JP2005296005A - γ−グルタミルシステイン合成酵素の阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】寄生虫等に特異的なγ−グルタミルシステイン合成酵素（γＧＣＳ）の阻害剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【解決手段】大腸菌γＧＣＳの第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニンであるヒト型γＧＣＳと、前記第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニン以外である非ヒト型γＧＣＳとを準備し、予め準備した薬剤候補化合物を、前記ヒト型及び非ヒト型γＧＣＳのそれぞれと接触させて、結合の強さをそれぞれ評価し、前記ヒト型γＧＣＳよりも前記非ヒト型γＧＣＳにより強く結合する前記薬剤候補化合物を選択する工程を含む。本発明のスクリーニング方法に用いる薬剤候補化合物の設計は、大腸菌γＧＣＳと基質遷移状態アナログとの共結晶であり、空間群が、Ｐ２1である結晶を解析して得られるγＧＣＳの立体構造データに基づくことが好ましい。
【選択図】図２
【解決手段】大腸菌γＧＣＳの第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニンであるヒト型γＧＣＳと、前記第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニン以外である非ヒト型γＧＣＳとを準備し、予め準備した薬剤候補化合物を、前記ヒト型及び非ヒト型γＧＣＳのそれぞれと接触させて、結合の強さをそれぞれ評価し、前記ヒト型γＧＣＳよりも前記非ヒト型γＧＣＳにより強く結合する前記薬剤候補化合物を選択する工程を含む。本発明のスクリーニング方法に用いる薬剤候補化合物の設計は、大腸菌γＧＣＳと基質遷移状態アナログとの共結晶であり、空間群が、Ｐ２1である結晶を解析して得られるγＧＣＳの立体構造データに基づくことが好ましい。
【選択図】図２
Description
本発明は、γ−グルタミルシステイン合成酵素の阻害剤のスクリーニング方法に関する。なお、本出願は、国の委託に係る成果の出願である。
グルタチオンによるホメオスタシスは、細胞内の酸化還元バランスの維持、及び、酸化ストレスや化学的ストレスに対する防御の維持において重要な役割を果たす。その一方、グルタチオンのレベルの制御は、薬理学的に注目されている。なぜなら、グルタチオンは、ある種の寄生虫やガン細胞における多剤耐性獲得機構に関与するからである。抗ガン剤又は抗寄生虫剤がガン細胞や寄生虫細胞内に侵入すると、これらの薬剤とグルタチオンとが結合してＧＳＨ包接化合物が形成され、このＧＳＨ包接化合物が、例えば、ＭＤＲ輸送体等により、細胞外に排出される。このような機構により、寄生虫やガン細胞は、薬剤耐性を獲得する。
γ−グルタミルシステイン合成酵素（グルタミン酸-システインリガーゼ：EC 6.3.2.2、以下、γＧＣＳと呼ぶ。）は、グルタチオンの生合成の最初のステップを触媒する酵素である。グルタチオンの生合成系を、図３に示す。図３に示すように、γＧＣＳは、Ｍｇ2+、ＡＴＰ存在下で、Ｌ-グルタミン酸とＬ-システインから、γ−グルタミルシステインが合成される反応を触媒する。そして、γＧＣＳが触媒するこの反応は、グルタチオン生合成の律速段階である。また、γＧＣＳの活性は、生体内では、グルタチオンによるノンアロステリックなフィードバック阻害、細胞内Ｌ-システインの欠乏、ならびに、さまざまな生理学的条件下における転写及び転写後の発現制御によって、正確に制御されている。
グルタチオンの多剤耐性獲得機構への関与等の理由により、γＧＣＳは、創薬ターゲットとして注目されている。伝統的なγＧＣＳの阻害剤としては、例えば、Ｌ-ブチオニンスルホキシイミン（ＢＳＯ）があげられる。前記ＢＳＯは、ヒトのアフリカ眠り病を引き起こす寄生原虫トリパノゾーマ・ブルース（Trypanosoma brucei）に感染したマウスを延命できること（非特許文献１参照）、及び、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の成長を阻害できること（非特許文献２参照）が示されている。さらに、前記ＢＳＯで、ガン細胞を前処理すると、前記ガン細胞において、ＭＲＰ輸送体による薬剤耐性を取り除くことができることも報告されている（例えば、非特許文献３及び４参照）。
その他のγＧＣＳ阻害剤としては、前記ＢＳＯと同様にスルホキシイミン構造を有する化合物であって、γ-グルタミルリン酸とＬ-システインとの予測される遷移状態のアナログからなる阻害剤があげられる（非特許文献５参照）。
B. A. Arrick, O. W. Griffith, A. Cerami, J. Exp. Med. 153, 720 (1981). K. Luersen, R. D. Walter, S. Muller, Biochem. J. 346, 545 (2000). G. Rappa et al., Eur. J. Cancer 39, 120 (2003). T. Fojo, S. Bates, Oncogene 22, 7512 (2003). J. Hiratake, T. Irie, N. Tokutake, J. Oda, Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1500 (1998).
B. A. Arrick, O. W. Griffith, A. Cerami, J. Exp. Med. 153, 720 (1981). K. Luersen, R. D. Walter, S. Muller, Biochem. J. 346, 545 (2000). G. Rappa et al., Eur. J. Cancer 39, 120 (2003). T. Fojo, S. Bates, Oncogene 22, 7512 (2003). J. Hiratake, T. Irie, N. Tokutake, J. Oda, Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1500 (1998).
