【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二種類の微粒子を比重の違いにより簡便かつ高い精度で分別する方法およびその装置に関する。特に体液から赤血球を分画除去するのに適した方法並びに装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液などからの赤血球の除去法および有核細胞の分離法には、従来から（１）バフィー・コート採取法、（２）溶血による赤血球除去法、（３）赤血球凝集沈降分離法、（４）比重溶液の密度勾配を利用した遠心分離法などの手法が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前記公知の手法には、それぞれ次のような問題点があった。
（１）バフィー・コート採取法
この方法は、採取しようとする有核細胞への大量の赤血球の混入が不可避で、また有核細胞の回収率も手技を施す人の熟練度に大きく左右される。
（２）溶血による赤血球除去法
この方法は、溶血に用いる試薬の細胞毒性が不可避であり、有核細胞の回収率および純度は、試薬の濃度や混合比率および反応時間といった条件に左右される。また、大容量の検体には不向きである。
（３）赤血球凝集沈降分離法
この方法によって満足しうる回収率を得るためには、試料を等張液で希釈するか、または擬集沈降手技を数回反復する必要がある。従って、分画後に浮遊細胞を再度遠沈洗浄してデキストランやヘタスターチなどの凝集薬を除去し、多量の溶液中に拡散した状態で存在する有核細胞を回収する必要があり、作業工程が多く煩雑である。
（４）比重溶液の密度勾配を利用した遠心分離法
この方法は、溶液の重層や目的とする比重帯の分離手技等、慎重な操作と熟練が要求される。また、分画後に浮遊細胞を再度遠沈洗浄して、たとえばファイコール（Ficall)、パーコール（Percoll)等の比重溶液を除去する必要があり、作業工程が多く煩雑である。
また、血清分離用には既にゾル状の介在物を用いて、血球等の分離を行う方法も知られてはいるが、細胞分離用として用いるためには、介在物の厳密な比重調整が必要で、かつ検体の比重分布そのものの個体差に影響されるため、安定した結果が得られない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、比重の異なる２種以上の微粒子と特定の比重と形状を有する固体介在物を一緒に遠心することにより、高比重の微粒子を固体介在物の下方に、または低比重の微粒子を固体介在物の上方に移動させ、比重の異なる微粒子を互いに分離する方法を見つけた。
すなわち、本発明は、
（１）比重の異なる二種以上の微粒子を含む微粒子群を、その微粒子群の比重の中間帯に位置する比重を持ち、微粒子群との接触面の外縁が遠心管に内接して上下に移動可能な固体介在物と共に遠心して、遠心管内壁と固体介在物との接触面を通して高比重微粒子を固体介在物の下方に、または低比重微粒子を固体介在物の上方に移動させると同時に固体介在物を比重の高低二粒子群の中間に移動、介在させることを特徴とする比重の異なる微粒子の分別法。
（２）固体介在物の形状が、球状、楕円体状または微粒子群との接触面の少なくとも一部が遠心管内壁に対して鋭角で接触している柱状であることを特徴とする（１）記載の方法。
（３）微粒子の粒径が０．０１〜２００μmの範囲内にあることを特徴とする（１）記載の方法。
（４）微粒子が液体中に懸濁しているかまたはコロイド状として存在していることを特徴とする（１）記載の方法。
（５）微粒子を含む液体が、体液であることを特徴とする（１）記載の方法。
（６）固体介在物が、寒天、ゼラチン、合成樹脂、セラミクス、タンパク質、多糖類から選ばれた一種であることを特徴とする（１）記載の方法。
（７）遠心管内に、外縁が遠心管に内接し且つ上下移動が可能な固体介在物を収容したことを特徴とする（１）記載の方法を実施するための装置、
である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において、分別の対象となる比重の異なる二種以上の微粒子とは、微粒子径が０．０１〜２００μｍ程度のもので、微粒子の種類、形状を問わず、比重の異なる二種以上の微粒子を含む微粒子群、特に微粒子が液体媒体中混在している状態の微粒子群である。その代表的なものは、体液、特に赤血球、白血球などの種々の比重の異なる細胞を含む血液である。その他、比重の異なるコロイド微粒子を含むコロイド液、ミセルを含む液、、エマルション、サスペンジョンなども含まれる。本発明においては、特に体液中の細胞集団から赤血球を分離除去して有核細胞を採取するのに適している。
