【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なロイコトリエンB4受容体のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞及び該細胞を使用する薬物のスクリーニング法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジンやトロンボキサン、ロイコトリエンのようなエイコサノイドはアラキドン酸の代謝産物の一つのファミリーであり、生体のホメオスタシスを維持するために様々な生理作用を発揮している（講座プロスタグランジン１〜８、鹿取信、室田誠逸、山本尚三 編 (1988)参照）。それらの生理作用はそれぞれのエイコサノイドに特有の細胞膜受容体を介して発揮されていると考えられている。エイコサノイドの一つロイコトリエンはアラキドン酸の５-リポキシゲナーゼ系の代謝産物の中で低濃度で強い生理活性を示す一連の生理活性脂質である（Samuelsson, B. et al. (1987) Science. 237, 1171-1176）。ロイコトリエン類はロイコトリエンB4(LTB4)と脂肪酸にペプチドが結合したペプチドロイコトリエン（LTC4、LTD4、LTE4）の二つ大別される。LTC4、LTD4、LTE4は気道平滑筋をはじめとする種々の平滑筋の収縮、気道の粘膜分泌亢進、細動静脈の収縮、血清成分の漏出などの作用を持っている（Taylor, G. W. et al. (1986) Trends Pharmacol. Sci. 7, p100-103）。また、LTB4は白血球の強力な活性化因子であり、炎症免疫反応や感染防御などで重要な役割を果たしている（Chen, X. S. et al. (1994) Nature 372. p179-182）。そのほかに、リソソーム酵素の遊離や活性酸素産生、血管内皮細胞への接着なども引き起こす（Palmblad, J. et al. (1994) J. Immunol. 152. p262-269）。LTB4はおもに白血球など骨髄球系の細胞で産生されるが、LTB4前駆体であるLTA4が供給されれば腸管、肺などの実質細胞でも産生される。このような作用から、LTB4は慢性関節リウマチ、浮腫、糸球体腎炎などの腎疾患、気管支炎や気道過敏症などの呼吸器疾患、湿疹や皮膚炎などの皮膚疾患、乾せんやinflammatory bowel diseaseや潰瘍性大腸炎などの腸疾患、脳脊髄炎などの中枢性疾患の発症、進展、増悪に関与していると考えられている（鹿取信、室田誠逸、山本尚三 編 (1988) 講座プロスタグランジン３, 225-227, 484-486, William T. J.(1999) Novel Inhibitors of Leukotrienes, 299-316）。実際、抗炎症薬を目指して多くのLTB4受容体拮抗薬（Negro, J. M. et al. (1997) Allergol. Immunopathol. Madr. 25, 104-112, Kishikawa, K. et al. (1995) Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 23, 279-281）が研究開発されている。
現在までにロイコトリエンの受容体としては、LTB4を特異的に認識する受容体(BLT受容体)がヒト（Yokomizo, T. et al (1997) Nature 387. 620-624）、マウス(Martin, V. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274. 8597-8603)で単離同定されている。また、LTD4を高親和性で認識する受容体（CysLT1）がヒトで単離同定されている（Lynch, K. R. et al. (1999) Nature 399, 789-793）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規なロイコトリエン受容体又は該受容体と同等の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供することである。また、本発明の別の目的は、該遺伝子を用いて発現させたロイコトリエン受容体または該受容体と同様の機能を有するポリペプチドを提供することである。さらに、ロイコトリエン受容体のポリペプチドを使用したロイコトリエン受容体の活性を修飾する物質のスクリーニング法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、既存のロイコトリエン受容体とは異なる、新規なヒトロイコトリエンB4受容体をコードする遺伝子を単離することに成功し、ヒトロイコトリエンB4受容体蛋白質のアミノ酸配列配列、ヒトロイコトリエンB4受容体をコードするDNA配列を決定した。さらに、該ロイコトリエンB4受容体を発現させ、組み換え蛋白質の生産を可能にし、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該宿主細胞を用いたロイコトリエンB4受容体蛋白質、該ロイコトリエンB4受容体に対する抗体の製造法を確立した。これにより、該ロイコトリエンB4受容体および該ロイコトリエンB4受容体の活性を修飾する物質のスクリーニングを可能にし、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明は、
（１）配列番号２記載のアミノ酸配列を有するロイコトリエンB4受容体、あるいは、該受容体の同効物であるロイコトリエンB4受容体、
（２）（１）記載のロイコトリエンB4受容体のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
（３）（２）記載の遺伝子を含むベクター、
（４）（３）記載のベクターを含む宿主細胞、
（５）（４）記載の宿主細胞を用いることを特徴とする、（１）に記載のロイコトリエンB4受容体の製造方法、
（６）（１）記載のロイコトリエンB4受容体に結合する抗体、
（７）（１）記載のロイコトリエンB4受容体と被験化合物とを接触させることを特徴とする、当該ロイコトリエンB4受容体の活性を修飾する物質をスクリーニングする方法、
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「ロイコトリエンB4受容体」は「ロイコトリエンB4受容体蛋白質」を表す。
【０００７】
本発明のロイコトリエンB4受容体は、配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるロイコトリエンB4受容体、あるいは、該ロイコトリエンB4受容体の同効物なら何れでもよい。本発明のロイコトリエンB4受容体の「同効物」とは、配列番号２記載のアミノ酸配列中のいずれかの１乃至複数個の部位において、１乃至複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または挿入されていてもよく、かつ、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するロイコトリエンB4受容体と同種の活性を示すロイコトリエンB4受容体をいう。本発明のロイコトリエンB4受容体の「同効物」として好ましくは配列番号２記載のアミノ酸配列において１乃至１０個、更に好ましくは１乃至７個、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸でアミノ酸の置換、欠失または挿入があるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２記載のアミノ酸配列で示される蛋白質と同種の活性を有するロイコトリエンB4受容体であり、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが最適である。本発明の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するロイコトリエンB4受容体と同種の活性を有することは、実施例３記載の方法で、ロイコトリエンＢ4の共存下においてフォルスコリン(Forskolin)刺激によるｃＡＭＰ発現量が用量依存的に抑制されることにより、確認できる。本発明のロイコトリエンB4受容体として特に好ましくは、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０００８】
また、本発明のロイコトリエンB4受容体をコードする塩基配列を有する遺伝子は、配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるロイコトリエンB4受容体、あるいは、それらの同効物をコードする塩基配列を有する遺伝子なら何れでもよい。好ましくは、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であり、さらに好ましくは、配列番号１記載の塩基配列である。
【０００９】
（製造法）
本発明のロイコトリエンB4受容体をコードする遺伝子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のロイコトリエンB4受容体、本発明のロイコトリエンB4受容体の活性を修飾する物質のスクリーニング方法、ロイコトリエンB4受容体に反応する抗体の製造方法は、以下１）〜４）に記載する。
【００１０】
１）本発明のヒトのロイコトリエンB4受容体遺伝子の製造方法
a)第１製造法
本発明のロイコトリエンB4受容体を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織からｍＲＮＡを抽出する。次いでこのｍＲＮＡを鋳型として該受容体ｍＲＮＡまたは一部のｍＲＮＡ領域をはさんだ２種類のプライマーを作製する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲという）を行うことにより、該ロイコトリエンB4受容体ｃＤＮＡまたはその一部を得ることができる。さらに、得られたヒトのロイコトリエンB4受容体ｃＤＮＡまたはその一部を適当な発現ベクターに組み込むことにより、宿主細胞で発現させ、該受容体の蛋白質を製造することができる。
まず、本発明のロイコトリエンB4受容体の産生能力を有する細胞あるいは組織、例えばヒト脳から該蛋白質をコードするものを包含するｍＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。該蛋白質の産生能力を有する細胞あるいは組織は、該蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザン ブロッティング法、該蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタン ブロッティング法などにより特定することができる。
【００１１】
ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えばｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製することができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出せずとも、市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いても良い。
次に、精製されたｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Saiki, R. K. et al. (1988) Science 239, 487-491；以下、ＰＣＲという）に供し、目的とするロイコトリエンB4受容体ＤＮＡを増幅する。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、上記ＤＮＡを制限酸素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
【００１２】
b）第２製造法
本発明の遺伝子は上述の製造法の他、常法の遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。まず、前述の方法で得たｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としてはＳ１ヌクレアーゼ法（Efstratiadis, A. et al. (1976) Cell, 7, 279-288)、Land法(Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266)、 O. Joon Yoo法(Yoo, O. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053)、Okayama-Berg法(Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol., 2, 161-170)などが挙げられる。
次に、上述の方法で得られる組換えプラスミドを大腸菌、例えばＤＨ５α株に導入して形質転換させて、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性を指標として組換体を選択することができる。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合にはHanahanの方法(Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol., 166, 557-580)、すなわちCaCl2やMgCl2またはRbClを共存させて調製したコンピテント細胞に該組換えDNA体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしてはプラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターも用いることができる。
【００１３】
上記により得られる形質転換株から、目的のロイコトリエンB4受容体のＤＮＡを有する株を選択する方法としては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。
▲１▼合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
本発明のロイコトリエンB4受容体の全部または一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列または考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列のどちらでもよく、また後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる）、これをプローブ（32P又は33Pで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索して、これを選択する。
【００１４】
▲２▼ポリメラーゼ連鎖反応により作製したプローブを用いるスクリーニング法
本発明のロイコトリエンB4受容体の一部に対応するセンスプライマーとアンチセンスプライマーのオリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行い、目的のロイコトリエンB4受容体の全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、該ロイコトリエンB4受容体を産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡの断片を32P又は33Pで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより目的のクローンを選択する。
【００１５】
▲３▼他の動物細胞でのロイコトリエンB4受容体を産生させてスクリーニングする方法
形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミドもしくは動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白を細胞表面に産生させる。本発明のロイコトリエンB4受容体に対する抗体を用いて該受容体を検出することにより、元の形質転換株より目的のロイコトリエンB4受容体をコードするｃＤＮＡを有する株を選択する。