しかしながら、γＧＣＳの阻害剤として、例えば、前記寄生虫を含むヒト以外の生物のγＧＣＳに特異的に作用する阻害剤の存在は知られておらず、そのような阻害剤をスクリーニングできる方法が望まれている。
そこで、本発明は、寄生虫を含むヒト以外の生物に特異的なγＧＣＳの阻害剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のスクリーニング方法は、γ−グルタミルシステイン合成酵素（γＧＣＳ）の阻害剤のスクリーニング方法であって、下記（Ａ）のヒト型γＧＣＳと、下記（Ｂ）の非ヒト型γＧＣＳとを準備し、予め準備した薬剤候補化合物を、前記ヒト型及び非ヒト型γＧＣＳのそれぞれと接触させて、前記化合物の前記両γＧＣＳへの結合の強さをそれぞれ評価し、前記ヒト型γＧＣＳよりも前記非ヒト型γＧＣＳにより強く結合する前記薬剤候補化合物を選択する工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）ヒト型γＧＣＳ：γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニンであるγＧＣＳ。
（Ｂ）非ヒト型γＧＣＳ：γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸残基であるγＧＣＳ。
（Ａ）ヒト型γＧＣＳ：γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニンであるγＧＣＳ。
（Ｂ）非ヒト型γＧＣＳ：γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸残基であるγＧＣＳ。
本発明者らは、γＧＣＳに結合する化合物であって、γＧＣＳの反応中間体であるγ-グルタミルリン酸とＬ-システインとの遷移状態のアナログであるスルホキシイミン構造を有する化合物において、Ｌ-システインのカルボキシル基と側鎖に相当する部分が、前記化合物とγＧＣＳとの結合の強さに影響することに着目して、鋭意研究を重ねた。本発明者らは、まず、大腸菌γＧＣＳ（AC No.P06980：配列番号１）と下記構造式（１）で表される化合物との共結晶であって、空間群が、Ｐ２1である結晶を作製し、その結晶解析を行い、γＧＣＳのタンパク質立体構造を世界で初めて明らかにした。次に、本発明者らは、前記構造解析により明らかにされたγＧＣＳのＬ-システイン結合部位に寄与するアミノ酸残基の一つが、ヒトを含む多くのγＧＣＳで保存されているにも関わらず、ある種の寄生虫において置換されていることに着目し、前記アミノ酸残基の置換によりもたらされる構造の差異に基づけば、前記寄生虫のγＧＣＳに特異的な阻害剤となる化合物を設計できることを見出した。さらに、本発明者らは、前記アミノ酸残基を置換した組換えγＧＣＳを用いれば、設計した薬剤候補化合物をスクリーニングできることを見出し、本発明に到達した。
本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、トリパノゾーマ・ブルース（Trypanosoma brucei）や、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）等の寄生虫のγＧＣＳを含む非ヒト型γＧＣＳに特異的な阻害剤をスクリーニングできる。前記阻害剤は、前記寄生虫の薬剤耐性獲得を抑制できるから、例えば、新たな寄生虫感染症の治療・予防薬や、治療・予防方法に利用できる。
本発明のスクリーニング方法は、一態様として、トリパノゾーマ・ブルース(Trypanosoma brucei)のγＧＣＳの阻害剤をスクリーニング対象とし、前記非ヒト型γＧＣＳとして、前記第１３２番目に相当するアミノ酸残基がアスパラギンである非ヒト型γＧＣＳを使用する方法である。
本発明のスクリーニング方法は、その他の態様として、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)のγＧＣＳの阻害剤をスクリーニング対象とし、前記第１３２番目に相当するアミノ酸残基がグルタミンである非ヒト型γＧＣＳを使用する方法である。
本発明のスクリーニング方法において、前記薬剤候補化合物は、大腸菌γＧＣＳと前記構造式（１）で表される化合物との共結晶の結晶構造解析データから設計される化合物を使用することができる。その中でも、前記薬剤候補化合物としては、下記一般式（２）の化学構造を有する化合物を用いることが好ましい。
上記式（２）において、Ｘは、−Ｈ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＣＨ2ＮＨＣＨ3、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2、−ＣＦ3、−ＣＨ2Ｂｒ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨＣｌ2、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＮＣ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒ、−ＣＨ2ＣＦ3、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、−ＰＯ3Ｈ、−ＣＨ2ＰＯ3Ｈ、−Ｐ（ＣＨ3）Ｏ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ2Ｈ、−ＮＯ2、−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＣＮＨ2、及び、−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2からなる群から選択される置換基であり、Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＣＨ3、−ＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＳＯ3Ｈ、及び、−ＮＯ2からなる群から選択される置換基である。
本発明のスクリーニング方法において、γＧＣＳと前記薬剤候補化合物の結合の強さは、例えば、スローバインディングキネティクス(slow-binding kinetics)に基づくアッセイ法で評価することができる。
本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基がアルギニン以外のアミノ酸残基である組換えγＧＣＳである。本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、例えば、本発明のスクリーニング方法に使用可能である。
本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、下記（i）又は（ii）に記載の非ヒト型組換えγＧＣＳであることが好ましい。
（i） 大腸菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.P06980：配列番号１）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
コレラ菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.AAF93724：配列番号２）の第１３１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
緑膿菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 253890：配列番号３）の第１３４番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
サルモネラ菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 457216：配列番号４）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ブフネラγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 777980：配列番号５）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ヒトγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 001489：配列番号６）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ラットγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.P97494：配列番号７）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
マウスγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.O09172：配列番号８）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
マイコプラズマγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 857368：配列番号９）の第１１２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、及び
トリパノゾーマ・グルージγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.AAC80009：配列番号１０）の第１８５番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる非ヒト型組換えγＧＣＳ。
（ii） 前記(i)のアミノ酸配列におけるアスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する非ヒト型組換えγＧＣＳ。
（i） 大腸菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.P06980：配列番号１）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
コレラ菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.AAF93724：配列番号２）の第１３１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
緑膿菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 253890：配列番号３）の第１３４番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
サルモネラ菌γＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 457216：配列番号４）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ブフネラγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 777980：配列番号５）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ヒトγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 001489：配列番号６）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ラットγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.P97494：配列番号７）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
マウスγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.O09172：配列番号８）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
マイコプラズマγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.NP 857368：配列番号９）の第１１２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、及び
トリパノゾーマ・グルージγＧＣＳアミノ酸配列（AC No.AAC80009：配列番号１０）の第１８５番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる非ヒト型組換えγＧＣＳ。
（ii） 前記(i)のアミノ酸配列におけるアスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する非ヒト型組換えγＧＣＳ。
本発明のヒト型組換えγＧＣＳは、γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基がアルギニンである組換えγＧＣＳである。本発明のヒト型組換えγＧＣＳは、例えば、本発明のスクリーニング方法に使用可能である。本発明のヒト型組換えγＧＣＳとしては、下記（iii）又は（iv）に記載のヒト型組換えγＧＣＳが好ましい。
（iii） トリパノゾーマ・ブルースγＧＣＳ（AC No.AAC47195：配列番号１１）の第１８５番目のアスパラギンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列、又は、
熱帯熱マラリア原虫γＧＣＳ（AC No.T18400：配列番号１２）の第４７３番目のグルタミンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなるヒト型組換えγＧＣＳ。
（iv） 前記(iii)のアミノ酸配列におけるアルギニンに置換されたアミノ酸残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する非ヒト型組換えγＧＣＳ。
（iii） トリパノゾーマ・ブルースγＧＣＳ（AC No.AAC47195：配列番号１１）の第１８５番目のアスパラギンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列、又は、
熱帯熱マラリア原虫γＧＣＳ（AC No.T18400：配列番号１２）の第４７３番目のグルタミンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなるヒト型組換えγＧＣＳ。
（iv） 前記(iii)のアミノ酸配列におけるアルギニンに置換されたアミノ酸残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する非ヒト型組換えγＧＣＳ。
本発明のポリヌクレオチドは、前記(i)から(iv)のいずれかの組換えγＧＣＳをコードするポリヌクレオチドであり、本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。そして、本発明の形質転換生物又はその細胞は、本発明のベクターにより形質転換された生物又はその細胞である。
本発明の結晶は、薬剤候補化合物の設計に使用される共結晶であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるγＧＣＳと前記構造式（１）で表される化合物との共結晶であり、空間群が、Ｐ２1である。
本発明の寄生虫感染症の予防・治療薬の製造方法は、薬剤候補化合物を準備する工程と、前記薬剤候化合物を本発明のスクリーニング方法により非ヒト型γＧＣＳを特異的に阻害する化合物を選択する工程と、選択された前記化合物を有効量含む寄生虫感染症の予防・治療薬を製造する工程とを含む製造方法である。
まず、本発明のスクリーニング方法に使用するγＧＣＳについて説明する。本発明において、ヒト型γＧＣＳは、γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニンであるγＧＣＳを指す。ヒト、ラットをはじめ、細菌まで、多くの生物が、ヒト型のγＧＣＳを有している。下記表１に、ヒト型のγＧＣＳを有する生物と、それぞれのγＧＣＳ配列のデータベース登録番号及び前記第１３２番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基の位置を示す。
（表１）
生物 登録番号 配列位置 配列番号
大腸菌 (Escherichia coli) P06980 １３２ １
コレラ菌 (Vibrio cholerae) AAF93724 １３１ ２
緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) NP 253890 １３４ ３
サルモネラ菌（Salmonella enterica） NP 457216 １３２ ４
ブフネラ (Buchnera aphidicola) NP 777980 １３２ ５
ヒト NP 001489 １９１ ６
ラット P97494 １９１ ７
マウス O09172 １９１ ８
マイコプラズマ（Mycobacterium bovis AF2122/97）NP 857368 １１２ ９
トリパノゾーマ・クルージ (Trypanosoma cruzi) AAC80009 １８５ １０
生物 登録番号 配列位置 配列番号
大腸菌 (Escherichia coli) P06980 １３２ １
コレラ菌 (Vibrio cholerae) AAF93724 １３１ ２
緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) NP 253890 １３４ ３
サルモネラ菌（Salmonella enterica） NP 457216 １３２ ４
ブフネラ (Buchnera aphidicola) NP 777980 １３２ ５
ヒト NP 001489 １９１ ６
ラット P97494 １９１ ７
マウス O09172 １９１ ８
マイコプラズマ（Mycobacterium bovis AF2122/97）NP 857368 １１２ ９
トリパノゾーマ・クルージ (Trypanosoma cruzi) AAC80009 １８５ １０