本発明に用いられる遠心管１は、材質、大きさ等は、特に限定されるものではなく、通常の遠心分離器に用いられるものであればよいが、半球状、半楕円体状、コーン状などの形状を有する底部６と、それに続く円筒状の胴部７からなるものがよい。遠心管の材質は、ガラス、合成樹脂、ゴム、金属等が用いられる。
【０００６】
本発明に用いられる固体介在物２は、比重の異なる二種以上の微粒子が、液体に分散されている場合は、その液体に不溶のもので、遠心力が加わったとき微粒子が遠心管器壁と内接している固体介在物との間を移動しうる僅かの隙間を有しているものか、または、そのような間隙を生む程度の柔軟性を有しているもの、すなわち、弾性体がよい。
固体介在物２の材質は、たとえば、寒天、ゼラチン、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂，ポリウレタン樹脂等の合成樹脂、ガラスなどのセラミクス、タンパク質、多糖類等が挙げられる。
固体介在物２の比重は、その中に比重の異なる微粉末たとえば、シリカ、クレー、セラミクスパウダー，金属粉末などを必要量混合することにより調節することができる。
【０００７】
本発明の特徴の一つは、固体介在物を微粒子群中に介在させ、固体介在物の微粒子群との分界面の形状を遠心力方向に直交する平面以外の形状、例えば、球状、楕円体状または微粒子群との接触面の少なくとも一部が遠心管内壁に対して鋭角で接触している柱状に設定したことである。
図４〜６に示したように、遠心力により、微粒子群を含む液１０の微粒子が整然とした比重勾配を形成する。ついで固体介在物２よりも高比重の微粒子３が遠心管内壁と固体介在物との接触面９の間を擦り抜けて順々に固体介在物の下方に移動し、その結果固体介在物２は上方に移動する。最終的な定常状態においては、固体介在物の面８と遠心管内壁との漸近により構成される狭い空間５に微粒子群は少量の比重勾配を残したまま拮抗する。従って、微粒子群自体の比重にロット差がある場合でも、目的とする低比重微粒子４を他の微粒子の混在が少ない状態で安定して分別することができる。
固体介在物２の望ましい形状の一つは、球（図３）または楕円体である。他の望ましい形状は、固体介在物が微粒子群に接している面と遠心力方向、すなわち遠心管内壁とのなす角度αが鋭角である柱状体（図１および２）である。この場合の角度は、２０〜７０度が好ましく、３０〜６０度であることがより好ましい。
固体介在物が微粒子と接する面８は、平面であっても、曲面であってもよい。固体介在物の比重は、微粒子分別の目的に応じて適宜選択することができるが、分別しようとする二つの微粒子の比重の間にくるように適当な比重を有する物質を混入することで、その比重を任意に調節することができる。
【０００８】
遠心管底部内壁には、遠心した際、固体介在物が遠心管の上下に移動しやすくするために、パラフィン等の離型剤を塗布しておくこともできる。
次に本発明の代表的な実施方法について、図面を参照しながら説明する。
まず、図４に示される通り、半径ｒの半球状の底部６とそれに続く円筒状胴部７を有する遠心管１に、上面に傾斜面８を有する固体介在物２を、遠心管１に内接するように配置する。この遠心管１に赤血球３（高比重微粒子）と有核細胞４（低比重微粒子）の比重の異なる二種の微粒子を含む血液１０を入れ、遠心管を遠心機にかける。遠心を始めると、高比重である赤血球３が固体介在物傾斜面と遠心管内壁が漸近してくる部分５に集まり、さらに遠心力が加わるとその赤血球３は、遠心管内壁と固体介在物との間５を擦り抜けて固体介在物の下方に移動し、一方固形介在物２は、赤血球との比重差により生じる負の遠心力により押し上げられて上方に移動する。遠心終了時点では、血球は低比重から高比重へと整然と積層する。そして、固体介在物の下方には大部分の赤血球３が移動し、有核細胞４と赤血球３とが接する界面９に固体介在物２が介在する。
比重の異なる二種以上の微粒子の混合物１０は、固体介在物の下方に配置してもよい。この場合は、まず、遠心管に、比重の異なる二種以上の微粒子の混合物１０を入れ、その上に成形された固体介在物２を挿入する。この場合の固体介在物の形状は，球形または楕円形のものが、挿入が容易であることにおいて好ましい。この比重の異なる二種以上の微粒子の混合物と固体介在物を収容した遠心管を遠心すると低比重微粒子４が遠心管内壁と固体介在物との接触面の間９を擦り抜けて固体介在物の上方に移動し、高比重粒子３が固体介在物の下方に留まる。その際、固体介在物２は、低比重粒子４が上方に移動した分だけ下方に移動する。
