーのＰ２Ｘ２／Ｐ２Ｘ３レセプターは、遅い脱感作動力学および低いｐＨによる相乗作用においてＰ２Ｘ２と共通し、そしてαβメチレンＡＴＰによる闘争性、および２’，３’−Ｏ−（２，４，６−トリニトロフェニル）−ＡＴＰによるブロックについてＰ２Ｘ３に類似する。リガンドコントロールイオンチャネル（ＡＴＰに応答性）のＰ２Ｘレセプターファミリーの７つのサブタイプは、同定され、ホモ多量体細孔、またはヘテロ多量体細孔を形成する。Ｐ２Ｘ３レセプターは、後根、三叉神経節および下神経節（特にレクチンＩＢ４を用いて標識された非ペプチド作動性亜集団）中の小二量体侵害受容感覚ニューロンで、主に選択的に発現される。Ｐ２Ｘ２／３標識はまた、脊髄の内部薄膜ＩＩならびに皮膚および内蔵に対する感覚神経突出中に存在するが、少しのレセプターは、骨格筋中に存在する。Ｐ２Ｘ３レセプターは、末梢神経損傷後に下方制御され、そしてこれらの発現は、神経膠細胞誘導神経栄養性因子によって調節され得る。感覚神経のＰ２Ｘレセプター活性化は、インビボでの疼痛モデル（ラットの後足および膝関節の調製を含む）および炎症性モデルにおいて示されている。ＣＮＳ中のＰ２Ｘ４および／またはＰ２Ｘ６レセプターはまた、疼痛経路に関するようである。感覚神経上の非侵害受容Ｐ２レセプター（これらは、迷走神経の求心性線維および遠心性神経線維に関する反射作用を開始する）は、筋肉内ならびに心臓および肺の感覚器末端に存在する。
【０２８９】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１１タンパク質およびＮＯＶ１１核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１１が、ＡＴＰＰ２Ｘレセプターファミリーに特徴的な重要な構造機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用および研究ツールとして有用である。これらは、特異的もしくは選択的な、核酸診断マーカーおよび／もしくは核酸予後マーカーまたはタンパク質診断マーカーおよび／もしくはタンパク質予後マーカーとして役立つものが挙げられ、ここで、その核酸もしくはそのタンパク質の存在、またはその核酸もしくはそのタンパク質の量が評価され、そして、以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０２９０】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害ならびに／または他の病理に関係する潜在的な診断適用および治療適用に有用である。例えば、感覚神経のＰ２Ｘレセプター活性化が、インビボでの疼痛モデル（ラットの後足および膝関節の調製を含む）および炎症性モデルにおいて示されているので、本発明の組成物は、疼痛に羅患している患者の処置に対して効果を有し得る。ＣＮＳ中のＰ２Ｘ４および／またはＰ２Ｘ６レセプターはまた、疼痛経路に関するようである。感覚神経上の非侵害性Ｐ２レセプター（これらは、迷走神経の求心性線維および遠心性神経線維に関する反射作用を開始する）は、筋肉内ならびに心臓および肺の感覚器末端に中に存在する（ＢｒＪＡｎａｅｓｔｈ２０００Ａｐｒ；８４（４）：４７６−８８）。本発明の組成物はまた、以下に罹患する患者の処置に対して有効性を有する：糖尿病、肥満症、Ｘ症候群ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０２９１】
本発明のＰ２Ｘ２Ｃ様タンパク質をコードする新規核酸またはそれらのフラグメントは、診断的用途において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１１タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。１つの実施形態では、企図されるＮＯＶ１１エピトープは、アミノ酸約５〜約１０である。別の実施形態では、企図されるＮＯＶ１１エピトープは、アミノ酸約２０〜約２５である。他の特定の実施形態では、企図されるＮＯＶ１１エピトープは、アミノ酸約４０〜約５０、約７０〜約８０、約９５〜約１０５、約１４０〜約１４８、約１９５〜約２１５、約２５０〜約３００、約３４０〜約３６０、約３７０〜約３８０、約４１０〜約４３０および約４５５〜約４６５である。
【０２９２】
（ＮＯＶ１２）
開示されたＮＯＶ１２核酸（ＣｕｒｅＧｅｎ登録番号ＣＧ５６１３２−０１と名付けられる）は、新規のＤＩＡＢＬＯ様タンパク質をコードし、そして表１２Ａに示される１８２３ヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）を含む。オープンリーディングフレームが同定され、これは、ヌクレオチド３１〜３３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１６０６〜１６０８においてＴＧＡコドンで終了する。開始コドンから上流の推定非翻訳領域および終止コドンから下流の推定非翻訳領域は、表１２Ａにおいて下線が引かれ、そして開始コドンおよび終止コドンは太字である。
【０２９３】
【表１２Ａ】

本発明のＮＯＶ１２の核酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃＤＮＡＦＬＪ２００８１ｆｉｓ、クローンＣＯＬ０３２４２）由来ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ００００８８｜ａｃｃ：ＡＫ００００８８．１ｍＲＮＡに対して９１８塩基中９０９塩基（９９％）の同一性を有する（Ｅ＝９．３ｅ^−１９８）。
【０２９４】
ＮＯＶ１２ポリペプチドは、（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）は、５２５アミノ酸残基であり、そして表１２Ｂに一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１２が、おそらく０．８５００の確実性で小胞体（膜）に局在化されることを予測する。代替の実施形態において、ＮＯＶ１２ポリペプチドはまた、０．４４００の確実性で原形質膜に、０．３０８４の確実性でマイクロボディー（ペルオキシソーム）に、または０．１０００の確実性でミトコンドリア内膜に局在化される。
【０２９５】
【表１２Ｂ】

ＮＯＶ１２のアミノ酸配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｆｒｕｉｔｆｌｙ）由来６２３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＮＧＸ７タンパク質（ＤＯＭＡＩＮ）に対して５２１アミノ酸残基中２２５アミノ酸残基（４３％）の同一性、そして５２１アミノ酸残基中３２４アミノ酸残基（６２％）の類似性を有する（Ｅ＝２．０ｅ^−１０９）。
【０２９６】
本発明におけるＮＯＶ１２は、少なくとも以下の組織で発現される：包皮、視床下部、腎臓、前立腺、網膜、扁桃、胸部、生物全体。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ源、公的なＥＳＴ源、文献源および／またはＲＡＣＥ源を含む（がそれらに限定されない）本発明に含まれた配列の組織源を決定することによって導き出された。
【０２９７】
ＮＯＶ１２はまた、表１２Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列と相同性を有する。
【０２９８】
【表１２Ｃ】

これらの配列の相同性を、表１２Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。
【０２９９】
【表１２Ｄ】

表１２Ｅ、表１２Ｆおよび表１２Ｇは、ＮＯＶ１２に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ１２配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【０３００】
【表１２Ｅ】

【０３０１】
【表１２Ｆ】

【０３０２】
【表１２Ｇ】

アポトーシスまたはプログラム化された細胞死は、後生動物の発達およびカスパーゼによって行なわれるホメオスタシスにおいて必須のプロセスである。ＤＩＡＢＬＯタンパク質（低いｐＩを直接有するＩＡＰ結合タンパク質）は、カスパーゼに対するＩＡＰ（アポトーシスタンパク質のインヒビター）の阻害的効果を排除することによってアポトーシスにおける重大な機能を遂行する（１）。このタンパク質はまた、カスパーゼの二次ミトコンドリア誘導化アクチベーターのＳｍａｃとして公知である。ＤＩＡＢＬＯ／Ｓｍａｃは、通常ミトコンドリアタンパク質であるが、細胞がアポトーシスを経験する場合、細胞質ゾルに放出される。ミトコンドリアの移入およびそのシグナルペプチドの切断は、アポトーシス活性を増すためにＤＩＡＢＬＯ／Ｓｍａｃにとって必要である。さらに、ＤＩＡＢＬＯ／Ｓｍａｃの過剰発現は、アポトーシスの刺激薬に対する細胞感受性を増大することを示す（２）。
【０３０３】
本発明において記載されたタンパク質は、ＤＩＡＢＬＯ／Ｓｍａｃタンパク質と相同であり、従って、アポトーシスの役割を果たすことが予測される。これは、ＢＴＢ／ＰＯＺドメインならびにケルヒ（ｋｅｌｃｈ）モチーフの５コピーを含む。ＢＴＢ／ＰＯＺドメインは、ホモマーの二量体化およびある場合にはヘテロマーの二量体化を媒介することを示した（３）。ケルヒは、５０残基モチーフであり、これが最初に同定されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ変異体にちなんで名付けられた（４）。ケルヒ含有タンパク質の公知の機能は、多様である。本発明において記載された遺伝子は、第１４染色体にマップし、そしてこれに基づく発現パターンは、多くのヒト疾患（例えば、癌、炎症性疾患／自己免疫疾患、代謝疾患およびＣＮＳ障害など）に寄与し得る。さらに、新規ＤＩＡＢＬＯ様タンパク質は、おそらくアポトーシスを調節する機能を果たすので、この遺伝子は、診断ツールまたは予後ツールとして、および遺伝子治療において有用であり得る。
【０３０４】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１２タンパク質およびＮＯＶ１２核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１２が、ＤＩＡＢＬＯファミリーに特徴的な重要な構造機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的もしくは選択的な、核酸診断マーカーおよび／もしくは核酸予後マーカーまたはタンパク質診断マーカーおよび／もしくはタンパク質予後マーカーとして役立つものが挙げられ、ここで、その核酸もしくはそのタンパク質の存在、またはその核酸もしくはそのタンパク質の量が評価され、そして、これらとしては以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０３０５】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害ならびに／または他の病理に関係する潜在的な診断適用および治療適用に有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患する患者の処置に対して有効性を有する：癌、外傷、細菌感染およびウイルス感染、再生（インビボおよびインビトロ）、受胎能、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、結節硬化症、内分泌障害、アルツハイマー病、発作、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、多発性硬化症、運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０３０６】
本発明のＤＩＡＢＬＯ様タンパク質をコードする新規核酸またはそれらのフラグメントは、診断的用途において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１２タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。１つの実施形態では、企図されるＮＯＶ１２エピトープは、アミノ酸約５〜約７である。別の実施形態では、企図されるＮＯＶ１２エピトープは、アミノ酸約１０〜約１５である。他の特定の実施形態では、企図されるＮＯＶ１２エピトープは、アミノ酸約８０〜約９０、約１３０〜約１３５、約１４０〜約１４５、約１７０〜約１８０、約１９０〜約１９２、約１９８〜約２０５、約２２０〜約２７０、約２９５〜約３２０、約３４０〜約３７０、約４００〜約４１５、約４２０〜約４７０および約４９０〜約５００である。
【０３０７】
（ＮＯＶ１３）
開示されたＮＯＶ１３核酸（ＣｕｒｅＧｅｎ登録番号ＣＧ５６１９５−０１と名付けられる）は、新規のＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質様タンパク質をコードし、そして表１３Ａに示される１９７０ヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）を含む。
【０３０８】
【表１３Ａ】

ＮＯＶ１３の核酸配列は、第２２染色体にマップし、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃＤＮＡＦＬＪ１３１３０ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００２９７２、ＨｒＰＥＴ−１のＨａｌｏｃｙｎｔｈｉａｒｏｒｅｔｚｉｍＲＮＡに対して弱い類似性）由来ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ０２３１９２｜ａｃｃ：ＡＫ０２３１９２．１ｍＲＮＡに対して１２２８塩基中８９１塩基（７２％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。
【０３０９】
ＮＯＶ１３ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）は、５０８アミノ酸残基であり、そして表１３Ｂに一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１３が、おそらく、０．７０００の確実性で原形質膜に局在化されると予測される。別の実施形態において、ＮＯＶ１３は、おそらく０．３０００の確実性で核に、０．２０００の確実性で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実性でミトコンドリア内膜に局在化される。
【０３１０】
【表１３Ｂ】

ＮＯＶ１３のアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ＷＵＧＳＣ：Ｈ＿ＤＪ１３０Ｈ１６．２ＰＲＯＴＥＩＮ）由来４３８アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ７６０５３タンパク質に対して４３８アミノ酸残基中４３８アミノ酸残基（１００％）の同一性、および４３８アミノ酸残基中４３８アミノ酸残基（１００％）の類似性を有する。（Ｅ＝４．３ｅ^−２４２）
ＮＯＶ１３は、少なくとも以下の組織で発現される：骨髄、脳、気管支、真皮、表皮、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ系組織、乳房。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ源、公的なＥＳＴ源、文献源および／またはＲＡＣＥ源を含む（がそれらに限定されない）本発明に含まれた配列の組織源を決定することによって導き出された。さらに、密接に関連したＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃＤＮＡＦＬＪ１３１３０ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００２９７２（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ種におけるＨｒＰＥＴ−１ホモログのＨａｌｉｃｙｎｔｈｉａｒｏｒｅｔｚｉｍＲＮＡに対して弱い類似性）（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ０２３１９２｜ａｃｃ：ＡＫ０２３１９２．１）の発現パターンに起因して、この配列は、以下の組織において発現されることが予測される：精巣、卵巣、結腸、上皮小体、甲状腺、骨、脾臓、胃、頸、副腎、頭−頸。
【０３１１】
ＮＯＶ１３はまた、表１３Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列と相同性を有する。
【０３１２】
【表１３Ｃ】

これらの配列の相同性を、表１３Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。
【０３１３】
【表１３Ｄ】

表１３Ｅおよび表１３Ｆは、ＮＯＶ１３に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ１３配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【０３１４】
【表１３Ｅ】

【０３１５】
【表１３Ｆ】

ＮＯＶ１３は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、マウスおよびヒトの間で、種を超えて高度に保存される。これは、膜に関連することが予測される。主な配列における高度な保存は、現在未知であるが、重要な生物学的機能を有することを示す。ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質はまた、植物接着分子と相同性を示し、ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質がおそらく細胞相互作用および細胞移動に関する細胞接着分子であることを示唆する。
【０３１６】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１３タンパク質およびＮＯＶ１３核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１３が、細胞接着分子ファミリーに特徴的な重要な構造機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的もしくは選択的な、核酸診断マーカーおよび／もしくは核酸予後マーカーまたはタンパク質診断マーカーおよび／もしくはタンパク質予後マーカーとして役立つものが挙げられ、ここで、その核酸もしくはそのタンパク質の存在、またはその核酸もしくはそのタンパク質の量が評価され、そして、これらとしては、以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０３１７】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害ならびに／または他の病理に関係する潜在的な診断適用および治療適用に有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患する患者の処置に対して有効性を有する：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室性（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵臓炎、受胎能、子宮内膜症、口内乾燥症、肝硬変症、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫疾患、アレルギー、免疫欠損、対宿主性移植片病、リンパ水腫、血友病、凝固能亢進、アルツハイマー病、発作、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、全身性エリテマトーデス、喘息、気腫、強皮症、ＡＲＤＳ、乾癬、光線性角化症、挫瘡、毛髪増殖／欠損、ａｌｌｏｐｅｃｉａ、色素沈着障害、内分泌障害、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、レッシュ−ナイハン症候群、ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０３１８】
本発明のＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質をコードする新規核酸またはそれらのフラグメントは、診断的用途において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１３タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。１つの実施形態では、企図されるＮＯＶ１３エピトープは、アミノ酸約２〜約７０である。別の実施形態では、企図されるＮＯＶ１３エピトープは、アミノ酸約９０〜約１２０である。他の特定の実施形態では、企図されるＮＯＶ１３エピトープは、アミノ酸約１２５〜約２００、約２１０〜約２１５、約２２０〜約２３０、約３１０〜約３２０、約３８０〜約３９０、約３９０〜約３９８、約４１０〜約４２５、および約４８０〜約５００である。
【０３１９】
（ＮＯＶ１４）
Ｂ７−Ｈ２様タンパク質をコードする、開示されたＮＯＶ１４核酸（ＣｕｒｅＧｅｎ登録番号ＣＧ５５７９０−０２と名付けられる）は、８２７０ヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）を含み、そして表１４Ａに示される。オープンリーディングフレームが同定され、ヌクレオチド２４〜２６においてＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１４４３〜１４４５においてＴＡＧコドンで終了する。終止コドンから下流の推定非翻訳領域は、表１４Ａにおいて下線が引かれ、そして開始コドンおよび終止コドンは太字である。
【０３２０】
【表１４Ａ】

ＮＯＶ１４の核酸配列は、第２１染色体にマップし、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓゲノムＤＮＡ、染色体２１ｑ、位置９７／１０５）由来ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＰ００１７５３｜ａｃｃ：ＡＰ００１７５３．１ｍＲＮＡに対して６０７塩基中４８０塩基（７９％）の同一性を有する（Ｅ＝１．５ｅ^−１１７）。
【０３２１】
ＮＯＶ１４ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）は、４７３アミノ酸残基であり、そして表１４Ｂに一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１４がシグナルペプチド含み、そしておそらく０．４６００の確実性で原形質膜に局在化されることと予測する。別の実施形態において、ＮＯＶ１４は、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に、０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に、または０．１０００の確実性で細胞の外側に局在化される。ＮＯＶ１４ペプチドについて最も可能性のある切断部分は、アミノ酸１８と１９との間（ＬＲＡ−ＤＴ）である。
【０３２２】
【表１４Ｂ】

ＮＯＶ１４のアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ＴＲＡＮＳＭＥＭＢＲＡＮＥＰＲＯＴＥＩＮＢ７−Ｈ２ＩＣＯＳＬＩＧＡＮＤ）由来３０２アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＧ０１１７６タンパク質に対して３００アミノ酸残基中３００アミノ酸残基（１００％）の同一性、および３００アミノ酸残基中３００アミノ酸残基（１００％）の類似性を有する。（Ｅ＝７．３ｅ^−１６０）
ＮＯＶ１４は、少なくとも以下の組織で発現される：骨髄、脳、視床、脂肪、扁桃、骨、心臓、腎臓、リンパ系組織、乳腺／胸部、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、視床、扁桃、膀胱、子宮、外陰部、生物全体、垂、気管支、軟骨、心臓、腎臓、肺、リンパ節、胎盤、右小脳、骨格筋、精巣、胸腺。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ源、公的なＥＳＴ源、文献源および／またはＲＡＣＥ源を含む（がそれらに限定されない）本発明に含まれた配列の組織源を決定することによって導き出された。
【０３２３】
可能な小数のヌクレオチド多型（ｓｍａｌｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）（ＳＮＰ）は、表１４Ｃに列挙されるＮＯＶ１４ｒｅを見出した。
【０３２４】
【表１４Ｃ】

ＮＯＶ１４はまた、表１４Ｄに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータ中に示されるアミノ酸配列に相同である。
【０３２５】
【表１４Ｄ】

これらの配列の相同性を、表１４Ｅに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。
【０３２６】
【表１４Ｅ】

表１４Ｆは、ＮＯＶ１４に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ１４配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【０３２７】
【表１４Ｆ】

Ｂ７ファミリーのリガンドとそれらのレセプターとの間の同時刺激性相互作用は、Ｔ細胞の増殖、分化および死において重大な役割を果たす。特定の抗体またはその天然のリガンドＢ７−１およびＢ７−２のいずれかによるＴ細胞の同時刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）ＣＤ２８の結合は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の抗原特異的増殖を増加し、サイトカインの生成を増強し、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の変異を誘導し、そしてＴ細胞の生存を促進する。しかし、活性化Ｔ細胞によるＢ７−１およびＢ７−２の相同性ＣＴＬＡ−４レセプターを介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、インターロイキン（ＩＬ）−２の生成および細胞周期の進行を阻害するネガティブなシグナルを送達すると考えられる。Ｂ７−１およびＢ７−２は、それらのアミノ酸中に約２０％の相同性のみを共有するが、これらは、類似の三次構造および同時刺激性機能を有する。
【０３２８】
現在の研究は、Ｂ７−ＣＤ２８ファミリーの他のメンバーもまた細胞応答および体液性免疫応答の調節に関与し得ることを示す。新しいメンバーの１つは、誘導性同時刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２８様レセプターである。ヒトＩＣＯＳに対するＦ４４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｔ細胞増殖を同時刺激し、そしていくつかのサイトカイン（ＩＬ−１０、インターフェロン−、およびＩＬ−４を含むが、抗ＣＤ３抗体の最適用量の存在下ではＩＬ−２は含まない）の分泌を増加する。別の新しいＢ７ファミリーのメンバーは、マウスＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１である。Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に結合せず、そして抗原性シグナルの存在下でＴ細胞増殖を同時刺激し得る。Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１の表面発現は、３Ｔ３線維芽細胞中の腫瘍壊死因子によって上方制御され、そしてＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の増加はまた、リポ多糖類（ＬＰＳ）に曝露された非リンパ系組織中で観察されることが示された。Ｙｏｓｈｉｎａｇａおよび研究者らは、Ｂ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１がマウスＣＲＰ−１のリガンド、ヒトＩＣＯＳのマウスホモログであることを示した。トランスジェニックマウスのＢ７ＲＰ−１融合タンパク質の発現は、いくつかのリンパ系器官中の過形成およびオキサゾロン誘導接触過敏を増強するＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１融合タンパク質を用いてのマウスの処置を導く。
【０３２９】
ヒトＢ７ファミリーの新しいメンバー（Ｂ７−Ｈ１）は、ＩｇＶ様細胞外ドメインおよびＩｇＣ様細胞外ドメイン中のＢ７−１およびＢ７−２と約２０％同一アミノ酸配列を共有するが、細胞質ドメイン中のＢ７−１およびＢ７−２とはより大いに異なる。Ｂ７−Ｈ１とマウスＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１との間のアミノ酸の同一性が３０％未満であるので、Ｂ７−Ｈ１は、マウスＢ７ｈ／Ｂ７ＲＰ−１のヒトホモログではなさそうである。さらに、Ｂ７−Ｈ１はＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＩＣＯＳに結合しない。Ｂ７−Ｈ１の表面発現は、大多数の活性化ＣＤ１４^＋マクロファージおよび活性化Ｔ細胞の画分中で検出され得る。Ｂ７−Ｈ１は、抗ＣＤ３ｍＡｂの最適用量の存在化でＴ細胞応答を同時刺激し、同種異系混合リンパ球応答を増強し、そしてＴ細胞からのＩＬ−１０分泌を優先的に誘導する。ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）中のＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−Ｈ１のＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインと相同性を共有する分子検索、次いで、その後のクローニングおよび配列決定によって、Ｂ７−Ｈ２（Ｂ７ホモログ２）と名付けられた新しいＢ７様遺伝子を同定した。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−Ｈ１に類似する全体構造に加えて、Ｂ７−Ｈ２は、ＩＣＯＳに結合し、そしてヒトＴ細胞の増殖およびサイトカイン生産を同時刺激する。Ｂ７−Ｈ２タンパク質の細胞表面発現は、単球由来未成熟樹状細胞中で検出される。可溶性Ｂ７−Ｈ２および免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質（Ｂ７−Ｈ２Ｉｇ）は、活性化された休止Ｔ細胞ではなく活性化Ｔ細胞に結合し、そして結合はＣＴＬＡ４Ｉｇではなく誘導性同時刺激因子Ｉｇ（ＩＣＯＳＩｇ）によって抑止される。さらに、ＩＣＯＳＩｇ株チャイニーズハムスターの卵巣細胞は、Ｂ７−Ｈ２遺伝子を用いてトランスフェクションした。最適以下のＣＤ３の交差結合によって、Ｂ７−Ｈ２ＩｇによるＴ細胞増殖の同時刺激は、用量に依存し、そしてインターロイキン（ＩＬ−２）の分泌と関連するが、最適なＣＤ３ライゲーションは、ＩＬ−１０生産を優先的に刺激する。この結果は、Ｂ７−Ｈ２が、ＩＣＯＳＴ細胞分子の推定リガンドであることを示す（Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２８０８−２８１３）。ＰＭＩＤ：１１０２３５１５、ＵＩ：２０４７７８４６。
【０３３０】
Ｔ細胞特異的細胞表面レセプターＣＤ２８（ＯＭＩＭ＃１８６７６０）およびＣＴＬＡ４（ＯＭＩＭ＃１２３８９０）は、免疫系の重要な制御因子である。ＣＤ２８は、効果的な抗原特異的免疫応答に必須のこれらのＴ細胞機能を強力に増強し、そしてＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８媒介シグナルを平衡させる。従って、リンパ球系の他の致命的な過剰刺激を防ぐ。活性化ヒトＴ細胞に対するモノクローナル抗体を作製することによって、Ｈｕｔｌｏｆｆら（１９９９）は、このファミリーの分子の別のメンバー（「誘導性同時刺激因子」ＩＣＯＳと記号で表される）を同定した。ＩＣＯＳ特異的モノクローナル抗体は、休止ヒト末梢血Ｔ細胞と反応しないが、Ｔ細胞抗原レセプター複合体の刺激によって活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球を染色した。免疫沈降は、５５〜６０ｋＤの見かけ上の相対的分子量を有するジスルフィド結合ダイマーとしてＩＣＯＳ抗原を規定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質精製は、ＩＣＯＳがそれらの翻訳後修飾中においてのみ異なる２つの鎖を有するホモダイマータンパク質として細胞表面上に発現することを示した。２，６４１塩基対の全長ＩＣＯＳｃＤＮＡを、ＭＯＬＴ−４ＶＴリンパ芽球ｃＤＮＡライブラリーからクローン化した。ノーザン分析は、活性化ヒトＴ細胞中に約２．８ｋｂ長の単一ＩＣＯＳｍＲＮＡ種を示した。ＩＣＯＳｍＲＮＡのオープンリーディングレームは、１９９アミノ酸のタンパク質をコードする。このＩＣＯＳアミノ酸は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４とそれぞれ、２４％および１７％の相同性を共有する。予測された成熟ＩＣＯＳは、単一免疫グロブリンＶ様ドメイン（４２位および１０９位の保存されたシステイン残基によって安定化される）；約２３アミノ酸の膜貫通領域；および３５アミノ酸の細胞質テールからなるＩ型膜貫通分子である。これは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に対して密接な構造類似点を示す。ＣＤ２８の１４１位に局在するシステイン残基（ＣＴＬＡ４中にもまた見出される）は、これらのタンパク質のホモダイマー鎖間のジスルフィド結合形成におそらく関与し、そしてＩＣＯＳの１３６位にもまた見出される。ＩＣＯＳは、有効性においてＣＤ２８に対応し、外来抗原に対する全ての基本的なＴ細胞応答を増強する（すなわち、増殖およびリンフォカインの分泌、細胞−細胞相互作用を媒介する分子の上方制御およびＢ細胞による抗体分泌に対する効果的補助）。本質的に発現したＣＤ２８とは異なり、ＩＣＯＳは、Ｔ細胞表面上に新規に誘導され、そしてインターロイキンー２（ＩＬ２；ＯＭＩＭ＃１４７６８０）の生産を上方制御しないが、インターロイキン−１０（ＩＬ１０；ＯＭＩＭ＃１２４０９２）（Ｂ細胞分化因子）の合成をさらに誘発する。インビボで、ＩＣＯＳは、扁桃Ｔ細胞上で高度に発現し、この扁桃Ｔ細胞は胚中心の先端のライトゾーン（Ｂ細胞変異の末端部位）のＢ細胞に密接に関連する。
【０３３１】
Ｄｏｎｇら（２００１）は、Ｉｃｏｓ欠損マウスを生成し、Ｉｃｏｓの不在がＴ細胞発達を障害しないことを決定した。しかし、増殖期におけるＴ細胞活性化およびＩＬ２生産は、障害される。分化したＩｃｏｓ−／−細胞は、ＩＦＮＧ（ＯＭＩＭ＃１４７５７０）を生産し得るが、ＩＬ４（ＯＭＩＭ＃１４７７８０）もＩＬ２も生産し得ない。インビボでの免疫化はまた、ＩＬ２およびＩＬ４生産における欠損ならびに血清ＩｇＧ１およびＩｇＥにおける減少を示した。アレルギーモデルを使用して、Ｄｏｎｇら（２００１）は、ＩｃｏｓがＴｈ２細胞分化に必要でないが、ＩＬ４およびＩＬ１３（ＯＭＩＭ＃１４７６８３）生産を制御することが見出された。多発性硬化症に対する実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）モデルを使用して、著者らは、発達したＩｃｏｓ−／−マウスが、野生型マウスと比較してＥＡＥ耐性に関連する他の遺伝的背景と比較した場合でさえも、疾患をより強く増強したことを見出した。ノックアウトマウスおよび野生型マウス由来の球状赤血球は、検出可能でないレベルのＩＬ４および類似のレベルのＩＬ１０およびＩＦＮＧを生産した；しかし、Ｉｃｏｓ−／−マウス由来の細胞は、ＩＬ１３を生産しなかったが、一方、野生型マウスは大量のＩＬ１３を生産した。Ｄｏｎｇら（２００１）は、ＩＣＯＳが、炎症性疾患に対する保護においてＩＬ１３の誘導を介して、重要なネガティブ制御因子の役割を有し得ると結論付けた。
【０３３２】
ＭｃＡｄａｍら（２００１）は、Ｉｃｏｓ欠損マウスが野生型マウスと比較して、類似の基本レベルのＩｇＭ、わずかに増加したＩｇＧ３、ならびに減少したＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを有することを見出した。免疫化ノックアウトマウスおよび野生型マウス（高炎症性完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバントの存在を除く）はまた、類似レベルのＩｇＭ特異的抗体を有するが、ＩｇＧ１特異的抗体およびＩｇＧ２ａ特異的抗体を減少し、そして胚中心形成を減少した。ＩｇＭからＩｇＧまでのクラススウィッチングは、ＣＤ４０（ＯＭＩＭ＃１０９５３５）の刺激によってＩｃｏｓ−／−マウス中で回復される。
【０３３３】
Ｔａｆｕｒｉ（２００１）は、Ｉｃｏｓ欠損マウス由来の細胞中の減少したＴ細胞増殖は、ＣＤ４０ＬＧ（ＯＭＩＭ＃３０８２３０）、ＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡ；ＯＭＩＭ＃１４７７３０）、およびＣＤ６９（ＯＭＩＭ＃１０７２７３）の発現において顕著な減少に関連することを見出した。Ｂ細胞活性化およびＴ細胞非依存性抗体応答は、Ｉｃｏｓノックアウトマウスにおいて損なわれなかった。対照的に、ＭｃＡｄａｍら（２００１）、Ｔａｆｕｒｉら（２００１）の知見は、基底レベルのＩｇＧ１のみがＩｃｏｓ−／−マウス中で有意に減少することを見出した；しかし、彼らは、血清ＩｇＧ１よびＩｇＧ２ａレベルが減少され、そしてＩｇＥレベルは免疫化後に検出可能ではないことに同意した。ＥＬＩＳＡアッセイは、このクラススウィッチング障害がＩＬ４生産に関連するが、ＩＦＮＧ生産には関連しないことを示した。免疫組織化学分析は、胚中心形成がＣｄ４０１ｇまたはＣｄ２８欠損マウスに存在するので、胚中心形成はまた、Ｉｃｏｓノックアウトマウス中で減少することを示した。
【０３３４】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１４タンパク質およびＮＯＶ１４核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１４が、Ｂ７免疫グロブリンファミリーに特徴的な重要な構造機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的もしくは選択的な、核酸診断マーカーおよび／もしくは核酸予後マーカーまたはタンパク質診断マーカーおよび／もしくはタンパク質予後マーカーとして役立つものが挙げられ、ここで、その核酸もしくはそのタンパク質の存在、またはその核酸もしくはそのタンパク質の量が評価され、そして、これらとしては、以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０３３５】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害ならびに／または他の病理に関係する潜在的な診断適用および治療適用に有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患する患者の処置に対して有効性を有する：てんかん、摂食障害、精神分裂病、ＡＤＤ、および癌を含む脳障害；心臓疾患；クローン病、ＩＢＤ、アレルギー、リウマチおよび変形性関節症、炎症性皮膚障害、アレルギー、血液障害を含む炎症性障害および自己免疫性障害；乾癬結腸癌、白血病ＡＩＤＳ；視床障害；糖尿病および肥満症を含む代謝障害；喘息、気腫、嚢胞性線維症および癌のような肺疾患；膵臓機能不全症および癌を含む膵臓障害；前立腺癌を含む前立腺障害ならびに他の疾患、障害および状態など。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０３３６】
本発明のＢ７−Ｈ２Ｂ様核酸およびＢ７−Ｈ２Ｂ様タンパク質またはそれらのフラグメントは、診断的用途において有用であり、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１４タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。１つの実施形態では、企図されるＮＯＶ１４エピトープは、アミノ酸約２０〜約２５である。別の実施形態では、企図されるＮＯＶ１４エピトープは、アミノ酸約４８〜約４９である。他の特定の実施形態では、企図されるＮＯＶ１０エピトープは、アミノ酸約５０〜約５２、約５８〜約７５、約１００〜約１２０、約１５０〜約１９０、約２４０〜約２６０、約２９０〜約３５０、約３７０〜約４２０、および約４４０〜約４５０である。
【０３３７】
（ＮＯＶ１５）
新規のガラクトシルトランスフェラーゼ様タンパク質をコードする、開示されたＮＯＶ１５核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５６２５２−０１と名付けられる）は、１３０２ヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）を含み、そして表１５Ａに示される。オープンリーディングフレームが同定され、これはヌクレオチド１〜３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１２７６〜１２７８においてＴＡＧコドンで終了する。終止コドンから下流の推定非翻訳領域は、表１５Ａにおいて下線が引かれ、そして開始コドンおよび終止コドンは太字である。
【０３３８】
【表１５Ａ】

ＮＯＶ１５の核酸配列は、第１６染色体にマップし、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ膜貫通トリプターゼｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）由来ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１７５５２２｜ａｃｃ：ＡＦ１７５５２２．１ｍＲＮＡに対して６３９塩基中４２１塩基（６５％）の同一性を有する（Ｅ＝１．９ｅ^−３３）。
【０３３９】
ＮＯＶ１５ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）は、４２５アミノ酸残基であり、そして表１５Ｂに一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１５がシグナルペプチド含み、そしておそらく０．７９００の確実性で原形質膜に局在化されることを予測する。別の実施形態において、ＮＯＶ１５は、０．６４００の確実性でマイクロボディー（ペルオキソーム）に、０．３０００の確実性でゴルジ体に、または０．２０００の確実性で小胞体（膜）に局在化される。ＮＯＶ１５ポリペプチドに対する最も可能性のある切断部位は、アミノ酸５５とアミノ酸５６の間（ＤＧＡ−ＡＰ）である。
【０３４０】
【表１５Ｂ】

ＮＯＶ１５のアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）（ＰＲＯＳＴＡＳＩＮ）由来３４２アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＧ３２６４１タンパク質に対して２０１アミノ酸残基中９３アミノ酸残基（４６％）の同一性、および２０１アミノ酸残基中１２５アミノ酸残基（６２％）の類似性を有する（Ｅ＝９．６ｅ^−５５）。
【０３４１】
ＮＯＶ１５は、少なくとも以下の組織で発現される：大細胞癌腫、成体の脳、扁桃、大動脈、垂、動脈、骨髄、脳、軟骨、小脳、頸、表皮、腎臓、肺、リンパ節、リンパ系組織、卵巣、卵管（ｏｖｉｄｕｃｔ）／卵管（ｕｔｅｒｉｎｅｔｕｂｅ）／ファローピウス管、下垂体、前立腺、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、滑膜（ｓｙｎｏｖｉｕｍ）／滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅ）、精巣、視床、胸腺、甲状腺、外陰部、生物全体、骨髄。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ源、公的なＥＳＴ源、文献源および／またはＲＡＣＥ源を含む（がそれらに限定されない）本発明に含まれた配列の組織源を決定することによって導き出された。さらに、この配列は、ＩＩ型膜貫通タンパク質、完全ｃｄｓ、クローン：Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ種におけるＨＰ１０３２８ホモログのＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍＲＮＡに密接に関連する（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０１５６３０｜ａｃｃ：ＡＢ０１５６３０．１）の発現パターンに起因して以下の組織において発現されると予測される：類表皮癌腫。
【０３４２】
ＮＯＶ１５はまた、表１５Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータ中に示されるアミノ酸配列に相同である。
【０３４３】
【表１５Ｃ】

これらの配列の相同性を、表１５Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。
【０３４４】
【表１５Ｄ】

表１５Ｅは、ＮＯＶ１５に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ１５配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【０３４５】
【表１５Ｆ】

酵素ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）は、ガラクトースβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンを生成するための、ＵＤＰガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンに関する反応を触媒する。ガラクトシルトランスフェラーゼ（ガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ）にＵＤＰ−ガラクトースを提供する酵素は、同じバンドにマップする。ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素はまた、ラクトースシンテターゼ（ＥＣ２．４．１．２２）を形成するために、制御タンパク質のα−ラクトアルブミンとヘテイダイマーを形成し得る。生合成の役割に加えて、ガラクトシルトランスフェラーゼは、細胞内の認識および／または接着において機能し得る場合、原形質膜の成分であり得る。Ｍａｓｒｉら（１９８８）は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと呼ばれる）が、主にゴルジ複合体のトランス−槽に局在し、そして膜結合形態および可溶性形態の両方で存在することを報告した。
【０３４６】
Ａｐｐｅｒｔら（１９８６）は、精製したタンパク質の配列に基づくプローブを用いてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡをクローン化した。部分的ｃＤＮＡは、推定のＮ末端膜結合領域を含まなかった。Ａｐｐｅｒｔら（１９８６）によって単離された部分的ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡを用いるヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、Ｍａｓｒｉら（１９８８）は、全長のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡをクローン化した。これはＮ末端膜付着ドメインを有する予測された４００アミノ酸タンパク質をコードする。酵素の可溶性形態は、アルギニン７７の膜結合形態のタンパク質分解切断に起因するようである。Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇａｗら（１９９１）は、ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧａｌＴａｓｅと呼ばれる）が５０ｋｂより多いスパンの６つのエキソンからなることを報告した。ノーザンブロット分析によって、ＧａｌＴａｓｅは試験された全ての細胞株で４．２ｋｂｍＲＮＡとして発現された；細胞株の間での発現レベルにおいて高度の可変性が存在する。Ａｐｐｅｒｔら（１９８６）は、第９染色体にガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をマップした。Ｓｈａｐｅｒら（１９８６）は、クローン化ウシｃＤＮＡプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによって９ｐ１３にガラクトシルトランスフェラーゼの構造遺伝子を局在した。投薬効果に基づいて、Ｆｕｒｕｋａｗａら（１９８６）は、様々なガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子がマウスの第１７染色体に局在し得；トリソミー１７胚が二倍体胚よりもほぼ１．５倍高い酵素活性を有することを示唆した。Ｆｕｒｕｋａｗａら（１９８６）は、これらのガラクトシルトランスフェラーゼと主要な組織適合性複合体との間の関連性を示唆した。Ｌｏら（１９９８）は、Ｂ４ＧＡＬＴガラクトシルトランスフェラーゼファミリーの６つの膜を分析した。ノーザンブロット分析は、これらのホモログに対して、Ｂ４ＧＡＬＴ１のみがマウスの授乳中の乳腺に発現することを示した。彼らは、Ｂ４ＧＡＬＴ１ヌルマウスがラクトースを生産し得ないことを述べた。従って、Ｂ４ＧＡＬＴ１は、哺乳動物の発達の間、ラクトース生合成を増大した（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）遺伝子であるようである。
【０３４７】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１５タンパク質およびＮＯＶ１５核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１５が、ガラクトシルトランスフェラーゼファミリーに特徴的な重要な構造機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的もしくは選択的な、核酸診断マーカーおよび／もしくは核酸予後マーカーまたはタンパク質診断マーカーおよび／もしくはタンパク質予後マーカーとして役立つものが挙げられ、ここで、その核酸もしくはそのタンパク質の存在、またはその核酸もしくはそのタンパク質の量が評価され、そして、これらとしては、以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０３４８】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害ならびに／または他の病理に関係する潜在的な診断適用および治療適用に有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患する患者の処置に対して有効性を有する：プロテオデルマタン硫酸、ＰＤＳの欠損生合成、デルマタン硫酸プロテオグリカンキシロシルプロテイン４−β−ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損の欠損生合成、ｘｇｐｔ欠損ガラクトシルトランスフェラーゼＩ欠損、エーレルス−ダンロー症候群、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心疾患、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室管（Ａ−Ｖ）欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、子宮内膜症、受胎能、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０３４９】
本発明のガラクトシルトランスフェラーゼ様タンパク質をコードする新規核酸またはそれらのフラグメントは、診断的用途において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１０タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。１つの実施形態では、企図されるＮＯＶ１５エピトープは、アミノ酸約３０〜約４５である。別の実施形態では、企図されるＮＯＶ１５エピトープは、アミノ酸約６０〜約６５である。他の特定の実施形態では、企図されるＮＯＶ１５エピトープは、アミノ酸約８０〜約１１０、約１４０〜約１４５、約１５５〜約１６５、約１７０〜約１７５、約１８０〜約１８３、約１９０〜約１９２および約２１０〜約２６０である。
【０３５０】
（ＮＯＶ１６）
新規のリンパ球抗原前駆体様タンパク質をコードする開示されたＮＯＶ１６核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５６３０３−０１と名付けられる）は、４４７ヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）を含み、そして表１６Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３１〜３３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド４１８〜４２０においてＴＧＡコドンで終了すると同定された。終止コドンから下流の推定非翻訳領域は、表１３Ａにおいて下線が引かれ、そして開始コドンおよび終止コドンは太字である。
【０３５１】
【表１６Ａ】

ＮＯＶ１６の核酸配列は、第８染色体にマップし、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（特許ＷＯ９６３５８０８由来の配列１）由来ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ａ５８０８４｜ａｃｃ：Ａ５８０８４ｍＲＮＡに対して４４０塩基中３８３塩基（８７％）の同一性を有する（Ｅ＝３．６ｅ^−６７）。
【０３５２】
ＮＯＶ１６ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）は、１２９アミノ酸残基であり、そして表１６Ｂに一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１６がシグナルペプチド含み、そしておそらく０．９１９０の確実性で原形質膜に局在化されることを予測する。別の実施形態において、ＮＯＶ１６は、０．２０００の確実性でリソソーム（膜）に、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に、または０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在化される。ＮＯＶ１６に対する最も可能性のある切断部位は、アミノ酸２０とアミノ酸２１との間（ＡＱＡ−ＬＤ）である。
【０３５３】
【表１６Ｂ】

ＮＯＶ１６のアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＡＮＴＩＧＥＮＬＹ−６ＤＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（Ｅ４８ＡＮＴＩＧＥＮ）由来１２８アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ１４２１０タンパク質に対して１２９アミノ酸残基中１００アミノ酸残基（７７％）の同一性、および１２９アミノ酸残基中１０８アミノ酸残基（８３％）の類似性を有する。（Ｅ＝５．１ｅ^−４８）
ＮＯＶ１６は、少なくとも以下の組織で発現されると予測される：ヒト胸部腺癌。
【０３５４】
可能な小数のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、表１６Ｃに列挙されるＮＯＶ１６を見出した。
【０３５５】
【表１６Ｃ】

ＮＯＶ１６はまた、表１６Ｄに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータ中に示されるアミノ酸配列に相同である。
【０３５６】
【表１６Ｄ】

これらの配列の相同性を、表１６Ｅに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。
【０３５７】
【表１６Ｅ】

表１６Ｆは、ＮＯＶ１６に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ１６配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【０３５８】
【表１６Ｆ】

Ｌｙ−６Ａ．２分子およびＬｙ−６Ｅ．１分子は、相反しそしてＭＡＬＡ−１と同一である。オクチルグルコシド中で可溶化そして電気泳動的に分離されるリンパ球の表面タンパク質のウェスタンブロットによって、Ｌｙ−６Ａ．２抗原またはＬｙ−６Ｅ．１抗原と同時移動するバンドを検出した。細胞上または免疫アッセイにおいて、これらはＬｙ−６Ａ．２またはＬｙ−６Ｅ．１に対する同種異系抗体をブロックした。ＭＡＬＡ−１の組織分布はまた、Ｌｙ−６Ａ．２またはＬｙ−６Ｅ．１と相関した。オクチルグルコシドまたはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、これらの抗原は同じ大きさを示した。従って、Ｌｙ−６Ａ．２およびＬｙ−６Ｅ．１は代替の対立遺伝子を最も生産しそうである。電気泳動分析は、Ｌｙ−６Ａ．２、Ｌｙ−６Ｂ．２、Ｌｙ−６Ｄ．２およびＬｙ−２７．２．Ｌｙ−６Ｃ．２ならびにＬｙ−２８．２に対する類似の大きさおよび電荷が同一であるようであり、そしてＬｙ−６Ａ．２については同じ大きさであるが、電荷および内鎖ジスルフィドの拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）において異った。Ｌｙ−６Ｄ．２およびＬｙ−２７．２は、Ｌｙ−６Ａ．２分子上の同じまたは異なるエピトープを表し得るので、以前に仮定された、組織分布に基づいて分離可能と考えられる５つのＬｙ−６様抗原は、オクチルグリコシドを含むゲルの電気泳動の移動度によって２つの異なるカテゴリーのうちの１つに割当てられ得る３個以下の別個のタンパク質を表し得る。
【０３５９】
競合的結合研究および免疫沈降実験は、Ｌｙ−６−結合遺伝子（Ｌｙ−６Ａ．２、Ｌｙ−６Ｂ．２、Ｌｙ−６Ｃ．２、Ｌｙ−６Ｄ．２およびＴｈＢ）によってコードされた少なくとも５つの異なるエピトープを規定する。３３ｋｄタンパク質のＬｙ−６Ｃ．２およびＬｙ−６Ｄ．２は、それぞれ、１０％〜２０％または９０％より高いそれらの独特な胸腺反応よって識別され得る密接な重複エピトープである。同様に、１４ｋｄ部分に存在するＬｙ−６Ｃ．２抗原は、Ｌｙ−６Ｂ．２抗原と弱く重複する。しかし、Ｌｙ−６Ｃ．２抗原およびＬｙ−６Ｂ．２抗原は、Ｌｙ−６Ａ．２およびＬｙ−６Ｄ．２と異なる。ＴｈＢは、他のいずれの「Ｌｙ−６」抗原とも細胞表面で関連しない１６〜１８ｋｄの抗原である。さらに、Ｌｙ−６Ｃ．２に作製された独立して誘導された抗体は、Ｌｙ−６Ａ．２およびＬｙ−６Ｂ．２に対する抗原を検出するので、同一のエピトープを検出する。これらの結果は、これらの各分子の単一抗原性部位の存在を意味する。
【０３６０】
これらが認識する抗原およびこれらが実行するエフェクター機能における差異に関わらず、Ｂリンパ球およびＴリンパ球は、応答を開始するために著しく類似したシグナル形質導入成分を使用する。これらの両方は、異なる認識およびシグナル形質導入サブユニットを含むオリゴマーレセプターを使用する。両方の細胞上の抗原レセプター（これらは、一般的な進化した前駆体からおそらく進化した）は、一般的な配列モチーフ（ＡＲＡＭ）を介して、これらの不変鎖の細胞テールにおいて少なくとも２つの異なるＰＴＫのファミリーと相互作用する。補助受容体は、リガンド結合およびシグナル形質導入に影響する事象を介して、これらのレセプター系の両方の感受性を増加するように働くようである。下流のシグナル伝達成分（例えば、ホスホリパーゼＣ）のチロシンリン酸化の重要な役割は、抗原レセプター制御ＰＴＫおよびＰＴＰａｓｅの作用のバランスにおける変化の正味の結果である。リンフォカイン遺伝子発現のような細胞応答を制御する下流エフェクター（カルシニュリンおよびＲａｓを含む）の同定は、将来、リンパ球において原形質膜から核までの複合経路を結合し得ることを期待する。ＴＣＲ刺激およびＢＣＲ刺激のシグナル伝達経路の下流の研究から得られる洞察は、発達細胞および成熟細胞における異物から自己のリンパ球の分化および区別を担う機構の将来の理解に十分に貢献しそうである。
【０３６１】
Ｅ４８抗原（２０ｋＤタンパク質の推定ヒトホモログが、ウシ鼻鏡部のデスモソーム調製物に存在し、そして以前にデスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ）ＩＩＩ（ｄｇ４）と呼ばれた）は、ヒトの扁平上皮細胞癌腫の抗体に基づく治療のための有望な標的抗原である。高い抗体用量処置の効果を予測するために、そして発癌における抗原の可能な生物学的関与を評価するために、発明者らは抗原の分子的な特徴付けを試みた。Ｅ４８抗原をコードするｃＤＮＡクローンは、ＣＯＳ細胞中での発現クローニングによって単離された。配列分析は、クローンが１２８アミノ酸のオープンリーディングフレームを含み、１３，２８６ｋＤのコアタンパク質をコードすることを示した。データベース検索は、Ｅ４８抗原がマウスＴｈＢ抗原（Ｌｙ−６抗原ファミリーのメンバー）と高いレベルの配列類似性を有することを示した。ホスホファチジルイノシトール特異的（ＰＩ−特異的）ホスホリパーゼ−Ｃ処置は、Ｅ４８抗原が原形質膜に対するグリコシルホスホファチジルイノシトール結合（ＧＰＩ結合）であることを示した。Ｅ４８抗原をコードする遺伝子は、単一コピー遺伝子であり、ヒト第８染色体の８ｑ２４−ｑｔｅｒ領域に局在される。遺伝子の発現は、ケラチノサイトおよび扁平上皮腫瘍細胞に制限される。リンパ球直系の細胞上の抗原として本来同定された推定のマウスホモログ（ＴｈＢ抗原）は、扁平上皮マウスの上皮中で高く発現されることが示された。さらに、ＴｈＢ発現レベルはケラチノサイト中に存在し、対照的にリンパ球ではマウス株には関連しない。マウスＳＶ４０ポリオーマのトランスフェクションは、抗原が細胞−細胞接着におそらく関与することが確認されたＥ４８ｃＤＮＡを用いて、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を形質転換した。
【０３６２】
Ｔｈｂ遺伝子座は、マウス胸腺細胞およびＢ細胞で１５ｋＤａのホスホファチジルイノシトール結合分子（ＴｈＢ）の発現を担う。ｍＡｂで検出されるようなＴｈｂの発現は２つの対立遺伝子を有するＢ細胞で多型性であり、ＴｈｂｈおよびＴｈｂ１はＢ細胞でのＴｈＢの高い発現および低い発現を担う。Ｔｈｂ発現の調節遺伝子座は、Ｃｈｒ１５に対する遺伝子のＬｙ−６クラスターにマップした。本発明者らの研究において、本発明者らは、ＣＯＳ細胞中での発現クローニングを使用して、トランスフェクション後のＴｈｂをコードするｃＤＮＡクローンを単離した；このｃＤＮＡ産物は抗ＴｈＢ抗体と反応するが、Ｌｙ−６Ａ．２抗体、Ｌｙ−６Ｂ．２抗体、Ｌｙ−６Ｃ．２抗体、またはＬｙ−６Ｄ．２抗体とは反応しない。これらのクローンの１つのｐＴｈＢ−Ａは、配列決定された７０２塩基の挿入を含む。翻訳されたアミノ酸配列は、１１個のシステイン残基を有し、そして潜在的Ｎ結合グリコシル化部位の非存在ではともに、Ｌｙ−６分子の構造に類似する。ＴｈＢｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｌｙ−６遺伝子およびＬｙ−６関連ヒトＣＤ５９のものと比較され、そして明確な相同性を示した。最後に種間の交雑を用いて、構造的なＴｈｂ遺伝子は、Ｃｈｒ１５にマップされた；従って、構造遺伝子および調節遺伝子の両方が類似の部位にマップする。Ｌｙ−６付近の遺伝子的マップ位置および配列類似性は、ＴｈｂおよびＬｙ−６が遺伝子の重複による同じ祖先に由来し得ることを示唆する。
【０３６３】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１６タンパク質およびＮＯＶ１６核酸についてのタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１６が、ＴＧＦファミリーに特徴的な重要な構造機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、ならびに、研究ツールとして有用である。これらは、特異的もしくは選択的な、核酸診断マーカーおよび／もしくは核酸予後マーカーまたはタンパク質診断マーカーおよび／もしくはタンパク質予後マーカーとして役立つものが挙げられ、ここで、その核酸もしくはそのタンパク質の存在、またはその核酸もしくはそのタンパク質の量が評価され、そして、これらとしては、以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０３６４】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される様々な疾患および障害ならびに／または他の病理に関係する潜在的な診断適用および治療適用に有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に罹患する患者の処置に対して有効性を有する：癌、外傷、再生、ウイルス感染／細菌感染／寄生虫感染。
【０３６５】
本発明のリンパ球抗原前駆体様タンパク質をコードする新規核酸またはそれらのフラグメントは、診断的用途において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ１６タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。１つの実施形態では、企図されるＮＯＶ１６エピトープは、アミノ酸約２５〜約３０である。別の実施形態では、企図されるＮＯＶ１６エピトープは、アミノ酸約５０〜約７０である。他の特定の実施形態では、企図されるＮＯＶ１０エピトープは、アミノ酸約８２〜約１０２である。
【０３６６】
（ＮＯＶ１７）
新規なペプシノーゲンＣ様タンパク質をコードする開示されたＮＯＶ１７核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６３０７−０１とも呼ばれる）は、１２７０ヌクレオチド（配列番号５３）を含み、これを表１３Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８〜１０においてＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１１２４〜１１２６においてＴＡＧコドンで終わることを同定した。終止コドンより下流の推定非翻訳領域を、表１７Ａにおいて下線で示し、開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０３６７】
【表１７Ａ】

ＮＯＶ１７の核酸配列は、染色体１６ｑ２１．３−ｐ２１．１にマッピングされ、そして本発明は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＰＧＣＡ｜ａｃｃ：Ｊ０４４４３．１ｍＲＮＡ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓペプシノーゲンＣ（ＰＧＣ）ｍＲＮＡ、完全コード）に対して、１２７７塩基中１１７１塩基（９１％）の同一性を有する（Ｅ＝７．０ｅ^−２２８）。
【０３６８】
ＮＯＶ１７ポリペプチド（配列番号５４）は、３７２アミノ酸残基であり、そして表１７Ｂに１文字コードを使用して提示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ１７が、シグナルペプチドを有し、そして０．８２００の確実性で細胞外に局在するようであることが予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ１７は、０．２０７６の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在するか、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に局在するか、または０．１０００の確実性で小胞体（管腔）に局在する。ＮＯＶ１７ペプチドについての最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸１６とアミノ酸１７との間（ＬＥＡ−ＡＶ）である。
【０３６９】
【表１７Ｂ】

ＮＯＶ１７アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の３８８アミノ酸残基ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２０１４２タンパク質（ＧＡＳＴＲＩＣＳＩＮＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．４．２３．３））（ＰＥＰＳＩＮＯＧＥＮＣ）に対して、３８８アミノ酸残基のうち３７２アミノ酸残基（９５％）の同一性、および３８８アミノ酸残基のうち３７２アミノ酸残基（９５％）の類似性を有する（図３Ｂ）。本発明の配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２０１４２タンパク質（ＧＡＳＴＲＩＣＳＩＮＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．４．２３．３））（ＰＥＰＳＩＮＯＧＥＮＣ）と比較した場合、１６個の内部アミノ酸を欠失している（Ｅ＝１．１ｅ^−１９７）。
【０３７０】
ＮＯＶ１７は、少なくとも以下の組織で発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮、大動脈、十二指腸、胆嚢、肝臓、肺、肺胸膜、リンパ節、卵巣、末梢血。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ供給源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ（文献）供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって誘導された。さらに、この配列は、胃粘膜において発現されることが推定される。なぜなら、（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＰＧＣＡ｜ａｃｃ：Ｊ０４４４３．１）の発現パターンは、ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓペプシノーゲンＣ（ＰＧＣ）ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ種における完全コードホモログ）に密接に関連するからである。
【０３７１】
ＮＯＶ１７はまた、表１７Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０３７２】
【表１７Ｃ】

これらの配列の相同性は、表１７Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図的に示される。
【０３７３】
【表１７Ｄ】

表１７Ｅは、ＮＯＶ１７に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメイン内容を列挙する。これは、ＮＯＶ１７配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質に類似の特性を有することを示す。
【０３７４】
【表１７Ｅ】

胃アスパラギン酸プロテイナーゼ（ペプシンＡ、ペプシンＢ、ガストリクシン／ペプシノーゲンＣおよびキモシン）は、チモーゲンとして知られる不活性前駆体として胃粘膜内で合成される。胃チモーゲンは、それぞれプロセグメント（すなわち、活性酵素のＮ末端にさらなる残基を含み）、これは、不活性形態を安定化し、そして活性部位への基質の侵入を妨げるように作用する。食物の摂取の際に、チモーゲンのそれぞれは、胃の管腔内へ放出され、そして酸性の胃液中で活性酵素への変換を受ける。この活性化反応は、酸性ｐＨ値で、プロセグメントと活性酵素部分との間の静電相互作用の崩壊によって開始される。その活性形態へのチモーゲンの変換は、複雑なプロセスであり、このプロセスは、一連のコンフォメーション変化および結合切断工程に関連し、活性部位の露出（ｕｎｖｅｉｌｉｎｇ）ならびに最終的には酵素の活性中心からのプロセグメントの除去および解離を導く。この活性化反応の間、プロセグメントおよび活性酵素の両方は、コンフォーメーションにおける変化を受け、そしてプロセグメントのタンパク質分解性の切断が、分子内反応または分子間反応のいずれかによって１つ以上の工程で生じ得る。タンパク質分解の機構における可変性は、プロセグメントの構造に部分的に起因するようである。４つの型の胃チモーゲンの間および同一型のチモーゲンの種間での活性化機構における相違のために、単一の活性化のモデルは、提案され得ない。
【０３７５】
ペプシノーゲンは、ペプシン（典型的なアルパラギン酸プロテイナーゼであり、胃腺の主細胞において合成される）の不活性前駆体である。ペプシノーゲンの２つの主要な群、すなわち、ペプシノーゲンＡ（ＰＧＡ）およびペプシノーゲンＣ（ＰＧＣ）（すなわち、プロガストリクシン）が存在し、そしてそれぞれは、頻繁にアイソチモーゲン（ｉｓｏｚｙｍｏｇｅｎ）を有する。２つのペプシノーゲンの発現の相対程度は、動物種の間で変動し、さらに、これらの生合成は、ガストリンおよびセクレチンのような生理活性ペプチドによって影響されることが知られている。しかし、ペプシノーゲン生合成の調節機構、従ってペプシノーゲン遺伝子発現は、いまだに明らかでない。従って、このような研究のためにペプシノーゲン遺伝子の一次構造を解明することは根本的に重要であると考えられる。ヒトＰＧＡ遺伝子およびヒトＰＧＣ遺伝子ならびにラットＰＧＣ遺伝子の構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、本質的に同一であり；対応するプレペプシノーゲンのアミノ酸配列をコードする各遺伝子は、種々の長さの８つのイントロンによって９つのエキソンに分離されていることが見出された。これらの結果は、これらの遺伝子が、全て共通の祖先の遺伝子に由来することを示す。しかし、ヒトＰＧＡ遺伝子の５’隣接領域は、ヒトＰＧＣ遺伝子およびラットＰＧＣ遺伝子の５’隣接領域との異なり、一方、ヒトＰＧＣ遺伝子およびラットＰＧＣ遺伝子の５’隣接領域は、互いに類似した。従って、ＰＧＡ遺伝子およびＰＧＣ遺伝子の発現は、幾分異なって調節されることが示唆される。ヒトアスパラギン酸プロテイナーゼ（ペプシノーゲンＡ、ペプシノーゲンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥおよびレニン）についての遺伝子の比較分析は、それらのそれぞれのコード配列およびエキソン−イントロン接合部位置に関して高い類似性を明らかにしている。
【０３７６】
活性部位アスパルチル基を含有する領域の高い（ｓｔｒｏｎｇ）保存にも関わらず、遺伝的多型は、カテプシンＤ以外のプロテイナーゼ遺伝子のそれぞれについて同定されてきた。これらの遺伝的多型は、連鎖地図に関する遺伝子の位置決定（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）および遺伝子コピー数の決定のために有用である。各アスパルチルプロテイナーゼの染色体位置は、体細胞ハイブリッドマッピングパネルの分析、分裂中期染色体調製物に対するインサイチュハイブリダイゼーションおよび多型マーカーを用いる家系連鎖分析を含む、組換えＤＮＡプローブを使用する種々の遺伝子マッピング方法によって決定されてきた。ペプシノーゲンＡは、アスパラギン酸プロテイナーゼの中で最も広範な多型を示し、ペプシノーゲンＡは、タンパク質電気泳動によってか、またはＤＮＡ分析によって検出され得る。それぞれのＤＮＡプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子のコード部分および非コード部分に位置したヌクレオチド差異を明らかにしてきた。これらの多型は、遺伝的に影響された臨床状態におけるそれぞれのプロテイナーゼの潜在的な役割を研究するために使用され得る。分岐したヌクレオチド配列反復のＰＣＲ増幅によって検出されるさらに高度な多型マーカーの開発は、特定の臨床疾患（例えば、潰瘍および高血圧症）を有し得るアスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝的改変の効果の考証に非常に役立つ。ＰＧＣ遺伝子多型は、胃潰瘍に関連し、そして胃潰瘍に対する遺伝的疾病素因の無症状マーカーであり得る。ペプシノーゲンＡ（ＰＧＡ）およびペプシノーゲンＣ（ＰＧＣ）の血清決定は、胃粘膜の炎症および萎縮症を示し得る。身体の胃粘膜は、ＰＧＡおよびＰＧＣの両方を生成するが、洞の粘膜は、ＰＧＣのみ生成する。従って、主に洞に関する疾患（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染）は、主として、血清ＰＧＡよりも血清ＰＧＣにおける改変体によって示される。一致して、洞粘膜が、より毒性のｃａｇＡポジティブＨ．ｐｙｌｏｒｉ株によって感染される場合、これは、重篤な炎症を生じ、血清ＰＧＣが有意に増加する。
【０３７７】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１７タンパク質およびＮＯＶ１７核酸に対するタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１７が真核生物のアスパルチルプロテアーゼファミリーの重要な構造的および／または生理学的機能の特徴を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的なまたは選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとして機能すること（ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに以下のような潜在的な治療適用を含む：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０３７８】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病理と関係付けられる潜在的な診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、潰瘍、高血圧症（ＳｃａｎｄＪＣｌｉｎＬａｂＩｎｖｅｓｔＳｕｐｐｌ１９９２；２１０：１１１〜９）、胃粘膜炎症および萎縮症、ならびに他の疾患、障害および状態などで苦しむ患者の処置に対して効力を有し得る。ＰＧＣ遺伝子多型は、胃潰瘍と関連し、そして胃潰瘍に対する遺伝的疾病素因の無症状マーカーであり得る（ＮｉｐｐｏｎＲｉｎｓｈｏ１９９６Ａｐｒ；５４（４）：１１４９〜５４）。ペプシノーゲンＡ（ＰＧＡ）およびペプシノーゲンＣ（ＰＧＣ）の血清決定は、胃粘膜炎症および萎縮症を示し得る。身体の胃粘膜は、ＰＧＡおよびＰＧＣの両方を生成するが、洞の粘膜は、ＰＧＣのみ生成する。従って、主に洞に関する疾患（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染）は、主として、血清ＰＧＡよりも血清ＰＧＣにおける改変体によって示される。一致して、洞粘膜が、より毒性のｃａｇＡポジティブＨ．ｐｙｌｏｒｉ株によって感染される場合、これは、重篤な炎症を生じ、血清ＰＧＣが有意に増加する（ＲｅｃｅｎｔｉＰｒｏｇＭｅｄ１９９９Ｊｕｎ；９０（６）：３４２〜６）。
【０３７９】
本発明のペプシノーゲンＣ様タンパク質をコードする新規な核酸、またはそのフラグメントは、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される場合、診断適用において有用である。これらの材料は、さらに、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＮＯＶ１０タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ１７エピトープは、アミノ酸約３０〜約６０である。別の実施形態において、企図されるＮＯＶ１７エピトープは、アミノ酸約１１０〜約１３０である。他の特定の実施形態において、企図されるＮＯＶ１７エピトープは、アミノ酸約１６０〜約１７０、約１８０〜約１８１、約２０１〜約２０２、約２０４〜約２０５、約２０７〜約２０８、約２４０〜約２５２、約２９０〜約３１０、約３４０〜約３４５または約３６０〜約３６５である。
【０３８０】
（ＮＯＶ１８）
新規なＡＲＬ様タンパク質をコードする開示されたＮＯＶ１８核酸（ＣｕｒａＧｅｎＡｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５６２９４−０１とも呼ばれる）は、１４８５９ヌクレオチド（配列番号５５）を含み、表１８Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１４８５７〜１４８５９においてＴＡＡコドンで終わると同定された。開始コドンおよび終止コドンを、表１８Ａにおいて太字で示す。
【０３８１】
【表１８Ａ】

ＮＯＶ１８の核酸配列は、染色体１２ｑ１２−ｑ１４にマッピングされ、そしてＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０１０４０４｜ａｃｃ：ＡＦ０１０４０４．１ｍＲＮＡ（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＡＬＲｍＲＮＡ、完全コード）に対して、１３１５３塩基中１３０８１塩基（９９％）の同一性を有する（Ｅ＝０．０）。
【０３８２】
ＮＯＶ１８ポリペプチド（配列番号５６）は、４９５２アミノ酸残基であり、そして表１８Ｂに１文字コードを使用して提示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ１８が、０．９８００の確実性で核に局在するようであることが予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ１８は、０．３０００の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在するか、０．１０００の確実性で糸粒体基質腔に局在するか、または０．１０００の確実性でリソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｙ）（管腔）に局在する。
【０３８３】
【表１８Ｂ】

ＮＯＶ１８アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の４９５７アミノ酸残基ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ１４９８７タンパク質（ＡＬＲ）に対して、４９５７アミノ酸残基のうち４９４６アミノ酸残基（９９％）の同一性、および４９５７アミノ酸残基のうち４９４６アミノ酸残基（９９％）の類似性を有する（Ｅ＝０．０）。
【０３８４】
ＮＯＶ１８は、少なくとも以下の組織で発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって誘導された。
【０３８５】
ＮＯＶ１８はまた、表１８Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０３８６】
【表１８Ｃ】

これらの配列の相同性は、表１８Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図的に示される。
【０３８７】
【表１８Ｄ】

表１８Ｅ、表１８Ｆ、表１８Ｇおよび表１８Ｈは、ＮＯＶ１８に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメイン内容を列挙する。これは、ＮＯＶ１８配列が、これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質に類似の特性を有することを示す。
【０３８８】
【表１８Ｅ】

