JP2005073550A - Method for producing prenyl alcohol - Google Patents
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Abstract
【課題】 生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法の提供。
【解決手段】 プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法。
【選択図】 なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing prenyl alcohol excellent in production efficiency.
A method for producing prenyl alcohol, comprising culturing cells under conditions that reduce prenylated enzyme activity and recovering prenyl alcohol from the culture.
[Selection figure] None
Description
本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法に関する。また本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からスクアレンを回収するスクアレンの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing prenyl alcohol in which cells are cultured and prenyl alcohol is recovered from the obtained culture. The present invention also relates to a method for producing squalene in which cells are cultured and squalene is recovered from the obtained culture.
プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチル−ＣｏＡとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレニルアルコールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な種々のテルペノイドの他、トコフェノール、カロチノイドをはじめとするビタミン類の合成出発物質としてもまた重要な物質である。 Prenyl alcohol is synthesized by the mevalonic acid pathway from pyruvate via acetyl-CoA and mevalonic acid and the non-mevalonic acid pathway from pyruvate via glyceraldehyde triphosphate. Prenyl alcohols such as farnesol and geranylgeraniol are known as aromatic substances in essential oils used as fragrances. In addition to various terpenoids that are useful as pharmacological agents, synthetic starting materials for vitamins including tocophenols and carotenoids It is also an important substance.
従来、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みとしては、上述した代謝経路の酵素を強化したり、変異導入して酵素の特異性を改変するといった手法が取られてきた。例えば、特許文献１及び２には、スクアレン合成酵素活性を低下させ、プレニルアルコールを製造する方法が記載されている。この方法は、生物の細胞膜に多く含まれるステロール類がスクアレンから合成されるため、このスクアレン合成活性を阻害剤、遺伝子破壊等を利用して低下させることによりプレニルアルコールの生産が増加することに基づくものである。しかし、細胞内に蓄積した過剰のプレニル二リン酸類はプレニルアルコール合成以外にプレニル化タンパク、ドリコール合成等の原料として使われるため必ずしも効率的にプレニルアルコールを製造できるものではなかった。
Conventionally, as an attempt to improve the productivity of prenyl alcohol, techniques such as enhancing the enzyme of the metabolic pathway described above or modifying the specificity of the enzyme by introducing mutations have been taken. For example,
また、特許文献３には、カウレン合成酵素阻害剤を含む培地でジベレリン生産菌を培養しプレニルアルコールを製造方法が記載されている。特許文献４には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子、ＦＰＰ合成酵素遺伝子若しくはＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子を酵母に導入し、プレニルアルコールを製造する方法が記載されている。さらに特許文献５には、培養液に油状物質を添加して微生物のプレニルアルコール生産を促進する方法が記載されている。 Patent Document 3 describes a method for producing prenyl alcohol by culturing gibberellin-producing bacteria in a medium containing a kaurene synthase inhibitor. Patent Document 4 describes a method for producing prenyl alcohol by introducing an HMG-CoA reductase gene, FPP synthase gene or IPPΔ-isomerase gene into yeast. Furthermore, Patent Document 5 describes a method for promoting the production of prenyl alcohol by microorganisms by adding an oily substance to the culture solution.
これらの方法は、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法として大いに期待できるが、工業規模でプレニルアルコールを製造するためにはさらなる改善が望まれる。 Although these methods can be greatly expected as a method for producing prenyl alcohol having excellent production efficiency, further improvement is desired for producing prenyl alcohol on an industrial scale.
