JP2005295869A

JP2005295869A - 核酸分子の切断方法およびその装置

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Publication number: JP2005295869A
Application number: JP2004115685A
Authority: JP
Inventors: Masao Iguchi; 征夫井口; Hachiro Iguchi; 八郎井口
Original assignee: JFE Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 2004-04-09
Filing date: 2004-04-09
Publication date: 2005-10-27

Abstract

【課題】特に遺伝情報を担っているＤＮＡやＲＮＡを人為的に操作するために、核酸分子を物理的に効率よく切断する方法について提案する。
【解決手段】核酸分子を細管の内側に通して切断するに当たり、該細管に、金属製の中空円筒の外周面の少なくとも先端部分および内周面に、電気抵抗が10^５Ω・ｍ以上の絶縁性セラミックスを被覆したものを用いる。
【選択図】図２

Description

本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）に大別される核酸を効果的に切断する方法およびその装置に関するものである。特に、遺伝情報を担っているＤＮＡを人為的に操作するため、その核酸分子を物理的に効率よく切断するための装置に関するものである。

近年、ＤＮＡを主とする遺伝情報に関する分子生物学の進歩は目ざましく、ＤＮＡの組み替え技術を利用して新製品の開発が盛んに行われるようになってきている。ＤＮＡは、図１の模式図（例えば、生命科学のコンセプト「分子生物学」小関治男ほか著、化学同人、ｐ．２８参照）で示すように、太さが約２０Å（図では２．３ｎｍとなっている）で非常に長い（例えば細菌ウイルスの一種であるラムダファージでは約１７μｍの長さをもつ）の鎖状の高分子であるが、物理的に適当なサイズに切断することは簡単ではない。

現在、このようなＤＮＡの切断は、例えば非特許文献１に記載されているように、酵素を用いて行われるのが一般的であるが、その操作は複雑で長時間を要すること、また任意の位置で切断するには適切な酵素を選択しなければならないこと、などの問題がある。
Sambrook,J.,E.F.Fritsch，and T.J.Maniatis.1989.Molecular cloning:a laboratory manual,２nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y

ここで、酵素を使用せずにＤＮＡの切断が可能となった場合には、目的とするＤＮＡの結合あるいは組み替えが容易になるため、新規遺伝子の組み替え体の作製や、遺伝子制御システムの人工合成等が可能となることが期待されているが、未だその期待に十分に答える技術は開発されていない。

そこで、本発明は、特に遺伝情報を担っているＤＮＡやＲＮＡを人為的に操作するために、核酸分子を物理的に効率よく切断する方法について、その装置に併せて提案することを目的とする。

上記の現状に鑑み、発明者らは、ＤＮＡの物理的な切断を可能とする手法があれば、この方面の研究の飛躍的な進展が期待できるため、数多くの試行実験を重ねた。

その結果、ＤＮＡを切断する際には、従来とは全く異なった素材の器具、具体的には絶縁性のセラミックスを被覆した細管（注射針）を採用することによって、ＤＮＡ分子を有効に切断できる方法並びに装置の開発を実現したものである。

すなわち、本発明の要旨構成は次のとおりである。
（１）核酸分子を細管の内側に通して切断するに当たり、該細管に、金属製の中空円筒の外周面の少なくとも先端部分および内周面に、電気抵抗が10^５Ω・ｍ以上の絶縁性セラミックスを被覆したものを用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。

（２）上記（１）において、細管内の核酸分子の通過速度を、0.1〜100mm／min の範囲内の一定速度としたことを特徴とする核酸分子の切断方法。

（３）上記（１）または（２）において、細管内の核酸分子の通過を１回以上としたことを特徴とする核酸分子の切断方法。

（４）核酸分子を細管の内側に通して切断する装置であって、該細管が、金属製の中空円筒の外周面の少なくとも先端部分および内周面に、電気抵抗が10^５Ω・ｍ以上の絶縁性セラミックスを被覆したものであることを特徴とする核酸分子の切断装置。