遠心する場合の遠心力と時間は、分別しようとする微粒子の種類や量により適宜決めればよい
遠心後は、固体介在物より上にある低比重微粒子４を含む液相を遠心管の傾斜により、又は、ピペットなどの吸引具により取り出すことにより、容易に高低二群の微粒子を分別することができる。
【０００９】
【実施例】
実施例１
シリカ粉末で比重調節し加熱融解した寒天（比重１．０５）３ｍｌを予め内壁にパラフィンを塗布した１５ｍｌ容の遠心管に注ぎ、冷却して固化させ、遠心管に内接する大きさの上面が遠心力ベクトル軸方向に対して約６０度の斜面を形成している固体介在物を成形した。この遠心管にヒト末梢血（比重：約１．０５６）５ｍｌを注ぎ、遠心装置にかけて３００Gで、１５分間遠心した。固体介在物の傾斜面の下部に沈降した赤血球（平均比重：１．０９６）が器壁を伝って固体介在物の下方に移動し、同時に固体介在物が上方に押し上げられた。最終的には固体介在物の上方に白血球と血漿成分（比重：１．０２１５）を含む画分が残り、下方に赤血球が集積した。
【００１０】
この実験の結果を〔表１〕に纏めた。
実施例２
固体介在物の遠心管内壁と接するポリスチレン樹脂製の球（比重１．０５）を用い、５００Ｇで２０分遠心した外は実施例と同様に血液を処理した。その結果も〔表１〕に纏めた。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【発明の効果】
本発明の方法は、比較的簡単な装置を用いて、従来法の遠心分離操作を行うだけで、比重の異なる二種以上の微粒子を含む微粒子群を、比重の高低二群に高い精度で分画することができる。特に、血液中から赤血球を分離し、有核細胞である白血球を摂取するのに極めて適した方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】傾斜した上面を有する固体介在物の平面図
【図２】傾斜した上面を有する固体介在物の垂直断面図
【図３】球状の固体介在物を配置した遠心管の垂直断面図
【図４】遠心前の傾斜した上面を有する固体介在物を収容した遠心管垂直断面の模式図
【図５】 遠心中の傾斜した上面を有する固体介在物を収容した遠心管垂直断面の模式図
【図６】遠心終了時の傾斜した上面を有する固体介在物を収容した遠心管垂直断面の模式図
【符号の説明】
１．遠心管
２．固体介在物
３．赤血球
４．有核細胞
５．固体介在物の傾斜した上面と遠心管内壁が漸近する部分
６．遠心管底部
７．遠心管胴部
８．固体介在物の微粒子群と接触する面
９．低比重微粒子と高比重微粒子とが接する面
１０．血液[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method and apparatus for separating two kinds of fine particles easily and with high accuracy based on the difference in specific gravity. More particularly, the present invention relates to a method and apparatus suitable for fractionating and removing red blood cells from a body fluid.
[0002]
[Prior art]
Conventional methods for removing erythrocytes from blood and separating nucleated cells include (1) buffy coat collection method, (2) erythrocyte removal method by hemolysis, (3) erythrocyte aggregation sedimentation method, (4) A method such as a centrifugal separation method using a density gradient of a specific gravity solution is known.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The known methods have the following problems.