また、スクアレンは、ステロール類の前駆物質であり、動植物・微生物の脂質成分として存在することが知られている。スクアレンは水素添加されてスクアランとなる。スクアランは流動パラフィンと比較して軽い油性感があり皮膚に対する触感が良く、低温での流動性も良いので化粧品の油性原料として広く使用されている。さらにステロール類は、製剤原料や乳化剤（コレステロール）、化粧品添加物（エルゴステロール）、ファンデーション、シャンプー、リンス及び化粧石鹸（シトステロール）等に使用される。 Squalene is a precursor of sterols and is known to exist as a lipid component of animals, plants and microorganisms. Squalene is hydrogenated to form squalane. Squalane is widely used as an oily raw material for cosmetics because it has a light oily feeling compared to liquid paraffin, a good feel on the skin, and good fluidity at low temperatures. Furthermore, sterols are used in pharmaceutical raw materials, emulsifiers (cholesterol), cosmetic additives (ergosterols), foundations, shampoos, rinses, cosmetic soaps (sitosterols) and the like.
スクアレン類は主として深海鮫の肝油又はオリーブ油等から採取精製したものが用いられている。しかしながらこれら天然物を原料とした場合、漁獲量の変動や天候・気候等の条件により供給量が安定しないこともあるため、安定かつ効率的なスクアレン類の製造方法が望まれている。例えば、シュードモナス属、プロタミノバクター属等のスクアレン生産菌を栄養培地に好気条件下で培養し、菌体内にスクアレンを蓄積させ、このスクアレンを取り出す方法が提案されている（特許文献６）。しかしながら、この方法では、培地１リットル当り換算でのスクアレン生成量は０.０５〜２.１２ｍｇと少なく、生産効率の点で問題がある。 Squalenes are mainly collected and purified from deep-sea shark liver oil or olive oil. However, when these natural products are used as raw materials, the supply amount may not be stable depending on conditions such as fluctuations in the amount of catch and the weather and climate, and therefore a stable and efficient method for producing squalene is desired. For example, a method has been proposed in which squalene-producing bacteria such as Pseudomonas and Protaminobacter are cultured in a nutrient medium under aerobic conditions, squalene is accumulated in the cells, and the squalene is extracted (Patent Document 6). . However, this method has a problem in terms of production efficiency because the amount of squalene produced per liter of the medium is as small as 0.05 to 2.12 mg.
一方、特許文献７〜９には、プレニル化酵素の阻害剤が開示されている。しかし、これらの文献は、プレニル化酵素阻害剤の医療用途、すなわち疾患の治療用途等を開示するのみである。従って、プレニル化酵素の阻害剤をプレニルアルコール又はスクアレンの製造に使用することについては従来報告されていない。 On the other hand, Patent Documents 7 to 9 disclose inhibitors of prenylating enzymes. However, these documents only disclose the medical use of the prenylated enzyme inhibitor, that is, the therapeutic use of a disease. Therefore, there has been no report on the use of prenylating enzyme inhibitors for the production of prenyl alcohol or squalene.
以上のように、プレニルアルコール又はスクアレンの生産性を向上させるため、より簡易に且つ、十分な生産効率を達成できるプレニルアルコール又はスクアレンの製造方法が望まれている。 As described above, in order to improve the productivity of prenyl alcohol or squalene, there is a demand for a method for producing prenyl alcohol or squalene that can achieve simpler and sufficient production efficiency.
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、生産効率に優れたプレニルアルコール又はスクアレンの製造方法を提供することを目的とする。 Then, an object of this invention is to provide the manufacturing method of the prenyl alcohol or squalene excellent in production efficiency in view of the actual condition mentioned above.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、炭素源のプレニルアルコールへの変換効率が上昇しない原因の１つとして、プレニルアルコール及びスクアレンの原料となるプレニル二リン酸が、プレニルアルコール及びスクアレンに変換されると同時にプレニル化酵素によりプレニル化タンパク質に変換されるため、プレニルアルコール及びスクアレンの生成率が低くなるのではないかと考えた。そこで、このプレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養したところ、プレニルアルコール及びスクアレンの生産を上昇させることができるという知見を得、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor, as one of the causes that the conversion efficiency of the carbon source to prenyl alcohol does not increase, prenyl diphosphate as a raw material of prenyl alcohol and squalene, Since it was converted into prenylated alcohol and squalene and simultaneously converted into prenylated protein by prenylated enzyme, it was thought that the production rate of prenyl alcohol and squalene might be lowered. Thus, when cells were cultured under conditions that reduce the prenylating enzyme activity, the inventors have found that the production of prenyl alcohol and squalene can be increased, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法である。
また上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素阻害剤を培地に添加することで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
That is, this invention is a manufacturing method of prenyl alcohol which culture | cultivates a cell on the conditions which reduce prenylation enzyme activity, and collect | recovers prenyl alcohol from a culture.