本発明のスクリーニング方法において、非ヒト型γＧＣＳは、γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸残基であるγＧＣＳを指す。非ヒト型のγＧＣＳを生来的に有する生物としては、下記表２の生物があげられる。下記表２には、生物名と、配列データベース登録番号と、前記第１３２番目に相当するアミノ酸残基とその位置を示す。
（表２）
生物 登録番号 対応アミノ酸残基 配列位置 配列番号
トリパノゾーマ・ブルース
(Trypanosoma brucei) AAC47195 アスパラギン １８５ １１
熱帯熱マラリア原虫
(Plasmodium falciparum) T18400 グルタミン ４７３ １２
生物 登録番号 対応アミノ酸残基 配列位置 配列番号
トリパノゾーマ・ブルース
(Trypanosoma brucei) AAC47195 アスパラギン １８５ １１
熱帯熱マラリア原虫
(Plasmodium falciparum) T18400 グルタミン ４７３ １２
本発明者らは、大腸菌γＧＣＳの立体構造解析を行い、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示すγＧＣＳの３次元及び２次元構造を世界で初めて明らかにした。さらに、本発明者らは、前記立体構造解析の結果に基づき、種々のγＧＣＳとのマルチプルアライメントを行い、γＧＣＳにおけるＬ-システインの結合部位を構成するＮ末端バリアブルアーム（配列番号１の第１０５番目〜第１４５番目）と中央バリアブルアーム（配列番号１の第２３８番目〜第３１１番目）のアライメントに成功した。そのアライメントの一例を図２に示す。図２は、大腸菌（Ｅｃ）、コレラ菌（Ｖｃ）、緑膿菌（Ｐａ）、ブルネラ（Ｂａ）、ヒト（Ｈｕ）、ラット（Ｒａ）、トリパノゾーマ・クルージ（Ｔｃ）、トリパノゾーマ・ブルース（Ｔｂ）、及び、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｆ）についてのアライメントである。立体構造解析からＬ−システインの側鎖の認識に関わるアミノ酸残基であることが明らかにされた大腸菌（Ｅｃ）の第１３２番目のアルギニン（Ｒ）は、図２に示すとおり、トリパノゾーマ・ブルース（Ｔｂ）、及び、熱帯熱マラリア原虫 （Ｐｆ）以外で保存されている。前記第１３２番目のアルギニン（Ｒ）は、トリパノゾーマ・ブルースでは、アスパラギン（Ｎ）に置換され、熱帯熱マラリア原虫では、グルタミン（Ｑ）に置換されている。
したがって、非ヒト型γＧＣＳとして、前記トリパノゾーマ・ブルースのγＧＣＳ、又は、前記ヒト型γＧＣＳにおいて前記第１３２番目のアミノ酸残基に相当するアルギニン（Ｒ）がアスパラギン（Ｎ）に置換された非ヒト型組換えγＧＣＳを用いれば、トリパノゾーマ・ブルースに特異的なγＧＣＳ阻害剤をスクリーニングできる。
また、非ヒト型γＧＣＳとして、前記熱帯熱マラリア原虫のγＧＣＳ、又は、前記ヒト型γＧＣＳにおいて前記第１３２番目のアミノ酸残基に相当するアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に置換された非ヒト型組換えγＧＣＳを用いれば、熱帯熱マラリア原虫にに特異的なγＧＣＳ阻害剤をスクリーニングできる。
なお、本発明のスクリーニング方法のスクリーニング対象は、前記トリパノゾーマ・ブルース又は熱帯熱マラリア原虫のγＧＣＳ阻害剤に限られず、γＧＣＳが生来的に非ヒト型であれば、その生物に特異的なγＧＣＳ阻害剤をスクリーニングできる。ある生物のγＧＣＳがヒト型か非ヒト型かは、例えば、図２を参照して、マルチプルアライメントを行い、配列番号１の第１３２番目に相当するアミノ酸残基がアルギニンであるか否かにより判定できる。
本発明のスクリーニング方法に用いる薬剤候補化合物としては、特に制限されず、あらゆる化学物質を候補化合物として使用できる。その中でも、前記薬剤候補化合物は、本発明の結晶の結晶解析データから得られるγＧＣＳの立体構造情報に基づき設計されたものが好ましい。立体構造情報に基づく薬剤候補化合物の設計は、例えば、低分子化合物ライブラリーから酵素の活性中心に適合する化合物の検索を下記のソフトウェアを用いたドッキングシュミレーション法等により行うことができる。その一態様は、例えば、スルホキシイミン型阻害剤のリード化合物とした薬剤候補化合物等と組み合せることで、ファーマコフォアモデルを構築していく方法である。前記ソフトウェアとしては、例えば、DOCK、AUTODOCK、3D-Dock、FlexX（以上、フリーウェア）、商品名：C2.Ludi（富士通、Accelrys Inc.製）、商品名：AS DOCK（(株)菱化システム社製）等があげられる。また、γＧＣＳの立体構造情報は、後述の実施例に記載の方法にしたがって、本発明の前記γＧＣＳ結晶を作製し、この結晶をＸ線解析することにより得ることができる。
また、本発明のスクリーニング方法に用いる薬剤候補化合物であって、トリパノゾーマ・ブルース又は熱帯熱マラリア原虫に特異的なγＧＣＳ阻害剤の薬物候補化合物は、Ｌ−システイン側鎖の認識部位を形成すると考えられる配列番号１の第１３２番目に相当するアスパラギンやグルタミンと水素結合が形成可能な官能基を含むように分子設計することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法に用いる薬剤候補化合物の具体例として、下記一般式（２）の化学構造を有するmechanism-based inhibitorとして機能する阻害剤の薬剤候補化合物があげられる。
上記式（２）において、Ｘは、−Ｈ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＣＨ2ＮＨＣＨ3、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2、−ＣＦ3、−ＣＨ2Ｂｒ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨＣｌ2、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＮＣ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒ、−ＣＨ2ＣＦ3、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、−ＰＯ3Ｈ、−ＣＨ2ＰＯ3Ｈ、−Ｐ（ＣＨ3）Ｏ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ2Ｈ、−ＮＯ2、−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＣＯＣＮＨ2、及び、−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2からなる群から選択される置換基であって、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＣＨ2ＮＨＣＨ3、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＦ3、−ＣＨ2ＣＦ3、又は、−ＣＮが好ましく、より好ましくは、−ＣＨ2ＣＨ3、又はＣＨ2ＯＨである。また、Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＣＨ3、−ＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＳＯ3Ｈ、及び、−ＮＯ2からなる群から選択される置換基であって、−Ｈ、−ＯＨ、又は、−ＣＯＯＨが好ましく、より好ましくは、−Ｈ、又は、−ＣＯＯＨである。
前記一般式（２）の化学構造を有する化合物が、mechanism-based inhibitorとして機能する場合、γＧＣＳとの結合した後、下記一般式（３）のようにリン酸化されてγＧＣＳと強く結合するように変換され、阻害剤として機能することとなる。
前記ヒト型γＧＣＳ又は非ヒト型γＧＣＳと、前記薬剤候補化合物とを接触させる方法は、特に制限されず、インビトロの方法であってもよく、インビボの方法であってもよい。
前記インビトロの方法としては、特に制限されないが、例えば、精製した前記ヒト型又は非ヒト型γＧＣＳと、Ｌ-グルタミン酸と、Ｌ-システインもしくはＬ-２-アミノ酪酸と、ＡＴＰと、マグネシウムとを含む反応液に、前記薬剤候補化合物を加えて、インキュベーションする方法があげられる。この場合、前記薬剤候補化合物とγＧＣＳとの結合の強さは、γＧＣＳの酵素活性が受ける阻害の程度で測定できる。前記mechanism-based inhibitorとして機能する阻害剤の薬剤候補化合物を用いた場合、例えば、スローバインディングキネティクス(slow-binding kinetics)に基づくアッセイ方法（例えば、非特許文献５参照）等により、前記阻害剤の阻害作用の強さを定量することができる。
具体的には、例えば、γＧＣＳ（Ｅ）、基質（グルタミン酸：Ｓ）、生成物（ＡＤＰ：Ｐ）及び、阻害剤（Ｉ）との反応を下記式（４）で表し、生成物であるＡＤＰを測定して下記式（５）〜（７）から「ＥＩ→ＥＩ＊」の速度定数ｋｏｎ［Ｉ］又は阻害定数Ｋｉを求め、前記ｋｏｎの大きさ又は前記Ｋｉをその阻害剤の阻害作用の強さとして定量する方法があげられる。なお、下記式において、Ｋｍは、γＧＣＳの「Ｅ＋Ｓ ⇔ ＥＳ」の反応についてのＫｍ値を表す。
Ｅ＋Ｓ ⇔ ＥＳ→Ｅ＋Ｐ