(1) Buffy coat collection method In this method, it is inevitable that a large amount of red blood cells are mixed into the nucleated cells to be collected, and the recovery rate of the nucleated cells greatly depends on the skill level of the person performing the procedure. .
(2) Erythrocyte removal method by hemolysis In this method, the cytotoxicity of the reagent used for hemolysis is inevitable, and the recovery rate and purity of nucleated cells depend on conditions such as reagent concentration, mixing ratio, and reaction time. Moreover, it is not suitable for a large-capacity sample.
(3) Hemagglutination-sediment separation method In order to obtain a satisfactory recovery rate by this method, it is necessary to dilute the sample with an isotonic solution or to repeat the pseudo-sedimentation procedure several times. Therefore, it is necessary to resuspend the suspended cells after fractionation to remove agglutinating agents such as dextran and hetastarch, and to recover the nucleated cells present in a diffused state in a large amount of solution. It is complicated.
(4) Centrifugation method using density gradient of specific gravity solution This method requires careful operation and skill such as separation of solution layer and target specific gravity zone. In addition, it is necessary to remove the specific gravity solution such as Ficall and Percoll again by centrifugation of the floating cells after fractionation, which requires many work steps and is complicated.
In addition, a method for separating blood cells and the like using sol-like inclusions has already been known for serum separation, but in order to use it for cell separation, it is necessary to strictly adjust the specific gravity of the inclusions. In addition, since it is influenced by individual differences in the specific gravity distribution of the specimen, a stable result cannot be obtained.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor makes two or more kinds of fine particles having different specific gravities and solid inclusions having a specific specific gravity and shape together to form high specific gravity fine particles below the solid inclusions or low specific gravity fine particles. A method for separating fine particles having different specific gravities from each other by moving the solid inclusions above was found.
That is, the present invention
(1) A group of fine particles containing two or more kinds of fine particles having different specific gravities has a specific gravity located in an intermediate zone of the specific gravity of the fine particle group, and the outer edge of the contact surface with the fine particle group moves up and down inscribed in the centrifuge tube. Centrifugation with possible solid inclusions, moving high specific gravity fine particles below solid inclusions or moving low specific gravity fine particles above solid inclusions at the same time through the contact surface between the inner wall of the centrifuge tube and solid inclusions. A method for fractionating fine particles having different specific gravities, characterized in that the particles are moved and interposed in the middle of a group of high and low specific gravity particles.
(2) The solid inclusion has a spherical shape, an ellipsoid shape, or a columnar shape in which at least a part of the contact surface with the fine particle group is in contact with the inner wall of the centrifuge tube at an acute angle (1) The method described.
(3) The method according to (1), wherein the particle diameter of the fine particles is in the range of 0.01 to 200 μm.
(4) The method according to (1), wherein the fine particles are suspended in a liquid or exist as a colloid.
(5) The method according to (1), wherein the liquid containing fine particles is a body fluid.
(6) The method according to (1), wherein the solid inclusion is a kind selected from agar, gelatin, synthetic resin, ceramics, protein, and polysaccharide.
(7) An apparatus for carrying out the method according to (1), characterized in that the centrifuge tube contains a solid inclusion whose outer edge is inscribed in the centrifuge tube and capable of moving up and down,
It is.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, the two or more kinds of fine particles having different specific gravities to be separated are those having a fine particle diameter of about 0.01 to 200 μm, and two or more kinds of fine particles having different specific gravities regardless of the kind and shape of the fine particles. In particular, a fine particle group in a state where fine particles are mixed in a liquid medium. A typical example is blood containing various body fluids such as red blood cells and white blood cells having different specific gravity. In addition, colloidal liquids containing colloidal fine particles having different specific gravities, liquids containing micelles, emulsions, suspensions, and the like are also included. The present invention is particularly suitable for collecting nucleated cells by separating and removing red blood cells from a cell population in a body fluid.