【００１６】
▲４▼本発明のロイコトリエンB4受容体に対する抗体を用いて選択する方法
あらかじめ、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株表面で蛋白を産生させ、本発明のロイコトリエンB4受容体に対する抗体および該抗体に対する２次抗体を用いて、所望のロイコトリエンB4受容体産生株を検出し、目的の株を選択する。
【００１７】
▲５▼本発明のロイコトリエンB4受容体に対するLTB4の結合を指標として選択する方法
あらかじめ、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株表面で蛋白を産生させ、標識したLTB4を用いて所望のロイコトリエンB4受容体産生株を検出し、目的株を選択する。
【００１８】
▲６▼セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーションの系を用いる方法
形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし本発明のロイコトリエンB4受容体産生細胞からのｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを蛋白翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白に翻訳させる。本発明ののペプチドロイコトリエンB4受容体に対する抗体や標識したLTB4を用いて検出して、目的の株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のロイコトリエンB4受容体をコードするＤＮＡを採取する方法は、公知の方法(Maniatis, T. et al.(1982):“ Molecular Cloning-A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY)に従い実施できる。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行ない得る。
【００１９】
ｃ）第３製造法
配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子は、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによっても製造できる。各ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ合成機（例えば、Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman社)、あるいは、394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems社)など）を用いて合成することができる。
【００２０】
ｄ）第４製造法
本発明の遺伝子を利用して遺伝子工学的手法により得られる物質が本発明のロイコトリエンB4受容体の機能を発現するためには、必ずしも配列表 配列番号２に示されるアミノ酸配列のすべてを有するものである必要は無く、例えばその一部の配列であっても、あるいは他のアミノ酸配列が付加されていても、それが配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するロイコトリエンB4受容体と同種の活性を示す限り、それらの蛋白質もまた本発明のロイコトリエンB4受容体に包含される。また、一般に真核生物の遺伝子はインターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorphism)を示すと考えられ（例えば、Nishi, T. et al. (1985) J. Biochem., 97, 153-159を参照）、この多型現象によって１または複数個のアミノ酸が置換される場合もあれば、ヌクレオチド配列の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。したがって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の中の１もしくは複数個の部位において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、または挿入されている蛋白質でも配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるロイコトリエンB4受容体と同種の活性を有していることがありえる。これらの蛋白質は、本発明のロイコトリエンB4受容体の同効物と呼び、本発明に含まれる。
【００２１】
これらの本発明のロイコトリエンB4受容体の同効物をコードする塩基配列を有する遺伝子はすべて本発明に含まれる。このような各種の本発明の遺伝子は、上記本発明のロイコトリエンB4受容体の情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法(Hunkapiller, M. et al.(1984) Nature, 10, 105-111)等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる(Crantham, R. et al.(1981) Nucleic Acids Res.,9 r43-r74)。さらに、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したサイトスペシフィック・ミュータジェネシス(site specific mutagenesis)(Mark, D. F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666)等に従うことができる。
【００２２】
以上、ａ）乃至ｄ）により得られるＤＮＡの配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法(Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980):“ Methods in Enzymology "65, 499-559)やＭ１３を用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法(Messing, J. and Vieira, J (1982) Gene, 19, 269-276)等により行うことができる。
【００２３】
また、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のロイコトリエンB4受容体は、下記の方法によって得ることができる。
２）本発明のロイコトリエンB4受容体の組み換え蛋白質の製造方法
単離された本発明のロイコトリエンB4受容体をコードする遺伝子を含む断片は、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能である。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞(Gluzman, Y. (1981) Cell, 23, 175-182)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220)、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞および同細胞にEpstein Barr VirusのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen社製）等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol., 1, 854-864)、ヒトのelongation factorプロモーターを有するpEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322)、cytomegalovirusプロモーターを有するpCEP4(Invitrogen社製）等を例示できるが、これに限定されない。
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、 pME18S、 (Maruyama, K. and Takebe,Y. (1990) Med. Immunol., 20, 27-32)、pEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322)、 pCDM8(Seed, B. (1987) Nature, 329, 840-842) 等が挙げられる。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法(Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法(Graham, F. L. and van der Ed, A. J. (1973) Virology, 52, 456-457)、 FuGENE6(Boeringer Mannheim社製）を用いた方法、および電気パスル穿孔法(Neumann, E. et al.(1982) EMBO J., 1, 841-845)等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００２５】
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばpRSVneo(Sambrook, J. et al. (1989): “ Molecular Cloning-A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY)やpSV2-neo(Southern, P. J. and Berg,P. (1982) J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341)等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することによりロイコトリエンB4受容体を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、Epstein Barr Virusの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なpCEP4(Invitrogen社）などの発現ベクターを用いて所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００２６】
上記で得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内または細胞表面に本発明のロイコトリエンB4受容体が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であればRPMI-1640培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地に必要に応じ牛胎児血清(FBS)等の血清成分を添加したものを使用できる。また、上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清(FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地にG418を加えたものを使用できる。
【００２７】
上記により、形質転換体の細胞内または細胞表面に生産される本発明のロイコトリエンB4受容体は、該受容体蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、それらより分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば受容体蛋白質を含む膜分画を可溶化した後、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。なお、膜分画は常法に従って得ることができる。例えば本発明のペプチドロイコトリエンB4受容体を表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁後、ホモジナイズし遠心分離することにより得られる。また、できるだけ緩和な可溶化剤（CHAPS、 Triton X-100、ジキトニン等）でロイコトリエンB4受容体を可溶化することにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
【００２８】
本発明のロイコトリエンB4受容体はマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、該ロイコトリエンB4受容体の発現の確認、細胞内局在の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、FLAG epitope、Hexa-Histidine tag、Hemagglutinin tag、myc epitopeなどがある。また、マーカー配列とロイコトリエンB4受容体の間にエンテロキナーゼ、ファクターXa、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とHexa-Histidine tagとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Hayashi, M.K. and Haga, T. (1996) J. Biochem., 120, 1232-1238）
【００２９】
３）本発明のロイコトリエンB4受容体の活性を修飾する物質（化合物、ペプチド及び抗体）のスクリーニング方法
本発明にはロイコトリエンB4受容体の活性を修飾する化合物，ペプチド及び抗体のスクリーニング法が包含される。該スクリーニング法は、前記により構築されたロイコトリエンB4受容体を用いて、該受容体の生理学的な特性に応じた該受容体の修飾の指標を測定する系に被験薬を添加し、該指標を測定する手段を含む。該測定系は、具体的には、以下のスクリーニング方法が挙げられる。また、被験薬はケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物やペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Terrett, N.K., et al. (1995) Tetrahedron, 51, 8135-8137）によって得られた化合物群やファージ・ディスプレイ法（Felici, F., et al. (1991) J. Mol. Biol., 222, 301-310）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などもスクリーニングの対象となる。あるいは本発明のスクリーニング法により選択された化合物またはペプチドを化学的または生物学的に修飾した化合物またはペプチドを用いうる、がそれらに限らない。
【００３０】
ａ）リガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法
本発明のロイコトリエンB4受容体に結合する化合物、ペプチド及び抗体はリガンド結合アッセイ法によりスクリーニングすることができる。該受容体蛋白質を発現させた細胞膜、あるいは該受容体蛋白質精製標品を調製する。緩衝液、イオン、pHのようなアッセイ条件を最適化し、最適化したバッファー中で同受容体蛋白質を発現させた細胞膜、あるいは該受容体蛋白質精製標品を、標識リガンド、例えば[3H]LTB4を被検薬と共に一定時間インキュベーションする。反応後、ガラスフィルター等で濾過し適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標に該受容体蛋白質のアゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体、アンタゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。
【００３１】
ｂ） GTPγS結合法を利用したスクリーニング方法