【０３８９】
【表１８Ｆ】

【０３９０】
【表１８Ｇ】

【０３９１】
【表１８Ｈ】

ＡＬＬ−１遺伝子は、染色体転座または内部再配列を介したヒト急性白血病に関与する。ＡＬＬ−１は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｔｒｉｔｈｏｒａｘのヒトホモログである。後者（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｔｒｉｔｈｏｒａｘ）は、Ｐｏｌｙｃｏｍｂグループ（Ｐｃ−Ｇ）遺伝子と一緒に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの身体構造を決定について、それぞれポジティブ調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）およびネガティブ調節因子として作用する、ｔｒｉｔｈｏｒａｘグループ（ｔｒｘ−Ｇ）遺伝子のメンバーである。ＡＬＲ（ＡＬＬ−１関連タンパク質）は、巨大な５２６２アミノ酸長のタンパク質をコードし、ＳＥＴドメイン、５つのＰＨＤフィンガー、潜在的なジンクフィンガー、および疎水性残基（大部分はロイシン）によって中断される非常に長い連続したグルタミンを含む。ＳＥＴモチーフ、ＰＤＨフィンガー、ジンクフィンガーおよび２つの他の領域は、ＡＬＬ−１およびＴＲＸのドメインについて最も類似している。最初の２つのモチーフはまた、他のｔｒｘ−Ｇタンパク質およびＰｃ−Ｇタンパク質においても見出される。このＡＬＲ遺伝子は、ＶＤＲ遺伝子に隣接する染色体バンド１２ｑ１２−１３にマッピングされた。この領域は、癌に関連した重複および転座に関係付けられる。ＡＬＲ発現の分析は、約１８ｋｂ長のそのｍＲＮＡが、ＡＬＬ−１のように、肝臓を除いて種々の造血性細胞を含むほとんどの成人組織において発現されることを示した。マウス初期胚に対するホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションは、複数の組織における発現を示す。構造および発現パターンの類似性に基づいて、ＡＬＲは、ＡＬＬ−１およびｔｒｘと同様な役割を果たしそうであるが、その標的遺伝子は、未だに同定されていない（Ｐｒａｓａｄら、１９９７，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｖｏｌ．１５：５４９〜６０）。
【０３９２】
本明細書中に開示されるＮＯＶ１８タンパク質およびＮＯＶ１８核酸に対するタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ１８が細胞内ファミリーの重要な構造的および／または生理学的機能の特徴を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用ならびに研究ツールとして有用である。これらは、特異的なまたは選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとして機能すること（ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに以下のような潜在的な治療適用を含む：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０３９３】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病理と関係付けられる潜在的な診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、癌（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、転座関連白血病）、ならびに他の疾患、障害および状態などで苦しむ患者の処置に対して効力を有する。
【０３９４】
本発明のＡＬＲ様タンパク質をコードする新規な核酸、またはそのフラグメントは、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される場合、診断適用において有用である。これらの材料は、さらに、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＮＯＶ１８タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々が、免疫原として用いられ得る。
【０３９５】
（ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子に関する。ＮＯＶＸコード核酸（例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するに十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントもまた本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ、ならびにこれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。この核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡで構成される。
【０３９６】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で用いられる場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態もしくはプロタンパク質の産物である。この天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、非限定的な例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これは、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定され得る。産物の「成熟」形態は、この遺伝子産物が生じる細胞、または宿主細胞内で生じ得る場合に、１以上の自然に起こるプロセシング工程の結果として（再び、非限定的な例として）生じる。「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質をもたらすこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎを有する（ここで、残基１は、Ｎ末端メチオニンである）前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残っている残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残っている残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解切断事象以外の翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみの操作またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせから生じ得る。
【０３９７】
本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」は、特定の用途に依存して、種々の長さ（好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、ほぼ６，０００ｎｔ程度の長さ）の核酸配列をいう。プローブは、同一の、類似の、または相補的な核酸配列の検出に用いられる。より長い長さのプローブは、一般に、天然供給源または組換え供給源から得られ、より短い長さのオリゴマープローブより高度に特異的であり、かつよりゆっくりとハイブリダイズする。プローブは、１本鎖または２本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように設計され得る。
【０３９８】
本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」核酸分子は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）がない。例えば、種々の実施形態において、この単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然で隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含み得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術により生成された場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないこともでき、または化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないこともできる。
【０３９９】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの前述のヌクレオチド配列の相補体）は、標準的な分子生物学技術および本明細書中で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の核酸配列の全部または一部を用いて、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ２^ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌ，ら（編），ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，１９９３に記載される）。
【０４００】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または代わりにゲノムＤＮＡを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて、調製され得る。
【０４０１】
本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において使用される十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはこれらの配列から設計され得、そして特定の細胞もしくは組織中の同一の、類似の、または相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅、確認またはこれらの存在を明らかにするために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、５０ｎｔ長、または１００ｎｔ長、好ましくは、約１５ｎｔ〜３０ｎｔ長を有する、核酸配列の一部を含む。本発明の１つの実施形態において、１００ｎｔ長未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５、またはその相補体の少なくとも６つの連続するヌクレオチドをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとしても用いられ得る。
【０４０２】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に示されるヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９または４１に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９または４１に示されるヌクレオチド配列に十分相補的なものであり、これは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に示されるヌクレオチド配列に対してほとんどまたは全くミスマッチなく水素結合し得、これにより安定な二重鎖を形成する。
【０４０３】
本明細書中で用いられる場合、用語「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソンクリック塩基対形成またはフーグスティーン塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドもしくは化合物、または関連するポリペプチドもしくは化合物、またはこれらの組み合わせの間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合としては、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介し得るか、またはこの効果に起因し得る。直接的結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介して、またはこの効果に起因して生じない相互作用をいうが、代わりに、他の実質的な化学的中間体がない。
【０４０４】
本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個（連続する）核酸の配列または少なくとも４個（連続する）アミノ酸の配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして長くても全長配列未満の何らかの部分である。フラグメントは、選り抜きの核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にか、または改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される、核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する（が、同一ではない）構造を有するが、特定の構成要素または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０４０５】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列と比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性（好ましい同一性は、８０〜９５％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸が、ストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。
【０４０６】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはそれらの改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に存在する対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、ならびにＮＯＶＸの生物学的活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性は以下に記載されている。
【０４０７】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンによって途切れない。全タンパク質についてのコード配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始（ｓｔａｒｔ）」コドンで始まり、そして３つの「終止（ｓｔｏｐ）」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）のうちの１つで終結する。本発明の目的のために、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方を有するかまたは有さない、コード配列の任意の部分であり得る。ｂｏｎａｆｉｄｅ細胞タンパク質のコードのための良好な候補としてみなされるＯＲＦについて、最小サイズの必要条件（例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡストレッチ）がしばしば設定される。
【０４０８】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＮＯＶＸホモログ、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の天然に存在する変異体のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０４０９】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じか、または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞サンプル中のＮＯＶＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡレベルを検出すること）またはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているかもしくは欠失しているか否かを決定することによって使用され得る。
【０４１０】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、本発明のポリペプチド（成熟形態を含む）の活性に類似するが、必ずしも同一ではない活性を示す、用量依存性を有するかまたは有さない、ポリペプチドをいう。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸの生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を（例えば、インビトロでの組換え発現によって）発現させ、そしてＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。
【０４１１】
（ＮＯＶＸの核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする、核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０４１２】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、このＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、ＮＯＶＸタンパク質（好ましくは、脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、かつこのＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるＮＯＶＸポリペプチド内のアミノ酸多型は、本発明の範囲内であることが意図される。
【０４１３】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、ヒトの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０４１４】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を記載することを意図する。
【０４１５】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０４１６】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）については、少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについては、少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、不安定化剤の添加によって達成され得る。
【０４１７】
ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄である。ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０４１８】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中での５５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０；ＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＲＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０４１９】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、２×ＳＳＣ、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーションについて用いられるような条件）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＲＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０４２０】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされ得ることを、当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０４２１】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５とはアミノ酸配列が異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に対してして少なくとも約８０％相同であり；さらにより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に対して少なくとも約９５％相同である。
【０４２２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失が、このコードされるタンパク質に導入される。
【０４２３】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にてなされる。「保存的アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異が、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体がＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の変異誘発後、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０４２４】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されるアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るアミノ酸によりグループ化されている）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表す）。
【０４２５】
１つの実施形態では、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質とＮＯＶＸのリガンドとの間の複合体形成；または（ｉｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質または生物学的に活性なその部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０４２６】
なお別の実施形態において、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能（例えば、インスリン放出の調節）を調節する能力についてアッセイされ得る。
【０４２７】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、ＮＯＶＸコード鎖全体の少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたは全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０４２８】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０４２９】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、種々に改変されたヌクレオチドを用いて、化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０４３０】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、発現ベクターを用いて生物学的に生成され得、このベクター中で、核酸は、アンチセンス方向でサブクローニングされている（すなわち、その挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡである）。
【０４３１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果、それらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれらに結合し、それによって、（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）このタンパク質の発現を阻害する。このハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介して行われ得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように、（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０４３２】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、このハイブリッドでは、通常のβ−ユニットとは対照的に、これらの鎖は、互いに平行に延びる。例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０４３３】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変された塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために少なくとも一部で実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０４３４】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ１９８８．Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５−５９１に記載されるようなハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＮＯＶＸｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによって、ＮＯＶＸｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内の切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９ＩＶＳＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＮＯＶＸｍＲＮＡはまた、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択するために、使用され得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０４３５】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ１４：８０７−１５を参照のこと。
【０４３６】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変されて、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍ４：５−２３を参照のこと。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」とは、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０４３７】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、（例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる）遺伝子発現の配列特異的調節のための、アンチセンス剤または抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子における一塩基対変異の分析（例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ））において；他の酵素（例えば、Ｓ_１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと）使用され得る。
【０４３８】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油性基もしくは他のヘルパー基を結合することによってか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。そのようなキメラは、ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供しながら、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６．ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る。例えば、Ｍａｇら，１９８９．ＮｕｃｌＡｃｉｄＲｅｓ１７：５９７３〜５９８８を参照のこと。次いで、ＰＮＡモノマーが段階的様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有する、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０４３９】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする因子。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８〜９７６を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０４４０】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、その配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に提供される。本発明はまた、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に示される対応する残基から変化され得るが、なおそのＮＯＶＸの活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする、変異体または改変体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。
【０４４１】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、その配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換されており、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む、任意の改変体を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０４４２】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０４４３】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＮＯＶＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を（乾燥重量にて）約３０％未満、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、これらはまた、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのＮＯＶＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０４４４】
用語「化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体からも他の化学物質から分離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０４４５】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはこのようなＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０４４６】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０４４７】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６に実質的に相同であり、そして以下に詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０４４８】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、その分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０４４９】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０ＪＭｏｌＢｉｏｌ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ生成ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０４５０】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０４５１】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質またはＮＯＶＸ融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一かまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質の全てまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態においてＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０４５２】
１つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０４５３】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０４５４】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＮＯＶＸリガンドを精製するために用いられ得、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０４５５】
本発明のＮＯＶＸキメラまたはＮＯＶＸ融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または付着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得、このフラグメントは、次いで、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合成分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０４５６】
（ＮＯＶＸのアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体（例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の活性の１つ以上を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体における副作用がさらに少ない。
【０４５７】
ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニスト活性またはＮＯＶＸタンパク質アンタゴニスト活性についてＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的に連結することによって、産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする全ての配列の供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０４５８】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下で、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ_１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０４５９】
点変異または短縮化により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く用いられる技術は、代表的には、複製可能な発現ベクター中に遺伝子ライブラリーをクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技術であるリクルーシブアンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅｅｎｓｅｍｂｌｅｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６：３２７−３３１を参照のこと。
【０４６０】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体もまた本発明に含まれる。用語「抗体」とは、本明細書において用いる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合（抗原と免疫反応）する抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆ_ａｂフラグメント、Ｆ_ａｂ’フラグメント、およびＦ_{（ａｂ’）２}フラグメント、ならびにＦ_ａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ヒトから得た抗体分子は、この分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。特定のクラスは、同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２等）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に関する本明細書における言及は、ヒト抗体種のこのようなクラス、サブクラス、およびタイプの全てに関する言及を包含する。
【０４６１】
本発明の単離されたＮＯＶＸ関連タンパク質は、抗原またはその一部もしくはフラグメントとして機能することが意図され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長のタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が、全長タンパク質と、またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するように、そのエピトープを包含する。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、その表面上に位置するタンパク質の領域である；通常これらは親水性領域である。
【０４６２】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、ＮＯＶＸ関連タンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸ関連タンパク質配列の疎水性分析によって、ＮＯＶＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って抗体産生を標的するのに有用な表面残基をコードする可能性が高いかが示される。抗体産生を標的するための手段として、親水性領域および疎水性領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかである、ＫｙｔｅＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐＷｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、その各々がその全体において本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体もまた、本明細書中で提供される。
【０４６３】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０４６４】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０４６５】
（ポリクロナール抗体）
ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または上記の誘導体を用いる１回以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を示す化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０４６６】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクロナール抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ（ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０４６７】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の唯一の分子種を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団の全ての分子に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０４６８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫因子で代表的に免疫され、その免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０４６９】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、ヒト起源の細胞が所望される場合に末梢血リンパ球が使用されるか、または、非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳＡＮＤＰＲＡＣＴＩＣＥ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する）を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマのための培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０４７０】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に敏感な細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、それらは、例えば、ＳａｌｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｅｌｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＹＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳＡＮＤＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０４７１】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０４７２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によって、クローンをサブクローニングし得、そして標準的な方法によって増殖し得る。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０４７３】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０４７４】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインについてのコード配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部の、免疫グロブリンコード配列への共有結合的な連結によって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域の代りに用いられ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代りに用いられ得、キメラの二価抗体を作製する。
【０４７５】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こすことなく、ヒトへの投与に適切である。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または抗体の他の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を用いることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。これらの内で、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０４７６】
（ヒト抗体）
完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の、本質的に全体配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＡＮＤＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８３．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）によってか、またはインビトロでのエプスタイン−バー−ウイルスを用いたヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＡＮＤＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）によって産生され得る。
【０４７７】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体の産生が観察され、このことは全ての点（遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ３６８８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６５−９３（１９９５））。
【０４７８】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答する動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主における重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は、無能にされており、そしてヒト重鎖免疫グロブリンおよびヒト軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座は、宿主のゲノムに挿入される。例えば、不可欠なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅ^ＴＭと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原での免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製物として）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０４７９】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。それは、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：胚性幹細胞において少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からこのＪセグメント遺伝子を欠失し、この遺伝子座の再構成を防止し、かつ、再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する工程であって、ここでこの欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含むベクターを標的化することによってもたらされる、工程；ならびにその胚性幹細胞から、その体細胞および生殖細胞が選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む、トランスジェニックマウスを作製する工程。
【０４８０】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するためにそれら２つの細胞を融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０４８１】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための関連する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０４８２】
（Ｆ_ａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために技術が適応され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆ_ａｂ発現ライブラリーの構築のために方法が適応され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦ_ａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下に挙げられるがこれらに限定されない当該分野で公知の技術によって、産生され得る：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ_{（ａｂ’）２}フラグメント；（ｉｉ）Ｆ_{（ａｂ’）２}フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦ_ａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦ_ａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆ_ｖフラグメント。
【０４８３】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化されたモノクローナル抗体）である。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして、この第２の結合標的は、有利に、細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０４８４】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的には、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここで、この２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１ＥＭＢＯＪ．、１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０４８５】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合物は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の部分を含む。この融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および所望される場合、この免疫グロブリンの軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０４８６】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するように操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖と同一または同様のサイズの補完的な「空洞（キャビティ）」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０４８７】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）_２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０４８８】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）_２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの指向性化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。このように、形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘因し得る。
【０４８９】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術がまた、記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間で対形成できないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインは、別のフラグメントの相補的なＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０４９０】
２より多くの結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０４９１】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球上の誘引分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））と結合するアームと結合し得、細胞性防御機構を、この特定の抗原を発現する細胞に集中させる。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレート剤（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０４９２】
（ヘテロ接合体抗体）
ヘテロ接合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合体抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を使用して調製され得ることが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０４９３】
（エフェクター機能の操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの能力および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され得、これは二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０４９４】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性の因子（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合体化した抗体を含む免疫結合体に関する。
【０４９５】
このような免疫結合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、薬用サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、および^１８６Ｒｅが挙げられる。
【０４９６】
抗体および細胞傷害性因子の結合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０４９７】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない結合体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０４９８】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法としては、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、このようなドメインを所有しているＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の所望のドメインについて特異的である抗体がまた、本明細書において提供される。
【０４９９】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的サンプル中のＮＯＶＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０５００】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸポリペプチドの精製、および宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清における）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられて、ＮＯＶＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断的に用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈが挙げられる。
【０５０１】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクター（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）が導入される宿主細胞中で自律複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０５０２】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０５０３】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０５０４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０５０５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおいて実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を増加させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０５０６】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０５０７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を欠損した宿主細菌中でそのタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０５０８】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０５０９】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０５１０】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ．第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０５１１】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）（特に、Ｔ細胞レセプターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１−７４８））、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．３：５３７−５４６））。
【０５１２】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡａｓａｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｏｏｌｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０５１３】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変はその後の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０５１４】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０５１５】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で容認されている種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ．第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０５１６】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションに関して、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０５１７】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０５１８】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入された、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＮＯＶＸ配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＮＯＶＸ配列が変更された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、ここで、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、かつ成熟動物のゲノムに残存し、それによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、この動物において、内因性のＮＯＶＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０５１９】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）受精卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびその卵母細胞を偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒａｎｉｍａｌ）中で発達させることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヒトのＮＯＶＸｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトのＮＯＶＸｃＤＮＡ（上記にさらに記載された）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、その導入遺伝子の発現の効率を増大させるために、導入遺伝子中に含まれ得る。組織特異的調節配列は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指向させるように、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧＴＨＥＭＯＵＳＥＥＭＢＲＹＯ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に交雑され得る。
【０５２０】
相同組換え動物を作製するために、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ここで、この遺伝子には、欠失、付加、または置換が導入され、それによってそのＮＯＶＸ遺伝子が変更されている（例えば、機能的に破壊されている）。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５のヒトのＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおける内因性のＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、その内因性のＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）。
【０５２１】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接されることにより、相同組換えが、ベクターによって保有される外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：９１５を参照のこと）。
【０５２２】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳＡＮＤＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳ：ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。相同組換えされたＤＮＡをその生殖細胞中に保有する子孫は、動物を育種するために使用され得、ここでこの動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０５２３】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０５２４】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクル（ｇｒｏｗｔｈｃｙｃｌｅ）から出て、Ｇ_０期に入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離されたのと同種の動物由来の除核された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、この細胞は桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０５２５】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログは、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考教科書であって、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンゲル（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０５２６】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量のバイアル中に封入され得る。
【０５２７】
注入用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、および滅菌注入可能溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ^ＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒体であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、要求される粒子サイズを維持することによって（分散物の場合）および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の吸収期間の延長は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０５２８】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中で、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散物は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）の分散媒体および上記で列挙される成分からの必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０５２９】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立てられ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０５３０】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０５３１】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０５３２】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０５３３】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの物質はまた、ＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０５３４】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定され、そして、これらに直接依存する。
【０５３５】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得る（例えば、レトロウイルスベクター）場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０５３６】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０５３７】
（スクリーニングおよび検出の方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＮＯＶＸタンパク質を（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）発現するため、ＮＯＶＸｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分もしくは過剰な産生によって、あるいはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害（例えば；糖尿病（インスリン放出を調節する）；肥満（脂質を結合および輸送する）；肥満に関連した代謝障害、代謝症候群Ｘ、ならびに拒食症および慢性疾患および種々の癌に関連する消耗性障害、および感染性疾患（抗菌活性を有する）、および種々の異脂肪血症）を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。なおさらなる局面において、本発明は、正の様式および負の様式の両方での、食欲、栄養の吸収、および代謝基質の処理に影響する方法において用いられ得る。
【０５３８】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上記で本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０５３９】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を含む。
【０５４０】
１実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸタンパク質もしくはポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、あるいはその膜結合形態の活性を調節する、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的に位置付け可能な並行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ（１９９７）ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ１２：１４５を参照のこと）。
【０５４１】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０５４２】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０５４３】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において提示され得る。
【０５４４】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせて、その結果、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対するこの試験化合物の結合が、複合体におけるその標識された化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０５４５】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通る細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子とＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０５４６】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ_３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０５４７】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する既知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０５４８】
なお別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０５４９】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０５５０】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）_ｎ（（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｅｔｈｅｒ）_ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０５５１】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適合させることが、所望され得る。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および未吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０５５２】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法としては、ＧＳＴ固定複合体に関して上記で述べた方法に加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０５５３】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０５５４】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「餌（ベイト）（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸに結合する（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）か、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流エレメントまたは下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性がある。
【０５５５】
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「餌」タンパク質および「餌食」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０５５６】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な因子および本明細書中に記載されるような処置のためのこの因子の使用に関する。
【０５５７】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。限定ではなく例として、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得（組織型決定）；そして（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。これらの適用のいくつかは、以下の節において記載される。
【０５５８】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５、またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＮＯＶＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一工程である。
【０５５９】
要するに、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングされ得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０５６０】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒト細胞およびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒト細胞およびマウスの細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。特定の酵素を欠くのでマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマッピングすることが可能になる（例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２０：９１９−９２４を参照のこと）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０５６１】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＮＯＶＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０５６２】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、（紡錘体を破壊する）コルセミドのような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合するより高い可能性を有する。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：ＡＭＡＮＵＡＬＯＦＢＡＳＩＣＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９８８）を参照のこと。
【０５６３】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルは、複数部位および／または複数染色体をマークするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間にクロスハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０５６４】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥＩＮＭＡＮ（ＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＷｅｌｃｈＭｅｄｉｃａｌＬｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０５６５】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の原因因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探す工程を包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０５６６】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のための独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限酵素断片長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０５６７】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０５６８】
この様式で調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、独特の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０５６９】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質として使用され得、これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０５７０】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）および臨床試験のモニタリングが、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の場合においては、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を決定するための診断アッセイに関し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅＸ）、ならびに慢性疾患および種々のガンと関連する消耗障害が挙げられる。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸ遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され、これによってＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは関連する障害の発病の前に個体を予防的に処置し得る。
【０５７１】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的試薬（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて個体の治療的処置または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０５７２】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０５７３】
これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０５７４】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸのタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＮＯＶＸｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＮＯＶＸｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５の核酸）またはそれらの一部（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０５７５】
ＮＯＶＸタンパク質を検出するための薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体を間接的に標識することを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸのタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、この抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０５７６】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体由来のタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体由来のｍＲＮＡ分子またはその試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０５７７】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在をその生物学的サンプルにおいて検出する工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０５７８】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおいて、標準と、ＮＯＶＸの量とを比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０５７９】
（予後アッセイ）
本明細書に記載される診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０５８０】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害のための薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０５８１】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０５８２】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０５８３】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０５８４】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０５８５】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る。例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）ＨｕｍａｎＭｕｔａｔｉｏｎ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０５８６】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０５８７】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖に基づくミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロール鎖とサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化することに対して、Ｓ_１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０５８８】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する。例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１５：１６５７〜１６６２を参照のこと。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０５８９】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る。例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、（ＤＮＡよりもむしろ）二次構造が配列中の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０５９０】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０５９１】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０５９２】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）；（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ．１１：２３８を参照のこと）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＰｒｏｂｅｓ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０５９３】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０５９４】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０５９５】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、障害（この障害としては、以下が挙げられる：代謝障害、糖尿病、肥満、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅＸ）、および慢性疾患に関連する消耗障害、および種々の癌。）を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０５９６】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０５９７】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０５９８】
従って、ＮＯＶＸのタンパク質の活性、ＮＯＶＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０５９９】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験にも適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートする薬剤の効力は、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートする薬剤の効力は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与するような他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０６００】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０６０１】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド模倣物、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加することが（すなわち、この薬剤の効力を増加すること）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少することが（すなわち、この薬剤の効力を減少すること）望ましくあり得る。
【０６０２】
（処置方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。このように関連する疾患または障害としては、例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支炎ぜん息、クローン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０６０３】
これらの処置方法は、以下により詳細に記載される。
【０６０４】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０６０５】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０６０６】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０６０７】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト薬剤またはＮＯＶＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０６０８】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０６０９】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、プレクランプシア（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０６１０】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０６１１】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０６１２】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する強力な予防的適用および治療的適用に有用である：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅＸ）、および慢性疾患に関連する消耗疾患、および種々の癌。
【０６１３】
例のように、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり、そしてこのタンパク質は、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的例示として、本発明の組成物は、代謝障害、糖尿病、肥満、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）に罹患した患者の処置についての効力を有する。
【０６１４】
本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードする新規の核酸、およびＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用に有用で有り得る。ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）としての用途である。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途に関する本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
【０６１５】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、これらの実施例は、特許請求の範囲中に記載される本明細書の範囲を限定しない。
【実施例】
【０６１６】
（実施例１：ＮＯＶＸ核酸の同定）
ポリペプチドまたはホモログのためのＣｕｒａＧｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ配列ファイルを使用して、ＴｂｌａｓｔＮを、ＧｅｎＢａｎｋによってか、または、個々の配列センターからダウンロードされたファイルから利用可能なＧｅｎｏｍｉｃＤａｉｌｙＦｉｌｅｓに対して実施した。エキソンを相同性より予測し、そして、イントロン／エキソンの境界を、標準的な遺伝的役割を使用して決定した。複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、ならびに、ある場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性決定を用いて、エキソンをさらに選択し、そして、精緻化した。公のデータベースおよび独占のデータベースの両方からの発現された配列をまた、さらなる定義および完全な遺伝子配列が利用可能である場合、追加した。次いで、ＤＮＡ配列を、明確な不一致に対して手動で補正し、これによって、全長タンパク質をコードする配列を得た。
【０６１７】
本発明で同定した新規のＮＯＶＸ標的配列を、配列を確認するためにエキソン連結プロセスに供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては入手可能な最も上流の配列で、そして逆方向プライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始するように設計した。ＰＣＲプライマーの配列を、種々のクローンを得るために使用した。それぞれの場合について、固有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には終止コドンに達するまで、コード配列に向ってそれぞれの末端から内側にウォーキングすることによって、配列を試験した。このようなプライマーを、標的配列の全長のｃＤＮＡ、ＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）またはタンパク質配列についてのインシリコ（ｉｎｓｉｌｉｃｏ）予測に基づいてか、または他の種由来の密接に関連するヒト配列に対する推定エキソンの翻訳された相同性によって、設計した。次いで、これらのプライマーを、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づいてＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高い縮重性について配列決定した。エキソンの連結によって導いたＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した。得られた細菌クローンは、ｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した完全なオープンリーディングフレームを包含している挿入物を有する。全てのクローンから得られた配列を、それ自体とともに、ＣｕｒａＧｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベース中の他のフラグメントとともに、そして公のＥＳＴとともにまとめた。集合の別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、集合の構成要素としてフラグメントおよびＥＳＴを含めた。さらに、配列のトレースを手動で評価し、そして適切である場合には修正を施した。これらの手順によって本明細書中に報告する配列を提供する。
【０６１８】
物理的クローン：エキソンを相同性によって推定し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝子規則を使用して決定した。エキソンを複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびいくつかの場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性の決定手段によって、さらに選択し、そして精緻化した。利用可能な場合、公のデータベースおよび独自データベースの両方からの発現配列もまた加え、これらの遺伝子配列をさらに定義しそして完全なものとした。次いで、ＤＮＡ配列を、明らかな不一致について手動で補正し、それによって、全長タンパク質をコードする配列を得た。
【０６１９】
（実施例２：ＮＯＶＸ核酸配列中の一ヌクレオチド多型の同定）
改変体配列もまた、本出願に含まれる。改変体配列は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、いくつかの例においては、ＳＮＰを含有しているヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源することを示す、「ｃＳＮＰ」と呼ばれる。ＳＮＰは、いくつかの様式で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位でのあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換に起因し得る。このような置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子と比較して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入によっても生じ得る。この場合には、多型の部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関してギャップを保有している部位である。遺伝子中に存在しているＳＮＰは、ＳＮＰの位置で遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする場合には、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントでもあり得る。遺伝子の領域の外側に存在しているＳＮＰ、または遺伝子内のイントロンに存在しているＳＮＰは、タンパク質のアミノ酸配列には全く変化を生じないが、発現パターンの調節の変更を生じ得る。例としては、一過性発現、生理学的応答の調節、細胞型発現調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性における変更が挙げられる。
【０６２０】
エキソン連結プロセスにより生成されたＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを、以下の基準を使用して選択し、そして、伸長させた。開始配列または伸長配列の全てまたは一部に対して９８％の同一性を有する領域を有するゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースを問い合わせるために、関連する配列を使用して、ＢＬＡＳＴＮによって同定した。得られたゲノムクローンを、さらなる解析のために選択した。なぜならば、この同一性は、これらのクローンが、これらのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリについてのゲノム遺伝子座を含むことを示すからである。これらの配列を、推定コード領域、ならびに、既知のＤＮＡ配列およびタンパク質配列に対しての類似性について分析した。これらの分析のために使用したプログラムとしては、Ｇｒａｉｌ、Ｇｅｎｓｃａｎ、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、ＦＡＳＴＡ、Ｈｙｂｒｉｄおよび他の関連するプログラムが挙げられる。
【０６２１】
いくつかのさらなるゲノム領域をまた、同定し得る。なぜならば、選択したＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリは、これらの領域に位置付けられたからである。このようなＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ配列は、相同性またはエキソン予測によって定義された領域と重複し得る。これらはまた、このフラグメントの位置が、本来の予測された配列中に含まれている相同性、またはエキソン予測により同定されたゲノム領域の近傍にあるので、含まれ得る。このように同定された配列を、手動で構築し、次いで、ＣｕｒａＧｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースから得た１つ以上のさらなる配列を使用して、伸長させ得る。包含に適切なＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントを、ＣｕｒａＴｏｏｌｓ^ＴＭプログラムＳｅｑＥｘｔｅｎｄによってか、または分析されたゲノムクローンの適切な領域に位置付けられるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントを同定することによって、同定した。
【０６２２】
次いで、上記の手順によって定義された領域を、手動で組込み、そして、明確な不一致（例えば、本来のフラグメント中の読み違えられた塩基からか、または予測されたエキソン接合部と、ＥＳＴ位置と、配列類似性の領域との間の不一致から生じ得る）について補正し、本明細書中で開示した最終の配列を導いた。必要な場合、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリおよびゲノムクローンを同定し、そして分析するためのプロセスを反復し、全長配列を導いた（Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら、ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｂｙＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ．１０（８）１２４９〜１２６５、２０００）。
【０６２３】
（実施例３：種々の細胞および組織におけるクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、種々の正常および病理状態由来の細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含有しているマイクロタイタープレートを使用し、実時間定量ＰＣＲ（ＲＴＱＰＣＲ）を使用して評価した。ＲＴＱＰＣＲを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００またはＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍによって実施した。サンプルの種々の収集物をプレート上に組み立て、そしてパネル１（正常組織および癌細胞株を含む）、パネル２（正常供給源および癌供給源由来の組織から誘導されたサンプルを含む）、パネル３（癌細胞株を含む）、パネル４（正常組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症状態に関連する細胞を含む）、パネル５Ｄ／５Ｉ（代謝疾患に対する重要性を有するヒト組織および細胞株を含む）、ＡＩ＿包括的＿パネル（正常組織および自己炎症疾患由来のサンプルを含む）、パネルＣＮＳＤ．０１（正常脳および疾患性の脳由来のサンプルを含む）、およびＣＮＳ＿神経変性＿パネル（正常脳およびアルツハイマー疾患の脳由来の中枢神経系サンプルを含む）と呼んだ。
【０６２４】
全てのサンプル由来のＲＮＡの完全性を、ガイド（２：１〜２．５：１２８ｓ：１８ｓ）として２８Ｓおよび１８ＳのリボソームＲＮＡ染色強度比を使用する、アガロースゲル電気泳動による目視評価、および分解産物の指標である低分子量ＲＮＡの非存在によって、品質を制御する。単一エキソンの長さを横切って増幅するように設計されたプローブおよびプライマーのセットを使用する、逆転写酵素の非存在下で行うＲＴＱＰＣＲ反応によって、サンプルを、ゲノムＤＮＡ混入に対して制御する。
【０６２５】
最初に、ＲＮＡサンプルを、参照核酸（例えば、構成的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ））に対して正規化した。正規化したＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに変換し、そしてＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＲｅａｇｅｎｔｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用し、製造業者の説明書に従って、ＲＴＱ−ＰＣＲによって分析した。
【０６２６】
他の場合において、正規化していないＲＮＡサンプルを、製造業者の指示書に従って、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カタログ番号１８０６４−１４７）およびランダムヘキサマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）に変換した。１０μｇまでの総ＲＮＡを含有する反応を、２０μｌの容量で行い、そして６０分間４２℃にてインキュベートした。この反応は、１００μｌの最終容量において５０μｇまでの総ＲＮＡにまでスケールアップされ得る。次いで、ｓｓｃＤＮＡサンプルを、製造業者の指示書に従って、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を使用して、以前に記載されたような参照核酸に対して正規化する。
【０６２７】
プローブおよびプライマーを、入力として標的配列を使用して、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓＳｏｆｔｗａｒｅパッケージ（ＡｐｐｌｅＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈＰｏｗｅｒＰＣ用バージョンＩ）または類似のアルゴリズムに従って、それぞれのアッセイについて設計した。デフォルト設定を反応条件について使用し、そして以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔ_ｍ）範囲＝５８〜６０℃、プライマーの最適ＴＭ＝５９℃、最大のプライマー差分＝２℃、プローブは５’にＧを有さず、プローブのＴ_ｍはプライマーのＴ_ｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンの大きさは７５ｂｐから１００ｂｐである。選択したプローブおよびプライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、ＨＰＬＣによって二重精製して、カップリングされなかった色素を除去し、そしてプローブの５’末端および３’末端に対する、それぞれ、レポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを確認するために、質量スペクトル分析によって評価した。それらの最終濃度は、順方向プライマーおよび逆方向プライマーについては、それぞれ９００ｎＭであり、そしてプローブについては、２００ｎＭであった。
【０６２８】
ＰＣＲ条件：ＲＮＡサンプルを用いて研究する場合、各組織および各細胞株由来の正規化したＲＮＡを、９６ウェルまたは３８４ウェルのいずれかＰＣＲプレート（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。ＰＣＲ混液は、単一の遺伝子特異的プローブおよびプライマーセット、または２つの多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）プローブおよびプライマーセット（標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブと多重化する別の遺伝子特異的セット）のいずれかを含有した。ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｏｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１３８０３）を使用して、製造業者の指示書に従って設定した。逆転写を、４８℃で３０分間行い、続いて、以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを行った：９５℃で１０分間、次いで、４０サイクルの、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。結果を、ＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値レベルを超えるサイクル）としてｌｏｇスケールを使用して記録し、ここで、所定のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の差分を、２のΔＣＴ乗として表す。次いで、相対的な発現の割合を、このＲＮＡ差分の逆数をとり、そして１００を乗算することによって得る。
【０６２９】
ｓｓｃＤＮＡサンプルを用いて研究する場合、正規化したｓｓｃＤＮＡを、ＲＮＡサンプルについて先に記載したように使用した。１セットまたは２セットのプローブおよびプライマーを含むＰＣＲ反応を、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を使用して、製造業者の指示書に従って、先に記載したように設定した。ＰＣＲ増幅を、以下のように行った：９５℃で１０分間、次いで、４０サイクルの、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。結果を、先に記載したように分析および評価した。
【０６３０】
（パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄ）
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄのプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。これらのパネルのサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常細胞由来のサンプル。これらの細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色種、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。これらのパネルにおいて使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）から広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養された。これらのパネルにおいて見出される正常組織は、１人の成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０６３１】
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄの結果においては、以下の略号を使用する：
ｃａ．＝癌腫
^＊＝転移によって確立された
ｍｅｔ＝転移
ｓｃｅｌｌｖａｒ＝小細胞変異株
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮細胞
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水
ｇｌｉｏ＝神経膠腫
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０６３２】
（一般＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４（Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．４））
パネル１．４のプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。パネル１．４のサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常細胞由来のサンプル。この細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色種、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。パネル１．４において使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）から広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養される。パネル１．４において見出された正常組織は、２〜５人の異なる成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルのプールから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略語は、パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄについて記載される通りである。
【０６３３】
（パネル２Ｄおよび２．２）
パネル２Ｄおよび２．２のプレートは、一般的には、２つのコントロールのウェルと９４個の試験サンプルを含む。これは、ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＨｕｍａｎＴｉｓｓｕｅＮｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌＤｉｓｅａｓｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との緊密に協同して研究している、外科医の作業によって入手したヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡから構成される。組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示される場合、多くの悪性組織は、腫瘍にすぐ隣接している非癌性組織から得られる「整合された縁（ｍａｔｃｈｅｄｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらを、正常隣接組織と呼び、そして以下の結果には「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「整合された縁」を、２人の別々の病理学者によって評価する（外科の病理学者、およびＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者によって再度）。この分析は、腫瘍の分化の段階の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もともとの外科の病理報告を含む。これは、患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらの整合された縁を、外科手術領域の周辺（すなわち、すぐ隣接している）組織（表ＲＲにおいては正常な隣接組織を「ＮＡＴ」と明示する）から採取する。さらに、ＲＮＡおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然死の被害者（事故など）について行った検死に由来する種々のヒト組織から得た。これらの組織が疾患を有さないことを確認し、そしてこれを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）、ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給元から購入した。
【０６３４】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２個のコントロールサンプルを含む。詳細には、これらのサンプルのうちの９２個は、培養されたヒトの癌細胞株に由来し、２個のサンプルはヒトの初代小脳組織であり、そして２つはコントロールである。ヒトの細胞株は、一般的には、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分ける：舌の扁平上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌腫、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頚癌、胃癌、結腸癌、肺癌、およびＣＮＳ癌細胞株。さらに、小脳の２つの独立したサンプルが存在する。これらの細胞の全てを、標準的な推奨される条件下で培養し、そして標準的な手順を使用してＲＮＡを抽出した。パネル３Ｄおよび１．３Ｄの細胞株は、科学技術文献において使用される最も一般的な細胞株である。
【０６３５】
（パネル４Ｄ、４Ｒおよび４．１Ｄ）
パネル４は、９６ウェルプレート（２個のコントロールのウェル、９４個の試験サンプル）上にサンプルを含む。これは、炎症状態に関連している種々のヒトの細胞株または組織から単離したＲＮＡ（パネル４Ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４Ｄ／４．１Ｄ）から構成される。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常組織に由来する総ＲＮＡを使用した。肝硬変患者由来の肝臓組織および狼瘡患者由来の腎臓に由来する総ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（ＢｉｏｃｈａｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者からのＲＮＡの調製のための腸組織を、ＮａｔｉｏｎａｌＤｉｓｅａｓｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０６３６】
星状細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮細胞、気管支上皮細胞、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒトの肺大動脈の血管内皮細胞、ヒトの臍帯静脈の血管内皮細胞を、全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型に供給される培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、示すように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せを用いて６時間および／または１２〜１４時間の間、活性化した。以下のサイトカインを使用した：約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、時折、０．１％の血清を有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓによる基底培地中での培養によって種々の時間枯渇させた。
【０６３７】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して、ＣｕｒａＧｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびインターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２）中での４〜６日間の培養によって、これらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、および１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで、６時間活性化した。いくつかの場合には、単核細胞を、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＭ（アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進物質）を含有する、ＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、４〜５日間培養した。ＲＮＡの調製のために、サンプルを２４、４８、および７２時間で採取した。ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを、２人のドナーから採血し、Ｆｉｃｏｌｌを使用して単核細胞の単離し、および単離した単核細胞を、ＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０^−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中において約２×１０^６個の細胞／ｍｌの最終濃度で１：１にて混合することによって得た。このＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡの調製のために１〜７日までの範囲の種々の時点でサンプルを採取した。
【０６３８】
単球を、製造業者の説明書に従って、ＣＤ１４ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｅａｄｓ、＋ｖｅＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏＭａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ５％のウシの胎児の血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦ、および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０％のＡＢヒト血清または約５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間の単球の培養によって調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０６３９】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞をまた、製造業者の説明書に従って、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラム、およびＶａｒｉｏＭａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡリンパ球およびＣＤ４５ＲＯＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を使用して、ＣＤ８細胞、ＣＤ５６細胞、ＣＤ１４細胞およびＣＤ１９細胞の単核細胞を涸渇することによって単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを使用してＣＤ４５ＲＯＣＤ４リンパ球を単離し、残りの細胞はＣＤ４５ＲＡＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯＣＤ４およびＣＤ８のリンパ球を、ＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に入れ、そしてＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）で一晩コーティングしたＦａｌｃｏｎ６ウェル組織培養プレート上に、１０^６細胞／ｍｌでプレートした。６時間および２４時間後、細胞をＲＮＡの調製のために回収した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３でコーティングしたプレート上で４日間、単離したＣＤ８リンパ球を活性化し、次いで細胞を回収して、それらをＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で増殖させた。次いで、再び、増殖したＣＤ８細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４日間活性化し、そして先のように拡大させた。ＲＮＡを２回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびに２回目の培養物の拡大の４日後に単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で、ＲＮＡを調製する前に４〜６日間培養した。
【０６４０】
Ｂ細胞を得るために、扁桃をＮＤＲＩから獲得した。扁桃を、滅菌した解剖用の鋏で切断し、次いで篩に通過させた。次いで、扁桃体の細胞をスピンダウンし、そしてＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０^６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化するために、本発明者らは、５μｇ／ｍｌでＰＷＭ、または約１０μｇ／ｍｌで抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−４を使用した。細胞をＲＮＡの調製のために、２４、４８、および７２時間で回収した。
【０６４１】
初代Ｔｒ１細胞ならびに２代目Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞およびＴｒ１細胞を調製するために、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）で一晩コーティングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（ＰｏｉｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ，ＧｅｒｍａｎＴｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で１０^５〜１０^６個の細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）を、Ｔｈ１に指向させるために使用し、一方で、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）をＴｈ２に指向させるために使用し、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０をＴｒ１に指向させるために使用した。４〜５日後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を、ＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間増殖させた。この後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球を、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３および上記のようなサイトカインを用いて、しかしアポトーシスを防ぐために抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加して、５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで再び、ＩＬ−２を用いて４〜７日間増殖させた。活性化させたＴｈ１リンパ球およびＴｈ２リンパ球を最大３回のサイクルまで、この方法で維持した。ＲＮＡを、プレートに結合させた抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂでの２回目および３回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびにインターロイキン２中での２回目および３回目の増殖培養の４日目に、初代および２代目Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から調製した。
【０６４２】
以下の白血球株をＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、５×１０^５個の細胞／ｍｌの０．１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ中での８日間の培養、３日毎の培地の交換、および５×１０^５個の細胞／ｍｌへの細胞濃度の調節によってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、（ＡＴＣＣによって推奨されるような）ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを使用した。ＲＮＡを、休止細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間および１４時間活性化した細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２もまたＡＴＣＣから入手した。両方を、ＤＭＥＭ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０^−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間および１４時間活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３、および２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ。
【０６４３】
これらの細胞株および血液細胞について、約１０^７個の細胞／ｍｌをＴｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して溶解させることによってＲＮＡを調製した。簡潔には、１／１０容量のブロモクロロプロパン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分後、チューブをＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローターで１４，０００ｒｐｍで回転させた。水相を採取し、そして１５ｍｌのＦａｌｃｏｎＴｕｂｅに入れた。等量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃で一晩静置した。沈殿させたＲＮＡをＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローター中で９，０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンさせ、そして７０％のエタノール中で洗浄した。このペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含まない水中に再度溶解させ、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌのＤＴＴ、７μｌのＲＮＡｓｉｎ、および８μｌのＤＮＡｓｅを添加した。チューブを、混入しているゲノムＤＮＡを除去するために３７℃で３０分間インキュベートし、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２倍容量の１００％エタノールで再度沈殿させた。ＲＮＡをスピンダウンさせ、そしてＲＮＡｓｅを含まない水中に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０６４４】
（ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０）
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０のプレートは、２個のコントロールのウェルおよび８９個の試験サンプルを含む。これは、ＢａｃｋｕｓＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＣｌｉｎｏｍｉｃｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した外科的な死後のヒト組織から単離されたｃＤＮＡを含む。総ＲＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎの施設にあるＢａｃｋｕｓ病院からの組織サンプルから抽出した。他の組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。
【０６４５】
滑液、滑膜、骨および軟骨を含む関節組織を、Ｂａｃｋｕｓ病院で全ての膝または股関節部の置換手術を経験した患者から入手した。組織サンプルは、単離されたＲＮＡが最適な量で、分解されないことを確実にするように液体窒素中で瞬時に冷凍した。変形性関節症および慢性関節リウマチ結合組織のさらなるサンプルが、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手された。正常なコントロール組織がＣｌｉｎｏｍｉｃｓによって供給され、そして外傷犠牲者の死体解剖の間に得られた。
【０６４６】
乾癬組織の外科検体および隣接一致組織がＣｌｉｎｏｍｉｃｓによって総ＲＮＡとして提供された。二人の男性患者および二人の女性患者が、２５歳と４７歳の間で選択された。この患者は、サンプルが単離された時に薬剤を投与されていない。
【０６４７】
潰瘍性大腸炎およびクローン病に罹患した患者由来の罹患した結腸の外科検体および隣接一致組織が、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手された。４１歳〜６９歳の三人の女性クローン病患者および３人の男性クローン病患者由来の腸組織が使用された。二人の患者が処方箋を必要とする薬を摂取しなかったが、他の患者はデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを摂取した。潰瘍性大腸炎組織は、三人の男性患者および四人の女性患者由来である。その患者のうちの四人は、レブビド（ｌｅｂｖｉｄ）を摂取し、二人は、フェノバルビタールを摂取した。
【０６４８】
疾患を有さないか、あるいは気腫、ぜん息またはＣＯＰＤを有する外傷犠牲者からの死後の肺組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから購入した。気腫患者は、４０歳〜７０歳の範囲であり、全てが喫煙者であり、この年齢範囲は、タバコ関連肺気腫の患者に焦点を当て、α−１アンチトリプシン欠乏の患者を避けるように選択した。ぜん息患者は、３６歳〜７５歳の範囲であり、ＣＯＰＤも有し得る患者であることを避けるために喫煙者を除いた。ＣＯＰＤ患者は、３５歳〜８０歳の範囲であり、喫煙者と非喫煙者の両方を含んだ。ほとんどの患者が副腎皮質ステロイド、および気管支拡張薬を摂取していた。
【０６４９】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０パネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用した：
ＡＩ＝自己免疫
Ｓｙｎ＝滑液
Ｎｏｒｍａｌ＝見かけ上の疾患なし
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０＝個々の患者
ＲＡ＝慢性関節リウマチ
Ｂａｃｋｕｓ＝Ｂａｃｋｕｓ病院由来
ＯＡ＝変形性関節症
（ＳＳ）（ＢＡ）（ＭＦ）＝個々の患者
Ａｄｊ＝隣接組織
Ｍａｔｃｈｃｏｎｔｒｏｌ＝隣接組織
−Ｍ＝男性
−Ｆ＝女性
ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患。
【０６５０】
（パネル５Ｄおよび５Ｉ）
パネル５Ｄおよび５Ｉのプレートは、代謝病に重点をおいて、２個のコントロールウェルおよびヒト組織から単離された種々のｃＤＮＡおよび細胞株を含む。代謝組織は、妊娠糖尿病研究に登録された患者から得られた。細胞は、ヒト間葉幹細胞由来の脂肪細胞の分化における異なる段階の間に得られた。ヒト膵臓島もまた得られた。
【０６５１】
妊娠糖尿病研究において、被験体は若く（１８歳〜４０歳）、慣用的な（選択的な）帝王切開を受ける妊娠糖尿病に罹患しているかまたは罹患していない、その他の点では健常な女性である。胎児の分娩後、外科的切開が修復され／閉じられる時に、産科医は、各外科的レベルの閉鎖の間に、曝露された代謝組織の小さなサンプル（１ｃｃ未満）を取り出した。バイオプシー物質を、滅菌生理食塩水でリンスし、ブロットし、そして、組織の除去から５分以内に高速凍結した。次いで、この組織を、液体窒素中で瞬間凍結し、そして、滅菌ネジ蓋管中に個々に保存し、そして、輸送のためにドライアイス上で維持され、そして、ＣｕｒａＧｅｎによって回収された。目的の代謝組織としては、子宮壁（平滑筋）、内臓脂肪、骨格筋（腹直筋）、および皮下脂肪が挙げられる。患者の記述は、以下の通りである：
患者２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリンなし
患者７〜９：非糖尿病の白人、肥満（ＢＭＩ＞３０）
患者１０：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリン投与
患者１１：非糖尿病のアメリカ黒人、体重超過
患者１２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、インスリン投与。
【０６５２】
脂肪細胞分化は、Ｏｓｉｒｕｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒの部門）から入手されたドナー前駆体細胞において、２つの複製のみ有したドナー３Ｕを除いて、三連で誘導された。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓの科学者は、ＣｕｒａＧｅｎのために、ＭａｒｋＦ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、ＭｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅＰｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＡｄｕｌｔＨｕｍａｎＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１９９９年４月２日：１４３−１４７において見出される公開されたプロトコルに基づいてヒト間葉幹細胞（ＨｕＭＳＣ）を単離し、増殖および分化させた。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓは、ｍＲＮＡ単離およびｄｓｃＤＮＡ生成に適切なトリゾール溶解物または凍結ペレットを提供した。各ドナーの一般的な記載は、以下のとおりである：
ドナー２および３Ｕ：間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー２および３ＡＭ：脂肪、分化中の脂肪
ドナー２および３ＡＤ：脂肪、分化された脂肪。
【０６５３】
ヒトの細胞株を、一般的には、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分けた：近位曲尿細管、子宮平滑筋、小腸、肝臓ＨｅｐＧ２癌細胞、心臓初代基質細胞、および副腎皮質腺種細胞。これらの細胞は、全て標準の推奨条件下において培養され、そしてＲＮＡは、標準の手順を用いて抽出された。全てのサンプルを、一本鎖ｃＤＮＡを生成するためにＣｕｒａＧｅｎで処理した。
【０６５４】
パネル５Ｉは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉａｍｉＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した５８歳の女性患者由来の膵臓島を追加した、前に記載した全てのサンプルを含む。島組織は、外部供給元において総ＲＮＡに処理され、そしてパネル５Ｉに加えるためにＣｕｒａＧｅｎに送られた。
【０６５５】
５Ｄおよび５Ｉのパネル中の組織を同定するために使用された標識では、以下の略号が使用される：
ＧＯＡｄｉｐｏｓｅ＝大網脂肪
ＳＫ＝骨格筋
ＵＴ＝子宮
ＰＬ＝胎盤
ＡＤ＝分化した脂肪
ＡＭ＝中程度に分化した脂肪
Ｕ＝未分化の幹細胞
（パネルＣＮＳＤ．０１）
パネルＣＮＳＤ．０１についてのプレートは、２個のコントロールウェル、およびＨａｒｖａｒｄＢｒａｉｎＴｉｓｓｕｅＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒから得られる死後のヒト脳組織から単離されたｃＤＮＡから構成される９４個の試験サンプルを含む。脳は、死後４時間〜２４時間の間に、ドナーの頭蓋冠から除去され、神経解剖学者によって切片化され、−８０℃の液体窒素蒸気中で凍結される。全ての脳は、切片化され、神経病理学者によって試験されて、神経病理学に明確に関連する診断を確認される。
【０６５６】
疾患の診断を、患者の記録から得る。このパネルは、以下の各診断由来の２つの脳を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、進行性核上麻痺、抑うつ症、および「正常なコントロール」。これらの各脳の中で、以下の領域が表示される：帯状回、大脳側頭極、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓｐａｌｌａｄｕｓ）、黒質、ブロードマン野４（初期運動性細片）、ブロードマン野７（頭頂葉皮質）、ブロードマン野９（プレ前頭皮質）、およびブロードマン野１７（後頭葉皮質）。全ての脳の領域が全ての場合において示されるわけではなく、例えば、ハンティングトン病は、淡蒼球における神経変性によって部分的に特徴付けられ、従って、この領域を、ハンティングトンと確認されたケースから得ることは不可能である。パーキンソン病も同様に、この領域をより入手困難にする黒質の変性によって、特徴付けられる。正常なコントロールの脳は、神経生理学について試験され、神経変性と一致する任意の病理学がないことが見出された。
【０６５７】
ＣＮＳパネル中の組織を同定するために使用された標識では、以下の略号が使用される。
ＰＳＰ＝進行性核上麻痺
ＳｕｂＮｉｇｒａ＝黒質
ＧｌｏｂＰａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球（Ｇｌｏｂｕｓｐａｌｌａｄｕｓ）
ＴｅｍｐＰｏｌｅ＝大脳側頭極
ＣｉｎｇＧｙｒ＝帯状回
ＢＡ４＝ブロードマン野４
（パネルＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０（ＰａｎｅｌＣＮＳ＿Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿Ｖ１．０））
パネルＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０についてのプレートは、２個のコントロールウェル、ならびにＨａｒｖａｒｄＢｒａｉｎＴｉｓｓｕｅＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ（ＭｃＬｅａｎＨｏｓｐｉｔａｌ）およびＨｕｍａｎＢｒａｉｎａｎｄＳｐｉｎａｌＦｌｕｉｄＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ（ＶＡＧｒｅａｔｅｒＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＳｙｓｔｅｍ）から得られた、死後のヒト脳組織から単離されたｃＤＮＡから構成される４７個の試験サンプルを含む。脳は、死後４時間〜２４時間の間に、ドナーの頭蓋冠から除去され、神経解剖学者によって切片化され、−８０℃の液体窒素蒸気中で凍結される。全ての脳は、切片化され、神経病理学者によって試験され、神経病理学に明確に関連する診断を確認される。
【０６５８】
疾患の診断を患者の記録から得る。このパネルは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者由来の６個の脳、および死の前に痴呆の症候を示さない「正常な（Ｎｏｒｍａｌ）コントロール」由来の８個の脳を含む。８個の正常なコントロールの脳は、２つのカテゴリーに分けられる：痴呆もアルツハイマー様病理学も有さないコントロール（コントロール）、および痴呆は有さないが重篤なアルツハイマー様病理学の症候を有するコントロール（特に、０〜３のスケールにおけるレベル３として評価される老人斑負荷；０＝斑の症候なし、３＝重篤なＡＤ老人斑負荷）。これらの各脳の中で、以下の領域が示される：海馬、側頭皮質（ブロードマン野２１）、頭頂葉皮質（ブロードマン野７）、および後頭葉皮質（ブロードマン野１７）。これらの領域は、ＡＤにおける全てのレベルの神経変性を含むように選択された。海馬は、ＡＤにおける、初期の神経損失および重篤な神経損失の領域であり；側頭皮質は、海馬の後で、ＡＤにおける神経変性を示すことが知られており；頭頂葉皮質は、この疾患の後期段階における中程度の神経死を示し、後頭葉皮質は、ＡＤでは生存し、従って、ＡＤ患者において、「コントロール」領域として作用する。全ての脳の領域が、全ての場合において示されるわけではない。
【０６５９】
ＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０パネル中の組織を同定するために使用された標識にでは、以下の略号が使用される。
ＡＤ＝アルツハイマー病の脳；患者は、痴呆になり、検死の際にＡＤ様の病理学を示した
Ｃｏｎｔｒｏｌ＝コントロールの脳；患者は、痴呆にならず、何ら病理学を示さなかった
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐａｔｈ）＝コントロールの脳；患者は、痴呆にならないが、重篤なＡＤ様の病理学を示した
ＳｕｐＴｅｍｐｏｒａｌＣｔｘ＝上側頭皮質
ＩｎｆＴｅｍｐｏｒａｌＣｔｘ＝下側頭皮質
（Ａ．ＮＯＶ３（ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂ）：Ｂ７−Ｈ２）
ＮＯＶ３遺伝子（ＣＧ５５７９０−０３およびＣＧ５５７９０−０４）の発現を、表１９、２０および２１に記載される、プライマー−プローブセットＡｇ２５８９、Ａｇ２６２１およびＡｇ２９１５を使用して評価した。ＲＴ−ＰＣＲ実行の結果を、表２２、２３、２４および２５に示す。
【０６６０】
【表１９】

【０６６１】
【表２０】

【０６６２】
【表２１】

【０６６３】
【表２２−１】

【０６６４】
【表２２−２】

【０６６５】
【表２３−１】

【０６６６】
【表２３−２】

【０６６７】
【表２３−３】

【０６６８】
【表２３−４】

【０６６９】
【表２４−１】

【０６７０】
【表２４−２】

【０６７１】
【表２５−１】

【０６７２】
【表２５−２】

【０６７３】
【表２５−３】

（ＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０の要約）
Ａｇ２５８９／Ａｇ２６２１／Ａｇ２９１５同じプローブおよびプライマーのセットを用いた複数の実験の生成する結果は、非常によく一致する。全ての場合において、ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、非痴呆性コントロールと比較する場合、アルツハイマー病患者の側頭皮質で、アップレギュレートされる。この違いは、共変量としてＲＮＡの質および／または量全てを使用して、データがＡＮＣＯＶＡを介して分析される場合に、明らかである。この遺伝子のアップレギュレーションは、Ａｇ１８４５によって検出される改変体において最も明らかである。側頭皮質は、この疾患の中間段階で変性を示す領域である。従って、ＡＤにおいて、死期まで多くのニューロンがすでに失われている海馬および内側嗅皮質とは対照的に、神経変性の現象が、この領域で捕捉されたようである。さらに、神経変性がアルツハイマー病で生じない）後頭皮質において、この遺伝子は、同一の患者においてアップレギュレートされないことが見出される。合わせると、これらのデータは、この遺伝子が少なくともアルツハイマー様神経変性のマーカーであり、神経変性の過程におそらく関与することを示唆する。
【０６７４】
さらに、この遺伝子は、Ｂ７タンパク質の形態（Ｂ７−Ｈ２Ｂ）であり、このタンパク質は、炎症において役割を果たす。神経炎症は、過去の研究において、抗炎症剤の長期の使用が、アルツハイマーの発病率の減少と関連したという点で、ＡＤに関与している。従って、この遺伝子は、アルツハイマー病、および他の任意の神経炎症状態の処置についての優れた薬物標的を表す。
【０６７５】
（パネル１．３Ｄの要約）
Ａｇ２５８９／Ａｇ２６２１／Ａｇ２９１５同じプローブおよびプライマーのセットを用いた複数の実験は、非常によく一致する結果を生成する。ＮＯＶ３ａ遺伝子の最大の発現は、脳、胎児腎臓、および乳癌細胞株において見られる。
【０６７６】
ＣＮＳパネルにおける発現は、ＣＮＳにおけるこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の議論については、パネル、ＣＮＳ＿神経変性を参照して下さい。
【０６７７】
成人の骨格筋（ＣＴ＝３３〜３５）における発現と比較した場合、より高いレベルの発現がまた、胎児骨格筋（ＣＴ＝２９〜３０）において、一貫して見られる。従って、ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現を使用して、この組織の成人供給源と胎児供給源との間で区別し得る。
【０６７８】
ＮＯＶ３ａ遺伝子産物はまた、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、成人肝臓および胎児肝臓、成人心臓および胎児心臓、ならびに脂肪で中程度に発現される。代謝性組織におけるその発現プロフィールに基づいて、この遺伝子産物は、肥満および糖尿病を含む代謝性疾患の診断および／または治療において、有用であり得る。
【０６７９】
（パネル２．２の要約）
Ａｇ２６２１ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、正常腎臓縁（ＣＴ＝２９．１）由来のサンプルにおいて最大であるようである。さらに、いくつかの腎臓癌サンプルに関連する実質的な発現が、存在するようである。従って、この遺伝子の発現を使用して、このパネルにおける他のサンプルからこの正常腎臓サンプルを区別し得る。さらに、低分子薬物、タンパク質治療剤または抗体の使用を介する、この遺伝子の治療的調節は、腎臓癌の処置に対して有益であり得る。
【０６８０】
（パネル４Ｄの要約）
Ａｇ２５８９／Ａｇ２６２１／Ａｇ２９１５ＮＯＶ３ａ転写物は、活性化ＥＯＬ細胞、活性化した肺および皮膚の微小血管内皮、活性化ヒト肺動脈内皮細胞、ならびにＴＮＦα活性化ヒト臍静脈内皮細胞で高度に発現される。ＮＯＶ３ａは、Ｂ７−Ｈ２をコードし、このＢ７−Ｈ２は抗原提示において重要であることが示された。このＢ７−Ｈ２は、ＩＣＯＳに対するリガンドであり、同時刺激分子を提供する（Ｒｅｆ．１〜２）。従って、ＮＯＶ３ａタンパク質産物を使用して設計されたモノクローナル抗体治療薬は、抗原提示を減少または阻害し得、そしてＴ細胞が、慢性的に刺激される喘息のような疾患の処置において重要であり得る。
【０６８１】
（参考文献）
ＬｉｎｇＶ，ＷｕＰＷ，ＦｉｎｎｅｒｔｙＨＦ，ＢｅａｎＫＭ，ＳｐａｕｌｄｉｎｇＶ，ＦｏｕｓｅｒＬＡ，ＬｅｏｎａｒｄＪＰ，ＨｕｎｔｅｒＳＥ，ＺｏｌｌｎｅｒＲ，ＴｈｏｍａｓＪＬ，ＭｉｙａｓｈｉｒｏＪＳ，ＪａｃｏｂｓＫＡ，ＣｏｌｌｉｎｓＭ．Ｃｕｔｔｉｎｇｅｄｇｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧＬ５０，ａｎｏｖｅｌＢ７−ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｂｉｎｄｓｔｏＩＣＯＳｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ２０００Ｆｅｂ１５；１６４（４）：１６５３−７
分泌タンパク質をコードするマウスｃＤＮＡの遺伝的選択によって、Ｂ７ｈと同一の３２２ａａのポリペプチドをコードする、マウスＧＬ５０（ｍＧＬ５０）と名づけられるＢ７様ｃＤＮＡクローンを単離した。このｃＤＮＡのヒトオルソログ（ｈＧＬ５０）の単離は、ｍＧＬ５０と４２％の配列同一性を有する３０９ａａ残基のコード配列を示した。ノザン分析は、ＧＬ５０が、リンパ球サンプル、胚卵黄嚢サンプル、および胎児肝臓サンプルを含む多くの組織において存在することを示した。試験されたＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、およびＩＣＯＳ融合構築物の中で、フローサイトメトリー分析によって、マウスＩＣＯＳ−ＩｇＧのみがｍＧＬ５０細胞トランスフェクト物に結合することが示された。続く表現型決定によって、高レベルのＩＣＯＳリガンドが脾臓性ＣＤ１９＋Ｂ細胞上で染色し、低レベルのＩＣＯＳリガンドがＣＤ３＋Ｔ細胞上で染色することが示された。これらの結果は、ＧＬ５０が、ＩＣＯＳレセプターに対する特異的なリガンドであることを示し、そしてＧＬ５０−ＩＣＯＳ相互作用が、リンパ球の同時刺激において機能することを示唆する。
【０６８２】
ＷａｎｇＳ，ＺｈｕＧ，ＣｈａｐｏｖａｌＡＩ，ＤｏｎｇＨ，ＴａｍａｄａＫ，ＮｉＪ，ＣｈｅｎＬ．ＣｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌｓｂｙＢ７−Ｈ２，ａＢ７−ｌｉｋｅｍｏｌｅｃｕｌｅｔｈａｔｂｉｎｄｓＩＣＯＳ．Ｂｌｏｏｄ２０００Ｏｃｔ１５；９６（８）：２８０８−１３。
【０６８３】
この報告は、Ｂ７−Ｈ２と称される新たなヒトＢ７様遺伝子を記載する。Ｂ７−Ｈ２タンパク質の細胞表面発現は、単球由来未成熟樹状細胞で検出される。可溶性Ｂ７−Ｈ２と免疫グロブリン（Ｉｇ）との融合タンパク質（Ｂ７−Ｈ２Ｉｇ）は、活性化Ｔ細胞を結合するが、休止Ｔ細胞を結合せず、そしてこの結合は、誘導性の同時刺激因子Ｉｇ（ＩＣＯＳＩｇ）によって阻害されるが、ＣＴＬＡ４Ｉｇによっては阻害されない。さらに、ＩＣＯＳＩｇは、Ｂ７−Ｈ２遺伝子でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞を染色する。ＣＤ３の最適下限の架橋によって、Ｂ７−Ｈ２ＩｇによるＴ細胞増殖の同時刺激は、用量依存性であり、そしてインターロイキン（ＩＬ）−２の分泌と相関するが、最適なＣＤ３連結は、ＩＬ−１０産生を優先的に刺激する。この結果は、Ｂ７−Ｈ２がＩＣＯＳＴ細胞分子に対する推定のリガンドであることが示す。（Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２８０８−２８１３）
ＰＭＩＤ：１１０２３５１５
（Ｂ．ＮＯＶ４ａ：Ｂ７−Ｈ１）
ＮＯＶ４ａ遺伝子（ＣＧ５６１１０−０１）の発現は、表２６に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１５４４を使用して評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表２７、２８、２９および３０に示される。
【０６８４】
【表２６】

【０６８５】
【表２７−１】

【０６８６】
【表２７−２】

【０６８７】
【表２８−１】

【０６８８】
【表２８−２】

【０６８９】
【表２９】

【０６９０】
【表３０】

（パネル１．２概要）：Ａｇ１５４４ＮＯＶ４ａ遺伝子は、心臓において最も高く発現する（ＣＴ＝２３．４）。この遺伝子はまた、いくつかの他の内分泌／代謝関連組織（副腎、腎臓、肝臓、骨格筋、および小腸を含む）における中程度から高いレベルでの発現を有する。従って、この遺伝子および／または遺伝子産物に対する治療モジュレーターは、内分泌／代謝器官の疾患の処置に有用であり得る。
【０６９１】
このＮＯＶ４ａ遺伝子の発現は、海馬、視床および大脳皮質における発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の議論については、パネル１．３Ｄを参照して下さい。
【０６９２】
さらに、３つの肺癌細胞株に関連する実質的な発現が存在する。従って、このＮＯＶ４ａの発現は、心臓組織を、このパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤を介するこの遺伝子の治療的調節は、肺癌の処置に有益であり得る。
【０６９３】
（パネル１．３Ｄ概要）：Ａｇ１５４４ＮＯＶ４ａ遺伝子の発現は、胃癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ８７）由来のサンプルにおいて最も高いようである（ＣＴ＝２７．３）。さらに、肺癌細胞株、乳癌細胞株および胎盤組織において見出される（ｆｏｒｕｎｄ）実質的な発現が存在する。従って、この遺伝子の発現は、ＮＣＩ−Ｈ８７細胞を、このパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用によるこの遺伝子の治療的調節は、肺癌または乳癌の処置に有益であり得る。
【０６９４】
（パネル２Ｄ概要）：Ａｇ１５４４ＮＯＶ４ａ遺伝子の発現は、パネル２Ｄにおける２つの独立した実行によって評価され、これらの実行間に非常に良好な一致を伴った。この２つの実行において、サンプル由来の膀胱癌組織および肺組織に関連する高い発現が存在する。従って、このＮＯＶ４ａ遺伝子の発現は、これらのサンプルとこのパネル中の残りのサンプルとの間を区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用によるこの遺伝子の治療的調節は、膀胱癌または肺癌の処置に有益であり得る。
【０６９５】
（パネル４．１Ｄ概要）：Ａｇ１５４４このＮＯＶ４ａ転写物は、ＬＡＫ細胞において発現され、そしてＰＭＡ／イオノマイシンで活性化されたＬＡＫ細胞、ＬＰＳで処理された樹状細胞、ＬＰＳで処理された単球、γインターフェロン処理されたＨＵＶＥＣ細胞ならびにＴＮＦαおよびＩＬ−１βで処理されたケラチノサイトにおいて誘導される。この転写物は、Ｂ７−Ｈ１のより小さいアイソフォーム、抗原掲示コレセプターをコードする。Ｂ７−Ｈ１は、Ｔ細胞上のＰＤ−１リガンドに結合し、Ｔ細胞の活性化およびＩＬ−１０の産生をもたらす。抗体、またはＢ７−Ｈ１を用いて設計された他の型の治療剤は、Ｔ細胞の活性化をブロックし得、ぜん息、乾癬、ＩＢＤおよび関節炎のようなＴ細胞媒介性の疾患の処置において特に重要である。あるいは、アゴニスト治療剤は、ＮＯＶ４ａタンパク質を用いて設計され得、そしてアジュバンドまたは免疫調節特性を有し得る。
【０６９６】
（参考文献）
ＤｏｎｇＨ、ＺｈｕＧ、ＴａｍａｄａＫ、ＣｈｅｎＬ．Ｂ７−Ｈ１，ａｔｈｉｒｄｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅＢ７ｆａｍｉｌｙ，ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓＴ−ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．ＮａｔＭｅｄ１９９９Ｄｅｃ；５（１２）：１３６５−９。
【０６９７】
Ｂ７ファミリーのメンバーであるＢ７−１およびＢ７−２は、ＣＤ２８と相互作用し、そして抗原特異的な体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の開始において必須のＴ細胞の同時刺激経路を構築する。ここで、本発明者らは、Ｂ７ファミリーの第３のメンバー（Ｂ７−Ｈ１と呼ばれる）が、ＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球Ａ４またはＩＣＯＳ（誘導性同時刺激因子）を結合しないことを記載する。Ｂ７−Ｈ１の連結は、ポリクローナル刺激および同種抗原に対するＴ細胞応答を同時刺激し、そしてインターロイキンー１０の産生を優先的に刺激した。インターロイキンー２は、少量しか産生されなかったが、Ｂ７−Ｈ１同時刺激の効果に必要とされた。従って、本発明者らの研究によって、以前に未知であった、細胞媒介性免疫応答のネガティブな調節に関与し得る同時刺激分子が、規定された。
【０６９８】
ＰＭＩＤ：１０５８１０７７
（Ｃ．ＮＯＶ４ｂ）：ＮＯＶ４ａのスプライシング改変体、Ｂ７Ｈ１
ＮＯＶ４ｂ遺伝子（ＣＧ５６１１０−０４）の発現を、表３１に記載されるプライマー−プローブセット（Ａｇ５２８２）を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表３２、３３および３４に示す。
【０６９９】
【表３１】

【０７００】
【表３２】

【０７０１】
【表３３】

【０７０２】
【表３４】

（ＣＮＳ＿ｎｅｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０概要）：Ａｇ５２８２このＮＯＶ４ｂ遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いかまたは検出できない（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０７０３】
（Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．５概要）：Ａｇ５２８２ＮＯＶ４ｂ遺伝子の発現は、胃癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ８７）由来のサンプルにおいて最も高いようである（ＣＴ＝３１）。該して、パネル１．５の残りのサンプルにおいて、相対的に低い発現が存在する。従って、この遺伝子の発現は、ＮＣＩ−Ｈ８７細胞をこのパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得た。
【０７０４】
（パネル４．１Ｄ概要）：Ａｇ５２８２ＮＯＶ４ｂ転写物は、このパネル中の正常な組織サンプル中では発現しない。この転写物は、ＬＡＫ細胞中に発現され、そしてＰＭＡ／イオノマイシンで活性化されたＬＡＫ細胞、ＬＰＳで処理された樹状細胞、ＬＰＳで処理された単球、γインターフェロン処理されたＨＵＶＥＣ細胞ならびにＴＮＦαおよびＩＬ−１βで処理されたケラチノサイトおいて誘導される。このＮＯＶ４ｂ転写物は、Ｂ７−Ｈ１のより小さいアイソフォーム、抗原掲示コレセプターをコードする。Ｂ７−Ｈ１は、Ｔ細胞上のＰＤ−１リガンドに結合し、そしてＴ細胞の活性化およびＩＬ−１０の産生をもたらす。抗体、またはＢ７−Ｈ１で設計された他の型の治療剤は、Ｔ細胞の活性化をブロックし、ぜん息、乾癬、ＩＢＤおよび関節炎のようなＴ細胞媒介性の疾患の処置において特に重要である。あるいは、アゴニスト治療剤は、このタンパク質を用いて設計され得、そしてアジュバンドのような特性を有し得る。
【０７０５】
（参考文献）：
ＤｏｎｇＨ、ＺｈｕＧ、ＴａｍａｄａＫ、ＣｈｅｎＬ．Ｂ７−Ｈ１，ａｔｈｉｒｄｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅＢ７ｆａｍｉｌｙ，ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓＴ−ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．ＮａｔＭｅｄ１９９９Ｄｅｃ；５（１２）：１３６５−９。
【０７０６】
このＢ７ファミリーのメンバーであるＢ７−１およびＢ７−２は、ＣＤ２８と相互作用し、そして抗原特異的な体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の開始において必須のＴ細胞の同時刺激経路を構築する。ここで、本発明者らは、Ｂ７ファミリーの第３のメンバー（Ｂ７−Ｈ１と呼ばれる）が、ＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球Ａ４またはＩＣＯＳ（誘導性同時刺激物質）を結合しないことを記載する。Ｂ７−Ｈ１の連結は、ポリクローナル刺激および同種抗原に対するＴ細胞応答を同時刺激し、そしてインターロイキンー１０の産生を優先的に刺激した。インターロイキンー２は、少量しか産生されなかったが、Ｂ７−Ｈ１同時刺激の効果に必要とされた。従って、本発明者らの研究によって、以前に未知であった、細胞媒介性免疫応答のネガティブな調節に関与し得る同時刺激分子が、規定された。
【０７０７】
ＰＭＩＤ：１０５８１０７７
（Ｄ．ＮＯＶ５ａ）：プロスタシン
ＮＯＶ５ａ遺伝子（ＣＧ５６１４２−０１）の発現は、表３５に記載されるプライマー−プローブセット（Ａｇ２８８８）を使用して評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表３６、３７および３８に示す。
【０７０８】
【表３５】

【０７０９】
【表３６】

【０７１０】
【表３７】

【０７１１】
【表３８】

（パネル１．３Ｄ概要）：Ａｇ２８８８ＮＯＶ５ａ遺伝子の発現は、パネル１．３Ｄにおける２つの独立した実行において評価された。この遺伝子の発現は、結腸癌由来のサンプルに対して最も高くそしてほとんど排他的であるようである（ＣＴ＝３１）。従って、このＮＯＶ５ａ遺伝子の発現は、このサンプルをこのパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用によるこの遺伝子の治療的調節は、結腸癌の処置に有益であり得る。
【０７１２】
（パネル２Ｄ概要）：Ａｇ２８８８ＮＯＶ５ａ遺伝子の発現は、結腸癌由来のサンプルに対して最も高くそしてほとんど排他的であるようである（ＣＴ＝３０）。この発現は、パネル１．３Ｄにおける発現と一致する。従って、このＮＯＶ５ａ遺伝子の発現は、このサンプルをこのパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用によるこの遺伝子の治療的調節は、結腸癌の処置に有用であり得る。
【０７１３】
（パネル３Ｄ概要）：Ａｇ２８８８ＮＯＶ５ａ遺伝子の発現は、胃癌細胞株由来のサンプルに対して最も高くそしてほとんど排他的であるようである（ＣＴ＝３４．１）。従って、この遺伝子の発現は、このサンプルをこのパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用によるＮＯＶ５ａ遺伝子の治療的調節は、胃癌の処置に有益であり得る。
【０７１４】
（パネル４Ｄ概要）：Ａｇ２８８８ＮＯＶ５ａ遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いかまたは検出できない（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０７１５】
（Ｅ．ＮＯＶ５ｂ）：プロスタシン
ＮＯＶ５ｂ遺伝子（ＣＧ５６１４２−０２）の発現を、表３９に記載されるプライマー−プローブセット（Ａｇ４０９５）を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表４０、４１および４２に示す。
【０７１６】
【表３９】

【０７１７】
【表４０】

【０７１８】
【表４１】

【０７１９】
【表４２】

（ＣＮＳ＿ｎｅｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０概要）：Ａｇ４０９５ＮＯＶ５ｂ遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いかまたは検出できない（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０７２０】
（Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．４概要）：Ａｇ４０９５ＮＯＶ５ｂ遺伝子の発現は、結腸癌細胞株由来のサンプルに対して最も高くそしてほとんど排他的であるようである（ＣＴ＝２７）。従って、この遺伝子の発現は、この結腸癌サンプルをこのパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、タンパク質治療剤または抗体の使用によるＮＯＶ５ｂ遺伝子の治療的調節は、結腸癌の処置に有益であり得る。
【０７２１】
（パネル４．１Ｄ概要）：Ａｇ４０９５ＮＯＶ５ｂ遺伝子（プロスタシンホモログ）は、休止している好中球においてほとんど排他的に発現される。この発現は、ＴＮＦ−α＋ＬＰＳによって活性化された好中球中でほとんどバックグラウンドレベルにまで減少される（ＣＴ＝３４．１８）。この発現プロファイルは、ＮＯＶ５ｂ遺伝子によってコードされるセリンプロテイナーゼホモログが、休止している好中球によって産生されるが、活性化された好中球によっては産生されないことを示唆する。従って、このＮＯＶ５ｂ遺伝子産物は、これらの炎症性細胞の活性化を軽減し得、そしてクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、ぜん息、気腫、リウマチ様動脈炎、エリテマトーデスまたは乾癬を伴う患者の症状を軽減または除去するためのタンパク質治療剤として有用である。
【０７２２】
さらに、低分子のＮＯＶ５ｂ遺伝子産物または抗体アンタゴニストのＮＯＶ５ｂ遺伝子産物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫欠損を伴う患者における免疫応答を増加するのに効果的であり得る。
【０７２３】
（Ｆ．ＮＯＶ６（ＮＯＶ６ａ、ＮＯＶ６ｂおよびＮＯＶ６ｃ））：リソソーマル酸リパーゼ前駆体
ＮＯＶ６ａ遺伝子およびＮＯＶ６ｂ遺伝子（ＣＧ５０１５９−０１およびＣＧ５０１５９−０２）の発現を表４３、４４、４５、４６、４７および４８に記載されるプライマー−プローブセット（Ａｇ１４５６、Ａｇ２４６６、Ａｇ２１３２、Ａｇ２４４４、Ａｇ１８９９およびＡｇ２０５９）を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表５２、５３、および５４に示す。プローブおよびプライマーセット（Ａｇ２０５９、Ａｇ２１３２、Ａｇ２４４４、Ａｇ２４４６）は、ＮＯＶ６ｂ改変体に対応しないことに注意して下さい。表４９に記載されるプローブおよびプライマーセット（Ａｇ２９１９）は、ＮＯＶ６ａに対応しない。ＮＯＶ６ｃ（ＣＧ５０１５９−０４）は、プローブおよびプライマーセット（Ａｇ２０５９およびＡｇ２１３２）に一致しない。表５１および５０に記載されるプローブおよびプライマーセット（Ａｇ２１３１およびＡｇ６０４８）は、ＮＯＶ６ｃに排他的である。これらの排除は、以下に示される発現結果または発現分析を変化しない。
【０７２４】
【表４３】

【０７２５】
【表４４】

【０７２６】
【表４５】

【０７２７】
【表４６】

【０７２８】
【表４７】

【０７２９】
【表４８】

【０７３０】
【表４９】

【０７３１】
【表５０】

【０７３２】
【表５１】

【０７３３】
【表５２】

【０７３４】
【表５３】

【０７３５】
【表５４】

【０７３６】
【表５５】

【０７３７】
【表５６】

（ＡＩ＿ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｐａｎｅｌ＿ｖ１．０概要）：Ａｇ１４５６ＮＯＶ６ａ転写物の最も高い発現は、クローン病または潰瘍性大腸炎に罹患した組織に隣接する正常な結腸組織において見出される（ＣＴ＝３３）。この転写物は、パネル１．２Ｄおよび２Ｄにおける正常な結腸においてもまた見出される。このＮＯＶ６ａ転写物は、罹病結腸において下方制御されるようであり、この遺伝子またはそのタンパク質産物の、タンパク質治療剤の使用による発現または機能の治療的調節は、この組織の正常な恒常性を調節し得、そして炎症性腸疾患の処置に有益であり得る。
【０７３８】
（ＣＮＳ＿ｎｅｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０概要）：Ａｇ２４４６ＮＯＶ６ａ遺伝子の発現は、このこのパネル中の全てのサンプルにおいて低いかまたは検出できない（ＣＴ＞３５）。ａｍｐプロットは、この実験においてプローブの不全が存在し得たことを示す。（データは示さず）。
【０７３９】
（パネル１．２概要）：Ａｇ１４５６ＮＯＶ６ａ遺伝子の最も高い発現は、骨髄において検出される（ＣＴ＝２８．９）。さらに、心臓（ＣＴ＝３１．２）と胎児心臓組織（ＣＴ＝３６．２）との間の発現の差異は、このパネルにおいて有意である。従って、ＮＯＶ６ａ遺伝子の発現は、骨髄をこのパネル中の他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子の発現は、成人心臓組織を胎児心臓組織と区別するのに使用され得る。
【０７４０】
ＮＯＶ６ａ遺伝子はまた、代謝機能を有する多くの組織（心臓、胎児肝臓および成人肝臓、骨格筋ならびに副腎を含む）において発現する。このＮＯＶ６ａ遺伝子によってコードされるタンパク質は、リパーゼホモログであり、そしてこれらの組織中の脂肪の動的な流動に関与し得る。従って、この遺伝子産物またはこれに対して設計された、アゴニストの投与は、リポリーシスを増強し、肥満、および脂肪異栄養症に対する効果的な治療として作用し得る。逆に、この遺伝子産物のアンタゴニストは、悪液質のような貯蔵脂肪の過剰な枯渇を含む状態の処置に有用であり得る。
【０７４１】
（パネル１．３Ｄ概要）：Ａｇ１４５６／Ａｇ２１３２／Ａｇ２４４４異なるプローブおよびプライマーのセットを使用する４つの実験のうち３つは、骨髄（ＣＴ＝３３〜３４）および肺（ＣＴ＝３２．４）におけるＮＯＶ６ａの発現を示す。骨髄における高い発現は、パネル１．２に見られるその発現と一致する。従って、ＮＯＶ６ａ遺伝子の発現は、骨髄および肺由来のサンプルを、このこのパネル中の他の組織と区別するのに使用され得る。さらに、このＮＯＶ６ａ遺伝子の発現は、成人肺組織と胎児肺組織との間を区別するのに使用され得る。Ａｇ２０５９／Ａｇ２４４６この遺伝子の発現は、パネル１．３Ｄ中の全てのサンプルにおいて低いかまたは検出不可能（ＣＴ値＞３５）である（データは示さず）。
【０７４２】
（パネル２Ｄ概要）：Ａｇ１４５６同じプローブおよびプライマー手順を用いる３つの実験は、良好な一致を示す結果を生成し、腫瘍に隣接する正常な肺組織におけるＮＯＶ６ａ遺伝子の最も高い発現を伴う（ＣＴ＝３０〜３１）。さらに、このＮＯＶ６ａ遺伝子は、対応する癌組織と比較される場合、３対の正常な肺組織において過剰発現するようである。さらに９つの腎臓癌のうち４つは、これらのそれぞれの正常隣接組織と比較される場合、この遺伝子の過剰発現を示す。従って、このＮＯＶ６ａ遺伝子の発現は、正常な肺組織を悪性の肺組織と、ならびに悪性の腎臓を正常な腎臓と区別するのに使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用によるこのＣＧ５０１５９−０１遺伝子またはその遺伝子産物の発現の治療的調節は、腎臓癌または肺癌の処置に効果的であり得る。
【０７４３】
（パネル４Ｄ概要）：Ａｇ１４５６／Ａｇ１８９９／Ａｇ２０５９／Ａｇ２１３２異なるプローブおよびプライマーセットを用いる複数の実験は、休止している単球におけるＮＯＶ６ａ遺伝子の最も高い発現を示す（ＣＴ＝２９〜３２）。この遺伝子は、ＬＰＳ処理後にこれらの細胞において下方制御されるようであり（ＣＴ＝３２〜３４）、そしてマクロファージにおいては、検出可能なレベルで発現しない。このＮＯＶ６ａ遺伝子によってコードされるタンパク質は、酸性リパーゼと相同であり、そしてこれらの細胞の脂肪代謝、分化、および食作用のような活性において役割を果たし得る。従って、このＮＯＶ６ａ遺伝子またはそのタンパク質産物の、タンパク質治療剤の使用による発現または機能の治療的調節は、単球の機能および／または分化を調節し得る。
【０７４４】
逆に、抗体または低分子による、この転写物によってコードされる推定タンパク質の発現または活性の調節は、ぜん息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、またはリウマチ様動脈炎のような疾患に見られる単球の蓄積に関連する炎症症状を軽減または予防し得る。その他の２つの実験（１４４５７５３３１および１６４３９１５６８と示される）の結果は、含まれなかったことに注意してください。不良なａｍｐプロットは、これらの実験に実験的な困難さが存在したことを示す。
【０７４５】
（Ｇ．ＮＯＶ７）：トリプターゼ４
ＮＯＶ７遺伝子（ＣＧ５６１４０−０１）の発現を、表５７および５８に記載されるプライマー−プローブセット（Ａｇ２８８６およびＡｇ２８８７）を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表５９および６０に示す。
【０７４６】
【表５７】

【０７４７】
【表５８】

【０７４８】
【表５９】

【０７４９】
【表６０】

（ＣＮＳ＿ｎｅｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０概要）：Ａｇ２８８６／Ａｇ２８８７このＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いかまたは検出できない（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０７５０】
（パネル１．３Ｄ概要）：Ａｇ２８８６ＮＯＶ７遺伝子の発現は、正常な結腸直腸組織に限定される（ＣＴ＝３４．８）。従って、この遺伝子の発現は、このサンプルとこのこのパネル中の他のサンプルとの間、ならびに結腸直腸組織と他の正常組織および悪性組織との間を区別するために使用され得た。プローブおよびプライマーセット（Ａｇ２８７７）を用いる他の２つの実験は、このこのパネル中の全てのサンプル中で低いかまたは検出不可能なレベル（ＣＴ＞３５）を示した。（データは示さず）。
【０７５１】
（パネル２Ｄ概要）：Ａｇ２８８６／Ａｇ２８８７ＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプル中で低いかまたは検出不可能（ＣＴ＞３５）である。（データは示さず）。
【０７５２】
（パネル３Ｄ概要）：Ａｇ２８８７ＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプル中で低いかまたは検出不可能（ＣＴ＞３５）である。（データは示さず）。
【０７５３】
（パネル４Ｄ概要）：Ａｇ２８８６／Ａｇ２８８７ＮＯＶ７遺伝子の発現は、正常な結腸組織に限定される（ＣＴ＝３４．５）。さらに、この遺伝子の発現は、炎症性腸疾患を有する患者由来のサンプルにおいて検出不可能である。さらに、ＮＯＶ７転写物の発現は、正常な結腸と罹病結腸との間を区別するのに使用され得る。さらに、このパネルおよびパネル１．３Ｄにおける結腸直腸組織中のＮＯＶ７遺伝子の高度に特異的な発現は、この遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の治療的調節が、炎症性腸疾患の処置に有用であり得ることを示唆する。
【０７５４】
（Ｈ．ＮＯＶ９）：ミツグミン（ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ）２９
ＮＯＶ９遺伝子（ＣＧ５６２０７−０１）の発現を、表６１に記載されるプライマー−プローブセット（Ａｇ２２８４）を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表６２および６３に示す。
【０７５５】
【表６１】

【０７５６】
【表６２】

【０７５７】
【表６３】

（パネル１．３Ｄ概要）：Ａｇ２２８４このＮＯＶ９遺伝子（ミツグミン２９ホモログ）は、胎児骨格筋（ＣＴ＝２６．３）および成人骨格筋（ＣＴ＝２６．４）において最も高度に発現される。非常に低いが有意な発現がまた、脂肪、精巣、子宮、卵巣、腎臓、心臓、甲状腺および副腎（ＣＴ＝３１〜３３）において検出される。従って、このＮＯＶ９遺伝子の発現は、骨格筋を他の組織と区別するのに使用され得た。ＮｉｓｈｉＭらは、ミツグミンが、筋肉の適切な機能に必須であることを示している。従って、ＮＯＶ９遺伝子または遺伝子産物の、代償療法による治療的調節は、筋肉疾患の再生治療として使用され得た。
【０７５８】
（参考文献）：
１．ＮｉｓｈｉＭ．，ＫｏｍａｚａｋｉＳ．，ＫｕｒｅｂａｙａｓｈｉＮ．，ＯｇａｗａＹ．，ＮｏｄａＴ．，ＩｉｎｏＭ．，ＴａｋａｓｈｉｍａＨ．（１９９９）Ａｂｎｏｒｍａｌｆｅａｔｕｒｅｓｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｆｒｏｍｍｉｃｅｌａｃｋｉｎｇｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ２９．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１４７：１４７３−１４８０。
【０７５９】
４つの膜貫通セグメントを保有し、シナプス小胞を含む細胞内膜に基本的に分布する、シナプトフィジンファミリーのメンバーの生理学的な役割は、まだ確立されていない。最近、ミツグミン２９（ＭＧ２９）は、骨格筋由来のシナプトフィジンファミリーの新規のメンバーとして同定された。ＭＧ２９は、細胞表面横行（Ｔ）小管と筋小胞体（ＳＲ）（三連接合部（ｔｒｉａｄｊｕｎｃｔｉｏｎ）と呼ばれる）との間の接合膜複合体において発現され、ここで、脱分極シグナルは、ＳＲからのＣａ（２＋）放出に変換される。この研究において、本発明者らは、ノックアウトマウスを作製するとによってＭＧ２９の生物学的機能を試験した。このＭＧ−２９欠損マウスは、正常な健康状態および再生を示したが、体重はわずかに減少した。三連接合部のまわりの膜の超微細構造異常は、変異筋肉（すなわち、腫大したＴ細管、不規則なＳＲ構造、および三連接合部の部分的な誤形成）由来の骨格筋において検出された。この変異筋肉において、正常な強縮張力が明らかに観察されたが、単収縮張力は有意に低減された。さらに、この変異筋肉は、Ｃａ（２＋）を含まない条件下で単収縮張力のより迅速な減少を示した。この変異筋肉の形態学的な異常および機能的な異常は、互いに関連するようであり、ＭＧ２９が膜構造の純化および骨格筋三連接合部に結合する効果的な興奮収縮連関の両方に必須であることを示す。さらに、本発明の結果は、細胞表面と細胞内膜との間の接合複合体の正確な形成におけるシナプトフィジンファミリー膜としてのＭＧ２９の役割を暗示する。
【０７６０】
ＰＭＩＤ：１０６１３９０５
（パネル４．１Ｄ概要）：Ａｇ２２８４パネル中のこのＮＯＶ９遺伝子の有意な発現は、主に腎臓において見られる。さらに、相同なミツグミン２９遺伝子はまた、腎臓において発現され、そして分泌活性およびおそらく特定化された小胞体系に関与し得ると考えられる（参考文献１）。従って、ＮＯＶ９遺伝子産物に対して設計された治療薬物は、腎臓機能の調節のために重要であり得る。
【０７６１】
（参考文献）：
１．ＳｈｉｍｕｔａＭ．，ＫｏｍａｚａｋｉＳ．，ＮｉｓｈｉＭ．，ＩｉｎｏＭ．，ＮａｋａｇａｗａｒａＫ．，ＴａｋｅｓｈｉｍａＨ．（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ２９ｇｅｎｅ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４３１：２６３−２６７。
【０７６２】
最近、骨格筋中の三連接合部特有のミツグミン２９が、シナプトフィジンファミリーの新規のメンバーとして同定された；このファミリーのメンバーは、４つの膜貫通セグメントを有しそして細胞内小胞に分布される。この研究において、本発明者らは、マウスミツグミン２９ｃＤＮＡおよびこの遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離しそして分析した。マウス第３染色体、Ｆ３−Ｈ２にマッピングされたミツグミン２９遺伝子は、エキソン−イントロン機構においてのシナプトフィジン遺伝子に密接に関連し、このことは、これらの分子進化における密接な関連を示す。ＲＮＡブロットハイブリダイゼーション分析およびイムノブロット分析によって、ミツグミン２９が、骨格筋において大量に、そして腎臓においてより低いレベルで発現されることが明らかとなった。免疫蛍光顕微鏡検査法は、ミツグミン２９が、腎臓中の近位尿細管細胞および遠位尿細管細胞の細胞質領域において特異的に存在することを示した。得られたこの結果は、ミツグミン２９が、骨格筋および腎臓尿細管細胞中の特定化された小胞体系の形成に関与し得ることを示唆し得る。
【０７６３】
ＰＭＩＤ：９７０８９１６
（Ｉ．ＮＯＶ１０）：マイクロモル濃度のカルシウムに活性化された中性のプロテアーゼ１様
ＮＯＶ１０遺伝子（ＣＧ５６１２７−０１）の発現を、表６４および６５に記載されるプライマー−プローブセット（Ａｇ２８８５およびＡｇ２８８２）を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表６６、６７、６８および６９に示す。
【０７６４】
【表６４】

【０７６５】
【表６５】

【０７６６】
【表６６】

【０７６７】
【表６７】

【０７６８】
【表６８】

【０７６９】
【表６９】

（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０要約）Ａｇ２８８５ＮＯＶ１０遺伝子の発現は、成体中枢神経系において、低いが有意なレベルで、広範囲に及ぶ。本パネルのこの結果から、この遺伝子は、アルツハイマー病において差示的に発現されそうである。ゆえに、このＮＯＶ１０プロテアーゼホモログの阻害は、アルツハイマー病の処置に有利であり得る。
【０７７０】
（パネル１．３Ｄ要約）Ａｇ２８８２／２８８５同一のプローブおよびプライマーセットを用いる２つの実験は、妥当な同意である結果を生じる。ＮＯＶ１０遺伝子の最も高度な発現が、卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ−５）（ＣＴ＝３３）および気道（ＣＴ＝３０）において見られる。さらに、他の卵巣癌細胞株、乳癌細胞株、結腸組織、小腸組織、胃組織、腎臓組織、肺組織、および乳腺組織中で、かなり発現しそうである。従って、ＮＯＶ１０遺伝子の発現を使用して、パネル中の他のサンプルからＯＶＣＡＲ−５細胞を区別し得る。カルパインの差示的な発現を、様々な癌において観察し、そして、Ｂｒａｕｎら（以下の参考文献を参照のこと）は、このカルパインが、恐らく、発癌および腫瘍発達において役割を果たすことを示唆する。ゆえに、低分子薬物、抗体治療薬、またはタンパク質治療薬の使用を介するＮＯＶ１０遺伝子の治療調節は、卵巣癌または乳腺癌の処置において有用であり得る。
【０７７１】
（参考文献：）
ＢｒａｕｎＣ，ＥｎｇｅｌＭ，ＳｅｉｆｅｒｔＭ，ＴｈｅｉｓｉｎｇｅｒＢ，ＳｅｉｔｚＧ，ＺａｎｇＫＤ，ＷｅｌｔｅｒＣ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｌｐａｉｎＩｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｉｎｈｕｍａｎｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｔｙｐｅ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１９９９Ｆｅｂ１９；８４（１）：６−９。
【０７７２】
カルパイン（ＣＡＮＰ（カルシウム活性化神経プロテアーゼを表して）とも名付けられる）は、活性にカルシウムイオンを必要とする細胞内細胞質非リソソームシステインエンドペプチダーゼである。カルパインアイソザイムの多くの基質（例えば、転写因子ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎ、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３、プロテインキナーゼＣ、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ、ならびに接着分子インテグリン）は、異なるヒト腫瘍の病因に関しており、悪性疾患におけるカルパインの重要な役割を示唆する。本発明者らは、ここで、種々の腫瘍中でのカルパインＩ遺伝子（ＣＬＩ）の差示的な発現を報告し、より大きな一連の腎臓細胞癌まで本発明者らの研究を広げる。ノーザンブロット分析を使用して、本発明者らは、一致する健康細胞と比較して、３０の腎臓細胞癌におけるカルパインＩ発現を研究した。腫瘍サンプルを、それらの以下の組織学型に従って分類した：２１の明細胞癌、４つの難染性癌、３つの乳癌および２つの膨大細胞。腎臓腫瘍サンプルにおいて、カルパインＩ遺伝子ｍＲＮＡは、非常に可変的なレベルで発現され、これは、有意に異なる組織学型に依存した。さらに、より高いカルパインＩ発現と悪性腫瘍に相互関係があった：明細胞癌サブセット内では、重症の結節状態を有する腫瘍サンプル（Ｎ１およびＮ２）は、領域リンパ節への転移を有さない腫瘍よりも、有意に高いカルパインＩ発現を示した。本発明者らのデータは、発癌および腫瘍進行におけるカルパインアイソザイムの重要な役割を示唆する。
ＰＭＩＤ：９９８８２２４
（パネル２．２要約）：Ａｇ２８８２／２８８５同一のプローブおよびプライマーセットを用いた２つの実験は、妥当な合意の結果を導いた。ＮＯＶ１０遺伝子の最も高い発現は、乳癌または正常な胃組織由来のサンプルにおいて見られる（ＣＴ＝３３）。さらに、他の乳癌サンプル、子宮癌サンプルおよび肺癌サンプル中で多く発現すると思われる。従って、ＮＯＶ１０遺伝子の発現を使用して、このパネルにおいて、これらのサンプルと他のサンプルを区別し得る。このカルパインホモログ中の有意な発現レベルは、種々の腫瘍中の差示的なカルパインの発現を示す、公開されたデータ、ならびに、このカルパインが発癌および腫瘍進行において役割を果たすという示唆に従う（参考として、パネル１．３Ｄを参照のこと）。従って、低分子薬物、抗体治療薬またはタンパク質治療薬の使用を介したＮＯＶ１０遺伝子の治療調節は、乳癌、肺癌または卵巣癌の処置に有用であり得る。
【０７７３】
（パネル４Ｄ要約）：Ａｇ２８８２／２８８５同一のプローブおよびプライマーセットを用いた２つの実験は、妥当な合意の結果を導いた。ＮＯＶ１０遺伝子の有意な発現は、正常結腸、正常胸腺および正常肺に限定される。ＮＯＶ１０転写産物は、カルシウム活性化神経プロテアーゼ様分子をコードする。分子のこのファミリーは、細胞骨格組織、細胞増殖、細胞移動および止血に関する。従って、ＮＯＶ１０遺伝子産物は、これらの組織の正常なホメオスタシスに重要な役割を果たし得る。さらに、カルパイン１は、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することを示し、そして、局部炎症または全身炎症に関連する状態の処置に有用であり得る（以下の参考文献を参照のこと）。従って、低分子を使用して、ＮＯＶ１０転写産物によってコードされるタンパク質を用いて設計された治療薬は、炎症中の肺、結腸、および胸腺に対する正常機能を維持するか、または回復するのに重要であり得る。
【０７７４】
（参考文献）：
ＲｕｅｔｔｅｎＨ，ＴｈｉｅｍｅｒｍａｎｎＣ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｃａｌｐａｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒＩ，ａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｏｆＩｋａｐｐａＢ，ｏｎｔｈｅｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙｆａｉｌｕｒｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｏｒｇａｎｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｃａｕｓｅｄｂｙｅｎｄｏｔｏｘｉｎｉｎｔｈｅｒａｔ．ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ１９９７Ｊｕｎ；１２１（４）：６９５−７０４。
【０７７５】
１．著者らは、カルパインインヒビターＩの効果を比較した。ここで、このカルパインインヒビターＩは、ＩκＢのタンパク質分解（従って、核因子κＢ（ＮＦκＢ）の活性化）、および（ｉ）循環障害、（ｉｉ）多臓器機能障害および（ｉｉｉ）内毒素性ショックを有する麻酔されたラット中の、一酸化窒素（ＮＯ）シンターゼの誘導性アイソフォーム（ｉＮＯＳ）およびシクロ−オキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の誘導に対するデキサメタゾンのインヒビターである。２．リポ多糖（ＬＰＳ，Ｅ．ｃｏｌｉ、１０ｍｇｋｇ−１、ｉ．ｖ．）の注射は、低血圧およびノルアドレナリンにより誘導される昇圧応答の減少を生じた。この循環障害は、カルパインインヒビターＩ（１０ｍｇｋｇ−１，ｉ．ｖ．、ＬＰＳの前に２時間）またはデキサメタゾン（１ｍｇｋｇ−１、ｉ．ｖ．）でＬＰＳ−ラットを予備処置することによって、減衰された。３．内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘａｅｍｉａ）はまた、（ｉ）尿素およびクレアチニン（腎臓機能障害）、（ｉｉ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（肝細胞傷害）、ビリルビンおよびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（γＧＴ）（肝臓機能障害）（ｉｉｉ）リパーゼ（膵臓傷害）および（ｉｖ）乳酸の血清レベルの上昇を引き起こした。カルパインインヒビターＩおよびデキサメタゾンは、肝臓傷害、膵臓傷害、乳酸アシドーシスならびにＬＰＳにより引き起こされる低血糖症を減衰した。デキサメタゾンは、ＬＰＳにより引き起こされた腎臓機能傷害を軽減したが、カルパインインヒビターＩは軽減しなかった。４．６時間の内毒素血症（ｅｎｄｏｔｏｘａｅｍｉａ）は、肺および肝臓中のｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のタンパク質および活性の実質的な増加を生じ、これは、カルパインインヒビターＩまたはデキサメタゾンで予備処置したＬＰＳ−ラット中で減衰された。５．従って、カルパインインヒビターＩおよびデキサメタゾンは、（ｉ）循環障害、（ｉｉ）多臓器機能障害（肝臓および膵臓の機能障害／傷害、乳酸アシドーシス、低血糖症）、ならびに（ｉｉｉ）内毒素ショックを有するラットにおけるｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のタンパク質および活性の誘導を減衰する。著者らは、インビボでのＮＦ−κＢの活性化の防止は、循環ショックまたは局部炎症もしくは全身性炎症に関連する障害の治療において有用であり得ることを示唆する。
【０７７６】
（ＰＭＩＤ：９２０８１３６）
（Ｊ．ＮＯＶ１１：新規なＰ２Ｘ２Ｃレセプター）
ＮＯＶ１１遺伝子（ＣＧ５６１７９−０１）の発現を、表７０中に記載した。プライマー−プローブセットＡｇ３４９１を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を、表７１および表７２中に示した。
【０７７７】
【表７０】