The material and size of the centrifuge tube 1 used in the present invention are not particularly limited, and any centrifuge tube 1 may be used as long as it is used in a normal centrifuge. The bottom part 6 having a shape such as the above and the cylindrical body part 7 following the bottom part 6 are preferable. The material of the centrifuge tube is glass, synthetic resin, rubber, metal or the like.
[0006]
The solid inclusion 2 used in the present invention, when two or more kinds of fine particles having different specific gravity are dispersed in a liquid, is insoluble in the liquid, and when centrifugal force is applied, the fine particles are separated from the wall of the centrifuge tube. Having a slight gap that can move between the solid inclusion and the inscribed solid inclusion, or having a degree of flexibility that produces such a gap, that is, an elastic body Good.
Examples of the material of the solid inclusion 2 include agar, gelatin, silicon resin, polystyrene resin, ABS resin, polyurethane resin, and other synthetic resins, glass and other ceramics, proteins, polysaccharides, and the like.
The specific gravity of the solid inclusion 2 can be adjusted by mixing necessary amounts of fine powders having different specific gravity, for example, silica, clay, ceramic powder, metal powder and the like.
[0007]
One of the features of the present invention is that solid inclusions are interposed in the fine particle group, and the shape of the interface between the solid inclusions and the fine particle group is a shape other than a plane orthogonal to the centrifugal force direction, for example, a spherical shape or an ellipsoid Or at least a part of the contact surface with the fine particle group is set in a columnar shape in contact with the inner wall of the centrifuge tube at an acute angle.
As shown in FIGS. 4 to 6, the fine particles of the liquid 10 including the fine particle groups form an orderly specific gravity gradient by centrifugal force. Subsequently, the fine particles 3 having a specific gravity higher than that of the solid inclusions 2 pass through the contact surface 9 between the inner wall of the centrifuge tube and the solid inclusions and sequentially move below the solid inclusions. Move upward. In the final steady state, the fine particle groups antagonize while leaving a small specific gravity gradient in the narrow space 5 formed by the asymptotic relationship between the solid inclusion surface 8 and the inner wall of the centrifuge tube. Therefore, even when there is a lot difference in the specific gravity of the fine particle group itself, the target low specific gravity fine particles 4 can be stably separated with a small amount of other fine particles.
One desirable shape of the solid inclusion 2 is a sphere (FIG. 3) or an ellipsoid. Another desirable shape is a columnar body (FIGS. 1 and 2) having an acute angle α between the surface where the solid inclusions are in contact with the particle group and the direction of centrifugal force, that is, the inner wall of the centrifuge tube. The angle in this case is preferably 20 to 70 degrees, and more preferably 30 to 60 degrees.
The surface 8 where the solid inclusions are in contact with the fine particles may be a flat surface or a curved surface. The specific gravity of the solid inclusion can be appropriately selected according to the purpose of fine particle separation, but by mixing a substance having an appropriate specific gravity so as to be between the specific gravity of the two fine particles to be separated, Specific gravity can be adjusted arbitrarily.
[0008]
A mold release agent such as paraffin may be applied to the inner wall of the bottom of the centrifuge tube so that the solid inclusions can easily move up and down the centrifuge tube when centrifuged.
Next, typical implementation methods of the present invention will be described with reference to the drawings.
First, as shown in FIG. 4, a centrifuge tube 1 having a hemispherical bottom portion 6 having a radius r and a cylindrical body portion 7 subsequent thereto is provided with a solid inclusion 2 having an inclined surface 8 on the upper surface. Arrange to touch. Blood 10 containing two kinds of fine particles having different specific gravity of red blood cells 3 (high specific gravity fine particles) and nucleated cells 4 (low specific gravity fine particles) is placed in the centrifuge tube 1 and the centrifuge tube is put into a centrifuge. When centrifugation is started, red blood cells 3 having a high specific gravity gather at the portion 5 where the inclined surface of the solid inclusion and the inner wall of the centrifuge tube approach each other, and when a centrifugal force is further applied, the red blood cell 3 The solid inclusions 2 are pushed down by the negative centrifugal force generated by the specific gravity difference with the red blood cells and moved upward. At the end of the centrifugation, blood cells are orderly stacked from a low specific gravity to a high specific gravity. Most of the red blood cells 3 move below the solid inclusions, and the solid inclusions 2 are interposed at the interface 9 where the nucleated cells 4 and the red blood cells 3 are in contact.