本発明の装置を用いれば、長い主鎖に配列されたＤＮＡを効果的に切断することが可能であり、遺伝子の分野は勿論、長鎖状高分子（たとえば、糖鎖やポリペプチド鎖など）の物性とＳｈｅａｒｉｎｇｆｏｒｃｅに関する基礎研究などの方面への応用も期待できる。

以下、本発明を具体的に説明する。ここでは、ＤＮＡを対象として説明するが、本発明は、ＲＮＡについてもＤＮＡの場合と同様に適合することは勿論である。
先に、発明者らは、現行の導体金属（ステンレス鋼：電気抵抗10^６〜10^８ Ω・ｍ）の穿刺針とは全く異なる穿刺針を発明し、特開2003−310759号公報にて提案した。すなわち、高プラズマ雰囲気を利用して、高真空中で絶縁性（電気抵抗：10^９ Ω・ｍ以上の絶縁体特性を有する）に優れた薄膜のセラミック被覆穿刺針を開発し、肝生検あるいは腎生検の際には有効に利用可能な、人に優しい医療用セラミック被覆穿刺針を開発した。

次に、発明者らは、ＤＮＡを採取する際に、電気抵抗が無限大である絶縁物のセラミック被覆した細管（中空針）を通過させることにより、ＤＮＡが非常に効率良く切断できることを見出し、特願2004−91193号にて特許出願した。

以上の技術開発を基礎として、さらに、本発明では、ＤＮＡ切断を再現性良く、しかも切断片を連続的に採取可能とする条件を見出すとともに、その実現に寄与する装置を開発するに到った。
まず、この装置の詳細について、図２を参照して説明する。

図２は、本発明のＤＮＡ切断装置を模式的に示した縦型の一例である。なお、本発明の装置は横型にも設置可能である。
すなわち、図２において符号１は、例えば符号２の矢印方向に回転する可変速のステップ回転モーターであり、ここでの回転運動を、コラム３を介して上下の往復動４に変換し、例えばゴム製のピストン５をシリンダ６内で上下動することができる。さらに、シリンダ６の底面には、支持体７を介して細管８の基端を接続し、この細管８の先端はＤＮＡ溶液９中に浸漬する。

以上の構成の装置において、ステップ回転モーター１を駆動して、シリンダ６の底面にあるピストン５を上昇させることによって、細管８の先端からＤＮＡ溶液９を細管８に通してシリンダ６内に導く。この細管８内をＤＮＡ溶液９が通過する際に、ＤＮＡはいわゆるＳｈｅａｒｉｎｇｆｏｒｃｅによって切断される。この細管８内でのＤＮＡの通過を少なくとも一度は行うことによって、ＤＮＡの切断が実現する。

ついで、ピストン５が上死点をこえて下降すると、切断されたＤＮＡを含む溶液９ａは、再び下部のＤＮＡ溶液９の槽に戻される。引き続き、ステップ回転モーター１を駆動してピストン５を上昇させれば、細管８の先端からＤＮＡ溶液９が再び細管８を通ることになり、ＤＮＡが再度切断される。
以上の操作を、１回または複数回繰り返すことによって、ＤＮＡの切断が確実に達成されるのである。

ここで、上記の細管８の外周面の少なくとも先端部分および内周面、すなわちＤＮＡ溶液９と接触する部分には、電気抵抗が10^５Ω・ｍ以上の絶縁性セラミックスを被覆しておくことが肝要である。なぜなら、電気抵抗が10^５ Ω・m 未満のセラミックでは、採取したＤＮＡへのＳｈｅａｒｉｎｇｆｏｒｃｅの影響が小さいからである。なお、セラミック膜の被覆は、必ずしも細管の全面に施す必要はなく、少なくともその使用に際してＤＮＡ溶液と接触する上記領域が被覆されていれば良い。
なお、穿刺針の研究において、実際のラットの肝臓から抽出したサンプルを調整したところ、穿刺針を覆うセラミック膜の抵抗範囲が10^５Ω・ｍ以上ではまわりの細胞に悪影響を与える度合いが小さいことが判明している。