本発明のロイコトリエンB4受容体の活性を修飾する化合物、ペプチド及び抗体はGTPγS結合法によりスクリーニングすることが可能である（Lazareno, S. and Birdsall, N.J.M. (1993) Br. J. Pharmacol. 109, 1120-1127）。該受容体を発現させた細胞膜を20 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 mM GDP溶液中で、35Sで標識されたGTPγS 400 pMと混合する。被検薬存在下と非存在下でインキュベーション後、ガラスフィルター等で濾過し、結合したGTPγSの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。被検薬存在下における特異的なGTPγS結合の上昇を指標に、該ロイコトリエンB4受容体のアゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。また、被検薬存在下における、LTB4によるGTPγS結合上昇の抑制を指標に該受容体蛋白質のアンタゴニスト活性を有する化合物，ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。
【００３２】
ｃ）細胞内Ca++およびcAMP濃度の変動を利用したスクリーニング方法
本発明のロイコトリエンB4受容体の活性を修飾する化合物、ペプチド及び抗体はロイコトリエンB4受容体を発現させた細胞の細胞内Ca++またはcAMP濃度の変動を利用してスクリーニングすることが可能である。Ca++濃度の測定はfura2、fluo3等を用い、cAMP濃度の測定は市販のcAMP測定キット(Amersham社等)を用いて測定できる。また、Ca++およびcAMP濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を検出することにより間接的にCa++およびcAMP濃度を測定することが可能である。該受容体を発現させた細胞と受容体を発現させていない宿主細胞（コントロール細胞）に化合物、ペプチド、抗体等を一定時間作用させ、Ca++およびcAMP濃度を直接あるいは間接的に測定する。コントロール細胞と比較して、該受容体を発現させた細胞特異的なCa++の上昇および／またはcAMP濃度の上昇または低下を指標にアゴニスト活性を有する化合物，ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。また、被検薬存在下における、LTB4によるCa++の上昇および／またはcAMP濃度の上昇または低下の阻害作用を指標に該ロイコトリエンB4受容体のアンタゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。好ましくは、実施例３記載の条件で、EC50 ＝100μM以下の物質を、更に好ましくは、 EC50 ＝10μM以下の物質をアゴニスト活性を有する物質として、選択することができる。また、実施例３記載のアッセイ条件に被験薬を追加することにより、IC50 ＝10μM以下の物質を、更に好ましくはIC50 ＝１μM以下の物質をアンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
【００３３】
４）本発明のロイコトリエンB4受容体に反応する抗体の作成方法
本発明のロイコトリエンB4受容体に反応する抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、は各種動物に該ロイコトリエンB4受容体や該ロイコトリエンB4受容体の断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のロイコトリエンB4受容体をコードする遺伝子を導入したプラスミドを用いてDNAワクチン法（Raz, E. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523; Donnelly, J. J. et al. (1996) J. Infect. Dis., 173, 314-320）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は該受容体蛋白質またはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁し、腹腔、皮下また静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、ラット、ヤギ、またはニワトリ等の血清または卵から製造される。このように製造された血清または卵からポリクローナル抗体は常法の蛋白質単離精製法により分離精製することができる。そのような方法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、DEAE-セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインAアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。
以上のように分離精製された抗体につき、常法により、ペプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素によって消化を行い、引き続き常法の蛋白質単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、F(ab')2、Fab、Fab'、Fvを得ることができる。
【００３４】
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Nature, 256, 495-497）により当業者が容易に製造することが可能である。
本発明のロイコトリエンB4受容体またはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁した乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮下または静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞とと融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、ヒポキサンチンーグアニンーホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損やチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを持つミエローマ細胞、例えば、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8.U1、を利用する。また、融合剤としてはポリエチレングリーコールを利用する。さらにはハイブリドーマ作製における培地として、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、RPMI-1640などの通常よく用いられているものに適宜10〜30%の牛胎児血清を加えて用いる。融合株はHAT選択法により選択する。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ELISA法、免疫組織染色法などの周知の方法または前記のスクリーニング法により行い、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択する。また、限界希釈法によって、サブクローニングを繰り返すことによりハイブリドーマの単クローン性を保証する。このようにして得られるハイブリドーマは培地中で2〜４日間、あるいはプリスタンで前処理したBALB/c系マウスの腹腔内で10〜20日培養することで精製可能な量の抗体が産生される。
【００３５】
このように製造されたモノクローナル抗体は培養上清あるいは腹水から常法の蛋白質単離精製法により分離精製することができる。そのような方法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、DEAE-セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインAアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。また、モノクローナル抗体またはその一部分を含む抗体断片は該抗体をコードする遺伝子の全部または一部を発現ベクターに組み込み、大腸菌、酵母、または動物細胞に導入して生産させることもできる。以上のように分離精製された抗体につき、常法により、ペプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素によって消化を行い、引き続き常法の蛋白質単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、F(ab')2、Fab、Fab'、Fvを得ることができる。
【００３６】
さらには、本発明のロイコトリエンB4受容体に反応する抗体を、クラクソンらやゼベデらの方法（Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352, 624-628; Zebedee, S. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179）によりsingle chain FvやFabとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Lonberg, N. et al. (1994) Nature, 368, 856-859）に免疫することでヒト抗体を得ることも可能である。
【００３７】
本発明には、該ロイコトリエンB4受容体または前記スクリーニング法により選択された該受容体の活性を有意に修飾する化合物、ペプチド及び抗体を有効成分とする医薬が包含される。
本発明のロイコトリエンB4受容体の活性を有意に修飾する化合物、ペプチド、抗体または抗体断片を有効成分とする製剤は、該有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製されうる。
【００３８】
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液剤などによる経口投与、あるいは静注、筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、経粘膜投与剤などによる非経口投与が挙げられる。特に胃で消化されるペプチドにあっては静注等の非経口投与が望まれる。
本発明による経口投与のための固体組成物は、一つ又はそれ以上の活性物質が少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、溶解乃至溶解補助剤などを含有していてもよい。錠剤や丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆していてもよい。
【００３９】
経口のための液体組成物は、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールを含む。該組成物は不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を含む。水溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として例えば注射用蒸留水、生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等を含む。該組成物はさらに湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解乃至溶解補助剤、防腐剤などを含んでいてもよい。組成物は例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、または照射によって無菌化される。また、無菌の固体組成物を製造し、使用に際し無菌水その他の無菌用注射用媒体に溶解し使用することもできる。
投与量は前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して適宜決定される。
【００４０】
本発明はまた、診断薬としてのロイコトリエンB4受容体をコードするＤＮＡの使用法が包含される。機能障害と関連したロイコトリエンB4受容体遺伝子の変異型の検出は、ロイコトリエンB4受容体の過少発現、過剰発現または変化した発現により生ずる疾患またはその罹病性の診断に利用される。診断用のＤＮＡは、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ることができる。欠失および挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識ロイコトリエンB4受容体ヌクレオチドとハイブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いるまたは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検出できる（Myers, R. M. et al. (1985) Science. 230, 1242-1246）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認できる（Cotton et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401）。また、ロイコトリエンB4受容体のヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。このアレイ技法は公知で、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を解析するために用いられている(Chee, M. et al. (1996) Science, .274, 610-613）。さらに、被験者から得られたサンプルからのロイコトリエンB4受容体のレベルの異常な低下または増加を測定する方法により、ロイコトリエンB4受容体の過少発現、過剰発現または変化した発現により生ずる疾患またはその罹病性の診断に利用される。発現の低下または増加は、当業者で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーション法によりＲＮＡレベルで測定することができる。また、被験者から得られたサンプル中のロイコトリエンB4受容体のような蛋白質のレベルの低下または増加は当業者で公知のアッセイ法により測定できる。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。
【００４１】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳述するが，本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Maniatis, T. at al. (1982) : "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）に従って実施可能である。
【００４２】
（実施例１）新規受容体JULF2をコードする遺伝子の単離
本発明の新規受容体(以下JULF2とする)をコードする全長cDNAは、ヒトゲノムDNA（Clontech社製）をテンプレート(template)としてPCRにより取得した。配列番号3で示されるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー（forward primer）として、配列番号4で示されるオリゴヌクレオチドをリバースプライマー(reverse primer)として用いた（それぞれの5'末端にはXbaI siteが付加してある）。PCRはPfu DNA polymerase（Stratagene社製）を用い、5% DMSO存在下で98 ℃ (20秒)／58 ℃（30秒）／74 ℃（3分）のサイクルを34回繰り返した。その結果、約1.0 kbpのDNA断片が増幅された。この断片をXbaIで消化した後、pEF-BOS plasmid（Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりABI377 DNA Sequencer（Applied Biosystems社製）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号1に示す。