↑↓ ・・・（４）
ＥＩ→ＥＩ＊
［Ｐ］＝［Ｐ］ｍａｘ ・ ［１−ｅｘｐ（−ｋｔ）］ ・・・（５）
ｋ ＝ ｋｏｎ［Ｉ］／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ） ・・・（６）
Ｋｉ＝ ［Ｅ］・［Ｉ］／［ＥＩ＊］ ・・・（７）
Ｅ＋Ｓ ⇔ ＥＳ→Ｅ＋Ｐ
↑↓ ・・・（４）
ＥＩ→ＥＩ＊
［Ｐ］＝［Ｐ］ｍａｘ ・ ［１−ｅｘｐ（−ｋｔ）］ ・・・（５）
ｋ ＝ ｋｏｎ［Ｉ］／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ） ・・・（６）
Ｋｉ＝ ［Ｅ］・［Ｉ］／［ＥＩ＊］ ・・・（７）
前記インビボの方法としては、特に制限されないが、例えば、非ヒト型γＧＣＳを有する前記寄生虫に直接、薬剤候補化合物を作用させる方法や、遺伝子組換え技術等により、ヒト型及び非ヒト型のγＧＣＳどちらか一方のみを有するモデル実験生物又は細胞を作製し、前記生物又は細胞に薬剤候補化合物を作用させ、細胞内部でγＧＣＳと接触させる方法があげられる。前記薬剤候補化合物とγＧＣＳとの結合の強さを評価する方法としては、例えば、γＧＣＳが阻害されることによりグルタチオンが欠乏するから、例えば、グルタチオンの欠乏により誘導される遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を配置し、前記レポーター遺伝子の発現を指標として評価する方法があげられる。
本発明のスクリーニング方法に用いるヒト型γＧＣＳ及び非ヒト型γＧＣＳは、由来が同じであることが好ましい。結合の強さの判定が容易となるからである。その場合、前記由来となる生物は、特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等のヒト型γＧＣＳである実験動物があげられ、前記ヒト型γＧＣＳに対応する非ヒト型γＧＣＳとしては、前記ヒト型γＧＣＳの前記第１３２番目に相当するアルギニンを置換した本発明の組換えγＧＣＳがあげられる。これらのγＧＣＳの発現及び精製方法は、特に制限されず、従来公知の方法で行うことができる。
本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、上記表１に示したヒト型γＧＣＳを有する生物のγＧＣＳのアミノ酸配列における同表に示した配列位置のアルギニンを、異なるアミノ酸に置換した組換えγＧＣＳを含む。置換アミノ酸としては、特に制限されないが、アスパラギン又はグルタミンが好ましい。また、本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、さらに、上記置換アミノ酸以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する非ヒト型組換えγＧＣＳを含む。このような非ヒト型組換えγＧＣＳにおいて、欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸残基数は、γ-グルタミルシステイン合成酵素活性が阻害されなければ、特に制限されないが、例えば、１〜２０であり、好ましくは、１〜１０であり、より好ましくは、１〜５であり、さらに好ましくは、１〜２である。また、本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、精製の手順の簡略化・低廉化や、安定性の向上・可溶化等を目的として、酵素活性を阻害しない範囲で、各種のタンパク質もしくはペプチドタグと融合させてもよい。
本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳの具体例として、上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の非ヒト型組換えγＧＣＳが挙げられる。また、図２に示すとおり、トリパノゾーマ・ブルース及び熱帯熱マラリア原虫において、配列番号１の第１３１番目に相当するアミノ酸残基は、トレオニン（Ｔ）であるから、例えば、大腸菌、コレラ菌、緑膿菌、サルモネラ菌及びブフネラ等の非ヒト型組換えγＧＣＳにおいては、配列番号１の第１３１番目に相当するチロシン（Ｙ）をトレオニン（Ｔ）に置換した非ヒト型組換えγＧＣＳとすることも好ましい。
本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、例えば、まず、前記表１のヒト型γＧＣＳのコード配列（ＣＤＳ）をクローニングし、次に、前記ＣＤＳに前記表１の配列位置のアルギニンを、アスパラギン又はグルタミンに置換する変異を導入して非ヒト型組換えγＧＣＳのＣＤＳからなるポリヌクレオチドを得て、そして、前記ＣＤＳを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入して発現させ、必要に応じて精製することで、製造することができる。前記表１に記載の各種生物のγＧＣＳのコード配列（ＣＤＳ）のクローニング及び前記置換変異導入は、当業者であれば、容易に行うことができる。下記表３に、前記表１に記載の各種生物のγＧＣＳのＣＤＳのデータバンク登録番号及び非ヒト型組換えγＧＣＳの製造のために置換変異を導入すべき配列位置を示す。
（表３）
生物 登録番号 配列位置 配列番号
大腸菌 U00096 394-396 １３
コレラ菌 AE004141 391-393 １４
緑膿菌 NC 002516 400-402 １５
サルモネラ菌 NC 003198 394-396 １６
ブフネラ NC 004545 394-396 １７
ヒト NM 001498 571-573 １８
ラット NM 010295 571-573 １９
マウス NM 008129 571-573 ２０
マイコプラズマ NC 002945 334-336 ２１
トリパノゾーマ・クルージ AF095637 552-555 ２２
生物 登録番号 配列位置 配列番号
大腸菌 U00096 394-396 １３
コレラ菌 AE004141 391-393 １４
緑膿菌 NC 002516 400-402 １５
サルモネラ菌 NC 003198 394-396 １６
ブフネラ NC 004545 394-396 １７
ヒト NM 001498 571-573 １８
ラット NM 010295 571-573 １９
マウス NM 008129 571-573 ２０
マイコプラズマ NC 002945 334-336 ２１
トリパノゾーマ・クルージ AF095637 552-555 ２２
前記本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳをコードする本発明のポリヌクレオチドは、例えば、上述したように、ヒト型γＧＣＳのＣＤＳからなるポリヌクレオチドを入手し、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアルギニン残基の部分に変異を導入することで製造することができる。ＣＤＳの増幅方法やクローニング方法、及び、部位特異的変異導入方法は、従来公知の方法を適用できる。本発明のポリヌクレオチドの具体例として、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１３：大腸菌γＧＣＳ遺伝子）において、第１３２番目のアルギニン残基をコードする第３９４番目〜第３９６番目の「ｃｇｔ」の塩基配列を、「ａａｃ」「ａａｔ」「ｃａａ」又は「ｃａｇ」に置換した塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のヒト型組換えγＧＣＳは、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基がアルギニン以外のアミノ酸残基である非ヒト型γＧＣＳの前記アミノ酸残基をアルギニンにしたものであり、前記（iii）及び（iv）の組換えγＧＣＳを含む。また、前記（iv）のヒト型組換えγＧＣＳにおいて、欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸残基数は、γ-グルタミルシステイン合成酵素活性が阻害されなければ、特に制限されないが、例えば、１〜２０であり、好ましくは、１〜１０であり、より好ましくは、１〜５であり、さらに好ましくは、１〜２である。また、本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳは、精製の手順の簡略化・低廉化や、安定性の向上・可溶化等を目的として、酵素活性を阻害しない範囲で、各種のタンパク質もしくはペプチドタグと融合させてもよい。
本発明のヒト型組換えγＧＣＳは、例えば、まず、前記表２の非ヒト型γＧＣＳのコード配列（ＣＤＳ）をクローニングし、次に、前記ＣＤＳに前記表２の配列位置のアスパラギン又はグルタミンを、アルギニンに置換する変異を導入してヒト型組換えγＧＣＳのＣＤＳからなるポリヌクレオチドを得て、そして、前記ＣＤＳを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入して発現させ、必要に応じて精製することで、製造することができる。前記表２に記載の各種生物のγＧＣＳのコード配列（ＣＤＳ）のクローニング及び前記置換変異導入は、当業者であれば、容易に行うことができる。下記表４に、前記表２の非ヒト型γＧＣＳのＣＤＳのデータバンク登録番号及びヒト型組換えγＧＣＳの製造のために置換変異を導入する配列位置を示す。