具体的には、図３（ａ）に示すように、ステンレス鋼製の円筒からなる細径の管１０の、外周面の少なくとも先端部分および内周面に、ドライプレーティング法を用いて、薄い絶縁性に優れたセラミック膜１１をプラズマコーティングする。特に、緻密かつ密着性に優れたセラミック膜を均一に形成することが可能である、マグネトロン・スパッタ法を用いて、セラミック膜を被覆することが好ましい。

なお、セラミック膜１１としては、例えば絶縁性に優れた、好ましくは電気抵抗が無限大であるSiNxのほか、Al₂O₃、AlＮ、SiＯ₂およびＢＮ等を用いることができる。

かようなセラミック膜としては、既に発明者らが、特願2004−91193号にて開示した種類のセラミック膜が好適に使用できる。
すなわち、電気抵抗が10⁵ Ω・m 以上の絶縁牲を有するAl、ＢおよびSiの窒化物、炭化物または酸化物のうちから選んだ少なくとも一種からなるセラミック薄膜、あるいはダイヤモンド・ライク・カーボン（ＤＬＣ：Diamond・Like・Carbon）の薄膜等が有利に適合する。

一方、本発明で使用する円筒状の細管は、外周面の少なくとも先端部分および内周面にセラミックスを形成するため、金属材料であれば特に種類は問わないが、好ましくはステンレス鋼である。というのは、ステンレス鋼は、表面が錆びず、かつ精密加工処理が容易であるからであり、とりわけフェライト系ステンレス鋼が有利に適合する。

例えば、細管の基体をステンレス鋼で製造する場合は、ステンレス鋼素材を連続鋳造し、熱間圧延−冷間圧延−光輝焼鈍を行った後、精密加工により外径：0.02〜2.5mm、内径：0.01〜2.0mmおよび長さ：10〜250mm 程度の、目的に応じた種々の注射針形状に加工処理する。なお、この際の処理工程は、従来技術に従って行えば良い。

ついで、得られた円筒状の細管の表面を、超音波洗浄や電解研磨等によって清浄にしたのち、上述したセラミック膜を形成するわけであるが、かようなセラミックスとして、電気抵抗が10⁵ Ω・m 以上の絶縁性セラミックを用いることが重要である。

かかるセラミック膜の被覆厚みについては、0.05〜5.0 μm とすることが好ましい。というのは、セラミック膜厚が0.05μm に満たないと、十分な絶縁性の確保が困難であり、一方セラミック膜厚が5.0 μm を超えると、セラミック膜とマトリックスとの密着性の確保が困難になるだけでなく、コーティングによるコストアップを招くからである。

さらに、上記のようなセラミック膜の被覆方法としては、高イオン化および高速成膜が可能なマグネトロン・スパッタ法の適用が最適であることは上述の通りであるが、その他ＲＦ（Radio Frequency）、中空陰極放電法、あるいはアーク放電法などの公知のＰＶＤコーティング法を使用することもできる。

ちなみに、マグネトロン・スパッタ法による、セラミック膜の好適被覆条件は、次のとおりである。
例えは、SiNxコーティングを行うため、フェロシリコン・ターゲットを使用した場合には、投入パワー：３〜10kW、真空度： 0.8×10⁴ 〜３×10^３ Torr、Arガス流量：50〜500sccm およびN₂ガス流量：50〜500sccm が最適条件である。

以上の装置構成を採用することによって、ＤＮＡ切断の一連の作業を効率良くできることから、この装置の使用により、数多くの種類のＤＮＡの切断が極めて再現性良く実現することが可能になった。なお、細管を異なるサイズのものに交換することによって、さらに多種類のＤＮＡの切断に対応させることが可能である。

また、図２に示した装置では、セラミック膜を被覆した細管を１本使用しているが、さらに大量に切断したＤＮＡを採取するためには、図３（ａ）に示したセラミック膜を被覆した管の複数本、例えば図３（ｂ）に示す３本または図３（ｃ）に示す７本を集合させて用いることが有効である。

さらに、細管内にＤＮＡを通過する際、その通過速度を、0.1〜100mm／min の範囲内の一定速度とすることが好ましい。なぜなら、細管の内径と通過速度は、ＤＮＡ切断に大きく影響することが実験的にわかっており、均一で、かつ再現性が高い切断片ＤＮＡ分子を得るためには重要な条件である。