配列番号1で示される塩基配列は1077 baseのORFを持っている。ORFから予測されるアミノ酸配列（358アミノ酸）を配列番号2に示す。予想アミノ酸配列は、G蛋白共役型受容体の特徴である7個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を有していることから、本JULF2遺伝子がG蛋白共役型受容体をコードすることが判った。
【００４３】
（実施例２）組織におけるヒト新規JULF2遺伝子の発現分布
ノーザン ブロット ハイブリダイゼーション法によりJULF2遺伝子の発現分布を解析した。ヒトJULF2のプローブにはcDNA断片（配列番号：１の第22番目から第615番目）を用いた。ヒトの各臓器由来のpoly A+ RNA（2 μg）をブロットしたメンブレン（Clontech社製）とプローブのハイブリダイゼーションは50% ホルムアミド（formamide）、5ｘ SSPE、10 x Denhardt's溶液、2% SDS、100 μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃（18時間）で行った。メンブレンは、最終的に0.2 x SSC、0.1% SDSを含む溶液で２回（65℃、30分）洗浄した。
ヒトの各臓器（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球、胃、甲状腺、脊髄、リンパ節、気管、副腎、骨髄）についてNorthern解析を行ったところ、図1、図2および図3に示すように約2.5 kbのmRNAが脾臓、末梢血白血球、副腎、骨髄、気管、甲状腺、卵巣、リンパ節で強く検出され、膵臓、心臓、脊髄でも若干シグナルが検出された。また、末梢血白血球では3.5 kbと5 kbと9.5 kbのmRNAが発現しており、特に5 kbのmRNAは脾臓、骨髄、副腎で強く検出された。さらに、6.5 kbのmRNAは気管にのみ特異的に検出された。本発明のＧ蛋白質共役型レセプターヒトJULF2遺伝子は少なくとも5種類大きさのmRNAがヒト組織の広範に発現していることがわかった。以上のことから、既存のBLT受容体が末梢血白血球にのみ発現しているのに対し、本発明のJULF2は脾臓、末梢血白血球、骨髄をはじめ、広範に遺伝子発現が確認されたことから、LTB4に起因する広範な生理作用に重要な役割を担っている可能性が示唆された。
【００４４】
（実施例３）CHO細胞によるJULF2の発現とLTB4によるcAMP産生阻害実験
ヒトJULF2を発現させるための発現ベクターとしてpEF-BOSを用いた。構築したプラスミドをpEF-BOS-Jul22とした。
10cmシャーレにCHO-dhfr(-)株を1x106細胞でαMEM（核酸存在）培地を用いて播種し1日培養後、8μgのpEF-BOS-Jul22およびpEF-BOS（空ベクター）をFuGENE6（Boeringer Mannheim社製）を用いて遺伝子導入した。24時間後、遺伝子導入した細胞を回収し、αMEM（核酸非存在）培地／100 nM Methotrexate（和光純薬社製）に懸濁後、段階希釈して10cmシャーレに播き直した。2週間後に出現したコロニーを個別に取得し、JULF2発現細胞とした。
【００４５】
JULF2発現CHO細胞と空ベクター導入CHO細胞を24ウェルプレートに1x105細胞で播種した。1日培養後、αMEM（核酸非存在）培地／1 mM 3-isobutyl-1-methlxanthine (Sigma社製)／0.1% BSAで10分間処理した後、1μMフォルスコリン (和光純薬社製)／LTB4 0〜1 μMを滴下した。37 ℃で30分後に培養上清を除去し、cAMP EIAシステム（BIOTRAK; アマシャム社製）細胞溶解液を用いて細胞を溶解した。
各条件における細胞のcAMP産生量の測定はcAMP EIAシステムを用いて行い、添付プロトコールに従って実施した。1 μM フォルスコリン単独刺激でのcAMP産生量を100%とし、LTB4共存下でのcAMP量の用量依存曲線を作製した（図4）。用量依存曲線から、JULF2に対するLTB4の応答性は EC50 = 10 nM以下であった。一方、空ベクター導入CHO細胞ではLTB4添加によるcAMP産生量に変化は見られなかった。さらに、JULF2発現CHO細胞のフォルスコリン刺激によるcAMP産生量がLTB4によって抑制されたことから、JULF2が細胞内三量体G蛋白のうちGαiと共役していることが示唆された。
【００４６】
以上のように、本発明のロイコトリエンB4受容体は、これまでその存在が示唆されながら実体が不明であったLTB4に親和性を持つ新たな受容体であり、本ロイコトリエンB4受容体で形質転換した細胞を用いることで初めて結合実験および拮抗薬のスクリーニングが可能となった。
【００４７】
【発明の効果】
本発明は新規なヒトのロイコトリエンB4受容体を提供することにある。本発明の受容体はヒトのロイコトリエンB4に起因する疾患、例えば炎症性疾患（気管支炎や皮膚炎、乾せん、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、浮腫）の予防及び／または治療剤としての該受容体の活性を修飾する物質の探索及び評価に有用であり、該受容体の関与する疾患に対する治療薬を提供することができる。また、本発明のロイコトリエンB4受容体をコードする遺伝子はロイコトリエンB4受容体の製造に利用されるのみならず、ロイコトリエンB4受容体の変異や異常な発現変動に起因する疾患の診断に有用である。該受容体のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は該受容体作動薬，診断薬又はポリペプチドの分離精製の手段等に有用である。
【００４８】
【図面の簡単な説明】
【図１】ノーザン解析によるロイコトリエンB4受容体の組織分布（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）の結果を示す。
【図２】ノーザン解析によるロイコトリエンB4受容体の組織分布（脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球）の結果を示す。
【図３】ノーザン解析によるロイコトリエンB4受容体の組織分布（胃、甲状腺、脊髄、リンパ節、気管、副腎、骨髄）の結果を示す。
【図４】ロイコトリエンB4受容体に対するLTB4のcAMP発現抑制作用の結果を示す。
【００４９】
【配列表】
[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention provides a novel leukotriene B Four The present invention relates to a receptor polypeptide, a gene encoding the polypeptide, a vector containing the gene, a transformed cell containing the vector, and a drug screening method using the cell.
[0002]
[Prior art]
Eicosanoids such as prostaglandins, thromboxanes, and leukotrienes are a family of metabolites of arachidonic acid that exert various physiological actions to maintain homeostasis in the body (course prostaglandins 1-8). , Shin Katori, Seiji Murota, and Shozo Yamamoto (1988)). These physiological actions are thought to be exerted via cell membrane receptors peculiar to each eicosanoid. One of the eicosanoids, leukotrienes, is a series of bioactive lipids that exhibit strong bioactivity at low concentrations among the metabolites of the arachidonic acid 5-lipoxygenase system (Samuelsson, B. et al. (1987) Science. 237, 1171. -1176). Leukotrienes are leukotriene B Four (LTB Four ) And fatty acid peptide leukotriene (LTC) Four , LTD Four , LTE Four ). LTC Four , LTD Four , LTE Four Has effects such as contraction of various smooth muscles including airway smooth muscle, increased mucosal secretion of airways, contraction of fibrillation veins, leakage of serum components (Taylor, GW et al. (1986) Trends Pharmacol Sci. 7, p100-103). LTB Four Is a powerful activator of leukocytes and plays an important role in inflammatory immune responses and infection protection (Chen, XS et al. (1994) Nature 372. p179-182). In addition, it causes release of lysosomal enzymes, production of active oxygen, adhesion to vascular endothelial cells, etc. (Palmblad, J. et al. (1994) J. Immunol. 152. p262-269). LTB Four It is mainly produced by myeloid cells such as leukocytes, but LTB Four LTA as a precursor Four Is also produced in parenchymal cells such as the intestine and lungs. Because of this action, LTB Four Are chronic diseases such as rheumatoid arthritis, edema, glomerulonephritis, respiratory diseases such as bronchitis and airway hypersensitivity, skin diseases such as eczema and dermatitis, bowel diseases such as psoriasis, inflammatory bowel disease and ulcerative colitis It is thought to be involved in the onset, progress and exacerbation of central diseases such as encephalomyelitis (Shin Katori, Seiya Murota, Shozo Yamamoto (1988) Lecture Prostaglandin 3, 225-227, 484 -486, William TJ (1999) Novel Inhibitors of Leukotrienes, 299-316). In fact, many LTBs aiming at anti-inflammatory drugs Four Receptor antagonist (Negro, JM et al. (1997) Allergol. Immunopathol. Madr. 25, 104-112, Kishikawa, K. et al. (1995) Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 23, 279-281) Has been researched and developed.
To date, the receptor for leukotrienes is LTB. Four Receptors (BLT receptors) that specifically recognize humans are human (Yokomizo, T. et al (1997) Nature 387. 620-624), mice (Martin, V. et al. (1999) J. Biol. Chem) 274. 8597-8603). Also LTD Four Has been isolated and identified in humans (Lynch, KR et al. (1999) Nature 399, 789-793).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a gene encoding a novel leukotriene receptor or a polypeptide having a function equivalent to that of the receptor. Another object of the present invention is to provide a leukotriene receptor expressed using the gene or a polypeptide having the same function as the receptor. It is another object of the present invention to provide a screening method for a substance that modifies the activity of a leukotriene receptor using a leukotriene receptor polypeptide.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found a novel human leukotriene B that is different from the existing leukotriene receptor. Four Successful isolation of the receptor-encoding gene, human leukotriene B Four Receptor protein amino acid sequence, human leukotriene B Four The DNA sequence encoding the receptor was determined. Further, the leukotriene B Four Expression of receptor and production of recombinant protein, vector containing the gene, host cell containing the vector, leukotriene B using the host cell Four Receptor protein, the leukotriene B Four A method for producing antibodies against the receptor was established. As a result, the leukotriene B Four Receptor and the leukotriene B Four The present invention was completed by enabling screening for substances that modify the activity of receptors.