The mixture 10 of two or more kinds of fine particles having different specific gravities may be disposed below the solid inclusions. In this case, first, a mixture 10 of two or more kinds of fine particles having different specific gravities is put in a centrifuge tube, and the solid inclusion 2 formed thereon is inserted. In this case, the shape of the solid inclusion is preferably spherical or elliptical because it can be easily inserted. When the centrifuge tube containing the mixture of two or more kinds of fine particles having different specific gravities and the solid inclusions is centrifuged, the low specific gravity fine particles 4 rub through the contact surface 9 between the inner wall of the centrifuge tube and the solid inclusions. It moves upward and the high specific gravity particles 3 remain below the solid inclusions. At that time, the solid inclusion 2 moves downward by the amount that the low specific gravity particles 4 have moved upward.
Centrifugal force and time when centrifuging may be appropriately determined according to the type and amount of fine particles to be separated.After centrifugation, the liquid phase containing the low specific gravity fine particles 4 above the solid inclusions is inclined by the inclination of the centrifuge tube. Alternatively, by taking out with a suction tool such as a pipette, it is possible to easily separate the high and low two groups of fine particles.
[0009]
【Example】
Example 1
Pour 3 ml of agar (specific gravity 1.05) with specific gravity adjusted with silica powder into a 15 ml centrifuge tube coated with paraffin on the inner wall, solidify by cooling, and the top surface of the centrifuge tube is indented. A solid inclusion forming a slope of about 60 degrees with respect to the direction of the force vector axis was formed. 5 ml of human peripheral blood (specific gravity: about 1.056) was poured into this centrifuge tube, and centrifuged at 300 G for 15 minutes through a centrifuge. Red blood cells (average specific gravity: 1.096) settled below the inclined surface of the solid inclusions moved down the solid inclusions along the vessel wall, and at the same time, the solid inclusions were pushed up. Finally, a fraction containing white blood cells and plasma components (specific gravity: 1.0215) remained above the solid inclusions, and red blood cells accumulated below.
[0010]
The results of this experiment are summarized in [Table 1].
Example 2
Using a polystyrene resin ball (specific gravity 1.05) in contact with the inner wall of the centrifuge tube of solid inclusions, blood was treated in the same manner as in Example except that it was centrifuged at 500 G for 20 minutes. The results are also summarized in [Table 1].
[0011]
[Table 1]
[0012]
【The invention's effect】
In the method of the present invention, by performing a conventional centrifugal separation operation using a relatively simple apparatus, a group of fine particles containing two or more kinds of fine particles having different specific gravities can be separated into high and low specific groups with high accuracy. Can be drawn. In particular, it is a very suitable method for separating red blood cells from blood and ingesting white blood cells that are nucleated cells.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view of a solid inclusion having an inclined upper surface. FIG. 2 is a vertical sectional view of a solid inclusion having an inclined upper surface. FIG. 3 is a vertical sectional view of a centrifuge tube having a spherical solid inclusion. 4 is a schematic diagram of a vertical cross section of a centrifuge tube containing a solid inclusion having an inclined upper surface before centrifugation. FIG. 5 is a schematic diagram of a vertical cross section of a centrifuge tube containing a solid inclusion having an inclined upper surface during centrifugation. FIG. 6 is a schematic diagram of a vertical cross section of a centrifuge tube containing solid inclusions having an inclined upper surface at the end of centrifugation.
1. 1. Centrifuge tube 2. Solid inclusions Erythrocytes 4. Nucleated cells5. 5. A portion where the inclined upper surface of the solid inclusion and the inner wall of the centrifuge tube approach each other. 6. Centrifuge tube bottom Centrifugal tube barrel 8. 8. the surface of the solid inclusion in contact with the particles 9. Surface where low specific gravity fine particles and high specific gravity fine particles are in contact blood