【０７７８】
【表７１】

【０７７９】
【表７２】

（一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４要約：Ａｇ３４９１）ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）由来のサンプル中で最も高い（ＣＴ＝２９．８）と思われる。従って、ＮＯＶ１１遺伝子の発現を使用して、このパネル中の他のサンプルからＭＣＦ−７を区別し得る。さらに、低分子薬物、タンパク質治療薬、または抗体の使用を介した、この遺伝子の治療的調節は、乳癌の処置において有利であり得る。
【０７８０】
さらに、成体肺における発現と比較した場合、胎児肺に関連するＮＯＶ１１の実質的な発現がありそうである（ＣＴ＝３０．３）。従って、ＮＯＶ１１遺伝子発現を使用して、成体肺組織から胎児肺組織を区別し得る（ＣＴ＝３５．６）。
【０７８１】
代謝的機能を有する組織の中で、ＮＯＶ１１遺伝子は、膵臓で発現される（ＣＴ＝３３）。代謝疾患におけるこの遺伝子の有用性の討論について、パネル５を参照のこと。
【０７８２】
ＮＯＶ１１遺伝子はまた、海馬、皮質、視床および扁桃中で低レベルで発現される。ＮＯＶ１１遺伝子は、新規なイオノトロピープリン性レセプターである。これらのレセプターは、神経興奮性伝達において重要な役割を果たす。さらに、現在公知である遺伝連鎖をともなう全ての発作性疾患は、イオンチャネル変異から生じる。従って、ＮＯＶ１１遺伝子は、癲癇、または任意の発作性疾患、ならびに、改変された神経伝達が関連する任意の精神神経疾患（統合失調症、双極性疾患またはうつ病）の処置のための、優れた低分子標的である。
【０７８３】
（参考文献）
ＰａｎｋｒａｔｏｖＹ，ＣａｓｔｒｏＥ，Ｍｉｒａｓ−ＰｏｒｔｕｇａｌＭＴ，ＫｒｉｓｈｔａｌＯ．ＡｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｔｈｅｅｘｃｉｔａｔｏｒｙｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｃｕｒｒｅｎｔｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＰ２ＸｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｔｈｅＣＡ１ｎｅｕｒｏｎｓｏｆｔｈｅｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．ＥｕｒＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１９９８Ｄｅｃ；１０（１２）：３８９８−９０２。
【０７８４】
１７日齢〜１９日齢のラット由来の海馬薄片のＣＡ１領域中の錐体神経を、パッチクランプ法により研究した。興奮性シナプス電流（ＥＰＳＣ）を、０．２Ｈｚ未満の周波数でシェーファー側副を刺激することによって誘発した。２０μＭの６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ）および１００μＭの２−アミノ−５−ホスホノバレリアン酸（Ｄ−ＡＰＶ）によるグルタミン酸伝達の阻害は、ＥＰＳＣの低分子成分を阻害されないままにしたことを見出した。この残渣ＥＰＳＣ（ｒＥＰＳＣ）の振幅は、−５０ｍＶの保持電圧で測定した場合、全ＥＰＳＣの２５＋／−１１％を含んだ。ｒＥＰＳＣを、選択的なＰ２ブロッカーであるピリドキサルホスフェート−６−アゾフェニル−２’−４’−ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ）１０μＭ、ならびに非加水分解性ＡＴＰアナログ、ＡＴＰ−γ−Ｓおよびα，β−メチレン−ＡＴＰ、各々５０μＭおよび２０μＭとの浴槽インキュベーションによって、ブロックした。ｒＥＰＳＣは、外部Ｚｎ２＋（１０μＭ）により、劇的に増強された。別の一連の実験において、外因性ＡＴＰを、インサイチュでＣＡ１ニューロンに供した。ＡＴＰにより誘起された内向き電流は、ｒＥＰＳＣと同一の程度までＰＰＡＤＳによって阻害された。膜電位に依存して、ラットの海馬ＣＡ１ニューロンへの興奮性シナプス入力により生成されたＥＰＳＣの５分の１〜４分の１は、Ｐ２Ｘレセプターの活性に起因するということを結論付けた。
【０７８５】
（パネル５島（ｉｓｌｅｔ）要約：Ａｇ３４９１）ＮＯＶ１１遺伝子の発現は、ヒトランゲルハンス島由来のサンプルに制限される（ＣＴ＝３３）。これは、パネル１．３Ｄ中の膵臓において見られる発現と一致する。リガンドを用いたＰ２レセプターの刺激は、島からのインスリン分泌を増強する。従って、この遺伝子によりコードされるＰ２レセプターホモログについてのアゴニストは、β細胞分泌欠損を伴う２型糖尿病の全ての型の処置剤であり得る。
【０７８６】
（参考文献：）
Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ＡｌｖａｒｅｚＪ，Ｈｉｌｌａｉｒｅ−ＢｕｙｓＤ，Ｌｏｕｂａｔｉｅｒｅｓ−ＭａｒｉａｎｉＭＭ，ＧｏｍｉｓＲ，ＰｅｔｉｔＰ．Ｐ２ｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｉｎｓｕｌｉｎｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓ．Ｐａｎｃｒｅａｓ．２００１Ｊａｎ；２２（１）：６９−７１。
【０７８７】
アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）および／またはアデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）に対するＰ２レセプターを、哺乳動物膵臓β細胞中で特徴付けたが、Ｐ２レセプターアゴニストのインスリン分泌効果についてのいかなる証明も、ヒトにおいては今のところ報告されていない。本研究は、Ｐ２レセプターアゴニストが脳死器官ドナーから得られたヒト膵臓島におけるインスリン放出を刺激し得るか否かを研究することを目的とした。実験を、異なるグルコース濃度を使用して実施し、そして、インスリンを、ラジオイムノアッセイによって測定した。グルコース濃度（８．３ｍｍｏｌ／Ｌ）がインスリン放出をわずかに刺激している場合、α，β−メチレンＡＴＰ（２００μｍｏｌ／Ｌ）およびＡＤＰβＳ（５０μｍｏｌ／Ｌ）は、同様にインスリン分泌を増幅した：両化合物は、インスリン応答を３倍増加させた。非刺激グルコース濃度（３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）の存在下で、α，β−メチレンＡＴＰのみが、インスリン放出の有意な１．４倍の増加を誘導し得、ＡＤＰβＳは、完全に無効であった。これらの結果は、Ｐ２レセプターアゴニストが、ヒト中でインスリン放出を刺激する際に有効であり、Ｐ２Ｙアゴニストの効果は、本質的にグルコース依存であるという証明を与える。
【０７８８】
（ＰＭＩＤ：１１１３８９７４）
（Ｋ．ＮＯＶ１２：ＤＩＡＢＬＯ様）
ＮＯＶ１２遺伝子（ＣＧ５６１３２−０１）の発現を、表７３中に記載した。プライマー−プローブセット（Ａｇ２８８４）を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表７４、表７５および表７６に示す。
【０７８９】
【表７３】

【０７９０】
【表７４】

【０７９１】
【表７５】

【０７９２】
【表７６】

（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０要約：Ａｇ２８８４）痴呆でないコントロールと比較した場合、ＡＤ患者の死後の脳におけるＮＯＶ１２遺伝子の発現において、差異は認められなかった。このパネルは、独立した群の患者のＣＮＳにおけるＮＯＶ１２遺伝子の発現を実証する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の討論について、パネル１．３Ｄを参照のこと。
【０７９３】
（パネル１．３Ｄ要約：Ａｇ２８８４）ＮＯＶ１２遺伝子（ダイアブロ（ｄｉａｂｌｏ）ホモログ）の発現は、肺癌細胞株（ＳＨＰ−７７）由来のサンプルにおいて最も高いと思われる（ＣＴ＝３０．４）。さらに、他の肺癌細胞株、乳癌細胞株、および卵巣癌細胞株における実質的な発現がある。従って、ＮＯＶ１２遺伝子の発現を使用して、ＳＨＰ−７７細胞とこのパネル中の他のサンプルとを区別し得る。ダイアブロは、カスパーゼを活性化し、そして、アポトーシスを促進する。ミトコンドリア媒介アポトーシスは、動物発達および組織ホメオスタシスにおいて中心的な役割を担い、そして、その改変は、癌を含む様々な悪性疾患を生じる。従って、低分子薬物、タンパク質治療薬、または抗体の使用を介するＮＯＶ１２遺伝子の治療的調節は、肺癌、乳癌または卵巣癌の処置に有用であり得る。
【０７９４】
ＮＯＶ１２遺伝子はまた、試験した全てのＣＮＳ領域において低レベルであるが、有意なレベルで発現される。アポトーシスは、アルツハイマー病、外傷性脳傷害、病的疼痛、発作、ＣＮＳのウイルス感染、パーキンソン病、ハンティングトン病、および多発性硬化症に関連する。従って、ＮＯＶ１２遺伝子またはそのタンパク質生成物の選択的な閉塞／下方制御は、多くのＣＮＳ疾患／臨床状態において、広範な関連および有用性を有し得る。
【０７９５】
代謝的機能を有する組織の中で、ＮＯＶ１２遺伝子は、下垂体、胎児心臓、骨格筋、および脂肪において低レベルの発現を有する。ダイアブロタンパク質は、ミトコンドリアカスパーゼを活性化することによってアポトーシスを促進する。従って、ＮＯＶ１２遺伝子の阻害は、下垂体または骨格筋の疾患におけるアポトーシス／組織消耗に対して保護し得る。
【０７９６】
（参考文献）
ＭａｄｅｓｈＭ，ＡｎｔｏｎｓｓｏｎＢ，ＳｒｉｎｉｖａｓｕｌａＳＭ，ＡｌｎｅｍｒｉＥＳ，ＨａｊｎｏｃｚｋｙＧ．ＲａｐｉｄｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｔＢｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃａｎｄＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯｒｅｌｅａｓｅａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００１Ｄｅｃ６［ｅｐｕｂａｈｅａｄｏｆｐｒｉｎｔ］
Ｂｉｄの切断は、膜間スペースからサイトゾルへのアポトーシス誘導タンパク質の生じた放出を伴う、ミトコンドリア膜透過を誘導することによって、アポトーシスを促進することが示された。しかし、高度に区分化された膜間スペースからの種々のタンパク質のＢｉｄ誘導化放出の直接的な可視化、およびミトコンドリアの代謝機構における変化は、理解し難いままである。ＧＦＰ融合タンパク質を使用し、そして個々の透過したＨｅｐＧ２細胞を免疫染色することで、著者らは、最初に、短縮化Ｂｉｄ（１５．５−ｋＤａのＣ末端フラグメント、ｔＢｉｄ）は、全てのミトコンドリアからシトクロムｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの迅速かつ本質的に完全な放出を誘起したことを実証した。ｔＢｉｄ誘導化シトクロムｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出および脱分極の速度論の間接的な解決を確立するために、著者らは、透過した細胞において蛍光定量的にミトコンドリア膜電位をモニターし、そして、急速濾過法に供し、ウェスタンブロッティングのためのサイトゾル画分を得た。著者らは、ｎＭ以下の用量のｔＢｉｄが、シトクロムｃ放出およびミトコンドリア脱分極を誘発するのに十分である一方、全長Ｂｉｄは、効果が１００倍少ないことを見出した。Ｂｃｌ−ｘＬは、ｔＢＩＤ誘導化シトクロムｃ放出および脱分極を防止した。２．５ｎＭのｔＢｉｄに応答して、シトクロムｃ放出は、１０秒の遅延後に開始し、迅速な進行を示し、そして、５０秒〜７０秒で完了した。Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出は、シトクロムｃ放出と同期化した一方、ミトコンドリア膜電位の減少は、シトクロムｃ放出より僅かに遅かった。さらに、ｔＢｉｄ誘導化シトクロムｃ放出は、基質組成物の変化に感受性ではないが、ｔＢｉｄ誘導化脱分極は、ミトコンドリア外ＡＴＰ供給の存在下で生じなかった。従って、外部膜のｔＢＩＤ−誘導化透過は、膜間スペースの全てのドメインからのシトクロムｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの迅速な放出を可能にする。ミトコンドリア膜電位のｔＢＩＤ−誘導化減少は、シトクロムｃ放出後に生じ、そして、酸化的代謝の障害を反映する。
【０７９７】
（ＰＭＩＤ：１１７４１８８２）
ＡｄｒａｉｎＣ，ＣｒｅａｇｈＥＭ，ＭａｒｔｉｎＳＪ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯｆｒｏｍｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｒｅｑｕｉｒｅｓａｃｔｉｖｅｃａｓｐａｓｅｓａｎｄｉｓｂｌｏｃｋｅｄｂｙＢｃｌ−２．ＥＭＢＯＪ．２００１Ｄｅｃ３；２０（２３）：６６２７−３６。
【０７９８】
Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、恐らく、アポトーシス阻害タンパク質のＩＡＰファミリーの１つ以上のメンバーを中和することによって、アポトーシスのいくつかの形態を可能にするミトコンドリアタンパク質である。Ｓｍａｃは、ミトコンドリアに存在し、そして、ＵＶ放射またはγ放射によって引き起こされるアポトーシスの間にサイトゾルに入ることが示されている。ここで、著者らは、ミトコンドリアからサイトゾルへのＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ輸送が、細胞傷害性薬物およびＤＮＡ損傷によって、ならびにＣＤ９５死レセプターのライゲーションによって誘発されることを報告する。種々のプロアポトーシス性の薬剤に応答して、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯのミトコンドリア流速は、Ｂｃｌ−２過剰発現細胞中で大いに阻害された。従って、アポトーシス関連ミトコンドリアシトクロムｃ放出の調節に加えて、Ｂｃｌ−２はまた、Ｓｍａｃ放出を調節し、これは、両方の分子が、同じ経路を介して免れ得ることを示唆する。しかし、細胞ストレス関連ミトコンドリアシトクロムｃ放出は、ほとんどはカスパーゼに依存せず、同じ刺激への応答におけるＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出は、広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤によりブロックされた。これは、ミトコンドリアからのアポトーシス関連シトクロムｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出が、同じ経路を介して起こらないことを示唆する。むしろ、ミトコンドリアからのＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ流速は、シトクロムｃ放出の下流で生じるカスパーゼ触媒化事象である。
【０７９９】
（ＰＭＩＤ：１１７２６４９９）
ＨｕａｎｇＰ，ＯｌｉｆｆＡ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ２００１Ａｕｇ；１１（８）：３４３−８。
【０８００】
遺伝的不安定性は、癌の発生ならびに癌細胞が種々の治療薬耐性になる能力に寄与する。これに起因して、細胞増殖抑制性治療ではなく細胞傷害性治療が、この疾患に対して最も有効であり得る。多くのオンコジーンおよび腫瘍抑制因子は、アポトーシスシグナル伝達を妨害するか、または誘導することによって、それらの効果を媒介する。従って、アポトーシス経路は、形質転換されていない細胞と比較して癌細胞において有意に改変され得、そして、これらの差異は、癌薬物の開発のために開拓され得る治療域を表し得る。
【０８０１】
（ＰＭＩＤ：１１４８９６４０）
（パネル４Ｄ要約：Ａｇ２８８４）ＮＯＶ１２転写産物の発現は、パネル４Ｄにわたって遍在性であり、イオノマイシンで処置したとき、腎臓で（ＣＴ＝２８．７）、好塩基性細胞株Ｋｕ−８１２およびＢ細胞リンパ腫細胞株であるＲａｍｏｓで（ＣＴ２８．６）で最も高く発現した。初代Ｔｈ１細胞、および、ＰＷＭ活性化Ｂ細胞（これは、生存を促進すると報告された条件）でも、中程度に発現されるが、ＣＤ４０Ｌで処置したＢ細胞では発現されない。ＮＯＶ１２転写産物の中程度の発現はまた、細胞傷害性がよく実証されているＴＮＦ−ａで処置した皮膚線維芽細胞および小気道上皮で見出される。ＮＯＶ１２転写産物は、Ｄｉａｂｌｏ様タンパク質をコードする。Ｄｉａｂｌｏタンパク質は、アポトーシスの下流エフェクターの活性化のために重要である、前アポトーシス性ミトコンドリアタンパク質である。アポトーシスは、多くの自己免疫疾患および炎症性疾患の病状に関連する。従って、低分子によるＮＯＶ１２推定タンパク質の発現または活性の調節は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、１型糖尿病、エリテマトーデスおよび肺炎症性疾患の処置に有利であり得る。
【０８０２】
（Ｌ．ＮＯＶ１３：ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質）
ＮＯＶ１３遺伝子（ＣＧ５６１９５−０１）の発現を、表７７に記載されるプライマープローブセットＡｇ２８９５を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実験の結果を、表７８、表７９、表８０および表８１に示す。
【０８０３】
【表７７】

【０８０４】
【表７８】

【０８０５】
【表７９】

【０８０６】
【表８０】

【０８０７】
【表８１】

（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要）
Ａｇ２８９５。ＡＤ患者の死後の脳におけるＮＯＶ１３遺伝子の発現を、痴呆ではないコントロールと比較した場合、差異は見い出されない。このパネルは、患者の独立した分のＣＮＳにおけるＮＯＶ１３遺伝子の発現を実証する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の議論については、パネル１．３Ｄを参照のこと。
【０８０８】
（パネル１．３Ｄの概要）
Ａｇ２８９５。ＮＯＶ１３遺伝子の発現は、卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ−５）由来のサンプルにおいて最も高いようである（ＣＴ＝２８．５）。このパネルの残りにわたって、全般的に低レベルの発現が存在するようである。従って、この遺伝子の発現は、パネルにおけるサンプルの残りからＯＶＣＡＲ−５細胞を区別するために使用され得る。
【０８０９】
この遺伝子はまた、膵臓、副腎、胸腺、下垂体、成人および胎児の心臓、骨格筋および肝臓ならびに脂肪において、有意ではあるがわずかな発現レベルを有する。従って、この新規に同定された遺伝子産物は、代謝性疾患ならびに内分泌性疾患（肥満ならびに１型糖尿病および２型糖尿病を含む）の病原論、診断および／または処置にとって重要であり得る。
【０８１０】
この遺伝子は、試験した全てのＣＮＳ領域において中程度に発現する。ＮＯＶ１３遺伝子は、細胞接着および／または移動に関わり得る膜結合タンパク質であることが報告されているＥＰＩ６４（６４ｋｄのｅｂｐ５０−ｐｄｚインターアクター（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ））に類似するタンパク質をコードする。ＣＮＳにおいて、これらの機能は、通常、軸索／樹状突起の成長および標的化に関連する。従って、この分子は、脊髄または脳の外傷、発作、アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンティングトン病あるいは脊髄小脳性運動失調におけるニューロン死に応答する代償性シナプス形成への指向において使用され得る。
【０８１１】
（参考文献）
ＲｅｃｚｅｋＤ，ＢｒｅｔｓｃｈｅｒＡ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥＰＩ６４，ａＴＢＣ／ｒａｂＧＡＰｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍｉｃｒｏｖｉｌｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｂｉｎｄｓｔｏｔｈｅｆｉｒｓｔＰＤＺｄｏｍａｉｎｏｆＥＢＰ５０ａｎｄＥ３ＫＡＲＰ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ２００１Ａｐｒ２；１５３（１）：１９１−２０６。
【０８１２】
皮質の足場タンパク質ＥＢＰ５０（ＥＲＭ−結合リンタンパク質−５０）およびＥ３ＫＡＲＰ（ＮＨＥ３キナーゼＡ調節タンパク質）は、２つのＰＤＺ（ＰＳＤ−５２／Ｄ１ｇＡ／ＺＯ−１様）ドメインに続いてＣＯＯＨ末端配列（活性なＥＲＭファミリーメンバーに結合する）を含む。親和性クロマトグラフィーを使用して、本発明者らは、胎盤の微絨毛からＥＢＰ５０のＰＤＺドメインに結合するポリペプチドを同定した。これらのうちでもとりわけ、６４ｋＤおよび／または６５ｋＤの異なるリン酸化ポリペプチドであり、これらは、ＥＢＰ５０の第１のＰＤＺドメインに、ならびにＥ３ＫＡＲＰ（本発明者らはＥＰＩ６４（６４ｋＤのＥＢＰ５０−ＰＤＺインターアクター）と呼ぶ）に優先的に結合する。ヒトＥＰＩ６４遺伝子は、第２２染色体上に存在し、ここで、９つのエキソンは、Ｔｒｅ／Ｂｕｂ２／Ｃｄｃ１６（ＴＢＣ）／ｒａｂＧＴＰａｓｅ作用性タンパク質（ＧＡＰ）ドメインを含む５０８残基のタンパク質を特定する。ＥＰＩ６４は、ＥＢＰ５０のＰＤＺドメインに結合するために必要な（なぜなら、ＤＴＹＬＡで終了する変異体はもはや相互作用しないからである）ＤＴＹＬにおいて終了する。ＥＰＩ６４は、合胞体層および培養した細胞微絨毛において、ＥＢＰ５０およびエズリンと共存し、そして培養細胞におけるこの局在は、ＤＴＹＬＡ変異の導入によって回避される。ＥＰＩ６４に加えて、固定したＥＢＰ５０ＰＤＺドメインは、胎盤微絨毛由来のいくつかのポリペプチド（小胞輸送の調節に関わるナドリン（ｎａｄｒｉｎ）のアイソフォーム、ｒｈｏＧＡＰドメイン含有タンパク質を含む）を保持する。ナドリンは、ＥＢＰ５０に直接的に、好ましくは、そのＣＯＯＨ末端ＳＴＡＬ配列を通して結合する。従って、ＥＢＰ５０は、膜タンパク質ならびに膜輸送（ｔｒａｆｆｉｃ）の調節に潜在的に関わる因子に結合するようである。
【０８１３】
ＰＭＩＤ：１１２８５２８５
（パネル２．２概要）
Ａｇ２８９５。ＮＯＶ１３遺伝子発現は、転移性乳癌由来のサンプルにおいて最も高いようである（ＣＴ＝３０．８）。従って、この遺伝子の発現は、パネル内のサンプルの残りからこの乳癌サンプルを区別するために使用され得る。さらに、ＮＯＶ１３遺伝子の治療的改変（タンパク質治療剤の使用、低分子薬物または抗体の使用による）は、乳癌の処置において有益であり得る。
【０８１４】
（パネル４Ｄの概要）
Ａｇ２８９５。ＮＯＶ１３転写物は、パネル４Ｄに提示する大部分の細胞において高レベル〜中程度のレベルで発現する。この転写物の最も高い発現は、ＴＮＦ−ａで処置した皮膚線維芽細胞（ＣＴ＝２８．１）、ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−１ｂで処置した小気道上皮および気管支上皮において見い出される。Ｔ細胞およびＢ細胞においてもまた、中程度のレベルで発現する。ＮＯＶ１３転写物は、ＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質（６４ｋｄのｅｂｐ５０−ｐｄｚインターアクターに類似する）をコードする。このＨＲＰＥＴ−１関連タンパク質は、細胞接着および／または移動に関わり得る膜結合タンパク質であることが報告されている（上記の参考文献を参照のこと）。従って、抗体によるこの推定タンパク質の発現および／または活性の調節は、Ｂ細胞およびＴ細胞の機能ならびに局所的な上皮または線維芽細胞とのこれらの細胞の相互作用をブロックし得る。結果として、これは、慢性閉塞性肺炎疾患、喘息、気腫、気管支炎、乾癬、炎症性腸疾患、エリテマトーデスおよび慢性リウマチの症状を減少または排除し得る。
【０８１５】
（Ｍ．ＮＯＶ１４：Ｂ７−Ｈ２Ｂ）
ＮＯＶ１４遺伝子（ＣＧ５５７９０−０２）の発現をプライマー−プローブセット（Ａｇ１８４５、Ａｇ２５８９、Ａｇ２６２１、Ａｇ２９１５およびＡｇ２１０、表８２、８３、８４、８５および８６に記載される）を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試験の結果を表８７、８８、８９、９０、９１、９２および９３に示す。
【０８１６】
【表８２】

【０８１７】
【表８３】

【０８１８】
【表８４】

【０８１９】
【表８５】

【０８２０】
【表８６】

【０８２１】
【表８７】

【０８２２】
【表８８】

【０８２３】
【表８９】

【０８２４】
【表９０】

【０８２５】
【表９１】

【０８２６】
【表９２】

【０８２７】
【表９３】

（ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０の要約：Ａｇ１８４５）
ＮＯＶ１４の転写物は、多くの異なる疾患組織で低いレベルで発現される。対照的に、正常な肺および結合組織は、この転写物を全く発現しないか、または非常に低いレベルでの発現する。ＮＯＶ１４転写物は単球で発現し、そしてマッチしたコントロール組織が最もおそらくこれらの炎症細胞（乾癬、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含むので、転写物発現がこれらの部位で検出されることは驚くことではない。ＮＯＶ１４転写物は、Ｂ７−Ｈ２をコードし、抗原提示において重要であることが示された。これはＩＣＯＳのリガンドであり、そして同時刺激分子として働く（パネル４を参照のこと）。従って、ＮＯＶ１４転写物で設計された治療物は、抗原提示を減少または阻害し得、そしてＴ細胞が慢性的に刺激される喘息、ＩＢＤ、乾癬および関節炎のような疾患の処置において重要であ得る。
【０８２８】
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の要約：Ａｇ１８４５／Ａｇ２５８９／Ａｇ２６２１／Ａｇ２９１５）
２つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いての複数の実験は、良好な一致でる。全ての場合において、非痴呆コントロールと比較した場合、ＮＯＶ１４遺伝子の発現は、アルツハイマー病患者の側頭皮質において上方制御される。共変量として全体のＲＮＡの質および／または量を用いてＡＮＣＯＶＡを介してデータを分析した場合、この差異は明白である。ＮＯＶ１４の上方制御は、Ａｇ１８４５によって検出された改変体において最も明らかにされる。側頭皮質は、この疾患の中期の変性を示す領域である。従って、多数のニューロンがＡＤにおける死の時点までにすでに失われている海馬および嗅内皮質と対照的に、神経変性の現象はこの領域で捕らえられたようである。さらに、後頭皮質（神経変性がアルツハイマー病において生じない）において、ＮＯＶ１４遺伝子は、同じ患者で上方制御されることが見出されていない。まとめると、これらのデータは、この遺伝子が少なくともアルツハイマー様神経変性のマーカーであり、神経変性のプロセスにおそらく関与されることを示唆する。
【０８２９】
さらに、ＮＯＶ１４遺伝子は、Ｂ７タンパク質（Ｂ７−Ｈ２Ｂ）の形態であり炎症において機能する。神経炎症は、ＡＤにおいて、長期の抗炎症剤の用法が遡及研究における減少したアルツハイマー病の発生率と相関される範囲に関係される。従って、この遺伝子はアルツハイマー病および任意の他の神経炎症状態の処置のための優れた薬物標的を表す。
【０８３０】
（パネル１の要約：Ａｇ２１０）
ＮＯＶ１４遺伝子の発現は、小脳の正常な脳組織に由来するサンプルにおいて最も高いようである（ＣＴ＝１９．５）。従って、この遺伝子の発現を使用して、パネル中の他の組織から正常な小脳組織を区別し得た。
【０８３１】
ＮＯＶ１４遺伝子はまた、膵臓、副腎を含む代謝組織中で広範な発現および高度〜中度の発現を示す。代謝または内分泌学においてＢ７−Ｈ２分子の役割は記載されていないが、その発現に基づいてこの遺伝子産物は、肥満症ならびに１型および２型糖尿病を含む代謝疾患または内分泌疾患の処置のための抗体標的であり得る。
【０８３２】
（パネル１．３Ｄ要約：Ａｇ１８４５／Ａｇ２５８９／Ａｇ２６２１／Ａｇ２９１５）２つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いた複数の実験は、最良に一致した。ＮＯＶ１４遺伝子の最高の発現は、脳、胎児腎臓および乳癌細胞株で見られる。
【０８３３】
ＣＮＳパネルにおける発現は、ＣＮＳにおけるＮＯＶ１４遺伝子の発現
を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の利用性についての討論のために、パネルＣＮＳ＿神経変性を参照にされたい。
【０８３４】
高度なレベルの発現はまた、成体骨格筋における発現（ＣＴ＝３３〜３５）と比較した場合、胎児骨格筋において一貫して見られる（ＣＴ＝２９〜３０）。従って、ＮＯＶ１４遺伝子の発現を使用して、この組織の成体供給源および胎児供給源の間を区別し得る。
【０８３５】
ＮＯＶ１４遺伝子産物はまた、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、成体肝臓および胎児肝臓、成体心臓および胎児心臓、ならびに脂肪において中程度で発現される。代謝組織におけるその発現プロフィールに基づいて、ＮＯＶ１４遺伝子産物は、代謝疾患（肥満および糖尿病を含む）の診断および／または処置において有用であり得る。
【０８３６】
（パネル２．２要約：Ａｇ２６２１）ＮＯＶ１４遺伝子の発現は、正常腎臓縁由来のサンプルにおいて最も高いと思われる（ＣＴ＝２９．１）。さらに、いくつかの腎臓癌サンプルに関連する実質的な発現が存在するようである。従って、ＮＯＶ１４遺伝子の発現を使用して、このパネルにおいて、正常腎臓サンプルと他のものを区別し得る。さらに、低分子薬物、タンパク質治療薬または抗体の使用を介したこの遺伝子の治療的調節は、腎臓癌の処置に有用であり得る。
【０８３７】
（パネル２Ｄ要約：Ａｇ１８４５）ＮＯＶ１４遺伝子の発現を、パネル２Ｄにおいて、実施間で最良の一致を伴う２回の独立した実施において評価した。この遺伝子の発現は、腎臓癌由来のサンプルにおいて最高である（ＣＴ＝２８）。さらに、腎臓組織、膀胱癌および乳癌由来の他のサンプルに関連する実質的な発現が存在する。従って、ＮＯＶ１４遺伝子の発現を使用して、本パネル中で、この腎臓癌サンプルと他のサンプルとを区別し得る。さらに、低分子薬物、タンパク質治療薬、または抗体の使用を介した、この遺伝子の治療的調節は、腎臓癌、乳癌または膀胱癌の処置に有用であり得る。
【０８３８】
（パネル４Ｄ要約：Ａｇ２５８９／Ａｇ２６２１／Ａｇ２９１５／Ａｇ１８４５）ＮＯＶ１４転写産物は、活性化ＥＯＬ細胞、活性化肺微小血管吻合内皮および皮膚微小血管吻合内皮、活性化ヒト肺大動脈内皮細胞、ならびにＴＮＦα活性化ヒト臍静脈内皮細胞において高度に発現される。ＣＧ５５７９０−０２は、Ｂ７−Ｈ２をコードし、これは、抗原提示において重要であることが示されている。このＢ７−Ｈ２は、ＩＣＯＳのためのリガンドであり、そして、同時刺激分子として役立つ（参考文献１〜２）。したがって、ＣＧ５５７９０−０２タンパク質産物で設計されたモノクローナル抗体治療薬は、抗原提示を減少させ得るか、または阻害し得、そして、Ｔ細胞が慢性的に刺激される喘息のような疾患の処置において重要であり得る。
【０８３９】
（参考文献：）
ＬｉｎｇＶ，ＷｕＰＷ，ＦｉｎｎｅｒｔｙＨＦ，ＢｅａｎＫＭ，ＳｐａｕｌｄｉｎｇＶ，ＦｏｕｓｅｒＬＡ，ＬｅｏｎａｒｄＪＰ，ＨｕｎｔｅｒＳＥ，ＺｏｌｌｎｅｒＲ，ＴｈｏｍａｓＪＬ，ＭｉｙａｓｈｉｒｏＪＳ，ＪａｃｏｂｓＫＡ，ＣｏｌｌｉｎｓＭ．Ｃｕｔｔｉｎｇｅｄｇｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧＬ５０，ａｎｏｖｅｌＢ７−ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｂｉｎｄｓｔｏＩＣＯＳｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ２０００Ｆｅｂ１５；１６４（４）：１６５３−７。
【０８４０】
分泌されたタンパク質をコードするマウスｃＤＮＡの遺伝的選択によって、Ｂ７様ｃＤＮＡクローン（マウスＧＬ５０（ｍＧＬ５０）と名付けられる）を単離し、このクローンは、Ｂ７ｈと同一な３２２アミノ酸のポリペプチドをコードする。このｃＤＮＡ（ｈＧＬ５０）のヒトオルトログの単離は、ｍＧＬ５０と４２％の配列同一性を有する、３０９アミノ酸残基のコード配列を示した。ノーザン分析は、ＧＬ５０が、リンパサンプル、胚卵黄嚢サンプルおよび胎児肝臓サンプルを含む多くの組織に存在することを示した。試験されたＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳ融合構築物のうち、フローサイトメトリー分析は、マウスＩＣＯＳ−ＩｇＧのみがｍＧＬ５０細胞トランスフェクト体に結合することを実証した。続く表現型試験は、脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞で高レベルのＩＣＯＳリガンド染色を、そして、ＣＤ３＋Ｔ細胞で低レベルの染色を実証した。これらの結果は、ＧＬ５０が、ＩＣＯＳレセプターのための特異的なリガンドであることを示し、そして、ＧＬ５０−ＩＣＯＳ相互作用が、リンパ球共刺激において機能することを示唆する。
【０８４１】
ＷａｎｇＳ，ＺｈｕＧ，ＣｈａｐｏｖａｌＡＩ，ＤｏｎｇＨ，ＴａｍａｄａＫ，ＮｉＪ，ＣｈｅｎＬ．ＣｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌｓｂｙＢ７−Ｈ２，ａＢ７−ｌｉｋｅｍｏｌｅｃｕｌｅｔｈａｔｂｉｎｄｓＩＣＯＳ．Ｂｌｏｏｄ２０００Ｏｃｔ１５；９６（８）：２８０８−１３。
【０８４２】
この報告は、Ｂ７−Ｈ２と命名された新規なヒトＢ７様遺伝子を記載する。Ｂ７−Ｈ２タンパク質の細胞表面の発現を、単球由来の未成熟樹状細胞において検出する。可溶性Ｂ７−Ｈ２および免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質であるＢ７−Ｈ２Ｉｇは、休止Ｔ細胞ではなく活性化Ｔ細胞に結合し、そして、この結合は、ＣＴＬＡ４Ｉｇではなく、誘導型同時刺激因子Ｉｇ（ＩＣＯＳＩｇ）によって排除される。さらに、ＩＣＯＳＩｇは、Ｂ７−Ｈ２遺伝子でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞を染色する。ＣＤ３の最適下限の架橋により、Ｂ７−Ｈ２ＩｇによるＴ細胞増殖の同時刺激は、用量依存性であり、そして、インターロイキン（ＩＬ）−２の分泌に関連するが、最適なＣＤ３ライゲーションは、ＩＬ−１０生成を優先的に刺激する。この結果は、Ｂ７−Ｈ２が、ＩＣＯＳＴ細胞分子の推定リガンドであることを示す（Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２８０８−２８１３）ＰＭＩＤ：１１０２３５１５。
【０８４３】
（Ｎ．ＮＯＶ１５：ガラクトシルトランスフェラーゼ）
ＮＯＶ１５遺伝子（ＣＧ５６２５２−０１）の発現を、表９４に記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２９０２を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表９５、９６および９７に示す。
【０８４４】
【表９４】

【０８４５】
【表９５】

【０８４６】
【表９６】

【０８４７】
【表９７】

（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０概要）：Ａｇ２９０２ＮＯＶ１５遺伝子を用いた１つの実験からの結果を含まない。ａｍｐプロットは、この実行には実験的困難性があったことを示す。
【０８４８】
（パネル１．３Ｄ概要）：Ａｇ２９０２ＮＯＶ１５遺伝子の最も高い発現は、卵巣において見られる（ＣＴ＝２８）。従って、この遺伝子の発現は、正常な卵巣組織のマーカーとして使用され得る。ＮＯＶ１５遺伝子はまた、いくつかの内分泌／代謝関連組織（脂肪、副腎、胃腸管、下垂体、骨格筋および胸腺を含む）において中程度レベル〜高レベルの発現を有する。従って、ＮＯＶ１５遺伝子および／または遺伝子産物を標的化する治療モジュレーターは、これらの組織に罹患する任意の多くの疾患を処置する際に有用であり得る。
【０８４９】
有意な発現は、胎児骨格筋においても検出される（ＣＴ＝２９）。興味深いことに、この遺伝子は、成体骨格筋（ＣＴ＝３３．７）と比較した場合、胎児においてずっと高レベルで発現される。この観測は、ＮＯＶ１５遺伝子の発現が、胎児骨格筋と成体骨格筋とを区別するために使用され得ることを示唆する。さらに、胎児骨格筋におけるこの遺伝子の相対的な過剰発現は、このタンパク質産物が、胎児における筋肉成長または発達を増強し得、そして従って、成体における再生能力において作用し得ることを示唆する。従って、この遺伝子によってコードされるタンパク質の治療的調節は、筋肉関連疾患の処置に有用であり得る。より詳細には、ＮＯＶ１５遺伝子によってコードされるタンパク質を用いる、弱い筋肉またはジストロフィー筋肉の処置は、筋肉質量または機能を回復し得る。
【０８５０】
種々の脳癌細胞株と関連する実質的な発現もまた存在するようである。さらに、低分子薬物、タンパク質治療または抗体の使用による、ＮＯＶ１５遺伝子の治療的調節は、脳癌の処置において有益であり得る。
【０８５１】
さらに、ＮＯＶ１５遺伝子（ガラクトシルトランスフェラーゼホモログ）は、試験されるＣＮＳの全ての領域において、低レベル〜中程度レベルで発現される。ガラクトシルトランスフェラーゼは、軸索髄鞘形成においてある役割を果たす。従って、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、多発性硬化症または任意の脱髄疾患の処置に利点があり得る。
【０８５２】
（参考文献）：
ＳｉｍｏｎｓＭ，ＫｒａｍｅｒＥＭ，ＴｈｉｅｌｅＣ，ＳｔｏｆｆｅｌＷ，ＴｒｏｔｔｅｒＪ．Ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｍｙｅｌｉｎｂｙａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ−ｒｉｃｈｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ２０００Ｏｃｔ２；１５１（１）：１４３−５４。
【０８５３】
ミエリンは、限定された範囲のタンパク質を含むグリコスフィンゴリピドおよびコレステロールにおいて豊富な専門化された膜である。本発明者らは、稀突起神経膠細胞によりミエリン成分の構築を調査し、そしてこのプロセスにおける脂質−タンパク質相互作用の役割を分析した。プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）（主要ミエリンタンパク質）を、ミエリン脂質中に濃縮された、低密度ＣＨＡＰＳ不溶性膜画分（ＣＩＭＦ）由来の培養された稀突起神経膠細胞から回収した。小胞体を離れた後であるがゴルジ装置を出る前に、ＰＬＰは、ＣＩＭＦと関連し、これは、ミエリン脂質およびタンパク質成分が、ゴルジ複合体で構築することを示唆する。ＣＩＭＦにおけるミエリン脂質とＰＬＰとの特定の関連は、光活性化可能コレステロールに効果的に架橋されるが、ホスファチジルコリン（これは、ミエリンおよびＣＩＭＦの両方において過小評価される）には効果的に架橋しなかったという知見によって支持された。さらに、稀突起神経膠細胞におけるコレステロールの枯渇またはスフィンゴリピド合成の阻害は、ＣＩＭＦとＰＬＰの関係を消滅させた。従って、ＰＬＰは、脂質−タンパク質相互作用を介して、ＣＩＭＦによって表されるミエリンラフト（ｒａｆｔ）に補充され得る。稀突起神経膠細胞と対照的に、ＢＨＫ細胞におけるトランスフェクションの後に、ＰＬＰは、単離されたＣＩＭＦから非存在であり、これは、ＰＬＰがラフト会合に関して特定の脂質を必要とすることを示唆する。酵素セラミドガラクトシルトランスフェラーゼを欠損するマウス（これは、主要ミエリングリコスフィンゴリピドを合成し得ない）において、大きな画分のＰＬＰが、もはやラフトに会合しない。コレステロールリッチおよびガラクトシルセラミドリッチな膜ドメイン（ミエリンラフト）の形成は、ＰＬＰの分類および稀突起神経膠細胞におけるミエリンの構築について重要であり得る。
【０８５４】
（パネル２Ｄ概要）：Ａｇ２９０２ＮＯＶ１５遺伝子の発現は、乳癌由来のサンプルにおいて最も高いようである（ＣＴ＝２８．１）。他の乳癌、腎臓癌、膀胱癌および卵巣癌と関連する実質的な発現が存在するようである。従って、この遺伝子の発現は、この乳癌サンプルとパネル上のサンプルの残りとを区別するために使用され得る。さらに、低分子薬物、タンパク質治療または抗体の使用による、ＮＯＶ１５遺伝子の治療的調節は、乳癌、卵巣癌、膀胱癌または腎臓癌の処置において有益であり得る。
【０８５５】
（パネル４Ｄ概要）：Ａｇ２９０２ＮＯＶ１５転写物は、線維芽細胞および粘膜表皮細胞株において高度に発現され、造血細胞株においてかなり低い発現がある。転写物は、ガラクトシルトランスフェラーゼアイソフォームをコードする。この酵素は、ガラクトース β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンの合成のためおよび形質膜（ここで、細胞間認識および／または接着において機能し得る）の成分としての両方で重要であり得る（ＯＭＩＭ１３７０６０）。線維芽細胞および白血球における、タンパク質グリコシル化または細胞内区画を介する往来は、この酵素の活性によって変更され得る。これは、次いで、これらの細胞が、細胞間相互作用において正常な造血に関係するタンパク質を発現する能力を調節し得る。従って、ＮＯＶ１５転写物によってコードされるタンパク質を用いて設計された治療は、喘息、気腫、乾癬、ＩＢＤ、および関節炎から生じる炎症を減少または阻害し得る。
【０８５６】
（Ｏ．ＮＯＶ１６：リンパ球抗原前駆体様タンパク質）
ＮＯＶ１６遺伝子（ＣＧ５６３０３−０１）の発現を、表９８および９９に記載されるように、プライマー−プローブセットＡｇ３７９８およびＡｇ４１１９を使用して評価した。
【０８５７】
【表９８】

【０８５８】
【表９９】

（一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４概要）：Ａｇ３７９８ＮＯＶ１６遺伝子の発現は、このパネルにおいて全てのサンプルで低い／検出不可能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０８５９】
（パネル４．１Ｄ概要）：Ａｇ３７９８／Ａｇ４１１９ＮＯＶ１６遺伝子の発現は、このパネルにおいて全てのサンプルで低い／検出不可能である（ＣＴ＞３５）。（データは示さず）。
【０８６０】
（他の実施形態）
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは例示の目的のみのための例として行われており、そして添付される特許請求の範囲の範囲に関して限定するようには意図されない。詳細には、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸の出発物質、目的のクローン、ライブラリーの型の選択は、本明細書中に記載されている実施形態の知見を考慮すると、当業者にとって慣用的な事項であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。【Technical field】
[0001]
(Field of Invention)
The present invention relates to polynucleotides, and polypeptides encoded by such polynucleotides, as well as vectors, host cells, antibodies and recombinant methods for producing the polypeptides and polynucleotides, and uses thereof Regarding the method.
[Background]
[0002]
(Background of the Invention)
The present invention is based in part on nucleic acids encoding proteins that are new members of the following protein families: fibromodulin, secretin receptor precursor, B7-H2, B7-H1, prostasin, Lysosomal acid lipase, tryptase 4, P450, mitsugumin 29, neutral protease 1 activated by micromolar calcium, P2X2C, DIABLO, HRPET-1-related protein, B7- H2B, galactosyltransferase, lymphocyte antigen precursor, pepsinogen C, and ALR. More particularly, the present invention relates to nucleic acids encoding novel polypeptides, and vectors, host cells, antibodies, recombinant methods for producing these nucleic acids and polypeptides.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Means for Solving the Problems]
[0003]
(Summary of the Invention)
The present invention is based in part on the discovery of nucleic acid sequences that encode novel polypeptides. This novel nucleic acid and polypeptide is herein referred to as NOVX, or NOV1, NOV2, NOV3, NOV4, NOV5, NOV6, NOV7, NOV8, NOV9, NOV10, NOV11, NOV12, NOV13, NOV14, NOV15, NOV16, NOV17. , And NOV18 nucleic acids and polypeptides. These nucleic acids and polypeptides, and derivatives, homologues, analogues (analogs), and fragments thereof are collectively referred to herein as “NOVX” nucleic acid sequences or “NOVX” polypeptide sequences. Called.
[0004]
In one aspect, the invention provides an isolated NOVX nucleic acid molecule that encodes a NOVX polypeptide, which is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 , 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55. Nucleic acid sequences having identity to the nucleic acids disclosed in including. In some embodiments, the NOVX nucleic acid molecule hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid sequence that is complementary to a nucleic acid molecule comprising the protein coding sequence of the NOVX nucleic acid sequence. The invention also encompasses an isolated nucleic acid encoding a NOVX polypeptide, or a fragment, homologue, analog or derivative thereof. For example, the nucleic acid is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, It may encode a polypeptide that is at least 80% identical to a polypeptide comprising the amino acid sequence of 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56. This nucleic acid is, for example, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, It may be a genomic DNA fragment or cDNA molecule comprising any of the nucleic acid sequences 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55.
[0005]
Oligonucleotides (e.g., NOVX nucleic acids (e.g., SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55) are also included in the present invention. A substantially purified NOVX polypeptide (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56) are also included in the present invention. In certain embodiments, the NOVX polypeptide comprises an amino acid sequence that is substantially identical to the amino acid sequence of a human NOVX polypeptide.
[0006]
The invention also features antibodies that immunoselectively bind to NOVX polypeptides, or fragments, homologs, analogs or derivatives thereof.
[0007]
In another aspect, the invention encompasses a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount or a prophylactically effective amount of a therapeutic agent and a pharmaceutically acceptable carrier. The therapeutic agent can be, for example, a NOVX nucleic acid, NOVX polypeptide, or an antibody specific for a NOVX polypeptide. In a further aspect, the present invention includes a therapeutically or prophylactically effective amount of the pharmaceutical composition in one or more containers.
[0008]
In a further aspect, the invention encompasses a method of producing a polypeptide, wherein the method comprises culturing a cell comprising a NOVX nucleic acid under conditions that allow expression of the NOVX polypeptide encoded by the DNA. by. If desired, the NOVX polypeptide can then be recovered.
[0009]
In another aspect, the invention includes a method for detecting the presence of a NOVX polypeptide in a sample. In this method, a sample is contacted with a compound that selectively binds to the polypeptide and conditions that allow formation of a complex between the polypeptide and the compound. This complex, if present, is detected, thereby identifying the NOVX polypeptide in the sample.
[0010]
The invention also encompasses a method for identifying a particular cell or tissue type based on the expression of NOVX.
[0011]
Also encompassed by the present invention is a method for detecting the presence of a NOVX nucleic acid molecule in a sample, wherein the method is contacted with a NOVX nucleic acid probe or primer, and the nucleic acid probe or primer is contacted with NOVX in the sample. By detecting whether it has bound to a nucleic acid molecule.
[0012]
In a further aspect, the present invention provides a method for modulating the activity of a NOVX polypeptide comprising: binding a compound that binds to the NOVX polypeptide to a cell sample comprising the NOVX polypeptide. By contacting in an amount sufficient to regulate the activity of This compound may be a small molecule (eg, a nucleic acid, peptide, polypeptide, peptidomimetic, carbohydrate, lipid or other organic molecule (carbon-containing) or inorganic molecule, as further described herein. ).
[0013]
The use of therapeutic agents in the manufacture of a medicament for treating or preventing disorders or syndromes including the following is also within the scope of the present invention: for example, trauma, regeneration (in vitro and in vivo), virus / bacteria / parasite infection Von Hippel-Lindau (VHL) syndrome, Alzheimer's disease, stroke, tuberous sclerosis, hypercalcemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Lesch-Nyhan syndrome, multiple sclerosis, telangiectasia Sexual ataxia, white matter atrophy, behavioral disorder, addiction, anxiety, pain, actinic keratosis, pressure ulcers, hair growth disorders, alopecia, pigmentation disorders, endocrine disorders, connective tissue disorders (eg, severe) Neonatal Marfan syndrome, dominant lens dislocation, family ascending aortic aneurysm, isolated skeletal mechanism of Marfan syndrome (iso) ate skeletal features), Shprintzen-Goldberg syndrome, hereditary dermatosis, contracture spider injuries, inflammatory disorders (eg, osteoarthritis and rheumatoid arthritis), inflammatory bowel disease, Crohn's disease; immunological disorders, AIDS; cancer (lung cancer, colon cancer, neoplasm; adenocarcinoma; lymphoma; prostate cancer; including but not limited to uterine cancer, leukemia or pancreatic cancer); blood disorder; asthma; psoriasis; vascular disorder, hypertension, Skin disorders, renal disorders including Alport syndrome, immunological disorders, tissue damage, fibrosis disorders, bone diseases, Type VI Erlers-Danlo syndrome, Type VII Erlers-Dunlo syndrome, Type IV Erlers-Dunlo syndrome, S-related ( S-linked) flaccid skin and type V Erlers-Danlo syndrome, osteogenesis imperfecta Autoimmune disorders like neurological disorders, brain and / or encephalomyelitis, neurodegenerative disorders, immune disorders, hematopoietic disorders, muscle disorders, inflammation and wound healing, bacterial infections, fungal infections, protozoal infections and viral infections (especially , Infection caused by HIV-1 or HIV-2), pain, acute heart failure, hypotension, hypertension, residual urine, osteoporosis, treatment of allbright hereditary dysplasia, angina, myocardial infarction, ulcer, benign Prostatic hypertrophy, congenital multiple joint contractures, bone dysplasia, keratoconus, scoliosis, duodenal atresia, esophageal atresia, intestinal malrotation, pancreatitis, obesity, systemic lupus erythematosus, autoimmune disease, emphysema, strong Dermatosis, allergy, ARDS, neuroprotection, fertility myasthenia gravis, diabetes, obesity, proliferative disorders and reproductive disorders, hemophilia, hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, immune deficiency Damage, anti-host graft, adrenal brain leukodystrophy, congenital adrenal hyperplasia, endometriosis, xerostomia, ulcer, cirrhosis, transplantation, diverticulosis, Hirschsprung disease, appendicitis, arthritis, ankylosing spine Inflammation, tendinitis, renal artery stenosis, interstitial nephritis, glomerulonephritis, polycystic nephropathy, lupus erythematosus, tubular acidosis, IgA nephropathy, anorexia, bulimia, psychiatric disorders (anxiety) ), Schizophrenia, manic depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities (eg Huntington's disease) and / or other medical conditions and disorders.
[0014]
The therapeutic agent can be, for example, a NOVX nucleic acid, a NOVX polypeptide, or a NOVX-specific antibody, or a biologically active derivative or fragment thereof.
[0015]
For example, the compositions of the present invention have efficacy for the treatment of patients suffering from the diseases and disorders disclosed above and / or other medical conditions and disorders. This polypeptide can be used as an immunogen to produce antibodies specific to the present invention and as a vaccine. They can also be used to screen for potential agonist and antagonist compounds. For example, a cDNA encoding NOVX can be useful in gene therapy, and NOVX can be useful when administered to a subject in need thereof. By way of non-limiting example, the compositions of the present invention have efficacy for the treatment of patients suffering from the diseases and disorders disclosed above and / or other medical conditions and disorders.
[0016]
The invention further encompasses methods for screening for modulators of disorders or syndromes including, for example, the diseases and disorders disclosed above and / or other medical conditions and disorders. The method includes contacting a test compound with a NOVX polypeptide and determining whether the test compound binds to the NOVX polypeptide. Binding of the test compound to the NOVX polypeptide indicates that the test compound is a modulator of activity against the aforementioned disorder or syndrome or a potential or predisposing modulator for the aforementioned disorder or syndrome.
[0017]
Also within the scope of the present invention is the administration of a test compound to a test animal with an increased risk for the aforementioned disorder or syndrome, thereby providing a modulator of the activity of the disorder or syndrome comprising: Methods of screening for modulators of latency or predisposition to a disorder or syndrome are included, including: for example, the diseases and disorders disclosed above and / or other medical conditions and disorders. The test animal expresses a recombinant polypeptide encoded by the NOVX nucleic acid. NOVX polypeptide expression or activity was then measured in this test animal, as well as control animals (which recombinantly expressed NOVX polypeptide and increased risk for a disorder or syndrome). The expression or activity of this protein is measured. The expression of NOVX polypeptide is then compared in both test and control animals. A change in the activity of the NOVX polypeptide in the test animal compared to the control animal indicates that the test compound is a modulator of disorder or syndrome latency.
[0018]
In yet another aspect, the invention includes a method for determining the presence or predisposition of a disease associated with a change in the level of NOVX polypeptide, NOVX nucleic acid, or both in a subject (eg, a human subject). The method comprises measuring the amount of NOVX polypeptide in a test sample from the subject, and comparing the amount of the polypeptide in the test sample with the amount of NOVX polypeptide present in a control sample. . A change in NOVX polypeptide level in the test sample as compared to the control sample indicates the presence or predisposition to the disease in the subject. Preferably, the predisposition includes the following: diseases and disorders disclosed above and / or other medical conditions and disorders. Also, the expression levels of the novel polypeptides of the present invention can be used in methods for screening for various cancers and for determining the stage of cancer.
[0019]
In a further aspect, the invention relates to administering a NOVX polypeptide, NOVX nucleic acid, or NOVX-specific antibody to a subject (eg, a human subject) in an amount sufficient to alleviate or prevent a pathological condition. And methods of treating or preventing a pathological condition associated with a disorder in a mammal. In a preferred embodiment, the disorder includes the following: for example, the diseases and disorders disclosed above and / or other medical conditions and disorders.
[0020]
In yet another aspect, the present invention can be used in a method for identifying cellular receptors and downstream effectors of the present invention by any one of a number of techniques commonly used in the art. These techniques include, but are not limited to, two-hybrid systems, affinity purification, coprecipitation using antibodies or other specific interacting molecules.
[0021]
NOVX nucleic acids and NOVX polypeptides are further useful for generating antibodies that immunospecifically bind to novel NOVX agents for use in therapeutic or diagnostic methods. These NOVX antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOVX proteins have multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. These NOVX proteins can be used in assay systems for the functional analysis of various human disorders, which aids in understanding the pathology of the disease and in the development of new drug targets for various disorders .
[0022]
The NOVX nucleic acids and NOVX proteins identified herein may be useful in potential therapeutic applications associated with, but not limited to, various conditions and disorders as shown below. Potential therapeutic applications of the present invention include, but are not limited to: protein therapeutics, small molecule drug targets, antibody targets (therapeutic targets, diagnostic targets, drug targets / cytotoxic antibodies), diagnostic markers And / or in vivo and in vitro of all tissues and cell types consisting of, but not limited to, predictive markers, gene therapy (gene delivery / genetic excision), search tools, tissues and cells as defined herein Tissue regeneration.
[0023]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents and other references cited herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.
[0024]
Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and from the claims.
(Detailed description of the invention)
The present invention provides novel nucleotides and polypeptides encoded thereby. Novel nucleic acid sequences and the polypeptides they encode are included in the present invention. These sequences are collectively referred to as “NOVX nucleic acids” or “NOVX polynucleotides” and the corresponding encoded polypeptides are referred to as “NOVX polypeptides” or “NOVX proteins”. Unless otherwise indicated, “NOVX” is meant to refer to any of the novel sequences disclosed herein. Table A provides a summary of NOVX nucleic acids and the polypeptides they encode.
[0025]
[Table 1]

NOVX nucleic acids and the polypeptides they encode are useful in a variety of applications and situations. Various NOVX nucleic acids and NOVX polypeptides according to the present invention are useful as novel members of the protein family according to the existence of domain and sequence relationships to the proteins described above. Furthermore, NOVX nucleic acids and NOVX polypeptides can also be used to identify proteins that are members of the family to which the NOVX polypeptide belongs.
[0026]
NOV1 is homologous to the fibromodulin family of proteins. Thus, NOV1 nucleic acids, NOV1 polypeptides, NOV1 antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: of cartilage and ligament damage Repair; therapeutic application to joint repair, other diseases, disorders and conditions.
[0027]
Fibromodulin has been suggested to be involved in the construction of the extracellular matrix by its ability to interact with type I and type II collagen fibrils and to inhibit fibril development in vitro.
[0028]
NOV2 is homologous to the secretin receptor precursor-like family of proteins. Thus, NOV2 nucleic acids, polypeptides, antibodies, and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving: developmental disorders, MHCII and MHCIII diseases (immune diseases), taste detection Impairment and olfactory detection ability, Burkitt lymphoma, cortical neuropathy, signal transduction pathway disorders, retinal diseases (including retinal diseases related to photoreception), cell proliferation rate disorders; cell shape disorders, eating disorders; Potential obesity due to overeating; potential disorders due to starvation (lack of appetite), non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM1), bacterial infection, fungal infection, protozoal infection and viral infection (especially Infection caused by HIV-1 or HIV-2), pain, cancer (neoplasm; adenoma; lymphoma) Prostate cancer; including but not limited to uterine cancer), anorexia, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, residual urine, osteoporosis, Crohn's disease; multiple sclerosis; and all Bright hereditary bone dysplasia, angina, myocardial infarction, ulcer, asthma, allergy, benign prostatic hypertrophy, and psychotic and neurological disorders (anxiety, schizophrenia, manic depression, delirium, dementia, severe Mental retardation, dentate nucleus red nucleus pallidus atrophy (DRPLA) hypophosphatemic rickets, autosomal dominant (2) acrocalosal syndrome and dyskinesia (eg, Huntington) And / or other pathologic conditions and disorders, such as diseases or Gilles de la Tourette syndrome).
[0029]
Secretin occupies a unique position in the history of gastrointestinal hormones. This is because secretin was first discovered in the duodenal mucosa by Bayliss and Starling (1902). This 27 amino acid peptide stimulates the secretion of bicarbonate, enzymes, and potassium ions by the pancreas.
[0030]
NOV3 is homologous to the B7-H2-like protein. Thus, NOV3 nucleic acids and polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: brain damage (including epilepsy) Eating disorders, schizophrenia, ADD and cancer; heart disease; inflammation and autoimmune disorders (including Crohn's disease), IBD, allergies, rheumatoid arthritis and osteoarthritis, inflammatory skin disorders, allergies, blood disorders; Psoriasis colon cancer, leukemia, AIDS; thalamic disorders; metabolic disorders (including diabetes and obesity); lung diseases (eg, asthma, emphysema, cystic fibrosis and cancer); pancreatic disorders (including pancreatic dysfunction and pancreatic cancer) ); And prostate disorders (including prostate cancer), and other diseases, disorders, and conditions.
[0031]
Co-stimulatory interactions between B7 family ligands and their receptors play an important role in T cell proliferation, differentiation and death. The involvement of T cells with the costimulator CD28 by either specific antibodies or their natural ligands (B7-1 and B7-2) is CD4 ⁺ Increase antigen-specific proliferation of T cells, enhance cytokine production, ⁺ Induces effector T cell maturation and promotes T cell survival.
[0032]
NOV4 is homologous to the B7-H1-like protein. Thus, NOV4 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: brain disorders (including epilepsy), Eating disorders, schizophrenia, ADD and cancer; heart disease; inflammation and autoimmune disorders (including Crohn's disease), IBD, allergies, rheumatoid arthritis and osteoarthritis, inflammatory skin disorders, blood disorders; psoriasis Colon cancer, leukemia, AIDS; thalamic disorders; metabolic disorders (including diabetes and obesity); lung diseases (eg, asthma, emphysema, cystic fibrosis and cancer); pancreatic disorders (including pancreatic dysfunction and cancer); And prostate disorders (including prostate cancer) and other diseases, disorders, and conditions.
[0033]
Some recent studies have shown that antigen receptors (eg, CD28, CTLA-4 (cytotoxic T) of B7 family members such as B7RP-1 (B7-related protein-1), B7-1, and B7-2. The importance of costimulatory interactions with lymphocyte-associated antigen 4) and ICOS (Inducible Co-Stimulatory molecule) has been demonstrated, these protein interactions activate normal T cells. And has been shown to be important for proliferation, B cell stimulation and antibody production, immunoglobulin class switching, interleukin production, and germinal center formation.
[0034]
NOV5 is homologous to the prostasin protein family. Thus, NOV5 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension Congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, aortic subvalvular stenosis, ventricular septal defect (VSD) ), Valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation and other diseases, disorders, and conditions.
[0035]
Human semen contains various proteolytic enzymes, including prostate specific antigen (OMIM number 176820) and acrosin (OMIM number 102480). These enzymes are involved in post-ejaculation proteolysis and semen coagulation and liquefaction (Yu et al. (1995)), and of the 40-kD protein originally isolated from semen by Yu et al. (1994). A partial amino acid sequence was obtained. This protein, named serine protease-8 (gene symbol = PRSS8), was called prostasin by the nomens. The precursor proprostasin is cleaved between residues 12 and 13 to yield a 12 amino acid light chain and a 299 amino acid heavy chain, which are linked via disulfide bonds. . The predicted amino acid sequence is between 34% and 42% identical to human acrosin, serum kallikrein (OMIM number 229000), and hepsin (OMIM number 142440).
[0036]
NOV6 is homologous to proteins of the lysosomal acid lipase family. Accordingly, NOV6 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful in therapeutic and diagnostic applications involving, for example, Wolman disease and cholesteryl ester storage disease.
[0037]
Lysosomal acid lipase A (LIPA), an enzyme that is probably defective in the allelic Wolman disease and cholesterol ester storage disease (OMIM number 278000), is located on chromosome 10. The clear kinetic and physical properties of lipase A and lipase B were defined by Warner et al. (1980). They stated that the natural substrate for LIPB is unknown and it is not clear that LIPB is a lysosomal hydrolase. LIPA can play an important role in cellular metabolism by releasing cholesterol. The liberated cholesterol suppresses further cholesterol synthesis and stimulates the esterification of intracellular cholesterol.
[0038]
NOV7 is homologous to tryptase 4. Thus, NOV7 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: Diabetes, von Hippel-Lindau ( VHL) syndrome, pancreatitis, obesity, cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) defect, arterial duct, pulmonary valve Stenosis, lower aortic stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, transplantation, fertility, endometriosis, Hirschsprung's disease, Crohn's disease, appendicitis, and Other diseases, disorders, and conditions.
[0039]
Human tryptase is a trypsin-like serine protease that is structurally unique and specific to mast cells. Recent biological and immunological studies relate to tryptase as a mediator in the pathology of numerous allergic and inflammatory conditions, including rhinitis, conjunctivitis, and most notably asthma. The growing body of data further relates tryptase to certain gastrointestinal disorders, skin disorders, cardiovascular disorders, and the like. However, the recent effectiveness of potent and selective tryptase inhibitors has facilitated the validation of this protease as an important therapeutic target.
[0040]
NOV8 is homologous to the P450 family of proteins. NOV8 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of certain pathologies and disorders. This is because the NOV8 protein of the present invention is ubiquitously expressed in many tissues.
[0041]
This P450 gene superfamily is a biologically diverse class of oxidase enzymes; members of this class are found in all organisms. P450 proteins are clinically and toxicologically important in humans; they are important enzymes in the metabolism of drugs and xenobiotic compounds and in the synthesis of cholesterol, steroids, and other lipids. Induction of some P450 genes may also be a risk factor for some types of cancer. This functional diversity is reflected in the diversity of nucleotide and protein sequences; there are currently over 100 human P450 forms described. Many allelic forms of the cytochrome P450 gene have been identified to cause quantitatively different rates of drug metabolism, and therefore it is important to consider the development of safe and effective human pharmaceutical therapies. For example, E.I. See review by Tanaka, J Clinical Pharmacy & Therapeutics 24: 323-329, 1999.
[0042]
NOV9 is homologous to the mitsugumin 29 protein. Thus, NOV9 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: Viscot-Oldrich Syndrome, Old Rich syndrome, eczema-thrombocytopenic immunodeficiency syndrome, thrombocytopenia, night blindness, amyotrophic lateral sclerosis, Batten's disease, ceroid lipolindrosis, Rett syndrome, Pick's disease (lobar atrophy), Cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, lower aortic stenosis , Ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, von Hippel-Lindau (VHL) syndrome, Alzheimer -Disease, seizure, tuberous sclerosis, hypercalcemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Lesch-Nyhan syndrome, multiple sclerosis, telangiectasia ataxia, white matter atrophy, behavioral disorder, addiction , Anxiety, pain, neuroprotection and other diseases, disorders, and conditions.
[0043]
Mitsugmin 29 is involved in the formation of specialized vesicular system in skeletal muscle cells and renal tubular cells. Its subcellular distribution and protein structure suggest that mitsugmin 29 is involved in signal transmission between T-tubules and the SR membrane at the junction.
[0044]
NOV10 is homologous to members of the neutral protease 1 family of proteins that are activated to micromolar calcium. Thus, NOV10 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: Diabetes, von Hippel-Lindau ( VHL) syndrome, pancreatitis, obesity, hypercalcemia, ulcer, endometriosis, fertility, hemophilia, hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune disease, allergy, immune deficiency, transplantation, Graft versus host disease, psoriasis, actinic keratosis, tuberous sclerosis, pressure ulcers, hair growth / hair loss, alopecia, pigmentation disorders, endocrine disorders, hemophilia, lymphedema, and others Diseases, disorders, and conditions.
[0045]
The predicted sequences described herein belong to the calpain protease family. Calpain or calcium-activated neutral protease is a non-lysosomal intracellular cysteine protease (Richard et al.). Calpain is an intracellular protease associated with many important cellular functions that is regulated by calcium.
[0046]
NOV11 is homologous to the P2X2C-like protein. Accordingly, NOV11 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from pain. Because activation of P2X receptors on sensory neurons has been demonstrated in vivo in pain models (including rat hind and knee joint preparations) as well as inflammatory models. P2X4 and / or P2X6 receptors in the CNS also appear to be involved in the pain pathway. Non-nociceptive P2 receptors on sensory nerves are present in reflex active intramuscular and sensory nerve endings, including afferent and efferent nerve fibers of the vagus nerve (Br J Anaesth 2000). Apr; 84 (4): 476-88). The compositions of the invention may also have efficacy in treating patients suffering from diabetes, obesity, syndrome X, and other diseases, disorders, and conditions.
[0047]
NOV12 relates to a DIABLO-like protein. Thus, NOV12 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: cancer, trauma, bacterial infections and viruses. Infection, regeneration (in vitro and in vivo), fertility, diabetes, autoimmune disease, renal artery stenosis, interstitial nephritis, glomerulonephritis, polycystic kidney disease, systemic lupus erythematosus, tubular acidosis, IgA nephropathy , Hypercalcemia, Lesch-Nyhan syndrome, von Hippel-Lindau (VHL) syndrome, tuberous sclerosis, endocrine disorder, Alzheimer's disease, stroke, hypercalcemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Multiple sclerosis, capillary dilatation ataxia, white matter atrophy, behavioral disorder, addiction, anxiety, pain, After protection as well as other diseases, disorders, and conditions such as.
[0048]
This DIABLO protein (indicating an IAP-binding protein with low pI) performs an important function in apoptosis by eliminating the inhibitory effect of IAP (an inhibitor of apoptotic proteins) on caspase (1). This protein is also known as Smac for the activator of caspases from the second mitochondria. DIABLO / Smac is usually a mitochondrial protein, but is released into the cytosol when cells undergo apoptosis. Mitochondrial uptake and cleavage of its signal peptide is required for DIABLO / Smac to obtain its apoptotic activity. Furthermore, overexpression of DIABLO / Smac has been shown to increase the sensitivity of cells to apoptotic stimuli (2).
[0049]
NOV13 is homologous to HRPET-1-related proteins. Accordingly, NOV13 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension Congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, aortic subvalvular stenosis, ventricular septal defect ( VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, diabetes, von Hippel-Lindau (VHL) syndrome, pancreatitis, fertility, endometriosis, dry mouth, cirrhosis, hemophilia, Hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune disease, allergy, immunodeficiency, graft-versus-host disease, lymphedema, hemophilia, hypercoagulability, Alzheimer's disease, stroke, hypercalcemia, parkin Disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Lesch-Nyhan syndrome, multiple sclerosis, telangiectasia ataxia, white matter atrophy, behavioral disorder, addiction, anxiety, pain, neuroprotection, systemic lupus erythematosus, asthma, Emphysema, scleroderma, ARDS, psoriasis, actinic keratosis, acne, hair growth / alopecia, alopecia, pigmentation disorder, endocrine disorder, renal artery stenosis, interstitial nephritis, glomerulus Nephritis, polycystic kidney disease, systemic lupus erythematosus, tubular acidosis, IgA nephropathy, Lesch-Nyhan syndrome and other diseases, disorders, and conditions.
[0050]
HRPET-1-related proteins are C.I. It is highly conserved across species among elegans, Drosophila, mice and humans. This protein is predicted to bind to the membrane. A high degree of conservation in the major sequence indicates that it has important biological functions but is currently unknown. This HRPET-1-related protein also shows homology with plant adhesion molecules, suggesting that HRPET-1-related proteins appear to be cell adhesion molecules involved in cell interactions and cell migration. To do.
[0051]
NOV14 is homologous to the B7-H2B protein. Thus, NOV14 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: brain disorders (epilepsy, eating disorders) Heart disease; inflammation and autoimmune disorders (including Crohn's disease, IBD, allergies, rheumatoid arthritis and osteoarthritis, inflammatory skin disorders, allergies, blood disorders), including schizophrenia, ADD, and cancer) Psoriasis colon cancer, leukemia AIDS; thalamic disorders; metabolic disorders (including diabetes and obesity); lung diseases (eg, asthma, emphysema, cystic fibrosis, and cancer); pancreatic disorders (including pancreatic dysfunction and cancer); ); And prostate disorders (including prostate cancer) and other diseases, disorders, and conditions.
[0052]
Costimulatory interactions between B7 family ligands and their receptors play an important role in T cell proliferation, differentiation, and death. The engagement of the T cell costimulator CD28 by either a specific antibody or its natural ligands B7-1 and B7-2 is CD4 ⁺ Increase antigen-specific proliferation of T cells, enhance cytokine production, CD8 ⁺ Induces effector T cell maturation and promotes T cell survival. However, signaling through the homologous CTLA-4 receptor for B7-1 and B7-2 on activated T cells inhibits T cell proliferation, interleukin (IL) -2 production, and cell cycle progression To deliver a negative signal.
[0053]
NOV15 is homologous to a galactosyltransferase-like protein. Accordingly, NOV15 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful in therapeutic and diagnostic applications involving, for example, the treatment of patients suffering from: proteodermatan sulfate, PDS imperfections Biosynthesis, incomplete biosynthesis of dermatan sulfate proteoglycan xylosyl protein 4-β-galactosyltransferase deficiency xgpt deficiency galactosyltransferase I deficiency, Erelus-Dunlo syndrome, cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart Defects, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular duct (AV) defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, lower aortic stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease Tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, endometriosis, fertility, von Hippel Dow (VHL) syndrome, Alzheimer's disease, seizure, tuberous sclerosis, hypercalcemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Lesch-Nyhan syndrome, multiple sclerosis, capillary dilatation ataxia, white matter atrophy Symptoms, behavioral disorders, addiction, anxiety, pain, neuroprotection and other diseases, disorders, and conditions.
[0054]
This enzyme galactosyltransferase (EC 2.4.1.38) catalyzes a reaction involving UDP galactose and N-acetylglucosamine for the production of galactose β-1,4-N-acetylglucosamine. This galactosyltransferase enzyme also forms a heterodimer with the regulatory protein α-lactalbumin to form lactose synthetase (EC 2.4.1.22). In addition to biosynthetic roles, galactosyltransferases can be components of the plasma membrane that they can function in cell-cell recognition and / or adhesion.
[0055]
NOV16 is homologous to lymphocyte antigen precursor-like protein. Accordingly, NOV16 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: cancer, trauma, regeneration, viral infection / Bacterial infection / parasitic infection.
[0056]
NOV17 is homologous to pepsinogen C-like protein. Thus, NOV17 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from: Ulcer, Hypertension (Scan J Clin Lab) Invest Suppl 1992; 210: 111-9), gastric mucosal inflammation and atrophy and other diseases, disorders, and conditions. PGC gene polymorphisms are associated with gastric ulcers and may be a subclinical marker of hereditary predisposition to gastric ulcers (Nippon Rinsho 1996 Apr; 54 (4): 1149-54). Serum quantification of pepsinogen A (PGA) and pepsinogen C (PGC) may indicate gastric mucosal inflammation and atrophy. The body gastric mucosa produces both PGA and PGC, whereas the sinus mucosa expresses only PGC. Thus, diseases primarily related to sinuses (eg, H. pylori infection) are primarily indicated by changes in serum PGC rather than serum PGA. Under consent, the sinus mucosa is more pathogenic, cagA positive, causing severe inflammation. When infected by the Pylori strain, it causes a significant increase in serum PGC (Recenti Prog Med 1999 Jun; 90 (6): 342-6).
[0057]
Gastric aspartic proteinases (pepsin A, pepsin B, gastricin / pepsinogen C and chymosin) are synthesized in the gastric mucosa as inactive precursors (known as zymogens). Each gastric zymogen contains a prosegment (ie, an N-terminal additional residue of the active enzyme) that serves to stabilize the inactive form and prevents transfer of the substrate to the active site. Upon food intake, each zymogen is released into the gastric lumen and undergoes conversion to the active enzyme in acidic gastric juice.
[0058]
NOV18 is homologous to ALR-like proteins. Accordingly, NOV18 nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention are useful, for example, in therapeutic and diagnostic applications involving the treatment of patients suffering from cancer (eg, acute lymphocytic leukemia) , Acute myeloid leukemia, translocation-related leukemia, and other diseases, disorders, and conditions.
[0059]
This ALL-1 gene relates to human acute leukemia via chromosomal translocation or internal rearrangement. ALL-1 is a human homologue of Drosophila trithorax. This trisolux is a member of the trisolux group (trx-G) gene, together with the polycomb group (Pc-G) gene, to determine the body structure of Drosophila. Each acts as a positive regulator and a negative regulator. ALL, an ALL-1 related protein, is a very long run of glutamine interrupted by the SET domain, five PHD fingers, potential zinc fingers, and hydrophobic residues (mostly leucine). ) Encodes a large long protein of 5262 amino acids.
[0060]
NOVX nucleic acids and NOVX polypeptides can also be used to screen for molecules that inhibit or increase NOVX activity or NOVX function. In particular, the nucleic acids and polypeptides according to the invention are used as targets, for example, for the identification of small molecules that modulate or inhibit neurogenesis, cell differentiation, cell proliferation, hematopoiesis, wound healing and angiogenesis. obtain.
[0061]
Further utility for NOVX nucleic acids and NOVX polypeptides according to the present invention is disclosed herein.
[0062]
(NOV1)
One NOVX protein of the present invention (referred to herein as NOV1) includes four fibromodulin-like proteins. These disclosed proteins are named NOV1a, NOV1b, NOV1c and NOV1d.
[0063]
(NOV1a)
The disclosed NOV1a (designated as CuraGen Acc. No. CG-56201-01) encodes a novel fibromodulin-like protein and includes a 1455 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1), which is shown in Table 1A. Indicated. An open reading frame for the mature protein was identified that begins with an ATG start codon at nucleotides 197-199 and ends with a TGA stop codon at nucleotides 1445-1447. The putative untranslated region is underlined in Table 1A and the start and stop codons are bolded.
[0064]
[Table 1A]

The disclosed NOV1a nucleic acid sequence is located on chromosome 1 and has 1061 bases relative to gb: GENBANK-ID: HSFIBR | acc: X729313.1 mRNA (H. sapiens gene for fibrojuline) from Homo sapiens Of which have 1050 bases (98%) identity (E = 2.0e ^-246 ).
[0065]
The NOV1a polypeptide (SEQ ID NO: 2) is 416 amino acid residues long and is shown in Table 1B using the one letter amino acid code. The results of SignalP, Psort, and / or hydropathy predict that NOV1a has a signal peptide and may localize to the lysosome (lumen) with a certainty of 0.5500. In alternative embodiments, the NOV1a polypeptide is extracellular to the cell with a certainty of 0.3700, to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000 or to the endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 0.1000 Localized. SignalP predicts that a possible cleavage site for the NOV1a peptide is between amino acids 18 and 19 (ie, the dashed line in the sequence SQA-QY).
[0066]
[Table 1B]

NOV1a amino acid sequence is 353 amino acid residues relative to ptnr: SWISSSNEW-ACC: Q06828 protein (fibrojuline precursor (FM) (59 KDA collagen binding protein)) derived from Homo sapiens (human) (376 amino acid residues) Have 336 amino acid residues (95%) identity, and 353 amino acid residues 338 amino acid residues (95%) similarity (E = 3.9e) ^-184 ).
[0067]
The possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV1a are listed in Table 1C.
[0068]
[Table 1C]

(NOV1b)
The disclosed NOV1b (designated as CuraGen Acc. No. CG56201-02) contains a sequence of 965 nucleotides (SEQ ID NO: 3) and is shown in Table 1D. The open reading frame for the mature protein was identified to begin with an ATG codon at nucleotides 57-59 and end with a TGA codon at nucleotides 963-965. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. The estimated untranslated region is underlined.
[0069]
[Table 1D]

The disclosed NOV1b nucleic acid sequence is located on chromosome 1 and 613 against gb: GENBANK-ID: HSFIBR | acc: X729313.1 mRNA (H. sapiens gene for fibrojuline) from Homo sapiens 613 bases (100%) of the bases are identical (E = 2.7e) ^-211 ).
[0070]
This NOV1b polypeptide (SEQ ID NO: 4) is 302 amino acid residues long and is shown in Table 1E using the one letter amino acid code. The results of SignalP, Psort, and / or hydropathy predict that NOV1b has a signal peptide and may be localized to the lysosome (lumen) with a certainty of 0.4595. In alternative embodiments, the NOV1b polypeptide is extracellular to the cell with a certainty of 0.3700, to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000, or to the endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 0.1000. Localized. SignalP predicts that a possible cleavage site for the NOV1b peptide is between amino acid positions 18 and 19 (ie, the dashed line in the sequence SQA-QY).
[0071]
[Table 1E]