[0005]
That is, the present invention
(1) Leukotriene B having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Four Receptor, or leukotriene B, which is an equivalent of the receptor Four Receptors,
(2) Leukotriene B according to (1) Four A gene encoding the amino acid sequence of the receptor,
(3) a vector comprising the gene according to (2),
(4) a host cell comprising the vector according to (3),
(5) The leukotriene B according to (1), wherein the host cell according to (4) is used. Four A method for producing a receptor;
(6) Leukotriene B according to (1) Four An antibody that binds to the receptor,
(7) Leukotriene B according to (1) Four The leukotriene B, which comprises contacting a receptor and a test compound Four A method of screening for a substance that modifies the activity of a receptor;
About.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, terms used in the present invention will be described.
As used herein, “leukotriene B Four "Receptor" is "Leukotriene B" Four Receptor protein ".
[0007]
Leukotriene B of the present invention Four The receptor is leukotriene B represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Four Receptor or the leukotriene B Four Any synergistic substance of the receptor may be used. Leukotriene B of the present invention Four The “same effect” of the receptor is a substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acid residues at any one or more sites in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. And leukotriene B having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Four Leukotriene B showing the same activity as the receptor Four Refers to the receptor. Leukotriene B of the present invention Four As a “same effect” of the receptor, amino acid substitution, deletion or insertion with 1 to 10, more preferably 1 to 7, particularly preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 Leukotriene B having a certain amino acid sequence and having the same activity as the protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Four A polypeptide that is a receptor and has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is optimal. Leukotriene B having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 of the present invention Four It has the same kind of activity as the receptor by the method described in Example 3, leukotriene B Four This can be confirmed by suppressing the amount of cAMP expression by stimulation with Forskolin in a dose-dependent manner. Leukotriene B of the present invention Four Particularly preferred as a receptor is a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
[0008]
The leukotriene B of the present invention Four The gene having the base sequence encoding the receptor is leukotriene B represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Four Any gene may be used as long as it has a base sequence that encodes a receptor or an equivalent thereof. A gene having a base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is preferable, and a base sequence described in SEQ ID NO: 1 is more preferable.
[0009]
(Production method)
Leukotriene B of the present invention Four Gene encoding receptor, vector of the present invention, host cell of the present invention, leukotriene B of the present invention Four Receptor, leukotriene B of the present invention Four Leukotriene B, screening method for substances that modify receptor activity Four A method for producing an antibody that reacts with a receptor is described in 1) to 4) below.
[0010]
1) Human leukotriene B of the present invention Four Method for producing receptor gene
a) First production method
Leukotriene B of the present invention Four MRNA is extracted from human cells or tissues having the ability to produce receptors. Next, using this mRNA as a template, two types of primers sandwiching the receptor mRNA or a part of the mRNA region are prepared. By performing reverse transcriptase-polymerase chain reaction (hereinafter referred to as RT-PCR), the leukotriene B Four Receptor cDNA or a part thereof can be obtained. In addition, the resulting human leukotriene B Four By incorporating the receptor cDNA or a part thereof into an appropriate expression vector, the receptor cDNA can be expressed in a host cell to produce the receptor protein.
First, leukotriene B of the present invention Four MRNA containing the protein is extracted from a cell or tissue capable of producing a receptor, such as human brain, by a known method. Examples of the extraction method include a guanidine / thiocyanate / hot / phenol method, a guanidine / thiocyanate-guanidine / hydrochloric acid method, and a guanidine / thiocyanate / cesium chloride method is preferable. Cells or tissues having the ability to produce the protein are identified by Northern blotting using a gene having a nucleotide sequence encoding the protein or a part thereof, or Western blotting using an antibody specific to the protein. be able to.
[0011]
The mRNA may be purified by a conventional method. For example, the mRNA can be purified by adsorbing and eluting on an oligo (dT) cellulose column. Furthermore, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. Moreover, you may use the extracted mRNA marketed, without extracting mRNA.
Next, the purified mRNA is subjected to reverse transcriptase reaction in the presence of a random primer or oligo dT primer to synthesize first strand cDNA. This synthesis can be performed by a conventional method. Using the obtained first strand cDNA, polymerase chain reaction (Saiki, RK et al. (1988) Science 239, 487-491; hereinafter referred to as PCR) using two types of primers sandwiching a partial region of the target gene. The target leukotriene B Four Amplify the receptor DNA. The obtained DNA is fractionated by agarose gel electrophoresis or the like. If desired, the desired DNA fragment can be obtained by cleaving the DNA with restriction oxygen or the like and connecting the DNAs.
[0012]
b) Second production method
In addition to the production method described above, the gene of the present invention can also be produced using conventional genetic engineering techniques. First, single-stranded cDNA is synthesized using reverse transcriptase with the mRNA obtained by the above-described method as a template, and then double-stranded cDNA is synthesized from this single-stranded cDNA. The methods include S1 nuclease method (Efstratiadis, A. et al. (1976) Cell, 7, 279-288) and Land method (Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266. ), O. Joon Yoo method (Yoo, OJ et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053), Okayama-Berg method (Okayama, H. and Berg, P. (1982 ) Mol. Cell. Biol., 2, 161-170).
Next, the recombinant plasmid obtained by the above-described method can be introduced into E. coli, for example, DH5α strain, and transformed, and a recombinant can be selected using tetracycline resistance or ampicillin resistance as an index. For example, when the host cell is Escherichia coli, transformation of the host cell can be performed by the method of Hanahan (Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol., 166, 557-580), that is, CaCl. 2 Or MgCl 2 Alternatively, the recombinant DNA can be added to competent cells prepared in the presence of RbCl. In addition to the plasmid, a lambda-based phage vector can also be used as the vector.
[0013]
From the transformant obtained as described above, the desired leukotriene B Four As a method for selecting a strain having a receptor DNA, for example, the following various methods can be employed.
(1) Screening method using synthetic oligonucleotide probe
Leukotriene B of the present invention Four Synthesize oligonucleotides corresponding to all or part of the receptor (in this case either a nucleotide sequence derived using codon usage or multiple nucleotide sequences combined with possible nucleotide sequences, in the latter case , Inosin can be included to reduce the type), and probe this ( 32 P or 33 Label with P) and hybridize with a nitrocellulose filter in which the DNA of the transformant is denatured and immobilized, and search for and select the resulting positive strain.
[0014]
(2) Screening method using probes prepared by polymerase chain reaction
Leukotriene B of the present invention Four Sense oligonucleotide and antisense primer oligonucleotide corresponding to a part of the receptor are synthesized, PCR is performed by combining these oligonucleotides, and the desired leukotriene B Four A DNA fragment encoding all or part of the receptor is amplified. The template DNA used here is the leukotriene B Four CDNA or genomic DNA synthesized by reverse transcription from the mRNA of a receptor-producing cell can be used. The DNA fragment thus prepared is 32 P or 33 A target clone is selected by labeling with P and performing colony hybridization or plaque hybridization using this as a probe.
[0015]
(3) Leukotriene B in other animal cells Four Method for producing and screening receptor
The transformed strain is cultured, the gene is amplified, and the gene is transfected into animal cells (in this case, either a plasmid that is self-replicating and contains a transcription promoter region or a plasmid that can be integrated into the chromosome of an animal cell). Good), gene-encoded protein is produced on the cell surface. Leukotriene B of the present invention Four By detecting the receptor using an antibody against the receptor, the target leukotriene B is detected from the original transformed strain. Four A strain having a cDNA encoding the receptor is selected.
[0016]
(4) Leukotriene B of the present invention Four Method of selecting using an antibody against the receptor
In advance, the cDNA is incorporated into an expression vector, the protein is produced on the surface of the transformant, and the leukotriene B of the present invention is produced. Four Using an antibody against the receptor and a secondary antibody against the antibody, the desired leukotriene B Four A receptor producing strain is detected, and a target strain is selected.
[0017]
(5) Leukotriene B of the present invention Four LTB for receptors Four To select a combination of two as an indicator
Incorporating cDNA into the expression vector, producing protein on the surface of the transformant, and labeling the LTB Four Desired leukotriene B Four A receptor producing strain is detected, and a target strain is selected.