Moreover, in the manufacturing method of the said prenyl alcohol, a prenylation enzyme activity can be reduced by adding a prenylation enzyme inhibitor to a culture medium.
上記プレニルアルコールの製造方法では、複数のプレニル化酵素遺伝子のうち、少なくとも１のプレニル化酵素遺伝子を破壊した細胞を用いることができる。
また上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素遺伝子の発現を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
さらに上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素遺伝子の翻訳効率を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
In the method for producing prenyl alcohol, a cell in which at least one prenylated enzyme gene is destroyed among a plurality of prenylated enzyme genes can be used.
Moreover, in the manufacturing method of the said prenyl alcohol, the prenylation enzyme activity can be reduced by reducing the expression of a prenylation enzyme gene.
Furthermore, in the said manufacturing method of prenyl alcohol, the prenylation enzyme activity can be reduced by reducing the translation efficiency of a prenylation enzyme gene.
上記プレニルアルコールの製造方法において、プレニル化酵素としては、例えばファルネシル化酵素及びゲラニルゲラニル化酵素が挙げられる。 In the method for producing prenyl alcohol, examples of the prenylation enzyme include farnesylation enzyme and geranylgeranylation enzyme.
一方、上記プレニルアルコールの製造方法では、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させてもよい。
さらに本発明は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からスクアレンを回収するスクアレンの製造方法である。
On the other hand, in the method for producing prenyl alcohol, squalene synthase activity may be reduced by adding a squalene synthase inhibitor to the medium.
Furthermore, this invention is a manufacturing method of squalene which culture | cultivates a cell on the conditions which reduce prenylation enzyme activity, and collect | recovers squalene from a culture.
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、菌体又は細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。また、本発明に係る方法では、スクアレンの生産性を向上させることができ、スクアレンを優れた生産性で製造できる。 In the method for producing prenyl alcohol according to the present invention, the productivity of prenyl alcohol in cells or cells can be improved, and prenyl alcohol useful in various fields can be produced with excellent productivity. In the method according to the present invention, the productivity of squalene can be improved, and squalene can be produced with excellent productivity.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養することで、当該菌体又は細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール及びゲラニルリナロール等を意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。 In the method for producing prenyl alcohol according to the present invention, the cells or cells are cultured under conditions that reduce the prenylation enzyme activity, thereby enhancing the ability of the cells or cells to produce prenyl alcohol and recovering prenyl alcohol. Is. In the present invention, prenyl alcohol means farnesol, geranylgeraniol, nerolidol, linalool, geraniol, geranyl linalool and the like. According to the present invention, productivity of at least one of these prenyl alcohols can be improved.
また本発明に係るスクアレンの製造方法は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養することで、当該菌体又は細胞のスクアレン生産能を亢進させ、スクアレンを回収するものである。本発明において、スクアレンとは、スクアレン、並びにスクアレンから生成されるステロール類、エルゴステロール類等を意味する。本発明によれば、これらスクアレンのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。 Further, the method for producing squalene according to the present invention is to recover squalene by culturing microbial cells or cells under conditions that reduce prenylated enzyme activity, thereby enhancing the squalene production ability of the microbial cells or cells. is there. In the present invention, squalene means squalene, sterols produced from squalene, ergosterols, and the like. According to the present invention, the productivity of at least one of these squalenes can be improved.