NOV1b amino acid sequence is 217 amino acid residues relative to ptnr: SWISSSNEW-ACC: Q06828 protein (fibrojuline precursor (FM) (59 KDA collagen binding protein)) (376 amino acid residues) derived from Homo sapiens (human) Of 207 amino acid residues (95%) and 209 amino acid residues (96%) of 217 amino acid residues (96%) (E = 7.2e) ⁻¹⁰⁵ ).
[0072]
(NOV1c)
The disclosed NOV1c (designated as CuraGen Acc. No. CG56201-04) comprises a 1139 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) and is shown in Table 1F. An open reading frame for the mature protein was identified that begins with an ATG codon at nucleotides 57-59 and ends with a TGA codon at nucleotides 1137-1139. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. The estimated untranslated region is underlined.
[0073]
[Table 1F]

The nucleic acid sequence of NOV1c is located on chromosome 1, and is 1065 bases relative to gb: GENBANK-ID: HSFIBR | acc: X72913.1 mRNA (H. sapiens gene for fibrojuline) from Homo sapiens. Of these, 1036 bases (97%) have identity (E = 9.4e) ^-220 ).
[0074]
The NOV1c polypeptide (SEQ ID NO: 6) is 360 amino acid residues long and is shown in Table 1G using the one letter amino acid code. The results of SignalP, Psort, and / or hydropathy predict that NOV1c has a signal peptide and may be localized to the lysosome (lumen) with a certainty of 0.5305. In alternative embodiments, the NOV1c polypeptide is extracellular to the cell with a certainty of 0.3700, to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000, or to the endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 0.1000. Localized. SignalP predicts that a possible cleavage site for the NOV1c peptide is between amino acid positions 18 and 19 (ie, the dashed line in the sequence SQA-QY).
[0075]
[Table 1G]

NOV1c amino acid sequence is 376 amino acid residues relative to ptnr: SWISSSNEW-ACC: Q06828 protein (fibrojuline precursor (FM) (59 KDA collagen binding protein)) derived from Homo sapiens (human) (376 amino acid residues) Of 360 amino acid residues (95%) and 360 of 376 amino acid residues similarity (95%) (E = 1.4e) ^-195 ).
[0076]
NOV1c is expressed in at least the following tissues: aorta, bone marrow, brain, cartilage, cochlea, colon, heart, kidney, liver, lung, lymph node, lymphoid tissue, mammary gland / breast, muscle, ovary, Pancreas, parathyroid gland, parotid salivary gland, placenta, prostate, retina, salivary gland, skin, spinal cord, stomach, testis, thyroid, uterus, whole organism.
[0077]
(NOV1d)
The disclosed NOV1d (CuraGen Acc. No. CG56201-01; indicated as assembly 224700033) comprises a 1053 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) and is shown in Table 1H. The open reading frame for the mature protein was identified to begin with a GGA codon at nucleotides 1 to 3 and end with a GAG codon at nucleotides 1051 to 1053. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold.
[0078]
[Table 1H]

The NOV1d polypeptide (SEQ ID NO: 8) is 360 amino acid residues long and is shown in Table 1I using the one letter amino acid code. The results of SignalP, Psort, and / or hydropathy predict that NOV1c has a signal peptide and may be localized to the lysosome (lumen) with a certainty of 0.5305. In alternative embodiments, the NOV1d polypeptide is extracellular to the cell with a certainty of 0.3700, to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000, or to the endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 0.1000. Localized. SignalP predicts that a possible cleavage site for the NOV1d peptide is between amino acids 18 and 19 (ie, the dashed line in the sequence SQA-QY).
[0079]
[Table 1I]

NOV1d is expressed in at least the following tissues: aorta, bone marrow, brain, cartilage, cochlea, colon, heart, kidney, liver, lung, lymph node, lymphoid tissue, mammary gland / breast, muscle, ovary, Pancreas, parathyroid gland, parotid salivary gland, placenta, prostate, retina, salivary gland, skin, spinal cord, stomach, testis, thyroid, uterus, whole organism. The expression information is derived from the tissue source of the sequence contained in the induction of the NOV1d sequence.
[0080]
NOV1a, NOV1b, NOVlc and NOV1d are very strictly homologous, as shown in the amino acid alignment in Table 1J.
[0081]
[Table 1J]

Homology to any of the above NOV1 proteins is shared by other NOV1 proteins to the extent they are homologous to each other as shown above. Any reference to NOV1 is generally assumed to refer to both of those NOV1 proteins, unless otherwise stated.
[0082]
NOV1a also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 1K.
[0083]
[Table 1K]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 1L.
[0084]
[Table 1L]

Tables 1M and 1N list domain descriptions from DOMAIN analysis results for NOV1. This result indicates that the NOV1 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0085]
[Table 1M]

[0086]
[Table 1N]

The N-terminal domain of leucine-rich repeat (Accno.gnl | Pfam | pfam01462) is represented by the sequence domain LRRNT. Leucine-rich repeat pfam00560 is a short sequence motif with diverse functions and cellular locations that is present in many proteins. Leucine-rich repeats are often flanked by cysteine-rich domains. This domain is often found at the N-terminus of tandem leucine-rich repeats.
[0087]
This fibromodulin precursor (59 kd collagen binding protein) binds to type I and type II collagen and affects the rate of myofibril formation. This fibromodulin precursor also binds to keratan sulfate chains and belongs to the small interstitial proteoglycan family. The protein also contains 10 repeated leucine-rich (lrr) segments.
[0088]
Fibromodulin is a member of the small interstitial proteoglycan family, including also decorin (DCN; OMIM125255), biglycan (BGN; OMIM301870), and lumican (LDC; OMIM600616). These proteoglycan core proteins are composed of a leucine-rich repeat core sandwiched by disulfide-bonded terminal domains, and have a structure and a fibrojuline core protein having 4 or less keratan sulfate chains in the leucine-rich domain. Related. Fibromodulin exhibits a wide tissue distribution, with maximum amounts observed in the cartilage, tendons and ligaments of the joints. Fibromodulin has been suggested to be involved in extracellular matrix assembly by its ability to interact with type I and type II collagen myofibrils and inhibit fibril development in vitro.
[0089]
The similarity information, expression pattern, cellular localization, and mapping position of the NOV1 protein and NOV1 nucleic acid disclosed herein are important structures and / or characteristics that this NOV1 is characteristic of the glycoprotein family. Or it may have a physiological function. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include serving as a specific or selective diagnostic and / or prognostic marker for a nucleic acid or protein, where the presence and amount of the nucleic acid or protein is assessed. These also include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapy, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic targets, diagnostic targets, drug targeting / cytotoxicity) Antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / genetic excision), (v) agents that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, and (vi) biological defense measures.
[0090]
The nucleic acids and proteins of the invention have application in the diagnosis and / or treatment of various diseases and disorders. For example, the compositions of the invention have efficacy in the treatment of patients suffering from: repair of damage to cartilage and ligaments; joint repair, and therapeutic applications to other diseases, disorders, and conditions.
[0091]
The novel nucleic acids encoding the fibromodulin-like proteins of the invention, or fragments thereof, are useful in diagnostic applications, where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be evaluated. These substances are further useful in the generation of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV1 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV1 epitope is about 30-32 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV1 epitope is about 45-49 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV1 epitopes are about amino acids 65-80, 105-120, 140-150, 155-180, 190-192, 198-200, 210-215, 220-225, 230. ~ 250 and 280-300.
[0092]
(NOV2)
NOV2 contains three novel secretin receptor precursor-like proteins. These disclosed proteins are named NOV2a, NOV2b, and NOV2c.
[0093]
(NOV2a)
The disclosed NOV2a nucleic acid (designated as CuraGen Acc. No. CG56213-01) encodes a novel secretin receptor precursor-like protein, which contains a sequence of 1280 nucleotides (SEQ ID NO: 9) and is shown in Table 2A It is. The open reading frame for the mature protein was identified to begin with an ACT codon at nucleotides 1 to 3 and end with a TGA codon at nucleotides 1264 to 1266. The putative untranslated region is underlined in Table 2A and the start and stop codons are bolded.
[0094]
[Table 2A]

The nucleic acid sequence of NOV2a is located on chromosome 2 ql4.1 and is 932 against gb: GENBANK-ID: HSU13989 | acc: U19989.1 mRNA (human secretin receptor mRNA, complete cds) from Homo sapiens. Has 868 bases (93%) of the identity (E = 2.5e) ^-176 ).
[0095]
The NOV2a polypeptide (SEQ ID NO: 10) is 421 amino acid residues long and is shown in Table 2B using the one letter amino acid code. SignalP, Psort, and / or hydropathy results predict that NOV2a may localize to the plasma membrane with a certainty of 0.6000. In an alternative embodiment, the NOV2a polypeptide is Golgi with 0.4000 certainty, endoplasmic reticulum (membrane) with 0.3000 certainty, or microbody (peroxisome) with 0.3000 certainty. Be localized.
[0096]
[Table 2B]

The NOV2a amino acid sequence is 416 amino acid residues out of 421 amino acid residues with respect to ptnr: SWISSPROT-ACC: P47872 protein (secretin receptor precursor (SCT-R)) (440 amino acid residues) derived from Homo sapiens (human). (98%) identity and 416 amino acid residues (98%) of 421 amino acid residues (E = 3.7e) ^-227 ).
[0097]
NOV2a is expressed in at least the following tissues: pancreas, lung. This information is derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention, including but not limited to SeqCalling sources.
[0098]
Possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV2a are listed in Table 2C.
[0099]
[Table 2C]

(NOV2b)
The disclosed NOV2b nucleic acid (designated as CuraGen Acc. No. CG56213-02) contains a sequence of 789 nucleotides (SEQ ID NO: 11) and is shown in Table 2D. The open reading frame for the mature protein was identified to begin with an ATG codon at nucleotides 76-78 and end with a TGA codon at nucleotides 559-561. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. Putative untranslated regions found upstream from the start codon and downstream from the stop codon are underlined.
[0100]
[Table 2D]

The nucleic acid sequence of NOV2b is located on chromosome 2 ql4.1 and is 526 against gb: GENBANK-ID: HSU28281 | acc: U28281.1 mRNA (human secretin receptor mRNA, complete cds) from Homo sapiens. Has 472 bases (89%) of the identity (E = 4.1e) ^-118 ).
[0101]
The NOV2b polypeptide (SEQ ID NO: 12) is 161 amino acid residues long and is shown in Table 2E using the one letter amino acid code. SignalP, Psort, and / or hydropathy results predict that NOV2b has a signal peptide and may localize to the plasma membrane with a certainty of 0.4600. In alternative embodiments, the NOV2b polypeptide may be microbodies (peroxisomes) with a certainty of 0.2543, endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000, or an endoplasmic reticulum with a certainty of 0.1000 ( Localized in the lumen). SignalP predicts that a possible cleavage site for the NOV2b peptide is between amino acids 61 and 62 (ie, the dash line in the sequence LHC-TR).
[0102]
[Table 2E]

NOV2b amino acid sequence is 82 amino acid residues out of 92 amino acid residues for ptnr: SWISSPROT-ACC: P47872 protein (secretin receptor precursor (SCT-R)) (440 amino acid residues) derived from Homo sapiens (human) (89%) identity and similarity of 84 amino acid residues (91%) out of 92 amino acid residues (E = 9.6e) ^-81 ).
[0103]
NOV2b is expressed in at least the following tissues: pancreas, lung. Expression information was derived from the tissue source of the sequence involved in the induction of the sequence of NOV2b.
[0104]
(NOV2c)
The disclosed NOV2c nucleic acid (designated as CuraGen Acc. No. CG56213-03) comprises a 1633 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) and is shown in Table 2F. The open reading frame for the mature protein was identified to begin with an ATG codon at nucleotides 109-111 and end with a TAA codon at nucleotides 979-981. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. The putative untranslated region is underlined and is found upstream from the start codon and downstream from the stop codon.
[0105]
[Table 2F]

The nucleic acid sequence of NOV2c is located on chromosome 2 ql4.1 and is 961 against gb: GENBANK-ID: HSU28281 | acc: U28281.1 mRNA (human secretin receptor mRNA, complete cds) from Homo sapiens. Of the bases, it has 960 bases (99%) identity (E = 0.0).
[0106]
The NOV2c polypeptide (SEQ ID NO: 14) is 290 amino acid residues long and is shown in Table 2G using the one letter amino acid code. SignalP, Psort, and / or hydropathy results predict that NOV2c has a signal peptide and may be localized extracellularly to the plasma membrane with a certainty of 0.4600. In alternative embodiments, the NOV2c polypeptide is microbodies (peroxisomes) with a confidence of 0.1589, endoplasmic reticulum (membrane) with a confidence of 0.1000, or endoplasmic reticulum with a confidence of 0.1000 ( Localized in the lumen). SignalP predicts that a possible cleavage site for the NOV2c peptide is between amino acids 27 and 28, which is the dashed line of the sequence TGA-LP.
[0107]
[Table 2G]

NOV2c amino acid sequence is 283 amino acid residues out of 284 amino acid residues to ptnr: SWISSPROT-ACC: P47872 protein (secretin receptor precursor (SCT-R)) (440 amino acid residues) derived from Homo sapiens (human) (99%) identity and 283 amino acid residues (99%) of 284 amino acid residues (E = 1.5e) ^-155 ).
[0108]
NOV2c is expressed in at least the following tissues: pancreas, lung. Expression information is derived from the tissue source of the sequence involved in the induction of the sequence of NOV2c.
[0109]
NOV2a, NOV2b, and NOV2c are very strictly homologous, as shown in the amino acid alignment in Table 2H.
[0110]
[Table 2H]

Homology to any of the above NOV2 proteins is shared by other NOV2 proteins to the extent they are homologous to each other as shown above. Any reference to NOV2 is generally assumed to refer to both of those NOV2 proteins, unless otherwise stated.
[0111]
NOV2a also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 2I.
[0112]
[Table 2I]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 2J.
[0113]
[Table 2J]

Tables 2K, 2L, and 2M list the domain descriptions from the DOMAIN analysis results for NOV2. This result indicates that the NOV2 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0114]
[Table 2K]

[0115]
[Table 2L]

This extracellular domain probably contains four conserved cysteines for disulfide bonds. This domain is found in various hormone receptors. This can be a ligand binding domain.
[0116]
[Table 2M]

Selectin (SCT; OMIM no. 182099) occupies a unique position in the history of gastrointestinal hormones due to its first discovery in the duodenal mucosa by Bayliss and Starling (1902). This 27 amino acid peptide stimulates the secretion of bicarbonate, enzymes and potassium ions by the pancreas. Ishihara et al. (1991) isolated a cDNA encoding the rat secretin receptor. This nucleotide sequence indicated that this secretin receptor has a calculated molecular weight of 48,696. This receptor contains seven putative transmembrane segments and belongs to the family of G protein coupled receptors. G protein-coupled receptors include parathroid hormone receptor (OMIM number 168468), glucagon-like receptor (OMIM number 138032), and calcitonin receptor (OMIM number 114131).
[0117]
Chow (1995) showed that the secretin receptor cDNA isolated from the pancreatic line carcinoma cell line cDNA library was 1,717 bp long and encoded a 440 amino acid polypeptide. Northern blot analysis detected 1.8 kb mRNA in the human pancreas and small intestine, while weak hybridization signals were detected in the human colon, kidney, and lung.
[0118]
The NOV2 protein and NOV2 nucleic acid disclosed herein suggest that it may have important structural and / or physiological functions characteristic of the secretin receptor precursor family. Thus, the nucleic acids and proteins of the present invention are useful as potential diagnostic and therapeutic applications and research tools. These include specific or selective nucleic acid or protein diagnostic and / or prognostic markers, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed, and potential therapeutic applications such as: Those that play a role: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug targeted / cytotoxic antibodies), (iv) genes Nucleic acids useful in therapy (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo (vi) biological defense measures.
[0119]
The nucleic acids and proteins of the present invention are useful in potential diagnostic and potential therapeutic applications involving the following various diseases and disorders and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention have efficacy in the treatment of patients suffering from: developmental disorders, MHCII and MHCIII diseases (immune diseases), impaired taste detection ability and impaired olfactory detection ability, Burkitt lymphoma, cortical nerve Sexually transmitted diseases, signal transduction pathway disorders, retinal diseases (including retinal diseases related to photoreception), cell growth rate disorders; cell shape disorders, eating disorders; regulation of feeding; potential obesity due to overeating; starvation (appetite ( apetite) deficiency), potential disorders due to non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM1), bacterial infections, fungal infections, protozoal and viral infections (especially infections caused by HIV-1 or HIV-2), pain , Cancer (neoplasm; adenoma; lymphoma; prostate cancer; uterine cancer, including but not limited to), anorexia, bulimia Asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, residual urine, osteoporosis, Crohn's disease; multiple sclerosis; and allbright hereditary dysplasia, angina, myocardial infarction, ulcer, asthma, allergy, benign Prostatic hypertrophy, and psychotic and neurological disorders (anxiety, schizophrenia, manic depression, delirium, dementia, severe mental retardation, dentate nucleus red nucleus pallidal atrophy (DRPLA) hypophosphatemia Symptomatic rickets, autosomal dominant (2) including apical corpus callosum syndrome and dyskinesia (eg, including Huntington's disease or Gilles de la Tourette syndrome) and / or other pathologies and disorders. This polypeptide can be used as an immunogen to produce antibodies specific to the present invention and as a vaccine. They can also be used to screen for potential agonist and antagonist compounds. For example, a cDNA encoding the NOV2 protein can be useful for gene therapy, and the NOV2 protein can be useful when administered to a subject in need thereof. By way of non-limiting example, the compositions of the present invention may be used to treat bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, and viral infections (especially infections caused by HIV-1 or HIV-2), pain, cancer ( Organisms; adenocarcinoma; lymph node; prostate cancer; including uterine cancer), anorexia, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, residual urine, osteoporosis, Crohn's disease; Multiple sclerosis and Albright hereditary osteogenesis, angina, myocardial infarction, ulcer, asthma, allergy, benign prostatic hypertrophy, and psychotic and neurological disorders (anxiety, schizophrenia, manic depression For the treatment of illness, delirium, dementia, severe mental retardation and dyskinesia (eg Huntington's disease or Gilles de la Tourette syndrome) and / or other pathologies and disorders Novel nucleic acids encoding the NOV2 protein of the present invention, and NOV proteins, or fragments thereof, may be further useful for diagnostic applications, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed These substances are cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis Aortic valve stenosis, atrioventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation; colon cancer, colorectal cancer; type 6 familial nonpolyposis; esophageal cancer Hepatoblastoma; low beta lipoproteinemia familial 2; lung cancer, metaphyseal cartilage dysplasia, Murk Jansen type; ovarian cancer, endometrioid carcinoma type; hairy tumor; pseudo-Zerweger Syndrome and other diseases, disorders, and conditions are further useful in the generation of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the present invention for use in therapeutic methods or diagnostic methods, such as.
[0120]
The novel nucleic acids (or fragments thereof) encoding the secretin receptor precursor-like protein of the present invention are useful for diagnostic applications in which the presence or amount of this nucleic acid or protein is assessed. These materials are further useful for the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel agents of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV2 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV2 epitope is approximately amino acid 10 to amino acid 25. In another embodiment, a contemplated NOV2 epitope is approximately amino acid 70 to amino acid 80. In an alternative embodiment, contemplated NOV2 epitopes include approximately amino acid 100 to amino acid 120, approximately amino acid 160 to amino acid 170, approximately amino acid 230 to amino acid 235, approximately amino acid 255 to amino acid 260, approximately amino acid 310 to amino acid 320, approximately Examples include amino acids 370 to 380, and about amino acids 400 to 405.
[0121]
(NOV3)
NOV3 includes two novel B7-H2-like proteins. The disclosed proteins are named NOV3a and NOV3b.
[0122]
(NOV3a)
The disclosed NOV3a nucleic acid (shown as CuraGen accession number CG55790-03) encodes a novel B7-H2-like protein and includes the 1449 nucleotide sequence shown in Table 3A (SEQ ID NO: 15). An open reading frame was identified for the mature protein starting at the ATG codon at nucleotides 2-4 and ending at the TGA codon at nucleotides 908-910. Putative untranslated regions downstream of the stop codon and upstream of the start codon are underlined in Table 3A and the start and stop codons are bolded.
[0123]
[Table 3A]

The nucleic acid sequence of NOV3a of the present invention mapped to chromosome 21 is derived from Homo sapiens-derived gb: GENBANK-ID: AF28909028 | acc: AF2899021 mRNA (Homo sapiens transmembrane protein B7-H2 ICOS ligand mRNA, complete cds) In contrast, 1448 bases out of 1449 bases (99%) are identical (E = 0.0).
[0124]
The NOV3a polypeptide (SEQ ID NO: 16) is 302 amino acid residues long and is shown in Table 3B using the one letter amino acid code. Signal P, Psort and / or hydropathy predict that NOV3a has a signal peptide and may be localized to the plasma membrane with a probability of 0.4600. In alternative embodiments, the NOV3a polypeptide is placed in the lysosome (lumen) with an accuracy of 0.2000, placed in the endoplasmic reticulum (membrane) with an accuracy of 0.1000, or 0. Placed in the endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 1000. Signal P predicts a potential cleavage site for the NOV3a peptide between amino acid positions 18 and 19 (ie, the dash of the sequence LRA-DT).
[0125]
[Table 3B]

NOV3a amino acid sequence is 302 (100%) of 302 amino acid residues to 302 amino acid residues ptnr: TREMBLNEW-ACC: AAG01176 protein (transmembrane protein B7-H2 ICOS ligand) derived from Homo sapiens (human) Are the same and 302 (100%) of 302 amino acid residues are similar (E = 4.0e) ¹⁶¹ ).
[0126]
NOV3a is expressed in at least the following tissues: adrenal gland, bone marrow, brain-tonsillar, brain-cerebellum, brain-hippocampus, brain-substantia nigra, brain-thalamus, brain-whole, fetal brain, fetal kidney, fetal liver, Fetal lung, heart, kidney, lymphoma-large, breast, pancreas, pituitary, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, testis, thyroid, trachea, and uterus. Expression information was derived from the tissue information of the sequence included in the induction of the NOV3a sequence.
[0127]
The possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV3a are listed in Table 3C and Table 3D.
[0128]
[Table 3C]

[0129]
[Table 3D]

(NOV3b)
The disclosed NOV3b nucleic acid (shown as CuraGen accession number CG55790-04) encodes a novel B7-H2-like protein, which contains the 8250 nucleotide sequence shown in Table 3E (SEQ ID NO: 17). An open reading frame was identified for the mature protein starting at the ATG codon at nucleotides 4-6 and ending at the stop codon at nucleotides 1420-1422. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. A putative untranslated region is underlined and found upstream of the start codon and downstream of the stop codon.
[0130]
[Table 3E]

The NOV3b polypeptide (SEQ ID NO: 18) is 473 amino acid residues long and is shown in Table 3F using the one letter amino acid code.
[0131]
[Table 3F]

NOV3a and NOV3b have very close homology as shown in the amino acid alignment of Table 3G.
[0132]
[Table 3G]

Homology to any of the above NOV3 proteins is shared by other NOV3 proteins to the extent that they are homologous to each other as shown above. Any reference to NOV3 is assumed to generally refer to both NOV3 proteins, unless otherwise indicated.
[0133]
NOV3a also has homology to the amino acid sequences shown in the BLASTP data listed in Table 3H.
[0134]
[Table 3H]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 3I.
[0135]
[Table 3I]

Table 3J lists the domain descriptions from the domain analysis results for NOV3. This indicates that the NOV3 sequence contains properties similar to those of other proteins known to have these domains.
[0136]
[Table 3J]

Co-stimulatory interactions between B7 family ligands and their receptors play an important role in T cell proliferation, differentiation and death. Coupling of the T cell costimulator CD28 with either a specific antibody or its natural ligands B7-1 and B7-2 is associated with antigen-specific CD4 ⁺ Increase T cell proliferation, increase cytokine production, CD8 ⁺ Induces effector T cell maturation and promotes T cell survival. However, signaling through the homologous CTLA-4 receptor of B7-1 and B7-2 on activated T cells is negative that inhibits T cell proliferation, interleukin (IL) -2 production, and cell cycle progression It is thought to transmit a simple signal. Although B7-1 and B7-2 share only about 20% homology in their amino acids, they have a similar tertiary structure and costimulatory function. Recent studies indicate that other members of this B7-CD28 family may also be involved in the regulation of cellular and humoral immune responses. One of the new members is inducible costimulator (ICOS) (CD28-like receptor). The F44 monoclonal antibody (mAb) against human ICOS co-stimulates T cell proliferation in the presence of an optimal dose of anti-CD3 antibody and contains multiple cytokines (IL-10, interferon-, and IL4 but IL- 2) is increased.
[0137]
Another new B7 family member is mouse B7h / B7RP-1. B7h / B7RP-1 does not bind to CD28 and CTLA-4 and cannot co-stimulate T cell proliferation in the presence of antigenic signals. Surface expression of B7h / B7RP-1 is upregulated by tumor necrosis factor in the 3T3 fibroblast cell line, and an increase in B7h / B7RP-1 messenger RNA (mRNA) is also exposed to lipopolysaccharide (LPS). Observed in non-lymphoid tissues. B7h / B7RP-1 has been shown to be a ligand for mouse CRP-1 (a mouse homolog of human ICOS). Expression of B7RP-1 fusion protein in transgenic mice led to hyperplasia of multiple lymphoid organs, and treatment of mice with B7h / B7RP-1 fusion protein increased oxazoline-induced contact hypersensitivity. A new member of the human B7 family (B7-H1) has recently been reported. B7-H1 shares about 20% identical amino acid sequence with B7-1 and B7-2 in the IgV-like and IgC-like extracellular domains, but in the cytoplasmic domain more than B7-1 and B7-2. to differ greatly. Since the amino acid identity between them is less than 30%, B7-H1 does not appear to be a human homologue of mouse B7h / B7RP-1. Furthermore, B7-HI does not bind to CD28, CTLA-4, and ICOS. Surface expression of B7-Hl is the majority of activated CD14 ⁺ It can be detected on macrophages and some activated T cells.
[0138]
B7-H1 co-stimulates T cell responses, enhances allogeneic mixed lymphocyte responses, and favors secretion of IL-10 from T cells in the presence of suboptimal doses of anti-CD3 mAb To guide. By searching for molecules that share homology with the Ig V and Ig C domains of B7-1, B7-2, and B7-Hl in the NCBI database, followed by cloning and sequencing, B7-H2 A novel B7-like gene designated as (B7 homolog 2) was identified. In addition to the overall structural similarity to B7-1, B7-2, and B7-H1, B7-H2 binds to ICOS and co-stimulates human T cell proliferation and cytokine production. Cell surface expression of B7-H2 protein is detected in immature dendritic cells derived from monocytes. Soluble B7-H2 and immunoglobulin (Ig) fusion protein (B7-H2Ig) binds to activated T cells but not to resting T cells, and this binding is induced by inducible costimulator Ig (ICOSIg). ) But not by CTLA4Ig. In addition, ICOSIg stains Chinese hamster ovary cells transfected with the B7-H2 gene. With suboptimal cross-linking of CD3, costimulation of T cell proliferation by B7-H2Ig is dose dependent and correlates with secretion of interleukin (IL) -2, but optimal CD3 ligation is IL-10. Production is preferentially stimulated. This result indicates that B7-H2 is a putative ligand for ICOS T cell molecules (Blood. 2000; 96: 2808-2813) PMID: 11023515, UI: 20477846).
[0139]
T cell specific cell surface receptors CD28 and CTLA4 are important regulators of the immune system. CD28 potently enhances T cell function essential for an effective antigen-specific immune response, and CTLA4 counteracts CD28-mediated signals, and thus, over-stimulates the lymphatic system which is fatal without it. prevent. By creating monoclonal antibodies against activated human T cells, another member of this family of molecules of “inducible costimulators” designated ICOS has been identified. ICOS specific monoclonal antibodies did not react with resting human peripheral blood T cells, but stained CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes activated by stimulation of the T cell antigen receptor complex. Immunoprecipitation defined ICOS antigen as a disulfide-linked dimer with an apparent relative molecular weight of 55-60 kD. Protein purification by SDS-PAGE showed that ICOS is expressed on the cell surface as a homodimeric protein with two chains that differ only in post-translational modifications. A 2,641 base pair full length ICOS cDNA was cloned from the MOLT-4V T lymphoblast cDNA library. Northern analysis revealed a single ICOS mRNA species approximately 2.8 kb long in activated human T cells. The open reading frame of ICOS mRNA encodes a protein of 199 amino acids. The ICOS amino acid sequence shares 24% and 17% identity with CD28 and CTLA4, respectively. The predicted mature ICOS consists of a single immunoglobulin V-like domain stabilized by cysteine residues conserved at positions 42 and 109; a transmembrane region of approximately 23 amino acids; and a cytoplasmic tail of 35 amino acids It is a type I transmembrane molecule. It shows close structural similarity to CD28 and CTLA4. A cysteine residue located at position 141 in CD28 (also found in CTLA4) is clearly involved in the formation of disulfide bridges between the homodimeric chains of these proteins, and this is also ICOS In position 136. ICOS is consistent with CD28 in efficacy, and all basic T cell responses to external antigens (ie proliferation, secretion of lymphokines, upregulation of molecules that mediate cell-cell interactions, and antibody secretion by B cells) Effective supplement for strengthening). Unlike constitutively expressed CD28, ICOS must be newly induced on the T cell surface and does not upregulate the production of interleukin-2 (IL2), but interleukin-10 Over-induced synthesis of (IL10) (B cell differentiation factor). In vivo, ICOS is highly expressed on tonsil T cells, which are closely associated with B cells in the light zone at the tip of the T cell germinal center (the site of maturation of terminal B cells). ing.
[0140]
Icos-deficient mice have been generated and it has been determined that the absence of Icos does not impair T cell development. However, T cell activation for proliferation and IL2 production was impaired. Differentiated Icos − / − cells could produce IFNG, but neither IL4 nor IL2. In vivo immunization also revealed a deficiency in the production of IL2 and IL4 and a reduction in serum IgG1 and IgE. Using an allergy model, Icos is not required for Th2 cell differentiation but has been found to regulate the production of IL4 and IL13. Using an experimental autoimmune encephalitis (EAE) model of multiple sclerosis, Icos − / − mice are stronger compared to wild-type mice (having equal genetic background except for EAE resistance) It has been found to develop enhanced disease. Splenocytes from knockout and wild type mice produced undetectable levels of IL4 and similar levels of ILI0 and IFNG; however, Icos − / − mice derived cells did not produce IL13, Thus, wild type mice produce abundant quantities. It has been concluded that ICOS may have an important negative regulator role in protection against inflammatory diseases through induction of IL13.
[0141]
Icos-deficient mice have been found to have similar basal levels of IgM, slightly increased levels of IgG3, and decreased levels of IgG1, IgG2a, and IgE compared to wild-type mice. Immunized knockout mice and wild-type mice also have similar levels of IgM-specific antibodies, except in the presence of highly inflammatory complete Freund's adjuvant, but IgG1-specific and IgG2a-specific antibodies. Reduced antibody and reduced germinal center formation. IgM to IgG class switching was restored in Icos − / − mice by CD40 stimulation.
[0142]
It has been found that decreased T cell proliferation in cells from Icos deficient mice was associated with a marked decrease in expression of CD40LG, CD25, and CD69. B cell activation and T cell independent antibody responses were not impaired in Icos knockout mice. Only basal levels of IgG1 have been found to be significantly reduced in Icos − / − mice; however, after immunization, serum IgG1 and serum IgG2a levels are reduced, and IgE levels are detected It was consistent with what was impossible. An ELISA assay showed that this loss of class switching was associated with decreased IL4 production but not IFNG production. Immunohistochemical analysis determined that germinal center formation was also reduced in Icos knockout mice as in mice deficient in Cd40lg or Cd28.
[0143]
Protein similarity information, expression patterns, cellular localization, and map locations for the NOV3 proteins and NOV3 nucleic acids disclosed herein are important structural functions that are characteristic of immunoglobulin domain-containing protein families and Suggests that it may have a physiological function. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and potential therapeutic applications, and as research tools. These include serving as specific or selective nucleic acid or protein diagnostic and / or prognostic markers, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These also include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug targeted antibodies / cytotoxicity) Sex antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / gene excision), (v) agents that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, and (vi) biological protection measures.
[0144]
The nucleic acids and proteins of the invention have application in the diagnosis and / or treatment of various diseases and disorders. For example, the compositions of the invention may have efficacy for the treatment of patients suffering from: brain disorders including epilepsy, eating disorders, schizophrenia, ADD and cancer; heart disease; inflammatory disorders and Crohn's disease Autoimmune diseases, including IBD, allergies, rheumatic and osteoarthritis, inflammatory skin disorders, allergies, blood disorders; psoriasis, colon cancer, leukemia, AIDS; thalamus disorders; metabolic disorders (including diabetes and obesity); Lung diseases (eg, asthma, emphysema, cystic fibrosis and cancer); pancreatic disorders (including pancreatic dysfunction and pancreatic cancer); and prostate disorders (including prostate cancer), as well as other diseases, disorders, and conditions .
[0145]
The novel nucleic acids encoding the B7-H2-like proteins of the present invention, or fragments thereof, are useful in diagnostic applications where the presence or amount of this nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful for the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV3 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV3 epitope is approximately amino acid 20 to amino acid 25. In another embodiment, a contemplated NOV3 epitope is approximately amino acid 40 to amino acid 42. In other specific embodiments, contemplated NOV3 epitopes are approximately amino acid 48-amino acid 55, approximately amino acid 60-amino acid 75, approximately amino acid 90-amino acid 120, approximately amino acid 145-amino acid 180, approximately amino acid 230-amino acid 250, and It is approximately amino acid 270 to amino acid 290.
[0146]
(NOV4)
NOV4 contains two novel B7-H1-like proteins. The disclosed proteins are named NOV4a and NOV4b.
[0147]
(NOV4a)
The disclosed NOV4a nucleic acid (designated CG56110-01) encodes a novel B7-H1-like protein, includes a 4582 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 19), and is shown in Table 4A. An open reading frame for the mature protein was identified that begins with an ATG codon at nucleotides 10-12 and ends with a TAA codon at nucleotides 887-889. The putative untranslated regions downstream from the stop codon and upstream from the start codon are underlined in Table 4A, and the start and stop codons are bolded.
[0148]
[Table 4A]

The nucleic acid sequence of NOV4a mapped on chromosome 9 is 672 out of 873 bases relative to gb: GENBANK-ID: AF317088 | acc: AF317088.1 mRNA (Mus musculus B7-H1 protein mRNA, complete cds) from Mus musculus. The base (76%) is identical (E = 8.5e ⁻¹⁰⁶ ).
[0149]
The NOV4a polypeptide (SEQ ID NO: 20) is 290 amino acid residues long and is shown in Table 4B using the one letter amino acid code. Signal P, Psort and / or hydropathy predict that NOV4a has a signal peptide and may be localized to the plasma membrane with a probability of 0.4600. In alternative embodiments, the NOV4a polypeptide is placed in the endoplasmic reticulum (membrane) with an accuracy of 0.1000, placed in the endoplasmic reticulum (lumen) with an accuracy of 0.1000, or It is placed outside the cell with a certainty of 0.1000. Signal P predicts a potential cleavage site for the NOV4a peptide between amino acid positions 18 and 19 (ie, the dash of the sequence LNA-FT).
[0150]
[Table 4B]

NOV4a amino acid sequence is 202 (69%) of 290 amino acid residues identical to 290 amino acid residue ptnr: TREMBLNEW-ACC: AAG18509 protein (PD-1 ligand precursor) derived from Mus musculus (mouse) And 236 (81%) of 290 amino acid residues are similar (E = 3.0e) ^-116 ).
[0151]
NOV4a is expressed in at least the following tissues: LPS-treated dendritic cells, LPS-treated monocytes and macrophages, brain, neck, ovary, pituitary, placenta, uterus, whole organ. This information was obtained by determining the tissue source of the sequences included in the present invention, including but not limited to, SeqCalling sources, public EST sources, literature sources and / or RACE sources. .
[0152]
The possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV4a are listed in Table 4C.
[0153]
[Table 4C]

(NOV4b)
The disclosed NOV4b nucleic acid (shown as CG56110-04) (which is a splicing variant of NOV4a) comprises the 745 nucleotide sequence shown in Table 4D (SEQ ID NO: 21). An open reading frame for the mature protein was identified that begins with an ATG codon at nucleotides 1-3 and ends with a TAG codon at nucleotides 535-537. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. The putative untranslated region is underlined and is found upstream of the start codon and downstream of the stop codon.
[0154]
[Table 4D]

The nucleic acid sequence of NOV4b mapped to chromosome 9 is 530 bases relative to gb: GENBANK-ID: AF233516 | acc: AF2333516.1 mRNA (Homo sapiens PD-1 ligand precursor mRNA, complete cds) derived from Homo sapiens. Of these, 530 bases (100%) are identical (E = 2.8e) ^-160 ).
[0155]
The NOV4b polypeptide (SEQ ID NO: 22) is 178 amino acid residues long and is shown in Table 4E using the one letter amino acid code. Signal P, Psort and / or hydropathy predicts that NOV4b may have a signal peptide and be localized outside the cell with a certainty of 0.4180. In other embodiments, NOV4b is located in the endoplasmic reticulum (membrane) lysosome (lumen) with an accuracy of 0.1000, or is localized to the microbody (peroxisome) with an accuracy of 0.1000. The most likely cleavage site for the NOV4b peptide is between amino acid positions 18 and 19 (LNA-FT dash).
[0156]
[Table 4E]

The NOV4b amino acid sequence is 177 of 177 amino acid residues relative to the 290 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: Q9NZQ7 protein (B7-H1 (PD-1 ligand precursor)) derived from Homo sapiens (human). 100%) are identical, and 177 (100%) of 177 amino acid residues are similar (E = 1.8e) ^-92 ).
[0157]
NOV4b is expressed in at least the following tissues: mammalian tissue, uterus. Expression information was obtained from a tissue source of sequences included in the induction of the sequence of NOV4b.
[0158]
NOV4a and NOV4b are very closely homologous as shown in the amino acid alignment in Table 4F.
[0159]
[Table 4F]

Homology to any of the above NOV4 proteins is shared by other NOV4 proteins to the extent that they are homologous to each other as shown above. Any reference to NOV4 is assumed to generally refer to both NOV4 proteins, unless otherwise indicated.
[0160]
NOV4a also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 4G.
[0161]
[Table 4G]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 4H.
[0162]
[Table 4H]

Tables 4I and 4J list the domain descriptions from the DOMAIN analysis results for NOV4. This indicates that the NOV4 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0163]
[Table 4I]

[0164]
[Table 4J]

The interlocking of CTLA4 with B7-1 or B7-2, on the other hand, can inhibit proliferation and interleukin-2 (IL2) production. Antibodies against the CD28-related molecule ICOS can stimulate T cell proliferation and induce the production of IL10 and IL4. By searching the EST database for B7-1 and B7-2 homologs and then RT-PCRing the placental cDNA library, Dong et al. (1999) obtained cDNA encoding B7Hl (B7 homolog-1). Sequence analysis shows that this 290 amino acid type I transmembrane protein (which is 20% and 15% identical to B7-1 and B7-2, respectively) has an immunoglobulin V-like domain and immunoglobulin C. It was expected to have a like domain as well as a 30 amino acid cytoplasmic tail. Northern blot analysis detected the most abundant 4.1 kb and 7.2 kb B7H1 transcripts in heart, skeletal muscle, placenta, and lung, and these transcripts with weak expression in thymus, spleen, kidney, and liver Things were detected and no expression was detected in the brain, colon, and small intestine. Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis demonstrated B7H1 expression in the monocyte fraction and weak expression in T and B cells. Activation significantly increased expression on both T cells and monocytes, and to a lesser extent on B cells. Binding analysis did not demonstrate an interaction between B7H1 and ICOS, CTLA4, or CD28. Stimulation of T cells in the presence of B7H1 increased proliferation and preferential production of IL10 and gamma interferon (IFNG) in an IL2-dependent manner, but not preferential production of IL4.
[0165]
Freeman et al. (2000) also cloned B7H1, which they called “programmed cell death-1 (PDCD1 or PD1) ligand-1” or PDL1. Mouse Pdl1 is 70% identical to the human protein. Flow cytometry analysis and BIAcore analysis PDLI was determined to bind to PDCD1, but not to structurally similar CTLA4, CD28, or ICOS proteins. RNA blot hybridization shows that PDL1 is upregulated in monocytes by treatment with IFNG and upregulated in dendritic cells and keratinocytes by treatment with IFNG along with other activators. It was. In dendritic cells, B7-1 and B7-2 were upregulated in parallel with PDL1. PDL1 expression was also upregulated in B cells activated by surface Ig crosslinking. Activation of human and mouse Pdcdl + / + T cells in the presence of PDL1 reduces proliferation and cytokine secretion, probably due to the presence of a cytoplasmic immune receptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM) on PDCD1 Led.
[0166]
By PCR and somatic cell hybrid analysis, Freeman et al. (2000) mapped PDLI to chromosome 9. Scott (2000) mapped the B7HI gene to chromosome 9 based on the sequence similarity between the B7H1 sequence (GenBank GENBANK AF177937) and chromosome 9 clone RP11-574F11 (GenBank GENBANK AL162253).
[0167]
Rennert et al. (1997) Int Immunol 9, 805-13: B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) are genetically and structurally related molecules expressed on antigen presenting cells. Both of these bind to CD28 and costimulate T lymphocytes, resulting in proliferation and cytokine production. The extracellular portions of B7-1 and B7-2 that bind to CD28 and CTLA-4 are related to Ig variable (V) domain sequences and Ig constant (C) domain sequences. Recent reports describe splicing variant forms of the B7 protein that occur in vivo and whose function is unknown. Here we describe soluble recombinant forms of B7-1 and B7-2 that contain either an Ig-like extracellular domain or both individual IgV or IgC domains bound to an IgFc tail. . Soluble B7-1 and B7-2 bind to CD28 and CTLA-4 and effectively costimulate T lymphocytes, resulting in their proliferation and cytokine secretion. Furthermore, the IgV domain of B7-2 binds to CD28 and CTLA-4, competes with B7-1 and B7-2 for binding to these receptors, and co-stimulates T lymphocytes. Cross-linked soluble B7-2v is the most likely tested costimulatory molecule and is active at concentrations about 1 / 100-fold lower than cross-linked soluble B7-1 or B7-2 protein. there were. When bound to tosyl activated beads, B7-2v could support multiple rounds of T cell proliferation. These data complement the description of the naturally occurring variants, suggesting that in vivo costimulation of T cells can be prepared with soluble or truncated forms of B7 protein.
[0168]
Some recent studies have shown that B7 family members like B7RP-I (B7-related protein-1), B7-1, and B7-2 and antigen receptors (eg, CD28, CTLA-4 (cytotoxic T lymphocytes) The importance of costimulatory interactions with related antigens 4) and ICOS (inducible costimulatory molecules)) is demonstrated. These protein interactions have been shown to be essential for normal T cell activation and proliferation, B cell stimulation and antibody production, immunoglobulin class switching, interleukin production, and germinal center formation. . Because these events constitute an essential step in mediating an appropriate humoral immune response, these modulations can act as potential treatments for many types of immune system disorders (Dong, C , Et al, ICOS co-stimulatory receptor is essential for T-cell activation and function. Nature. 409, 97-101 (2001); 409, 102-105 (2001); Taftiri, A., et al., ICOS is essential for effective T-helper- .. Ell responses Nature 409, 105-109 (2001);... Yoshinaga, S.K., et T-cell co-stimulation through B7RP-1 and ICOS Nature 402, 827-932 (1999)).
[0169]
B7 family members B7-1 and B7-2 interact with CD28 and constitute an essential T cell costimulatory pathway in the initiation of antigen-specific humoral and cell-mediated immune responses. Here we describe a third member of the B7 family called B7-Hl. It does not bind to CD28, cytotoxic T lymphocyte A4 or ICOS (inducible costimulator). Ligation of B7-H1 costimulated T cells responded to polyclonal stimulants and allogeneic antigens and preferentially stimulated production of interleukin-10. Although produced in small amounts, interleukin-2 was required for the effect of B7-H1 costimulation. Thus, our studies define previously unknown costimulator molecules that can be involved in negative regulation of cell-mediated immune responses. PMID: 10581077, UI: 20048154
Co-stimulation is essential for T cell activation. On antigen presenting cells, important factors are found in the expanded family of B7 genes, which include cd80, cd86, B7h / B7RP-1 and B7-Hl. cd80 and cd86 encode proteins that bind to CD28 and CTLA4 on T cells. Blocking this pathway with a strong CTLA4-Ig fusion protein is shown to promote its therapeutic potential. The cd80 and cd86 pathways act primarily on untreated T cells, whereas B7h / B7RP-1 and B7-H1 appear to exert their effects on antigen-received lymphocytes. PMID: 11029388, UI: 20485717.
[0170]
The interlocking of CD28 (OMIM # 186760) with B7-1 (CD80; OMIM # 112203) or B7-2 (CD86; OMIM # 601020) in the presence of antigens is T cell proliferation, cytokine production, differentiation of effector T cells, And promotes induction of BCL-X (OMIM # 600039), a promoter of T cell survival. On the other hand, interlocking of CTLA4 (OMIM # 123890) with B7-1 or B7-2 can inhibit proliferation and interleukin-2 (IL2; OMIM # 147680) production. Antibodies against the CD28-related molecule ICOS (OMIM # 604558) can stimulate T cell proliferation and induce the production of IL10 (OMIM # 124092) and IL4 (OMIM # 147780). By searching the EST database for B7-1 and B7-2 homologs, and then performing RT-PCR of the placental cDNA library, Dong et al. (1999) obtained a cDNA encoding B7-Hl (B7 homolog-1). Obtained. Sequence analysis shows that the 290 amino acid type I transmembrane protein (which is 20% and 15% identical to B7-1 and B7-2, respectively) is an immunoglobulin V-like domain and an immunoglobulin C-like domain. As well as a 30 amino acid cytoplasmic tail. Northern blot analysis detected the most abundant 4.1 kb and 7.2 kb B7-H1 transcripts in heart, skeletal muscle, placenta, and lung, with weak expression in thymus, spleen, kidney, and liver No transcript was detected, and no expression was detected in the brain, colon, and small intestine. Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis demonstrated B7-H1 expression in the monocyte fraction and weak expression in T cells and B cells. Activation significantly increased expression on both T cells and monocytes, and to a lesser extent on B cells. Binding analysis did not demonstrate an interaction between B7-H1 and ICOS, CTLA4, or CD28. Stimulation of T cells in the presence of B7-H1 increased proliferation and preferential production of IL10 and gamma interferon (IFNG; OMIM # 147570) but increased preferential production of IL4 in an IL2-dependent manner I did not let it.
[0171]
The protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV4 protein and NOV4 nucleic acid disclosed herein have important structural and / or physiological functions that are characteristic of the B7 family. Suggest to get. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and potential therapeutic applications, and as research tools. These include serving as specific or selective nucleic acid or protein diagnostic and / or prognostic markers, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These also include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug antibodies / cytotoxic antibodies) ), (Iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, and (vi) biological protection measures.
[0172]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications associated with various diseases and disorders described below and / or other pathologies. For example, the compositions of the invention have efficacy for the treatment of patients suffering from: brain disorders including epilepsy, eating disorders, schizophrenia, ADD, and cancer; heart diseases; inflammatory disorders and Crohn's disease Including autoimmune diseases, IBD, allergies, rheumatoid and osteoarthritis, inflammatory skin disorders, allergies, blood disorders; psoriasis, colon cancer, leukemia, AIDS; thalamic disorders; metabolic disorders (including diabetes and obesity); lungs Diseases (eg, asthma, emphysema, cystic fibrosis and cancer); pancreatic disorders (including pancreatic dysfunction and pancreatic cancer); and prostate disorders (including prostate cancer), immune-mediated etiology, T cell mediated Disease, multiple sclerosis, colitis, cancer, trauma, regeneration (in vitro and in vivo), viral / bacterial / parasite infection, and other diseases, disorders, and conditions, etc.
[0173]
These substances are further useful for the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies are made according to methods known in the art using predictions from hydrophilicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV4 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV4 epitope is approximately amino acid 40 to amino acid 45. In another embodiment, a contemplated NOV4 epitope is approximately amino acid 52 to amino acid 55. In other specific embodiments, the contemplated NOV4 epitope is approximately amino acid 60-amino acid 68, approximately amino acid 70-amino acid 90, approximately amino acid 110-amino acid 112, approximately amino acid 130-amino acid 140, approximately amino acid 142-amino acid 145, Approximately amino acid 150 to amino acid 155, approximately amino acid 157 to amino acid 160, approximately amino acid 175 to amino acid 190, approximately amino acid 220 to amino acid 240, and approximately amino acid 260 to amino acid 280.
[0174]
(NOV5)
NOV5 contains two novel prostasin-like proteins. The disclosed proteins are called NOV5a and NOV5b.
[0175]
(NOV5a)
The disclosed NOV5a nucleic acid (referred to as CuraGen accession number CG56142-01) encodes a novel prostasin-like protein and includes the 866 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 23) and is shown in Table 5A. An open reading frame was identified that begins with an ATG codon at nucleotides 19-21 and ends with a TGA codon at nucleotides 820-822. The putative untranslated regions downstream from the stop codon and upstream from the start codon are underlined in Table 2A, and the start and stop codons are in bold.
[0176]
[Table 5A]

The nucleic acid sequence of NOV5a mapped to chromosome 16 is 421 out of 639 bases relative to gb: GENBANK-ID: AF175522 | acc: AF175522.1 mRNA (Homo sapiens transmembrane tryptase mRNA, complete cds) derived from Homo sapiens. The base (65%) is identical (E = 1.2e ^-30 ).
[0177]
The NOV5a polypeptide (SEQ ID NO: 25) is 267 amino acid residues long and is shown in Table 5B using the one letter amino acid code. Signal P, Psort and / or hydropathy predict that NOV5a has a signal peptide and may be localized extracellularly with a probability of 0.6902. In alternative embodiments, the NOV5a polypeptide is placed in the endoplasmic reticulum (membrane) with an accuracy of 0.1000, placed in the endoplasmic reticulum (lumen) with an accuracy of 0.1000, or Placed in the lysosome (lumen) with a certainty of 0.1000. Signal P predicts a possible cleavage site for the NOV5a peptide between amino acid positions 18 and 19 (ie, the dash of the sequence ACG-QP).
[0178]
[Table 5B]

The NOV5a amino acid sequence is identical in 93 (46%) of 201 amino acid residues to the 342 amino acid residue ptnr: TREMBLNEW-ACC: AAG32641 protein (PROSTASIN) protein from Rattus norvegicus (rat) and 201 125 (62%) of the amino acid residues are similar (E = 1.2e ^-45 )
NOV5a is expressed in at least the following tissues: endometrial cancer tissue. This information was obtained by determining the tissue source of the sequences included in the present invention, including but not limited to, SeqCalling source, public EST source, literature source and / or RACE source. .
[0179]
The possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV5a are listed in Table 5.
[0180]
[Table 5C]

(NOV5b)
The disclosed NOV5b nucleic acid (shown as CuraGen CG56142-02) encodes a novel prosstatin-like protein and includes the 1020 nucleotide sequence shown in Table 5D (SEQ ID NO: 25). An open reading frame for the mature protein was identified that begins with an ATG codon at nucleotides 91-93 and ends with a TAA codon at nucleotides 931-933. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. The putative untranslated region is underlined and is found upstream of the start codon and downstream of the stop codon.
[0181]
[Table 5D]

The nucleic acid sequence of NOV5b mapped to chromosome 16 is 863 compared to the gmo: GENBANK-ID: HSA306593 | acc: AJ306593.1 mRNA (Homo sapiens mRNA for marapsin (MPN gene) from Homo sapiens. Of the bases, 561 bases (65%) are identical (E = 4.8e). ^-47 ).
[0182]
The NOV5b polypeptide (SEQ ID NO: 26) is 280 amino acid residues long and is shown in Table 5E using the one letter amino acid code. Signal P, Psort and / or hydropathy predict that NOV5b has a signal peptide and may be localized to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.8200. In alternative embodiments, the NOV5b polypeptide is placed in the plasma membrane with a 0.1900 accuracy, placed in the endoplasmic reticulum (lumen) with a 0.1000 accuracy, or 0. It is placed outside the cell with a certainty of 1000. Signal P predicts a potential cleavage site for the NOV5b peptide between amino acid positions 22 and 23 (ie, the dash of the sequence TQG-RK).
[0183]
[Table 5E]

The NOV5b amino acid sequence is identical to 132 of 276 amino acid residues (47%) and 276 to the 342 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: Q9ES87 protein (PROSTATIN) from Rattus norvegicus (rat). Of the amino acid residues, 172 (62%) are similar (E = 6.9e) ^-67 ).
[0184]
NOV5a and NOV5b are very closely homologous, as shown in the amino acid alignment of Table 5F.
[0185]
[Table 5F]

Homology to any of the above NOV5 proteins is shared by other NOV5 proteins to the extent that they are homologous to each other as shown above. Any reference to NOV5 is assumed to generally refer to both NOV5 proteins, unless otherwise indicated.
[0186]
NOV5a also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 5G.
[0187]
[Table 5G]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 5H.
[0188]
[Table 5H]

The protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV5 protein and NOV5 nucleic acid disclosed herein may have important structural and / or physiological functions characteristic of this family. Suggest. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and potential therapeutic applications, and as research tools. These serve specific or selective nucleic acid or protein diagnostic and / or prognostic markers (where the presence or amount of this nucleic acid or protein is assessed) and potential therapeutic applications such as: (Ii) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug antibodies / cytotoxic antibodies), (iv) gene therapy (gene delivery / gene excision) Nucleic acids useful in) and (v) agents that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, and (vi) biological protection measures.
[0189]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications associated with the various diseases and disorders described below and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention have efficacy for the treatment of patients suffering from: cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (A -V) Duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, aortic stenosis, cancer, trauma, regeneration (in vivo and in vitro), viral infection / bacterial infection / parasite infection, cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension Congenital heart failure, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, aortic subvalvular stenosis, ventricular septal defect (VSD) , Valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, aneurysm, fibromuscular dysplasia, stroke, anemia, bleeding disorder, adrenal white matter dystrophy, congenital adrenal hyperplasia, diabetes, von Hippel- Lindau (VHL) disease Group, pancreatitis, hyperparathyroidism, hypoparathyroidism, SIDS, endometriosis, fertility, dry mouth, hypercalcemia, ulcer, cirrhosis, inflammatory bowel disease, diverticular disease, Hirschspr Nong disease, Crohn's disease, appendicitis, hemophilia, hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune disease, allergy, immune deficiency, graft-versus-host disease, telangiectasia ataxia, blood Hemophilia, lymphedema, tonsillitis, osteoporosis, arthritis, ankylosing spondylitis, scoliosis, tendonitis, muscular dystrophy, Lesch-Nyhan syndrome, myasthenia gravis, dental disease and infection, Alzheimer's disease, tuberous sclerosis, Parkinson's disease , Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Lesch-Nyhan syndrome, multiple sclerosis, telangiectasia ataxia, leukodystrophy, behavioral disorder (behav) oral disorder, addiction, anxiety, pain, neuroprotection, growth and reproductive disorders, secretion failure, systemic lupus erythematosus, asthma, emphysema, ARDS, pharyngitis, hearing impairment , Tinnitus, psoriasis, actinic keratosis, tuberous sclerosis, pressure ulcer, hair growth, allopecia, pigmentation disorder, cystitis, incontinence, renal artery stenosis, interstitial nephritis, glomerulonephritis, multiple Cystic kidney disease, systemic lupus erythematosus, tubular acidosis, IgA nephropathy, vesicoureteral reflux, glaucoma, blindness, and hypothyroid ventricular septal defect (VSD), valve disorder, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity Transplants and other diseases, disorders and conditions.
[0190]
The novel nucleic acids encoding the prostasin-like proteins of the invention, or fragments thereof, are useful for diagnostic applications, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful for the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophilicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV5 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV5 epitope is approximately amino acid 30 to amino acid 35. In another embodiment, a contemplated NOV5 epitope is approximately amino acid 40 to amino acid 45. In other specific embodiments, the contemplated NOV5 epitope is approximately amino acid 70 to amino acid 80, approximately amino acid 95 to amino acid 105, approximately amino acid 110 to amino acid 115, approximately amino acid 140 to amino acid 150, approximately amino acid 160 to amino acid 170, About amino acids 175 to 180, about amino acids 190 to 195, about amino acids 220 to 225, about amino acids 230 to 240, about amino acids 245 to 248, about amino acids 249 to 252 and about 260 to 262 is there.
[0191]
(NOV6)
NOV6 contains three novel lysosomal acid lipase-like proteins. The disclosed proteins are called NOV6a and NOV6b.
[0192]
(NOV6a)
The disclosed NOV6a nucleic acid (referred to as CuraGen accession number CG50159-01) encodes a novel lysosomal acid lipase-like protein and includes a 1267 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 27) and is shown in Table 6A. An open reading frame for the mature protein was identified that begins with an ATG codon at nucleotides 9-10 and ends with a TAA codon at nucleotides 1127-1129. The putative untranslated regions downstream from the stop codon and upstream from the start codon are underlined in Table 6A, and the start and stop codons are bolded.
[0193]
[Table 6A]

The nucleic acid sequence of NOV6a mapped to chromosome 10 is 545 bases (66%) of Ratus norvegicus-derived gb: GENBANK-ID: RNLIP | acc: X02309.1 mRNA (rat mRNA for tongue lipase). ) Are identical (E = 2.5e) ^-71 ).
[0194]
The NOV6a polypeptide (SEQ ID NO: 28) is 373 amino acid residues long and is shown in Table 6B using the one letter amino acid code. Signal P, Psort and / or hydropathy results predict that NOV6a has a signal peptide and may be localized to the lysosome (lumen) with a certainty of 0.5500. In alternative embodiments, the NOV6a polypeptide is placed extracellularly with a probability of 0.3700, placed in a microbody (peroxisome) with a probability of 0.2967, or 0.1000. Arranged in the endoplasmic reticulum (membrane) with certainty. Signal P predicts a potential cleavage site for the NOV6a peptide between amino acid positions 17 and 18 (ie, the dash of the sequence LNA-GG).
[0195]
[Table 6B]

The NOV6a amino acid sequence is identical in 152 (51%) of 297 amino acid residues to 399 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: Q16529 protein (lysosomal acid lipase precursor) derived from Homo sapiens (human). And 201 (67%) of 297 amino acid residues are similar (E = 6.2e) ⁻¹⁰⁸ ).
[0196]
The possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV6 are listed in Table 6C.
[0197]
[Table 6C]

(NOV6b)
The disclosed NOV6b nucleic acid (designated CuraGen Acc. No. CG50159-02) encodes a novel lysosomal acid lipase-like protein and includes the 1267 nucleotide sequence shown in Table 6D (SEQ ID NO: 29). The open reading frame for the mature protein was identified as starting with an ATG codon at nucleotides 8-10 and ending with a TAA codon at nucleotides 1266-1128. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. The putative untranslated region is underlined and is found upstream of the start codon and downstream of the stop codon.
[0198]
[Table 6D]

The nucleic acid sequence of NOV6b is mapped to chromosome 17 and is 545 bases (820 bases) identical to gb: GENBANK-ID: RNLIP | acc: X02309.1 mRNA (rat mRNA for tongue lipase) from Rattus norvegicus Medium; 66%) (E = 2.5e) ^-71 ).
[0199]
The NOV6b polypeptide (SEQ ID NO: 30) is 373 amino acid residues long and is represented in Table 6E using the one letter amino acid code. SignalP, Psort and / or hydropathic results speculate that NOV6b appears to localize in the lysosome (lumen) with a signal peptide with a certainty of 0.5500. In alternative embodiments, the NOV6b polypeptide is external to the cell with a certainty of 0.3700, microbodies (peroxisomes) with a certainty of 0.2967, or endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000. Located in. SignalP infers a likely cleavage site for the NOV6b peptide between amino acids 17 and 18 (ie, a dash in the sequence LNA-GG).
[0200]
[Table 6E]

The amino acid sequence of NOV6b is 152 amino acid residues (among 297 amino acid residues) identical to the 399 amino acid ptnr: SPTREMBL-ACC: Q16529 protein (lysosomal acid lipase precursor) from Homo sapiens (human); 51%) and similar 201 amino acid residues (of 297 amino acid residues; 67%) (E = 6.2e) ⁻¹⁰⁸ ).
[0201]
(NOV6c)
The disclosed NOV6c nucleic acid (referred to as CuraGen Acc. No. CG50159-04) encodes a novel lysosomal acid lipase-like protein and includes the 1195 nucleotide sequence shown in Table 6F (SEQ ID NO: 30). The open reading frame for the mature protein was identified as starting with an ATG codon at nucleotides 8-10 and ending with a TAA codon at nucleotides 1266-1128. The start and stop codons of the open reading frame are highlighted in bold. The putative untranslated region is underlined and is found upstream of the start codon and downstream of the stop codon.
[0202]
[Table 6F]

The nucleic acid sequence of NOV6c is mapped to chromosome 10 and is 557 identical to gb: GENBANK-ID: A01046 | acc: A0101046.1 mRNA (H. sapiens mRNA for human gastric lipase) from Homo sapiens. With base (in 827 bases; 67%) (E = 2.5e) ^-71 ).
[0203]
The NOV6c polypeptide (SEQ ID NO: 30) is 349 amino acid residues long and is represented in Table 6G using the one letter amino acid code. SignalP, Psort and / or hydropathy results speculate that NOV6c appears to have a signal peptide and localize in the lysosome (lumen) with a certainty of 0.8306. In alternative embodiments, the NOV6c polypeptide is external to the cell with a certainty of 0.3700, microbodies (peroxisomes) with a certainty of 0.2944, or endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000. Located in. SignalP infers a likely cleavage site for the NOV6b peptide between amino acids 17 and 18 (ie, a dash in the sequence LNA-GG).
[0204]
[Table 6G]

The amino acid sequence of NOV6c is 143 amino acid residues (among 278 amino acid residues; 51%) identical to the 395 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: Q9D798 protein (2310051B21RIK protein) from Mus musculus (mouse) and Has similar 185 amino acid residues (out of 278 amino acid residues; 66%) (E = 7.2e ^-99 ).
[0205]
NOV6c is expressed in at least the following tissues: pooled mammalian tissues. Expression information was derived from the tissue source of this sequence included in the derivatization of the NOV6c sequence.
[0206]
NOV6a, NOV6b and NOV6c are very closely similar, as shown in the amino acid alignment in Table 6H.
[0207]
[Table 6H]

Similarity to any of the above NOV6 proteins can be shared by other NOV6 proteins to the extent that they are similar to each other as indicated above. Any reference to NOV6 is considered to refer generally to both NOV6 proteins unless indicated otherwise.
[0208]
NOV6a also has homology to amino acid sequences as shown in the BLASTP data listed in Table 6I.
[0209]
[Table 6I]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 6J.
[0210]
[Table 6J]

Table 6K lists the domain descriptions from the results of the domain analysis for NOV6. This indicates that the NOV6 sequence has properties similar to the specificity of other proteins known to contain these domains.
[0211]
[Table 6K]

LIPB was assigned to chromosome 16 by somatic cell hybrid studies (Van Cong et al., 1980). Lysosomal acid lipase-A (LIPA) is an enzyme that is probably deficient in the allele Wolman disease and cholesterol ester storage disease. The different kinetic and physical properties of lipase A and lipase B were defined by Warner et al. (1980). They stated that the natural substrate for LIPS is unknown and it is not clear whether LIPB is a lysosomal hydrolase. LIPA can play an important role in cellular metabolism by releasing cholesterol. The liberated cholesterol inhibits further cholesterol synthesis and stimulates esterification of cholesterol within the cell. Lysosomal acid lipase (LIPA or LAL) (otherwise known as acid cholesteryl ester hydrolase) is encoded by a gene on chromosome 10 (LIPA).
[0212]
Two major diseases, the more severe infant-onset Wolman disease and the milder late-onset cholesteryl ester storage disease (CESD), are apparently caused by mutations in different parts of the LIPA gene. Wolman et al. (Pediatrics 28: 742-757, 1961) described three siblings in which visceral involvement is an important feature and death occurs at about 3 months of age. Xanthoma changes were observed in the liver, adrenal gland, spleen, lymph nodes, bone marrow, small intestine, lungs and thymus, and slight changes were seen in the skin, retina and central nervous system. The adrenal glands were calcified. Death was thought to be due to malabsorption of the small intestine resulting from intestinal involvement. My parents (Persian Jews) were cousins. Plasma lipids were normal or moderately elevated. Several features suggested that this entity is different from hypercholesterolemia and hyperlipidemia (see). Three cases (first from the US) were reported by Crocker et al. (Pediatrics 35: 627-640, 1965), who gave no information about ethnicity. The relatively non-specific clinical picture includes poor weight gain, vomiting, diarrhea, increasing hepatosplenomegaly with abnormal protuberance, and death from nutritional deficits up to 2-4 months of age. As in Niemann-Pick disease (257200), foam cells are found in the bone marrow and vacuolar lymphocytes are found in peripheral blood. Adrenal diffuse speckled calcification is typical. Disseminated foam cell infiltration is found in many organs. A large increase in cholesterol is found in the organ. Konno et al. (Tohoku J. Exp. Med. 90: 375-389, 1996) reported a Japanese family with three affected siblings. Spiegel-Adolf et al. (Confin. Neurol. 28: 399-406, 1966) reported three affected siblings in an American family.
[0213]
Patrick and Lake (Nature 222: 1067-1068, 1969), acidic lipase (cholesteryl ester hydrolase; EC 3.1.1.), Which clearly leads to progressive accumulation of triglycerides and cholesterol esters in lysosomes in affected tissues. 13) Demonstrated deficiency. Lough et al. (Arch. Path. 89: 103-110, 1970) described an affected infant of a Greek family in which calcium-calcified adrenal glands were demonstrated on day 5 after birth. Young and Patrick (Arch. Dis. Children. 45: 664-668, 1970) have the same biochemical and histological changes as in the acute infant form, but with a slower onset and a much less fulminant course Commented on the experience of the case. One of their cases was alive and good until age 8, indicating that there were no clinical abnormalities other than moderate hepatoma. This same enzyme is deficient in all cases. Therefore, they suggested the term “acidic lipase deficiency” for the entire group and suggested that Wolman disease be named for the acute infant form. Burton and Reed (Am. J. Hum. Genet. 33: 203-208, 1981) cross-linked antibodies against acid lipase in fibroblasts from three Wolman disease patients and three cholesterol ester storage disease patients. The reacting material was demonstrated. CRM quantification showed normal levels in both cell types. Enzyme activity was reduced about 200-fold in Wolman's disease fibroblasts and 50- to 100-fold in cholesterol ester storage disease cells. Perhaps cholesterol ester storage disease is an allelic disorder for Wolman's disease (Assmann and Fredrickson: Acid lipid definition (Wolman's disease and cholesteryl ester storage disease), Stanbury, J. Bg; Fredrickson, DS; Goldstein, JL; Brown, MS; Metabolic Basis of Inherited Disease.New York: McGraw-Hill (publisher) (5th edition) 1983.803. 819), but experiments such as cell fusion studies are known to the inventors to establish this fact. Not. Supporting the allelic nature of Wolman's disease and cholesteryl swell storage disease is the emergence of a possible genetic complex, ie, a case of intermediate severity (Schmitz and Assmann: Acid lipidase: Wolman disease and cholesteryl ester storage disease.Scriver, CR; Beaudet, AL; Sly, WS; Valle, D .: The Metabolic Basic of Induced Dishes, New York, Inc. (New York). 6th edition) 1989. 1633-1644).
[0214]
In both Wolman disease and cholesteryl swell storage disease, Chatterjee et al. (Clin. Genet. 29: 360-368, 1986) have found that renal tubular cells that have fallen into urine have cholesteryl esters and triacylglycerols. As well as the lack of LIPA in these cells. Yoshida and Kuriyama (Lab. Animal Sci. 40: 486-489, 1990) described lysosomal acid lipase deficiency in rats. Roytta et al. (Clin. Genet. 42: 1-7, 1992) reported a case of an affected 1 month old girl in the Aland Islands (the first published Scandinavian case of Wolman disease). A skin biopsy showed a cytoplasmic accumulation identical to that seen in two siblings of the Aland Islands who died at about 3 months of age during the 1950s. A pedigree analysis showed that the two families had ancestors and common ancestors from the same restricted area during the 17th century. The two affected sibling parents were born on a small island and associated "in many different ways" with each other. Schiff et al. (Am. J. Med. 44: 538-546, 1968) described cholesterol ester storage disease in the liver in teenage brothers and sisters (whose liver was orange in color). Four younger siblings showed milder changes. Parents were not known to be related. Tissue accumulation of cholesterol esters and triglycerides occurs in both this disease and Wolman disease. Chemical and enzymatic abnormalities are similar. Notable differences in phenotypic expression are not explained, but between Halar syndrome and Schier syndrome, between late infantile and adult metachromatic white atrophy, and the classical form (type A ) And the difference between visceral (B-type) Neiman-Pick disease. Each of these is probably a pair of allelic disorders.
[0215]
In contrast to Wolman's disease, cholesterol ester storage disease is relatively benign; however, in a pair of siblings, three sisters died at 7, 9 and 17 years of age due to acute liver failure. (Beaudet et al., J. Pediat. 90: 910-914, 1977). The accumulation of neutral fat and cholesterol esters in the arteries makes affected individuals susceptible to atherosclerosis. Hypercholesterolemia is common. Large hepatoma and liver fibrosis can lead to esophageal varices. Lysosomal acid lipase A, an enzyme that is deficient in both Wolman disease and this disorder, is one of three acid lipase isozymes. The role of lipase B and lipase C is unknown. Besley et al. (Clin. Genet. 26: 195-203, 1984) reported the first patient observed in Ireland. Then, at age 39 with hepatoma and Sea Blue histiospheres in the bone marrow, the patient has suffered general malaise and a period of recurrence of diarrhea since age 21. Desai et al. (Am. J. Med. Genet. 26: 689-698, 1987) have demonstrated that pre-birth of this disorder by demonstrating deficient lysosomal acid lipase activity in cultured fetal amniotic cells (amniocytes). A diagnosis was made. This finding in the 17 weeks affected fetus has been described. Large lysosomal cholesterol and lipid accumulation have been demonstrated in fetal liver cells, adrenal cells and syncytial layers. Of particular interest was the finding of extensive necrosis in the fetal adrenal gland. Adrenal necrosis may precede the calcium observed later in these patients. Cagle et al. (Am. J. Med. Genet. 24: 711-722, 1986) concluded that patients with CESD are at risk of developing pulmonary hypertension. This was noted in a 15 year old patient who died at the age of 18. Di Bisceglie et al. (Hepatology 11: 764-772, 1990) showed significant changes in serum lipoprotein levels and liver histopathology until more than 12 months after treatment with lovastatin (a cholesterol lowering agent). It was possible to prove that there was not. Yokoyama and McCoy (J. Inherit. Metab. Dis. 15: 291-292, 1992) observed some improvement with combined cholestyramine and lovastatin treatment. Koch et al. (Cytogenet. Cell Genet. 25: 174, 1979; Somat. Cell Genet. 7: 345-358, 1981) assigned lysosomal acid lipase A to chromosome 10 by a human-Chinese hamster somatic cell hybrid. . Judging from close agreement with GOT1 (138180), these loci can be close together to the 10 long arms. Lipase A is encoded by chromosome 19 in mice (Koch et al., 1981).
[0216]
Soluble glutamate oxaloacetate transaminase (138180) is also present on chromosome 10q in humans and 19 in mice. By fluorescence in situ hybridization, Anderson et al. (Genomics 15: 245-247, 1993) determined that the LIPA locus was 10q23.2-q. Mapping to 23.3. This was clearly distinct from the locus for pancreatic lipase (246600) at 10q26.1. Anderson and Sando (J. Biol. Chem. 266: 22479-22484, 1991) reported that the amino acid sequence of LAL deduced from the 2.6 kb cDNA nucleotide sequence is human gastric lipase (which is a measure of ingested triglycerides). It was reported to be 58% identical to the amino acid sequence (involved in pre-duodenal degradation). Aslanidis et al. (Genomics 20: 329-331, 1994) summarized the exon structure of the LIPA gene (which consists of 10 exons) along with the size of the genomic EcoRI and SacI fragments that hybridize to each exon. . The DNA sequence of the putative promoter region was presented. Anderson et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 2718-2722, 1994) isolated and sequenced the gene for LIPA. They found that this spread over 36 kb of genomic DNA. The 5-prime flanking region is GC rich and has the characteristics of a “housekeeping” gene promoter. Aslanidis et al. (Genomics 33: 85-93, 1996) provided evidence that a significantly more severe course of Wolman disease was caused by a genetic defect in LAL with no residual enzymatic activity. In CESD patients, a G to A transition at position -1 of the exon 8 splice donor site results in exon 8 skipping in 97% of the mRNA resulting from this allele, while 3% is correctly spliced. It became the full-length LAL enzyme.
[0217]
Pagani et al. (Hum. Molec. Genet. 5: 1611-1617, 1996) described the molecular basis of CESD in three patients. They identified mutations by sequence analysis of LAL cDNA and genomic DNA. The role of mutations as a direct cause of this disease was confirmed by measuring LAL enzyme activity in extracts from cells transfected with LAL mutants. Three CESD patients were found to be complex heterozygotes. Pagani et al. (1996) identified three different missense mutations, two splicing defects and a null allele. Du et al. (Hum. Molec. Genet. 7: 1347-1354, 1998) generated a mouse model of lysosomal acid lipase deficiency due to the null mutation generated by targeting the disruption of the mouse gene. Homozygous knockout mice produced no Lip1 mRNA, protein, or enzyme activity. This homozygous deficient mouse was born at Mendelian ratio, appeared normal at birth, and followed normal development into adults. However, large accumulations of triglycerides and cholesteryl esters occurred in several organs. By day 21, the liver appeared yellow to orange and was up to twice as large as normal. Accumulated cholesteryl esters and triglycerides were about 30 times higher than normal. Heterozygous mice had about 50% normal enzyme activity and did not show lipid accumulation. Male and female homozygous deficient mice were fertile and could be bred to produce offspring. This mouse model is a phenotypic model of human CESD and is a biochemical and histopathological mimic of human Wolman disease. Allele variant (selected example). [0001] Cholesteryl ester storage disease [LIPA, LEU179PRO].
[0218]
In a family with two children affected by CESD, Maslen and Illingworth (mJ Hum. Genet. 53 (Supplement): A926, 1993) correspond to amino acids 254-277 in an allele inherited from the father We found a complex heterozygosity for the T to C transition at position 639, resulting in a 72 bp deletion and a proline replacement for position 179 leucine in the allele inherited from the mother. [0006] Wolman disease [LIPA, TYR22TER]. In Japanese patients with Wolman disease, Fujiyama et al. (Hum. Mutat. 8: 377-380, 1996) identified a mutation of the LIPA gene from tyr22 to ter. This female patient had umbilical hernia formation at birth. About 30 days after birth, this patient exhibited abdominal bloating with hepatospleen enlargement and frequent episodes of diarrhea and vomiting. Abdominal computer tomography revealed large hepatic spleen enlargement and adrenal swelling with calcification. Anemia and liver failure progressed rapidly and the patient died on day 114. These patients were cousins. My sister died 80 days after birth with similar symptoms.
[0219]
The protein similarity information, expression pattern, cellular localization and map location for the NOV6 proteins and nucleic acids disclosed herein is important for the lysosomal acidic lipase family of NOV6 lysosomal acidic lipase-like proteins. It suggests that it may have a structural function and / or a physiological function. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include serving as a specific or selective nucleic acid or protein diagnostic marker and / or prognostic marker, where the presence or amount of the nucleic acid or protein should be assessed. These also include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug targets / cytotoxicity) Antibodies), (iv) nucleic acids useful in gene therapy (gene delivery / genetic excision), (v) agents that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, and (vi) biological defense weapons.
[0220]
The nucleic acids and proteins of the invention have application in the diagnosis and / or treatment of various diseases and disorders. For example, the compositions of the present invention are effective in the treatment of patients suffering from: severe infant-onset Wolman disease and milder late-onset cholesteryl ester storage disease (CESD), obesity, diabetes, von Hippel Lindau (VHL) syndrome, and pancreatitis, and other diseases, disorders and conditions. The novel nucleic acid or fragment thereof encoding the polydome-like protein of the present invention is useful in diagnostic applications, where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be evaluated.
[0221]
These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV6 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV6 epitope is about amino acids 40-60. In another embodiment, a contemplated NOV6 epitope is about amino acids 70-80. In other specific embodiments, contemplated NOV6 epitopes are about amino acids 90-95, 110-140, 150-152, 155-157, 240-250, 270-280, 310-315 and 320-325. .
[0222]
(NOV7)
The disclosed NOV7 nucleic acid (alternatively referred to herein as CG56140-01) encodes a novel tryptase-4-like protein and includes the 1608 nucleotide sequence shown in Table 7A (SEQ ID NO: 33). The open reading frame for the mature protein was identified as starting with an ATG codon at nucleotides 1 to 3 and ending with a TGA codon at nucleotides 1279 to 1281. In Table 7A, the putative untranslated region is underlined and the start and stop codons are in bold.
[0223]
[Table 7A]

The nucleic acid sequence of NOV7 is mapped to chromosome 16 and the present invention relates to gb: GENBANK-ID: AB031329 | acc: AB031329.1 mRNA (Homo sapiens esp-1 mRNA for a basal serine protease) from Homo sapiens , Complete cds) with the same 587 bases (in 853 bases; 68%) (E = 5.7e) ^-58 ).
[0224]
The NOV7 polypeptide (SEQ ID NO: 34) is 426 amino acid residues long and is represented in Table 7B using the one letter amino acid code. SignalP, Psort and / or hydropathy results speculate that NOV7 appears to localize in the lysosome (lumen) with a signal peptide with a certainty of 0.5500. In alternative embodiments, the NOV7 polypeptide is located outside of the cell with a certainty of 0.3700, on the plasma membrane with a certainty of 0.1900, or in the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000. To do. SignalP infers a likely cleavage site for the NOV7 peptide between amino acids 19 and 20 (ie, a dash in the sequence GLG-KP).
[0225]
[Table 7B]

The amino acid sequence of NOV7 is 105 amino acid residues (among 199 amino acid residues; 52%) identical to the 305 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: Q9JHJ7 protein (tryptase 4) from Mus musculus (mouse) Has similar 140 amino acid residues (out of 199 amino acid residues; 70%) (E = 6.5e ^-73 ).
[0226]
NOV7 is expressed in at least the following tissues: pancreas. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling source, Public EST source, Literature source and / or RACE source.
[0227]
NOV7 also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 7C.
[0228]
[Table 7C]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 7D.
[0229]
[Table 7D]

Tables 7E and 7F list domain descriptions from the results of domain analysis for NOV7. This indicates that the NOV7 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0230]
[Table 7E]

[0231]
[Table 7F]

Human tryptase is a structurally unique and mast cell-specific trypsin-like serine protease. Recent biological and immunological studies have estimated tryptase as a mediator of the pathogenesis of a number of allergic and inflammatory conditions, including rhinitis, conjunctivitis and most prominent asthma. In addition to the growing body of data, tryptase has also been estimated for certain gastrointestinal disorders, skin disorders and cardiovascular disorders. Nonetheless, the availability of potent and selective tryptase inhibitors in recent years has facilitated the identification of this protease as an important therapeutic target. Herein, we describe the design and efficacy of four classes of selective tryptase inhibitors. Of these selective proteases, the first three types are synthetic and the fourth is of natural origin: 1) peptidic inhibitors (eg APC-366), 2) two Basic inhibitors (ie pentamidine-like), 3) Zn (2+) mediated inhibitors (ie BABIM-like), and 4) heparin antagonists (eg lactoferrin). These inhibitors have been tested in the airways and skin of allergic sheep. Aerosol administration of tryptase inhibitors from each structural class 30 minutes before allergen challenge and 4 and 24 hours eliminates late phase bronchoconstriction and airway hyperreactivity in a dose response manner. Furthermore, intradermal injection of APC-366 blocks the skin response to the antigen. These studies provide an essential proof of concept for further study of tryptase inhibitors for the treatment of asthma and possibly other allergic diseases. Results from clinical studies with the first generation tryptase inhibitor APC-366, currently in phase II trials for the treatment of asthma, provide further support for the pathological role of tryptase in this disease. Axys Pharmaceuticals, Inc. Significant advancements in the area of tryptase inhibitor design at the It is mentioned that it was issued. Independently, the X-ray crystal structure of the active tryptase tetramer complexed with 4-amidinophenylpyruvic acid has been reported. These findings are expected to further accelerate the design of structurally novel tryptase inhibitors as well as the development of new drugs for the treatment of mast cell tryptase-mediated disorders.
[0232]
The protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV7 proteins and nucleic acids disclosed herein have important structural and / or physiological functions that are unique to the serine protease family. Suggest to get. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include the role of specific or selective nucleic acid or protein as a diagnostic and / or prognostic marker (where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be assessed) and, for example, Potential therapeutic applications include: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug targets / cytotoxic antibodies), (iv) in gene therapy Useful nucleic acids (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, (vi) biological defense weapons.
[0233]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications involving various diseases and disorders described below and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention are effective in the treatment of patients suffering from: diabetes, von Hippel Lindau (VHL) syndrome, pancreatitis, obesity, cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital Heart failure, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, aortic valve stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, strong Dermatosis, transplantation, fertility, endometriosis, Hirschsprung's disease, Crohn's disease, appendicitis, and other similar diseases, disorders and conditions.
[0234]
The novel nucleic acids or fragments thereof encoding the novel tryptase-4 protein of the invention are useful in diagnostic applications, where the presence or amount of the nucleic acid or protein should be assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV7 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV7 epitope is about amino acids 10-15. In another embodiment, a contemplated NOV7 epitope is about amino acids 20-25. In other specific embodiments, contemplated NOV7 epitopes are about amino acids 40-60, 70-80, 80-85, 120-160, 180-200, 220-260, 280-300, 340-360 and 420. ~ 430.
[0235]
(NOV8)
The disclosed NOV8 nucleic acid (referred to as CuraGen Acc. No. CG56134-01) encodes a novel P450-like protein and includes the 1539 nucleotide sequence shown in Table 8A (SEQ ID NO: 35). The open reading frame for the mature protein was identified as starting with an ATG codon at nucleotides 1-3 and ending with a TAA codon at nucleotides 1537-1539. The start and stop codons are in bold in Table 8A.
[0236]
[Table 8A]