[0018]
(6) Method using a selective hybridization translation system
The cDNA obtained from the transformant is blotted onto a nitrocellulose filter or the like, and leukotriene B of the present invention Four After hybridizing the mRNA from the receptor-producing cells, the mRNA bound to the cDNA is dissociated and recovered. The recovered mRNA is translated into protein by a protein translation system, for example, injection into Xenopus oocytes, or a cell-free system such as rabbit reticulocyte lysate or wheat germ. Peptide leukotriene B of the present invention Four Receptor antibodies and labeled LTB Four And select the target strain.
From the obtained transformant of interest, leukotriene B of the present invention Four The method for collecting DNA encoding the receptor can be performed according to a known method (Maniatis, T. et al. (1982): “Molecular Cloning-A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, NY). For example, it can be carried out by separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and excising a cDNA region from the plasmid DNA.
[0019]
c) Third production method
A gene having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can also be produced by binding a DNA fragment produced by a chemical synthesis method. Each DNA fragment can be synthesized using a DNA synthesizer (for example, Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman) or 394 DNA / RNA Synthesizer (Applied Biosystems)).
[0020]
d) Fourth production method
A substance obtained by genetic engineering techniques using the gene of the present invention is leukotriene B of the present invention. Four In order to express the function of the receptor, it is not always necessary to have all of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. For example, even a partial sequence or other amino acid sequences Leukotriene B having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 even if added Four As long as they show the same type of activity as the receptor, these proteins are also leukotriene B of the present invention. Four Included in the receptor. In general, eukaryotic genes are known to exhibit polymorphism as known by interferon genes and the like (for example, Nishi, T. et al. (1985) J. Biochem., 97 , 153-159), one or more amino acids may be replaced by this polymorphism, or the amino acid may not change at all even if the nucleotide sequence changes. Therefore, a protein in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, or inserted at one or more sites in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Leukotriene B indicated Four It may have the same type of activity as the receptor. These proteins are leukotriene B of the present invention. Four It is called a receptor synergist and is included in the present invention.
[0021]
These leukotriene B of the present invention Four Any gene having a base sequence encoding the equivalent of a receptor is included in the present invention. Such various genes of the present invention are the above-described leukotriene B of the present invention. Four Based on receptor information, it can also be produced by chemical synthesis of nucleic acids according to conventional methods such as the phosphite triester method (Hunkapiller, M. et al. (1984) Nature, 10, 105-111). . The codons for the desired amino acids are known per se, and the selection thereof may be arbitrary.For example, the codon usage can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host to be used (Crantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res., 9 r43-r74). Furthermore, partial modification of the codons of these base sequences is carried out in accordance with a conventional method using site specific mutagenesis (Mark, DF et al. 1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666).
[0022]
As described above, DNA sequencing obtained by a) to d) can be performed by, for example, the chemical modification method of Maxam-Gilbert (Maxam, AM and Gilbert, W. (1980): “Methods in Enzymology” 65, 499-559) or M13. Can be carried out by the dideoxynucleotide chain termination method (Messing, J. and Vieira, J (1982) Gene, 19, 269-276).
[0023]
Further, the vector of the present invention, the host cell of the present invention, the leukotriene B of the present invention Four The receptor can be obtained by the following method.
2) Leukotriene B of the present invention Four Method for producing recombinant protein of receptor
Isolated leukotriene B of the present invention Four Fragments containing the gene encoding the receptor can be transformed into eukaryotic and prokaryotic host cells by re-integration into the appropriate vector DNA. Furthermore, genes can be expressed in the respective host cells by introducing appropriate promoters and sequences involved in expression into these vectors.
For example, eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeasts. Examples of vertebrate cells include COS cells (Gluzman, Y. (1981) Cell, 23, 175-182) or dihydrofolate reductase deficient strain of Chinese hamster ovary cells (CHO) (Urlaub, G. and Chasin, LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220), human fetus Kidney-derived HEK293 cells and 293-EBNA cells (manufactured by Invitrogen) in which the EBNA-1 gene of Epstein Barr Virus is introduced into the cells are often used, but are not limited thereto.
[0024]
As an expression vector for vertebrate cells, a vector having a promoter usually located upstream of the gene to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like can be used. You may have. Examples of the expression vector include pSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol., 1, 854-864) having the early promoter of SV40, pEF-BOS having the human elongation factor promoter. (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322), pCEP4 (manufactured by Invitrogen) having a cytomegalovirus promoter can be exemplified, but not limited thereto.
For example, when a COS cell is used as the host cell, the expression vector has an SV40 origin of replication, can autonomously grow in the COS cell, and further comprises a transcription promoter, a transcription termination signal and an RNA splice site. For example, pME18S, (Maruyama, K. and Takebe, Y. (1990) Med.Immunol., 20, 27-32), pEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322), pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature, 329, 840-842). The expression vector is prepared by DEAE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308), calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL and van der Ed, AJ ( 1973) Virology, 52, 456-457), method using FuGENE6 (Boeringer Mannheim), electropulse drilling (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J., 1, 841-845), etc. Can be incorporated into COS cells, and thus desired transformed cells can be obtained.
[0025]
When a CHO cell is used as a host cell, a vector capable of expressing a neo gene functioning as a G418 resistance marker together with an expression vector, such as pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): “Molecular Cloning-A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and pSV2-neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341) etc. Leukotriene B by selecting resistant colonies Four A transformed cell that stably produces the receptor can be obtained. In addition, when 293-EBNA cells are used as host cells, the desired trait can be obtained using an expression vector such as pCEP4 (Invitrogen) which has an Epstein Barr Virus replication origin and is capable of self-replication in 293-EBNA cells. Converted cells can be obtained.
[0026]
The desired transformant obtained above can be cultured according to a conventional method, and the leukotriene B of the present invention can be cultured in the cell or on the cell surface by the culture. Four A receptor is produced. As the medium used for the culture, various media commonly used according to the adopted host cells can be appropriately selected. For example, the COS cells include RPMI-1640 medium and Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM). What added serum components, such as fetal bovine serum (FBS), to a culture medium as needed can be used. In addition, as long as the 293-EBNA cells are used, those obtained by adding G418 to a medium such as Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM) supplemented with serum components such as fetal bovine serum (FBS) can be used.
[0027]
As described above, leukotriene B of the present invention produced in the cell or on the cell surface of the transformant. Four Receptors can be separated and purified from them by various known separation methods utilizing the physical properties and chemical properties of the receptor proteins. Specifically, for example, after solubilizing a membrane fraction containing a receptor protein, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion Examples include various liquid chromatography such as exchanger chromatography, affinity chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC), dialysis methods, and combinations thereof. The membrane fraction can be obtained according to a conventional method. For example, the peptide leukotriene B of the present invention Four It is obtained by culturing cells expressing the receptor on the surface, suspending them in a buffer, homogenizing and centrifuging them. In addition, leukotriene B with a solubilizing agent that is as mild as possible (CHAPS, Triton X-100, dichitonin, etc.) Four By solubilizing the receptor, the properties of the receptor can be maintained after solubilization.
[0028]
Leukotriene B of the present invention Four The receptor is expressed in a fusion with the marker sequence in-frame, so that the leukotriene B Four Confirmation of receptor expression, confirmation of intracellular localization, purification, and the like become possible. Examples of the marker sequence include FLAG epitope, Hexa-Histidine tag, Hemagglutinin tag, and myc epitope. In addition, the marker sequence and leukotriene B Four By inserting a specific sequence recognized by a protease such as enterokinase, factor Xa or thrombin between the receptors, the marker sequence portion can be cleaved and removed by these proteases. For example, there is a report of linking a muscarinic acetylcholine receptor and a Hexa-Histidine tag with a thrombin recognition sequence (Hayashi, MK and Haga, T. (1996) J. Biochem., 120, 1232-1238)
[0029]
3) Leukotriene B of the present invention Four Screening method for substances (compounds, peptides and antibodies) that modify receptor activity
In the present invention, leukotriene B Four Methods for screening compounds, peptides and antibodies that modify receptor activity are included. The screening method comprises leukotriene B constructed as described above. Four A means for measuring the index by adding a test drug to a system that uses the receptor to measure an index of modification of the receptor according to the physiological characteristics of the receptor. Specific examples of the measurement system include the following screening methods. In addition, the test drugs are various known compounds and peptides registered in the chemical file, compound groups and phages obtained by combinatorial chemistry technology (Terrett, NK, et al. (1995) Tetrahedron, 51, 8135-8137). A random peptide group created by applying a display method (Felici, F., et al. (1991) J. Mol. Biol., 222, 301-310) or the like can be used. In addition, culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants and marine organisms, animal tissue extracts and the like are also subject to screening. Alternatively, a compound or peptide obtained by chemically or biologically modifying a compound or peptide selected by the screening method of the present invention can be used, but is not limited thereto.