（表４）
生物 登録番号 配列位置 配列番号
トリパノゾーマ・ブルース U56818 552-555 ２３
熱帯熱マラリア原虫 NC 004330 1417-1419 ２４
生物 登録番号 配列位置 配列番号
トリパノゾーマ・ブルース U56818 552-555 ２３
熱帯熱マラリア原虫 NC 004330 1417-1419 ２４
本発明のヒト型組換えγＧＣＳをコードする本発明のポリヌクレオチドは、上述した本発明の非ヒト型γＧＣＳをコードするポリヌクレオチドの製造方法と同様にして製造できる。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、従来公知の発現ベクターや組換えベクターに組込むことで、本発明のベクターとすることができる。本発明のベクターは、例えば、本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳを製造するため、又は、インビボのスクリーニング方法に使用するための形質転換生物やその細胞の製造等に使用できる。したがって、本発明のベクターは、導入する宿主において本発明の非ヒト型組換えγＧＣＳを発現可能な発現ベクターであることが好ましい。本発明の形質転換生物又はその細胞は、本発明のベクターにより形質転換された生物又はその細胞である。前記生物は、特に制限されず、例えば、微生物、動物又は植物等に由来するものを使用できる。また、これらの生物又はその細胞の製造は、特に制限されず、従来公知の遺伝子導入技術を適用して行うことができる。前記遺伝子導入方法としては、特に制限されず、例えば、ファージやウイルスを利用する方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。本発明の形質転換生物又はその細胞は、例えば、本発明のスクリーニング方法において、薬剤候補化合物のγＧＣＳへの結合の強さをインビボで評価する場合に使用できる。
本発明の結晶は、薬剤候補化合物の設計に使用される共結晶であって、配列番号１のアミノ酸配列からなる大腸菌γＧＣＳと前記構造式（１）で表される化合物との共結晶であり、空間群が、Ｐ２1である結晶である。
本発明の結晶の作製にあたっては、得られる結晶が、単結晶ではなく、双晶や多結晶構造であるものが多く、構造解析には適さないという技術的な問題があった。一般に、Ｘ線の回析現象を用いて構造解析を行うためには、単位格子で定義される分子の配列が全体に均一に並んだ結晶（単結晶）が必要となる。しかしながら、結晶の成長過程において、１つの単結晶の特定の成長面が新たな単結晶の成長開始点になり、２つ以上の単結晶が分離できない状態で見かけ上１つの結晶（双晶）となるツイニング（twining）が生じたり、また、単結晶同士が複数付着し合った多結晶構造が生じる場合がある。前記多結晶構造の結晶は、単結晶が分離できれば構造解析が可能となる場合があるが、結晶が小さかったり、物理的に損傷したりするため、一般的に構造解析には適していない。
通常、前記問題を解決する方法としては、例えば、界面活性剤、ジオキサン等の有機溶媒、もしくは、グリセロール等の糖類の添加を行ったり、又は、タンパク質の分子表面にある残基を改変方法が知られていた。しかしながら、本発明の結晶に関しては、前記界面活性剤や有機溶媒等は、ほとんど効果がなく、単結晶の製造が困難であった。本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、本発明の結晶の単結晶の成長促進には、ジアミン化合物の添加が効果があることを見出し、本発明の結晶を得るに至った。
前記ジアミン化合物は、結晶化において、通常、タンパク質を安定化するためにキレート剤として利用されることがあるが、双晶や多結晶構造を抑制し、単結晶の成長を促進するためにジアミン化合物が利用できることは、本発明者らが初めて見出したことである。
本発明の結晶は、例えば、精製した大腸菌γＧＣＳと下記構造式（８）で表される化合物とを、マグネシウム・ＡＴＰ存在下でインキュベーションし、ジアミン化合物を添加したγＧＣＳ溶液を用いて、シッティングドロップ蒸気拡散法を行うことで結晶化することができる。前記大腸菌γＧＣＳの精製方法は、特に制限されず、従来公知の方法で精製できる。
前記γＧＣＳ溶液に添加するジアミン化合物としては、例えば、１,６-ジアミノヘキサンや１,８-ジアミノオクタンがあげられ、その添加濃度は、γＧＣＳ溶液の初期濃度として、例えば、０.３〜０.８％(W/V)であり、好ましくは、０.５〜０.７％(W/V)であり、より好ましくは、０.５％(W/V)である。また、前記ジアミン化合物の添加時におけるγＧＣＳ溶液のｐＨは、８.０〜９.５である。ｐＨが９.５を越えると酵素が変性してしまい、また、ｐＨが８.０未満では、結晶が生じない。前記ｐＨは、好ましくは、８.０〜９.０であり、より好ましくは、８.０〜８.５である。
本発明のスクリーニング方法により薬剤候補化合物から選択された化合物は、人体に対する作用や副作用等に関する薬理学的実験を行い、薬学的に許容できるものである場合には、従来公知の方法で、寄生虫等の感染症に対する治療・予防薬とすることができる。
以下、本発明を実施例により、さらに説明する。
（γＧＣＳの結晶化）
γＧＣＳの発現・精製は、以下とおりに行った。まず、大腸菌（ＪＭ１０９）の菌体培養後、超音波破砕法等により細胞膜を破壊して菌体粗抽出液を調製した。得られた前記菌体粗抽出液に硫酸アンモニウムを４５−５０％飽和となるように加えて硫安沈殿した後、遠心分離をした上清画分を用いて疎水カラムクロマトグラフィー、ＡＴＰアガロースアフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ又はＱＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分離をこの順で行い、精製酵素標品を得た。
γＧＣＳの発現・精製は、以下とおりに行った。まず、大腸菌（ＪＭ１０９）の菌体培養後、超音波破砕法等により細胞膜を破壊して菌体粗抽出液を調製した。得られた前記菌体粗抽出液に硫酸アンモニウムを４５−５０％飽和となるように加えて硫安沈殿した後、遠心分離をした上清画分を用いて疎水カラムクロマトグラフィー、ＡＴＰアガロースアフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ又はＱＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分離をこの順で行い、精製酵素標品を得た。
次に、精製γＧＣＳと前記構造式（８）で表される化合物とを、マグネシウム・ＡＴＰ存在下で、２５℃で、その活性が完全に止まるまでインキュベーションした。この複合体を、シッティングドロップ蒸気拡散法により、１５％（Ｗ／Ｖ） ＰＥＧ ２０００ＭＭＥと、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ,ｐＨ７.５のバッファーに対して、２０℃で結晶化した。なお、前記γＧＣＳの溶液には、ツイニングを防止するため、０.５％(W/V)のジアミノオクタンを添加した。得られた結晶を、瞬間的に、２５％ ＰＥＧ４００を含む凍結防止溶液に浸した後、直接液体窒素中で、データコレクションまで保持した。
（データコレクション）
ＳＰｒｉｎｇ−８ビームラインＢＬ４１ＸＵのＭＡＲ ＣＣＤ検出器を使用して、１００Ｋで、結晶のＸ線回析データを収集した。強度データは、ＭＯＳＦＬＭプログラムとＣＣＰ４プログラム（Collaborative Computational Project製）とを組み合せて、又は、商品名：ＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒソフトウェア（Rigaku/MSC, Inc.製）を使用して、処理等を行った。その結果を下記表３に示す。下記表３に示すとおり、分解能２.１Åという、従来の結晶よりも、より高分解能で立体構造解析データを得ることができる共結晶を得た。
ＳＰｒｉｎｇ−８ビームラインＢＬ４１ＸＵのＭＡＲ ＣＣＤ検出器を使用して、１００Ｋで、結晶のＸ線回析データを収集した。強度データは、ＭＯＳＦＬＭプログラムとＣＣＰ４プログラム（Collaborative Computational Project製）とを組み合せて、又は、商品名：ＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒソフトウェア（Rigaku/MSC, Inc.製）を使用して、処理等を行った。その結果を下記表３に示す。下記表３に示すとおり、分解能２.１Åという、従来の結晶よりも、より高分解能で立体構造解析データを得ることができる共結晶を得た。
（表３）
データコレクション統計値
Space group Ｐ２1
Unit cell parameters ａ = 70.45 Å, ｂ = 97.36 Å
ｃ= 102.18 Å, β =109.63°
No. of monomers/asymmetric unit ２
Wavelength (Å) 1.0000
Resolution (Å) 48.8 - 2.10 (2.21-2.10)
Total No. of reflections 280,959
No. of unique reflections 73,644