The nucleic acid sequence of NOV8 is mapped to chromosome 4 and gb: GENBANK-ID: AF251548 | acc: AF2515488.1 mRNA from Tribolium castaneum (complete for CYP4Q4s (CYP4Q4) to Tribodium castaneum cytochrome P450 monooxygenase CYP4Q4s) Have the same 158 bases (of 252 bases; 62%) (E = 1.5e ⁻⁰⁶ ).
[0237]
The NOV8 polypeptide (SEQ ID NO: 36) is 512 amino acid residues long and is represented in Table 8B using the one letter amino acid code. SignalP, Psort and / or hydropathic results speculate that NOV8 appears to localize to the plasma membrane with a signal peptide with a certainty of 0.6000. In alternative embodiments, the NOV8 polypeptide is located in the Golgi apparatus with a probability of 0.4000, in the inner mitochondrial cavity with a certainty of 0.3131, or in the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.3000. To do. SignalP infers a likely cleavage site for the NOV8 peptide between amino acid positions 39 and 40 (ie, a dash in the sequence VAS-YA).
[0238]
[Table 8B]

The amino acid sequence of NOV8 is 57 identical to ptnr: SWISSSNEW-ACC: Q9VA27 protein (cytochrome P450 4C3 (EC 1.14 .-.-) (CYPIVC3)) of 535 amino acid residues derived from Drosophila melanogaster (Drosophila). Has amino acid residues (in 131 amino acid residues; 43%) and similar 77 amino acid residues (in 131 amino acid residues; 58%) (E = 1.6e ^-40 ).
[0239]
NOV8 is expressed in at least the following tissues: liver, lung. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling source, Public EST source, Literature source and / or RACE source.
[0240]
NOV8 also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 8C.
[0241]
[Table 8C]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 8D.
[0242]
[Table 8D]

The P450 gene superfamily is a biologically diverse class of oxidase enzymes; members of this class are found in all organisms. P450 proteins are clinically and toxicologically important in humans; they are the main enzymes in the metabolism of drugs and xenobiotic compounds and in the synthesis of cholesterol, steroids and other lipids. Induction of some P450 genes may also be a risk factor for some types of cancer. This diverse function is reflected in the diversity of nucleotide and protein sequences; currently over 100 human P450 forms have been described. Many allelic forms of cytochrome P450 genes have been identified to cause quantitatively different rates of drug metabolism and are therefore important when considering the development of safe and effective human pharmaceutical therapeutics . [E. Tanaka, J Clinical Pharmacy & Therapeutics 24: 323-329, 1999].
[0243]
The protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV8 proteins and nucleic acids disclosed herein may have important structural and / or physiological functions that are unique to the P450 family. I suggest that. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include the role of specific or selective nucleic acid or protein as a diagnostic and / or prognostic marker (where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be assessed) and, for example, Potential therapeutic applications include: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug targets / cytotoxic antibodies), (iv) in gene therapy Useful nucleic acids (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, and (vi) biological defense weapons.
[0244]
The novel nucleic acids or fragments thereof encoding the P450-like proteins of the present invention are useful in diagnostic applications, where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV8 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV8 epitope is about amino acids 20-25. In another embodiment, a contemplated NOV8 epitope is about amino acids 80-85. In other specific embodiments, contemplated NOV8 epitopes are about amino acids 110-115, 140-145, 202-205, 220-320, 330-335, 380-405, 420-425 and 490-500. .
[0245]
(NOV9)
The disclosed NOV9 nucleic acid (referred to as CuraGen Acc. No. CG56207-01) encodes a novel mitsugumin 29-like protein and includes the 813 nucleotide sequence shown in Table 9A (SEQ ID NO: 37). The open reading frame for the mature protein was identified as starting at nucleotide 1 and ending with the TAA codon at nucleotides 805-807. The putative untranslated region downstream of the stop codon is underlined in Table 9A, and the stop codon is bold.
[0246]
[Table 9A]

The nucleic acid sequence of NOV9 is mapped to chromosome 3 and is identical to the gb: GENBANK-ID: AB004816 | acc: AB004816.1 mRNA from Oryctolagus cuniculus (Oryctolagus cuniculus mRNA for mitsugmin 29, complete cds) 606 With base (in 676 bases; 89%) (E = 2.0e) ^-116 ).
[0247]
The NOV9 polypeptide (SEQ ID NO: 37) is 268 amino acid residues long and is represented in Table 9B using the one letter amino acid code. SignalP, Psort and / or hydropathic results infer that NOV9 appears to localize to the plasma membrane with a signal peptide with a certainty of 0.6000. In an alternative embodiment, the NOV9 polypeptide is Golgi with 0.4000 certainty, endoplasmic reticulum (membrane) with 0.3000 certainty, or microbody (peroxisome) with 0.3000 certainty. To position. SignalP infers a possible cleavage site for the NOV9 peptide between amino acids 50 and 51 (ie, a dash in the sequence SCG-SY).
[0248]
[Table 9B]

The amino acid sequence of NOV9 is 223 amino acid residues (among 268 amino acid residues; 83%) identical to the 264 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: O62646 protein (Mitsugmine 29) from Oryctolagus cuniculus (rabbit) and Has similar 235 amino acid residues (of 268 amino acid residues; 87%) (E = 7.9e) ⁻¹¹⁵ ).
[0249]
NOV9 is expressed in at least the following tissues: brain, skeletal muscle, heart. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling source, Public EST source, Literature source and / or RACE source.
[0250]
The possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV9 are listed in Table 9C.
[0251]
[Table 9C]

NOV9 also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 9D.
[0252]
[Table 9D]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 9E.
[0253]
[Table 9E]

Synaptophysin and synaptoporin are related glycoproteins; they are the main integral membrane proteins of a particular class of small neurosecretory vesicles, but they are also found in various non-endocrine cells Can also be found [1,2]. This polypeptide chain penetrates the membrane four times and probably acts as an ion or solvent channel.
[0254]
Recently, mitsugmine 29, unique to the triple junction in skeletal muscle, has been identified as a new member of the synaptophysin family; members of this family are members of four transmembrane segments and are found in intracellular vesicles Distributed. Mouse mitogmine 29 cDNA and genomic DNA containing this gene have been isolated and analyzed. Mitsugmin 29 has been mapped to mouse chromosome 3 F3-H2, which is closely related to the synaptophysin gene in the exon-intron configuration, indicating that they are closely related in molecular evolution. RNA blot hybridization and immunoblot analysis revealed that mitsugmin 29 was abundantly expressed in skeletal muscle and expressed at lower levels in the kidney. Immunofluorescence microscopy demonstrated that mitogmine 29 was specifically present in the cytoplasmic region of the proximal and distal tubular cells of the kidney. The results obtained may suggest that mitsugmine 29 is involved in the formation of specialized vesicular systems in skeletal muscle and renal tubule cells.
[0255]
In skeletal muscle, excitation-contraction (EC) coupling converts the invaginated surface membrane (ie, transverse (T-type) tubule) polarization signal into Ca 2+ release from the sarcoplasmic reticulum (SR). I need. Signal transduction occurs in a linking complex between the T-shaped tubule and the SR (referred to as a triple junction). This conjugated complex contains two components essential for EC coupling (ie, a dihydropyridine receptor as a T-shaped capillary voltage sensor and a ryanodine receptor as an SR Ca 2+ release channel). However, the functional expression of these two receptors does not appear to constitute a signal transduction system or a junction between the surface membrane and the intracellular membrane in cultured cells, which means that there are several unknowns. It was suggested that the molecule is involved in both mechanisms. Furthermore, the molecular basis for the formation of triplet connections is unknown as a whole. Therefore, it is important to examine the components localized at this triplet connection. Therefore, the present inventors report the primary structure of mitsugmin 29, a novel transmembrane protein derived from the triple junction in skeletal muscle, using monoclonal antibodies and cDNA cloning. This protein is homologous in amino acid sequence with members of the synaptophysin family and shares characteristic structural properties. Intracellular distribution and protein structure suggest that mitsugmin 29 is involved in communication between the T-shaped tubules and the SR membrane at the junction.
[0256]
The physiological role of members of the synaptophysin family, which has four transmembrane segments and is basically distributed in the intracellular membrane (including synaptic vesicles), has not yet been established. Recently, mitsugmine 29 (MG29) has been identified as a novel member of the synaptophysin family derived from skeletal muscle. MG29 is expressed in the junction membrane complex (called triplet junction) between the cell surface transverse (T-type) tubules and sarcolemma (SR), where the depolarization signal is expressed by Ca from SR. Converted to (2+) release. In this study, we examined the biological function of MG29 by creating knockout mice. MG29-deficient mice showed normal health and reproduction but had a slight weight loss. Triplet membrane ultrastructural abnormalities (ie, expanded T-tubules, irregular SR structures and partial mis- formation of triplet junctions) were detected in skeletal muscle from mutant mice. In the mutant muscles, apparently normal sustained myotonic tension was observed, while twitch tension was slightly reduced. Furthermore, mutant muscles showed a faster decrease in twitch tension under conditions where Ca (2+) was not present. Mutant muscle morphological and functional abnormalities appear to be related to each other and MG29 is essential for both subtle aspects of membrane structure and effective excitatory-constrictive coupling at the skeletal muscle triad junction It shows that. Our results further indicate the role of MG29 as a member of the synaptophysin family in the correct formation of a junction complex between the cell surface and the inner membrane.
[0257]
The protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV9 proteins and nucleic acids disclosed herein have important structural and / or physiological functions that are unique to the mitsugmine 29 family. Suggest to get. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include specific or selective nucleic acid or protein roles as diagnostic and / or prognostic markers, where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be assessed, and for example the potential of Therapeutic applications include: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug targets / cytotoxic antibodies), (iv) useful in gene therapy Nucleic acid (gene delivery / gene excision) and (v) a composition that promotes tissue regeneration in vitro and in vivo, (vi) a biological defense weapon.
[0258]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications involving various diseases and disorders described below and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention are effective in the treatment of patients suffering from: Viscott-Aldrich syndrome, Oldrich syndrome, eczema-thrombocytopenia-immunodeficiency syndrome, thrombocytopenia, night blindness , Amyotrophic lateral sclerosis, Batten's disease, ceroid lipolindrosis, Rett syndrome, Pick's disease (leaf atrophy), cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septum Defect (ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, lower aortic stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, von Hippellindau (VHL) syndrome, Alzheimer's disease, stroke, tuberous sclerosis, hypercalcemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Lesch-Neuhan syndrome , Multiple sclerosis, ataxia telangiectasia, white matter atrophy, behavioral disorders, addiction, anxiety, pain, neuroprotection, as well as other similar diseases, disorders and conditions. The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications involving the following various diseases and disorders, and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention have efficacy in the treatment of patients suffering from: diabetes, von Hippel Lindau (VHL) syndrome, pancreatitis, obesity, cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital Heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, aortic valve stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, nodular stiffness, Scleroderma, transplantation, fertility, endometriosis, Hirschsprung's disease, Crohn's disease, appendicitis, and other similar diseases, disorders and conditions.
[0259]
The novel nucleic acids encoding the mitogmine 29 protein of the present invention, or fragments thereof, are useful in diagnostic applications, where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV9 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV9 epitope is about amino acids 20-25. In another embodiment, a contemplated NOV9 epitope is about amino acids 30-35. In other specific embodiments, contemplated NOV9 epitopes are about amino acids 60-65, 75-105, 145-155, 170-175, 180-185, and 240-260.
[0260]
(NOV10)
The disclosed NOV10 nucleic acid (referred to as CuraGen Acc. No. CG56127-01) encodes a novel micromolar calcium-activated neutral protease 1-like protein and the 2542 nucleotides shown in Table 10A Of the sequence (SEQ ID NO: 39). The open reading frame for the mature protein was identified as starting at the ATG codon at nucleotides 260-262 and ending at the TAA codon at nucleotides 2318-2320. In Table 10A, the putative untranslated region downstream of the stop codon and the putative untranslated region upstream of the start codon are underlined, and the start and stop codons are in bold.
[0261]
[Table 10A]

The nucleic acid sequence of NOV10 is mapped to chromosome 2 and gb: GENBANK-ID: AF221129 | acc: AF221129.1 mRNA from Bos taurus (Bos taurus micromolar calcium-dependent neutral protease large subunit ( CAPN1) has the same 574 bases (out of 909 bases; 63%) to mRNA, complete cds) (E = 1.4e ^-31 ).
[0262]
The NOV10 polypeptide (SEQ ID NO: 39) is 686 amino acid residues long and is represented in Table 10B using the one letter amino acid code. SignalP, Psort and / or hydropathic results speculate that NOV10 appears to localize to microbodies (peroxisomes) with a certainty of 0.7480. In an alternative embodiment, the NOV10 polypeptide is at the plasma membrane with a certainty of 0.7000, into the endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 0.2000, or into the inner mitochondrial membrane with a certainty of 0.1000. To position.
[0263]
[Table 10B]

The amino acid sequence of NOV10 is a 703 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: Q64698 protein derived from Rattus norvegicus (rat) (calpain, large (catalyst) subunit (EC 3.4.22.1.7) (calcium activity) 194 amino acid residues (out of 503 amino acid residues; 38%) and similar 258 amino acids to (Neutral Neutral Proteinase) (CANP) (gastric specific calcium-activated neutral protease large subunit) (NCL2)) With residues (in 503 amino acid residues; 51%) (E = 7.2e) ^-80 ).
[0264]
NOV10 is expressed in at least the following tissues: pancreas, colon, skin, lung, breast, uterus, placenta, lymph, leukocyte export, eye and bone marrow. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling source, Public EST source, Literature source and / or RACE source.
[0265]
NOV10 also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 10C.
[0266]
[Table 10C]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 10D.
[0267]
[Table 10D]

Tables 10E and 10F list the domain descriptions from the results of the domain analysis for NOV10. This indicates that the NOV10 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0268]
[Table 10E]

[0269]
[Table 10F]

The deduced sequences described herein belong to the calpain protease family. Calpain (ie, a calcium-activated neutral protease) is a non-lysosomal intracellular cysteine protease (Richard et al.). Calpain is an intracellular protease that is involved in many important cellular functions regulated by calcium. Mammalian calpains include two ubiquitous proteins, CAPN1 and CAPN2, as well as two gastric specific proteins, and CAPN3, which is muscle specific. These ubiquitous enzymes consist of heterodimers with distinct large subunits associated with a common small subunit, all of which are encoded by different genes. The association of tissue-specific large subunits with small subunits has not been demonstrated. The large subunit of calpain can be subdivided into four domains; domains I and III (these functions remain unknown) do not show homology to known proteins. However, the former can be important in regulating proteolytic activity. Domain II shows similarities to other cysteine proteases, which share histidine, cysteine and asparagine residues in their active sites. Domain IV contains four EF-hand structures that are potential calcium binding sites. In addition, three unique regions with no known homology (ie, NS, IS1 and IS2 (the latter containing the nuclear translocation signal)) are present in muscle-specific CAPN proteins. These regions may be important for muscle-specific functions of CAPN3 (Richard et al.).
[0270]
It has previously been shown that a deficiency in the human calpain 3 gene is responsible for the extremity band muscular dystrophy type 2A (LGMD2A), an inherited disease that primarily affects proximal limb muscles. To better understand the function of calpain 3 and the pathophysiological mechanism of LGMD2A, and also to develop a model suitable for therapeutic studies, we generated capn3-deficient mice by gene targeting did. capn3-deficient mice are fully fertile and viable. Allelic transmission in crossbred offspring demonstrated a statistically significant departure from Mendel's law. Capn3-deficient mice show mild progressive muscular dystrophy that affects a specific group of muscles. The age of appearance of myopathic features varies with genetic background, suggesting the involvement of modifier genes. Affected muscle represents an apoptosis-related variation in the IκBα / nuclear factor κB pathway as seen in LGMD2A patients. In addition, Evans blue staining of muscle fibers reveals that pathological processes resulting from calpain 3 deficiency are associated with membrane changes (Richard et al.).
[0271]
Recently, it was suggested that calpain is involved in the progression of α-fodrin proteolysis and tissue destruction in the development of Sjogren's syndrome (SS) (Hayashi et al.). SS is an autoimmune disease characterized by diffuse lymphocyte infiltration in the salivary and lacrimal glands, resulting in dry mouth and dry eyes due to insufficient secretion. It has been postulated that a combination of immunological, genetic and environmental factors may play an important role in the development of autoimmune injury in salivary and lacrimal glands, but little is known about the pathogenesis of SS disease in humans. It is not done. Although the 120 kDa α-fodrin is an important autoantigen in the development of SS in both animal models and SS patients, the mechanism of α-hodrin cleavage leading to tissue destruction in SS remains unclear. Tissue-infiltrating CD4 + T cells purified from the salivary gland of a mouse model for SS carry a large proportion of Fas ligand and the salivary gland ducts carry the apoptotic receptor Fas. Anti-Fas antibody-induced apoptotic salivary gland cells result in specific α-fodrin cleavage into a 120 kDa fragment in vitro. Preincubation with a combination of calpain and a caspase inhibitor peptide may be responsible for the inhibition of 120 kDa α-fodrin cleavage. Thus, increases in apoptotic protease activity, including calpain and caspases, may be involved in the progression of α-fodrin proteolysis and tissue destruction in the development of SS (Hayashi et al.).
[0272]
The novel sequences described herein are expected to have useful properties and functions similar to calpain protease. This is because there is a calpain-type cysteine protease (C2 family) domain and there is homology to calpain III.
[0273]
The protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV10 proteins and nucleic acids disclosed herein have important structural and / or physiological functions that are unique to the cysteine protease family. Suggest to get. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include specific or selective nucleic acid or protein roles as diagnostic and / or prognostic markers, where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be assessed, and, for example, Potential therapeutic applications include: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies, drug targets / cytotoxic antibodies), (iv) in gene therapy Useful nucleic acids (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, (vi) biological defense weapons.
[0274]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications involving various diseases and disorders described below and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention are effective in the treatment of patients suffering from: diabetes, von Hippel Lindau (VHL) syndrome, pancreatitis, obesity, hypercalcemia, ulcers, endometriosis, fertilization Ability, hemophilia, hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune disease, allergy, immunodeficiency, transplantation, graft-versus-host disease, psoriasis, actinic keratosis, tuberous sclerosis, pressure ulcer, hair Growth / loss, allopecia, pigmentation disorders, endocrine disorders, hemophilia, lymphedema, and other similar diseases, disorders and conditions.
[0275]
The novel nucleic acid or fragment thereof encoding the micromolar calcium-activated neutral protease-1 protein of the present invention is useful in diagnostic applications, where the presence or amount of this nucleic acid or protein should be evaluated . These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be made according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV10 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, a contemplated NOV10 epitope is about amino acids 5-90. In another embodiment, a contemplated NOV10 epitope is about amino acids 105-110. In other specific embodiments, the contemplated NOV10 epitope is about amino acids 170-180, 230-310, 370-400, 420-430, 450-455, 460-465, 480-485, 510-515, 570. ~ 580 and 680-690.
[0276]
(NOV11)
The disclosed NOV11 nucleic acid (referred to as CuraGen Acc. No. CG56179-01) encodes a novel P2X2C-like protein and includes the 1422 nucleotide sequence shown in Table 11A (SEQ ID NO: 41). The open reading frame was identified as starting at the ATG start codon at nucleotides 1-3 and ending at the TGA codon at nucleotides 1420-1422. In Table 11A, the start and stop codons are in bold.
[0277]
[Table 11A]

The nucleic acid sequence of NOV11 is mapped to chromosome 1 and is identical to the gb: GENBANK-ID: AF190824 | acc: AF190824.1 mRNA (Homo sapiens P2X2C receptor (P2X2) mRNA, complete cds) from Homo sapiens 990 bases (out of 991 bases; 99%) (E = 3.6e) ^-295 ).
[0278]
The NOV11 polypeptide (SEQ ID NO: 42) is 473 amino acid residues long and is represented in Table 11B using the one letter amino acid code. SignalP, Psort and / or hydropathy results speculate that NOV11 appears to have a signal peptide and localize to the inner mitochondrial membrane with a certainty of 0.6577. In alternative embodiments, the NOV11 polypeptide is located in the plasma membrane with 0.6500 certainty, in the microbody (peroxisome) with 0.3556 certainty, or in the Golgi with 0.3000 certainty. . SignalP infers a likely cleavage site for the NOV11 peptide between amino acid positions 68 and 69 (ie, a dash in the sequence SYQ-ES).
[0279]
[Table 11B]

The amino acid sequence of NOV11 is a 447 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: Q9UHD6 protein (P2X2C receptor) from Homo sapiens (human) and 330 amino acid residues (among 330 amino acid residues; 100%) Has similar 330 amino acid residues (out of 330 amino acid residues; 100%) (E = 8.7e ^-248 ).
[0280]
NOV11 is expressed in at least the following tissues: adrenal gland, bone marrow, brain-tonsillar, brain-cerebellum; brain-hippocampus, brain-substantia nigra, brain-thalamus, brain-whole, fetal brain, fetal kidney, fetal liver, Fetal lung, heart, kidney, lymphoma-Raji, breast, pancreas, pituitary, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, bone marrow, spleen, stomach, testis, thyroid, trachea, uterus. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling source, Public EST source, Literature source and / or RACE source.
[0281]
Possible small nucleotide polymorphisms (SNPs) found for NOV11 are listed in Table 11C and Table 11D.
[0282]
[Table 11C]

[0283]
[Table 11D]

NOV11 also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 11E.
[0284]
[Table 11E]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 11F.
[0285]
[Table 11F]

Table 11G lists the domain descriptions from the results of the domain analysis for NOV11. This indicates that the NOV11 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0286]
[Table 11G]

The P2X receptor is a membrane ion channel that is gated by extracellular adenosine 5′-triphosphate (ATP); nucleotides also activate a family of seven transmembrane G protein-coupled receptors (P2Y). P2X receptors are widely expressed on mammalian cells and they can be widely differentiated into three groups. The first group is almost equally well activated by ATP and its analog αβ methylene ATP (αβmeATP), while the second group is not activated by αβmeATP. The third group of receptors (named P2Z) is distinguished by the fact that the channel opening continues after cell permeabilization and cell lysis if the agonist application lasts longer than a few seconds. Seven cDNAs encoding P2X receptor subunits have been cloned. When expressed separately in a heterologous system, P2X1 and P2X3 subunits form channels activated by ATP or αβmeATP; whereas P2X2, P2X4 and P2X5 form channels activated by ATP However, it is not formed by αβmeATP. The P2X6 receptor does not express rapidly and the P2X7 receptor corresponds closely in their properties to P2Z. If the two subunits are co-expressed, an additional phenotype can be produced, indicating heteromultimerization. Smooth muscles and nerves separated in electrophysiological experiments showed three different phenotypes of the P2X receptor: (1) rapid desensitization (most typical smooth muscle β-methylene ATP sensitive response); 2) non-desensitization (alpha, beta methylene ATP insensitive response characteristic of PC12 pheochromocytoma cells and rat dominant cervical ganglion neurons); and (3) non-desensitization (observed in sensory neurons). α, β methylene ATP sensitive response).
[0287]
All these purine receptors are of similar cationic and high Ca2 + permeability and by suramin, Cibacron blue, oxidized ATP, pyridoxal-5-phosphate and pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2 ', 4'-disulfonic acid Share sensitivity to blockade. The heterologous expression of the two forms of the cloned P2X receptor (from rat vas deferens and PC12 cells) indicates that the cloned receptors of each other can reconstitute the native response with significant fidelity. These results suggest that homo-oligomeric channels can be formed from a single subunit of the P2X receptor in smooth muscle, PC12 cells and some neurons. A third phenotype observed in native cells can arise from co-assembly of cloned receptor subunits. However, co-expression studies indicate that these two forms of P2X receptor do not heteromultimerize. Thus, the α, β methylene ATP sensitive response observed in non-desensitized, sensory neurons results in different P2X receptors or heteromultimerization of more than one different P2X purine receptor.
[0288]
There are seven P2X receptor cDNAs currently known. Six homomers (P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X7) and three heteromers (P2X2 / P2X3, P2X4 / P2X6, P2X1 / P2X5) P2X receptor channels were characterized in a heterologous expression system. Homomeric P2X1 and P2X3 receptors are easily facilitated by their rapid desensitization, agonistic action of αβ methylene ATP and blocking by 2 ′, 3′-O- (2,4,6-trinitrophenyl) -ATP It can be distinguished. P2X2 receptors are unique among the homomeric forms in their synergy due to low pH. The homomeric P2X4 receptor is slightly sensitive to antagonism by ceramine and pyridoxal 5-phosphate-6-azo-2 ', 4'-disulfonic acid. The homomeric P2X7 receptor is the only form in which 2 ', 3'-O- (4-benzoylbenzoyl) -ATP is more potent than ATP. Heteromeric P2X2 / P2X3 receptors are common with P2X2 in slow desensitization dynamics and synergism due to low pH, and competitiveness by αβ methylene ATP, and 2 ′, 3′-O- (2,4,6-tri Similar to P2X3 for blocking by nitrophenyl) -ATP. Seven subtypes of the P2X receptor family of ligand control ion channels (responsive to ATP) have been identified and form homomultimeric or heteromultimeric pores. P2X3 receptors are predominantly selectively expressed on small dimeric nociceptive sensory neurons in dorsal roots, trigeminal ganglia and inferior ganglia (especially non-peptidergic subpopulations labeled with lectin IB4). The P2X2 / 3 labeling is also present in the inner membrane II of the spinal cord and sensory nerve protrusions to the skin and viscera, but a few receptors are present in skeletal muscle. P2X3 receptors are down-regulated after peripheral nerve injury, and their expression can be regulated by glial cell-induced neurotrophic factors. Sensory nerve P2X receptor activation has been shown in in vivo pain models (including preparation of rat hind paws and knee joints) and inflammatory models. P2X4 and / or P2X6 receptors in the CNS also appear to be associated with pain pathways. Non-nociceptive P2 receptors on sensory nerves (which initiate reflex effects on vagal afferent and efferent nerve fibers) are present in the muscle and at the sensory organ ends of the heart and lungs.
[0289]
Protein similarity information, expression patterns, and map positions for the NOV11 protein and NOV11 nucleic acid disclosed herein indicate that NOV11 has important structural and / or physiological functions characteristic of the ATP P2X receptor family. I suggest that you have. Thus, the nucleic acids and proteins of the present invention are useful as potential diagnostic and therapeutic applications and research tools. These include those that serve as specific or selective nucleic acid diagnostic markers and / or nucleic acid prognostic markers or protein diagnostic markers and / or protein prognostic markers, wherein the nucleic acid or the presence of the protein, or the nucleic acid Alternatively, the amount of the protein is evaluated and potential therapeutic applications include: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies, diagnostic antibodies) , Drug-targeted antibodies / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / genetic excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo (vi) biological Defense weapon.
[0290]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful for potential diagnostic and therapeutic applications related to various diseases and disorders and / or other pathologies described below. For example, since P2X receptor activation of sensory nerves has been shown in in vivo pain models (including preparation of rat hind paws and knee joints) and inflammatory models, the compositions of the present invention are It may have an effect on the treatment of affected patients. P2X4 and / or P2X6 receptors in the CNS also appear to be associated with pain pathways. Non-nociceptive P2 receptors on sensory nerves, which initiate reflex effects on vagal afferent and efferent nerve fibers, are present in the muscle and in the sensory organ ends of the heart and lungs (Br J Anaesth 2000 Apr; 84 (4): 476-88). The compositions of the present invention also have efficacy for the treatment of patients suffering from: diabetes, obesity, syndrome X and other diseases, disorders and conditions.
[0291]
Novel nucleic acids or fragments thereof encoding a P2X2C-like protein of the invention can be useful in diagnostic applications, where the presence or amount of nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV11 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, contemplated NOV11 epitopes are from about 5 to about 10 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV11 epitope is from about 20 to about 25 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV11 epitopes are from about 40 to about 50, from about 70 to about 80, from about 95 to about 105, from about 140 to about 148, from about 195 to about 215, from about 250 to about 300, about 340 to about 360, about 370 to about 380, about 410 to about 430, and about 455 to about 465.
[0292]
(NOV12)
The disclosed NOV12 nucleic acid (named CureGen accession number CG56132-01) encodes a novel DIABLO-like protein and contains the 1823 nucleotides (SEQ ID NO: 43) shown in Table 12A. An open reading frame is identified, which begins with an ATG start codon at nucleotides 31-33 and ends with a TGA codon at nucleotides 1606-1608. The putative untranslated region upstream from the start codon and the putative untranslated region downstream from the stop codon are underlined in Table 12A, and the start and stop codons are in bold.
[0293]
[Table 12A]

The nucleic acid sequence of NOV12 of the present invention is 909 bases (99%) identical to homapapiens (Homo sapiens cDNA FLJ20081 fis, clone COL03242) derived from gb: GENBANK-ID: AK000088 | acc: AK000000881 mRNA. (E = 9.3e) ⁻¹⁹⁸ ).
[0294]
The NOV12 polypeptide (SEQ ID NO: 43) is 525 amino acid residues and is represented in Table 12B using the single letter code. Signal P, Psort and / or Hydropathy results predict that NOV12 is localized to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.8500. In an alternative embodiment, the NOV12 polypeptide is also present in the plasma membrane with 0.4400 certainty, into microbodies (peroxisomes) with 0.3084 certainty, or into the inner mitochondrial membrane with 0.1000 certainty. Localized.
[0295]
[Table 12B]

The amino acid sequence of NOV12 is 225 amino acid residues (43%) identical in 521 amino acid residues to ptnr: SPTREMBL-ACC: Q9NGX7 protein (DOMAIN) of 623 amino acid residues from Drosophila melanogaster (Fruit fly), and Has similarity of 324 amino acid residues (62%) out of 521 amino acid residues (E = 2.0e ⁻¹⁰⁹ ).
[0296]
NOV12 in the present invention is expressed in at least the following tissues: foreskin, hypothalamus, kidney, prostate, retina, tonsil, breast, whole organism. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention, including (but not limited to) SeqCalling sources, public EST sources, literature sources and / or RACE sources.
[0297]
NOV12 also has homology with the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 12C.
[0298]
[Table 12C]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 12D.
[0299]
[Table 12D]

Tables 12E, 12F and 12G list the domain details from the DOMAIN analysis results for NOV12. This indicates that the NOV12 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0300]
[Table 12E]

[0301]
[Table 12F]

[0302]
[Table 12G]

Apoptosis or programmed cell death is an essential process in metazoan development and homeostasis performed by caspases. DIABLO protein (an IAP binding protein with a low pI directly) performs a critical function in apoptosis by eliminating the inhibitory effect of IAP (an inhibitor of apoptotic proteins) on caspases (1). This protein is also known as Smac, a secondary mitochondrial activating activator of caspases. DIABLO / Smac is usually a mitochondrial protein, but is released into the cytosol when cells undergo apoptosis. Mitochondrial import and cleavage of its signal peptide is required for DIABLO / Smac to increase apoptotic activity. Furthermore, overexpression of DIABLO / Smac is shown to increase cell sensitivity to apoptotic stimulants (2).
[0303]
The proteins described in the present invention are homologous to the DIABLO / Smac protein and are therefore expected to play a role in apoptosis. This includes the BTB / POZ domain as well as 5 copies of the kelch motif. The BTB / POZ domain has been shown to mediate homomer dimerization and in some cases heteromer dimerization (3). Kölch is a 50 residue motif, named after the Drosophila mutant that was first identified (4). The known functions of kerchis-containing proteins are diverse. The genes described in the present invention map to chromosome 14 and expression patterns based on this contribute to many human diseases such as cancer, inflammatory / autoimmune diseases, metabolic diseases and CNS disorders. Can do. Furthermore, since the novel DIABLO-like protein probably functions to regulate apoptosis, this gene may be useful as a diagnostic or prognostic tool and in gene therapy.
[0304]
The protein similarity information, expression patterns, and map positions for the NOV12 protein and NOV12 nucleic acid disclosed herein are important for NOV12 to have important structural and / or physiological functions characteristic of the DIABLO family. Suggest to get. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include those that serve as specific or selective nucleic acid diagnostic markers and / or nucleic acid prognostic markers or protein diagnostic markers and / or protein prognostic markers, wherein the nucleic acid or the presence of the protein, or the nucleic acid Alternatively, the amount of the protein is evaluated and these include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic antibodies) , Diagnostic antibodies, drug target antibodies / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / genetic excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo (vi) Biological defense weapon.
[0305]
The nucleic acids and proteins of the present invention are useful for potential diagnostic and therapeutic applications related to various diseases and disorders and / or other pathologies described below. For example, the compositions of the invention have efficacy for the treatment of patients suffering from: cancer, trauma, bacterial and viral infections, regeneration (in vivo and in vitro), fertility, diabetes, autoimmune diseases, Renal artery stenosis, interstitial nephritis, glomerulonephritis, polycystic kidney disease, systemic lupus erythematosus, tubular acidosis, IgA nephropathy, hypercalcemia, Lesch-Nyhan syndrome, von Hippel-Lindau (VHL) Syndrome, tuberous sclerosis, endocrine disorder, Alzheimer's disease, stroke, hypercalcemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, ataxia, white matter atrophy, behavioral disorder, addiction, anxiety Pain, neuroprotection, and other diseases, disorders and conditions.
[0306]
The novel nucleic acids or fragments thereof encoding the DIABLO-like proteins of the present invention may be useful in diagnostic applications, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV12 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, contemplated NOV12 epitopes are from about 5 to about 7 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV12 epitope is about 10 to about 15 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV12 epitopes are from about 80 to about 90, about 130 to about 135, about 140 to about 145, about 170 to about 180, about 190 to about 192, about 198 to about 198 205, about 220 to about 270, about 295 to about 320, about 340 to about 370, about 400 to about 415, about 420 to about 470, and about 490 to about 500.
[0307]
(NOV13)
The disclosed NOV13 nucleic acid (named CureGen accession number CG56195-01) encodes a novel HRPET-1-related protein-like protein and contains the 1970 nucleotides (SEQ ID NO: 45) shown in Table 13A.
[0308]
[Table 13A]

The nucleic acid sequence of NOV13 maps to chromosome 22 and is derived from Homo sapiens (Homo sapiens cDNA FLJ13130 fis, clone NT2RP30000292, a weak similarity to HaloCythia roretzi mRNA of HrPET-1) gb: GENBANK31-A : AK023192.1 has 891 (72%) identity in 1228 bases to mRNA (E = 0.0).
[0309]
The NOV13 polypeptide (SEQ ID NO: 46) is 508 amino acid residues and is represented in Table 13B using the single letter code. Signal P, Psort and / or Hydropathy results predict that NOV13 is probably localized to the plasma membrane with a certainty of 0.7000. In another embodiment, NOV13 is localized to the nucleus, possibly with a probability of 0.3000, to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.2000, or to the inner mitochondrial membrane with a certainty of 0.1000. The
[0310]
[Table 13B]

The amino acid sequence of NOV13 is 438 amino acid residues identical to ptnr: SPTREMBL-ACC: O76053 protein of 438 amino acid residues derived from Homo sapiens (human) (WUGSC: H_DJ130H16.2PROTEIN). And similarity of 438 amino acid residues (100%) out of 438 amino acid residues. (E = 4.3e ^-242 )
NOV13 is expressed in at least the following tissues: bone marrow, brain, bronchi, dermis, epidermis, heart, kidney, liver, lung, lymph node, lymphoid tissue, breast. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling sources, public EST sources, literature sources and / or RACE sources. In addition, the closely related Homo sapiens cDNA FLJ13130 fis, clone NT2RP30000292 (weak similarity to the HalP. Homolog of HalP. Due to the expression pattern of .1), this sequence is predicted to be expressed in the following tissues: testis, ovary, colon, parathyroid, thyroid, bone, spleen, stomach, neck, adrenal gland, Head-neck.
[0311]
NOV13 also has homology with the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 13C.
[0312]
[Table 13C]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 13D.
[0313]
[Table 13D]

Tables 13E and 13F list the domain details from the DOMAIN analysis results for NOV13. This indicates that the NOV13 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0314]
[Table 13E]

[0315]
[Table 13F]

NOV13 is a C.I. It is highly conserved across species among elegans, Drosophila, mice and humans. This is expected to be related to the membrane. The high degree of conservation in the main sequence is currently unknown but indicates that it has important biological functions. HRPET-1-related proteins also show homology with plant adhesion molecules, suggesting that HRPET-1-related proteins are probably cell adhesion molecules for cell interactions and cell migration.
[0316]
Protein similarity information, expression patterns, and map positions for the NOV13 protein and NOV13 nucleic acid disclosed herein indicate that NOV13 has important structural and / or physiological functions characteristic of the cell adhesion molecule family. I suggest that you have. Thus, the nucleic acids and proteins of the present invention are useful as potential diagnostic and therapeutic applications and research tools. These include those that serve as specific or selective nucleic acid diagnostic markers and / or nucleic acid prognostic markers or protein diagnostic markers and / or protein prognostic markers, wherein the nucleic acid or the presence of the protein, or the nucleic acid Alternatively, the amount of the protein is evaluated, and these include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapy) Antibodies, diagnostic antibodies, drug target antibodies / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo (vi ) Biological defense weapons.
[0317]
The nucleic acids and proteins of the present invention are useful for potential diagnostic and therapeutic applications related to various diseases and disorders and / or other pathologies described below. For example, the compositions of the present invention have efficacy for the treatment of patients suffering from: cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart disease, aortic stenosis, atrial septal defect ( ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, lower aortic stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity , Transplantation, diabetes, von Hippel-Lindau (VHL) syndrome, pancreatitis, fertility, endometriosis, xerostomia, cirrhosis, hemophilia, hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, self Immune disease, allergy, immune deficiency, graft-versus-host disease, lymphedema, hemophilia, hypercoagulability, Alzheimer's disease, stroke, hypercalcemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebral palsy, epilepsy, resch -Naihan syndrome, Multiple sclerosis, ataxia, white matter atrophy, behavioral disorder, addiction, anxiety, pain, neuroprotection, systemic lupus erythematosus, asthma, emphysema, scleroderma, ARDS, psoriasis, actinic keratosis, pressure ulcer, Hair growth / deficiency, allopecia, pigmentation disorder, endocrine disorder, renal artery stenosis, interstitial nephritis, glomerulonephritis, polycystic kidney disease, systemic lupus erythematosus, tubular acidosis, IgA nephropathy, Lesch-Nyhan syndrome As well as other diseases, disorders and conditions.
[0318]
The novel nucleic acids or fragments thereof encoding the HRPET-1-related proteins of the present invention may be useful in diagnostic applications, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV13 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, contemplated NOV13 epitopes are from about 2 to about 70 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV13 epitope is from about 90 to about 120 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV13 epitopes are from about 125 to about 200, from about 210 to about 215, from about 220 to about 230, from about 310 to about 320, from about 380 to about 390, from about 390 to about 398, about 410 to about 425, and about 480 to about 500.
[0319]
(NOV14)
The disclosed NOV14 nucleic acid (named CureGen accession number CG55790-02) encoding a B7-H2-like protein contains 8270 nucleotides (SEQ ID NO: 47) and is shown in Table 14A. An open reading frame is identified, starting at nucleotides 24-26 with an ATG start codon and ending with nucleotides 1443-1445 at a TAG codon. The putative untranslated region downstream from the stop codon is underlined in Table 14A, and the start and stop codons are in bold.
[0320]
[Table 14A]

The nucleic acid sequence of NOV14 maps to chromosome 21 and is derived from Homo sapiens (Homo sapiens genomic DNA, chromosome 21q, position 97/105) gb: GENBANK-ID: AP001753 | acc: AP001753.1 607 bases for mRNA Medium with 480 bases (79%) identity (E = 1.5e ^-117 ).
[0321]
The NOV14 polypeptide (SEQ ID NO: 48) is 473 amino acid residues and is represented in Table 14B using the single letter code. Signal P, Psort and / or Hydropathy results predict that NOV14 contains a signal peptide and is probably localized to the plasma membrane with a probability of 0.4600. In another embodiment, NOV14 is in the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000, in the endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 0.1000, or outside the cell with a certainty of 0.1000. Localized. The most likely cleavage site for the NOV14 peptide is between amino acids 18 and 19 (LRA-DT).
[0322]
[Table 14B]

The amino acid sequence of NOV14 is derived from Homo sapiens (human) (TRANSMEMBRANE PROTEIN B7-H2 ICOS LIGAND). 302 amino acid residues of ptnr: TREMBLNEW-ACC: 300 amino acid residues in 300 amino acid residues (100%) of AAG01176 protein And a similarity of 300 amino acid residues (100%) out of 300 amino acid residues. (E = 7.3e ^-160 )
NOV14 is expressed in at least the following tissues: bone marrow, brain, thalamus, fat, tonsil, bone, heart, kidney, lymphoid tissue, mammary gland / chest, ovary, pancreas, peripheral blood, prostate, thalamus, tonsil, bladder , Uterus, vulva, whole organism, drooping, bronchial, cartilage, heart, kidney, lung, lymph node, placenta, right cerebellum, skeletal muscle, testis, thymus. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling sources, public EST sources, literature sources and / or RACE sources.
[0323]
A small number of possible nucleotide polymorphisms (SNPs) found NOV14re listed in Table 14C.
[0324]
[Table 14C]

NOV14 is also homologous to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 14D.
[0325]
[Table 14D]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 14E.
[0326]
[Table 14E]

Table 14F lists the domain details from the DOMAIN analysis results for NOV14. This indicates that the NOV14 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0327]
[Table 14F]

Co-stimulatory interactions between B7 family ligands and their receptors play a critical role in T cell proliferation, differentiation and death. Binding of T cell costimulator CD28 by a specific antibody or any of its natural ligands B7-1 and B7-2 is CD4 ⁺ Increase antigen-specific proliferation of T cells, enhance cytokine production, CD8 ⁺ Induces effector T cell mutations and promotes T cell survival. However, signal transduction through activated CT cells through the homologous CTLA-4 receptor of B7-1 and B7-2 is negative that inhibits T cell proliferation, interleukin (IL) -2 production and cell cycle progression. It is thought that it delivers a good signal. B7-1 and B7-2 share only about 20% homology in their amino acids, but they have similar tertiary structure and costimulatory function.
[0328]
Current studies indicate that other members of the B7-CD28 family may also be involved in the regulation of cellular and humoral immune responses. One of the new members is the inducible costimulator (ICOS), a CD28-like receptor. The F44 monoclonal antibody (mAb) against human ICOS co-stimulates T cell proliferation and includes several cytokines (IL-10, interferon-, and IL-4, but in the presence of an optimal dose of anti-CD3 antibody Increases secretion of IL-2). Another new B7 family member is mouse B7h / B7RP-1. B7h / B7RP-1 does not bind to CD28 and CTLA-4 and can costimulate T cell proliferation in the presence of antigenic signals. Surface expression of B7h / B7RP-1 was upregulated by tumor necrosis factor in 3T3 fibroblasts, and an increase in B7h / B7RP-1 messenger RNA (mRNA) was also exposed to lipopolysaccharide (LPS) It was shown to be observed in non-lymphoid tissues. Yoshinaga and researchers have shown that B7h / B7RP-1 is a ligand for mouse CRP-1, a mouse homologue of human ICOS. Expression of B7RP-1 fusion protein in transgenic mice leads to treatment of mice with B7h / B7RP-1 fusion protein that enhances hyperplasia and oxazolone-induced contact hypersensitivity in several lymphoid organs.
[0329]
A new member of the human B7 family (B7-H1) shares about 20% identical amino acid sequence with B7-1 and B7-2 in IgV-like and IgC-like extracellular domains, but B7 in the cytoplasmic domain. -1 and B7-2 are much different. Because the amino acid identity between B7-H1 and mouse B7h / B7RP-1 is less than 30%, B7-H1 is unlikely to be a human homologue of mouse B7h / B7RP-1. Furthermore, B7-H1 does not bind to CD28, CTLA-4 and ICOS. Surface expression of B7-H1 is the majority of activated CD14 ⁺ It can be detected in a fraction of macrophages and activated T cells. B7-H1 co-stimulates T cell responses in the presence of optimal doses of anti-CD3 mAb, enhances allogeneic mixed lymphocyte responses, and preferentially induces IL-10 secretion from T cells. Molecular search sharing homology with the IgV and IgC domains of B7-1, B7-2 and B7-H1 in the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) followed by subsequent cloning And by sequencing, a new B7-like gene named B7-H2 (B7 homolog 2) was identified. In addition to the overall structure similar to B7-1, B7-2 and B7-H1, B7-H2 binds to ICOS and costimulates human T cell proliferation and cytokine production. Cell surface expression of B7-H2 protein is detected in monocyte-derived immature dendritic cells. Soluble B7-H2 and immunoglobulin (Ig) fusion protein (B7-H2Ig) binds to activated T cells rather than activated resting T cells, and binding is inducible costimulator Ig (ICOSIg but not CTLA4Ig) ). In addition, ovary cells of the ICOSIg strain Chinese hamster were transfected with the B7-H2 gene. Due to suboptimal CD3 cross-linking, co-stimulation of T cell proliferation by B7-H2Ig is dose dependent and is associated with secretion of interleukin (IL-2), but optimal CD3 ligation is IL-10. Stimulate production preferentially. This result indicates that B7-H2 is a putative ligand for ICOS T cell molecules (Blood. 2000; 96: 2808-2813). PMID: 11023515, UI: 20477846.
[0330]
T cell specific cell surface receptors CD28 (OMIM # 186760) and CTLA4 (OMIM # 123890) are important regulators of the immune system. CD28 potently enhances these T cell functions essential for an effective antigen-specific immune response, and CTLA4 balances CD28-mediated signals. Thus, preventing other deadly overstimulation of the lymphocyte system. By generating monoclonal antibodies against activated human T cells, Hutloff et al. (1999) identified another member of this family of molecules, represented by the symbol “inducible costimulator” ICOS. ICOS specific monoclonal antibodies did not react with resting human peripheral blood T cells, but stained CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes activated by stimulation of the T cell antigen receptor complex. Immunoprecipitation defined the ICOS antigen as a disulfide bond dimer with an apparent relative molecular weight of 55-60 kD. Protein purification by SDS-PAGE showed that ICOS is expressed on the cell surface as a homodimeric protein with two chains that differ only in their post-translational modifications. A 2,641 base pair full length ICOS cDNA was cloned from a MOLT-4V T lymphoblast cDNA library. Northern analysis showed a single ICOS mRNA species approximately 2.8 kb long in activated human T cells. The open reading frame of ICOS mRNA encodes a protein of 199 amino acids. This ICOS amino acid shares 24% and 17% homology with CD28 and CTLA4, respectively. The predicted mature ICOS consists of a single immunoglobulin V-like domain (stabilized by conserved cysteine residues at positions 42 and 109); a transmembrane region of approximately 23 amino acids; and a cytoplasmic tail of 35 amino acids It is a type I transmembrane molecule. This shows close structural similarities to CD28 and CTLA4. A cysteine residue located at position 141 of CD28 (also found in CTLA4) is probably involved in disulfide bond formation between homodimeric chains of these proteins and is also found at position 136 of ICOS. ICOS corresponds to CD28 in efficacy and enhances all basic T cell responses to foreign antigens (ie, proliferation and secretion of lymphokines, upregulation of molecules that mediate cell-cell interactions and by B cells) Effective support for antibody secretion). Unlike essentially expressed CD28, ICOS is newly induced on the surface of T cells and does not upregulate the production of interleukin-2 (IL2; OMIM # 147680), but interleukin-10 (IL10; Further induces the synthesis of OMIM # 124092) (B cell differentiation factor). In vivo, ICOS is highly expressed on tonsil T cells, which are closely related to B cells in the light zone at the tip of the germinal center (the terminal site of B cell mutations).
[0331]
Dong et al. (2001) generated Icos-deficient mice and determined that the absence of Icos did not impair T cell development. However, T cell activation and IL2 production in the proliferative phase are impaired. Differentiated Icos − / − cells can produce IFNG (OMIM # 147570), but neither IL4 (OMIM # 147780) nor IL2. In vivo immunization also showed a defect in IL2 and IL4 production and a decrease in serum IgG1 and IgE. Using an allergy model, Dong et al. (2001) found that Icos is not required for Th2 cell differentiation but regulates IL4 and IL13 (OMIM # 147683) production. Using an experimental autoimmune encephalitis (EAE) model for multiple sclerosis, the authors have developed other genetic backgrounds in which developed Icos − / − mice are associated with EAE resistance compared to wild-type mice. It was found that the disease was enhanced more strongly even when compared to. Spherical erythrocytes from knockout and wild type mice produced undetectable levels of IL4 and similar levels of IL10 and IFNG; however, cells from Icos − / − mice did not produce IL13. On the other hand, wild type mice produced large amounts of IL13. Dong et al. (2001) concluded that ICOS may have an important negative regulator role through the induction of IL13 in protection against inflammatory diseases.
[0332]
McAdam et al. (2001) found that Icos-deficient mice had similar basal levels of IgM, slightly increased IgG3, and decreased IgG1, IgG2a and IgE compared to wild type mice. Immunized knockout mice and wild type mice (except for the presence of highly inflammatory complete Freund's adjuvant) also have similar levels of IgM-specific antibodies but reduce IgG1-specific and IgG2a-specific antibodies, and Reduced germinal center formation. Class switching from IgM to IgG is restored in Icos − / − mice by stimulation of CD40 (OMIM # 109535).
[0333]
Tafuri (2001) shows that decreased T cell proliferation in cells from Icos-deficient mice is markedly reduced in the expression of CD40LG (OMIM # 308230), CD25 (IL2RA; OMIM # 147730), and CD69 (OMIM # 107273) Found related to. B cell activation and T cell independent antibody responses were not impaired in Icos knockout mice. In contrast, the findings of McAdam et al. (2001), Tafuri et al. (2001) found that only basal levels of IgG1 were significantly reduced in Icos − / − mice; however, they were serum IgG1 and IgG2a Agreed that levels were reduced and IgE levels were not detectable after immunization. ELISA assay showed that this class switching disorder was associated with IL4 production but not IFNG production. Immunohistochemical analysis showed that germinal center formation was also reduced in Icos knockout mice since germinal center formation is present in Cd401g or Cd28 deficient mice.
[0334]
The protein similarity information, expression patterns, and map positions for the NOV14 protein and NOV14 nucleic acid disclosed herein indicate that NOV14 has important structural and / or physiological functions characteristic of the B7 immunoglobulin family. I suggest that you have. Thus, the nucleic acids and proteins of the present invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications, and as research tools. These include those that serve as specific or selective nucleic acid diagnostic markers and / or nucleic acid prognostic markers or protein diagnostic markers and / or protein prognostic markers, wherein the nucleic acid or the presence of the protein, or the nucleic acid Alternatively, the amount of the protein is evaluated and these include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapies) Antibodies, diagnostic antibodies, drug target antibodies / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo (vi ) Biological defense weapons.
[0335]
The nucleic acids and proteins of the present invention are useful for potential diagnostic and therapeutic applications related to various diseases and disorders and / or other pathologies described below. For example, the compositions of the invention have efficacy for the treatment of patients suffering from: brain disorders including epilepsy, eating disorders, schizophrenia, ADD, and cancer; heart disease; Crohn's disease, IBD Inflammatory and autoimmune disorders including allergies, rheumatoid and osteoarthritis, inflammatory skin disorders, allergies, blood disorders; psoriasis colon cancer, leukemia AIDS; thalamus disorders; metabolic disorders including diabetes and obesity; asthma Lung diseases such as emphysema, cystic fibrosis and cancer; pancreatic disorders including pancreatic dysfunction and cancer; prostate disorders including prostate cancer and other diseases, disorders and conditions. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances for use in therapeutic or diagnostic methods.
[0336]
The B7-H2B-like nucleic acids and B7-H2B-like proteins or fragments thereof of the present invention are useful in diagnostic applications, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV14 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, contemplated NOV14 epitopes are from about 20 to about 25 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV14 epitope is from about 48 to about 49 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV10 epitopes include from about 50 to about 52, from about 58 to about 75, from about 100 to about 120, from about 150 to about 190, from about 240 to about 260, from about 290 to about 350, about 370 to about 420, and about 440 to about 450.
[0337]
(NOV15)
The disclosed NOV15 nucleic acid (named CuraGen accession number CG56252-01) encoding a novel galactosyltransferase-like protein contains 1302 nucleotides (SEQ ID NO: 49) and is shown in Table 15A. An open reading frame is identified, which begins with a ATG start codon at nucleotides 1-3 and ends with a TAG codon at nucleotides 1276-1278. The putative untranslated region downstream from the stop codon is underlined in Table 15A, and the start and stop codons are bold.
[0338]
[Table 15A]

The nucleic acid sequence of NOV15 maps to chromosome 16 and is derived from Homo sapiens (Homo sapiens transmembrane tryptase mRNA, complete cds) gb: GENBANK-ID: AF175522 | acc: AF1755522.1 421 bases out of 639 bases (65%) identity (E = 1.9e) ⁻³³ ).
[0339]
The NOV15 polypeptide (SEQ ID NO: 50) is 425 amino acid residues and is represented in Table 15B using the single letter code. Signal P, Psort and / or Hydropathy results predict that NOV15 contains a signal peptide and is probably localized to the plasma membrane with a certainty of 0.7900. In another embodiment, NOV15 is localized to the microbody (peroxime) with a certainty of 0.6400, to the Golgi with a certainty of 0.3000, or to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.2000. It becomes. The most likely cleavage site for the NOV15 polypeptide is between amino acid 55 and amino acid 56 (DGA-AP).
[0340]
[Table 15B]

The amino acid sequence of NOV15 is identical to the 342 amino acid residue ptnr: TREMBLNEW-ACC: AAG32641 protein from Rattus norvegicus (rat) (PROSTASIN) with the identity of 93 amino acid residues out of 201 amino acid residues (46%), and 201 Similarity of 125 amino acid residues (62%) among amino acid residues (E = 9.6e) ^-55 ).
[0341]
NOV15 is expressed in at least the following tissues: large cell carcinoma, adult brain, tonsils, aorta, appendix, artery, bone marrow, brain, cartilage, cerebellum, neck, epidermis, kidney, lung, lymph node, lymphoid tissue Ovary, oviduct / uterine tube / fallopian tube, pituitary gland, prostate, skin, small intestine, spinal cord, spleen, synovium / synovial membrane, testis, thalamus, Thymus, thyroid, vulva, whole organism, bone marrow. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention, including (but not limited to) SeqCalling sources, public EST sources, literature sources and / or RACE sources. In addition, this sequence is closely related to the Homo sapiens mRNA of the type 10 transmembrane protein, complete cds, clone: Homo sapiens species HP10328 homolog (GENBANK-ID: gb: GENBANK-ID: AB0155630.1 | acc: AB015630.1 ) Is predicted to be expressed in the following tissues due to the expression pattern: epidermoid carcinoma.
[0342]
NOV15 is also homologous to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 15C.
[0343]
[Table 15C]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 15D.
[0344]
[Table 15D]

Table 15E lists the domain details from the DOMAIN analysis results for NOV15. This indicates that the NOV15 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0345]
[Table 15F]

The enzyme galactosyltransferase (EC 2.4.1.38) catalyzes a reaction involving UDP galactose and N-acetylglucosamine to produce galactose β-1,4-N-acetylglucosamine. Enzymes that provide UDP-galactose for galactosyltransferase (galactose-1-phosphate uridyltransferase) map to the same band. The galactosyltransferase enzyme can also form a gain dimer with the control protein α-lactalbumin to form lactose synthetase (EC 2.4.1.22). In addition to a biosynthetic role, a galactosyltransferase may be a component of the plasma membrane if it can function in intracellular recognition and / or adhesion. Masri et al. (1988) show that galactosyltransferase (referred to as β-1,4-galactosyltransferase) is mainly located in the trans-tank of the Golgi complex and exists in both membrane-bound and soluble forms. Reported.
[0346]
Appart et al. (1986) cloned galactosyltransferase cDNA by screening a human liver cDNA library with a probe based on the sequence of the purified protein. The partial cDNA did not contain a putative N-terminal membrane binding region. By screening a human placenta cDNA library using a partial galactosyltransferase cDNA isolated by Appart et al. (1986), Masri et al. (1988) cloned full length β-1,4-galactosyltransferase cDNA. This encodes a predicted 400 amino acid protein with an N-terminal membrane attachment domain. The soluble form of the enzyme appears to be due to proteolytic cleavage of the membrane-bound form of arginine 77. Mengle-Gaw et al. (1991) reported that the galactosyltransferase gene (called GalTase) consists of 6 exons with spans greater than 50 kb. By Northern blot analysis, GalTase was expressed as a 4.2 kb mRNA in all cell lines tested; there is a high degree of variability in expression levels among the cell lines. Appart et al. (1986) mapped the galactosyltransferase gene to chromosome 9. Shaper et al. (1986) localized the structural gene for galactosyltransferase at 9p13 by in situ hybridization using a cloned bovine cDNA probe. Based on dosing effects, Furukawa et al. (1986) found that various galactosyltransferase genes can be located on mouse chromosome 17; trisomy 17 embryos have approximately 1.5-fold higher enzyme activity than diploid embryos. I suggested that. Furukawa et al. (1986) suggested an association between these galactosyltransferases and major histocompatibility complexes. Lo et al. (1998) analyzed six membranes of the B4GALT galactosyltransferase family. Northern blot analysis showed that for these homologs, only B4GALT1 is expressed in the lactating mammary gland of mice. They stated that B4GALT1 null mice cannot produce lactose. Thus, B4GALT1 appears to be a gene that has been recruited for lactose biosynthesis during mammalian development.
[0347]
The protein similarity information, expression patterns, and map positions for the NOV15 proteins and NOV15 nucleic acids disclosed herein indicate that NOV15 has important structural and / or physiological functions characteristic of the galactosyltransferase family. Suggest that you can. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications and as research tools. These include those that serve as specific or selective nucleic acid diagnostic markers and / or nucleic acid prognostic markers or protein diagnostic markers and / or protein prognostic markers, wherein the nucleic acid or the presence of the protein, or the nucleic acid Alternatively, the amount of the protein is evaluated, and these include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapy) Antibodies, diagnostic antibodies, drug target antibodies / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo (vi ) Biological defense weapons.
[0348]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful for potential diagnostic and therapeutic applications related to various diseases and disorders and / or other pathologies described below. For example, the compositions of the present invention have efficacy for the treatment of patients suffering from: proteodermatan sulfate, PDS deficient biosynthesis, dermatan sulfate proteoglycan xylosylprotein 4-β-galactosyltransferase deficient Synthesis, xgpt deficient galactosyltransferase I deficiency, Erlerus-Dunlo syndrome, cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart disease, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular tube (A- V) deficiency, arterial duct, pulmonary valve stenosis, aortic valve stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, endometriosis, fertility Von Hippel-Lindau (VHL) syndrome, Alzheimer's disease, stroke, tuberous sclerosis, hypercalcemia, Parkinson's disease, Tontington's disease, cerebral palsy, epilepsy, Lesch-Nyhan syndrome, multiple sclerosis, telangiectasia ataxia, white matter atrophy, behavioral disorders, addiction, anxiety, pain, neuroprotection, and other diseases and disorders And status etc.
[0349]
Novel nucleic acids or fragments thereof encoding the galactosyltransferase-like proteins of the present invention may be useful in diagnostic applications, where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV10 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, contemplated NOV15 epitopes are from about 30 to about 45 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV15 epitope is from about 60 to about 65 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV15 epitopes are from about 80 to about 110, from about 140 to about 145, from about 155 to about 165, from about 170 to about 175, from about 180 to about 183, from about 190 to about 192 and about 210 to about 260.
[0350]
(NOV16)
The disclosed NOV16 nucleic acid (designated CuraGen accession number CG56303-01) encoding a novel lymphocyte antigen precursor-like protein contains 447 nucleotides (SEQ ID NO: 51) and is shown in Table 16A. The open reading frame was identified as starting at the ATG start codon at nucleotides 31-33 and ending at the TGA codon at nucleotides 418-420. The putative untranslated region downstream from the stop codon is underlined in Table 13A, and the start and stop codons are bold.
[0351]
[Table 16A]

The nucleic acid sequence of NOV16 maps to chromosome 8 and is 383 bases out of 440 bases (87%) against gb: GENBANK-ID: A58084 | acc: A58084 mRNA from Homo sapiens (sequence 1 from patent WO9636358) Have identity (E = 3.6e ^-67 ).
[0352]
The NOV16 polypeptide (SEQ ID NO: 51) is 129 amino acid residues and is represented in Table 16B using the single letter code. Signal P, Psort and / or Hydropathy results predict that NOV16 contains a signal peptide and is probably localized to the plasma membrane with a certainty of 0.9190. In another embodiment, NOV16 is lysosome (membrane) with a probability of 0.2000, endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000, or endoplasmic reticulum (lumen) with a certainty of 0.1000. To be localized. The most likely cleavage site for NOV16 is between amino acid 20 and amino acid 21 (AQA-LD).
[0353]
[Table 16B]

The amino acid sequence of NOV16 has a ptnr: SWISSSNEW-ACC: Q14210 protein of 100 amino acid residues (77) from 128 amino acid residues derived from Homo sapiens (human) (LYMPHOCYTE ANTIGEN LY-6D PRECURSOR (E48 ANTIGEN)). %) Identity and 108 amino acid residues (83%) of 129 amino acid residues (E = 5.1e). ^-48 )
NOV16 is predicted to be expressed in at least the following tissues: human thoracic adenocarcinoma.
[0354]
Possible minor nucleotide polymorphisms (SNPs) found NOV16 listed in Table 16C.
[0355]
[Table 16C]

NOV16 is also homologous to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 16D.
[0356]
[Table 16D]

The homology of these sequences is illustrated in the ClustalW analysis shown in Table 16E.
[0357]
[Table 16E]

Table 16F lists the domain details from the DOMAIN analysis results for NOV16. This indicates that the NOV16 sequence has properties similar to those of other proteins known to contain these domains.
[0358]
[Table 16F]

Ly-6A. 2 molecules and Ly-6E. One molecule is contradictory and identical to MALA-1. By Western blot of lymphocyte surface proteins solubilized and electrophoretically separated in octyl glucoside, Ly-6A. 2 antigen or Ly-6E. A band that co-migrated with one antigen was detected. On cells or in immunoassays, these are Ly-6A. 2 or Ly-6E. Allogeneic antibodies against 1 were blocked. The tissue distribution of MALA-1 is also Ly-6A. 2 or Ly-6E. 1 correlated. These antigens showed the same size on octyl glucoside or sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, Ly-6A. 2 and Ly-6E. 1 is most likely to produce an alternative allele. Electrophoretic analysis was performed using Ly-6A. 2, Ly-6B. 2, Ly-6D. 2 and Ly-27.2. Ly-6C. 2 and Ly-28.2 appear to be similar in size and charge, and Ly-6A. 2 was the same size, but differed in charge and internal chain disulfide constraints. Ly-6D. 2 and Ly-27.2 are Ly-6A. Since it can represent the same or different epitopes on two molecules, the previously hypothesized five Ly-6-like antigens considered separable based on tissue distribution are due to the electrophoretic mobility of gels containing octyl glycosides. It may represent no more than 3 distinct proteins that can be assigned to one of two different categories.
[0359]
Competitive binding studies and immunoprecipitation experiments have been performed with at least five encoded by Ly-6-binding genes (Ly-6A.2, Ly-6B.2, Ly-6C.2, Ly-6D.2 and ThB). Define different epitopes. Ly-6C of the 33 kd protein. 2 and Ly-6D. 2 are closely overlapping epitopes that can be distinguished by their unique thymic response higher than 10% -20% or 90%, respectively. Similarly, Ly-6C. The two antigens are Ly-6B. Weakly overlap with 2 antigens. However, Ly-6C. 2 antigen and Ly-6B. The two antigens are Ly-6A. 2 and Ly-6D. Different from 2. ThB is a 16-18 kd antigen that is not associated with any other “Ly-6” antigen on the cell surface. Furthermore, Ly-6C. Independently induced antibodies made in FIG. 2 and Ly-6B. Since the antigen for 2 is detected, the same epitope is detected. These results imply the presence of a single antigenic site for each of these molecules.
[0360]
Despite the differences in the antigens they recognize and the effector functions they perform, B and T lymphocytes use signal transduction components that are remarkably similar to initiate a response. Both of these use oligomeric receptors that contain different recognition and signal transduction subunits. Antigen receptors on both cells, which have probably evolved from common evolved precursors, are at least two different PTKs in the cell tails of these invariant chains via a common sequence motif (ARAM). Interact with the family. Co-receptors appear to act to increase the sensitivity of both of these receptor systems through events that affect ligand binding and signal transduction. An important role of tyrosine phosphorylation of downstream signaling components (eg, phospholipase C) is the net result of changes in the balance of action of antigen receptor-regulated PTKs and PTPases. The identification of downstream effectors (including calcineurin and Ras) that control cellular responses such as lymphokine gene expression hopes that in the future lymphocytes can bind a complex pathway from the plasma membrane to the nucleus. Insights gained from downstream studies of TCR-stimulated and BCR-stimulated signaling pathways are likely to contribute significantly to the future understanding of the mechanisms responsible for the differentiation and differentiation of autologous lymphocytes from foreign bodies in developing and mature cells.
[0361]
The E48 antigen (a putative human homologue of the 20 kD protein is present in bovine nasal speculum desmosome preparations and was previously called desmoglein III (dg4)) is an antibody to human squamous cell carcinoma antibodies It is a promising target antigen for therapeutic treatment. In order to predict the effects of high antibody dose treatment and to assess the possible biological involvement of the antigen in carcinogenesis, the inventors attempted molecular characterization of the antigen. A cDNA clone encoding the E48 antigen was isolated by expression cloning in COS cells. Sequence analysis showed that the clone contained a 128 amino acid open reading frame and encoded a 13,286 kD core protein. Database searches showed that the E48 antigen has a high level of sequence similarity with the mouse ThB antigen (a member of the Ly-6 antigen family). Phosphophatidylinositol-specific (PI-specific) phospholipase-C treatment showed that the E48 antigen was glycosyl phosphophatidylinositol binding (GPI binding) to the plasma membrane. The gene encoding the E48 antigen is a single copy gene and is localized in the 8q24-qter region of human chromosome 8. Gene expression is restricted to keratinocytes and squamous cell tumor cells. A putative mouse homolog (ThB antigen) originally identified as an antigen on lymphocyte lineage cells was shown to be highly expressed in the epithelium of squamous mouse. Furthermore, ThB expression levels are present in keratinocytes, in contrast to lymphocytes, which are not related to mouse strains. Transfection of mouse SV40 polyoma transformed mouse NIH / 3T3 cells with E48 cDNA, where the antigen was confirmed to be involved in cell-cell adhesion.
[0362]
The Thb locus is responsible for the expression of a 15 kDa phosphophatidylinositol binding molecule (ThB) in mouse thymocytes and B cells. Expression of Thb as detected by mAb is polymorphic in B cells with two alleles, and Thbh and Thb1 are responsible for high and low expression of ThB in B cells. The regulatory locus of Thb expression mapped to the Ly-6 cluster of genes for Chr15. In our study, we used expression cloning in COS cells to isolate a cDNA clone encoding Thb after transfection; this cDNA product reacted with anti-ThB antibody. However, Ly-6A. 2 antibody, Ly-6B. 2 antibody, Ly-6C. 2 antibody, or Ly-6D. Does not react with 2 antibodies. One of these clones, pThB-A, contains a sequenced 702 base insert. The translated amino acid sequence has 11 cysteine residues and is similar to the structure of the Ly-6 molecule, both in the absence of potential N-linked glycosylation sites. The nucleotide and amino acid sequences of the ThB cDNA were compared with those of the Ly-6 gene and Ly-6 related human CD59 and showed clear homology. Finally, using cross-species hybridization, the structural Thb gene was mapped to Chr 15; thus, both the structural and regulatory genes map to similar sites. Genetic map location and sequence similarity near Ly-6 suggest that Thb and Ly-6 may be derived from the same ancestor due to gene duplication.
[0363]
The protein similarity information, expression patterns, and map positions for the NOV16 protein and NOV16 nucleic acid disclosed herein are such that NOV16 has important structural and / or physiological functions characteristic of the TGF family. Suggest to get. Thus, the nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications, and as research tools. These include those that serve as specific or selective nucleic acid diagnostic markers and / or nucleic acid prognostic markers or protein diagnostic markers and / or protein prognostic markers, wherein the nucleic acid or the presence of the protein, or the nucleic acid Alternatively, the amount of the protein is evaluated, and these include potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapy) Antibodies, diagnostic antibodies, drug target antibodies / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo (vi ) Biological defense weapons.
[0364]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful for potential diagnostic and therapeutic applications related to various diseases and disorders and / or other pathologies described below. For example, the compositions of the present invention have efficacy for the treatment of patients suffering from: cancer, trauma, regeneration, viral infection / bacterial infection / parasite infection.
[0365]
Novel nucleic acids or fragments thereof encoding lymphocyte antigen precursor-like proteins of the invention can be useful in diagnostic applications, where the presence or amount of nucleic acid or protein is assessed. These substances are further useful in the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV16 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, contemplated NOV16 epitopes are from about 25 to about 30 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV16 epitope is from about 50 to about 70 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV10 epitopes are from about 82 to about 102 amino acids.
[0366]
(NOV17)
The disclosed NOV17 nucleic acid (also referred to as CuraGen Acc. No. CG56307-01) encoding a novel pepsinogen C-like protein contains 1270 nucleotides (SEQ ID NO: 53) and is shown in Table 13A. The open reading frame was identified as starting at the ATG start codon at nucleotides 8-10 and ending at the TAG codon at nucleotides 1241-2126. The putative untranslated region downstream from the stop codon is underlined in Table 17A, and the start and stop codons are shown in bold.
[0367]
[Table 17A]

The nucleic acid sequence of NOV17 is mapped to chromosome 16q21.3-p21.1, and the present invention relates to gb: GENBANK-ID: HUMPGCA | acc: J044443.1 mRNA (Homo sapiens pepsinogen C (PGC) mRNA from Homo sapiens, 1171 bases (91%) out of 1277 bases (E = 7.0e) ^-228 ).
[0368]
The NOV17 polypeptide (SEQ ID NO: 54) is 372 amino acid residues and is presented in Table 17B using a one letter code. SignalP, Psort, and / or Hydropathy results predict that NOV17 has a signal peptide and appears to be localized extracellularly with a probability of 0.8200. In other embodiments, NOV17 is localized to microbodies (peroxisomes) with a certainty of 0.2076, localized to the endoplasmic reticulum (membrane) with a certainty of 0.1000, or 0.1000. Localizes in the endoplasmic reticulum (lumen) with certainty. The most likely cleavage site for the NOV17 peptide is between amino acid 16 and amino acid 17 (LEA-AV).
[0369]
[Table 17B]

The NOV17 amino acid sequence is 388 amino acid residues relative to Homo sapiens (human) 388 amino acid residues ptnr: SWISSPROT-ACC: P20142 protein (GASTRICSIN PROCERSOR (EC 3.4.23.3)) (PEPSINNOGEN C). Of these, it has 372 amino acid residues (95%) identity and 388 amino acid residues (372%) similarity (Figure 3B). The sequence of the present invention lacks 16 internal amino acids when compared to the ptnr: SWISSPROT-ACC: P20142 protein (GASTRICSIN PRECURSOR (EC 3.4.23.3)) (PEPSINOGEN C) from Homo sapiens (human). Lost (E = 1.1e ^-197 ).
[0370]
NOV17 is expressed in at least the following tissues: adrenal gland, bone marrow, brain-tonsils, brain-cerebellum, brain-hippocampus, brain-substantia nigra, brain-thalamus, brain-whole, fetal brain, fetal kidney, fetal liver, Fetal lung, heart, kidney, lymphoma-Raji, breast, pancreas, pituitary, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, testis, thyroid, trachea, uterus, aorta, duodenum, gallbladder, liver , Lungs, lung pleura, lymph nodes, ovaries, peripheral blood. This information determines the tissue source of the sequences included in the present invention including, but not limited to, SeqCalling source, Public EST source, Literature source, and / or RACE source. Was induced by Furthermore, this sequence is presumed to be expressed in the gastric mucosa. Because the expression pattern of (GENBANK-ID: gb: GENBANK-ID: HUMPGCA | acc: J044443.1) is closely related to the Homo sapiens pepsinogen C (PGC) mRNA (the complete coding homolog in the Homo sapiens species). is there.
[0371]
NOV17 also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 17C.
[0372]
[Table 17C]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 17D.
[0373]
[Table 17D]

Table 17E lists the domain contents from the results of DOMAIN analysis for NOV17. This indicates that the NOV17 sequence has similar properties to other proteins known to contain these domains.
[0374]
[Table 17E]

Gastric aspartic proteinases (pepsin A, pepsin B, gastricin / pepsinogen C and chymosin) are synthesized in the gastric mucosa as inactive precursors known as zymogens. Gastric zymogens are each a prosegment (ie, containing additional residues at the N-terminus of the active enzyme), which act to stabilize the inactive form and prevent entry of the substrate into the active site. Upon food intake, each of the zymogens is released into the gastric lumen and undergoes conversion to an active enzyme in acidic gastric fluid. This activation reaction is initiated by the disruption of the electrostatic interaction between the prosegment and the active enzyme moiety at an acidic pH value. The conversion of zymogen into its active form is a complex process, which involves a series of conformational changes and bond cleavage steps, from active site unveiling and ultimately from the active center of the enzyme. Leading to the removal and dissociation of the prosegment. During this activation reaction, both the prosegment and the active enzyme undergo a change in conformation, and proteolytic cleavage of the prosegment is one or more steps by either an intramolecular reaction or an intermolecular reaction. Can occur. The variability in the mechanism of proteolysis appears to be due in part to the structure of the prosegment. Due to differences in activation mechanisms between the four types of gastric zymogen and between species of the same type of zymogen, no single activation model can be proposed.
[0375]
Pepsinogen is an inactive precursor of pepsin (a typical aspartic proteinase that is synthesized in the main cells of the gastric gland). There are two main groups of pepsinogens: pepsinogen A (PGA) and pepsinogen C (PGC) (ie progastrixin), and each frequently has an isozymogen. The relative degree of expression of the two pepsinogens varies between animal species, and furthermore, their biosynthesis is known to be affected by bioactive peptides such as gastrin and secretin. However, the regulatory mechanism of pepsinogen biosynthesis and hence pepsinogen gene expression is still unclear. Therefore, it is considered to be fundamentally important to elucidate the primary structure of the pepsinogen gene for such studies. The organization of the human PGA gene and the human PGC gene and the rat PGC gene is essentially identical; each gene encoding the amino acid sequence of the corresponding prepepsinogen has 9 It was found to be separated into exons. These results indicate that these genes are all derived from a common ancestral gene. However, the 5 ′ flanking region of the human PGA gene was different from the 5 ′ flanking region of the human PGC gene and the rat PGC gene, while the 5 ′ flanking region of the human PGC gene and the rat PGC gene were similar to each other. Therefore, it is suggested that the expression of PGA gene and PGC gene is regulated somewhat differently. Comparative analysis of the genes for human aspartate proteinases (pepsinogen A, pepsinogen C, cathepsin D, cathepsin E, and renin) reveals high similarity with respect to their respective coding sequences and exon-intron junction positions.
[0376]
Despite the strong conservation of the region containing the active site aspartyl group, genetic polymorphisms have been identified for each of the proteinase genes other than cathepsin D. These genetic polymorphisms are useful for the localization of genes with respect to linkage maps and the determination of gene copy number. The chromosomal location of each aspartyl proteinase is determined by various gene mapping methods using recombinant DNA probes, including analysis of somatic cell hybrid mapping panels, in situ hybridization to metaphase chromosome preparations, and family linkage analysis using polymorphic markers. Has been determined by. Pepsinogen A represents the most extensive polymorphism of aspartic proteinase, and pepsinogen A can be detected by protein electrophoresis or by DNA analysis. Southern blot hybridization and polymerase chain reaction (PCR) amplification using the respective DNA probes have revealed nucleotide differences located in the coding and non-coding portions of the aspartate proteinase gene. These polymorphisms can be used to study the potential role of each proteinase in genetically affected clinical conditions. The development of more advanced polymorphic markers detected by PCR amplification of branched nucleotide sequence repeats is a demonstration of the effects of genetic modification of aspartic proteinases that may have specific clinical diseases (eg, ulcers and hypertension) Very helpful. PGC gene polymorphisms are associated with gastric ulcers and may be asymptomatic markers of genetic predisposition to gastric ulcers. Serum determination of pepsinogen A (PGA) and pepsinogen C (PGC) may indicate gastric mucosal inflammation and atrophy. The gastric mucosa of the body produces both PGA and PGC, whereas the sinus mucosa produces only PGC. Thus, diseases related primarily to sinus (eg, H. pylori infection) are primarily indicated by variants in serum PGC rather than serum PGA. Consistently, the sinus mucosa is more toxic cagA positive H. When infected by a Pylori strain, this results in severe inflammation and significantly increases serum PGC.
[0377]
Protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV17 protein and NOV17 nucleic acid disclosed herein are important structural and / or physiological functional features of NOV17 aspartyl protease family. It is suggested that Thus, the nucleic acids and proteins of the present invention are useful as potential diagnostic and therapeutic applications and research tools. They function as specific or selective nucleic acid or protein diagnostic and / or prognostic markers (where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed) and potential as Therapeutic applications include: (i) protein therapy, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic, diagnostic, drug targets / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy ( Gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, (vi) biological defense weapons.
[0378]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications associated with various diseases and disorders described below and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention may be used to treat patients suffering from ulcers, hypertension (Scan J Clin Lab Invest Suppl 1992; 210: 111-9), gastric mucosal inflammation and atrophy, and other diseases, disorders and conditions. Can have efficacy against. PGC gene polymorphisms are associated with gastric ulcers and may be asymptomatic markers of genetic predisposition to gastric ulcers (Nippon Rinsho 1996 Apr; 54 (4): 1149-54). Serum determination of pepsinogen A (PGA) and pepsinogen C (PGC) may indicate gastric mucosal inflammation and atrophy. The gastric mucosa of the body produces both PGA and PGC, whereas the sinus mucosa produces only PGC. Thus, diseases related primarily to sinus (eg, H. pylori infection) are primarily indicated by variants in serum PGC rather than serum PGA. Consistently, the sinus mucosa is more toxic cagA positive H. When infected by the Pylori strain, this results in severe inflammation and significantly increases serum PGC (Recenti Prog Med 1999 Jun; 90 (6): 342-6).
[0379]
Novel nucleic acids encoding pepsinogen C-like proteins of the invention, or fragments thereof, are useful in diagnostic applications when the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These materials are further useful in the generation of antibodies that immunospecifically bind to the novel agents of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV10 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen. In one embodiment, contemplated NOV17 epitopes are from about 30 to about 60 amino acids. In another embodiment, a contemplated NOV17 epitope is from about 110 to about 130 amino acids. In other specific embodiments, contemplated NOV17 epitopes range from about 160 to about 170, about 180 to about 181, about 201 to about 202, about 204 to about 205, about 207 to about 208, about 240 to about 240 amino acids. 252, about 290 to about 310, about 340 to about 345, or about 360 to about 365.
[0380]
(NOV18)
The disclosed NOV18 nucleic acid (also referred to as CuraGen Acc. No. CG56294-01) encoding a novel ARL-like protein contains 14859 nucleotides (SEQ ID NO: 55) and is shown in Table 18A. The open reading frame was identified as starting at the ATG start codon at nucleotides 1-3 and ending at the TAA codon at nucleotides 14857-14859. Start and stop codons are shown in bold in Table 18A.
[0381]
[Table 18A]

The nucleic acid sequence of NOV18 is mapped to chromosome 12q12-q14 and is 13081 bases out of 13153 bases to gb: GENBANK-ID: AF010404 | acc: AF010404.1 mRNA (Homo sapiens ALR mRNA, complete code) from Homo sapiens (99%) identity (E = 0.0).
[0382]
The NOV18 polypeptide (SEQ ID NO: 56) is 4952 amino acid residues and is presented in Table 18B using a one letter code. SignalP, Psort and / or Hydropathy results predict that NOV18 appears to localize to the nucleus with a certainty of 0.9800. In other embodiments, NOV18 localizes to microbodies (peroxisomes) with a probability of 0.3000, localizes to the mitotic matrix cavity with a certainty of 0.1000, or 0.1000. With certainty, it is localized in the lysosome (lumen).
[0383]
[Table 18B]

The NOV18 amino acid sequence is the identity of 4946 amino acid residues (99%) of 4957 amino acid residues to the 4957 amino acid residue ptnr: SPTREMBL-ACC: O14987 protein (ALR) from Homo sapiens (human), and It has 4946 amino acid residues (99%) of 4957 amino acid residues (E = 0.0).
[0384]
NOV18 is expressed in at least the following tissues: adrenal gland, bone marrow, brain-tonsils, brain-cerebellum, brain-hippocampus, brain-substantia nigra, brain-thalamus, brain-whole, fetal brain, fetal kidney, fetal liver, Fetal lung, heart, kidney, lymphoma-Raji, breast, pancreas, pituitary, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, testis, thyroid, trachea, uterus. This information was derived by determining the tissue source of the sequences included in the present invention, including but not limited to SeqCalling sources, Public EST sources, and / or RACE sources.
[0385]
NOV18 also has homology to the amino acid sequence shown in the BLASTP data listed in Table 18C.
[0386]
[Table 18C]

The homology of these sequences is shown graphically in the ClustalW analysis shown in Table 18D.
[0387]
[Table 18D]

Table 18E, Table 18F, Table 18G and Table 18H list the domain contents from the results of DOMAIN analysis for NOV18. This indicates that the NOV18 sequence has similar properties to other proteins known to contain these domains.
[0388]
[Table 18E]

[0389]
[Table 18F]

[0390]
[Table 18G]

[0390]
[Table 18H]