[0030]
a) Screening method using ligand binding assay
Leukotriene B of the present invention Four Compounds, peptides and antibodies that bind to the receptor can be screened by ligand binding assays. A cell membrane expressing the receptor protein or a purified preparation of the receptor protein is prepared. A cell membrane expressing the receptor protein in an optimized buffer, or a purified sample of the receptor protein can be labeled with a labeled ligand such as [ Three H] LTB Four Is incubated with the test drug for a certain period of time. After the reaction, the mixture is filtered with a glass filter or the like and washed with an appropriate amount of buffer, and then the radioactivity remaining on the filter is measured with a liquid scintillation counter or the like. Compounds, peptides and antibodies having agonist activity of the receptor protein, compounds having antagonist activity, peptides and antibodies can be screened using the obtained binding inhibition of radioactive ligand as an index.
[0031]
b) Screening method using GTPγS binding method
Leukotriene B of the present invention Four Compounds, peptides and antibodies that modify the activity of the receptor can be screened by the GTPγS binding method (Lazareno, S. and Birdsall, NJM (1993) Br. J. Pharmacol. 109, 1120-1127). Cell membranes expressing the receptor were treated with 20 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl. 2 , In 50 mM GDP solution 35 Mix with 400 pM GTPγS labeled with S. After incubation in the presence and absence of the test drug, the mixture is filtered with a glass filter or the like, and the radioactivity of the bound GTPγS is measured with a liquid scintillation counter or the like. Using the increase in specific GTPγS binding in the presence of the test drug as an indicator, the leukotriene B Four Compounds, peptides and antibodies having receptor agonist activity can be screened. In addition, LTB in the presence of the test drug Four It is possible to screen for compounds, peptides and antibodies having antagonist activity of the receptor protein, using as an index the suppression of the increase in GTPγS binding by.
[0032]
c) Intracellular Ca ++ And screening method using fluctuation of cAMP concentration
Leukotriene B of the present invention Four Compounds, peptides and antibodies that modify receptor activity are leukotriene B Four Intracellular Ca in cells expressing receptors ++ Alternatively, screening can be performed by utilizing fluctuations in cAMP concentration. Ca ++ The concentration can be measured using fura2, fluo3, etc., and the cAMP concentration can be measured using a commercially available cAMP measurement kit (Amersham, etc.). Ca ++ And indirectly by detecting the transcriptional activity of genes whose transcription amount is regulated depending on cAMP concentration ++ And cAMP concentration can be measured. A compound, a peptide, an antibody, or the like is allowed to act on a cell expressing the receptor and a host cell (control cell) not expressing the receptor for a certain period of time. ++ And measure cAMP concentration directly or indirectly. Compared with control cells, the cell-specific Ca expressing the receptor ++ The compounds, peptides, and antibodies having agonist activity can be screened using the increase in the activity and / or the increase or decrease in the cAMP concentration as an index. In addition, LTB in the presence of the test drug Four By Ca ++ And leukotriene B using as an index the inhibitory effect on the increase and / or decrease in cAMP concentration Four Compounds, peptides and antibodies having receptor antagonist activity can be screened. Preferably, under the conditions described in Example 3, EC 50 = 100 μM or less, more preferably EC 50 = A substance of 10 μM or less can be selected as a substance having agonist activity. In addition, by adding a test drug to the assay conditions described in Example 3, IC 50 = 10 μM or less, more preferably IC 50 A substance having ≦ 1 μM or less can be selected as a substance having antagonist activity.
[0033]
4) Leukotriene B of the present invention Four Methods for producing antibodies that react with receptors
Leukotriene B of the present invention Four Antibodies that react with the receptor, such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, are used in various animals for the leukotriene B. Four Receptor and the leukotriene B Four It can be obtained by administering the receptor fragment directly. The leukotriene B of the present invention Four The DNA vaccine method (Raz, E. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523; Donnelly, JJ et al. ( 1996) J. Infect. Dis., 173, 314-320).
Polyclonal antibodies are obtained by emulsifying the receptor protein or a fragment thereof in a suitable adjuvant such as Freund's complete adjuvant and immunizing the abdominal cavity, subcutaneous, vein, etc., such as serum of rabbits, rats, goats, chickens, etc. Or manufactured from eggs. Polyclonal antibodies can be separated and purified from the serum or egg thus produced by a conventional protein isolation and purification method. Examples of such methods include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatographic methods using DEAE-cellulose, hydroxyapatite, protein A agarose, and the like.
The antibody separated and purified as described above is digested with proteolytic enzymes such as pepsin and papain by a conventional method, and then separated and purified by a conventional protein isolation and purification method to obtain a part of the active antibody. For example, F (ab ′) 2, Fab, Fab ′, and Fv can be obtained.
[0034]
Monoclonal antibodies can be easily produced by those skilled in the art by the cell fusion method of Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Nature, 256, 495-497).
Leukotriene B of the present invention Four Immunization is carried out by repeatedly inoculating the mouse abdominal cavity, subcutaneously or intravenously several times with a suspension of the receptor or a fragment thereof in an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant every several weeks. After the final immunization, spleen cells are removed and fused with myeloma cells to produce hybridomas.
As a myeloma cell for obtaining a hybridoma, a myeloma cell having a marker such as hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency or thymidine kinase deficiency, for example, mouse myeloma cell line P3X63Ag8.U1 is used. In addition, polyethylene glycol is used as a fusing agent. Furthermore, as a medium for hybridoma production, 10-30% fetal bovine serum is appropriately added to a commonly used medium such as Eagle's minimum essential medium, Dulbecco's modified minimum essential medium, RPMI-1640 and the like. The fused strain is selected by the HAT selection method. Hybridoma screening is performed using a culture supernatant by a well-known method such as ELISA or immunohistochemical staining or the screening method described above, and a hybridoma clone secreting the target antibody is selected. Moreover, the monoclonality of the hybridoma is ensured by repeating subcloning by limiting dilution. The thus obtained hybridoma produces an antibody in a purifiable amount by culturing in the medium for 2 to 4 days or in the abdominal cavity of BALB / c mice pretreated with pristane for 10 to 20 days.
[0035]
The thus produced monoclonal antibody can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional protein isolation and purification method. Examples of such methods include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatographic methods using DEAE-cellulose, hydroxyapatite, protein A agarose, and the like. An antibody fragment containing a monoclonal antibody or a part thereof can also be produced by incorporating all or part of the gene encoding the antibody into an expression vector and introducing it into Escherichia coli, yeast, or animal cells. The antibody separated and purified as described above is digested with proteolytic enzymes such as pepsin and papain by a conventional method, and then separated and purified by a conventional protein isolation and purification method to obtain a part of the active antibody. For example, F (ab ′) 2, Fab, Fab ′, and Fv can be obtained.
[0036]
Furthermore, the leukotriene B of the present invention Four Antibodies that react with the receptor can be obtained by the method of Claxson et al. Or Zebede et al. (Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352, 624-628; Zebedee, S. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179) can also be obtained as a single chain Fv or Fab. It is also possible to obtain human antibodies by immunizing a transgenic mouse (Lonberg, N. et al. (1994) Nature, 368, 856-859) in which the mouse antibody gene is replaced with a human antibody gene.
[0037]
In the present invention, the leukotriene B Four A pharmaceutical comprising a receptor, a compound that significantly modifies the activity of the receptor selected by the screening method, a peptide and an antibody as an active ingredient is included.
Leukotriene B of the present invention Four Formulations containing a compound, peptide, antibody or antibody fragment that significantly modifies the activity of the receptor as active ingredients can be prepared according to the type of the active ingredient, such as carriers and excipients commonly used for their formulation, It can be prepared using additives.
[0038]
Administration is orally by tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, oral liquids, or injections such as intravenous and intramuscular injections, suppositories, transdermal administration, transmucosal administration And parenteral administration. In particular, parenteral administration such as intravenous injection is desired for peptides digested in the stomach.
A solid composition for oral administration according to the invention comprises one or more active substances at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, polyvinylpyrrolidone , Mixed with magnesium aluminate metasilicate. The composition may contain additives other than the inert diluent, for example, lubricants, disintegrants, stabilizers, solubilizers or solubilizers in accordance with conventional methods. If necessary, tablets and pills may be coated with a sugar coating or a film of gastric or enteric material.
[0039]
Liquid compositions for oral use include emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, and commonly used inert diluents such as purified water, ethanol. The composition may contain additives other than inert diluents, such as wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances and preservatives.
Examples of parenteral injections include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Water-soluble solutions and suspensions include, for example, distilled water for injection and physiological saline as diluents. Diluents for water-insoluble solutions and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80, and the like. The composition may further contain a wetting agent, an emulsifying agent, a dispersing agent, a stabilizing agent, a solubilizing or solubilizing aid, a preservative and the like. The composition is sterilized, for example, by filtration through a bacteria-retaining filter, formulation of a bactericide, or irradiation. In addition, a sterile solid composition can be produced, and can be used by dissolving in sterile water or other sterile injection medium for use.
The dose is appropriately determined in consideration of the strength of activity of the active ingredient selected by the screening method, symptoms, age of the administration subject, sex, and the like.