Completeness (%) 97.2 (96.2)
Redundancy 3.8 (3.8)
I/σ 13.3 (3.2)
Ｒmerge(=ΣhΣi|Ih,I-<Ih>|/ΣhΣi|Ih,i|) 0.080 (0.371)
データコレクション統計値
Space group Ｐ２1
Unit cell parameters ａ = 70.45 Å, ｂ = 97.36 Å
ｃ= 102.18 Å, β =109.63°
No. of monomers/asymmetric unit ２
Wavelength (Å) 1.0000
Resolution (Å) 48.8 - 2.10 (2.21-2.10)
Total No. of reflections 280,959
No. of unique reflections 73,644
Completeness (%) 97.2 (96.2)
Redundancy 3.8 (3.8)
I/σ 13.3 (3.2)
Ｒmerge(=ΣhΣi|Ih,I-<Ih>|/ΣhΣi|Ih,i|) 0.080 (0.371)
（γＧＣＳのマルチプルアライメント）
γＧＣＳのシステイン結合部位のマルチプルアライメント（図２）は、以下のようにして行った。
（１）まず、比較的に近縁のγＧＣＳについて通常のマルチプルアライメントを行った。
（２）次に、保存性が高く、判別容易なグルタミン酸結合部位、ヌクレオチド結合部位、及びＭｇ結合部位を特定した。そして、その残りの部分の配列Ａにシステイン結合部位が含まれることとした。
（３）実施例１で得た結晶構造の解析を行い、システイン結合部位は、４０アミノ酸残基からなるＮ末端バリアブルアーム、５９残基の中央バリアブルアーム、及び、１０残基のスイッチループからなるという立体構造情報を得て、これをシステイン結合部位の基本構造とした。そして、前記配列Ａにおいて、変異が大きな箇所は、前記バリアブルアームから離れた箇所であり、保存性が高い箇所は前記バリアブルアーム内であるとして前記配列Ａを前記基本構造にあてはめた。
（４）その結果、前記配列Ａから、４０アミノ酸残基からなる領域（Ｎ末端バリアブルアームに相当）と７３アミノ酸残基からなる領域（中央バリアブルアームとスイッチループに相当）を切り出し、順次アライメントをして、最もホモロジーが高い組み合せを選択することで、図２のアライメントを得た。
γＧＣＳのシステイン結合部位のマルチプルアライメント（図２）は、以下のようにして行った。
（１）まず、比較的に近縁のγＧＣＳについて通常のマルチプルアライメントを行った。
（２）次に、保存性が高く、判別容易なグルタミン酸結合部位、ヌクレオチド結合部位、及びＭｇ結合部位を特定した。そして、その残りの部分の配列Ａにシステイン結合部位が含まれることとした。
（３）実施例１で得た結晶構造の解析を行い、システイン結合部位は、４０アミノ酸残基からなるＮ末端バリアブルアーム、５９残基の中央バリアブルアーム、及び、１０残基のスイッチループからなるという立体構造情報を得て、これをシステイン結合部位の基本構造とした。そして、前記配列Ａにおいて、変異が大きな箇所は、前記バリアブルアームから離れた箇所であり、保存性が高い箇所は前記バリアブルアーム内であるとして前記配列Ａを前記基本構造にあてはめた。
（４）その結果、前記配列Ａから、４０アミノ酸残基からなる領域（Ｎ末端バリアブルアームに相当）と７３アミノ酸残基からなる領域（中央バリアブルアームとスイッチループに相当）を切り出し、順次アライメントをして、最もホモロジーが高い組み合せを選択することで、図２のアライメントを得た。
（非ヒト型組換えγＧＣＳの精製）
非ヒト型γＧＣＳとして、トリパノゾーマ・ブルース型の大腸菌γＧＣＳのＲ１３２Ｎ変異体（Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳ）をコンストラクトし、宿主大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳ産生株を作製した。前記Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳ産生株を培養して菌体を回収し、超音波破砕した後、超遠心分離した。その上清分画を用いて、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーとＡＴＰアガロースによるアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行い、Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳの精製酵素標品を得た。
非ヒト型γＧＣＳとして、トリパノゾーマ・ブルース型の大腸菌γＧＣＳのＲ１３２Ｎ変異体（Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳ）をコンストラクトし、宿主大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳ産生株を作製した。前記Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳ産生株を培養して菌体を回収し、超音波破砕した後、超遠心分離した。その上清分画を用いて、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーとＡＴＰアガロースによるアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行い、Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳの精製酵素標品を得た。
（スルホキシイミン型阻害剤に対する非ヒト型組換えγＧＣＳの感受性）
γＧＣＳは、Ｍｇ2+存在下で、ＡＴＰを消費して、Ｌ−ＧｌｕとＬ−Ｃｙｓからγ−グルタミルシステインを合成する（図３参照）。この際に生成するＡＤＰ量を測定することで、γＧＣＳの活性を測定できる。また、前記ＡＤＰ量は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及びＮＡＤＨを共役酵素法(coupled enzyme method) を適用して、ＮＡＤＨの消費量（ＮＡＤ+の生成量）として測定できる。なお、ＮＡＤＨの波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、ε＝６２２０Ｍ-1・ｃｍ-1である。
γＧＣＳは、Ｍｇ2+存在下で、ＡＴＰを消費して、Ｌ−ＧｌｕとＬ−Ｃｙｓからγ−グルタミルシステインを合成する（図３参照）。この際に生成するＡＤＰ量を測定することで、γＧＣＳの活性を測定できる。また、前記ＡＤＰ量は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及びＮＡＤＨを共役酵素法(coupled enzyme method) を適用して、ＮＡＤＨの消費量（ＮＡＤ+の生成量）として測定できる。なお、ＮＡＤＨの波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、ε＝６２２０Ｍ-1・ｃｍ-1である。
上述のγＧＣＳ活性測定系を用いて、スルホキシイミン型阻害剤（基質遷移状態アナログ）を様々な濃度で添加した場合のＲ１３２Ｎ変異型γＧＣＳ及び野生型γＧＣＳの活性を測定した。具体的には、スルホキシイミン型阻害剤を含む反応溶液（２５ｍＭ Ｌ−Ｃｙｓ，１５ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕ，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4，０．２４ｍＭ ＮＡＤＨ，１ｍＭ ＰＥＰ，１０ｕｎｉｔ ＰＫ，２５ｕｎｉｔ ＬＤＨ，０．１Ｍ ＫＣｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）に３．０μｇ／ｍｌの野生型γＧＣＳ又は１２０μｇ／ｍｌのＲ１３２Ｎ変異型γＧＣＳを５０μｌ加えて反応を開始し、波長３４０ｎｍにおける吸光度の経時変化を３０分間測定した。なお、酵素１ｕｎｉｔとは、３７℃において、１μｍｏｌの基質を１分間に消費する酵素量を示す。また、スルホキシイミン型阻害剤として、下記式（９）のＢＳＯ、及び下記式（１０）の阻害剤を使用した。その結果の図４及び表４に示す。
上記式（１０）において、Ｒは、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ3又は−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3である。
（表４）
遷移状態 阻害定数Ｋｉ（μＭ） 速度定数ｋｏｎ（Ｍ -1 ｓ -1 ）
アナログ 野生型 Ｒ１３２Ｎ 野生型 Ｒ１３２Ｎ
Ｒ＝ＣＨ2ＯＨ ８．９ ３９ １０ １．６
ＢＳＯ ４９ ＞１０００ ４．９ ＜０．００１
Ｒ＝Ｅｔ ０．０９９ ＞１０００ １４００ ＜０．００１
Ｒ＝ｎ−Ｐｒ ０．５９ ＞１０００ ２２０ ＜０．００１
遷移状態 阻害定数Ｋｉ（μＭ） 速度定数ｋｏｎ（Ｍ -1 ｓ -1 ）
アナログ 野生型 Ｒ１３２Ｎ 野生型 Ｒ１３２Ｎ
Ｒ＝ＣＨ2ＯＨ ８．９ ３９ １０ １．６
ＢＳＯ ４９ ＞１０００ ４．９ ＜０．００１
Ｒ＝Ｅｔ ０．０９９ ＞１０００ １４００ ＜０．００１