The ALL-1 gene is involved in human acute leukemia through chromosomal translocation or internal rearrangement. ALL-1 is a human homologue of Drosophila trithorax. The latter (Drosophila trithorax) is a trithorax group (trx-G) gene that, together with the Polycomb group (Pc-G) gene, acts as a positive regulator and a negative regulator, respectively, in determining Drosophila body structure. Is a member of ALR (ALL-1-related protein) encodes a large 5262 amino acid long protein, interrupted by the SET domain, five PHD fingers, potential zinc fingers, and hydrophobic residues (mostly leucine) Contains a very long continuous glutamine. The SET motif, PDH finger, zinc finger and two other regions are most similar for the domains of ALL-1 and TRX. The first two motifs are also found in other trx-G and Pc-G proteins. This ALR gene was mapped to chromosomal band 12q12-13 adjacent to the VDR gene. This region is implicated in cancer-related duplications and translocations. Analysis of ALR expression showed that the mRNA, approximately 18 kb long, was expressed in most adult tissues including various hematopoietic cells except the liver, such as ALL-1. Whole mount in situ hybridization to mouse early embryos shows expression in multiple tissues. Based on the similarity in structure and expression pattern, ALR is likely to play a similar role as ALL-1 and trx, but its target gene has not yet been identified (Prasad et al., 1997, Oncogene vol. 15). : 549-60).
[0392]
Protein similarity information, expression patterns, and map locations for the NOV18 protein and NOV18 nucleic acids disclosed herein that NOV18 may have important structural and / or physiological functional features of the intracellular family. Suggest. Thus, the nucleic acids and proteins of the present invention are useful as potential diagnostic and therapeutic applications and research tools. They function as specific or selective nucleic acid or protein diagnostic and / or prognostic markers (where the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed) and potential as Therapeutic applications include: (i) protein therapy, (ii) small molecule drug targets, (iii) antibody targets (therapeutic, diagnostic, drug targets / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy ( Gene delivery / gene excision), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, (vi) biological defense weapons.
[0393]
The nucleic acids and proteins of the invention are useful in potential diagnostic and therapeutic applications associated with various diseases and disorders described below and / or other pathologies. For example, the compositions of the present invention have efficacy for the treatment of patients suffering from cancer (eg, acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, translocation associated leukemia), and other diseases, disorders and conditions.
[0394]
Novel nucleic acids encoding ALR-like proteins of the invention, or fragments thereof, are useful in diagnostic applications when the presence or amount of the nucleic acid or protein is assessed. These materials are further useful in the generation of antibodies that immunospecifically bind to the novel agents of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods. These antibodies can be generated according to methods known in the art using predictions from hydrophobicity charts, as described in the “Anti-NOVX antibodies” section below. The disclosed NOV18 protein has multiple hydrophilic regions, each of which can be used as an immunogen.
[0395]
(NOVX nucleic acids and NOVX polypeptides)
One aspect of the invention pertains to isolated nucleic acid molecules that encode NOVX polypeptides or biologically active portions thereof. Also included are nucleic acid fragments sufficient for use as hybridization probes to identify NOVX-encoding nucleic acids (eg, NOVX mRNA), and fragments for use as PCR primers for amplification and / or mutation of NOVX nucleic acid molecules. Included in the invention. As used herein, the term “nucleic acid molecule” refers to DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA), RNA molecules (eg, mRNA), DNA or RNA analogs produced using nucleotide analogs, As well as derivatives, fragments and homologues thereof. The nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably composed of double-stranded DNA.
[0396]
The NOVX nucleic acid can encode a mature NOVX polypeptide. As used herein, a “mature” form of a polypeptide or protein disclosed in the present invention is the product of a naturally occurring polypeptide or precursor form or proprotein. This naturally occurring polypeptide, precursor or proprotein includes, as a non-limiting example, the full-length gene product encoded by the corresponding gene. Alternatively, it can be defined as a polypeptide, precursor or proprotein encoded by the ORFs described herein. The “mature” form of the product occurs (again, as a non-limiting example) as a result of one or more naturally occurring processing steps where this gene product can occur in the cell or host cell. Examples of such processing steps that result in a “mature” form of the polypeptide or protein include cleavage of the N-terminal methionine residue encoded by the initiation codon of the ORF, or proteolytic cleavage of the signal peptide or leader sequence. . Thus, the mature form resulting from a precursor polypeptide or protein having residues 1-N, where residue 1 is the N-terminal methionine, is the residue 2-N remaining after removal of the N-terminal methionine. Have Alternatively, the mature form resulting from a precursor polypeptide or protein having residues 1-N, where the N-terminal signal sequence of residues 1-M is cleaved is the remaining residues M + 1-1 It has a residue of group N. Further, as used herein, a “mature” form of a polypeptide or protein can result from a process of post-translational modification other than a proteolytic cleavage event. Such additional processes include, but are not limited to glycosylation, myristoylation or phosphorylation. In general, a mature polypeptide or protein can result from only one manipulation of these processes or any combination of these processes.
[0397]
As used herein, the term “probe” may vary in length (preferably at least about 10 nucleotides (nt), 100 nt, or such as on the order of about 6,000 nt, depending on the particular application. Length) nucleic acid sequence. Probes are used for the detection of identical, similar or complementary nucleic acid sequences. Longer length probes are generally obtained from natural or recombinant sources, are more specific than shorter length oligomeric probes, and hybridize more slowly. Probes can be single-stranded or double-stranded and can be designed to have specificity in PCR, membrane-based hybridization techniques, or ELISA-like techniques.
[0398]
As used herein, the term “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid. Preferably, an “isolated” nucleic acid is free of sequences that are naturally adjacent to the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (ie, sequences located at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleic acid). . For example, in various embodiments, the isolated NOVX nucleic acid molecule is a nucleotide that is naturally adjacent to the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell / tissue from which the nucleic acid is derived (eg, brain, heart, liver, spleen, etc.). It may contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of the sequence. Furthermore, an “isolated” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, can be substantially free of other cellular material or culture medium, or chemically synthesized when produced by recombinant techniques. If present, it may be substantially free of chemical precursors or other chemicals.
[0399]
The nucleic acid molecule of the present invention (for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, Nucleic acid molecules having the nucleotide sequence of 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, or the complement of this aforementioned nucleotide sequence) are provided in standard molecular biology techniques and herein. Sequence information. As hybridization probes, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, Using all or part of the 45, 47, 49, 51, 53 and 55 nucleic acid sequences, NOVX molecules can be isolated using standard hybridization and cloning techniques (see, eg, Sambrook, et al. ( Ed.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2 ^nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al. (Ed.) CURRENT PROTOCOLS IN MULTICULAR BIOLOGY, John Wiley, N. 93).
[0400]
The nucleic acids of the invention can be amplified using cDNA, mRNA, or alternatively genomic DNA, as a template and appropriate oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques. The nucleic acid so amplified can be cloned into an appropriate vector and characterized by DNA sequence analysis. In addition, oligonucleotides corresponding to NOVX nucleotide sequences can be prepared by standard synthetic techniques, eg, using an automated DNA synthesizer.
[0401]
As used herein, the term “oligonucleotide” refers to a series of linked nucleotide residues, which oligonucleotide has a sufficient number of nucleotide bases to be used in a PCR reaction. Short oligonucleotide sequences can be based on or designed from genomic or cDNA sequences, and amplify and confirm identical, similar or complementary DNA or RNA in specific cells or tissues Or used to clarify their existence. The oligonucleotide comprises a portion of a nucleic acid sequence having a length of about 10 nt, 50 nt, or 100 nt, preferably about 15 nt to 30 nt. In one embodiment of the invention, an oligonucleotide comprising a nucleic acid molecule less than 100 nt long is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27. , 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, or their complements. Oligonucleotides can be chemically synthesized and can also be used as probes.
[0402]
In another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31. 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, or a part of this nucleotide sequence (eg, a fragment that can be used as a probe or primer, or A nucleic acid molecule that is the complement of a biologically active portion of a NOVX polypeptide. Complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 or 41 The target nucleic acid molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 or 41 Which is sufficiently complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31. , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 can be hydrogen bonded with little or no mismatch, thereby producing a stable duplex. Form.
[0403]
As used herein, the term “complementary” refers to Watson-Crick base pairing or Hoogsteen base pairing between nucleotide units of a nucleic acid molecule, and the term “binding” refers to two polypeptides. Or a physical or chemical interaction between a compound, or a related polypeptide or compound, or a combination thereof. Examples of the binding include ionic interaction, nonionic interaction, van der Waals interaction, hydrophobic interaction and the like. The physical interaction can be either direct or indirect. Indirect interaction may be through or due to the effect of another polypeptide or compound. Direct binding refers to interactions that do not occur through or due to the effects of another polypeptide or compound, but instead are free of other substantial chemical intermediates.
[0404]
The fragments provided herein allow sequences of at least 6 (contiguous) nucleic acids or sequences of at least 4 (contiguous) amino acids (respectively in the case of nucleic acids, Or in the case of amino acids, it is defined as a length sufficient to allow specific recognition of the epitope) and is at most some portion less than the full length sequence. Fragments can be derived from any contiguous portion of a selected nucleic acid or amino acid sequence. A derivative is a nucleic acid or amino acid sequence formed from a native compound either directly or by modification or partial substitution. An analog is a nucleic acid or amino acid sequence that has a structure similar to (but not identical to) a native compound, but that differs from that with respect to a particular component or side chain. Analogs can be synthetic or can be derived from an evolutionarily different source and can have similar or opposite metabolic activity as compared to wild-type. A homolog is a nucleic acid or amino acid sequence of a particular gene from a different species.
[0405]
Derivatives and analogs can be full-length or other than full-length when the derivatives or analogs contain modified nucleic acids or amino acids, as described below. As a derivative or analog of the nucleic acid or protein of the invention, in various embodiments, the nucleic acid or protein of the invention is compared to a nucleic acid or amino acid sequence of the same size or compared to an aligned sequence (this alignment is Is carried out by computer homology programs known in the art) and is substantially homologous with at least about 70%, 80%, or 95% identity (preferred identity is 80-95%) Or a molecule comprising a region in which the encoding nucleic acid can hybridize to the complement of a sequence encoding the protein under stringent, moderately stringent or low stringent conditions. However, it is not limited to these. See, for example, Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993, and the following.
[0406]
“Homologous nucleic acid sequence” or “homologous amino acid sequence”, or variants thereof, refers to sequences characterized by homology at the nucleotide or amino acid level, as discussed above. A homologous nucleotide sequence encodes a sequence that encodes an isoform of a NOVX polypeptide. Isoforms can be expressed in different tissues of the same organism, for example as a result of alternative splicing of RNA. Alternatively, isoforms can be encoded by different genes. In the present invention, homologous nucleotide sequences include species other than humans (including but not limited to vertebrates) and thus include, for example, frogs, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses and other A nucleotide sequence encoding a NOVX polypeptide), which may include organisms. Homologous nucleotide sequences also include, but are not limited to, naturally occurring allelic variants and variants of the nucleotide sequences described herein. However, homologous nucleotide sequences do not include the exact nucleotide sequence encoding human NOVX protein. Homologous nucleic acid sequences are SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 conservative amino acid substitutions (see below), as well as nucleic acid sequences encoding polypeptides that possess the biological activity of NOVX. Various biological activities of the NOVX protein are described below.
[0407]
NOVX polypeptides are encoded by the open reading frame (“ORF”) of NOVX nucleic acids. The ORF corresponds to a nucleotide sequence that can potentially be translated into a polypeptide. The stretch of nucleic acid containing the ORF is not interrupted by a stop codon. The ORF representing the coding sequence for the entire protein begins with an ATG “start” codon and ends with one of the three “stop” codons (ie, TAA, TAG, or TGA). . For the purposes of the present invention, the ORF can be any part of the coding sequence with or without a start codon, stop codon or both. For ORFs that are considered good candidates for the coding of the bona-fide cellular protein, minimum size requirements (eg, DNA stretches that encode proteins of 50 amino acids or more) are often set.
[0408]
Nucleotide sequences determined from cloning of human NOVX genes are for use in identifying and / or cloning NOVX homologs in other cell types (eg, from other tissues), as well as NOVX homologs from other vertebrates Enables the production of probes and primers designed to This probe / primer typically comprises a substantially purified oligonucleotide. This oligonucleotide typically has SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 at least about 12, about 25, about 50, about 100, about 150, about 200, about 250, about 300 , About 350 or about 400 contiguous sense strand nucleotide sequences; or SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55; or SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 2 , 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, hybridize under stringent conditions to the antisense strand nucleotide sequences of naturally occurring variants. Contains a region of the nucleotide sequence to soybean.
[0409]
Probes based on human NOVX nucleotide sequences can be used to detect transcripts or genomic sequences encoding the same or homologous proteins. In various embodiments, the probe further comprises a label group attached to the probe, for example, the label group can be a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme, or an enzyme cofactor. Such a probe may be used as part of a diagnostic test kit to identify cells or tissues that misexpress NOVX protein, eg, to measure the level of a nucleic acid encoding NOVX in a cell sample from a subject. (Eg, detecting NOVX mRNA levels) or by determining whether the genomic NOVX gene is mutated or deleted.
[0410]
A “polypeptide having a biologically active portion of a NOVX polypeptide” is similar to the activity of a polypeptide of the invention (including mature forms) as measured in a particular biological assay, A polypeptide that exhibits or does not necessarily have a dose-dependent activity that is not necessarily the same. A nucleic acid fragment encoding "a biologically active portion of NOVX" encodes a polypeptide having the biological activity of NOVX (the biological activity of NOVX protein is described below), SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, Prepared by isolating portions of 51, 53 and 55, expressing the encoded portion of the NOVX protein (eg, by recombinant expression in vitro) and assessing the activity of the encoded portion of NOVX. obtain.
[0411]
(NOVX nucleic acid and polypeptide variants)
The present invention further includes SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 due to the degeneracy of the genetic code. , 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, and thus, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 , 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 A nucleic acid molecule encoding the same NOVX protein. In another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32. , 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56, having a nucleotide sequence encoding a protein having the amino acid sequence shown in FIG.
[0412]
SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, In addition to the human NOVX nucleotide sequences shown in 49, 51, 53 and 55, DNA sequence polymorphisms leading to changes in the amino acid sequence of this NOVX polypeptide may exist within a population (eg, the human population) As understood by those skilled in the art. Such genetic polymorphisms in the NOVX gene may exist in individuals within a population due to natural allelic variations. As used herein, the terms “gene” and “recombinant gene” refer to a nucleic acid molecule comprising an open reading frame (ORF) encoding a NOVX protein, preferably a vertebrate NOVX protein. . Such natural allelic variations can typically result in 1-5% variation in the nucleotide sequence of the NOVX gene. Any and all such nucleotide variations and amino acid polymorphisms within the resulting NOVX polypeptide that are the result of natural allelic variation and do not alter the functional activity of this NOVX polypeptide are within the scope of the present invention. Is intended to be within.
[0413]
Furthermore, it encodes NOVX proteins from other species, and thus human SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 are intended to be within the scope of the present invention. Nucleic acid molecules corresponding to natural allelic variants and homologues of the NOVX cDNA of the present invention, under stringent hybridization conditions, based on their homology to the human NOVX nucleic acids disclosed herein, According to standard hybridization techniques, it can be isolated using human cDNA or a portion thereof as a hybridization probe.
[0414]
Thus, in another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention is at least 6 nucleotides in length and is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 under stringent conditions. , 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 hybridize to nucleic acid molecules comprising nucleotide sequences To do. In another embodiment, the nucleic acid is at least 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, or 2000 or more nucleotides in length. In yet another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention hybridizes to the coding region. As used herein, the term “hybridizes under stringent conditions” refers to hybridization and wash conditions in which nucleotide sequences that are at least 60% homologous to each other typically remain hybridized to each other. It is intended to be described.
[0415]
Homologs (ie, nucleic acids encoding NOVX proteins from non-human species) or other related sequences (eg, paralogs) are probed with all or part of a particular human sequence and are related to nucleic acid hybridization and cloning in the art. Can be obtained by low, moderate or high stringency hybridization using methods well known in the art.
[0416]
As used herein, the phrase “stringent hybridization conditions” refers to conditions under which a probe, primer or oligonucleotide will hybridize to its target sequence but not to other sequences. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures than shorter sequences. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. This Tm is the temperature (under a defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe complementary to the target sequence hybridizes to the target sequence in equilibrium. Since the target sequence is generally present in excess, at Tm, 50% of the probes are occupied in equilibrium. Typically, stringent conditions are pH 7.0-8.3, salt concentrations below about 1.0M sodium ion, typically about 0.01-1.0M sodium ion (or other Salt) and the temperature is at least about 30 ° C. for short probes, primers or oligonucleotides (eg, 10 nt to 50 nt) and at least about 60 ° C. for longer probes, primers and oligonucleotides It is a condition. Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.
[0417]
Stringent conditions are known to those of skill in the art and are described in Ausubel et al. (Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N .; Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Preferably, the conditions are such that sequences that are at least about 65%, about 70%, about 75%, about 85%, about 90%, about 95%, about 98% or about 99% homologous to each other typically Conditions that remain hybridized. Non-limiting examples of stringent hybridization conditions include 6 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, and Hybridization at 65 ° C. in high salt buffer containing 500 mg / ml denatured salmon sperm DNA, followed by one or more washes at 50 ° C. in 0.2 × SSC, 0.01% BSA. is there. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 under stringent conditions Isolated nucleic acid molecules of the present invention that hybridize to the sequences 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 correspond to naturally occurring nucleic acid molecules. As used herein, a “naturally-occurring” nucleic acid molecule refers to an RNA or DNA molecule having a nucleotide sequence that occurs in nature (eg, encodes a natural protein).
[0418]
In the second embodiment, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, and 55, or nucleic acid sequences that can hybridize to the fragments, analogs or derivatives thereof under moderate stringency conditions. . Non-limiting examples of moderate stringency hybridization conditions include hybridization at 55 ° C. in 6 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 mg / ml denatured salmon sperm DNA, followed by One or more washes at 37 ° C. in 1 × SSC, 0.1% SDS. Other conditions of moderate stringency that can be used are well known in the art. For example, see Ausubel et al. (Eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESION, A LABORON
[0419]
In the third embodiment, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, nucleic acids capable of hybridizing under low stringency conditions to nucleic acid molecules, or fragments, analogs or derivatives thereof, are provided. Non-limiting examples of low stringency hybridization conditions include: 35% formamide, 5 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2 % BSA, 100 mg / ml denatured salmon sperm DNA, hybridization at 40 ° C. in 10% (weight / volume) dextran sulfate, followed by 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA And one or more washes at 50 ° C. in 0.1% SDS. Other conditions of low stringency that can be used are well known in the art (eg, conditions such as those used for cross-species hybridization). For example, Ausubel et al. (Eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY and Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND REMASION, MALAN Sci USA 78: 6789-6792.
[0420]
(Conservative mutation)
In addition to naturally occurring allelic variants of the NOVX sequence that may be present in the population, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, Changes can be introduced by mutations to the nucleotide sequences of 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, thereby the function of this NOVX protein Those of skill in the art will further understand that changes can be made in the amino acid sequence of the encoded NOVX protein without altering the ability to function. For example, nucleotide substitutions leading to amino acid substitutions at “non-essential” amino acid residues are SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30. 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56. A “non-essential” amino acid residue is a residue that can be altered from the wild-type sequence of this NOVX protein without altering its biological activity, while an “essential” amino acid residue is such an organism. Is required for biological activity. For example, amino acid residues that are conserved among the NOVX proteins of the invention are predicted to be particularly unacceptable for changes. Amino acids for which conservative substitutions can be made are well known in the art.
[0421]
Another aspect of the invention pertains to nucleic acid molecules encoding NOVX proteins that contain changes in amino acid residues that are not essential for activity. Such NOVX proteins are SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41. 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 differ in amino acid sequence but still retain biological activity. In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a protein, wherein the protein comprises SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, Amino acid sequence that is at least about 45% homologous to the amino acid sequence of 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 including. Preferably, the protein encoded by this nucleic acid molecule is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36. , 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56; more preferably SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14; 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 at least about 70% homologous Still more preferably, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 4 and 56 are at least about 80% homologous; even more preferably, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56; and most preferably SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 is at least about 95% homologous.
[0422]
SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, Isolated nucleic acid molecules encoding NOVX proteins that are homologous to the proteins 50, 52, 54 and 56 are SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23. 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, introduce one or more nucleotide substitutions, additions or deletions As a result, one or more amino acid substitutions, additions or deletions are introduced into the encoded protein.
[0423]
Mutations are performed according to standard techniques (eg, site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55. Preferably, conservative amino acid substitutions are made at one or more predicted non-essential amino acid residues. A “conservative amino acid substitution” is one in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include: amino acids with basic side chains (eg lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (eg aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains Amino acids (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), β-branch side Amino acids with chains (eg threonine, valine, isoleucine) and amino acids with aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Thus, a putative nonessential amino acid residue in a NOVX protein is replaced with another amino acid residue from the same side chain family. Alternatively, in another embodiment, mutations can be introduced randomly along all or part of the NOVX coding sequence (eg, by saturation mutagenesis) and the resulting mutant is the NOVX biology. Mutants that are screened for pharmacological activity and that maintain activity can be identified. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, After mutagenesis of 49, 51, 53 and 55, the encoded protein can be expressed by any recombinant technique known in the art and the activity of this protein can be determined.
[0424]
Amino acid family relationships can also be determined based on side chain interactions. The substituted amino acid can be a fully conserved “strong” residue or a fully conserved “weak” residue. The “strong” group of conserved amino acid residues can be any one of the following groups: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW (where the single letter amino acid code is Grouped by amino acids that can be substituted for each other). Similarly, a “weak” group of conserved residues can be any one of the following: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDECK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY (where The letters in each group represent the single letter amino acid code).
[0425]
In one embodiment, mutant NOVX proteins can be assayed for: (i) protein: protein interactions with other NOVX proteins, other cell surface proteins, or biologically active portions thereof. The ability to form, (ii) complex formation between the mutant NOVX protein and the ligand of NOVX; or (iii) the ability of the mutant NOVX protein to bind to an intracellular target protein or biologically active portion thereof; (Eg, avidin protein).
[0426]
In yet another embodiment, the mutant NOVX protein can be assayed for the ability to modulate a particular biological function (eg, modulation of insulin release).
[0427]
(Antisense nucleic acid)
Another aspect of the present invention is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, An isolated antisense nucleic acid molecule capable of hybridizing to or complementary to a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 or fragments, analogs or derivatives thereof About. An “antisense” nucleic acid comprises a nucleotide sequence that is complementary to a “sense” nucleic acid encoding a protein (eg, complementary to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule or complementary to an mRNA sequence). . In certain aspects, an antisense nucleic acid molecule comprising a sequence that is complementary to at least about 10, about 25, about 50, about 100, about 250 or about 500 nucleotides or all of the entire NOVX coding strand, or only a portion thereof Is provided. SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, Nucleic acid molecules encoding 50, 52, 54 and 56 NOVX protein fragments, homologues, derivatives and analogs, or SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 , 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 are further provided with antisense nucleic acids complementary to the NOVX nucleic acid sequence.
[0428]
In one embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a “coding region” of the coding strand of a nucleotide sequence encoding a NOVX protein. The term “coding region” refers to a region of a nucleotide sequence that includes codons translated into amino acid residues. In another embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a “noncoding region” of the coding strand of a nucleotide sequence encoding a NOVX protein. The term “noncoding region” refers to 5 ′ and 3 ′ sequences that are adjacent to the coding region and are not translated into amino acids (ie, also referred to as 5 ′ untranslated region and 3 ′ untranslated region).
[0429]
In view of the coding strand sequence encoding the NOVX protein disclosed herein, the antisense nucleic acids of the invention can be designed according to Watson and Crick or Hoogsteen base pairing rules. An antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding region of NOVX mRNA, but more preferably is an oligonucleotide that is antisense to only a portion of the coding or non-coding region of NOVX mRNA. For example, the antisense oligonucleotide can be complementary to the region surrounding the translation start site of NOVX mRNA. Antisense oligonucleotides can be, for example, about 5, about 10, about 15, about 20, about 25, about 30, about 35, about 40, about 45, or about 50 nucleotides in length. The antisense nucleic acids of the invention can be constructed using chemical synthesis or enzyme ligation reactions using procedures known in the art. For example, an antisense nucleic acid (eg, an antisense oligonucleotide) is formed to increase the biological stability of a naturally occurring nucleotide or molecule, or between an antisense nucleic acid and a sense nucleic acid. It can be chemically synthesized using various modified nucleotides designed to increase the physical stability of the duplex (eg, phosphorothioate derivatives and acridine substituted nucleotides can be used).
[0430]
Examples of modified nucleotides that can be used to make antisense nucleic acids include: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4- Acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosine, inosine N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6- Denine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-mannosylqueosine, 5′-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxy Uracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v), wybutoxine, pseudouracil, cueosine, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2- Carboxypropyl) uracil, (acp3) w, and 2,6-diaminopurine. Alternatively, an antisense nucleic acid can be biologically generated using an expression vector, in which the nucleic acid is subcloned in the antisense orientation (ie, RNA transcribed from the inserted nucleic acid is , RNA in the antisense orientation relative to the target nucleic acid of interest, as further described in the following subsection).
[0431]
The antisense nucleic acid molecules of the invention are typically administered to a subject or generated in situ so that they hybridize with cellular mRNA and / or genomic DNA encoding the NOVX protein. Or bind to them, thereby inhibiting expression of this protein (eg, by inhibiting transcription and / or translation). This hybridization can be accomplished by conventional nucleotide complementarity to form a stable duplex or, for example, in the case of antisense nucleic acid molecules that bind to a DNA duplex, specific interactions in the main groove of the duplex. It can be done via action. An example of a route of administration of antisense nucleic acid molecules of the invention includes direct injection at a tissue site. Alternatively, antisense nucleic acid molecules can be modified to target selected cells and then administered systemically. For example, for systemic administration, antisense molecules can be coupled to a receptor or antigen expressed on a selected cell surface (eg, the antisense nucleic acid molecule can be It can be modified (by linking to a peptide or antibody that binds to the antigen). Antisense nucleic acid molecules can also be delivered to cells using the vectors described herein. To achieve sufficient nucleic acid molecules, vector constructs in which the antisense nucleic acid molecule is placed under the control of a strong pol II or pol III promoter are preferred.
[0432]
In yet another embodiment, the antisense nucleic acid molecule of the invention is an α-anomeric nucleic acid molecule. The α-anomeric nucleic acid molecule forms a specific double-stranded hybrid with complementary RNA, in which these strands extend parallel to each other as opposed to the normal β-unit. See, for example, Gaultier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641. Antisense nucleic acid molecules can also be 2′-o-methylribonucleotides (see, eg, Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) or chimeric RNA-DNA analogs (see, eg, Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).
[0433]
(Ribozyme and PNA part)
Non-limiting examples of nucleic acid modifications include modified bases and nucleic acids with modified or derivatized sugar phosphate backbones. These modifications are performed at least in part to enhance the chemical stability of the modified nucleic acid so that they can be used, for example, as antisense binding nucleic acids in therapeutic applications in subjects .
[0434]
In one embodiment, the antisense nucleic acid of the invention is a ribozyme. Ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity that can cleave single-stranded nucleic acids (eg, mRNA), which have a complementary region to the single-stranded nucleic acid. Thus, ribozymes (eg, hammerhead ribozymes as described in Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591) are used to catalytically cleave NOVX mRNA transcripts, thereby causing NOVX mRNA Can inhibit translation. A ribozyme having specificity for a nucleic acid encoding NOVX is the nucleotide sequence of the NOVX cDNA disclosed herein (ie, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 , 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55). For example, a derivative of Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed in which the nucleotide sequence of the active site is complementary to the cleaved nucleotide sequence in the mRNA encoding NOVX. See, for example, US Pat. No. 4,987,071 to Cech et al. And US Pat. No. 5,116,742 to Cech et al. NOVX mRNA can also be used to select catalytic RNAs with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules. See, for example, Bartel et al. (1993) Science 261: 1411-1418.
[0435]
Alternatively, NOVX gene expression targets a nucleotide sequence that is complementary to a regulatory region of a NOVX nucleic acid (eg, NOVX promoter and / or enhancer), forming a triple helical structure that interferes with transcription of the NOVX gene in the target cell. Can be inhibited. For example, Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene et al. 1992. Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. See Bioassays 14: 807-15.
[0436]
In various embodiments, NOVX nucleic acids can be modified with a base moiety, sugar moiety or phosphate backbone to improve, for example, the stability, hybridization or solubility of the molecule. For example, the nucleic acid deoxyribose phosphate backbone can be modified to produce peptide nucleic acids. For example, Hyrup et al., 1996. See Bioorg Med Chem 4: 5-23. As used herein, the term “peptide nucleic acid” or “PNA” refers to a nucleic acid mimic in which the deoxyribose phosphate backbone is replaced by a pseudopeptide backbone and only four natural nucleobases are retained. Things (eg, DNA mimetics). The neutral backbone of PNA has been shown to allow specific hybridization to DNA and RNA under conditions of low ionic strength. The synthesis of PNA oligomers is described in Hyrup et al., 1996. Supra; Perry-O'Keefe et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675, which can be performed using standard solid phase peptide synthesis protocols.
[0437]
NOVX PNAs can be used in therapeutic and diagnostic applications. For example, PNA can be used as an antisense or antigene agent for sequence-specific regulation of gene expression (eg, by inducing transcriptional or translational arrest or by inhibiting replication). . NOVX PNAs are also used, for example, in the analysis of single base pair mutations in genes (eg, PNA-directed PCR clamping); other enzymes (eg, S ₁ As an artificial restriction enzyme when used in combination with (nucleases) (see Hyrup et al., 1996. supra); or as DNA sequences and hybridization probes or primers (Hyrup et al., 1996, supra); O'Keefe et al., 1996, supra).
[0438]
In another embodiment, NOVX PNAs may be formed, for example, by attaching lipophilic groups or other helper groups to PNAs to enhance their stability or cellular uptake, or formation of PNA-DNA chimeras. Or by the use of liposomes or other techniques of drug delivery known in the art. For example, NOVX PNA-DNA chimeras can be generated that can combine the advantageous properties of PNA and DNA. Such chimeras allow DNA recognition enzymes (eg, RNase H and DNA polymerase) to interact with the DNA moiety while the PNA moiety provides high binding affinity and specificity. PNA-DNA chimeras can be ligated using linkers of appropriate length selected taking into account base stacking, the number and orientation of linkages between nucleobases (see Hyrup et al., 1996. supra). ). The synthesis of PNA-DNA chimeras is described in Hyrup et al., 1996, supra and Finn et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363. For example, DNA strands can be synthesized on a solid support using standard phosphoramidite coupling chemistry and modified nucleoside analogs (eg, 5 ′-(4-methoxytrityl) amino-5′- Deoxy-thymidine phosphoramidite) can be used between the PNA and the 5 ′ end of the DNA. For example, Mag et al., 1989. See Nucl Acid Res 17: 5973-5988. The PNA monomers are then coupled in a stepwise fashion to produce a chimeric molecule having a 5 ′ PNA segment and a 3 ′ DNA segment (see, eg, Finn et al., 1996, supra). Alternatively, chimeric molecules can be synthesized having a 5 ′ DNA segment and a 3 ′ PNA segment. See, for example, Petersen et al., 1975, Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124.
[0439]
In other embodiments, the oligonucleotide may include other attached groups such as: a peptide (eg, to target a host cell receptor in vivo) or a cell membrane (eg, Letsinger et al., 1989, Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Factors that facilitate transport across the blood brain barrier (see, eg, PCT Publication No. WO89 / 10134). In addition, oligonucleotides can be synthesized from hybridization-induced cleavage agents (see, eg, Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976) or intercalating agents (see, eg, Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539- 549)). For this purpose, the oligonucleotide can be conjugated to another molecule (eg, peptide, hybridization-induced cross-linking agent, transport agent, hybridization-induced cleavage agent, etc.).
[0440]
(NOVX polypeptide)
A polypeptide according to the invention comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of a NOVX polypeptide, the sequence comprising SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56. The present invention also provides that any residue of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 , 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56, variants that encode proteins that can be altered from the corresponding residues but still maintain their NOVX activity and physiological function Or a variant protein, or a functional fragment thereof.
[0441]
In general, a NOVX variant that retains a NOVX-like function has a residue at a particular position in the sequence replaced by another amino acid, and further inserts an additional residue between two residues of the parent protein. Includes any variants, including the possibility and the possibility of deleting one or more residues from the parent sequence. Any amino acid substitution, insertion or deletion is encompassed by the present invention. In preferred circumstances, this substitution is a conservative substitution as defined above.
[0442]
One aspect of the present invention relates to isolated NOVX proteins, and biologically active portions thereof, or derivatives, fragments, analogs or homologs thereof. Polypeptide fragments suitable for use as an immunogen to raise anti-NOVX antibodies are also provided. In one embodiment, native NOVX protein can be isolated from cells or tissue sources by an appropriate purification scheme using standard protein purification techniques. In another embodiment, the NOVX protein is produced by recombinant DNA technology. As an alternative to recombinant expression, NOVX proteins or NOVX polypeptides can be chemically synthesized using standard peptide synthesis techniques.
[0443]
An “isolated” or “purified” polypeptide or protein or biologically active portion thereof is substantially free of cellular material or other contaminating proteins from cells or tissue sources from which the NOVX protein is derived. Or are substantially free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. The term “substantially free of cellular material” includes a preparation of NOVX protein in which the NOVX protein is separated from the cellular components of the cell from which the NOVX protein is isolated or recombinantly produced. ing. In one embodiment, the term “substantially free of cellular material” refers to non-NOVX proteins (also referred to herein as “contaminating proteins”) (in dry weight) of less than about 30%, more preferably Comprises a preparation of NOVX protein having less than about 20% non-NOVX protein, even more preferably less than about 10% non-NOVX protein, and most preferably less than about 5% non-NOVX protein. If NOVX proteins or biologically active portions thereof are produced recombinantly, they are also preferably substantially free of culture medium. That is, the culture medium exhibits less than about 20% of the volume of the NOVX protein preparation, more preferably less than about 10%, and most preferably less than about 5%.
[0444]
The term “substantially free of chemical precursors and other chemicals” includes preparations of NOVX proteins in which the protein is separated from other chemicals as well as chemical precursors involved in the synthesis of the protein. . In one embodiment, the term “substantially free of chemical precursors or other chemicals” refers to chemical precursors or non-NOVX chemicals of less than about 30% (by dry weight), more preferably chemical. Having less than about 20% precursor or non-NOVX chemical, even more preferably less than about 10% chemical precursor or non-NOVX chemical, and most preferably less than about 5% chemical precursor or non-NOVX chemical; Includes preparations of NOVX protein.
[0445]
The biologically active portion of the NOVX protein includes fewer amino acids than the full length NOVX protein and exhibits at least one activity of the NOVX protein (eg, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 A peptide comprising an amino acid sequence sufficiently homologous to (amino acid sequence) or an amino acid sequence derived from the amino acid sequence of such NOVX protein. Typically, the biologically active portion includes a domain or motif having at least one activity of the NOVX protein. The biologically active portion of the NOVX protein can be, for example, a polypeptide that is 10, 25, 50, 100 or more amino acid residues in length.
[0446]
In addition, other biologically active portions lacking other regions of the protein can be prepared by recombinant techniques and evaluated for one or more of the functional activities of the native NOVX protein. obtain.
[0447]
In one embodiment, the NOVX protein is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, It has the amino acid sequence shown in 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56. In other embodiments, the NOVX protein is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, Substantially homologous to 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 and, as described in detail below, due to natural allelic variation or mutagenesis Are different, but SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, Retain the functional activity of 46, 48, 50, 52, 54 and 56 proteins. Thus, in another embodiment, the NOVX protein is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 comprising at least about 45% homologous amino acid sequences and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, Functional activity of 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 NOVX proteins It is a protein that holds
[0448]
(Determining homology between two or more sequences)
In order to determine the percentage of homology between two amino acid sequences or two nucleic acids, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (eg, a gap with a second amino acid sequence or nucleic acid sequence). Can be introduced into the sequence of the first amino acid sequence or nucleic acid sequence for optimal alignment). The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are homologous at that position (ie, as used herein). Amino acid or nucleic acid “homology” is equivalent to amino acid or nucleic acid “identity”.
[0449]
Nucleic acid sequence homology can be determined as the degree of identity between two sequences. Homology can be determined using computer programs known in the art (eg, GAP software provided in the GCG program package). See Needleman and Wunsch, 1970 J Mol Biol 48: 443-453. Using the GCG GAP software with the following settings for nucleic acid sequence comparison (GAP generation penalty, 5.0, and GAP extension penalty, 0.3), the coding region of the similar nucleic acid sequence referred to above is , SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 , 49, 51, 53 and 55, preferably at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99% identity with the CDS (coding) portion of the DNA sequence Indicates the degree.
[0450]
The term “sequence identity” refers to the degree to which two polynucleotide or polypeptide sequences are identical on a residue-by-residue basis over a particular comparison region. The term “percent sequence identity” is calculated by: comparing two sequences optimally aligned over this comparison region, nucleobases identical in both sequences (eg, A in the case of nucleic acids). , T, C, G, U, or I) to determine the number of positions present and derive the number of matched positions, the number of matched positions is the total number of positions in the comparison region (ie, (Window size) and multiply the result by 100 to derive the percentage of sequence identity. The term “substantial identity” as used herein indicates a characteristic of a polynucleotide sequence, wherein the polynucleotide comprises at least 80% sequence compared to a reference sequence over a comparison region. It includes sequences having identity, preferably at least 85% identity, and frequently 90-95% sequence identity, more usually at least 99% sequence identity.
[0451]
(Chimeric protein and fusion protein)
The present invention also provides NOVX chimeric proteins or NOVX fusion proteins. As used herein, a NOVX “chimeric protein” or NOVX “fusion protein” comprises a NOVX polypeptide operably linked to a non-NOVX polypeptide. “NOVX polypeptide” refers to a NOVX protein (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, and 56), but a “non-NOVX polypeptide” is not substantially homologous to a NOVX protein. A polypeptide having an amino acid sequence corresponding to a protein (for example, a protein different from NOVX protein and derived from the same or different organism). In a NOVX fusion protein, the NOVX polypeptide may correspond to all or a portion of the NOVX protein. In one embodiment, the NOVX fusion protein comprises at least one biologically active portion of the NOVX protein. In another embodiment, the NOVX fusion protein comprises at least two biologically active portions of the NOVX protein. In yet another embodiment, the NOVX fusion protein comprises at least three biologically active portions of the NOVX protein. In the fusion protein, the term “operably linked” is intended to indicate that the NOVX polypeptide and the non-NOVX polypeptide are fused together in frame. The non-NOVX polypeptide can be fused to the N-terminus or C-terminus of the NOVX polypeptide.
[0452]
In one embodiment, the fusion protein is a GST-NOVX fusion protein, wherein the NOVX sequence is fused to the C-terminus of the GST (glutathione S-transferase) sequence. Such fusion proteins can facilitate the purification of recombinant NOVX polypeptides.
[0453]
In another embodiment, the fusion protein is a NOVX protein comprising a heterologous signal sequence at its N-terminus. In certain host cells (eg, mammalian host cells), NOVX expression and / or secretion can be increased through the use of heterologous signal sequences.
[0454]
In yet another embodiment, the fusion protein is a NOVX-immunoglobulin fusion protein, wherein the NOVX sequence is fused to a sequence derived from a member of the immunoglobulin protein family. This NOVX-immunoglobulin fusion protein of the invention is incorporated into a pharmaceutical composition and administered to a subject to inhibit the interaction between NOVX ligand and NOVX protein on the surface of a cell, Can suppress NOVX-mediated signaling in vivo. This NOVX-immunoglobulin fusion protein can be used to affect the bioavailability of NOVX cognate ligands. Inhibition of the NOVX ligand / NOVX interaction may be therapeutically useful in treating both proliferative and differentiation disorders and modulating (eg, promoting or inhibiting) cell survival. In addition, this NOVX-immunoglobulin fusion protein of the invention can be used as an immunogen to produce anti-NOVX antibodies in a subject, can be used to purify NOVX ligands, and NOVX with NOVX ligands Can be used in screening assays to identify molecules that inhibit these interactions.
[0455]
The NOVX chimera or NOVX fusion protein of the invention can be produced by standard recombinant DNA techniques. For example, DNA fragments encoding different polypeptide sequences can be ligated according to conventional techniques, e.g., blunt or staggered ends for ligation, restriction enzyme digestion to provide appropriate ends, and optionally attached Cohesive end fill-in, alkaline phosphatase treatment to avoid undesired ligation, and enzymatic ligation ligate together in-frame. In another embodiment, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques including automated DNA synthesizers. Alternatively, PCR amplification of a gene fragment can be performed with an anchor primer that produces a complementary overhang between two consecutive gene fragments, which is then annealed and reamplified to produce a chimeric gene sequence. (See, for example, Ausubel et al. (Ed.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Moreover, many expression vectors are commercially available that already encode a fusion moiety (eg, a GST polypeptide). The nucleic acid encoding NOVX can be cloned into such an expression vector such that the fusion component is linked in-frame to the NOVX protein.
[0456]
(NOVX agonists and antagonists)
The invention also relates to variants of the NOVX protein that function as either NOVX agonists (ie, mimetics) or as NOVX antagonists. Variants of NOVX protein (eg, discrete point mutations or truncated forms of NOVX protein) can be generated by mutagenesis. An agonist of a NOVX protein may retain substantially the same biological activity, or a subset of that biological activity, as a naturally occurring form of NOVX protein. An antagonist of NOVX protein may inhibit one or more of the activities of naturally occurring forms of NOVX protein, for example, by competitively binding to downstream or upstream members of a cell signaling cascade comprising NOVX protein. Thus, certain biological effects can be induced by treatment with limited function variants. In one embodiment, treating a subject with a variant having a subset of a biologically active form of the naturally occurring form of the protein is subject to treatment with a naturally occurring form of the NOVX protein. There are even fewer side effects.
[0457]
NOVX protein variants that function as either NOVX agonists (ie, mimetics) or NOVX antagonists are combinatorial live variants of NOVX proteins (eg, truncated variants) for NOVX protein agonist activity or NOVX protein antagonist activity. Can be identified by screening the rally. In one embodiment, a versatile library of NOVX variants is generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level and encoded by a versatile gene library. A versatile library of NOVX variants, for example, from a degenerate set of potential NOVX sequences as individual polypeptides or in which a set of NOVX sequences is contained (eg, for phage display) A mixture of synthetic oligonucleotides can be produced by enzymatic ligation to a gene sequence so that it can be expressed as a large set of fusion proteins. There are various methods that can be used to generate a library of potential NOVX variants from a degenerate oligonucleotide sequence. Chemical synthesis of degenerate gene sequences can be performed in an automated DNA synthesizer, and then this synthetic gene is ligated into an appropriate expression vector. The use of a degenerate set of genes allows for the provision of all sequences that encode the desired set of potential NOVX sequences in one mixture. Methods for synthesizing degenerate oligonucleotides are well known in the art. For example, Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itura et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984. Science 198: 1056; Ike et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477.
[0458]
(Polypeptide library)
In addition, a library of NOVX protein coding sequence fragments can be used to generate a diverse population of NOVX fragments for screening and subsequent selection of NOVX protein variants. In one embodiment, the library of coding sequence fragments comprises treating a double stranded PCR fragment of the NOVX coding sequence with a nuclease under conditions that produce only about one nick per molecule, Regenerating this DNA to form double stranded DNA that may contain sense / antisense pairs from different nick products, S ₁ It can be generated by removing the single stranded portion from the duplex reshaped by treatment with nuclease and ligating the resulting fragment library into an expression vector. By this method, an expression library can be derived that encodes NV-terminal and internal fragments of various sizes of the NOVX protein.
[0459]
Various techniques are known in the art for screening gene products of combinatorial libraries generated by point mutations or truncations and for screening cDNA libraries of gene products having selected properties. Such techniques are applicable to rapid screening of gene libraries generated by combinatorial mutagenesis of NOVX proteins. The most widely used technique suitable for high-throughput analysis for screening large gene libraries is typically cloning gene libraries into replicable expression vectors and resulting vector libraries. Transforming appropriate cells and expressing the combinatorial gene under conditions that facilitate the detection of the desired activity that facilitates isolation of the vector encoding the gene from which the product was detected. A novel technique that increases the frequency of functional variants in the library, Recursive ensemble mutagenesis (REM), can be used in combination with screening assays to identify NOVX variants. For example, Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al., 1993. See Protein Engineering 6: 327-331.
[0460]
(Anti-NOVX antibody)
Antibodies to NOVX protein or fragments of NOVX protein are also included in the present invention. The term “antibody” as used herein refers to an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule and an immunoglobulin (Ig) molecule (ie, antigen binding that specifically binds (immunoreacts with an antigen) to an antigen). Molecule). Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, F _ab Fragment, F _{ab '} Fragment, and F _{(Ab ′) 2} Fragment, and F _ab Examples include, but are not limited to expression libraries. In general, antibody molecules obtained from humans relate to any of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD, which are different classes of heavy chains present in the molecule. Certain classes are similarly subclasses (eg, IgG ₁ , IgG ₂ Etc.). Furthermore, in humans, the light chain can be a kappa chain or a lambda chain. References herein to antibodies include references to all such classes, subclasses and types of human antibody species.
[0461]
The isolated NOVX-related proteins of the present invention can be intended to function as antigens or portions or fragments thereof, and further, using standard techniques for polyclonal and monoclonal antibody preparation, It can be used as an immunogen to generate antibodies that bind immunospecifically. The full-length protein can be used, or the present invention provides an antigenic peptide fragment of the antigen for use as an immunogen. An antigenic peptide fragment contains at least six amino acid residues of the amino acid sequence of the full-length protein, and an antibody raised against the peptide is specific immunity with the full-length protein or with any fragment containing this epitope. The epitope is included so as to form a complex. Preferably, the antigenic peptide comprises at least 10 amino acid residues, or at least 15 amino acid residues, or at least 20 amino acid residues, or at least 30 amino acid residues. Preferred epitopes encompassed by the antigenic peptide are regions of the protein located on its surface; usually these are hydrophilic regions.
[0462]
In certain embodiments of the invention, the at least one epitope comprised in the antigenic peptide is a region of the NOVX-related protein located on the surface of the NOVX-related protein, eg, a hydrophilic region. Hydrophobic analysis of human NOVX-related protein sequences indicates which regions of the NOVX-related protein are particularly hydrophilic and therefore likely to encode surface residues useful for targeting antibody production. As a means to target antibody production, hydropathy plots showing hydrophilic and hydrophobic regions, including, for example, the Kyte Doolittle or Hopp Woods method, either with or without Fourier transforms, It can be produced by any method known in the art. See, for example, Hopp and Woods, 1981, Proc., Each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Am. Mol. Biol. 157: 105-142. Antibodies specific for one or more domains within an antigenic protein or derivative, fragment, analog or homologue thereof are also provided herein.
[0463]
The proteins of the invention, or derivatives, fragments, analogs, homologs or orthologs thereof can be utilized as immunogens in the production of antibodies that immunospecifically bind to these protein components.
[0464]
Various procedures known in the art can be used for the production of polyclonal or monoclonal antibodies directed against the proteins of the invention, or derivatives, fragments, analogs, homologs or orthologs thereof (eg, Antibodies). : A Laboratory Manual, Harlow and Lane, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (incorporated herein by reference). Some of these antibodies are discussed below.
[0465]
(Polyclonal antibody)
For the production of polyclonal antibodies, various suitable host animals (eg, rabbits, goats, mice or other animals) can be obtained by one or more injections with the native protein, synthetic variants thereof, or derivatives described above. Can be immunized. Suitable immunogenic preparations can include, for example, naturally occurring immunogenic proteins, chemically synthesized polypeptides that exhibit immunogenic proteins, or recombinantly expressed immunogenic proteins . In addition, the protein can be conjugated to a second protein known to be immunogenic in the immunized mammal. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. The preparation can further include an adjuvant. Various adjuvants are used to increase the immunological response, such as Freund's adjuvant (complete and incomplete), mineral gels (eg aluminum hydroxide), surfactants (eg lysolecithin) , Pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, dinitrophenol, etc.), adjuvants that can be used in humans (eg, Bacilt Calmette-Guerin and Corynebacterium parvum) or similar immunostimulants, such as It is not limited to. Further examples of adjuvants that can be used include MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate).
[0466]
Polyclonal antibody molecules directed against an immunogenic protein can be isolated from a mammal (eg, from blood) and well-known techniques (eg, affinity chromatography using protein A or protein G, which It can be further purified by providing mainly the IgG fraction of immune serum)). Subsequently, or alternatively, the specific antigen or epitope of that antigen that is the target of the sought-after immunoglobulin can be immobilized on the column and the immunospecific antibody purified by immunoaffinity chromatography. Immunoglobulin purification is described, for example, in D.C. Wilkinson (The Scientist (issued by The Scientist, Inc., Philadelphia PA), Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pages 25-28).
[0467]
(Monoclonal antibody)
As used herein, the term “monoclonal antibody” (MAb) or “monoclonal antibody composition” refers to an antibody molecule comprising a unique molecular species of antibody molecules consisting of a unique light chain gene product and a unique heavy chain gene product. A group. In particular, the complementarity determining region (CDR) of a monoclonal antibody is identical to all molecules of this population. Thus, MAbs contain an antigen binding site capable of immunoreacting with a particular epitope of the antigen characterized by a unique binding affinity for the antigen.
[0468]
Monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma methods, such as those described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In the hybridoma method, a mouse, hamster, or other suitable host animal is typically immunized with an immune factor and produces or induces lymphocytes that produce antibodies that specifically bind to the immune factor. . Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro.
[0469]
The immune factor typically includes a protein antigen, a fragment thereof or a fusion protein thereof. Generally, whether peripheral blood lymphocytes are used when cells of human origin are desired, or whether spleen cells or lymph node cells are used when non-human mammalian sources are desired Either. A suitable fusion factor (eg, polyethylene glycol) is then used to fuse the lymphocytes to an immortal cell line to form hybridoma cells (Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press (1986) 59th. -103). Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells of rodent, bovine and human origin. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells can preferably be cultured in a suitable culture medium containing one or more substances (which inhibit the growth or survival of unfused immortalized cells). For example, if the parent cell lacks the enzyme, hypoxanthine annin phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the culture medium for the hybridoma typically comprises hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (“HAT medium”). "), These substances inhibit the growth of HGPRT-deficient cells.
[0470]
Preferred immortal cell lines are cell lines that fuse efficiently, support stable high level expression of antibody by selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. A more preferred immortal cell line is the mouse myeloma cell line, which can be from, for example, the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, and American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATION, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
[0471]
The culture medium in which the hybridoma cells are cultured can then be assayed for the presence of monoclonal antibodies directed against the antigen. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay (eg, radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)). The Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of monoclonal antibodies is described, for example, in Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980). Preferably, antibodies with a high degree of specificity and high binding affinity for the target antigen are isolated.
[0472]
After the desired hybridoma cells are identified, the clones can be subcloned by limiting dilution procedures and grown by standard methods. For example, suitable culture media for this purpose include Dulbecco's Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, the hybridoma cells can be grown in vivo as ascites in a mammal.
[0473]
Monoclonal antibodies secreted by subclones can be isolated or isolated from culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification procedures (eg, protein A sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography). Can be purified.
[0474]
Monoclonal antibodies can also be made by recombinant DNA methods, such as those described in US Pat. No. 4,816,567. DNA encoding the monoclonal antibodies of the invention can be readily obtained using conventional procedures (eg, by using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of mouse antibodies). Can be isolated and sequenced. The hybridoma cells of the invention serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector, which then contains host cells (eg, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not otherwise produce immunoglobulin proteins). To obtain synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. This DNA also includes, for example, substitutions of coding sequences for human heavy and light chain constant domains instead of homologous mouse sequences (US Pat. No. 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13). (1994)) or by covalent linkage of all or part of the coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide to an immunoglobulin coding sequence. Such non-immunoglobulin polypeptides can be used in place of the constant regions of the antibodies of the invention, or can be used in place of the variable domains of one antigen binding site of the antibodies of the invention, An antibody is produced.
[0475]
(Humanized antibody)
The antibody against the protein antigen of the present invention may further comprise a humanized antibody or a human antibody. These antibodies are suitable for administration to humans without causing a human immune response to the administered immunoglobulin. Humanized forms of antibodies include chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (eg, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′) ₂ Or other antigen binding sequences of antibodies), which are composed primarily of human immunoglobulin sequences and contain minimal sequences derived from non-human immunoglobulin. Humanization is performed by the method of Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,) By using rodent CDRs or CDR sequences in place of the corresponding sequences of human antibodies. Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). (See also US Pat. No. 5,225,539.) In some cases, Fv framework residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Humanized antibodies may also comprise residues that are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequences. In general, a humanized antibody comprises substantially all of at least one, and typically two variable domains. Of these, all or substantially all CDR regions correspond to regions of non-human immunoglobulin, and all or substantially all framework regions are regions of human immunoglobulin consensus sequences. Humanized antibodies also optimally comprise an immunoglobulin constant region (Fc), typically at least a portion of an immunoglobulin constant region of a human immunoglobulin (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta). Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)).
[0476]
(Human antibody)
A fully human antibody relates to an antibody molecule in which the entire entire sequence of both light and heavy chains, including the CDRs, originates from a human gene. Such antibodies are referred to herein as “human antibodies” or “fully human antibodies”. Human monoclonal antibodies can be prepared by trioma technology; human B cell hybridoma technology (see Kozbor et al., 1983 Immunol Today 4:72) and EBV hybridoma technology to produce human monoclonal antibodies (Cole et al. 1985: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pages 77-96). Human monoclonal antibodies can be used in the practice of the present invention and by the use of human hybridomas (see Cote et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) or in vitro Epstein-Barr -Can be produced by transformation of human B cells with viruses (see Cole et al., 1985: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
[0477]
In addition, human antibodies can also be used in additional techniques (phage display libraries (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991))). Can be produced using Similarly, human antibodies can be made by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals (eg, mice in which the endogenous immunoglobulin genes have been partially or completely inactivated). Production of human antibodies was observed upon challenge, which closely resembles that observed in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. This approach is described, for example, in US Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, and Marks et al. (Bio / Technology 10, 779-783 (1992)); Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994)); Morrison (Nature) 368, 812-13 (1994)); Fishwild et al. (Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)); Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996)); and Lonberg and Huszar (Intern. Re. .Immunol.13 65-93 (1995)).
[0478]
Human antibodies can be further produced using transgenic non-human animals that have been modified to produce fully human antibodies rather than the animal's endogenous antibodies in response to challenge with an antigen. (See PCT Publication WO 94/02602). Endogenous genes encoding heavy and light chain immunoglobulins in non-human hosts have been disabled and the active locus encoding human heavy and light chain immunoglobulins is Inserted into the genome. For example, human genes are integrated using yeast artificial chromosomes that contain essential human DNA segments. Animals that provide all the desired modifications are then obtained as offspring by mating intermediate transgenic animals that contain fewer modified complements than fully modified complements. A preferred embodiment of such a non-human animal is a mouse, Xenomouse as disclosed in PCT Publications WO 96/33735 and WO 96/34096. ^TM Called. This animal produces B cells that fully secrete human immunoglobulins. Obtaining an antibody directly from an animal after immunization with the immunogen of interest (eg, as a polyclonal antibody preparation) or from immortalized B cells from the animal (eg, a hybridoma producing a monoclonal antibody). Is possible. In addition, genes encoding immunoglobulins with human variable regions can be recovered and expressed to obtain antibodies directly, or further modified to obtain antibody analogs (eg, single chain Fv molecules). obtain.
[0479]
An example of a method for generating a non-human host (illustrated as a mouse) that lacks expression of an endogenous immunoglobulin heavy chain is disclosed in US Pat. No. 5,939,598. It can be obtained by a method comprising the following steps: deleting this J segment gene from at least one endogenous heavy chain locus in embryonic stem cells, preventing reorganization of this locus, And preventing the formation of transcripts of the rearranged immunoglobulin heavy chain locus, wherein the deletion is effected by targeting a vector comprising a gene encoding a selectable marker, And a step of producing a transgenic mouse comprising a gene encoding a marker selectable by the somatic cells and germ cells from the embryonic stem cells.
[0480]
Methods for producing antibodies of interest (eg, human antibodies) are disclosed in US Pat. No. 5,916,771. It includes the following steps: introducing an expression vector comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain into one mammalian host cell in culture, an expression vector comprising a nucleotide sequence encoding a light chain in another Introducing into a mammalian host cell, and fusing the two cells to form a hybrid cell. Hybrid cells express antibodies comprising heavy and light chains.
[0481]
In a further improvement of this procedure, a method for identifying clinically relevant epitopes on an immunogen, and a related method for selecting antibodies that immunospecifically bind to a relevant epitope with high affinity is described in PCT Publication. It is disclosed in WO99 / 53049.
[0482]
(F _ab Fragments and single chain antibodies)
In accordance with the present invention, techniques can be adapted for the production of single chain antibodies specific for the antigenic proteins of the invention (see, eg, US Pat. No. 4,946,778). In addition, F _ab Methods can be adapted for the construction of expression libraries (see, eg, Huse et al., 1989 Science 246: 1275-1281) and have the desired specificity for a protein or derivative, fragment, analog or homologue thereof. Monoclonal F _ab Allows rapid and effective identification of fragments. Antibody fragments comprising idiotypes against protein antigens can be produced by techniques known in the art, including but not limited to: (i) F produced by pepsin digestion of antibody molecules. _{(Ab ′) 2} Fragment; (ii) F _{(Ab ′) 2} F produced by reducing the disulfide bridge of the fragment _ab Fragments; (iii) F produced by treatment of antibody molecules with papain and a reducing agent _ab Fragment, and (iv) F _v Fragment.
[0483]
(Bispecific antibody)
Bispecific antibodies are monoclonal antibodies (preferably human monoclonal antibodies or humanized monoclonal antibodies) that have binding specificities for at least two different antigens. In this case, one of the binding specificities is for the antigenic protein of the invention. The second binding target is any other antigen, and this second binding target is advantageously a cell surface protein or a receptor or receptor subunit.
[0484]
Methods for making bispecific antibodies are known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy chain / light chain pairs, where the two heavy chains have different specificities ( Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Due to the random combination of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) create a potential mixture of 10 different antibody molecules, only one of which is accurate bispecific It has a structure. This accurate molecular purification is usually accomplished by an affinity chromatography step. Similar procedures are described in WO 93/08829 published May 13, 1993, and Traunecker et al., 1991 EMBO J. et al. 10: 3655-3659.
[0485]
Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. This fusion preferably has an immunoglobulin heavy chain constant domain and comprises at least part of the hinge, CH2, and CH3 regions. It is preferred to have a first heavy chain constant region (CH1) containing the site necessary for light chain binding present in at least one of the fusions. The immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the DNA encoding the immunoglobulin light chain are inserted into separate expression vectors and cotransfected into a suitable host organism. For further details of generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
[0486]
According to another approach described in WO 96/27011, the interface between a pair of antibody molecules can be manipulated to maximize the percentage of heterodimers recovered from the recombinant cell culture. A preferred interface includes at least a portion of the CH3 region of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg tyrosine or tryptophan). A complementary “cavity” of the same or similar size as the large side chain is the interface of the second antibody molecule by replacing the large amino acid side chain with a small amino acid side chain (eg, alanine or threonine). Generated on top. This provides a mechanism for increasing the yield of heterodimers over other unwanted end products such as homodimers.
[0487]
Bispecific antibodies can be full length antibodies or antibody fragments (eg, F (ab ′) ₂ Bispecific antibodies). Techniques for making bispecific antibodies from antibody fragments are described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science 229: 81 (1985), in which an intact antibody is proteolytically cleaved and F (ab ′) ₂ A procedure for making a fragment is described. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. This produced Fab ′ fragment is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab′-TNB derivatives is then reconverted to Fab′-thiol by reduction with mercaptoethylamine, which is mixed with an equimolar amount of other Fab′-TNB derivatives to produce bispecific antibodies. Form. The generated bispecific antibody can be used as an agent for the selective immobilization of enzymes.
[0488]
In addition, Fab ′ fragments are can be recovered directly from E. coli and chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) is a fully humanized bispecific antibody F (ab ′) ₂ Describes the generation of molecules. Each Fab ′ fragment is labeled with E. coli. secreted separately from E. coli and subjected to in vitro directed chemical coupling to form bispecific antibodies. Thus, this bispecific antibody formed can bind to cells overexpressing ErbB2 receptor and normal human T cells and triggers the lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets Can do.
[0489]
Various techniques for making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. For example, bispecific antibodies are produced using leucine zippers. Koselny et al. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides from Fos and Jun proteins were linked to the Fab ′ portions of two different antibodies by gene fusion. This antibody homodimer was reduced at the hinge region to form a monomer and then reoxidized to form an antibody heterodimer. This method can also be used for the production of antibody homodimers. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), this “diabody” technique provided an alternative mechanism for making bispecific antibody fragments. This fragment is too short to allow the light chain variable domain (V _L ) Connected to the heavy chain variable domain (V _H )including. Thus, one fragment's V _H Domain and V _L A domain is a complementary V of another fragment. _L Domain and V _H Forced to pair with the domain, this forms two antigen binding sites. Another strategy for making bispecific antibody fragments by the use of single chain Fv (sFv) dimers has also been reported. Gruber et al. Immunol. 152: 5368 (1994).
[0490]
Antibodies with a valency greater than 2 are contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. Immunol. 147: 60 (1991).
[0491]
Exemplary bispecific antibodies can bind to two different epitopes, at least one of which originates from the protein antigen of the invention. Alternatively, the anti-antigenic arm of an immunoglobulin molecule is an attractant molecule on a leukocyte such as a T cell receptor molecule (eg, CD2, CD3, CD28, or B7), or an Fc receptor for IgG (FcγR) (eg, FcγRI ( CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16)) can bind to the arm, and the cellular defense mechanism is concentrated in cells expressing this particular antigen. Bispecific antibodies can also be used to direct cytotoxic factors against cells expressing a particular antigen. These antibodies possess an antigen binding arm and an arm that binds to a cytotoxic agent or radionuclide chelator (eg, EOTUBE, DPTA, DOTA, or TETA). Another bispecific antibody of interest binds to the protein antigen described herein and further binds to tissue factor (TF).
[0492]
(Heteroconjugate antibody)
Heterozygous antibodies are also within the scope of the present invention. Heterozygous antibodies are composed of two covalently bound antibodies. Such antibodies are used, for example, to target immune system cells to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980) and for the treatment of HIV infection (WO91 / 00360; WO92 / 003733). EP03089) has been proposed. It is contemplated that this antibody can be prepared in vitro using methods known in synthetic protein chemistry, including methods involving cross-linking agents. For example, immunotoxins can be constructed by use of disulfide exchange reactions or formation of thioether bonds. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate and the reagents disclosed, for example, in US Pat. No. 4,676,980.
[0493]
(Effector function operation)
It may be desirable to modify the antibodies of the invention with respect to effector function, eg, to increase the efficacy of the antibody in the treatment of cancer. For example, cysteine residues can be introduced into the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. Thus, this homodimeric antibody produced may have improved internalization capabilities and / or increased complement-mediated cell killing, as well as antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Caron et al. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. et al. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with increased anti-tumor activity can also be prepared using heterobifunctional crosslinkers as described in Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, the antibody can be engineered, which has a double Fc region and thereby has increased complement lysis and ADCC capabilities. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).
[0494]
(Immunoconjugate)
The invention also includes cytotoxic agents (eg, chemotherapeutic agents, toxins (eg, enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or fragments thereof), or radioisotopes ( That is, it relates to an immunoconjugate comprising an antibody conjugated to a radioconjugate)).
[0495]
Chemotherapeutic agents useful in making such immunoconjugates are described above. Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modedecin ) A chain, α-sarcin, Aleurites fordiii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPIII, and PAP-S), mordicica charantia inhibitor, curcin, crotin, croton officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin lin), restrictocin, phenomycin, enomycin, and trichothecene. A variety of radionuclides are available for the production of radioconjugated antibodies. For example, ²¹² Bi, ¹³¹ I, ¹³¹ In, ⁹⁰ Y, and ¹⁸⁶ Re.
[0496]
Conjugates of antibodies and cytotoxic factors include various bifunctional protein binding factors such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imide ester Bifunctional derivatives (eg dimethyl adipimidate HCL), active esters (eg disuccinimidyl suberate), aldehydes (eg glutaraldehyde), bisazide compounds (eg bis (p-azidobenzoyl) ) Hexanediamine), bis-diazonium derivatives (eg, bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (eg, triene 2,6-diisocyanate), and bis-activated fluorinated compounds Product (eg, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene). For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for the attachment of radionucleotides to antibodies. See WO94 / 11026.
[0497]
In another embodiment, the antibody can be conjugated to a “receptor” (eg, streptavidin) for use in tumor pre-targeting, wherein the antibody-receptor conjugate is administered to the patient, followed by Unbound conjugate is removed from the circulation using a scavenger, and then a “ligand” (eg, avidin) that binds in turn to the cytotoxic agent is administered.
[0498]
In one embodiment, methods for screening for antibodies possessing the desired specificity include enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and other immunologically mediated techniques known in the art. Examples include, but are not limited to: In certain embodiments, the selection of antibodies that are specific for a particular domain of NOVX protein is facilitated by the generation of hybridomas that bind to fragments of NOVX protein that possess such domain. Accordingly, also provided herein are antibodies that are specific for the desired domain within the NOVX protein, or derivative, fragment, analog or homologue thereof.
[0499]
Anti-NOVX antibodies can be used in methods known in the art for localization and / or quantification of NOVX proteins (eg, for use in measuring the level of NOVX protein in an appropriate physiological sample For use in automated methods, for use in protein imaging, etc.). In certain embodiments, antibodies (including antibody-derived binding domains) to NOVX proteins, or derivatives, fragments, analogs or homologs thereof, are pharmacologically active compounds (hereinafter “therapeutic”). Agent ").
[0500]
Anti-NOVX antibodies (eg, monoclonal antibodies) can be used to isolate NOVX polypeptides by standard techniques (eg, affinity chromatography or immunoprecipitation). Anti-NOVX antibodies can facilitate the purification of native NOVX polypeptides from cells and recombinantly produced NOVX polypeptides expressed in host cells. In addition, anti-NOVX antibodies can be used to detect NOVX protein (eg, in cell lysates or cell supernatants) to assess the amount and pattern of NOVX protein expression. Anti-NOVX antibodies can be used diagnostically to monitor protein levels in tissues, for example, as part of a clinical trial procedure, to determine the effectiveness of a given treatment regimen. Detection can be facilitated by coupling (ie, physically linking) the antibody to a detectable substance. Examples of detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials and radioactive materials. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase or acetylcholinesterase; examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; Examples of such fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride, or phycoerythrin; examples of luminescent materials include luminol; Examples of luminescent materials include luciferase, luciferin and aequorin; and examples of suitable radioactive materials ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ³⁵ S or ³ H.
[0501]
(NOVX recombinant expression vector and host cell)
Another aspect of the invention relates to a vector, preferably an expression vector, comprising a nucleic acid encoding NOVX protein, or a derivative, fragment, analog or homologue thereof. As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. One type of vector is a “plasmid”. This refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated. Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which the vectors are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication, and episomal mammalian vectors). Other vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) are integrated into the host cell genome upon introduction into the host cell and are thereby replicated along with the host genome. In addition, certain vectors can direct the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as “expression vectors”. In general, expression vectors useful in recombinant DNA technology are often in the form of plasmids. In the present specification, “plasmid” and “vector” may be used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the present invention is intended to include such other forms of expression vectors, such as viral vectors (eg, replication defective retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses) that perform equivalent functions. .
[0502]
The recombinant expression vectors of the invention comprise a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression of the nucleic acid in a host cell. This means that the recombinant expression vector contains one or more regulatory sequences selected based on the host cell used for expression, operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed. In a recombinant expression vector, “operably linked” refers to a nucleotide sequence of interest (eg, in an in vitro transcription / translation system, or in a host cell if the vector is introduced into a host cell). It is intended to mean linked to regulatory sequences in a manner that allows expression of the sequences.
[0503]
The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). Such regulatory sequences are described, for example, by Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulatory sequences include sequences that direct constitutive expression of nucleotide sequences in many types of host cells and sequences that direct expression of nucleotide sequences only in specific host cells (eg, tissue specific regulatory sequences). It will be appreciated by those skilled in the art that the design of the expression vector can depend on factors such as the choice of host cell to be transformed, the level of expression of the desired protein, and the like. The expression vectors of the present invention can be introduced into a host cell, whereby proteins or peptides (including fusion proteins or fusion peptides) encoded by the nucleic acids described herein (eg, NOVX proteins, NOVX proteins) Mutant forms, fusion proteins, etc.) can be produced.
[0504]
The recombinant expression vectors of the invention can be designed for NOVX protein expression in prokaryotic or eukaryotic cells. For example, NOVX protein can be expressed in bacterial cells (eg, Escherichia coli), insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast cells or mammalian cells. Suitable host cells include Goeddel; GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternatively, the recombinant expression vector can be transcribed and translated in vitro, for example using T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
[0505]
Protein expression in prokaryotes is most often performed in Escherichia coli using a vector containing a constitutive or inducible promoter that directs the expression of either a fusion or non-fusion protein. A fusion vector adds a number of amino acids to the protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein. Such fusion vectors typically serve the following three purposes: (i) to increase expression of the recombinant protein; (ii) to increase the solubility of the recombinant protein; and ( iii) to assist in the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification. Often, in fusion expression vectors, a proteolytic cleavage site is introduced at the junction of the fusion moiety and the recombinant protein, allowing the recombinant protein to be separated from the fusion moiety after purification of the fusion protein. . Such enzymes, and their cognate recognition sequences, include Factor Xa, thrombin, and enterokinase. Exemplary fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Inc .; Smith and Johnson (1988), which fuse glutathione S-transferase (GST), maltose E binding protein, or protein A to a target recombinant protein, respectively. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) And pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ).
[0506]
Suitable inducible non-fused E. Examples of E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d (Studier et al. -89).
[0507]
E. One strategy for maximizing recombinant protein expression in E. coli is to express the protein in a host bacterium that lacks the ability to proteolytically cleave the recombinant protein. See, for example, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Another strategy is that the individual codons for each amino acid are E. coli. changing the nucleic acid sequence of a nucleic acid inserted into an expression vector to be a codon preferentially used in E. coli (see, eg, Wada et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118). ) Such alteration of the nucleic acid sequences of the present invention can be performed by standard DNA synthesis techniques.
[0508]
In another embodiment, the NOVX expression vector is a yeast expression vector. Examples of vectors for expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae include pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJ. (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), And picZ (InVitrogen Corp., San Diego, Calif.).
[0509]
Alternatively, NOVX can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors. Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells (eg, SF9 cells) include the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series. (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
[0510]
In yet another embodiment, the nucleic acids of the invention are expressed in mammalian cells using a mammalian expression vector. Examples of mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). When used in mammalian cells, the expression vector's control functions are often provided by viral regulatory elements. For example, commonly used promoters are derived from polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus, and simian virus 40. For other expression systems suitable for both prokaryotic and eukaryotic cells, see, for example, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.A. Y. , 1989, chapters 16 and 17.
[0511]
In another embodiment, the recombinant mammalian expression vector can direct the expression of the nucleic acid preferentially in a particular cell type (eg, expressing the nucleic acid using a tissue-specific regulatory element). Tissue specific regulatory elements are known in the art. Non-limiting examples of suitable tissue specific promoters include albumin promoters (liver specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymph specific promoters (Callame and Eaton (1988) Adv). Immunol.43: 235-275) (in particular, T cell receptor promoters (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) and immunoglobulin promoters (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740). Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748)), neuron-specific promoters (eg, neurofilament promoters; Byrne and Ruddle (198); 9) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), pancreas specific promoter (Edrund et al. (1985) Science 230: 912-916), and mammary gland specific promoter (eg, whey promoter; No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264,166). Developmentally regulated promoters are also included (eg, mouse hox promoter (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and α-fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-). 546)).
[0512]
The invention further provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule of the invention cloned into the expression vector in antisense orientation. That is, the DNA molecule is operably linked to regulatory sequences in a manner that allows expression (by transcription of the DNA molecule) of an RNA molecule that is antisense to NOVX mRNA. Can regulatory sequences (eg, viral promoters and / or enhancers) operably linked to nucleic acids cloned in the antisense orientation that direct the sustained expression of antisense RNA molecules in various cell types can be selected? Alternatively, regulatory sequences that direct constitutive, tissue-specific, or cell type-specific expression of antisense RNA can be selected. Antisense expression vectors can be in the form of recombinant plasmids, phagemids, or attenuated viruses, where the antisense nucleic acid is produced under the control of a high efficiency regulatory region and its activity is introduced into the vector. Cell type. See, eg, Weintraub et al., “Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis”, Reviews-Trends in Genetics, Volume 1 (1) 1986, for discussion of gene expression regulation using antisense genes.
[0513]
Another aspect of the present invention relates to a host cell into which the recombinant expression vector of the present invention has been introduced. The terms “host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably herein. It is understood that such terms refer not only to a particular test cell, but also to the progeny or potential progeny of such a cell. Such progeny may not actually be identical to the parental cell, as certain modifications may occur in subsequent generations, either due to mutations or environmental influences, although it is noted herein that Included within the scope of this term when used in the document.
[0514]
The host cell can be any prokaryotic or eukaryotic cell. For example, NOVX protein can be expressed in bacterial cells (eg, E. coli), insect cells, yeast or mammalian cells (eg, Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells). Other suitable host cells are known to those skilled in the art.
[0515]
Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques. As used herein, the terms “transformation” and “transfection” refer to various art-accepted techniques for introducing exogenous nucleic acid (eg, DNA) into a host cell. These include calcium phosphate coprecipitation or calcium chloride coprecipitation, DEAE dextran mediated transfection, lipofection, or electroporation. Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory. 1989) and other laboratory manuals.
[0516]
For stable mammalian cell transfection, it is known that only a small portion of the cell can integrate foreign DNA into its genome, depending on the expression vector and transfection technique used. In order to identify and select these components, a gene that encodes a selectable marker (eg, resistance to antibiotics) is generally introduced into the host cells along with the gene of interest. Various selectable markers include those that confer resistance to drugs (eg, G418, hygromycin, and methotrexate). Nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding NOVX or can be introduced on a separate vector. Cells stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (eg, cells that have incorporated the selectable marker gene survive, while other cells die).
[0517]
The host cells of the invention (eg, prokaryotic or eukaryotic host cells in culture) can be used to produce (ie, express) NOVX protein. Thus, the present invention further provides a method for producing NOVX protein using the host cells of the present invention. In one embodiment, the method comprises culturing a host cell of the invention, into which a recombinant expression vector encoding NOVX protein has been introduced, in a suitable medium such that NOVX protein is produced. The process of carrying out is included. In another embodiment, the method further comprises isolating the NOVX protein from the medium or the host cell.
[0518]
(Transgenic NOVX animals)
The host cells of the invention can also be used to produce non-human transgenic animals. For example, in one embodiment, the host cell of the invention is a fertilized oocyte or embryonic stem cell into which a NOVX protein coding sequence has been introduced. Such host cells can then be used to create non-human transgenic animals in which exogenous NOVX sequences have been introduced into the genome, or homologous recombinant animals in which endogenous NOVX sequences have been altered. Such animals are useful for studying the function and / or activity of NOVX protein and for identifying and / or evaluating modulators of NOVX protein activity. As used herein, a “transgenic animal” is a non-human animal, preferably a mammal, more preferably a rodent such as a rat or mouse, where One or more cells of the animal contain the transgene. Other examples of transgenic animals include non-human primates, sheep, dogs, cows, goats, chickens, amphibians and the like. The transgene is integrated into the genome of the cell from which the transgenic animal develops and remains in the genome of the mature animal, thereby expressing the gene product encoded in one or more cell types or tissues of the transgenic animal. Is an exogenous DNA. As used herein, a “homologous recombinant animal” is a non-human animal, preferably a mammal, more preferably a mouse, in which the endogenous NOVX gene is Altered by homologous recombination between the endogenous gene and an exogenous DNA molecule introduced into the animal's cells (eg, the animal's embryonic cells) prior to the animal's development.
[0519]
The transgenic animals of the present invention introduce a nucleic acid encoding NOVX (eg, by microinjection, retroviral infection) into the male pronucleus of a fertilized oocyte, and the oocyte is a pseudopregnant female rearing animal (Foster animal). SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 human NOVX cDNA sequences can be introduced as transgenes into the genome of non-human animals. Alternatively, a non-human homologue of the human NOVX gene (eg, the mouse NOVX gene) can be isolated based on hybridization to human NOVX cDNA (described further above) and used as a transgene. Intron sequences and polyadenylation signals can also be included in the transgene to increase the efficiency of expression of the transgene. Tissue specific regulatory sequences can be operably linked to the NOVX transgene to direct expression of the NOVX protein to specific cells. Methods for producing transgenic animals (especially animals such as mice) via embryo manipulation and microinjection have become conventional in the art and are described, for example, in US Pat. No. 4,736,866. No. 4,870,009; and No. 4,873,191; and Hogan 1986, MANIPULATING THE MOUSE EMBRYYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N .; Y. It is described in. Similar methods are used for the production of other transgenic animals. A transgenic founder animal can be identified based on the presence of a NOVX transgene in its genome and / or the expression of NOVX mRNA in the tissues or cells of the animal. The transgenic founder animal can then be used to breed additional animals carrying the transgene. In addition, transgenic animals having transgenes encoding NOVX proteins can be further crossed to other transgenic animals having other transgenes.
[0520]
In order to produce a homologous recombinant animal, a vector containing at least a part of the NOVX gene is prepared. Here, deletions, additions or substitutions have been introduced into this gene, thereby altering its NOVX gene (eg, functionally disrupted). The NOVX gene is a human gene (eg, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55), but more preferably a non-human homologue of the human NOVX gene. For example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, Mouse homologues of the 47, 49, 51, 53 and 55 human NOVX genes can be used to construct appropriate homologous recombination vectors to alter the endogenous NOVX gene in the mouse genome. In one embodiment, the vector is designed such that upon homologous recombination, its endogenous NOVX gene is functionally disrupted (ie, no longer encodes a functional protein; also referred to as a “knockout” vector) )
[0521]
Alternatively, the vector can be designed to encode an endogenous NOVX gene that is mutated or otherwise altered upon homologous recombination but still encodes a functional protein (eg, upstream regulation). Regions may be altered, thereby altering the expression of endogenous NOVX protein). In a homologous recombination vector, the altered portion of the NOVX gene is flanked at its 5 ′ and 3 ′ ends by additional nucleic acids of the NOVX gene, so that homologous recombination is carried out by the vector by exogenous NOVX. Allows to occur between the gene and the endogenous NOVX gene in embryonic stem cells. The additional flanking NOVX nucleic acid is long enough for successful homologous recombination with the endogenous gene. Typically, several kilobases of flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) are included in the vector. For example, see Thomas et al. (1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vectors. This vector is then introduced into an embryonic stem cell line (eg, by electroporation) and cells in which the introduced NOVX gene is homologously recombined with the endogenous NOVX gene are selected (eg, Li et al. ( 1992) Cell 69: 915).
[0522]
The selected cells are then injected into undifferentiated germ cells of an animal (eg, a mouse) to form an aggregate chimera. For example, see Bradley (1987), TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, edited by Robertson, IRL, Oxford, pages 113-152. The chimeric embryo can then be transferred to an appropriate pseudopregnant female rearing animal, and the embryo is delivered. Offspring that carry the homologously recombined DNA in its germ cells can be used to breed animals, where all cells of this animal have been homologously recombined by germline transmission of the transgene. Contains DNA. Methods for constructing homologous recombination vectors and animals are further described below; Bradley (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; PCT International Publication Numbers: WO90 / 11354; WO91 / 01140; WO92 / 0968; and WO93 / 04169.
[0523]
In another embodiment, transgenic non-human animals can be produced that contain selected systems that allow for regulated expression of the transgene. One example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. For a description of the cre / loxP recombinase system, see, eg, Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236. Another example of the recombinase system is the Saccharomyces cerevisiae FLP recombinase system (see O'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355). If the cre / loxP recombinase system is used to regulate transgene expression, an animal containing a transgene encoding both the Cre recombinase and the selected protein is required. Such an animal is, for example, a “double” trans by mating two transgenic animals, one containing a transgene encoding a selected protein and the other containing a transgene encoding a recombinase. It can be provided by the construction of a transgenic animal.
[0524]
Non-human transgenic animal clones described herein can also be produced according to the methods described in Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813. Briefly, cells (eg, somatic cells) from a transgenic animal can be isolated and exit the growth cycle to generate G ₀ It can be induced to enter a period. The quiescent cells can then be fused to enucleated oocytes from the same animal from which the quiescent cells were isolated, for example, by use of electric pulses. The reconstructed oocyte is then cultured so that the cell develops into morula or undifferentiated germ cells and then transferred to pseudopregnant female rearing animals. The offspring born from this female rearing animal is a clone of the animal from which the cell (eg, its somatic cell) was isolated.
[0525]
(Pharmaceutical composition)