[0040]
The present invention also provides leukotriene B as a diagnostic agent. Four The use of DNA encoding the receptor is included. Leukotriene B associated with dysfunction Four Detection of receptor gene variants is leukotriene B Four It is used for diagnosis of a disease caused by underexpression, overexpression or altered expression of a receptor or its susceptibility. Diagnostic DNA can be obtained from a subject's cells, such as blood, urine, saliva, tissue biopsy or autopsy material. Deletion and insertion mutations can be detected by a change in the size of the amplified product when compared to the normal genotype. Point mutations label amplified DNA with leukotriene B Four It can be identified by hybridizing with a receptor nucleotide. Perfectly matched sequences and mismatched duplexes can be distinguished by RNase digestion or by differences in melting temperatures. DNA sequence differences can also be detected by changes in electrophoretic mobility of DNA fragments on gels with or without denaturing agents, or by direct DNA sequencing (Myers, RM et al. (1985) Science 230, 1242-1246). Sequence changes at specific positions can also be confirmed by nuclease protection assays (eg RNase and S1 protection) or chemical cleavage methods (Cotton et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-4401 ). Leukotriene B Four An array of oligonucleotide probes comprising the receptor nucleotide sequence or fragments thereof can be constructed. This array technique is well known and has been used to analyze gene expression, genetic linkage and genetic variability (Chee, M. et al. (1996) Science, .274, 610-613). In addition, leukotriene B from a sample obtained from the subject Four Leukotriene B by a method that measures abnormal decreases or increases in receptor levels Four It is used for diagnosis of a disease caused by underexpression, overexpression or altered expression of a receptor or its susceptibility. The decrease or increase in expression can be measured at the RNA level by any polynucleotide quantification method known to those skilled in the art, such as PCR, RT-PCR, RNase protection, Northern blot, and other hybridization methods. In addition, leukotriene B in the sample obtained from the subject Four A decrease or increase in the level of a protein such as a receptor can be measured by assays known to those skilled in the art. Such assay methods include radioimmunoassay, competitive binding assay, western blotting, ELISA assay and the like.
[0041]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples. Unless otherwise specified, it can be carried out according to a known method (Maniatis, T. at al. (1982): “Molecular Cloning-A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY).
[0042]
(Example 1) Isolation of a gene encoding a novel receptor JULF2
Full-length cDNA encoding the novel receptor of the present invention (hereinafter referred to as JULF2) was obtained by PCR using human genomic DNA (Clontech) as a template. The oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 3 was used as a forward primer (forward primer) and the oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 4 was used as a reverse primer (XbaI site was added to each 5 'end) ). For PCR, Pfu DNA polymerase (Stratagene) was used, and the cycle of 98 ° C. (20 seconds) / 58 ° C. (30 seconds) / 74 ° C. (3 minutes) was repeated 34 times in the presence of 5% DMSO. As a result, a DNA fragment of about 1.0 kbp was amplified. This fragment was digested with XbaI and then cloned using pEF-BOS plasmid (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322). The base sequence of the obtained clone was analyzed by the dideoxy terminator method using ABI377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). The revealed sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an ORF of 1077 base. The amino acid sequence predicted from ORF (358 amino acids) is shown in SEQ ID NO: 2. The predicted amino acid sequence has a hydrophobic region that appears to be the seven transmembrane domains that are characteristic of G protein-coupled receptors. Therefore, this JULF2 gene may encode a G protein-coupled receptor. understood.
[0043]
(Example 2) Expression distribution of a novel human JULF2 gene in tissues
Northern blot hybridization was used to analyze the expression distribution of the JULF2 gene. A cDNA fragment (22nd to 615th of SEQ ID NO: 1) was used as a probe for human JULF2. Hybridization of the membrane (manufactured by Clontech) blotted with poly A + RNA (2 μg) from human organs and probe hybridization is 50% formamide, 5x SSPE, 10 x Denhardt's solution, 2% SDS, 100 μg / The reaction was carried out at 42 ° C. (18 hours) in a solution containing ml denatured salmon sperm DNA. The membrane was finally washed twice (65 ° C., 30 minutes) with a solution containing 0.2 × SSC and 0.1% SDS.
Human organs (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas, spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, peripheral blood leukocytes, stomach, thyroid, spinal cord, lymph node, trachea As shown in Fig. 1, Fig. 2 and Fig. 3, about 2.5 kb mRNA was found in the spleen, peripheral blood leukocytes, adrenal gland, bone marrow, trachea, thyroid gland, ovary and lymph nodes. It was strongly detected, and some signals were detected in the pancreas, heart, and spinal cord. Peripheral blood leukocytes expressed 3.5 kb, 5 kb, and 9.5 kb mRNA, and in particular, 5 kb mRNA was strongly detected in the spleen, bone marrow, and adrenal gland. Furthermore, 6.5 kb mRNA was detected specifically only in the trachea. The G protein-coupled receptor human JULF2 gene of the present invention was found to express at least 5 types of mRNA in a wide range of human tissues. From the above, the existing BLT receptor is expressed only in peripheral blood leukocytes, whereas JULF2 of the present invention, including spleen, peripheral blood leukocytes, bone marrow, has been confirmed gene expression widely, LTB Four This suggests that it may play an important role in a wide range of physiological effects.
[0044]
(Example 3) Expression of JULF2 by CHO cells and LTB Four CAMP production inhibition experiment
PEF-BOS was used as an expression vector for expressing human JULF2. The constructed plasmid was designated as pEF-BOS-Jul22.
1x10 CHO-dhfr (-) strain in a 10cm dish 6 Cells were seeded with αMEM (nucleic acid present) medium and cultured for 1 day, and then 8 μg of pEF-BOS-Jul22 and pEF-BOS (empty vector) were introduced using FuGENE6 (Boeringer Mannheim). After 24 hours, the transfected cells were collected, suspended in αMEM (nucleic acid-free) medium / 100 nM Methotrexate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), serially diluted, and seeded in a 10 cm petri dish. Colonies that appeared after 2 weeks were individually obtained and used as JULF2-expressing cells.
[0045]
1x10 JULF2-expressing CHO cells and empty vector-introduced CHO cells in a 24-well plate Five Seeded with cells. After 1-day culture, treated with αMEM (nucleic acid-free) medium / 1 mM 3-isobutyl-1-methlxanthine (Sigma) /0.1% BSA for 10 minutes, then 1 μM forskolin (Wako Pure Chemical Industries) / LTB Four 0-1 μM was added dropwise. After 30 minutes at 37 ° C., the culture supernatant was removed, and the cells were lysed using a cAMP EIA system (BIOTRAK; Amersham) cell lysate.
Measurement of the amount of cAMP produced by the cells under each condition was performed using the cAMP EIA system, and was performed according to the attached protocol. 1 μM Forskolin alone stimulates cAMP production to 100%, LTB Four A dose-dependent curve of the amount of cAMP in the coexistence was created (Fig. 4). LTB against JULF2 from dose-dependent curves Four Responsiveness is EC 50 = 10 nM or less. On the other hand, LTB for empty vector-introduced CHO cells Four There was no change in the amount of cAMP produced by the addition. Furthermore, the amount of cAMP produced by forskolin stimulation in JULF2-expressing CHO cells is LTB. Four It was suggested that JULF2 is coupled with Gαi of the intracellular trimeric G protein.
[0046]
As described above, leukotriene B of the present invention Four Receptor is an LTB whose existence has been previously unknown but its existence has been suggested Four Is a new receptor with affinity for leucotriene B Four Binding experiments and screening for antagonists became possible for the first time by using cells transformed with the receptor.
[0047]
【The invention's effect】
The present invention relates to a novel human leukotriene B. Four To provide a receptor. The receptor of the present invention is human leukotriene B Four For a substance that modifies the activity of the receptor as a preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by the disease, such as inflammatory diseases (bronchitis and dermatitis, psoriasis, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, edema) and It is useful for evaluation and can provide a therapeutic agent for a disease involving the receptor. The leukotriene B of the present invention Four The gene encoding the receptor is leukotriene B Four Not only is it used for the production of receptors, but also leukotriene B Four It is useful for diagnosing diseases caused by receptor mutations and abnormal expression fluctuations. The polyclonal or monoclonal antibody of the receptor is useful as a means for separating and purifying the receptor agonist, diagnostic agent or polypeptide.
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[Brief description of the drawings]
[Figure 1] Leukotriene B by Northern analysis Four Results of receptor tissue distribution (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas) are shown.
[Figure 2] Leukotriene B by Northern analysis Four The results of the receptor tissue distribution (spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, peripheral blood leukocytes) are shown.
[Figure 3] Leukotriene B by Northern analysis Four Results of receptor tissue distribution (stomach, thyroid, spinal cord, lymph nodes, trachea, adrenal gland, bone marrow) are shown.
[Figure 4] Leukotriene B Four LTB for receptors Four The result of cAMP expression suppression effect of is shown.
[0049]
[Sequence Listing]