なお、ＤＮＡの切断に当たって用いるＤＮＡ溶液としては、ＤＮＡの切断を高精度に検出するために、例えば分子数の少ないＤＮＡ溶液（λc1857ファージＤＮＡ：４×10^６分子／ml ）等が好適である。すなわち、濃度が高くなると、ｓｈｅａｒｉｎｇｆｏｒｃｅがかかりにくくなる。

図２に示した本発明の装置を用いて、ＤＮＡの切断を行った。なお、この装置において、細管８の仕様は下記のとおりである。
記
管寸法：外径0.83mm、内径0.58mmおよび長さ40mm
管基材：ステンレス鋼
セラミック膜：SiＮ_ｘセラミック膜
セラミック膜厚：1.0μm厚
セラミック膜電気抵抗：∞

すなわち、分子数の少ないＤＮＡ溶液〔λc1857 ファージＤＮＡ：４×10^６分子／ml 〕を、図２に示した装置のＤＮＡ溶液９として、ピストン５を50mm/minの速度で動かしてＤＮＡ溶液９を吸入させることによって、このＤＮＡ溶液９を細管８内に通過速度50mm／minで通してＤＮＡを切断した。そして、ＤＮＡを切断後の溶液９ａを抽出し、この溶液をラムダファージのパッケージング系に加えて、細菌ウイルス粒子を試験中で作らせたのち、該溶液中の活性ある細菌ウィルスＤＮＡ分子数を軟寒天培地によるプレーティング法にて測定した。
このときの実験で抽出した細菌のウイルスＤＮＡ分子数は55であった。

比較のために、本装置を使用しない場合、すなわち処理前の対照サンプルおよびステンレス鋼注射針を用いた装置にてＤＮＡを切断した場合の、溶液中の活性ある細菌ウィルスＤＮＡ分子数を測定したところ、ステンレス鋼注射針を装着した装置では本装置での場合に比して約15倍も活性ある分子（切れていない分子）が残った。

かように、切断処理後の溶液中の細菌ウィルス数が本発明装置による切断処理で少なくなるのは、より効率よくＤＮＡ切断がなされていることを意味している。なお、実際に処理したＤＮＡ分子をアガロースゲルの電気泳動法で解析し、切断されていることを確認している。通常行われているＤＮＡ切断は分子数の多い溶液を用いているが、本装置は低濃度で効率よい切断が可能であることを特徴とする。ちなみに、分子数が多くなると、粘性が高くなり、それがＳｈｅａｒｉｎｇｆｏｒｃｅをキャンセルするよう働くため、切断効率が悪くなるものと考えられる。

本発明によれば、ＤＮＡの切断操作を従来の酵素を用いる切断方法に比較してはるかに簡便に行えるため、医療、医薬品の研究開発、遺伝子組み換え技術を利用した動植物の品種改良、その他生化学分野などに広く利用することができるものである。

ＤＮＡの構造を示す模式図である。ＤＮＡの切断装置を示す図である。ＤＮＡを切断するために切断量を変化させる方法を示す図である。

符号の説明

１ステップ回転モーター
３コラム
５ピストン
６シリンダ
７支持体
８細管
９ＤＮＡ溶液

Claims

核酸分子を細管の内側に通して切断するに当たり、該細管に、金属製の中空円筒の外周面の少なくとも先端部分および内周面に、電気抵抗が10^５Ω・ｍ以上の絶縁性セラミックスを被覆したものを用いることを特徴とする核酸分子の切断方法。
請求項１において、細管内の核酸分子の通過速度を、0.1〜100mm／min の範囲内の一定速度としたことを特徴とする核酸分子の切断方法。
請求項１または２において、細管内の核酸分子の通過を１回以上としたことを特徴とする核酸分子の切断方法。
核酸分子を細管の内側に通して切断する装置であって、該細管が、金属製の中空円筒の外周面の少なくとも先端部分および内周面に、電気抵抗が10^５Ω・ｍ以上の絶縁性セラミックスを被覆したものであることを特徴とする核酸分子の切断装置。