NOVX nucleic acid molecules, NOVX proteins, and anti-NOVX antibodies of the present invention (also referred to herein as “active compounds”), and their derivatives, fragments, analogs, and homologs are suitable pharmaceutical compositions for administration Can be incorporated into. Such compositions typically comprise the nucleic acid molecule, protein or antibody, and a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic, which are compatible with pharmaceutical administration. It is intended to include agents, delaying agents and the like. Suitable carriers are described in the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (a standard reference textbook in the field, which is incorporated herein by reference). Preferred examples of such carriers or diluents include, but are not limited to water, saline, Ringer's solution, dextrose solution, and 5% human serum albumin. Liposomes and non-aqueous vehicles such as non-volatile oils can also be used. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. Except insofar as any conventional media or agent is incompatible with the active compound, its use in the composition is contemplated. Supplementary active compounds can also be incorporated into the compositions.
[0526]
A pharmaceutical composition of the invention is formulated to be compatible with its intended route of administration. Examples of routes of administration include parenteral (eg, intravenous, intradermal, subcutaneous) administration, oral (eg, inhalation) administration, transdermal (ie, topical) administration, transmucosal administration, and rectal administration. Is mentioned. Solutions or suspensions used for parenteral, intradermal or subcutaneous application may contain the following components: water for injection, saline solution, non-volatile oil, polyethylene glycol, glycerin, propylene glycol or others Sterile diluents such as synthetic solvents of; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); acetic acid Buffers such as salt, citrate or phosphate, and drugs for tonicity adjustment such as sodium chloride or dextrose. The pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. The parenteral preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple dose vials made of glass or plastic.
[0527]
Pharmaceutical compositions suitable for infusion use include sterile aqueous solutions (where water soluble) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, bacteriostatic water, Cremophor EL ^TM (BASF, Parsippany, NJ) or phosphate buffered saline (PBS). In all cases, the composition must be sterile and should be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example: water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size (in the case of dispersion) and by using surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents (eg, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, etc.). In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols (eg, mannitol, sorbitol), sodium chloride in the composition. Prolonged absorption periods of injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
[0528]
Sterile injectable solutions incorporate the required amount of this active compound (eg, NOVX protein or anti-NOVX antibody) with one or a combination of the above-listed components in a suitable solvent, followed It can be prepared by filter sterilization. Generally, dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the methods of preparation are vacuum drying and lyophilization, whereby the active ingredient and any further desired ingredient powders are pre-sterilized and filtered from the solution. obtain.
[0529]
Oral compositions generally include an inert diluent or an edible carrier. These can be enclosed in gelatin capsules or compressed into tablets. For the purpose of oral therapeutic administration, the active compound can be incorporated with excipients and used in the form of tablets, troches, or capsules. Oral compositions can also be prepared using a fluid carrier for use as a mouthwash, where the compound in the fluid carrier is applied orally and swished. And then exhaled or swallowed. Pharmaceutically compatible binding agents, and / or adjuvant materials can be included as part of the composition. Tablets, pills, capsules, lozenges, etc. may contain any of the following ingredients or compounds having similar properties: binders (eg microcrystalline cellulose, gum tragacanth or gelatin); excipients (eg starch Or lactose), disintegrants (eg, alginic acid, Primogel, or corn starch); lubricants (eg, magnesium stearate or Sterotes); lubricants (eg, colloidal silicon dioxide); Sweeteners (eg, sucrose or saccharin); or flavoring agents (eg, peppermint, methyl salicylate, or orange flavor).
[0530]
For administration by inhalation, the compound is delivered in the form of an aerosol spray from pressured container or dispenser that contains a suitable propellant (eg, a gas such as carbon dioxide), or a nebulizer.
[0531]
Systemic administration can also be obtained by transmucosal or transdermal means. For transmucosal or transdermal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are used in the formulation. Such penetrants are generally known in the art and include, for example, for transmucosal administration, surfactants, bile salts, and fusidic acid derivatives. Transmucosal administration can be accomplished through the use of nasal sprays or suppositories. For transdermal administration, the active compounds are formulated into ointments, salves, gels, or creams as generally known in the art.
[0532]
The compounds can also be prepared in the form of suppositories (eg, with conventional suppository bases such as cocoa butter and other glycerides) or retention enemas for rectal delivery.
[0533]
In one embodiment, the active compound is prepared with a carrier that protects the compound against rapid elimination from the body (eg, a controlled release formulation), including implants and microencapsulation. Delivered systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Methods for the preparation of such formulations will be apparent to those skilled in the art. These materials are also available from Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Commercially available. Liposomal suspensions (including liposomes targeted to cells infected with monoclonal antibodies to viral antigens) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These can be prepared according to methods known to those skilled in the art, for example, as described in US Pat. No. 4,522,811.
[0534]
It is especially advantageous to formulate oral or parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form as used herein refers to a physically individual unit suitable as a unit dosage for the subject to be treated; each unit is as desired in connection with the required pharmaceutical carrier. Contains a predetermined amount of active compound calculated to produce a therapeutic effect. Details about the dosage unit form of the present invention are determined by the unique characteristics of the active compound and the particular therapeutic effect to be achieved, as well as limitations inherent in the field of formulating such active compounds for the treatment of individuals. And depends directly on these.
[0535]
The nucleic acid molecules of the invention can be inserted into vectors and used as gene therapy vectors. Gene therapy vectors can be administered to a subject, for example, by intravenous injection, local administration (see US Pat. No. 5,328,470) or stereotaxic injection (see, eg, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). The pharmaceutical preparation of the gene therapy vector can include the gene therapy vector in an acceptable diluent or can include a sustained release matrix in which the gene delivery vehicle is embedded. Alternatively, where the complete gene delivery vector can be produced intact from recombinant cells (eg, a retroviral vector), the pharmaceutical preparation can include one or more cells that produce the gene delivery system.
[0536]
The pharmaceutical composition can be included in a container, package, or dispenser along with instructions for administration.
[0537]
(Screening and detection methods)
The isolated nucleic acid molecules of the invention, as described further below, express NOVX protein (eg, via a recombinant expression vector in a host cell in gene therapy applications), so that NOVX mRNA (eg, , In biological samples) or to detect genetic damage in the NOVX gene, as well as to modulate NOVX activity. In addition, NOVX protein has decreased activity or abnormality to screen for drugs or compounds that modulate NOVX protein activity or expression, as well as due to insufficient or excessive production of NOVX protein or compared to NOVX wild-type protein. Disorders characterized by the production of NOVX protein forms with various activities (eg; diabetes (modulating insulin release); obesity (binding and transporting lipids); obesity-related metabolic disorders, metabolic syndrome X, and anorexia And can be used to treat debilitating disorders associated with chronic diseases and various cancers, and infectious diseases (having antibacterial activity, and various dyslipidemias). Further, the anti-NOVX antibodies of the present invention can be used to detect and isolate NOVX proteins and to modulate NOVX activity. In yet a further aspect, the present invention can be used in methods that affect appetite, nutrient absorption, and processing of metabolic substrates in both positive and negative ways.
[0538]
The invention further relates to novel agents identified by the screening assays described herein and their use for treatment as described herein above.
[0539]
(Screening assay)
The present invention relates to candidate or test compounds or agents (eg, peptides, Methods for identifying peptidomimetics, small molecules or other drugs (also referred to herein as “screening assays”) are provided. The present invention also includes compounds identified in the screening assays described herein.
[0540]
In one embodiment, the invention provides a candidate or test compound that binds to or modulates the activity of a membrane-bound form of a NOVX protein or polypeptide, or biologically active portion thereof. An assay for screening is provided. Test compounds of the invention can be obtained using any of a number of approaches in combinatorial library methods known in the art, including: biological libraries; spatially located Possible parallel solid phase or solution phase libraries; synthetic library methods requiring deconvolution; “one bead one compound” library method; and synthetic library methods using affinity chromatography selection. The biological library approach is limited to peptide libraries, but the other four approaches are applicable to small molecule libraries of peptides, non-peptide oligomers or compounds (eg, Lam (1997) Anticancer Drug). (See Design 12: 145).
[0541]
As used herein, “small molecule” is meant to refer to a composition having a molecular weight of less than about 5 kD, most preferably less than about 4 kD. Small molecules can be, for example, nucleic acids, peptides, polypeptides, peptidomimetics, carbohydrates, lipids or other organic or inorganic molecules. Libraries of chemical and / or biological mixtures (eg, fungal, bacterial or algal extracts) are known in the art and can be screened using any of the assays of the present invention.
[0542]
Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art, for example: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Am. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 2611: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and Gallop et al. (1994) J. MoI. Med. Chem. 37: 1233.
[0543]
The library of compounds can be in solution (eg, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), or on beads (Lam (1991) Nature 354: 82-84), on chip (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacteria (Ladner US Pat. No. 5,223,409), spores (Ladner US Pat. No. 5,233,409), plasmids (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1865-1869) or on phage (Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390; Devlin (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. atl.Acad.Sci.U.S.A.87: 6378-6382; Felici (1991) J. Mol.Biol.222: 301-310; Ladner, US Pat. No. 5,233,409). .
[0544]
In one embodiment, the assay is a cell-based assay, wherein cells expressing a membrane-bound form of NOVX protein or a biologically active portion thereof on the cell surface are contacted with a test compound, and The ability of the test compound to bind to the NOVX protein is determined. For example, the cell can be of mammalian origin or a yeast cell. Determining the ability of the test compound to bind to the NOVX protein can be accomplished, for example, by coupling the test compound with a radioisotope or enzyme label so that the test compound against the NOVX protein or biologically active portion thereof. Can be achieved by being able to be determined by detecting the labeled compound in the complex. For example, the test compound is ¹²⁵ I, ³⁵ S, ¹⁴ C, or ³ It can be labeled either directly or indirectly with H and its radioisotope can be detected by direct counting of radiation emission or by scintillation counting. Alternatively, the test compound can be enzymatically labeled, eg, with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, or luciferase, and the enzymatic label can be detected by determining the conversion of the appropriate substrate to product. . In one embodiment, the assay involves contacting a cell that expresses a membrane-bound form of NOVX protein, or a biologically active portion thereof, on its cell surface with a known compound that binds NOVX. The step of contacting the test compound with the test mixture, and determining the ability of the test compound to interact with the NOVX protein, wherein the ability of the test compound to interact with the NOVX protein Determining the ability of the test compound to determine the ability to bind preferentially to the NOVX protein or biologically active portion thereof as compared to a known compound.
[0545]
In another embodiment, the assay is a cell-based assay, which comprises contacting a cell that expresses a membrane-bound form of NOVX protein or a biologically active portion thereof on the cell surface with a test compound. As well as determining the ability of the test compound to modulate (eg, stimulate or inhibit) the activity of the NOVX protein or biologically active portion thereof. Determining the ability of the test compound to modulate the activity of NOVX or a biologically active portion thereof is, for example, by determining the ability of the NOVX protein to bind to or interact with NOVX target molecules. Can be achieved. As used herein, a “target molecule” is a molecule to which a NOVX protein naturally binds or interacts, eg, a molecule on the cell surface that expresses a NOVX interacting protein, a second A molecule on the cell surface, a molecule in the extracellular environment, a molecule associated with the inner surface of the cell membrane, or a cytoplasmic molecule. The NOVX target molecule can be a non-NOVX molecule or a NOVX protein or polypeptide of the invention. In one embodiment, the NOVX target molecule is a component of a signal transduction pathway, which is an extracellular signal through the cell membrane into the cell (eg, a signal generated by the compound binding to the membrane-bound NOVX molecule). ) The target can be, for example, a second intracellular protein with catalytic activity, or a protein that facilitates the association of downstream signaling molecules with NOVX.
[0546]
Determining the ability of a NOVX protein to bind to or interact with a NOVX target molecule can be accomplished by one of the methods described above for determining direct binding. In one embodiment, determining the ability of a NOVX protein to bind to or interact with a NOVX target molecule can be accomplished by determining the activity of the target molecule. For example, the activity of this target molecule is related to the cellular second messenger of that target (ie, intracellular Ca ²⁺ , Diacylglycerol, IP ₃ NOVX operably linked to a nucleic acid encoding a reporter gene (eg, a detectable marker (eg, luciferase)), detecting the induction of a target to a suitable substrate, It can be determined by detecting the induction of responsive regulatory elements) or by detecting a cellular response (eg, cell viability, cell differentiation, or cell proliferation).
[0547]
In yet another embodiment, the assay of the present invention is a cell-free assay, wherein the NOVX protein or biologically active portion thereof is contacted with a test compound, and the test compound is a NOVX protein. Or determining the ability to bind to the biologically active portion thereof. The binding of the test compound to the NOVX protein can be determined either directly or indirectly, as described above. In one such embodiment, the assay involves contacting the NOVX protein or biologically active portion thereof with a known compound that binds NOVX to form an assay mixture, testing the assay mixture. Contacting the compound as well as determining the ability of the test compound to interact with the NOVX protein, wherein determining the ability of the test compound to interact with the NOVX protein comprises the step of Determining the ability to bind preferentially to NOVX, or a biologically active portion thereof, as compared to a known compound.
[0548]
In yet another embodiment, the assay is a cell-free assay, contacting the NOVX protein or biologically active portion thereof with a test compound, and the test compound is NOVX protein or biologically active thereof. Determining the ability to modulate (eg, stimulate or inhibit) the activity of the moiety. Determination of the ability of this test compound to modulate the activity of NOVX is accomplished, for example, by determining the ability of a NOVX protein to bind to a NOVX target molecule by one of the methods described above for direct binding determination. Can be done. In an alternative embodiment, determining the ability of the test compound to modulate the activity of the NOVX protein can be accomplished by determining the ability of the NOVX protein to further modulate the NOVX target molecule. For example, the catalytic / enzymatic activity of the target molecule for the appropriate substrate can be determined as described above.
[0549]
In yet another embodiment, the cell-free assay comprises contacting the NOVX protein or biologically active portion thereof with a known compound that binds the NOVX protein to form an assay mixture, the assay mixture being a test compound. And determining the ability of the test compound to interact with the NOVX protein, wherein the determination of the ability of the test compound to interact with the NOVX protein comprises determining that the NOVX protein is a NOVX target molecule Determining the ability to bind preferentially to or preferentially modulate the activity of the target molecule.
[0550]
The cell-free assay of the present invention is amenable to the use of both soluble or membrane-bound forms of NOVX protein. In the case of cell-free assays involving a membrane-bound form of NOVX protein, it may be desirable to utilize a solubilizer so that the membrane-bound form of NOVX protein is maintained in solution. Examples of such solubilizers include nonionic surfactants such as n-octyl glucoside, n-dodecyl glucoside, n-dodecyl maltoside, octanoyl-N-methylglucamide, decanoyl-N. -Methylglucamide, Triton (R) X-100, Triton (R) X-114, Thesit (R), isotridecyl poly (ethylene glycol ether) _n ((Isotridecyclic poly (ether glycol ether) _n ), N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (3-colamidopropyl) dimethylamminol-1-propanesulfonate (3- (3-cholamidopropyl) dimethylamine-1 -Propane sulfate (CHAPS), or 3- (3-colamidopropyl) dimethylamminol-2-hydroxy-1-propanesulfonate (3- (3-cholamidopropyl) dimethylamino-2-hydroxy-1-sulfonate) (CHAPSO).
[0551]
In more than one embodiment of the above assay method of the invention, either the NOVX protein or its target molecule is immobilized to facilitate separation of the complex form from one or both uncomplexed forms of the protein, and It may be desirable to adapt the assay to automation. Binding of the test compound to the NOVX protein, or the interaction of the NOVX protein with the target molecule in the presence and absence of the candidate compound, can be performed in any container suitable for containing these reactants. Can be achieved. Examples of such containers include microtiter plates, test tubes, and microcentrifuge tubes. In one embodiment, a fusion protein can be provided that adds a domain that allows one or both of the proteins to be bound to a matrix. For example, GST-NOVX fusion proteins or GST target fusion proteins can be adsorbed onto glutathione sepharose beads (Sigma Chemical, St. Louis, MO) or glutathione derivatized microtiter plates, which are then combined with test compounds. Or combined with a test compound and either unadsorbed target protein or NOVX protein, and the mixture is incubated under conditions that induce complex formation (eg, physiological conditions with respect to salt and pH). After incubation, the beads or microtiter plate wells are washed to remove any unbound components, and in the case of beads, the matrix is immobilized, eg, as described above, the complex can be either directly or indirectly Decide on. Alternatively, the complex can be dissociated from the matrix and the level of NOVX protein binding or activity can be determined using standard techniques.
[0552]
Other techniques for immobilizing proteins to the matrix can also be used in the screening assays of the invention. For example, the NOVX protein, or any of its target molecules, can be immobilized utilizing the binding of biotin and streptavidin. Biotinylated NOVX proteins, or target molecules, can be prepared from biotin-NHS (N-hydroxysuccinimide) using techniques well known in the art (eg, biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.), It can then be immobilized on the wells of a 96-well plate (Pierce Chemical) coated with streptavidin. Alternatively, an NOVX protein, or an antibody that is reactive with a target molecule but does not interfere with the binding of the NOVX protein to the target molecule, can be derivatized to the well of the plate and the unbound target or NOVX protein is It can be captured in the well by antibody binding. Methods for detecting such complexes include immunodetection of the complex using NOVX protein or an antibody reactive with the target molecule in addition to the methods described above for the GST immobilization complex, and NOVX Enzyme binding assays that rely on detection of enzyme activity for a protein or target molecule.
[0553]
In another embodiment, a modulator of NOVX protein expression is identified in a method of contacting a cell with a candidate compound and determining the expression of NOVX mRNA or protein in the cell. The expression level of NOVX mRNA or protein in the presence of the candidate compound is compared to the expression level of NOVX mRNA or protein in the absence of the candidate compound. Candidate compounds can then be identified as modulators of NOVX mRNA or protein expression based on this comparison. For example, if the expression of NOVX mRNA or protein is greater in the presence (ie, statistically significantly greater) than in the absence of the candidate compound, the candidate compound will stimulate NOVX mRNA or protein expression. Identified as a substance. Alternatively, if the expression of NOVX mRNA or protein is less in the presence (statistically significantly less) than in the absence of the candidate compound, the candidate compound is identified as an inhibitor of NOVX mRNA or protein expression. The The expression level of NOVX mRNA or protein in the cell can be determined by the methods described herein for detection of NOVX mRNA or protein.
[0554]
In yet another aspect of the invention, the NOVX protein is used as a “bait protein” in a two-hybrid assay or a three-hybrid assay (eg, US Pat. No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al., 1993 Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. Brent WO 94/10300) binds to NOVX (“NOVX binding protein” or “NOVX-bp”), or interacts with it, and reduces NOVX activity. It may identify other proteins that section. Such NOVX binding proteins may also be involved in signal transduction by NOVX proteins, for example as upstream or downstream elements of the NOVX pathway.
[0555]
The two-hybrid system is based on the modular nature of most transcription factors, which consist of separable DNA binding and activation domains. Briefly, this assay utilizes two different DNA constructs. In one construct, a gene encoding NOVX is fused to a gene encoding the DNA binding domain of a known transcription factor (eg, GAL-4). In the other construct, a DNA sequence encoding an unidentified protein ("prey" or "sample") from a library of DNA sequences is fused to a gene encoding the activation domain of a known transcription factor. Is done. When the “bait” protein and the “bait” protein can interact in vivo to form a NOVX-dependent complex, the DNA binding and activation domains of this transcription factor are very close together. Being proximal allows transcription of a reporter gene (eg, LacZ) operably linked to a transcriptional regulatory site responsive to a transcription factor. Reporter gene expression can be detected and cell colonies containing functional transcription factors can be isolated and used to obtain a cloned gene encoding a protein that interacts with NOVX.
[0556]
The present invention further relates to a novel factor identified by the screening assay described above and the use of this factor for treatment as described herein.
[0557]
(Detection assay)
A portion or fragment of the cDNA sequence identified herein (and the corresponding complete gene sequence) can be used in many ways as a polynucleotide reagent. By way of example and not limitation, these sequences can be used to (i) map each gene on a chromosome; thus, locate a gene region associated with a genetic disease; (ii) trace biological Individuals can be identified from samples (histotyping); and (iii) can assist in forensic identification of biological samples. Some of these applications are described in the following sections.
[0558]
(Chromosome mapping)
Once a gene sequence (or part of a sequence) has been isolated, this sequence can be used to map the location of the gene on the chromosome. This process is called chromosome mapping. Thus, a portion or fragment of the NOVX sequence, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55, or fragments or derivatives thereof, can be used to map the position of the NOVX gene onto the chromosome, respectively. Mapping NOVX sequences to chromosomes is an important first step in correlating these sequences with genes associated with disease.
[0559]
In short, the NOVX gene can be mapped to the chromosome by preparing PCR primers (preferably 15-25 bp in length) from the NOVX sequence. Computer analysis of NOVX sequences can be used to quickly select primers that do not span more than one exon in genomic DNA, thus complicating the amplification process. These primers can then be used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Only hybrids containing the human gene corresponding to the NOVX sequence will yield an amplified fragment.
[0560]
Somatic cell hybrids are prepared by fusing somatic cells from different mammals (eg, human cells and mouse cells). As hybrids of human and mouse cells proliferate and divide, they gradually lose human chromosomes in a random order, but maintain mouse chromosomes. By using a medium in which mouse cells cannot grow because they lack specific enzymes, but human cells can grow, one human chromosome containing the gene encoding the required enzyme is maintained. By using various media, a panel of hybrid cell lines can be established. Each cell line in the panel contains either a single human chromosome or a small number of human chromosomes and a complete set of mouse chromosomes, which allows easy mapping of individual genes to specific human chromosomes (See, eg, D'Eustachio et al. (1983) Science 220: 919-924). Somatic cell hybrids containing only fragments of human chromosomes can also be generated by using human chromosomes with translocations and deletions.
[0561]
PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid procedure for assigning specific sequences to specific chromosomes. More than two sequences can be assigned per day using a single thermal cycler. Using NOVX sequences to design oligonucleotide primers, sublocalization can be achieved using a panel of fragments from a particular chromosome.
[0562]
Fluorescence in situ hybridization (FISH) of DNA sequences to metaphase chromosomal spreads can further be used to provide accurate chromosomal location in one step. Chromosome spread can be performed using cells whose division is blocked in metaphase by chemicals such as colcemid (destroying the spindle). The chromosome can be treated briefly with trypsin and then Giemsa stained. A pattern of thin and dark bands occurs on each chromosome so that the chromosomes can be identified individually. FISH technology can be used with DNA sequences as short as 500 or 600 bases. However, clones larger than 1,000 bases have a higher probability of binding to unique chromosomal locations with signal intensity sufficient for simple detection. Preferably, 1,000 bases, and more preferably 2,000 bases are sufficient to obtain good results in a reasonable amount of time. For a review of this technology, see Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988).
[0563]
Chromosome mapping reagents can be used individually to mark a single chromosome or a single site on that chromosome, or a panel of reagents can be used to mark multiple sites and / or multiple chromosomes. obtain. Reagents corresponding to non-coding regions of the gene are indeed preferred for mapping purposes. Coding sequences are conserved within the gene family and thus are likely to increase the chance of cross-hybridization during chromosomal mapping.
[0564]
Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of that sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data is found, for example, in McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN (available online through the Johns Hopkins University Welch Medical Library). The relationship between the gene mapped to the same chromosomal region and the disease is then described, for example, by linkage analysis (co-inheritance of physically adjacent genes) described in Egeland et al. (1987) Nature, 325: 783-787. Can be identified by
[0565]
In addition, differences in the DNA sequence between individuals suffering from a disease associated with the NOVX gene and individuals not suffering from the disease can be determined. If a mutation is found in some or all of the affected individuals but not in any of the unaffected individuals, the mutation is likely a causative factor for the particular disease. Comparison of affected and unaffected individuals generally begins with structural changes in the chromosome (eg, deletions or translocations visible from the chromosome spread or detectable using PCR based on its DNA sequence). The process of searching for is included. Finally, complete sequencing of genes from some individuals can be performed to confirm the presence of mutations and to distinguish mutations from polymorphisms.
[0566]
(Tissue type determination)
The NOVX sequences of the present invention can also be used to identify an individual from a small biological sample. In this technique, an individual's genomic DNA is digested with one or more restriction enzymes and probed on a Southern blot to generate a unique band for identification. The sequences of the present invention are useful as additional DNA markers for RFLP (the “restriction fragment length polymorphism” described in US Pat. No. 5,272,057).
[0567]
Furthermore, the sequences of the present invention can be used to provide alternative techniques for determining DNA sequences by actual base for selected portions of an individual's genome. Thus, using the NOVX sequences described herein, two PCR primers can be prepared from the 5 'and 3' ends of the sequence. These primers can then be used to amplify the individual's DNA and subsequently sequence.
[0568]
A panel of corresponding DNA sequences from individuals prepared in this manner may provide a unique individual identification because each individual has a unique set of such DNA sequences due to allelic differences. The sequences of the present invention can be used to obtain such identification of sequences from individuals and tissues. The NOVX sequence of the present invention uniquely represents a portion of the human genome. Allelic variation occurs to some extent in the coding regions of these sequences and to a greater extent in non-coding regions. It is estimated that allelic variation between individual humans occurs at a frequency of about once for every 500 bases. The high degree of allelic variation is due to single nucleotide polymorphisms (SNPs), including restriction enzyme fragment length polymorphisms (RFLP).
[0569]
Each of the sequences described herein can, to some extent, be used as a standard, against which DNA from individuals can be compared for identification purposes. Since more polymorphisms occur in non-coding regions, not so many sequences are required to distinguish individuals. Non-coding sequences can provide positive individual identification without inconvenience, perhaps using a panel of 10-1,000 primers. These primers each yield an amplified non-coding sequence of 100 bases. Putative coding sequences (e.g., SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, When sequences 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55) are used, a more appropriate number of primers for positive individual identification is 500-2,000.
[0570]
(Predictive medicine)
The present invention also relates to the field of predictive medicine, where diagnostic assays, prognostic assays, pharmacogenomics and clinical trial monitoring are used for prognostic (predictive) purposes, thereby prophylactically treating an individual. Accordingly, one aspect of the invention is a diagnostic assay for determining NOVX protein and / or nucleic acid expression and NOVX activity in the case of biological samples (eg, blood, serum, cells, tissues). This determines whether the individual suffers from or is at risk of developing a disorder in connection with aberrant NOVX expression or activity. This disorder includes metabolic disorders, diabetes, obesity, infection, anorexia, cancer-related cachexia, cancer, neurodegenerative disorders, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immune disorders, and hematopoietic disorders, and various abnormal fatty disorders Examples include dyslipidemia, metabolic disorders associated with obesity, X metabolic syndrome X, and wasting disorders associated with chronic diseases and various cancers. The present invention also provides a prognostic (or predictive) assay for determining whether an individual is at risk for developing a disorder associated with NOVX protein, nucleic acid expression or activity. For example, mutations in the NOVX gene can be assayed in a biological sample. Such assays are used for prognostic or predictive purposes, thereby prophylactically treating an individual prior to the onset of a disorder characterized or related to NOVX protein, nucleic acid expression or biological activity. Can do.
[0571]
Another aspect of the present invention provides a method for determining NOVX protein, nucleic acid expression or activity in an individual, whereby appropriate therapeutic or prophylactic reagents for that individual (herein “Drugs”). Select “Genome”. The drug genome can be used for therapeutic or prophylactic treatment of an individual based on the genotype of the individual (eg, the genotype of the individual tested to determine the individual's ability to respond to a particular factor). Allows selection of factors (eg, drugs).
[0572]
Yet another aspect of the invention relates to monitoring the influence of factors (eg, drugs, compounds) on NOVX expression or activity in clinical trials.
[0573]
These and other factors are described in further detail in the following sections.
[0574]
(Diagnostic assay)
An exemplary method for detecting the presence or absence of NOVX in a biological sample is to obtain a biological sample from a test subject, and the biological sample encodes NOVX protein or NOVX protein. Contacting a compound or agent capable of detecting a nucleic acid (eg, mRNA, genomic DNA) such that the presence of NOVX is detected in the biological sample. An agent for detecting NOVX mRNA or genomic DNA is a labeled nucleic acid probe that can hybridize to NOVX mRNA or genomic DNA. This nucleic acid probe is, for example, a full-length NOVX nucleic acid (for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 and 55 nucleic acids) or a portion thereof (eg, at least 15, 30, 50, 100, 250 or 500 nucleotides in length) And a nucleic acid sufficient to specifically hybridize with NOVX mRNA or genomic DNA under stringent conditions. Other suitable probes for use in the diagnostic assays of the invention are described herein.
[0575]
The agent for detecting NOVX protein is an antibody capable of binding to NOVX protein, preferably an antibody having a detectable label. The antibody may be polyclonal or more preferably a monoclonal antibody. Intact antibody or fragment thereof (eg, Fab or F (ab ′) ₂ ) Can be used. The term “labeled” refers to directly labeling a probe or antibody with respect to the probe or antibody by coupling (ie, physically linking) a detectable substance to the probe or antibody; As well as indirectly labeling the probe or antibody by reactivity with another directly labeled reagent. Examples of indirect labeling include primary antibody detection using a fluorescently labeled secondary antibody, and end labeling using biotin as a DNA probe so that it can be detected using fluorescently labeled streptavidin. It is done. The term “biological sample” is intended to include tissues, cells and biological fluids isolated from a subject and tissues, cells and fluids present in a subject. That is, NOVX mRNA, protein or genomic DNA can be detected in a biological sample in vitro and in vivo using the detection method of the present invention. For example, in vitro techniques for detection of NOVX mRNA include Northern hybridization and in situ hybridization. In vitro techniques for the detection of NOVX proteins include enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot, immunoprecipitation and immunofluorescence. In vitro techniques for detecting NOVX genomic DNA include Southern hybridization. Furthermore, in vivo techniques for the detection of NOVX protein include introducing a labeled anti-NOVX antibody into a subject. For example, the antibody can be labeled with a radioactive marker. The presence and location of radioactive markers in the subject can be detected by standard imaging techniques.
[0576]
In one embodiment, the biological sample contains protein molecules from the test subject. Alternatively, the biological sample can include mRNA molecules from the test subject or genomic DNA molecules from the test subject. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means.
[0577]
In another embodiment, the method of the invention further comprises obtaining a control biological sample from a control subject, contacting the control sample with a compound or agent capable of detecting NOVX protein, mRNA or genomic DNA, As a result, detecting the presence of NOVX protein, mRNA or genomic DNA in the biological sample, and the presence of NOVX protein, mRNA or genomic DNA in the control sample and NOVX protein, mRNA or in the test sample Comparing with the presence of genomic DNA.
[0578]
The invention also includes a kit for detecting the presence of NOVX in a biological sample. For example, the kit may comprise: a labeled compound or agent capable of detecting NOVX protein or mRNA in a biological sample; means for determining the amount of NOVX in the sample; and in the sample Means for comparing the standard with the amount of NOVX. The compound or agent can be packaged in a suitable container. The kit may further comprise instructions for using the kit to detect NOVX protein or nucleic acid.
[0579]
(Prognostic assay)
The diagnostic methods described herein can be further utilized to identify subjects having or at risk for developing a disease or disorder associated with abnormal expression or activity of NOVX. For example, the assays described herein (eg, the diagnostic assays described above or the assays described below) may be used to have or be at risk of developing a disorder associated with NOVX protein, nucleic acid expression or activity. A subject can be identified. Alternatively, this prognostic assay can be utilized to identify subjects having or at risk for developing a disease or disorder. Accordingly, the present invention provides methods for identifying diseases or disorders associated with abnormal expression or activity of NOVX. Here, a test sample is obtained from a subject and NOVX protein or nucleic acid (eg, mRNA, genomic DNA) is detected, wherein the presence of NOVX protein or nucleic acid is aberrant expression or activity of NOVX A diagnostic indicator for a subject who has or is at risk of developing a disease or disorder associated with. As used herein, “test sample” refers to a biological sample obtained from a subject of interest. For example, the test sample can be a biological fluid (eg, serum), a cell sample, or a tissue.
[0580]
In addition, a prognostic assay described herein can be used to administer an agent (eg, an agonist, antagonist, peptidomimetic, protein, peptide, nucleic acid, small molecule, or other drug candidate) to a subject. It can be determined whether a disease or disorder associated with abnormal expression or activity of NOVX can be treated. For example, such methods can be used to determine whether a subject can be effectively treated with an agent for the disorder. Accordingly, the present invention provides a method for determining whether a subject can be effectively treated with an agent for a disorder associated with abnormal expression or activity of NOVX. Here, a test sample is obtained and NOVX protein or nucleic acid is detected (eg, the presence of NOVX protein or nucleic acid is associated with abnormal expression or activity of NOVX when the agent is administered) It is a diagnostic indicator for a subject whose disorder can be treated).
[0581]
The methods of the present invention also detect genetic damage in the NOVX gene, thereby determining whether a subject having the damaged gene is at risk for a disorder characterized by abnormal cell growth and / or differentiation. Can also be used to determine In various embodiments, the method comprises the presence or absence of genetic damage characterized by at least one change that affects the integrity of the gene encoding the NOVX protein in a sample of cells from the subject; Or the process of detecting the misexpression of NOVX gene is included. For example, such genetic damage can be detected by confirming the presence of at least one of the following: (i) a deletion of one or more nucleotides from the NOVX gene; (ii) one to the NOVX gene. (Iii) substitution of one or more nucleotides of the NOVX gene; (iv) chromosomal rearrangement of the NOVX gene; (v) changes in the level of messenger RNA transcripts of the NOVX gene; (vi) the NOVX gene (Vii) the presence of a non-wild type splicing pattern of the messenger RNA transcript of the NOVX gene, (viii) the non-wild type level of the NOVX protein, (ix) NOVX gene allele deletion, and (x) NOVX tamper After inappropriate translation of quality qualified. As described herein, there are a number of known assay techniques in the art that can be used to detect damage in the NOVX gene. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means. However, any biological sample containing nucleated cells can be used, including, for example, buccal mucosa cells.
[0582]
In certain embodiments, damage detection is performed by polymerase chain reaction (PCR) (see, eg, US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202) (eg, anchor PCR or RACE). PCR), or ligation chain reaction (LCR) (see, eg, Landegran et al. (1988) Science 241: 1077-1080; and Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364. Use of probes / primers in The latter may be particularly useful for detecting point mutations in the NOVX gene (see Abravaya et al., 1995 Nucl. Acids Res. 23: 675-682). The method comprises the steps of collecting a sample of cells from a patient, isolating nucleic acid (eg, genome, mRNA or both) from cells of the sample, one or more specifically hybridizing to a NOVX gene. Contacting the primer with its nucleic acid sample under conditions such that hybridization and amplification of the NOVX gene (if present) occurs, and detecting the presence or absence of the amplification product, or the size of the amplification product And detecting the length and comparing its length to a control sample. It is anticipated that PCR and / or LCR may be desirably used as a preliminary amplification step with any of the techniques used to detect the mutations described herein.
[0583]
Alternative amplification methods include the following: self-sustaining sequence replication (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad.), Prior to detection of the amplified molecule using techniques well known to those skilled in the art. Sci. USA 87: 1874-1878), transcription amplification system (see Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Qβ replicase (Lizardi et al., 1988). , BioTechnology 6: 1197), or any other nucleic acid amplification method. These detection schemes are particularly useful for the detection of such nucleic acid molecules when there are very few nucleic acid molecules present.
[0584]
In an alternative embodiment, mutations in the NOVX gene from sample cells can be identified by alterations in the restriction enzyme cleavage pattern. For example, sample and control DNA is isolated, amplified (optionally), digested with one or more restriction endonucleases, and fragment length sizes are determined by gel electrophoresis and compared Is done. A difference in fragment length size between sample DNA and control DNA indicates a mutation in the sample DNA. In addition, the use of sequence specific ribozymes (see, eg, US Pat. No. 5,493,531) is used to score for the presence of specific mutations by the occurrence or loss of ribozyme cleavage sites. obtain.
[0585]
In other embodiments, genetic mutations in NOVX are identified by hybridizing sample nucleic acids and control nucleic acids (eg, DNA or RNA) to a high-density array containing hundreds or thousands of oligonucleotide probes. obtain. See, for example, Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal et al. (1996) Nat. Med. 2: 753-759. For example, genetic mutations in NOVX can be identified in a two-dimensional array containing photogenerated DNA probes as described in Cronin et al. (Supra). Briefly, the first hybridization array of probes is used to scan across long stretches of DNA in samples and controls, identifying base changes between the sequences by creating a linear array of continuously overlapping probes. Can do. This step allows the identification of point mutations. This step is followed by a second hybridization array, which allows the characterization of specific mutations by using smaller specialized probe arrays that are complementary to all variants or mutants to be detected. To. Each mutation array is composed of parallel probe sets, one complementary to the wild type gene and the other complementary to the mutant gene.
[0586]
In yet another embodiment, the NOVX gene can be directly sequenced using any of a variety of sequencing reactions known in the art, and the sample NOVX sequence compared to the corresponding wild type (control) sequence By doing so, the mutation can be detected. Examples of sequencing reactions include: Maxim and Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560 or Sanger (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. And those based on the technology developed by USA 74: 5463. It is also contemplated that any of a variety of automated sequencing procedures may be utilized when performing a diagnostic assay (see, eg, Naeve et al. (1995) Biotechniques 19: 448). These include mass spectrometry sequencing methods (eg, PCT International Publication No. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatography 36: 127-162; and Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38. : 147-159).
[0587]
Other methods for detecting mutations in the NOVX gene include detecting mismatch bases based on RNA / RNA or RNA / DNA heteroduplexes using protection from cleaving agents. (See, for example, Myers et al. (1985) Science 230: 1242). In general, the art of “mismatch cleavage” involves hybridizing (labeled) RNA or DNA containing a wild-type NOVX sequence with potential mutant RNA or DNA obtained from a tissue sample. Begin by providing a heteroduplex to be formed. Using an agent that cleaves this double-stranded duplex into a single-stranded region of the duplex (eg, that exists due to a base pair mismatch between its control strand and the sample strand) Process. For example, RNA / DNA duplexes can be treated with RNase and DNA / DNA hybrids can be digested with enzymatic digestion of their mismatch regions. ₁ Can be treated with nucleases. In other embodiments, either DNA / DNA or RNA / DNA duplexes can be treated with hydroxylamine or osmium tetroxide and piperidine to digest mismatched regions. After digesting the mismatched region, the resulting material is then separated by size on a denaturing polyacrylamide gel to determine the site of mutation. For example, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleba et al. (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295. In one embodiment, the control DNA or RNA can be labeled for detection.
[0588]
In yet another embodiment, the mismatch cleavage reaction comprises one or more proteins that recognize mismatched base pairs in double stranded DNA (so-called “DNA mismatch repair” enzymes) in a NOVX cDNA obtained from a sample of cells. Used in a defined system to detect and map mutations. For example, E.I. E. coli mutY enzyme cleaves A with a G / A mismatch, and thymidine DNA glycosylase from HeLa cells cleaves T with a G / T mismatch. See, for example, Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662. According to an exemplary embodiment, a probe based on a NOVX sequence (eg, a wild type NOVX sequence) is hybridized to a cDNA or other DNA product from a test cell. The duplex is treated with a DNA mismatch repair enzyme, and its cleavage product (if any) can be detected from electrophoresis protocols and the like. See, for example, US Pat. No. 5,459,039.
[0589]
In other embodiments, changes in electrophoretic mobility are used to identify mutations in the NOVX gene. For example, single stranded conformational polymorphism (SSCP) can be used to detect differences in electrophoretic mobility between mutant and wild type nucleic acids. For example, Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766; Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144; Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79). Single-stranded DNA fragments of sample and control NOVX nucleic acids are denatured and regenerated. The secondary structure of single-stranded nucleic acids varies according to the sequence, and the resulting change in electrophoretic mobility allows even the detection of single base changes. The DNA fragment can be labeled or detected using a labeled probe. The sensitivity of the assay can be enhanced by using RNA (rather than DNA) whose secondary structure is more sensitive to changes in the sequence. In one embodiment, the methods of the invention utilize heteroduplex analysis to separate double stranded heteroduplex molecules based on changes in electrophoretic mobility. See, eg, Keen et al. (1991) Trends Genet. See 7: 5.
[0590]
In yet another embodiment, the migration of mutant or wild type fragments in a polyacrylamide gel containing a constant gradient of denaturing agent is assayed using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). See, for example, Myers et al. (1985) Nature 313: 495. When DGGE is used as the method of analysis, the DNA is modified to ensure that it is not completely denatured, for example by adding a GC clamp of high melting GC rich DNA of about 40 bp by PCR. In a further embodiment, temperature gradients are used in place of denaturant gradients to identify differences in control and sample DNA mobility. See, for example, Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753.
[0591]
Examples of other techniques for detecting point mutations include, but are not limited to: selective oligonucleotide hybridization, selective amplification, or selective primer extension. For example, oligonucleotide primers can be prepared such that known mutations are centrally located and then hybridized to target DNA under conditions that allow hybridization only if a perfect match is found. See, for example, Saiki et al. (1986) Nature 324: 163; Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See Sci USA 86: 6230. Such allele-specific oligonucleotides hybridize to PCR amplified target DNA or many different mutations when the oligonucleotide is attached to a hybridizing membrane and hybridized with a labeled target DNA. Is done.
[0592]
Alternatively, allele specific amplification technology which depends on selective PCR amplification may be used in conjunction with the instant invention. Oligonucleotides used as primers for specific amplification are at the center of the molecule (so that amplification is dependent on differential hybridization); (eg Gibbs et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448) or may carry the mutation of interest at the 3 ′ extreme end of one primer, which can prevent mismatches or reduce polymerase extension under appropriate conditions (eg, Prossner (1993) Tibtech. 11: 238). Furthermore, introducing a new restriction site in the mutated region to perform cleavage-based detection may be desirable to perform cleavage-based detection. See, for example, Gasparini et al. (1992) Mol. See Cell Probes 6: 1. In certain embodiments, it is anticipated that amplification may also be performed using amplification Taq ligase. For example, Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189. In such cases, ligation occurs only when there is a perfect match at the 3 'end of the 5' sequence, and the presence of a known mutation at a particular site is determined by searching for the presence or absence of amplification. Makes it possible to detect.
[0593]
The methods described herein can be performed, for example, by utilizing a prepackaged diagnostic kit comprising at least one probe nucleic acid or antibody reagent described herein, For example, it can be conveniently used in a clinical setting for diagnosing patients exhibiting symptoms or symptoms of a disease or illness that includes the NOVX gene or a family history.
[0594]
Furthermore, any cell type or tissue in which NOVX is expressed (preferably peripheral blood leukocytes) can be utilized in the prognostic assays described herein. However, any biological sample containing nucleated cells (eg, including buccal mucosa cells) can be used.
[0595]
(Pharmacogenomics)
Factors that have a stimulatory or inhibitory effect on NOVX activity (eg, NOVX gene expression), ie, modulators, are identified by the screening assay described herein as a disorder (which includes: Metabolic disorders, diabetes, obesity, infection, anorexia, cancer-related cachexia, cancer, neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immune disorders, and hematopoietic disorders, and various abnormal fatty edema ( dyslipidemia), metabolic disorders associated with obesity, X metabolic syndrome (X), and debilitating disorders associated with chronic diseases, and various cancers.) administered to an individual (prophylactically or therapeutically) Can be done. In conjunction with such treatment, the pharmacogenomics of an individual (ie, a study of the relationship between an individual's genotype and the individual's response to a foreign compound or drug) can be considered. Differences in the metabolism of a therapeutic agent can lead to severe toxicity or treatment failure by altering the relationship between pharmacologically active drug dose and blood concentration. Thus, the pharmacogenomics of an individual allows the selection of an effective drug (eg, drug) for prophylactic or therapeutic treatment based on consideration of the individual's genotype. Such pharmacogenomics can further be used to determine appropriate dosages and therapeutic regimens. Thus, the activity of NOVX protein, the expression of NOVX nucleic acid, or the mutation content of the NOVX gene in an individual can be determined, thereby selecting an appropriate agent for therapeutic or prophylactic treatment of the individual.
[0596]
Pharmacogenomics deals with clinically significant genetic alterations in response to drugs due to altered drug properties and abnormal effects in affected individuals. For example, Eichelbaum, 1996, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, 23: 983-985 and Linder, 1997, Clin. See Chem, 43: 254-266. In general, two types of pharmacogenomic conditions can be distinguished. A genetic state that is transmitted as one factor that alters how the drug acts on the body (altered drug action), or a genetic state that is transmitted as one factor that alters how the body acts on the drug ( Changed drug metabolism). These pharmacogenomic conditions can occur either as rare defects or as polymorphisms. For example, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is a common hereditary enzyme disease, and its main clinical complications include oxidant drugs (antimalarials, sulfonamides, analgesics, nitrofurans, ) And hemolysis after eating broad beans.
[0597]
In an exemplary embodiment, the activity of drug metabolizing enzymes is a major determinant of both the intensity and duration of drug action. The discovery of genetic polymorphisms of drug metabolizing enzymes (eg, N-acetyltransferase 2 (NAT2) and cytochrome P450 enzymes CYP2D6 and CYP2C19) has resulted in some patients not getting the expected drug effects or standard And provided an explanation for exhibiting excessive drug response and severe toxicity after taking a safe dose of drug. These polymorphisms are expressed in the population with two phenotypes: an extensible metabolizer (EM) and a poor metabolizer (PM). The prevalence of PM varies between different populations. For example, the gene encoding CYP2D6 is highly polymorphic, and some mutations have been identified in PM, all of which lead to the absence of functional CYP2D6. Persons with low metabolic capacity of CYP2D6 and CYP2C19 quite often experience excessive drug response and side effects when they receive standard doses. When the metabolite is an active therapeutic moiety, PM does not show a therapeutic response, as demonstrated for the analgesic effect of codeine mediated by its CYP2D6-forming metabolite, morphine. The other extreme is a person with so-called ultra-rapid metabolic capacity that does not respond to standard doses. Recently, a molecule that is the basis for ultra-rapid metabolism has been identified to be due to CYP2D6 gene amplification.
[0598]
Thus, NOVX protein activity, NOVX nucleic acid expression, or NOVX gene mutation content in an individual may be determined, thereby selecting an appropriate agent for therapeutic or prophylactic treatment of the individual. . In addition, pharmacogenomic studies can be used to apply polymorphic allele genotypes encoding drug-metabolizing enzymes for identification of an individual's drug responsive phenotype. This finding, when applied to dose or drug selection, can avoid adverse reactions or treatment failures and thus subject subjects to modulators of NOVX (eg, the exemplary screens described herein) The therapeutic or prophylactic efficiency may be enhanced when treated with a modulator identified by one of the assays.
[0599]
(Monitoring effects during clinical trials)
Monitoring the impact of an agent (eg, drug, compound) on NOVX expression or activity (eg, the ability to modulate abnormal cell growth and / or differentiation) is not only in basic drug screening, but also in clinical trials. Can also be applied. For example, NOVX gene expression, increased protein levels, or the efficacy of an agent that upregulates NOVX activity, as determined by screening assays as described herein, is reduced NOVX gene expression. , Protein levels, or down-regulated NOVX activity can be monitored in clinical trials of subjects. Alternatively, the efficacy of an agent that reduces NOVX gene expression, decreases protein levels, or down-regulates NOVX activity, as determined by a screening assay, is increased NOVX gene expression, protein levels, or up-regulated NOVX. It can be monitored in clinical trials of subjects exhibiting activity. In such clinical trials, the expression or activity of NOVX, and preferably other genes that are involved, for example, in cell proliferation or immune disorders, are “read out”, i.e. specific It can be used as a marker of cellular immune responsiveness.
[0600]
For example, by treatment with an agent (eg, compound, drug or small molecule) that modulates a gene comprising NOVX, which modulates NOVX activity (eg, identified in a screening assay as described herein). Is regulated in the cell), but is not limited thereto. Thus, to study the effects of drugs on cellular proliferative disorders, for example, in clinical trials, cells can be isolated and RNA can be prepared and the expression of NOVX and other genes involved in this disorder. It can be analyzed for levels. The level of gene expression (ie, gene expression pattern) can be determined by Northern blot analysis or RT-PCR, as described herein, or by measuring the amount of protein produced, It can be quantified by one of the methods as described in the document or by measuring the level of activity of NOVX or other genes. In this manner, the gene expression pattern can act as a marker that is indicative of a cellular physiological response to the drug. Thus, this response state can be determined before and during treatment of an individual with this agent.
[0601]
In one embodiment, the present invention provides agents (eg, agonists, antagonists, proteins, peptides, nucleic acids, peptidomimetics, small molecules, or other drug candidates identified by the screening assays described herein. A method for monitoring the efficacy of treatment of a subject, comprising the following steps: (i) obtaining a pre-dose sample from the subject prior to administration of the drug. (Ii) detecting the level of expression of NOVX protein, mRNA, or genomic DNA in the pre-dose sample; (iii) obtaining one or more post-dose samples from the subject; Techniques for detecting the level of NOVX protein, mRNA, or genomic DNA expression or activity in post-administration samples (V) comparing the level of NOVX protein, mRNA, or genomic DNA expression or activity in the pre-administration sample with the level of NOVX protein, mRNA, or genomic DNA expression or activity in the post-administration sample; And (vi) thus altering the administration of the drug to the subject. For example, increased administration of the agent may be desirable to increase NOVX expression or activity to a level higher than that detected (ie, increase the efficacy of the agent). Alternatively, reduced administration of the agent may be desirable to reduce NOVX expression or activity to a level lower than detected (ie, reduce the efficacy of the agent).
[0602]
(Treatment method)
The present invention provides both prophylactic and therapeutic methods for treating a subject at risk (or susceptibility) to or having a disorder associated with abnormal NOVX expression or activity. Examples of such diseases or disorders include atherosclerosis, hypertension, congenital heart defect, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), and atrioventricular (AV) duct defect. Disease, arterial duct, pulmonary valve stenosis, lower aortic stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, adrenal cerebral leukodystrophy, congenital adrenal hyperplasia Formation, prostate cancer, neoplasia; adenocarcinoma, lymphoma, uterine cancer, fertility, hemophilia, hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, immunodeficiency, graft-versus-host disease, AIDS, bronchitis Asthma, Crohn's disease; treatment of multiple sclerosis, allbright hereditary dysplasia, and other diseases, disorders and conditions.
[0603]
These treatment methods are described in more detail below.
[0604]
(Diseases and disorders)
Diseases and disorders characterized by increased levels or biological activity (as compared to subjects not suffering from the disease or disorder) use therapeutic agents that antagonize (ie, reduce or inhibit) activity. Can be treated. A therapeutic agent that antagonizes activity can be administered in a therapeutic or prophylactic manner. Therapeutic agents that may be utilized include, but are not limited to: (i) the above peptides, or analogs, derivatives, fragments or homologs thereof; (ii) antibodies to the peptides; (iii) encodes the peptides (Iv) antisense nucleic acids and “dysfunctional” utilized to “knock out” the endogenous function of the peptide by homologous recombination (ie, within the coding sequence of the coding sequence for the peptide Administration of a nucleic acid (due to a heterologous insertion of) (see, eg, Capecchi, 1989, Science 244: 1288-1292); or (v) altering the interaction between the peptide and its binding partner; Modulators (ie, inhibitors, agonists and Tagonists (including additional peptidomimetics of the invention or antibodies specific for the peptides of the invention)).
[0605]
Diseases and disorders characterized by decreased levels or biological activity (compared to a subject not afflicted with the disease or disorder) increase the activity (ie, are agonists for activity) therapeutic agents Can be used to treat. A therapeutic agent that upregulates activity can be administered in a therapeutic or prophylactic manner. Therapeutic agents that may be utilized include, but are not limited to: the above peptides, or analogs, derivatives, fragments or homologs thereof; or agonists that increase bioavailability.
[0606]
Increased or decreased levels can be readily detected by quantifying peptides and / or RNA. This quantification obtains a patient tissue sample (eg, from a biopsy tissue) and samples the RNA level or peptide level, structure and / or activity of the expressed peptide (or mRNA of the peptide) in vitro. By assaying. Methods well known in the art include, but are not limited to, immunoassays (eg, by immunoprecipitation followed by Western blot analysis, sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, immunocytochemistry, etc. ) And / or hybridization assays to detect mRNA expression (eg, Northern assay, dot blot, in situ hybridization, etc.).
[0607]
(Preventive method)
In one aspect, the present invention prevents a disease or condition associated with abnormal NOVX expression or activity in a subject by administering to the subject an agent that modulates NOVX expression or at least one NOVX activity. Provide a way to do that. A subject at risk of developing a disease caused by or due to abnormal NOVX expression or activity is, for example, by any of the diagnostic or prognostic assays described herein, or combinations thereof Can be identified. Administration of a prophylactic agent can occur prior to the onset of symptoms characteristic of this NOVX abnormality so that the disease or disorder is prevented or slowed down. Depending on the type of NOVX abnormality, for example, a NOVX agonist agent or NOVX antagonist agent can be used to treat the subject. The appropriate agent can be determined based on the screening assays described herein. The prevention methods of the present invention are further discussed in the following subsections.
[0608]
(Method of treatment)
Another aspect of the invention relates to a method of modulating NOVX expression or activity for therapeutic purposes. The modulatory method of the invention includes contacting a cell with an agent that modulates one or more of the activities of NOVX protein activity associated with the cell. Agents that modulate NOVX protein activity are agents as described herein, such as nucleic acids or proteins, naturally occurring cognate ligands of NOVX proteins, peptides, NOVX peptide mimetics, or other small molecules It can be. In one embodiment, the agent stimulates one or more of NOVX protein activity. Examples of such stimulatory agents include active NOVX proteins and nucleic acid molecules that encode NOVX introduced into the cell. In another embodiment, the agent inhibits one or more of NOVX protein activities. Examples of such inhibitory agents include antisense NOVX nucleic acid molecules and anti-NOVX antibodies. These modulating methods can be performed in vitro (eg, by culturing the cells with the agent) or in vivo (eg, by administering the agent to a subject). Thus, the present invention provides a method of treating an individual suffering from a disease or disorder characterized by abnormal expression or abnormal activity of a NOVX protein or nucleic acid molecule. In one embodiment, the method comprises an agent that modulates NOVX expression or activity (eg, upregulates or downregulates) (eg, an agent identified by a screening assay described herein) or Administering a combination of such agents. In another embodiment, the method comprises administering a NOVX protein or nucleic acid molecule as a treatment to compensate for reduced or abnormal NOVX expression or activity.
[0609]
Stimulation of NOVX activity is desirable in situations where NOVX is abnormally downregulated and / or in situations where increased NOVX activity appears to have a beneficial effect. One example of such a situation is when the subject has a disorder characterized by abnormal cell proliferation and / or cell differentiation (eg, cancer or immune related). Another example of such a situation is when the subject has a gestational disorder (eg, preclampsia).
[0610]
(Determination of biological effects of therapeutic agents)
In various embodiments of the invention, appropriate in vitro or in vivo assays are performed to determine the effect of a particular therapeutic agent and whether its administration is indicative of treatment of the affected tissue.
[0611]
In various specific embodiments, an in vitro assay can be performed on a representative cell type involved in a patient's disorder to determine whether a given therapeutic agent exerts a desired effect on this cell type. . The compounds used in therapy can be tested in an appropriate animal model system prior to testing in human subjects. These animal model systems include, but are not limited to: rats, mice, chickens, cows, monkeys, rabbits and the like. Similarly, for in vivo testing, any animal model system known in the art can be used prior to administration to a human subject.
[0612]
(Preventive and therapeutic uses of the composition of the present invention)
The NOVX nucleic acids and proteins of the invention are useful for powerful prophylactic and therapeutic applications associated with various disorders including, but not limited to: metabolic disorders, diabetes, obesity, infections, appetite Poorness, cancer-related cancers, neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immune disorders, hematopoietic disorders, and various abnormal dyslipidemias, obesity-related metabolic disorders, metabolic syndrome X, and Wasting diseases associated with chronic diseases, and various cancers.
[0613]
As an example, a cDNA encoding a NOVX protein of the invention is useful for gene therapy, and the protein may be useful when administered to a subject in need of gene therapy. By way of non-limiting illustration, the composition of the present invention may be used for metabolic disorders, diabetes, obesity, infection, anorexia, cancer-related cachexia, cancer, neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immune disorders, hematopoietic disorders, And has efficacy for the treatment of patients suffering from various dyslipidemias.
[0614]
The novel nucleic acids encoding the NOVX proteins of the present invention, and both NOVX proteins, or fragments thereof, may be useful for diagnostic applications. Here, the presence or amount of nucleic acid or protein is assessed. A further application is as an antimicrobial molecule (ie, some peptides have been found to have antimicrobial properties). These materials are further useful in the generation of antibodies that immunospecifically bind to the novel agents of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods.
[0615]
The invention will be further described in the following examples, which do not limit the scope of the specification described in the claims.
【Example】
[0616]
(Example 1: Identification of NOVX nucleic acid)
TblastN was performed against Genomic Daily Files available by GenBank or from files downloaded from individual sequence centers, using CuraGen Corporation sequence files for polypeptides or homologs. Exons were predicted by homology and intron / exon boundaries were determined using standard genetic roles. Exons were further selected and refined using multiple BLAST (eg, tBlastN, BlastX, and BlastN) searches and, in some cases, similarity determination using GeneScan and Grail. Expressed sequences from both public and proprietary databases were also added when further definitions and complete gene sequences were available. The DNA sequence was then manually corrected for clear discrepancies, resulting in the sequence encoding the full-length protein.
[0617]
The novel NOVX target sequence identified in the present invention was subjected to an exon ligation process to confirm the sequence. PCR primers were designed to start with the most upstream sequence available for the forward primer and the most downstream sequence available for the reverse primer. PCR primer sequences were used to obtain various clones. In each case, each towards the coding sequence until an appropriate sequence that is either unique or highly selective is encountered, or in the case of a reverse primer, a stop codon is reached. The sequence was tested by walking inward from the end of the. Such primers are based on in silico predictions for full-length cDNA, part of DNA (one or more exons) or protein sequence of the target sequence, or closely related from other species Designed by translated homology of putative exons to human sequences. These primers were then used in PCR amplification based on the following pool of human cDNAs: adrenal gland, bone marrow, brain-tonsil, brain-cerebellum, brain-hippocampus, brain-substantia nigra, brain-thalamus, brain-whole. Fetal brain, fetal kidney, fetal liver, fetal lung, heart, kidney, lymphoma-Raji, mammary gland, pancreas, pituitary gland, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, Testis, thyroid, trachea, uterus. Usually, the resulting amplicons were gel purified, cloned, and sequenced for high degeneracy. The PCR product derived by ligation of exons was cloned into the pCR2.1 vector by Invitrogen. The resulting bacterial clone has an insert that includes the complete open reading frame cloned into the pCR2.1 vector. The sequences obtained from all clones were summarized with themselves, with other fragments in the CuraGen Corporation database, and with public ESTs. Fragments and ESTs were included as members of a set if their degree of identity with another component of the set was at least 95% over 50 bp. In addition, sequence traces were manually assessed and modified where appropriate. These procedures provide the sequences reported herein.
[0618]
Physical clones: exons were estimated by homology, and intron / exon boundaries were determined using standard genetic rules. Exons were further selected and refined by multiple BLAST (eg, tBlastN, BlastX, and BlastN) searches, and in some cases by means of similarity determination using GeneScan and Grail. Where available, expressed sequences from both public and proprietary databases were also added to further define and complete these gene sequences. The DNA sequence was then manually corrected for obvious discrepancies, thereby obtaining the sequence encoding the full-length protein.
[0619]
Example 2: Identification of a single nucleotide polymorphism in the NOVX nucleic acid sequence
Variant sequences are also included in this application. The variant sequence may comprise a single nucleotide polymorphism (SNP). The SNP is referred to as “cSNP”, which in some instances indicates that the nucleotide sequence containing the SNP originates from cDNA. SNPs can occur in several ways. For example, a SNP can result from the substitution of one nucleotide for another at the polymorphic site. Such substitutions can be either transitions or transversions. SNPs can also be caused by nucleotide deletions or nucleotide insertions compared to a reference allele. In this case, a polymorphic site is a site in which one allele carries a gap with respect to a particular nucleotide in another allele. A SNP present in a gene can cause a change in the amino acid encoded by the gene at the position of the SNP. An intragenic SNP can also be silent if the codon containing the SNP encodes the same amino acid as a result of the degeneracy of the genetic code. SNPs that are outside the region of the gene, or in introns within the gene, do not cause any change in the amino acid sequence of the protein, but may result in altered regulation of the expression pattern. Examples include transient expression, regulation of physiological responses, cell type expression regulation, intensity of expression, changes in the stability of the transcribed message.
[0620]
The SeqCalling assembly produced by the exon ligation process was selected and stretched using the following criteria. Genomic clones having a region with 98% identity to all or part of the starting or extended sequence were identified by BLASTN using the relevant sequences to query the human genomic database. The resulting genomic clone was selected for further analysis. Because this identity indicates that these clones contain genomic loci for these SeqCalling assemblies. These sequences were analyzed for similarity to putative coding regions, as well as known DNA and protein sequences. Programs used for these analyzes include Grail, Genscan, BLAST, HMMER, FASTA, Hybrid and other related programs.
[0621]
Several additional genomic regions can also be identified. This is because the selected SeqCalling assembly is located in these areas. Such SeqCalling sequences can overlap with regions defined by homology or exon prediction. They can also be included because the position of this fragment is in the vicinity of the homology contained in the originally predicted sequence, or the genomic region identified by exon prediction. The sequences thus identified can be manually constructed and then extended using one or more additional sequences obtained from the CuraGen Corporation human SeqCalling database. A SeqCalling fragment suitable for inclusion is called CuraTools ^TM Identified by the program SeqExtend or by identifying SeqCalling fragments located in the appropriate region of the analyzed genomic clone.
[0622]
The region defined by the above procedure is then manually incorporated and a clear mismatch (e.g., from a misread base in the original fragment or predicted exon junction, EST position, (Which may result from mismatches between regions of sequence similarity), leading to the final sequence disclosed herein. If necessary, the process for identifying and analyzing SeqCalling assemblies and genomic clones was repeated, leading to a full-length sequence (Alderborn et al., Determination of Single Nucleotide Polymers by Real-time Pyrophosphate DNA. Sequencing DNA Sequence. 8) 1249-1265, 2000).
[0623]
Example 3: Quantitative expression analysis of clones in various cells and tissues
Quantitative expression of various clones using real-time quantitative PCR (RTQ PCR) using microtiter plates containing RNA samples from cells, cell lines and tissues from various normal and pathological conditions And evaluated. RTQ PCR was performed by Applied Biosystems ABI PRISM® 7700 or ABI PRISM® 7900 HT Sequence Detection System. Various collections of samples are assembled on a plate and panel 1 (including normal tissues and cancer cell lines), panel 2 (including samples derived from tissues from normal and cancer sources), panel 3 (Including cancer cell lines), panel 4 (including cells and cell lines derived from normal tissues and cells associated with inflammatory conditions), panel 5D / 5I (including human tissues and cell lines with importance for metabolic diseases) , AI_comprehensive_panel (including samples from normal tissues and autoinflammatory diseases), panel CNSD. 01 (including samples from normal and diseased brains), and CNS_neurodegeneration_panel (including central nervous system samples from normal and Alzheimer's disease brains).
[0624]
RNA integrity from all samples, visual assessment by agarose gel electrophoresis, and degradation using 28S and 18S ribosomal RNA staining intensity ratio as guide (2: 1-2.5: 1 28s: 18s) Quality is controlled by the absence of low molecular weight RNA, a product indicator. Samples are controlled for genomic DNA contamination by RTQ PCR reactions performed in the absence of reverse transcriptase, using probe and primer sets designed to amplify across the length of a single exon .
[0625]
Initially, RNA samples were normalized to reference nucleic acids (eg, constitutively expressed genes (eg, β-actin and GAPDH)). Normalized RNA (5 μl) was converted to cDNA and using One Step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems; catalog number 4309169) and gene specific primers and by RTQ-PCR according to the manufacturer's instructions analyzed.
[0626]
In other cases, unnormalized RNA samples are converted to single-stranded cDNA (sscDNA) using Superscript II (Invitrogen Corporation; catalog number 18064-147) and random hexamers according to manufacturer's instructions. did. Reactions containing up to 10 μg total RNA were performed in a volume of 20 μl and incubated for 60 minutes at 42 ° C. This reaction can be scaled up to 50 μg total RNA in a final volume of 100 μl. The sscDNA sample is then normalized to a reference nucleic acid as previously described using 1 × TaqMan® Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog number 4324020) according to manufacturer's instructions. To do.
[0627]
Probes and primers were designed for each assay according to the Applied Biosystems Primer Express Software package (Apple Computer Macintosh Power PC version I) or similar algorithm using the target sequence as input. Default settings were used for the reaction conditions and the following parameters were set prior to primer selection: primer concentration = 250 nM, primer melting point (T _m ) Range = 58-60 ° C, optimal primer TM = 59 ° C, maximum primer difference = 2 ° C, probe has no G at 5 ', probe T _m Is the primer T _m Must be 10 ° C. higher, and the size of the amplicon is 75 bp to 100 bp. Selected probes and primers (see below) were synthesized by Synthegen (Houston, TX, USA). The probe is double purified by HPLC to remove uncoupled dye and confirm the coupling of the reporter dye and quencher dye to the 5 'and 3' ends of the probe, respectively, Assessed by mass spectral analysis. Their final concentrations were 900 nM for the forward and reverse primers, respectively, and 200 nM for the probe.
[0628]
PCR conditions: When studying with RNA samples, normalized RNA from each tissue and cell line was spotted in each well of either 96-well or 384-well PCR plates (Applied Biosystems). PCR mixes can consist of a single gene-specific probe and primer set, or two multiplexed probes and primer sets (a set specific to the target clone and another gene-specific set that multiplexes with the target probe) Contains either. The PCR reaction was set up according to the manufacturer's instructions using TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems, catalog number 4313803). Reverse transcription was performed at 48 ° C. for 30 minutes followed by the following amplification / PCR cycle: 95 ° C. for 10 minutes, then 40 cycles of 95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 1 minute. Results are recorded as CT values (cycles where a given sample exceeds the threshold level of fluorescence) using the log scale, where the RNA concentration between the given sample and the sample with the lowest CT value is recorded. The difference is expressed as 2 to the power of ΔCT. The percentage of relative expression is then obtained by taking the reciprocal of this RNA difference and multiplying by 100.
[0629]
When studying with sscDNA samples, normalized sscDNA was used as described above for RNA samples. PCR reactions involving one or two sets of probes and primers as described previously using 1 × TaqMan® Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog number 4324020) according to manufacturer's instructions Set to. PCR amplification was performed as follows: 95 ° C for 10 minutes, then 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 1 minute. Results were analyzed and evaluated as described above.
[0630]
(Panels 1, 1.1, 1.2 and 1.3D)
Panels 1, 1.1, 1.2 and 1.3D plates contain two control wells (genomic DNA control and chemical control) and 94 wells containing cDNA from various samples. The samples in these panels fall into two classes: samples from cultured cell lines and samples from primary normal cells. These cell lines are derived from the following types of cancer: lung cancer, breast cancer, melanoma, colon cancer, prostate cancer, CNS cancer, squamous cell carcinoma, ovarian cancer, liver cancer, kidney cancer, gastric cancer and pancreatic cancer. The cell lines used in these panels are widely available from the American Type Culture Collection (ATCC) (cultured cell line depository) and were cultured using conditions recommended by the ATCC. The normal tissue found in these panels is composed of samples from all major organ systems of one adult individual or fetus. These samples are derived from the following organs: adult skeletal muscle, fetal skeletal muscle, adult heart, fetal heart, adult kidney, fetal kidney, adult liver, fetal liver, adult lung, Fetal lung, various regions of the brain, spleen, bone marrow, lymph node, pancreas, salivary gland, pituitary gland, adrenal gland, spinal cord, thymus, stomach, small intestine, colon, bladder, trachea, chest, ovary, uterus, placenta, prostate, Testis and fat.
[0631]
The following abbreviations are used in the results of panels 1, 1.1, 1.2 and 1.3D:
ca. = Carcinoma
^* = Established by metastasis
met = metastasis
s cell var = small cell mutant
non-s = non-sm = non-small
squam = squamous cell
pl. eff = pl effusion = pleural effusion
glio = glioma
astro = astrocytoma, and
neuro = neuroblastoma.
[0632]
(General_Screening_Panel_v1.4 (General_screening_panel_v1.4))
The panel 1.4 panel contains 2 control wells (genomic DNA control and chemical control) and 94 wells containing cDNA from various samples. Samples in panel 1.4 fall into two classes: samples from cultured cell lines and samples from primary normal cells. This cell line is derived from the following types of cancer: lung cancer, breast cancer, melanoma, colon cancer, prostate cancer, CNS cancer, squamous cell carcinoma, ovarian cancer, liver cancer, kidney cancer, stomach cancer and pancreatic cancer. The cell lines used in panel 1.4 are widely available from the American Type Culture Collection (ATCC) (cultured cell line depository) and are cultured using conditions recommended by the ATCC. The normal tissue found in panel 1.4 consists of a pool of samples from 2-5 different adult individuals or fetal all major organ systems. These samples are derived from the following organs: adult skeletal muscle, fetal skeletal muscle, adult heart, fetal heart, adult kidney, fetal kidney, adult liver, fetal liver, adult lung, Fetal lung, various regions of the brain, spleen, bone marrow, lymph node, pancreas, salivary gland, pituitary gland, adrenal gland, spinal cord, thymus, stomach, small intestine, colon, bladder, trachea, chest, ovary, uterus, placenta, prostate, Testis and fat. Abbreviations are as described for panels 1, 1.1, 1.2 and 1.3D.
[0633]
(Panels 2D and 2.2)
Panels 2D and 2.2 plates typically contain two control wells and 94 test samples. This is isolated from human tissue obtained from surgeon's work or in close cooperation with National Cancer Institute's Cooperative Human Tissue Network (CHTN) or National Dissease Research Initiative (NDRI) Composed. Tissues are derived from human malignancies, and where indicated, many malignant tissues have a “matched margin” derived from non-cancerous tissue immediately adjacent to the tumor. These are called normal adjacent tissues and are described as “NAT” in the following results. Tumor tissue and “aligned edges” are evaluated by two separate pathologists (again by a surgical pathologist and an NDRI or CHTN pathologist). This analysis provides an overall histopathological assessment of the stage of tumor differentiation. In addition, most samples contain original surgical pathology reports. This provides information regarding the clinical stage of the patient. These aligned edges are taken from tissue around the surgical area (ie, immediately adjacent) (normal adjacent tissue is designated as “NAT” in Table RR). In addition, RNA and cDNA samples were obtained from various human tissues derived from autopsy performed on elderly or victims of sudden death (such as accidents). These tissues were confirmed to have no disease and were purchased from various commercial sources such as Clontech (Palo Alto, CA), Research Genetics, and Invitrogen.
[0634]
(Panel 3D)
Panel 3D plates contain 94 cDNA samples and 2 control samples. Specifically, 92 of these samples are derived from cultured human cancer cell lines, 2 samples are human primary cerebellar tissue, and 2 are controls. Human cell lines are generally obtained from ATCC (American Type Culture Collection), NCI, or German tumor cell banks and divided into the following tissue groups: squamous cell carcinoma of the tongue, breast cancer, prostate cancer, Melanoma, epidermoid carcinoma, sarcoma, bladder cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, leukemia / lymphoma, ovarian / uterine / cervical cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, and CNS cancer cell lines. In addition, there are two independent samples of the cerebellum. All of these cells were cultured under standard recommended conditions and RNA was extracted using standard procedures. Panel 3D and 1.3D cell lines are the most common cell lines used in the scientific and technical literature.
[0635]
(Panels 4D, 4R and 4.1D)
Panel 4 contains the samples on a 96 well plate (2 control wells, 94 test samples). It is composed of RNA (panel 4R) or cDNA (panel 4D / 4.1D) isolated from various human cell lines or tissues associated with inflammatory conditions. Total RNA from control and normal tissues such as colon and lung (Stratagene, La Jolla, CA) and thymus and kidney (Clontech) was used. Total RNA from liver tissue from cirrhotic patients and kidney from lupus patients was obtained from BioChain (Biochain Institute, Inc., Hayward, Calif.). Intestinal tissue for preparation of RNA from patients diagnosed with Crohn's disease and ulcerative colitis was obtained from the National Disease Research Interchange (NDRI) (Philadelphia, PA).
[0636]
Astrocytes, lung fibroblasts, dermal fibroblasts, coronary smooth muscle cells, small airway epithelial cells, bronchial epithelial cells, microvascular skin endothelial cells, microvascular lung endothelial cells, human pulmonary aortic vascular endothelial cells, Human umbilical vein vascular endothelial cells were all purchased from Clonetics (Walkersville, MD) and grown in media supplied by Clonetics to these cell types. These primary cell types were activated for 6 hours and / or 12-14 hours with various cytokines or combinations of cytokines as indicated. The following cytokines were used: about 1-5 ng / ml IL-1β, about 5-10 ng / ml TNFα, about 20-50 ng / ml IFNγ, about 5-10 ng / ml IL-4, about 5 10 ng / ml IL-9, about 5-10 ng / ml IL-13. Endothelial cells were occasionally depleted for various times by culturing in basal medium with Clonetics with 0.1% serum.
[0637]
Mononuclear cells were prepared from the blood of CuraGen Corporation employees using Ficoll. LAK cells were treated with DMEM, 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco / Life Technologies, Rockville, MD), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10. ^-5 These cells were prepared by incubation for 4-6 days in M mercaptoethanol (Gibco), and 10 mM Hepes (Gibco), and interleukin 2 (Interleukin 2). The cells were then treated with 10-20 ng / ml PMA, and 1-2 μg / ml ionomycin, 5-10 ng / ml IL-12, 20-50 ng / ml IFNγ, and 5-10 ng / ml IL-18. Activated for 6 hours. In some cases, the mononuclear cells are treated with DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential, containing about 5 μg / ml PHA (phytohaemagglutinin) or PWM (Apis pokeweed mitogen). Amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10 ^-5 The cells were cultured for 4-5 days in M mercaptoethanol (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco). Samples were taken at 24, 48, and 72 hours for RNA preparation. MLR (mixed lymphocyte reaction) samples were collected from two donors, mononuclear cells were isolated using Ficoll, and the isolated mononuclear cells were isolated from DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM. Non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol (5.5 × 10 5 ^-5 M) (Gibco), and about 2 × 10 in 10 mM Hepes (Gibco) ⁶ Obtained by mixing 1: 1 at a final concentration of 1 cell / ml. The MLR was cultured and samples were taken at various time points ranging from 1-7 days for RNA preparation.
[0638]
Monocytes were isolated from mononuclear cells using CD14 Miltenyi Beads, + veVS selection column and Vario Magnet according to the manufacturer's instructions. Monocytes were isolated from DMEM 5% fetal bovine serum (FCS) (Hyclone, Logan, UT), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10. ^-5 Dendritic cells were differentiated by 5-7 days of culture in M mercaptoethanol (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco), 50 ng / ml GMCSF, and 5 ng / ml IL-4. Macrophages were treated with DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10. ^-5 Prepared by culturing monocytes for 5-7 days in M mercaptoethanol (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco), and 10% AB human serum or about 50 ng / ml MCSF. Monocytes, macrophages and dendritic cells were stimulated with 100 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) for 6 hours and 12-14 hours. Dendritic cells were also stimulated with 10 μg / ml anti-CD40 monoclonal antibody (Pharmingen) for 6 hours and 12-14 hours.
[0639]
CD4 lymphocytes, CD8 lymphocytes and NK cells were also isolated from mononuclear cells using CD4, CD8 and CD56 Miltenyi beads, a positive VS selection column, and Vario Magnet according to the manufacturer's instructions. CD45RA lymphocytes and CD45RO CD4 lymphocytes are isolated by depleting CD8, CD56, CD14 and CD19 cell mononuclear cells using Miltenyi beads and positive selection of CD8, CD56, CD14 and CD19 did. CD45RO CD4 lymphocytes were then isolated using CD45RO beads and the remaining cells were CD45RA CD4 lymphocytes. CD45RA CD4, CD45RO CD4 and CD8 lymphocytes were purified from DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10. ^-5 Place in M mercaptoethanol (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco) and coat overnight with 0.5 μg / ml anti-CD28 (Pharmingen) and 3 μg / ml anti-CD3 (OKT3, ATCC) in PBS On a Falcon 6-well tissue culture plate ⁶ Plated at cells / ml. After 6 and 24 hours, cells were harvested for RNA preparation. To prepare chronically activated CD8 lymphocytes, we activated isolated CD8 lymphocytes for 4 days on anti-CD28 and anti-CD3 coated plates and then recovered the cells DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10 ^-5 Grown in M mercaptoethanol (Gibco), and 10 mM Hepes (Gibco), and IL-2. The proliferated CD8 cells were then again activated with anti-CD3 and anti-CD28 bound to the plate for 4 days and expanded as before. RNA was isolated 6 and 24 hours after the second activation and 4 days after the second culture expansion. Isolated NK cells were treated with DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM nonessential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10 5 ^-5 Cultured in M mercaptoethanol (Gibco), and 10 mM Hepes (Gibco), and IL-2 for 4-6 days prior to RNA preparation.
[0640]
Tonsils were obtained from NDRI to obtain B cells. The tonsils were cut with a sterile dissecting scissor and then passed through a sieve. The amygdala cells were then spun down and DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM nonessential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10. ^-5 10 in M mercaptoethanol (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco) ⁶ Resuspended at individual cells / ml. To activate the cells we used PWM at 5 μg / ml, or anti-CD40 (Pharmingen) at about 10 μg / ml and IL-4 at 5-10 ng / ml. Cells were harvested at 24, 48, and 72 hours for RNA preparation.
[0641]
To prepare primary Tr1 cells and second generation Th1 / Th2 cells and Tr1 cells, 6 well Falcon plates were coated overnight with 10 μg / ml anti-CD28 (Pharmingen) and 2 μg / ml OKT3 (ATCC), Then it was washed twice with PBS. Umbilical cord blood CD4 lymphocytes (Poietic Systems, German Town, MD), DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10 ^-5 10 in M mercaptoethanol (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco), and IL-2 (4 ng / ml). ⁵ -10 ⁶ Cultured in individual cells / ml. IL-12 (5 ng / ml) and anti-IL-4 (1 μg / ml) were used to direct Th1, while IL-4 (5 ng / ml) and anti-IFNγ (1 μg / ml) were Th2 And 5 ng / ml IL-10 was used to direct Tr1. After 4-5 days, activated Th1 lymphocytes, Th2 lymphocytes and Tr1 lymphocytes were washed once in DMEM and DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM Sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10 ^-5 Grow in 4-7 days in M mercaptoethanol (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco), and IL-2 (1 ng / ml). After this, activated Th1, lymphocyte and Tr1 lymphocytes were added with anti-CD28 / OKT3 and cytokines as described above, but with anti-CD95L (1 μg / ml) to prevent apoptosis. And restimulated for 5 days. After 4-5 days, Th1 lymphocytes, Th2 lymphocytes and Tr1 lymphocytes were washed and then expanded again with IL-2 for 4-7 days. Activated Th1 and Th2 lymphocytes were maintained in this manner for up to 3 cycles. RNA was 6 and 24 hours after the second and third activation with anti-CD3 and anti-CD28 mAbs bound to the plate and 4 of the second and third growth cultures in interleukin-2. On the day, it was prepared from the first and second Th1, Th2 and Tr1.
[0642]
The following leukocyte lines were obtained from ATCC: Ramos, EOL-1, KU-812. EOL cells are 5 × 10 ⁵ 8 days of culture in 0.1 mM dbcAMP per cell / ml, medium change every 5 days, and 5 × 10 ⁵ Further differentiation was achieved by adjusting the cell concentration to individual cells / ml. For culturing these cells, we have 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10 5. ^-5 DMEM or RPMI (as recommended by ATCC) with the addition of M mercaptoethanol (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco) was used. RNA was prepared from either resting cells or cells activated with 10 ng / ml PMA and 1 μg / ml ionomycin for 6 and 14 hours. Keratinocyte line CCD106 and airway epithelial tumor line NCI-H292 were also obtained from ATCC. Both DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 5.5 × 10 ^-5 Cultured in M mercaptoethanol (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco). CCD1106 cells were activated with approximately 5 ng / ml TNFα and 1 ng / ml IL-1β for 6 and 14 hours, while NCI-H292 cells were activated with the following cytokines for 6 and 14 hours: 5 ng / ml IL-4, 5 ng / ml IL-9, 5 ng / ml IL-13, and 25 ng / ml IFNγ.
[0643]
About 10 for these cell lines and blood cells ⁷ RNA was prepared by lysing cells / ml using Trizol (Gibco BRL). Briefly, 1/10 volume of bromochloropropane (Molecular Research Corporation) was added to the RNA sample, vortexed, and after 10 minutes at room temperature, the tube was spun at 14,000 rpm in a Sorvall SS34 rotor. The aqueous phase was collected and placed in a 15 ml Falcon Tube. An equal volume of isopropanol was added and left at -20 ° C overnight. The precipitated RNA was spun down at 9,000 rpm for 15 minutes in a Sorvall SS34 rotor and washed in 70% ethanol. The pellet was redissolved in 300 μl RNAse free water and 35 μl buffer (Promega), 5 μl DTT, 7 μl RNAsin, and 8 μl DNAse were added. The tube is incubated for 30 minutes at 37 ° C. to remove contaminating genomic DNA, extracted once with phenol chloroform, and again with 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of 100% ethanol. Precipitated. RNA was spun down and placed in RNAse free water. RNA was stored at -80 ° C.
[0644]
(AI_Comprehensive Panel_v1.0)
The AI_Comprehensive Panel_v1.0 plate contains 2 control wells and 89 test samples. This includes cDNA isolated from surgical postmortem human tissue obtained from Bacus Hospital and Clinomics (Frederick, MD). Total RNA was extracted from tissue samples from Backus Hospital at the CuraGen facility. Total RNA from other tissues was obtained from Clinomics.
[0645]
Joint tissue, including synovial fluid, synovium, bone and cartilage, was obtained from a patient who had undergone all knee or hip replacement surgery at Backus Hospital. Tissue samples were frozen instantly in liquid nitrogen to ensure that the isolated RNA was not degraded in an optimal amount. Additional samples of osteoarthritis and rheumatoid arthritis connective tissue were obtained from Clinomics. Normal control tissue was supplied by Clinomics and obtained during the autopsy of the trauma victim.
[0646]
Surgical specimens of psoriatic tissue and adjacent matched tissue were provided as total RNA by Clinomics. Two male patients and two female patients were selected between 25 and 47 years old. The patient is not receiving the drug when the sample is isolated.
[0647]
Surgical colon surgical specimens and patients with adjacent matching tissue from patients with ulcerative colitis and Crohn's disease were obtained from Clinomics. Intestinal tissue from 3 female Crohn's disease patients and 3 male Crohn's disease patients aged 41 to 69 years was used. Two patients did not take medications that required prescriptions, while others took dexamethasone, phenobarbital, or tylenol. Ulcerative colitis tissue is derived from three male patients and four female patients. Four of the patients took levvid and two took phenobarbital.
[0648]
Total RNA from postmortem lung tissue from trauma victims with no disease or with emphysema, asthma or COPD was purchased from Clinomics. Emphysema patients range from 40 to 70 years, all are smokers, and this age range focuses on patients with tobacco-related emphysema and chooses to avoid patients with alpha-1 antitrypsin deficiency did. Asthma patients ranged from 36 to 75 years old and smokers were excluded to avoid being patients who could also have COPD. COPD patients ranged from 35 to 80 years and included both smokers and non-smokers. Most patients took corticosteroids and bronchodilators.
[0649]
The following abbreviations were used for the labels used to identify tissues in the AI_Comprehensive Panel_v1.0 panel:
AI = autoimmunity
Syn = Synovial fluid
Normal = No apparent disease
Rep22 / Rep20 = individual patient
RA = rheumatoid arthritis
Backus = From Backus Hospital
OA = osteoarthritis
(SS) (BA) (MF) = individual patient
Adj = adjacent tissue
Match control = adjacent tissue
-M = Male
-F = Female
COPD = chronic obstructive pulmonary disease.
[0650]
(Panels 5D and 5I)
Panels 5D and 5I plates contain various cDNAs and cell lines isolated from two control wells and human tissue with an emphasis on metabolic diseases. Metabolic tissue was obtained from patients enrolled in the Gestational Diabetes Study. Cells were obtained during different stages in the differentiation of adipocytes derived from human mesenchymal stem cells. Human pancreatic islets were also obtained.
[0651]
In gestational diabetes research, subjects are young (18 to 40 years old), otherwise healthy women with or without gestational diabetes undergoing conventional (selective) caesarean section is there. After delivery of the fetus, when the surgical incision was repaired / closed, the obstetrician removed a small sample (less than 1 cc) of exposed metabolic tissue during each surgical level of closure. Biopsy material was rinsed with sterile saline, blotted, and snap frozen within 5 minutes of tissue removal. The tissue was then snap frozen in liquid nitrogen and stored individually in sterile screw cap tubes and kept on dry ice for transport and collected by CuraGen. Target metabolic tissues include uterine wall (smooth muscle), visceral fat, skeletal muscle (stratus abdominis), and subcutaneous fat. The patient description is as follows:
Patient 2: Latin American diabetic, overweight, no insulin
Patients 7-9: non-diabetic white, obese (BMI> 30)
Patient 10: Latin American diabetic, overweight, insulin administration
Patient 11: Non-diabetic American black, overweight
Patient 12: Latin American diabetes patient, insulin administration.
[0652]
Adipocyte differentiation was induced in triplicate in donor precursor cells obtained from Osirus (Clonetics / BioWhittaker division) except for donor 3U, which had only two replicates. Clonetics scientists are working with Mark F. for CuraGen. Human mesenchymal stem cells (HuMSCs) were isolated, propagated and differentiated based on the published protocol found in Pittenger et al., Multilineage Potential of Human Human Senstem Stem Cell Science, April 2, 1999: 143-147. Clonetics provided Trizol lysates or frozen pellets suitable for mRNA isolation and ds cDNA generation. A general description of each donor is as follows:
Donors 2 and 3U: Mesenchymal stem cells, undifferentiated fat
Donor 2 and 3AM: fat, differentiating fat
Donor 2 and 3AD: fat, differentiated fat.
[0653]
Human cell lines were generally obtained from ATCC (American Type Culture Collection), NCI, or German tumor cell banks and divided into the following tissue groups: proximal convoluted tubules, uterine smooth muscle, small intestine Liver HepG2 cancer cells, cardiac primary matrix cells, and adrenocortical glandular cells. These cells were all cultured under standard recommended conditions, and RNA was extracted using standard procedures. All samples were treated with CuraGen to generate single stranded cDNA.
[0654]
Panel 5I includes all the previously described samples with the addition of pancreatic islets from a 58 year old female patient obtained from the Diabetes Research Institute at the University of Miami School of Medicine. Islet tissue was processed to total RNA at an external source and sent to CuraGen for addition to panel 51.
[0655]
In the labels used to identify tissues in the 5D and 5I panels, the following abbreviations are used:
GO Adipose
SK = skeletal muscle
UT = uterus
PL = placenta
AD = differentiated fat
AM = moderately differentiated fat
U = undifferentiated stem cell
(Panel CNSD.01)
Panel CNSD. The plate for 01 contains 2 control wells and 94 test samples consisting of cDNA isolated from postmortem human brain tissue obtained from Harvard Brain Tissue Resource Center. The brain is removed from the donor calvaria between 4 and 24 hours after death, sectioned by a neuroanatomist and frozen in liquid nitrogen vapor at -80 ° C. All brains are sectioned and examined by a neuropathologist to confirm a diagnosis clearly associated with neuropathology.
[0656]
Disease diagnosis is obtained from patient records. This panel includes two brains from each of the following diagnoses: Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, progressive supranuclear palsy, depression, and “normal controls”. Within each of these brains, the following areas are displayed: zonal gyrus, cerebral temporal pole, globus palladus, substantia nigra, Broadman field 4 (early motorized strip), Broadman field 7 (parietal cortex), Broadman area 9 (prefrontal cortex), and Broadman area 17 (occipital cortex). Not all brain regions are shown in all cases, for example, Huntington's disease is characterized in part by neurodegeneration in the pallidum and thus this region is identified as Huntington It is impossible to get from. Parkinson's disease is also characterized by substantia nigra degeneration making this area more difficult to obtain. Normal control brains were tested for neurophysiology and found to be free of any pathology consistent with neurodegeneration.
[0657]
The following abbreviations are used in the labels used to identify tissues in the CNS panel.
PSP = progressive supranuclear palsy
Sub Nigra = Black matter
Glob Palladus = Globus palladus
Temp Pole = Cranial temporal pole
Cing Gyr = Zonal times
BA4 = Broadman field 4
(Panel CNS_Neurodegeneration_V1.0 (Panel CNS_Neurodegeneration_V1.0))
Plates for panel CNS_Neurodegenesis_V1.0 were obtained from two control wells, as well as Harvard Brain Tissue Resource Center (McLean Hospital) and Human Brain and Spinal Fluid Resource Center (VA Greater Energy Loss). 47 test samples composed of cDNA isolated from human brain tissue. The brain is removed from the donor calvaria between 4 and 24 hours after death, sectioned by a neuroanatomist and frozen in liquid nitrogen vapor at -80 ° C. All brains are sectioned and examined by a neuropathologist to confirm a diagnosis clearly associated with neuropathology.
[0658]
Disease diagnosis is obtained from patient records. This panel includes 6 brains from Alzheimer's disease (AD) patients and 8 brains from “normal controls” that show no symptoms of dementia before death. The eight normal control brains are divided into two categories: controls with no dementia or Alzheimer-like pathology (control), and no symptoms of dementia but severe Alzheimer-like pathology Controls (especially senile plaque burden rated as level 3 on a 0-3 scale; 0 = no plaque symptoms, 3 = severe AD senile plaque burden) Within each of these brains, the following areas are shown: hippocampus, temporal cortex (Broadman area 21), parietal cortex (Broadman area 7), and occipital cortex (Broadman area 17). These regions were selected to include all levels of neurodegeneration in AD. The hippocampus is a region of early and severe neuronal loss in AD; the temporal cortex is known to show neurodegeneration in AD after the hippocampus; the parietal cortex is this It exhibits moderate neuronal death in the late stages of the disease, and the occipital cortex survives in AD and therefore acts as a “control” area in AD patients. Not all brain regions are shown in all cases.
[0659]
The following abbreviations are used in the labels used to identify tissues in the CNS_Neurodegenerative_V1.0 panel.
AD = Alzheimer's disease brain; patient became demented and showed AD-like pathology at necropsy
Control = control brain; patient did not have dementia and showed no pathology
Control (Path) = control brain; patient did not develop dementia but showed severe AD-like pathology
Sup Temporal Ctx = Upper temporal cortex
Inf Temporal Ctx = Inferior temporal cortex
(A. NOV3 (NOV3a and NOV3b): B7-H2)
The expression of the NOV3 gene (CG55790-03 and CG55790-04) was evaluated using the primer-probe sets Ag2589, Ag2621 and Ag2915 described in Tables 19, 20 and 21. The results of the RT-PCR run are shown in Tables 22, 23, 24 and 25.
[0660]
[Table 19]