Ｒ＝ｎ−Ｐｒ ０．５９ ＞１０００ ２２０ ＜０．００１
図４は、スルホキシイミン型阻害剤として、上記式（９）のＢＳＯ及び上記式（１０）のＲ＝ＣＨ2ＯＨを使用し、野生型γＧＣＳ及びＲ１３２Ｎ変異型γＧＣＳのＡＤＰ生成量を経時的に測定したグラフである。また、上記表４は、４種類のスルホキシイミン型阻害剤の野生型γＧＣＳ及びＲ１３２Ｎ変異型γＧＣＳに対する速度定数ｋｏｎおよび阻害定数Ｋｉを算出した結果を示す。ここで、阻害定数Ｋｉは、前述のとおり、Ｋｉ＝［Ｅ］・［Ｉ］／［ＥＩ＊］のようにして算出した。
図４及び表４に示すとおり、Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳは、従来から阻害剤として用いられてきたＢＳＯや、疎水的な官能基（Ｒ＝Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ）を持つスルホキシイミン型阻害剤に対して、阻害定数Ｋｉが１０００μＭ以上と、非常に弱い感受性しか示さなかった。一方、極性のある官能基（Ｒ＝ＣＨ2ＯＨ）を持つ阻害剤は、Ｒ１３２Ｎ変異型γＧＣＳに対して、野生型γＧＣＳに対するＢＳＯの阻害よりも強い阻害を示した。また、極性のある官能基（Ｒ＝ＣＨ2ＯＨ）を持つ阻害剤は、γＧＣＳに対して、阻害の程度が経時的に大きくなる slow binding inhibition の阻害活性を示した（図４参照）。これらの結果は、Ｒ＝ＣＨ2ＯＨの水酸基とＲ１３２Ｎ変異型γＧＣＳの１３２番目のアスパラギン（Ｎ）とが、水素結合を形成して酵素・阻害剤複合体を形成した後に、阻害剤がＡＴＰによってリン酸化されて、酵素の準不可逆的な失活が起きていることを示唆する。
そして、大腸菌のγＧＣＳの１３２番目のアルギニンに相当するアミノ酸残基が、アスパラギンやグルタミンに置換された非ヒト型γＧＣＳを特異的に選択して阻害するγＧＣＳの阻害剤の分子設計は、Ｌ−システイン側鎖の認識部位を形成すると考えられる前記アスパラギンやグルタミンと水素結合が形成可能な官能基を含むように設計することが好ましいことが示唆された。
以上、説明したとおり、本発明は、例えば、トリパノゾーマ・ブルースや、熱帯熱マラリア原虫等の寄生虫のγＧＣＳを含む非ヒト型γＧＣＳに特異的な阻害剤の開発に有用であり、例えば、アフリカ眠り病や、熱帯熱マラリア等の寄生虫感染症の治療・予防薬及び治療・予防方法の分野で有用である。
Claims (15)
- γ−グルタミルシステイン合成酵素（γＧＣＳ）の阻害剤のスクリーニング方法であって、
下記（Ａ）のヒト型γＧＣＳと、下記（Ｂ）の非ヒト型γＧＣＳとを準備し、
予め準備した薬剤候補化合物を、前記ヒト型及び非ヒト型γＧＣＳのそれぞれと接触させて、前記化合物の前記両γＧＣＳへの結合の強さをそれぞれ評価し、
前記ヒト型γＧＣＳよりも前記非ヒト型γＧＣＳにより強く結合する前記薬剤候補化合物を選択する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
（Ａ）ヒト型γＧＣＳ：γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニンであるγＧＣＳ。
（Ｂ）非ヒト型γＧＣＳ：γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸残基であるγＧＣＳ。 - スクリーニング対象の前記阻害剤は、トリパノゾーマ・ブルース(Trypanosoma brucei)のγＧＣＳの阻害剤であり、前記非ヒト型γＧＣＳは、前記第１３２番目に相当するアミノ酸残基がアスパラギンであるγＧＣＳである請求項１記載の方法。
- スクリーニング対象の前記阻害剤は、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)のγＧＣＳの阻害剤であり、前記非ヒト型γＧＣＳは、前記第１３２番目に相当するアミノ酸残基がグルタミンであるγＧＣＳである請求項１記載の方法。
- 前記薬剤候補化合物として、大腸菌γＧＣＳと下記構造式（１）で表される化合物との共結晶の結晶構造解析データから設計される化合物を使用する請求項１から３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 前記薬剤候補化合物として、下記一般式（２）の化学構造を有する化合物を用いる請求項１から３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 前記結合の強さの評価方法が、スローバインディングキネティクス(slow-binding kinetics)に基づくアッセイ法である請求項１から５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 非ヒト型組換えγＧＣＳであって、γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸残基である非ヒト型組換えγＧＣＳ。
- 請求項７に記載の非ヒト型組換えγＧＣＳであって、下記（i）又は（ii）に記載の非ヒト型組換えγＧＣＳ。
（i） 大腸菌γＧＣＳアミノ酸配列（配列番号１）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
コレラ菌γＧＣＳアミノ酸配列（配列番号２）の第１３１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
緑膿菌γＧＣＳアミノ酸配列（配列番号３）の第１３４番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
サルモネラ菌γＧＣＳアミノ酸配列（配列番号４）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ブフネラγＧＣＳアミノ酸配列（配列番号５）の第１３２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ヒトγＧＣＳアミノ酸配列（配列番号６）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
ラットγＧＣＳアミノ酸配列（配列番号７）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
マウスγＧＣＳアミノ酸配列（配列番号８）の第１９１番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
マイコプラズマγＧＣＳアミノ酸配列（配列番号９）の第１１２番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列、及び
トリパノゾーマ・グルージγＧＣＳアミノ酸配列（配列番号１０）の第１８５番目のアルギニンが、アスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる非ヒト型組換えγＧＣＳ。
（ii） 前記(i)のアミノ酸配列におけるアスパラギン又はグルタミンに置換されたアミノ酸残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する非ヒト型組換えγＧＣＳ。 - ヒト型組換えγＧＣＳであって、γＧＣＳのＬ-システイン結合部位に位置するアミノ酸残基であって配列番号１のアミノ酸配列とアライメントした場合に前記アミノ酸配列の第１３２番目に相当するアミノ酸残基が、アルギニンであるヒト型組換えγＧＣＳ。
- 請求項９に記載のヒト型組換えγＧＣＳであって、下記（iii）又は（iv）に記載のアミノ酸配列からなるヒト型組換えγＧＣＳ。
（iii） トリパノゾーマ・ブルースγＧＣＳ（配列番号１１）の第１８５番目のアスパラギンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列、又は、
熱帯熱マラリア原虫γＧＣＳ（配列番号１２）の第４７３番目のグルタミンが、アルギニンに置換されたアミノ酸配列からなるヒト型組換えγＧＣＳ。
（iv） 前記(iii)のアミノ酸配列におけるアルギニンに置換されたアミノ酸残基以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するヒト型組換えγＧＣＳ。 - 請求項８に記載の非ヒト型組換えγＧＣＳ又は請求項１０に記載のヒト型組換えγＧＣＳをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１２に記載のベクターにより形質転換された生物又はその細胞。
- 請求項１から６のいずれかのスクリーニング方法において薬剤候補化合物の設計に使用される結晶であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるγＧＣＳと下記構造式で表される化合物との共結晶であり、空間群が、Ｐ２1であることを特徴とする結晶。
- 寄生虫感染症の予防・治療薬の製造方法であって、薬剤候補化合物を準備する工程と、前記薬剤候化合物を請求項１から６のいずれかに記載のスクリーニング方法により非ヒト型γＧＣＳを特異的に阻害する化合物を選択する工程と、選択された前記化合物を有効成分として有効量含む寄生虫感染症の予防・治療薬を製造する工程とを含む製造方法。
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