[0661]
[Table 20]

[0662]
[Table 21]

[0663]
[Table 22-1]

[0664]
[Table 22-2]

[0665]
[Table 23-1]

[0666]
[Table 23-2]

[0667]
[Table 23-3]

[0668]
[Table 23-4]

[0669]
[Table 24-1]

[0670]
[Table 24-2]

[0671]
[Table 25-1]

[0672]
[Table 25-2]

[0673]
[Table 25-3]

(Summary of CNS_neurodegeneration_V1.0)
Ag2589 / Ag2621 / Ag2915 The results generated by multiple experiments with the same probe and primer set agree very well. In all cases, NOV3a gene expression is upregulated in the temporal cortex of Alzheimer's disease patients when compared to non-demented controls. This difference is evident when the data is analyzed via ANCOVA, using all RNA quality and / or quantity as covariates. This gene upregulation is most evident in the variants detected by Ag1845. The temporal cortex is an area that shows degeneration at an intermediate stage of the disease. Thus, in AD, in contrast to the hippocampus and inner olfactory cortex, where many neurons have already been lost until death, the phenomenon of neurodegeneration appears to have been captured in this area. Furthermore, in the occipital cortex (where neurodegeneration does not occur in Alzheimer's disease), it is found that this gene is not upregulated in the same patient. Taken together, these data suggest that this gene is at least a marker of Alzheimer-like neurodegeneration and is probably involved in the process of neurodegeneration.
[0674]
Furthermore, this gene is a form of B7 protein (B7-H2B), which plays a role in inflammation. Neuroinflammation has been implicated in AD in previous studies in that long-term use of anti-inflammatory agents has been associated with a reduced incidence of Alzheimer's. This gene thus represents an excellent drug target for the treatment of Alzheimer's disease and any other neuroinflammatory condition.
[0675]
(Summary of panel 1.3D)
Ag2589 / Ag2621 / Ag2915 Multiple experiments with the same set of probes and primers produce very good matching results. Maximum expression of the NOV3a gene is found in brain, fetal kidney, and breast cancer cell lines.
[0676]
Expression in the CNS panel confirms the expression of this gene in the CNS. For a discussion of the utility of this gene in the central nervous system, see the panel, CNS_Neurodegeneration.
[0677]
Higher levels of expression are also consistently seen in fetal skeletal muscle (CT = 29-30) when compared to expression in adult skeletal muscle (CT = 33-35). Thus, the expression of the NOV3a gene can be used to distinguish between adult and fetal sources of this tissue.
[0678]
The NOV3a gene product is also moderately expressed in the pancreas, adrenal gland, thyroid, pituitary, adult and fetal liver, adult and fetal heart, and fat. Based on its expression profile in metabolic tissues, this gene product may be useful in the diagnosis and / or treatment of metabolic diseases including obesity and diabetes.
[0679]
(Summary of panel 2.2)
Expression of the Ag2621 NOV3a gene appears to be maximal in samples from normal kidney margin (CT = 29.1). Furthermore, there appears to be substantial expression associated with some kidney cancer samples. Thus, the expression of this gene can be used to distinguish this normal kidney sample from other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies may be beneficial for the treatment of kidney cancer.
[0680]
(Summary of panel 4D)
Ag2589 / Ag2621 / Ag2915 NOV3a transcript is highly expressed on activated EOL cells, activated lung and skin microvascular endothelium, activated human pulmonary artery endothelial cells, and TNFα-activated human umbilical vein endothelial cells. NOV3a encodes B7-H2, which was shown to be important in antigen presentation. This B7-H2 is a ligand for ICOS and provides a costimulatory molecule (Ref. 1-2). Thus, monoclonal antibody therapeutics designed using the NOV3a protein product can reduce or inhibit antigen presentation and can be important in the treatment of diseases such as asthma where T cells are chronically stimulated. .
[0681]
(References)
Ling V, Wu PW, Finnery HF, Bean KM, Spaulding V, Fuser LA, Leonard JP, Hunter SE, Zollner R, Thomas JL, Miyashiro JS, Jacobs KA, Colls. Cutting edge: identification of GL50, a novel B7-like protein that functionally binds to ICOS receptor. J Immunol 2000 Feb 15; 164 (4): 1653-7
By genetic selection of a mouse cDNA encoding a secreted protein, a B7-like cDNA clone named mouse GL50 (mGL50) encoding a 322aa polypeptide identical to B7h was isolated. Isolation of the human orthologue (hGL50) of this cDNA showed a coding sequence of 309aa residue with 42% sequence identity with mGL50. Northern analysis showed that GL50 is present in many tissues including lymphocyte samples, embryonic yolk sac samples, and fetal liver samples. Of the CD28, CTLA4, and ICOS fusion constructs tested, flow cytometry analysis showed that only mouse ICOS-IgG binds to the mGL50 cell transfection. Subsequent phenotyping showed that high levels of ICOS ligand stain on splenic CD19 + B cells and low levels of ICOS ligand stain on CD3 + T cells. These results indicate that GL50 is a specific ligand for the ICOS receptor and suggest that the GL50-ICOS interaction functions in lymphocyte costimulation.
[0682]
Wang S, Zhu G, Chapoval AI, Dong H, Tamada K, Ni J, Chen L. Costulation of T cells by B7-H2, a B7-like molecular that binds ICOS. Blood 2000 Oct 15; 96 (8): 2808-13.
[0683]
This report describes a new human B7-like gene called B7-H2. Cell surface expression of B7-H2 protein is detected in monocyte-derived immature dendritic cells. A soluble B7-H2 and immunoglobulin (Ig) fusion protein (B7-H2Ig) binds activated T cells but not resting T cells, and this binding is induced by the inducible costimulator Ig Inhibited by (ICOSIg) but not by CTLA4Ig. Furthermore, ICOSIg stains Chinese hamster ovary cells transfected with the B7-H2 gene. By suboptimal cross-linking of CD3, costimulation of T cell proliferation by B7-H2Ig is dose dependent and correlates with secretion of interleukin (IL) -2, but optimal CD3 ligation is IL-10. Stimulate production preferentially. This result indicates that B7-H2 is a putative ligand for ICOS T cell molecules. (Blood. 2000; 96: 2808-2813)
PMID: 11023515
(B. NOV4a: B7-H1)
The expression of the NOV4a gene (CG56110-01) was evaluated using the primer-probe set Ag1544 described in Table 26. The results of the RTQ-PCR run are shown in Tables 27, 28, 29 and 30.
[0684]
[Table 26]

[0685]
[Table 27-1]

[0686]
[Table 27-2]

[0687]
[Table 28-1]

[0688]
[Table 28-2]

[0689]
[Table 29]

[0690]
[Table 30]

(Panel 1.2 overview): The Ag1544 NOV4a gene is most highly expressed in the heart (CT = 23.4). This gene also has moderate to high levels of expression in several other endocrine / metabolism related tissues, including adrenal gland, kidney, liver, skeletal muscle, and small intestine. Accordingly, therapeutic modulators for this gene and / or gene product may be useful in the treatment of diseases of the endocrine / metabolic organ.
[0691]
The expression of this NOV4a gene confirms expression in the hippocampus, thalamus and cerebral cortex. See panel 1.3D for a discussion of the utility of this gene in the central nervous system.
[0692]
In addition, there is substantial expression associated with three lung cancer cell lines. Thus, this NOV4a expression can be used to distinguish heart tissue from other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene via small molecule drugs, antibodies or protein therapeutics may be beneficial for the treatment of lung cancer.
[0693]
(Panel 1.3D Summary): Ag1544 NOV4a gene expression appears to be highest in samples from gastric cancer cell line (NCI-H87) (CT = 27.3). In addition, there is substantial expression found in lung cancer cell lines, breast cancer cell lines and placental tissue. Thus, expression of this gene can be used to distinguish NCI-H87 cells from other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene by the use of small molecule drugs, antibodies or protein therapeutics may be beneficial for the treatment of lung cancer or breast cancer.
[0694]
(Panel 2D Overview): The expression of the Ag1544 NOV4a gene was assessed by two independent runs in panel 2D, with very good agreement between these runs. In these two runs, there is high expression associated with bladder cancer tissue and lung tissue from the sample. Thus, the expression of this NOV4a gene can be used to distinguish between these samples and the remaining samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene by the use of small molecule drugs, antibodies or protein therapeutics may be beneficial for the treatment of bladder cancer or lung cancer.
[0695]
(Panel 4.1D Overview): Ag1544 This NOV4a transcript is expressed in LAK cells and activated with PMA / ionomycin, dendritic cells treated with LPS, monocytes treated with LPS, It is induced in γ-interferon-treated HUVEC cells and keratinocytes treated with TNFα and IL-1β. This transcript encodes a smaller isoform of B7-H1, an antigen-posting co-receptor. B7-H1 binds to PD-1 ligand on T cells, leading to T cell activation and IL-10 production. Antibodies, or other types of therapeutic agents designed with B7-H1, can block T cell activation, especially in the treatment of T cell mediated diseases such as asthma, psoriasis, IBD and arthritis is important. Alternatively, agonist therapeutics can be designed with NOV4a protein and have adjuvant or immunomodulatory properties.
[0696]
(References)
Dong H, Zhu G, Tamada K, Chen L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell propagation and interleukin-10 section. Nat Med 1999 Dec; 5 (12): 1365-9.
[0697]
Members of the B7 family, B7-1 and B7-2, interact with CD28 and build a co-stimulatory pathway of T cells essential in the initiation of antigen-specific humoral and cell-mediated immune responses . Here we describe that a third member of the B7 family (referred to as B7-H1) does not bind CD28, cytotoxic T lymphocytes A4 or ICOS (inducible costimulatory factor). . B7-H1 ligation costimulated polyclonal stimulation and T cell responses to alloantigens and preferentially stimulated production of interleukin-10. Interleukin-2 was produced only in small amounts, but was required for the effect of B7-H1 costimulation. Thus, our studies have defined costimulatory molecules that can be involved in negative regulation of cell-mediated immune responses, previously unknown.
[0698]
PMID: 10581077
(C. NOV4b): NOV4a splicing variant, B7H1
The expression of the NOV4b gene (CG56110-04) was evaluated using the primer-probe set (Ag5282) described in Table 31. The results of RTQ-PCR run are shown in Tables 32, 33 and 34.
[0699]
[Table 31]

[0700]
[Table 32]

[0701]
[Table 33]

[0702]
[Table 34]

(CNS_neurogeneration_v1.0 Summary): Ag5282 The expression of this NOV4b gene is low or undetectable in all samples of this panel (CT> 35). (Data not shown).
[0703]
(General_screening_panel_v1.5 Overview): Ag5282 NOV4b gene expression appears to be highest in samples from gastric cancer cell line (NCI-H87) (CT = 31). Thus, there is a relatively low expression in the remaining samples of panel 1.5. Thus, expression of this gene could be used to distinguish NCI-H87 cells from other samples in this panel.
[0704]
(Panel 4.1D Overview): The Ag5282 NOV4b transcript is not expressed in normal tissue samples in this panel. This transcript is expressed in LAK cells and PMA / ionomycin activated LAK cells, LPS treated dendritic cells, LPS treated monocytes, γ interferon treated HUVEC cells and TNFα And induced in keratinocytes treated with IL-1β. This NOV4b transcript encodes a smaller isoform of B7-H1, an antigen-posting co-receptor. B7-H1 binds to PD-1 ligand on T cells and results in T cell activation and IL-10 production. Antibodies, or other types of therapeutic agents designed with B7-H1, block T cell activation and are particularly important in the treatment of T cell mediated diseases such as asthma, psoriasis, IBD and arthritis . Alternatively, agonist therapeutics can be designed with this protein and have adjuvant-like properties.
[0705]
(References):
Dong H, Zhu G, Tamada K, Chen L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell propagation and interleukin-10 section. Nat Med 1999 Dec; 5 (12): 1365-9.
[0706]
Members of this B7 family, B7-1 and B7-2, interact with CD28 and build a co-stimulatory pathway of T cells essential in the initiation of antigen-specific humoral and cell-mediated immune responses To do. Here we describe that a third member of the B7 family (referred to as B7-H1) does not bind CD28, cytotoxic T lymphocytes A4 or ICOS (inducible costimulator). . B7-H1 ligation costimulated polyclonal stimulation and T cell responses to alloantigens and preferentially stimulated production of interleukin-10. Interleukin-2 was produced only in small amounts, but was required for the effect of B7-H1 costimulation. Thus, our studies have defined costimulatory molecules that can be involved in negative regulation of cell-mediated immune responses, previously unknown.
[0707]
PMID: 10581077
(D. NOV5a): Prostasin
The expression of the NOV5a gene (CG56142-01) was evaluated using the primer-probe set described in Table 35 (Ag2888). The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables 36, 37 and 38.
[0708]
[Table 35]

[0709]
[Table 36]

[0710]
[Table 37]

[0711]
[Table 38]

(Panel 1.3D Overview): Expression of the Ag2888 NOV5a gene was evaluated in two independent runs in panel 1.3D. The expression of this gene appears to be highest and almost exclusive to samples from colon cancer (CT = 31). Thus, the expression of this NOV5a gene can be used to distinguish this sample from the other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene through the use of small molecule drugs, antibodies or protein therapeutics may be beneficial for the treatment of colon cancer.
[0712]
(Panel 2D overview): Expression of the Ag2888 NOV5a gene appears to be the highest and almost exclusive to samples from colon cancer (CT = 30). This expression is consistent with that in panel 1.3D. Thus, the expression of this NOV5a gene can be used to distinguish this sample from the other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene through the use of small molecule drugs, antibodies or protein therapeutics may be useful for the treatment of colon cancer.
[0713]
(Panel 3D overview): Expression of the Ag2888 NOV5a gene appears to be the highest and almost exclusive to samples from gastric cancer cell lines (CT = 34.1). Thus, the expression of this gene can be used to distinguish this sample from the other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of the NOV5a gene by use of small molecule drugs, antibodies or protein therapeutics may be beneficial for the treatment of gastric cancer.
[0714]
(Panel 4D overview): Ag2888 NOV5a gene expression is low or undetectable in all samples of this panel (CT> 35). (Data not shown).
[0715]
(E. NOV5b): Prostasin
The expression of the NOV5b gene (CG56142-02) was evaluated using the primer-probe set described in Table 39 (Ag4095). The results of RTQ-PCR run are shown in Tables 40, 41 and 42.
[0716]
[Table 39]

[0717]
[Table 40]

[0718]
[Table 41]

[0719]
[Table 42]

(CNS_neurogeneration_v1.0 Overview): Ag4095 NOV5b gene expression is low or undetectable in all samples of this panel (CT> 35). (Data not shown).
[0720]
(General_screening_panel_v1.4 Overview): The expression of the Ag4095 NOV5b gene appears to be the highest and almost exclusive to samples from colon cancer cell lines (CT = 27). Thus, the expression of this gene can be used to distinguish this colon cancer sample from the other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of the NOV5b gene by use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies may be beneficial for the treatment of colon cancer.
[0721]
(Panel 4.1D Overview): The Ag4095 NOV5b gene (prostasin homolog) is almost exclusively expressed in resting neutrophils. This expression is almost reduced to background levels in neutrophils activated by TNF-α + LPS (CT = 34.18). This expression profile suggests that the serine proteinase homolog encoded by the NOV5b gene is produced by resting neutrophils but not by activated neutrophils. Therefore, this NOV5b gene product can reduce the activation of these inflammatory cells, and Crohn's disease, ulcerative colitis, multiple sclerosis, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, emphysema, rheumatoid arteritis It is useful as a protein therapeutic to reduce or eliminate symptoms in patients with lupus erythematosus or psoriasis.
[0722]
Furthermore, the small molecule NOV5b gene product or the antibody antagonist NOV5b gene product may be effective in increasing the immune response in patients with AIDS or other immune deficiencies.
[0723]
(F. NOV6 (NOV6a, NOV6b and NOV6c)): a lysosomal acid lipase precursor
The expression of the NOV6a and NOV6b genes (CG50159-01 and CG50159-02) is expressed in the primer-probe sets described in Tables 43, 44, 45, 46, 47 and 48 (Ag1456, Ag2466, Ag2132, Ag2444, Ag1899 and Ag2059) Was used to evaluate. The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables 52, 53, and 54. Note that the probe and primer sets (Ag2059, Ag2132, Ag2444, Ag2446) do not correspond to the NOV6b variant. The probe and primer set (Ag2919) listed in Table 49 does not correspond to NOV6a. NOV6c (CG50159-04) does not match the probe and primer set (Ag2059 and Ag2132). The probe and primer sets (Ag2131 and Ag6048) described in Tables 51 and 50 are exclusive to NOV6c. These exclusions do not change the expression results or expression analysis shown below.
[0724]
[Table 43]

[0725]
[Table 44]

[0726]
[Table 45]

[0727]
[Table 46]

[0728]
[Table 47]

[0729]
[Table 48]

[0730]
[Table 49]

[0731]
[Table 50]

[0732]
[Table 51]

[0733]
[Table 52]

[0734]
[Table 53]

[0735]
[Table 54]

[0736]
[Table 55]

[0737]
[Table 56]

(AI_comprehensive panel_v1.0 Summary): Highest expression of Ag1456 NOV6a transcript is found in normal colon tissue adjacent to tissues affected by Crohn's disease or ulcerative colitis (CT = 33). This transcript is also found in the normal colon in panels 1.2D and 2D. This NOV6a transcript appears to be down-regulated in the diseased colon, and the therapeutic regulation of expression or function of this gene or its protein product by use of protein therapeutics regulates the normal homeostasis of this tissue. And can be beneficial in the treatment of inflammatory bowel disease.
[0738]
(CNS_neurogeneration_v1.0 Summary): Ag2446 NOV6a gene expression is low or undetectable in all samples in this panel (CT> 35). The amp plot shows that probe failure could have been present in this experiment. (Data not shown).
[0739]
(Panel 1.2 Overview): The highest expression of the Ag1456 NOV6a gene is detected in the bone marrow (CT = 28.9). Furthermore, the difference in expression between the heart (CT = 31.2) and fetal heart tissue (CT = 36.2) is significant in this panel. Thus, NOV6a gene expression can be used to distinguish bone marrow from other samples in this panel. Furthermore, the expression of this gene can be used to distinguish adult heart tissue from fetal heart tissue.
[0740]
The NOV6a gene is also expressed in many tissues with metabolic functions, including heart, fetal and adult liver, skeletal muscle and adrenal glands. The protein encoded by this NOV6a gene is a lipase homolog and can be involved in the dynamic flow of fat in these tissues. Therefore, administration of this gene product or an agonist designed for it enhances lipolysis and can act as an effective treatment for obesity and lipodystrophy. Conversely, antagonists of this gene product may be useful in the treatment of conditions involving excessive depletion of stored fat, such as cachexia.
[0741]
(Panel 1.3D Overview): Ag1456 / Ag2132 / Ag2444 Three of the four experiments using different probe and primer sets were NOV6a in bone marrow (CT = 33-34) and lung (CT = 32.4) The expression of is shown. High expression in the bone marrow is consistent with that seen in panel 1.2. Thus, NOV6a gene expression can be used to distinguish bone marrow and lung derived samples from other tissues in this panel. Furthermore, the expression of this NOV6a gene can be used to distinguish between adult lung tissue and fetal lung tissue. Ag2059 / Ag2446 The expression of this gene is low or undetectable (CT value> 35) in all samples in panel 1.3D (data not shown).
[0741]
(Panel 2D Summary): Ag1456 Three experiments using the same probe and primer procedure produced results showing good agreement, with the highest expression of the NOV6a gene in normal lung tissue adjacent to the tumor (CT = 30 ~ 31). Furthermore, this NOV6a gene appears to be overexpressed in 3 pairs of normal lung tissues when compared to the corresponding cancer tissues. In addition, 4 out of 9 kidney cancers show overexpression of this gene when compared to their respective normal adjacent tissues. Thus, expression of this NOV6a gene can be used to distinguish normal lung tissue from malignant lung tissue and malignant kidney from normal kidney. Furthermore, therapeutic modulation of the expression of this CG50159-01 gene or its gene product by use of small molecule drugs, antibodies or protein therapeutics may be effective in the treatment of kidney cancer or lung cancer.
[0743]
(Panel 4D Summary): Ag1456 / Ag1899 / Ag2059 / Ag2132 Multiple experiments with different probe and primer sets show the highest expression of the NOV6a gene in resting monocytes (CT = 29-32). This gene appears to be down-regulated in these cells after LPS treatment (CT = 32-34) and is not expressed at detectable levels in macrophages. The protein encoded by this NOV6a gene is homologous to acid lipase and may play a role in fat metabolism, differentiation, and phagocytic activity of these cells. Thus, therapeutic modulation of expression or function of this NOV6a gene or protein product thereof through the use of protein therapeutics may modulate monocyte function and / or differentiation.
[0744]
Conversely, regulation of the expression or activity of putative proteins encoded by this transcript by antibodies or small molecules is a simple feature found in diseases such as asthma, allergies, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus, or rheumatoid arteritis. Inflammatory symptoms associated with sphere accumulation may be reduced or prevented. Note that the results of the other two experiments (denoted as 14457575331 and 16439568) were not included. A bad amp plot indicates that there was experimental difficulty in these experiments.
[0745]
(G. NOV7): Tryptase 4
The expression of the NOV7 gene (CG56140-01) was evaluated using the primer-probe sets described in Tables 57 and 58 (Ag2886 and Ag2887). The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables 59 and 60.
[0746]
[Table 57]

[0747]
[Table 58]

[0748]
[Table 59]

[0749]
[Table 60]

(CNS_neurogeneration_v1.0 Summary): Ag2886 / Ag2887 The expression of this NOV7 gene is low or undetectable in all samples of this panel (CT> 35). (Data not shown).
[0750]
(Panel 1.3D Overview): Expression of the Ag2886 NOV7 gene is restricted to normal colorectal tissue (CT = 34.8). Thus, the expression of this gene could be used to distinguish between this sample and other samples in this panel and between colorectal tissue and other normal and malignant tissues. Two other experiments using the probe and primer set (Ag2877) showed low or undetectable levels (CT> 35) in all samples in this panel. (Data not shown).
[0751]
(Panel 2D Overview): Ag2886 / Ag2887 NOV7 gene expression is low or undetectable (CT> 35) in all samples of this panel. (Data not shown).
[0752]
(Panel 3D Overview): Ag2887 NOV7 gene expression is low or undetectable (CT> 35) in all samples of this panel. (Data not shown).
[0753]
(Panel 4D Overview): Ag2886 / Ag2887 NOV7 gene expression is restricted to normal colon tissue (CT = 34.5). Furthermore, the expression of this gene is not detectable in samples from patients with inflammatory bowel disease. Furthermore, the expression of NOV7 transcripts can be used to distinguish between normal and diseased colons. Furthermore, the highly specific expression of the NOV7 gene in colorectal tissue in this panel and panel 1.3D indicates that the therapeutic modulation of the activity of the protein encoded by this gene is useful for the treatment of inflammatory bowel disease. Suggest that it is possible.
[0754]
(H.NOV9): mitsugumin 29
The expression of the NOV9 gene (CG56207-01) was evaluated using the primer-probe set described in Table 61 (Ag2284). The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables 62 and 63.
[0755]
[Table 61]

[0756]
[Table 62]

[0757]
[Table 63]

(Panel 1.3D Overview): Ag2284 This NOV9 gene (Mitsugmin 29 homolog) is most highly expressed in fetal skeletal muscle (CT = 26.3) and adult skeletal muscle (CT = 26.4). Very low but significant expression is also detected in fat, testis, uterus, ovary, kidney, heart, thyroid and adrenal glands (CT = 31-33). Thus, this NOV9 gene expression could be used to distinguish skeletal muscle from other tissues. Nishi M et al. Show that mitsugmine is essential for proper muscle function. Accordingly, therapeutic modulation of NOV9 gene or gene product by replacement therapy could be used as a regenerative treatment for muscle disease.
[0758]
(Reference):
1. Nishi M. , Komasaki S .; , Kurebayashi N .; Ogawa Y .; Noda T. Iino M. Takashima H .; (1999) Abnormal features in skeletal muscle from racking mitsugumin29. J. et al. Cell Biol. 147: 1473-1480.
[0759]
The physiological role of members of the synaptophysin family that possess four transmembrane segments and are basically distributed in the intracellular membrane containing synaptic vesicles has not yet been established. Recently, mitogmine 29 (MG29) has been identified as a new member of the synaptophysin family from skeletal muscle. MG29 is expressed in the junction membrane complex between cell surface transverse (T) tubules and sarcoplasmic reticulum (SR) (referred to as the triad junction), where the depolarization signal is Into Ca (2+) release from In this study, we tested the biological function of MG29 by creating knockout mice. The MG-29 deficient mice showed normal health and regeneration, but lost a slight weight. Ultrastructural abnormalities of the membrane around the triple junction are detected in skeletal muscle from mutant muscles (ie, swollen T tubules, irregular SR structures, and partial misconfiguration of the triple junction) It was done. In this mutant muscle, normal twitch tension was clearly observed, but twitch tension was significantly reduced. In addition, this mutant muscle showed a more rapid decrease in twitch tension under conditions without Ca (2+). The morphological and functional abnormalities of this mutant muscle appear to be related to each other and are essential for both the purification of membrane structure and the effective excitatory-constrictive linkage that binds to the skeletal muscle triad. Indicates that there is. Furthermore, the results of the present invention suggest a role for MG29 as a synaptophysin family membrane in the precise formation of a junction complex between the cell surface and the intracellular membrane.
[0760]
PMID: 10613905
(Panel 4.1D Overview): Significant expression of this NOV9 gene in the Ag2284 panel is mainly found in the kidney. In addition, the homologous mitsugmine 29 gene is also expressed in the kidney and is thought to be involved in secretory activity and possibly the specified vesicle system (ref. 1). Thus, therapeutic drugs designed for the NOV9 gene product may be important for the regulation of kidney function.
[0761]
(References):
1. Shimuta M. et al. , Komasaki S .; , Nishi M. Iino M. , Nakagawara K .; , Takeshima H .; (1998) Structure and expression of mitsugumin 29 gene. FEBS Lett. 431: 263-267.
[0762]
Recently, the triple junction specific mitsugmin 29 in skeletal muscle has been identified as a novel member of the synaptophysin family; members of this family have four transmembrane segments and are distributed in intracellular vesicles . In this study, we isolated and analyzed mouse mitogmine 29 cDNA and genomic DNA containing this gene. The mitsugmin 29 gene mapped to mouse chromosome 3, F3-H2, is closely related to the synaptophysin gene in the exon-intron mechanism, indicating a close link in their molecular evolution. RNA blot hybridization analysis and immunoblot analysis revealed that mitogmin 29 was expressed in large amounts in skeletal muscle and at lower levels in the kidney. Immunofluorescence microscopy showed that mitogmin 29 was specifically present in the cytoplasmic region of the proximal and distal tubular cells in the kidney. This result obtained may suggest that mitsugmine 29 may be involved in the formation of specialized vesicular systems in skeletal muscle and renal tubular cells.
[0763]
PMID: 9708916
(I. NOV10): Neutral protease 1 like activated to micromolar calcium
The expression of the NOV10 gene (CG56127-01) was evaluated using the primer-probe sets described in Tables 64 and 65 (Ag2885 and Ag2882). The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables 66, 67, 68 and 69.
[0764]
[Table 64]

[0765]
[Table 65]

[0766]
[Table 66]

[0767]
[Table 67]

[0768]
[Table 68]

[0769]
[Table 69]

(CNS_Neurodegeneration_v1.0 Summary) Expression of the Ag2885 NOV10 gene is widespread at low but significant levels in the adult central nervous system. From this result of this panel, this gene is likely to be differentially expressed in Alzheimer's disease. Thus, inhibition of this NOV10 protease homolog may be advantageous for the treatment of Alzheimer's disease.
[0770]
(Panel 1.3D Summary) Ag2882 / 2885 Two experiments with the same probe and primer set yield results that are reasonable agreement. The highest expression of the NOV10 gene is found in the ovarian cancer cell line (OVCAR-5) (CT = 33) and the respiratory tract (CT = 30). In addition, it is likely to be highly expressed in other ovarian cancer cell lines, breast cancer cell lines, colon tissue, small intestine tissue, stomach tissue, kidney tissue, lung tissue, and mammary tissue. Thus, expression of the NOV10 gene can be used to distinguish OVCAR-5 cells from other samples in the panel. Differential expression of calpain is observed in various cancers, and Braun et al. (See references below) suggest that this calpain probably plays a role in carcinogenesis and tumor development. . Thus, therapeutic modulation of the NOV10 gene through the use of small molecule drugs, antibody therapeutics, or protein therapeutics may be useful in the treatment of ovarian or breast cancer.
[0771]
(Reference :)
Braun C, Engel M, Seifert M, Theisinger B, Seitz G, Zang KD, Welter C. Expression of calpain I messenger RNA in human renal cell carcinoma: correlation with lymph node metastasis and histologic type. Int J Cancer 1999 Feb 19; 84 (1): 6-9.
[0772]
Calpain (also named CANP (for calcium-activated neuroprotease)) is an intracellular cytoplasmic non-lysosomal cysteine endopeptidase that requires calcium ions for activity. Many substrates of calpain isozymes (eg, transcription factors c-Fos and c-Jun, tumor suppressor protein p53, protein kinase C, pp60c-src, and adhesion molecule integrin) are related to the pathogenesis of different human tumors and malignant diseases Suggests an important role of calpain in We now report the differential expression of the calpain I gene (CLI) in various tumors, extending our work to a larger series of renal cell carcinomas. Using Northern blot analysis, we studied calpain I expression in 30 renal cell carcinomas compared to matched healthy cells. Tumor samples were classified according to their following histological types: 21 clear cell carcinomas, 4 intractable cancers, 3 breast cancers and 2 vast cells. In kidney tumor samples, calpain I gene mRNA was expressed at very variable levels, which depended on significantly different histology types. Furthermore, there was a correlation between higher calpain I expression and malignant tumors: Within the clear cell carcinoma subset, tumor samples with severe nodal status (N1 and N2) did not have metastasis to regional lymph nodes Showed significantly higher calpain I expression. Our data suggest an important role for calpain isozymes in carcinogenesis and tumor progression.
PMID: 9988224
(Panel 2.2 Summary): Ag2882 / 2885 Two experiments with the same probe and primer set led to reasonable agreement. The highest expression of the NOV10 gene is found in samples from breast cancer or normal stomach tissue (CT = 33). Furthermore, it appears to be highly expressed in other breast cancer samples, uterine cancer samples and lung cancer samples. Thus, expression of the NOV10 gene can be used to distinguish these samples from other samples in this panel. Significant expression levels in this calpain homologue follow published data showing differential calpain expression in various tumors, and suggestions that this calpain plays a role in carcinogenesis and tumor progression (for reference See panel 1.3D). Thus, therapeutic modulation of the NOV10 gene through the use of small molecule drugs, antibody therapeutics or protein therapeutics may be useful for the treatment of breast cancer, lung cancer or ovarian cancer.
[0773]
(Panel 4D summary): Ag2882 / 2885 Two experiments with the same probe and primer set led to reasonable agreement. Significant expression of the NOV10 gene is limited to normal colon, normal thymus and normal lung. The NOV10 transcript encodes a calcium-activated neuronal protease-like molecule. This family of molecules relates to cytoskeletal tissue, cell proliferation, cell migration and hemostasis. Thus, the NOV10 gene product may play an important role in the normal homeostasis of these tissues. Furthermore, calpain 1 has been shown to inhibit NF-κB activation and can be useful in the treatment of conditions associated with local or systemic inflammation (see references below). Thus, therapeutic agents designed using proteins encoded by the NOV10 transcript, using small molecules, are important to maintain or restore normal function to the inflamed lung, colon, and thymus It can be.
[0774]
(References):
Ruetten H, Thiermann C.I. Effect of calpain inhibitor I, an inhibitor of the protocol of I cappa B, on the facility failure and multiple organisations. Br J Pharmacol 1997 Jun; 121 (4): 695-704.
[0775]
1. The authors compared the effects of calpain inhibitor I. Here, this calpain inhibitor I inhibits IκB proteolysis (hence activation of nuclear factor κB (NFκB)), and (i) circulatory disturbance, (ii) multi-organ dysfunction and (iii) endotoxic shock. An inhibitor of dexamethasone for induction of nitric oxide (NO) synthase inducible isoform (iNOS) and cyclo-oxygenase (COX-2) in anesthetized rats. 2. Injection of lipopolysaccharide (LPS, E. coli, 10 mg kg-1, iv) resulted in a decrease in pressor response induced by hypotension and noradrenaline. This circulatory disturbance is pretreated by pretreatment of LPS-rats with calpain inhibitor I (10 mg kg-1, iv, 2 hours before LPS) or dexamethasone (1 mg kg-1, iv). Attenuated. 3. Endotoxemia is also used in (i) urea and creatinine (kidney dysfunction), (ii) alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) (hepatocyte injury), bilirubin and γ-glutamyltransferase ( (γGT) (liver dysfunction) (iii) lipase (pancreatic injury) and (iv) increased serum levels of lactic acid. Calpain inhibitor I and dexamethasone attenuated hypoglycemia caused by liver injury, pancreatic injury, lactic acidosis and LPS. Dexamethasone alleviated kidney function injury caused by LPS, but calpain inhibitor I did not. 4.6 hours of endotoxemia results in a substantial increase in iNOS and COX-2 protein and activity in the lung and liver, which is pre-treated with calpain inhibitor I or dexamethasone LPS- Attenuated in rats. 5. Thus, calpain inhibitor I and dexamethasone are (i) circulatory disorders, (ii) multi-organ dysfunction (liver and pancreas dysfunction / injury, lactic acidosis, hypoglycemia), and (iii) rats with endotoxin shock. Attenuates induction of iNOS and COX-2 proteins and activities in The authors suggest that prevention of NF-κB activation in vivo may be useful in the treatment of circulatory shock or disorders associated with local or systemic inflammation.
[0776]
(PMID: 9208136)
(J. NOV11: Novel P2X2C receptor)
The expression of NOV11 gene (CG56179-01) is listed in Table 70. The primer-probe set Ag3491 was used for evaluation. The results of RTQ-PCR were shown in Table 71 and Table 72.
[0777]
[Table 70]

[0778]
[Table 71]

[0779]
[Table 72]

(General_Screening_Panel_v1.4 Summary: Ag3491) The expression of the NOV11 gene appears to be the highest (CT = 29.8) among samples from the breast cancer cell line (MCF-7). Thus, expression of the NOV11 gene can be used to distinguish MCF-7 from other samples in this panel. In addition, therapeutic modulation of this gene through the use of small molecule drugs, protein therapeutics, or antibodies may be advantageous in the treatment of breast cancer.
[0780]
Furthermore, there is likely a substantial expression of NOV11 associated with the fetal lung when compared to expression in the adult lung (CT = 30.3). Thus, NOV11 gene expression can be used to distinguish fetal lung tissue from adult lung tissue (CT = 35.6).
[0781]
Among tissues with metabolic functions, the NOV11 gene is expressed in the pancreas (CT = 33). See panel 5 for a discussion of the utility of this gene in metabolic diseases.
[0782]
The NOV11 gene is also expressed at low levels in the hippocampus, cortex, thalamus and tonsils. The NOV11 gene is a novel ionotropic purinergic receptor. These receptors play an important role in neuroexcitatory transmission. Furthermore, all currently known seizure disorders with genetic linkage result from ion channel mutations. Thus, the NOV11 gene is excellent for the treatment of epilepsy, or any seizure disorder, as well as any neuropsychiatric disorder associated with altered neurotransmission (schizophrenia, bipolar disease or depression). It is a small molecule target.
[0783]
(References)
Pankratov Y, Castro E, Miras-Portugal MT, Krishtal O .; A purinergic component of the excitatory postsynthetic current medium by P2X receptors in the CA1 neurons of the hippocampus. Eur J Neurosci 1998 Dec; 10 (12): 3898-902.
[0784]
The pyramidal nerves in the CA1 region of hippocampal slices from 17-19 day old rats were studied by the patch clamp method. Excitatory synaptic current (EPSC) was induced by stimulating Schaffer collaterals at a frequency of less than 0.2 Hz. Inhibition of glutamate transmission by 20 μM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) and 100 μM 2-amino-5-phosphonovaleric acid (D-APV) reduces the low molecular component of EPSC. We found that we were left uninhibited. The amplitude of this residual EPSC (rEPSC) included 25 +/- 11% of the total EPSC as measured at a holding voltage of −50 mV. rEPSC was selected from the selective P2 blocker pyridoxal phosphate-6-azophenyl-2′-4′-disulfonic acid (PPADS) 10 μM and the non-hydrolyzable ATP analogs, ATP-γ-S and α, β- Blocked by bath incubation with methylene-ATP, 50 μM and 20 μM, respectively. rEPSC was dramatically enhanced by external Zn2 + (10 μM). In another series of experiments, exogenous ATP was subjected to CA1 neurons in situ. The inward current induced by ATP was inhibited by PPADS to the same extent as rEPSC. It was concluded that depending on the membrane potential, one-fifth to one-fourth of the EPSCs generated by excitatory synaptic inputs to rat hippocampal CA1 neurons are due to P2X receptor activity.
[0785]
(Panel 5 islet summary: Ag3491) Expression of the NOV11 gene is restricted to samples from human islets of Langerhans (CT = 33). This is consistent with the expression seen in the pancreas in panel 1.3D. Stimulation of the P2 receptor with a ligand enhances insulin secretion from the islets. Thus, agonists for the P2 receptor homologue encoded by this gene can be all types of treatment for type 2 diabetes with β-cell secretion deficiency.
[0786]
(Reference :)
Fernandez-Alvarez J, Hillaire-Buys D, Loubatieres-Mariani MM, Gomis R, Petit P. et al. P2 acceptor agonists stimulate insulin release from human pancreatic islets. Pancreas. 2001 Jan; 22 (1): 69-71.
[0787]
Although the P2 receptor for adenosine 5 ′ triphosphate (ATP) and / or adenosine 5′-diphosphate (ADP) has been characterized in mammalian pancreatic β cells, any evidence for the insulinotropic effect of a P2 receptor agonist However, it has not been reported so far in humans. This study aimed to investigate whether P2 receptor agonists could stimulate insulin release in human pancreatic islets obtained from brain death organ donors. Experiments were performed using different glucose concentrations and insulin was measured by radioimmunoassay. When glucose concentration (8.3 mmol / L) stimulated insulin release slightly, α, β-methylene ATP (200 μmol / L) and ADPβS (50 μmol / L) similarly amplified insulin secretion: both The compound increased the insulin response 3-fold. In the presence of unstimulated glucose concentration (3.0 mmol / L), only α, β-methylene ATP could induce a significant 1.4-fold increase in insulin release, and ADPβS was completely ineffective. . These results provide evidence that P2 receptor agonists are effective in stimulating insulin release in humans and that the effects of P2Y agonists are essentially glucose dependent.
[0788]
(PMID: 11138974)
(K. NOV12: DIABLO)
The expression of NOV12 gene (CG56132-01) is listed in Table 73. Evaluation was performed using a primer-probe set (Ag2884). The results of RTQ-PCR execution are shown in Table 74, Table 75, and Table 76.
[0789]
[Table 73]

[0790]
[Table 74]

[0791]
[Table 75]

[0792]
[Table 76]

(CNS_Neurodegeneration_v1.0 Summary: Ag2884) No difference was found in the expression of NOV12 gene in post-mortem brains of AD patients when compared to non-demented controls. This panel demonstrates the expression of the NOV12 gene in the CNS of an independent group of patients. See panel 1.3D for a discussion of the utility of this gene in the central nervous system.
[0793]
(Panel 1.3D Summary: Ag2884) Expression of the NOV12 gene (diablo homolog) appears to be highest in samples from the lung cancer cell line (SHP-77) (CT = 30.4). In addition, there is substantial expression in other lung cancer cell lines, breast cancer cell lines, and ovarian cancer cell lines. Thus, expression of the NOV12 gene can be used to distinguish SHP-77 cells from other samples in this panel. Diablo activates caspases and promotes apoptosis. Mitochondrial-mediated apoptosis plays a central role in animal development and tissue homeostasis, and its modification results in a variety of malignancies including cancer. Thus, therapeutic modulation of the NOV12 gene through the use of small molecule drugs, protein therapeutics, or antibodies may be useful for the treatment of lung cancer, breast cancer or ovarian cancer.
[0794]
The NOV12 gene is also expressed at significant levels, although at low levels in all CNS regions tested. Apoptosis is associated with Alzheimer's disease, traumatic brain injury, pathological pain, stroke, CNS viral infection, Parkinson's disease, Huntington's disease, and multiple sclerosis. Thus, selective occlusion / downregulation of the NOV12 gene or its protein product may have broad relevance and utility in many CNS diseases / clinical conditions.
[0795]
Among tissues with metabolic functions, the NOV12 gene has low levels of expression in the pituitary, fetal heart, skeletal muscle, and fat. Diablo proteins promote apoptosis by activating mitochondrial caspases. Thus, inhibition of the NOV12 gene may protect against apoptosis / tissue wasting in pituitary or skeletal muscle diseases.
[0796]
(References)
Madesh M, Antonson B, Srinivaula SM, Alnemri ES, Hajnoczky G. et al. Rapid kinetics of tBid-induced cytochrome c and Smac / DIABLO release and mitochondral depolarization. J Biol Chem. 2001 Dec 6 [epub ahead of print]
Bid cleavage has been shown to promote apoptosis by inducing mitochondrial membrane permeation with the resulting release of apoptosis-inducing proteins from the intermembrane space into the cytosol. However, direct visualization of Bid-induced release of various proteins from highly compartmentalized intermembrane spaces and changes in mitochondrial metabolic mechanisms remain difficult to understand. By using GFP fusion proteins and immunostaining individual permeated HepG2 cells, the authors first described a truncated Bid (15.5-kDa C-terminal fragment, tBid) from all mitochondria. It was demonstrated that it induced a rapid and essentially complete release of cytochrome c and Smac / DIABLO. To establish an indirect solution to the release and depolarization kinetics of tBid derivatized cytochrome c and Smac / DIABLO, we monitored mitochondrial membrane potentials fluorometrically in permeabilized cells and rapidly It was subjected to a filtration method to obtain a cytosolic fraction for Western blotting. The authors found that sub-nM doses of tBid were sufficient to induce cytochrome c release and mitochondrial depolarization, while full-length Bid was 100 times less effective. Bcl-xL prevented tBID-induced cytochrome c release and depolarization. In response to 2.5 nM tBid, cytochrome c release began after a 10 second delay, showed rapid progress, and was completed in 50-70 seconds. Smac / DIABLO release was synchronized with cytochrome c release, while the decrease in mitochondrial membrane potential was slightly slower than cytochrome c release. Furthermore, tBid-induced cytochrome c release is not sensitive to changes in substrate composition, but tBid-induced depolarization did not occur in the presence of extramitochondrial ATP supply. Thus, tBID-induced permeation of the outer membrane allows rapid release of cytochrome c and Smac / DIABLO from all domains of the intermembrane space. The tBID-induced decrease in mitochondrial membrane potential occurs after cytochrome c release and reflects impaired oxidative metabolism.
[0797]
(PMID: 11741882)
Adrain C, Clear EM, Martin SJ. Apoptosis-associated release of Smac / DIABLO from mitochondria requests active caspases and is blocked by Bcl-2. EMBO J.M. 2001 Dec 3; 20 (23): 6627-36.
[0798]
Smac / DIABLO is a mitochondrial protein that allows several forms of apoptosis, possibly by neutralizing one or more members of the IAP family of apoptosis-inhibiting proteins. Smac is present in mitochondria and has been shown to enter the cytosol during apoptosis caused by UV or γ radiation. Here, the authors report that Smac / DIABLO transport from the mitochondria to the cytosol is induced by cytotoxic drugs and DNA damage and by ligation of the CD95 death receptor. In response to various pro-apoptotic drugs, the mitochondrial flux of Smac / DIABLO was greatly inhibited in Bcl-2 overexpressing cells. Thus, in addition to regulating apoptosis-related mitochondrial cytochrome c release, Bcl-2 also regulates Smac release, suggesting that both molecules can escape through the same pathway. However, cellular stress-related mitochondrial cytochrome c release was largely caspase-independent and Smac / DIABLO release in response to the same stimulus was blocked by a broad spectrum caspase inhibitor. This suggests that the release of apoptosis-related cytochrome c and Smac / DIABLO from mitochondria does not occur via the same pathway. Rather, the Smac / DIABLO flow rate from mitochondria is a caspase catalyzed event that occurs downstream of cytochrome c release.
[0799]
(PMID: 1172499)
Huang P, Oliff A.A. Signaling pathways in apoptosis as potential targets for cancer therapy. Trends Cell Biol 2001 Aug; 11 (8): 343-8.
[0800]
Genetic instability contributes to the development of cancer as well as the ability of cancer cells to become resistant to various therapeutic agents. Due to this, cytotoxic therapy rather than cytostatic therapy can be most effective against this disease. Many oncogenes and tumor suppressors mediate their effects by interfering with or inducing apoptotic signaling. Thus, the apoptotic pathway can be significantly modified in cancer cells compared to non-transformed cells, and these differences can represent therapeutic areas that can be exploited for the development of cancer drugs.
[0801]
(PMID: 1149640)
(Panel 4D Summary: Ag2884) NOV12 transcript expression is ubiquitous across panel 4D, and when treated with ionomycin in the kidney (CT = 28.7), basophil cell line Ku-812 and B cells It was highly expressed in Ramos, a lymphoma cell line (CT 28.6). Primary Th1 cells and PWM-activated B cells (which are conditions reported to promote survival) are also moderately expressed, but not B cells treated with CD40L. Moderate expression of the NOV12 transcript is also found in TNF-a treated dermal fibroblasts and small airway epithelium where cytotoxicity is well documented. The NOV12 transcript encodes a Diablo-like protein. Diablo protein is a pro-apoptotic mitochondrial protein that is important for activation of downstream effectors of apoptosis. Apoptosis is associated with the pathology of many autoimmune and inflammatory diseases. Thus, modulation of NOV12 putative protein expression or activity by small molecules may be advantageous for the treatment of rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, type 1 diabetes, lupus erythematosus and pulmonary inflammatory diseases.
[0802]
(L. NOV13: HRPET-1-related protein)
The expression of the NOV13 gene (CG56195-01) was evaluated using the primer probe set Ag2895 described in Table 77. The results of the RTQ-PCR experiment are shown in Table 78, Table 79, Table 80, and Table 81.
[0803]
[Table 77]

[0804]
[Table 78]

[0805]
[Table 79]

[0806]
[Table 80]

[0807]
[Table 81]

(Overview of CNS_neurodegeneration_v1.0)
Ag2895. No difference is found when the expression of NOV13 gene in post-mortem brains of AD patients is compared to non-demented controls. This panel demonstrates the expression of the NOV13 gene in the CNS of an independent fraction of patients. See panel 1.3D for a discussion of the utility of this gene in the central nervous system.
[0808]
(Overview of panel 1.3D)
Ag2895. NOV13 gene expression appears to be highest in samples from the ovarian cancer cell line (OVCAR-5) (CT = 28.5). There seems to be an overall low level of expression throughout the rest of this panel. Thus, the expression of this gene can be used to distinguish OVCAR-5 cells from the rest of the sample in the panel.
[0809]
This gene also has significant but slight expression levels in pancreas, adrenal gland, thymus, pituitary, adult and fetal heart, skeletal muscle and liver and fat. Thus, this newly identified gene product may be important for the pathogenesis, diagnosis and / or treatment of metabolic and endocrine diseases, including obesity and type 1 and type 2 diabetes.
[0810]
This gene is moderately expressed in all CNS regions tested. The NOV13 gene encodes a protein similar to EPI64 (64 kd ebp50-pdz interactor), which has been reported to be a membrane-bound protein that may be involved in cell adhesion and / or migration. In the CNS, these functions are usually associated with axonal / dendritic growth and targeting. Thus, this molecule can be used in the direction of compensatory synapse formation in response to neuronal death in spinal or brain trauma, stroke, Alzheimer's disease, Parkinson's disease or Huntington's disease or spinocerebellar ataxia.
[0811]
(References)
Reczek D, Bretscher A. Identification of EPI64, a TBC / labGAP domain-containing microvillar protein that binds to the first PDZ domain of EBP50 and E3KARP. J Cell Biol 2001 Apr 2; 153 (1): 191-206.
[0812]
The cortical scaffold proteins EBP50 (ERM-binding phosphoprotein-50) and E3KARP (NHE3 kinase A regulatory protein) are followed by two PDZ (PSD-52 / D1gA / ZO-1-like) domains followed by a COOH terminal sequence (active Binds to ERM family members). Using affinity chromatography, we have identified polypeptides that bind to the PDZ domain of EBP50 from placental microvilli. Among these are 64 kD and / or 65 kD different phosphorylated polypeptides, which are in the first PDZ domain of EBP50, as well as E3KARP (we are EPI64 (64 kD EBP50-PDZ interactor)). Called preferentially). The human EPI64 gene is present on chromosome 22, where nine exons identify a 508 residue protein containing the Tre / Bub2 / Cdc16 (TBC) / lab GTPase acting protein (GAP) domain. EPI64 terminates in DTYL that is required to bind to the PDZ domain of EBP50 (since mutants that terminate in DTYLA no longer interact). EPI64 coexists with EBP50 and ezrin in syncytial layers and cultured cell microvilli, and this localization in cultured cells is avoided by the introduction of DTYLA mutations. In addition to EPI64, the immobilized EBP50 PDZ domain retains several polypeptides derived from placental microvilli, including nadrin isoforms involved in the regulation of vesicular transport, including rhoGAP domain-containing proteins. Nadrin binds directly to EBP50, preferably through its COOH-terminal STAL sequence. Thus, EBP50 appears to bind to membrane proteins as well as factors potentially involved in the regulation of membrane traffic.
[0813]
PMID: 1128285
(Panel 2.2 overview)
Ag2895. NOV13 gene expression appears to be highest in samples from metastatic breast cancer (CT = 30.8). Thus, the expression of this gene can be used to distinguish this breast cancer sample from the rest of the samples in the panel. Furthermore, therapeutic modification of the NOV13 gene (by using protein therapeutics, using small molecule drugs or antibodies) may be beneficial in the treatment of breast cancer.
[0814]
(Outline of panel 4D)
Ag2895. The NOV13 transcript is expressed at high to moderate levels in most cells presented in panel 4D. The highest expression of this transcript is found in dermal fibroblasts treated with TNF-a (CT = 28.1), small airway epithelium and bronchial epithelium treated with TNF-a and IL-1b. It is also expressed at moderate levels in T cells and B cells. The NOV13 transcript encodes a HRPET-1-related protein (similar to the 64 kd ebp50-pdz interactor). This HRPET-1-related protein has been reported to be a membrane-bound protein that can be involved in cell adhesion and / or migration (see references above). Thus, modulation of the expression and / or activity of this putative protein by antibodies can block B cell and T cell function and the interaction of these cells with local epithelial or fibroblasts. As a result, this may reduce or eliminate symptoms of chronic obstructive pneumonia disease, asthma, emphysema, bronchitis, psoriasis, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus and chronic rheumatism.
[0815]
(M.NOV14: B7-H2B)
The expression of the NOV14 gene (CG55790-02) was evaluated using primer-probe sets (described in Ag1845, Ag2589, Ag2621, Ag2915 and Ag210, Tables 82, 83, 84, 85 and 86). The results of the RTQ-PCR test are shown in Tables 87, 88, 89, 90, 91, 92 and 93.
[0816]
[Table 82]

[0817]
[Table 83]

[0818]
[Table 84]

[0819]
[Table 85]

[0820]
[Table 86]

[0821]
[Table 87]

[0822]
[Table 88]

[0823]
[Table 89]

[0824]
[Table 90]

[0825]
[Table 91]

[0826]
[Table 92]

[0827]
[Table 93]

(AI_Comprehensive Panel_v1.0 Summary: Ag1845)
NOV14 transcripts are expressed at low levels in many different diseased tissues. In contrast, normal lung and connective tissue do not express this transcript at all or at very low levels. Since the NOV14 transcript is expressed on monocytes and matched control tissues most likely contain these inflammatory cells (psoriasis, Crohn's disease and ulcerative colitis), transcript expression is detected at these sites Not surprising. The NOV14 transcript encodes B7-H2 and has been shown to be important in antigen presentation. This is a ligand for ICOS and serves as a costimulatory molecule (see panel 4). Thus, therapeutics designed with NOV14 transcripts can reduce or inhibit antigen presentation and can be important in the treatment of diseases such as asthma, IBD, psoriasis and arthritis where T cells are chronically stimulated. .
[0828]
(Summary of CNS_neurodegeneration_v1.0: Ag1845 / Ag2589 / Ag2621 / Ag2915)
Multiple experiments with two different probe and primer sets are in good agreement. In all cases, NOV14 gene expression is upregulated in the temporal cortex of Alzheimer's disease patients when compared to non-demented controls. This difference is evident when data is analyzed via ANCOVA using the total RNA quality and / or quantity as covariates. Upregulation of NOV14 is most apparent in the variants detected by Ag1845. The temporal cortex is an area that shows the middle stage degeneration of the disease. Thus, in contrast to the hippocampus and entorhinal cortex, where many neurons are already lost by the time of death in AD, the phenomenon of neurodegeneration appears to have been captured in this area. Furthermore, in the occipital cortex (neurodegeneration does not occur in Alzheimer's disease), the NOV14 gene has not been found to be upregulated in the same patient. Taken together, these data suggest that this gene is at least a marker for Alzheimer-like neurodegeneration and is probably involved in the process of neurodegeneration.
[0829]
Furthermore, the NOV14 gene is a form of B7 protein (B7-H2B) and functions in inflammation. Neuroinflammation is related to the extent to which long-term anti-inflammatory drug usage is correlated with reduced incidence of Alzheimer's disease in retrospective studies in AD. This gene therefore represents an excellent drug target for the treatment of Alzheimer's disease and any other neuroinflammatory condition.
[0830]
(Summary of panel 1: Ag210)
NOV14 gene expression appears to be highest in samples derived from normal brain tissue of the cerebellum (CT = 19.5). Thus, expression of this gene could be used to distinguish normal cerebellar tissue from other tissues in the panel.
[0831]
The NOV14 gene also exhibits extensive expression and high to moderate expression in metabolic tissues including the pancreas and adrenal gland. Although the role of the B7-H2 molecule in metabolism or endocrinology has not been described, on the basis of its expression this gene product is an antibody for the treatment of obesity and metabolic or endocrine diseases including type 1 and type 2 diabetes Can be a target.
[0832]
(Panel 1.3D Summary: Ag1845 / Ag2589 / Ag2621 / Ag2915) Multiple experiments with two different probes and primer sets agreed best. The highest expression of the NOV14 gene is found in brain, fetal kidney and breast cancer cell lines.
[0833]
Expression in the CNS panel is the expression of the NOV14 gene in the CNS
Confirm. For a discussion of the availability of this gene in the central nervous system, see panel CNS_Neurodegeneration.
[0834]
High levels of expression are also consistently seen in fetal skeletal muscle (CT = 29-30) when compared to expression in adult skeletal muscle (CT = 33-35). Thus, expression of the NOV14 gene can be used to distinguish between the adult and fetal sources of this tissue.
[0835]
The NOV14 gene product is also moderately expressed in the pancreas, adrenal gland, thyroid, pituitary, adult and fetal liver, adult and fetal heart, and fat. Based on its expression profile in metabolic tissues, the NOV14 gene product may be useful in the diagnosis and / or treatment of metabolic diseases (including obesity and diabetes).
[0836]
(Panel 2.2 Summary: Ag2621) NOV14 gene expression appears to be highest in samples from normal kidney margin (CT = 29.1). In addition, there appears to be substantial expression associated with several kidney cancer samples. Thus, the expression of the NOV14 gene can be used to distinguish normal kidney samples from others in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies may be useful in the treatment of kidney cancer.
[0837]
(Panel 2D summary: Ag1845) The expression of the NOV14 gene was evaluated in panel 2D in two independent runs with the best agreement between runs. The expression of this gene is highest in samples from kidney cancer (CT = 28). In addition, there is substantial expression associated with kidney tissue, bladder cancer and other samples from breast cancer. Therefore, expression of the NOV14 gene can be used to distinguish this kidney cancer sample from other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene through the use of small molecule drugs, protein therapeutics, or antibodies may be useful for the treatment of kidney cancer, breast cancer or bladder cancer.
[0838]
(Panel 4D Summary: Ag2589 / Ag2621 / Ag2915 / Ag1845) NOV14 transcripts are found in activated EOL cells, activated pulmonary microvascular anastomotic endothelium, activated human pulmonary aortic endothelial cells, and TNFα activated humans. It is highly expressed in umbilical vein endothelial cells. CG55790-02 encodes B7-H2, which has been shown to be important in antigen presentation. This B7-H2 is a ligand for ICOS and serves as a costimulatory molecule (refs. 1-2). Thus, monoclonal antibody therapeutics designed with the CG55790-02 protein product can reduce or inhibit antigen presentation and are important in the treatment of diseases such as asthma where T cells are chronically stimulated It can be.
[0839]
(Reference :)
Ling V, Wu PW, Finnerty HF, Bean KM, Spaulding V, Fuser LA, Leonard JP, Hunter SE, Zollner R, Thomas JL, Miyashiro JS, Jacobs KA, Colls. Cutting edge: identification of GL50, a novel B7-like protein that functionally binds to ICOS receptor. J Immunol 2000 Feb 15; 164 (4): 1653-7.
[0840]
By genetic selection of the mouse cDNA encoding the secreted protein, a B7-like cDNA clone (named mouse GL50 (mGL50)) was isolated and this clone encodes a 322 amino acid polypeptide identical to B7h. Isolation of the human orthologue of this cDNA (hGL50) showed a coding sequence of 309 amino acid residues with 42% sequence identity with mGL50. Northern analysis showed that GL50 is present in many tissues including lymph samples, embryonic yolk sac samples and fetal liver samples. Of the CD28, CTLA4 and ICOS fusion constructs tested, flow cytometric analysis demonstrated that only mouse ICOS-IgG binds to mGL50 cell transfectants. Subsequent phenotypic studies demonstrated high levels of ICOS ligand staining on splenic CD19 + B cells and low levels of staining on CD3 + T cells. These results indicate that GL50 is a specific ligand for the ICOS receptor, and suggest that the GL50-ICOS interaction functions in lymphocyte costimulation.
[0841]
Wang S, Zhu G, Chapoval AI, Dong H, Tamada K, Ni J, Chen L. Costulation of T cells by B7-H2, a B7-like molecular that binds ICOS. Blood 2000 Oct 15; 96 (8): 2808-13.
[0841]
This report describes a novel human B7-like gene designated B7-H2. Cell surface expression of B7-H2 protein is detected in immature dendritic cells derived from monocytes. A soluble B7-H2 and immunoglobulin (Ig) fusion protein, B7-H2Ig, binds to activated T cells rather than resting T cells, and this binding is not CTLA4Ig but inducible costimulatory Ig (ICOSIg) ). Furthermore, ICOSIg stains Chinese hamster ovary cells transfected with the B7-H2 gene. Due to the suboptimal cross-linking of CD3, costimulation of T cell proliferation by B7-H2Ig is dose-dependent and is related to secretion of interleukin (IL) -2, but optimal CD3 ligation is IL- Stimulate 10 production preferentially. This result indicates that B7-H2 is a putative ligand of the ICOS T cell molecule (Blood. 2000; 96: 2808-2813) PMID: 11023515.
[0843]
(N. NOV15: galactosyltransferase)
The expression of the NOV15 gene (CG56252-01) was evaluated using the primer-probe set Ag2902 described in Table 94. Results of RTQ-PCR runs are shown in Tables 95, 96 and 97.
[0844]
[Table 94]

[0845]
[Table 95]

[0846]
[Table 96]

[0847]
[Table 97]

(CNS_Neurodegenerative_v1.0 Summary): Does not include results from one experiment with the Ag2902 NOV15 gene. The amp plot shows that there were experimental difficulties in this run.
[0848]
(Panel 1.3D Overview): The highest expression of the Ag2902 NOV15 gene is found in the ovary (CT = 28). Thus, the expression of this gene can be used as a marker for normal ovarian tissue. The NOV15 gene also has moderate to high levels of expression in several endocrine / metabolism related tissues, including fat, adrenal gland, gastrointestinal tract, pituitary, skeletal muscle and thymus. Accordingly, therapeutic modulators that target the NOV15 gene and / or gene product may be useful in treating any number of diseases that affect these tissues.
[0849]
Significant expression is also detected in fetal skeletal muscle (CT = 29). Interestingly, this gene is expressed at a much higher level in the fetus when compared to adult skeletal muscle (CT = 33.7). This observation suggests that NOV15 gene expression can be used to distinguish between fetal and adult skeletal muscle. Furthermore, the relative overexpression of this gene in fetal skeletal muscle suggests that this protein product can enhance muscle growth or development in the fetus and thus act on the regenerative capacity in adults. Thus, therapeutic modulation of the protein encoded by this gene may be useful in the treatment of muscle related diseases. More particularly, treatment of weak or dystrophic muscle with a protein encoded by the NOV15 gene can restore muscle mass or function.
[0850]
There also appears to be substantial expression associated with various brain cancer cell lines. Furthermore, therapeutic modulation of the NOV15 gene through the use of small molecule drugs, protein therapy or antibodies may be beneficial in the treatment of brain cancer.
[0851]
Furthermore, the NOV15 gene (galactosyltransferase homolog) is expressed at low to moderate levels in all regions of the CNS being tested. Galactosyltransferase plays a role in axon myelination. Thus, therapeutic modulation of this gene or its protein product may be advantageous for the treatment of multiple sclerosis or any demyelinating disease.
[0852]
(References):
Simons M, Kramer EM, Thiele C, Stoffel W, Trotter J. et al. Assembly of myelin by association of proteolipid protein with cholesterol-and galactosylceramide-rich membrane domains. J Cell Biol 2000 Oct 2; 151 (1): 143-54.
[0853]
Myelin is a specialized membrane abundant in glycosphingolipids and cholesterol containing a limited range of proteins. We investigated the construction of the myelin component by oligodendrocytes and analyzed the role of lipid-protein interactions in this process. Proteolipid protein (PLP) (major myelin protein) was recovered from cultured oligodendrocytes derived from low density CHAPS insoluble membrane fraction (CIMF) concentrated in myelin lipids. After leaving the endoplasmic reticulum but before leaving the Golgi apparatus, PLP associates with CIMF, suggesting that myelin lipid and protein components are built up in the Golgi complex. The specific association between myelin lipids and PLP in CIMF is effectively cross-linked to photoactivatable cholesterol but effectively cross-linked to phosphatidylcholine (which is underestimated in both myelin and CIMF). Supported by the finding that it was not. Furthermore, depletion of cholesterol or inhibition of sphingolipid synthesis in oligodendrocytes abolished the relationship between CIMF and PLP. Thus, PLP can be recruited to the myelin raft represented by CIMF via lipid-protein interactions. In contrast to oligodendrocytes, after transfection in BHK cells, PLP is absent from isolated CIMF, suggesting that PLP requires specific lipids for raft association To do. In mice deficient in the enzyme ceramide galactosyltransferase, which is unable to synthesize the major myeling lycosphingolipid, the large fraction of PLP no longer associates with rafts. The formation of cholesterol-rich and galactosylceramide-rich membrane domains (myelin rafts) can be important for PLP classification and myelin assembly in oligodendrocytes.
[0854]
(Panel 2D Summary): Ag2902 NOV15 gene expression appears to be highest in breast cancer-derived samples (CT = 28.1). There appears to be substantial expression associated with other breast, kidney, bladder and ovarian cancers. Thus, the expression of this gene can be used to distinguish this breast cancer sample from the rest of the samples on the panel. Furthermore, therapeutic modulation of the NOV15 gene through the use of small molecule drugs, protein therapy or antibodies may be beneficial in the treatment of breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer or kidney cancer.
[0855]
(Panel 4D Summary): The Ag2902 NOV15 transcript is highly expressed in fibroblasts and mucosal epidermal cell lines, with much lower expression in hematopoietic cell lines. The transcript encodes a galactosyltransferase isoform. This enzyme can be important both for the synthesis of galactose β-1,4-N-acetylglucosamine and as a component of the plasma membrane, where it can function in cell-cell recognition and / or adhesion (OMIM). 137060). Trafficking through protein glycosylation or intracellular compartments in fibroblasts and leukocytes can be altered by the activity of this enzyme. This can then regulate the ability of these cells to express proteins involved in normal hematopoiesis in cell-cell interactions. Thus, treatments designed with proteins encoded by the NOV15 transcript can reduce or inhibit inflammation resulting from asthma, emphysema, psoriasis, IBD, and arthritis.
[0856]
(O. NOV16: lymphocyte antigen precursor-like protein)
The expression of the NOV16 gene (CG56303-01) was evaluated using primer-probe sets Ag3798 and Ag4119 as described in Tables 98 and 99.
[0857]
[Table 98]

[0858]
[Table 99]

(General_Screening_Panel_v1.4 Summary): Ag3798 NOV16 gene expression is low / undetectable in all samples in this panel (CT> 35). (Data not shown).
[0859]
(Panel 4.1D Overview): Ag3798 / Ag4119 NOV16 gene expression is low / undetectable in all samples in this panel (CT> 35). (Data not shown).
[0860]
(Other embodiments)
Although specific embodiments are disclosed in detail herein, this is done by way of example only for purposes of illustration and is intended to be limited with respect to the scope of the appended claims. Not intended. In particular, it is contemplated by the inventors that various substitutions, changes, and modifications may be made to the invention without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the claims. Is done. The choice of nucleic acid starting material, target clone, library type is considered routine for those skilled in the art in view of the knowledge of the embodiments described herein. Other aspects, advantages, and modifications are considered to be within the scope of the appended claims.

Claims

An isolated polypeptide comprising:
(A) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56, a mature form of an amino acid sequence selected from the group consisting of;
(B) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56, wherein one or more amino acid residues in the variant are amino acid sequences selected from the group consisting of: A variant that differs from the amino acid sequence, except that the variant differs from the mature form of the amino acid sequence by 15% or less amino acid residues;
(C) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56; and (d) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 , 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, and 56, wherein the variant is an amino acid sequence selected from the group consisting of Wherein one or more amino acid residues in the variant differ from the mature form of the amino acid sequence, provided that the variant differs from the amino acid sequence by 15% or less amino acid residues,
A polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

2. The polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32. 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, and 56, including the amino acid sequence of a naturally occurring allelic variant of an amino acid sequence selected from the group consisting of peptide.

3. The polypeptide of claim 2, wherein the allelic variant is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29. , 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, and 55, an amino acid that is a translation of a nucleic acid sequence that differs in single nucleotide from a nucleic acid sequence selected from the group consisting of A polypeptide comprising a sequence.

The polypeptide of claim 1, wherein the amino acid sequence of the variant comprises a conservative amino acid substitution.

An isolated nucleic acid molecule, wherein the nucleic acid molecule is:
(A) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56, a mature form of an amino acid sequence selected from the group consisting of;
(B) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56, wherein one or more amino acid residues in the variant are amino acid sequences selected from the group consisting of: A variant that differs from the amino acid sequence, provided that the variant differs from the mature form amino acid sequence by 15% or less amino acid residues;
(C) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56; an amino acid sequence selected from the group consisting of;
(D) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56, wherein one or more amino acid residues in the variant are the amino acid sequence of the mature form and Different, provided that the variant differs from the amino acid sequence by not more than 15% amino acid residues;
(E) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, and 56, a nucleic acid fragment encoding at least a part of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of, or a variant of the polypeptide, wherein the variant Wherein the one or more amino acid residues differ from the mature form of the amino acid sequence, provided that the variant differs from the amino acid sequence by no more than 15% amino acid residues; and (f) (a ), (B), (c), (d), or a nucleic acid molecule comprising the complement of (e),
A nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:

6. The nucleic acid molecule of claim 5, wherein the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of a naturally occurring allelic nucleic acid variant.

6. The nucleic acid molecule of claim 5, wherein said nucleic acid molecule encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence of a naturally occurring polypeptide variant.

6. The nucleic acid molecule according to claim 5, wherein the nucleic acid molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31. 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, and 55. A nucleic acid molecule that differs from a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:

6. The nucleic acid molecule of claim 5, wherein the nucleic acid molecule is:
(A) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 Nucleotide sequence selected from the group consisting of: 47, 49, 51, 53, and 55;
(B) a nucleotide sequence, wherein the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, One or more nucleotides differ from a nucleotide sequence selected from the group consisting of 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, and 55, provided that no more than 20% of the nucleotides A nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence;
(C) a nucleic acid fragment of (a); and (d) a nucleic acid fragment of (b),
A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:

6. The nucleic acid molecule of claim 5, wherein the nucleic acid molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, Stringent conditions for a nucleotide sequence selected from the group consisting of 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, and 55 or the complement of the nucleotide sequence A nucleic acid molecule that hybridizes underneath.

6. The nucleic acid molecule of claim 5, wherein the nucleic acid molecule is:
(A) a first nucleotide sequence comprising a coding sequence that differs from the coding sequence encoding the amino acid sequence by one or more nucleotide sequences, wherein no more than 20% of the first nucleotide sequence in the coding sequence A first nucleotide, wherein the nucleotide differs from the coding sequence;
(B) an isolated second polynucleotide that is the complement of the first polynucleotide; and (c) a nucleic acid fragment of (a) or (b);
A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:

A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 11.

13. The vector of claim 12, further comprising a promoter operably linked to the nucleic acid molecule.

A cell comprising the vector according to claim 12.

An antibody that immunospecifically binds to the polypeptide of claim 1.

The antibody of claim 15, wherein the antibody is a monoclonal antibody.

16. The antibody of claim 15, wherein the antibody is a humanized antibody.

A method for determining the presence or amount of a polypeptide of claim 1 in a sample, the method comprising:
(A) providing the sample;
(B) contacting the sample with an antibody that immunospecifically binds to the polypeptide; and (c) determining the presence or amount of an antibody that binds to the polypeptide, thereby determining the amount of poly in the sample. Determining the presence or amount of the peptide;
Including the method.

A method for determining the presence or amount of a nucleic acid molecule according to claim 5 in a sample, the method comprising:
(A) providing the sample;
(B) contacting the sample with a probe that binds to the nucleic acid molecule; and (c) determining the presence or amount of the probe bound to the nucleic acid molecule and thereby the presence of the nucleic acid molecule in the sample. Or determining the quantity,
Including the method.

A method of identifying an agent that binds to the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) contacting the polypeptide with the factor; and (b) determining whether the factor binds to the polypeptide;
Including the method.

A method for identifying an agent that modulates the expression or activity of the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) providing a cell that expresses the polypeptide;
(B) contacting the cell with the agent; and (c) determining whether the agent modulates expression or activity of the polypeptide, thereby expressing the polypeptide. Or a change in activity indicates that the agent modulates the expression or activity of the polypeptide,
Including the method.

A method for modulating the activity of a polypeptide according to claim 1, wherein said method is sufficient to modulate a cell sample expressing the polypeptide according to claim 1 to modulate the activity of said polypeptide. Contacting the compound with an amount that binds to the polypeptide.

A method for treating or preventing a NOVX-related disorder, wherein the method is sufficient for a subject in whom such treatment or prevention is desired to treat or prevent the NOVX-related disorder in the subject. A method comprising administering the polypeptide of claim 1.

24. The method of claim 23, wherein the subject is a human.

A method for treating or preventing a NOVX-related disorder, wherein the method is sufficient for a subject in whom such treatment or prevention is desired to treat or prevent the NOVX-related disorder in the subject. A method comprising administering the nucleic acid according to claim 5.

26. The method of claim 25, wherein the subject is a human.

A method for treating or preventing a NOVX-related disorder, wherein the method is sufficient for a subject in whom such treatment or prevention is desired to treat or prevent the NOVX-related disorder in the subject. A method comprising the step of administering the antibody of claim 15.

28. The method of claim 27, wherein the subject is a human.

A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid molecule of claim 5 and a pharmaceutically acceptable carrier.

A pharmaceutical composition comprising the antibody of claim 15 and a pharmaceutically acceptable carrier.

30. A kit comprising the pharmaceutical composition of claim 29 in one or more containers.

32. A kit comprising the pharmaceutical composition of claim 30 in one or more containers.

32. A kit comprising the pharmaceutical composition of claim 31 in one or more containers.

Use of a therapeutic agent in the manufacture of a medicament for treating a syndrome associated with a human disease, wherein the disease is selected from a NOVX-related disorder, wherein the therapeutic agent comprises a NOVX polypeptide, a NOVX nucleic acid, and Use, selected from the group consisting of NOVX antibodies.

A method for screening for modulators of activity or latency or a predisposition to a NOVX-related disorder, the method comprising:
(A) administering a test compound to a test animal having an increased risk for a NOVX-related disorder, wherein the test animal recombinantly expresses the polypeptide of claim 1;
(B) after the step of administering the compound of step (a), measuring the activity of the polypeptide in the test animal; and (c) determining the activity of the protein in the test animal. Comparing the activity of the polypeptide in a non-control animal, wherein the change in the activity of the polypeptide in the test animal relative to the control animal is indicative of the latency of the test compound to a NOVX-related disorder. Or a process indicating that it is a predisposing modulator,
Including the method.

37. The method of claim 36, wherein the test animal expresses the test protein transgene at an increased level relative to the wild type test animal or expresses the transgene under the control of a promoter. Wherein the promoter is not a native gene promoter of the transgene.

A method for determining the presence or predisposition of a disease associated with an altered level of a polypeptide according to claim 1 in a first mammalian subject, the method comprising:
(A) measuring the expression level of the polypeptide in a sample from the first mammalian subject; and (b) the amount of the polypeptide in the sample of step (a) Comparing to the amount of the polypeptide present in a control sample from a second mammalian subject known to be absent or known to be less susceptible to the disease;
Wherein a change in the expression level of the polypeptide in the first subject as compared to the control sample is indicative of the presence or predisposition of the disease.

A method for determining the presence or predisposition of a disease associated with an altered level of a nucleic acid molecule according to claim 5 in a first mammalian subject, the method comprising:
(A) measuring the amount of the nucleic acid in a sample from the first mammalian subject; and (b) determining the amount of the nucleic acid in the sample of step (a) not having the disease. Comparing to the amount of the nucleic acid present in a control sample from a second mammalian subject that is known to be or is less susceptible to the disease;
Wherein a change in the level of the nucleic acid in the first subject as compared to the control sample is indicative of the presence or predisposition of the disease.

A method of treating a pathological condition in a mammal comprising the step of administering a polypeptide to said mammal in an amount sufficient to alleviate said pathological condition, wherein said method comprises: The polypeptide is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, A polypeptide having an amino acid sequence at least 95% identical to a polypeptide comprising at least one amino acid sequence of 46, 48, 50, 52, 54, and 56 or a biologically active fragment thereof. .

A method for treating a pathological condition in a mammal comprising the step of administering to said mammal the antibody of claim 15 in an amount sufficient to alleviate said pathological condition. ,Method.