プレニルアルコール及びスクアレンを合成する代謝経路では、図１の経路に示すように、グルコースやエタノール等の炭素源から合成されたアセチル−ＣｏＡからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が合成される。イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）は、ペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に異性化される。また、図１に示すように、１分子のジメチルアリル二リン酸と２分子のイソペンテニル二リン酸とが、ゲラニル二リン酸合成酵素の作用により縮合反応してゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）が合成され、更に１分子のイソペンテニル二リン酸がファルネシル二リン酸合成酵素の作用により反応してファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）が合成され、さらにこれに１分子のイソペンテニル二リン酸がゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の作用により反応してゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が順次合成される。プレニルアルコールであるファルネソール（ＦＯＨ）とネロリドール（ＮＯＨ）はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から合成され、また、ゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）はゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から合成される。一方、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、図１に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンに変換される。スクアレンは、ステロイドの前駆体物質であり、酵母やカビ類においては最終的にエルゴステロールに変換される。 In the metabolic pathway for synthesizing prenyl alcohol and squalene, as shown in the pathway of FIG. 1, isopentenyl diphosphate (IPP) is synthesized from acetyl-CoA synthesized from a carbon source such as glucose or ethanol via mevalonic acid. The Isopentenyl diphosphate (IPP) is isomerized to dimethylallyl diphosphate (DMAPP) by pentenyl pyrophosphate isomerase. Further, as shown in FIG. 1, one molecule of dimethylallyl diphosphate and two molecules of isopentenyl diphosphate are subjected to a condensation reaction by the action of geranyl diphosphate synthase to produce geranyl diphosphate (GPP). Then, one molecule of isopentenyl diphosphate reacts with the action of farnesyl diphosphate synthase to synthesize farnesyl diphosphate (FPP), and one molecule of isopentenyl diphosphate is further converted to geranylgeranyl diphosphate. Geranylgeranyl diphosphate (GGPP) is synthesized in sequence by reacting with the action of phosphate synthase. The prenyl alcohols farnesol (FOH) and nerolidol (NOH) are synthesized from farnesyl diphosphate (FPP), and geranylgeraniol (GGOH) is synthesized from geranylgeranyl diphosphate (GGPP). On the other hand, farnesyl diphosphate (FPP) is converted to squalene by squalene synthase as shown in FIG. Squalene is a steroid precursor and is finally converted to ergosterol in yeast and molds.
さらに、図１に示すように、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、ファルネシル化酵素の作用によりそのファルネシル基がタンパク質に転移され、ファルネシル化タンパク質が生成される。また同様にゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）からはゲラニルゲラニル化酵素の作用によりゲラニルゲラニル化タンパク質が生成される。ｒａｓタンパク質を含む多くのタンパク質がプレニル化され、膜にアンカーされていることが知られている。 Furthermore, as shown in FIG. 1, farnesyl diphosphate (FPP) has its farnesyl group transferred to a protein by the action of a farnesylase to produce a farnesylated protein. Similarly, geranylgeranylated protein is produced from geranylgeranyl diphosphate (GGPP) by the action of geranylgeranylation enzyme. Many proteins, including the ras protein, are known to be prenylated and anchored to the membrane.
なお、図１並びに以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；ＧＧＯＨ）
ファルネソール（farnesol；ＦＯＨ）
ネロリドール（nerolidol；ＮＯＨ）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；ＧＧＰＰ）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；ＦＰＰ）
ゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate；ＧＰＰ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；ＩＰＰ）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；ＤＭＡＰＰ）
スクアレン（squalene；ＳＱ）
In addition, in FIG. 1 and the following description, each compound may be abbreviated as follows.
Geranylgeraniol (GGOH)
Farnesol (FOH)
Nerolidol (NOH)
Geranylgeranyl diphosphate (GGPP)
Farnesyl diphosphate (FPP)
Geranyl diphosphate (GPP)
Isopentenyl diphosphate (IPP)
Dimethylallyl diphosphate (DMAPP)
Squalene (SQ)
本方法においては、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養する。本発明において「プレニル化酵素」とは、プレニル二リン酸からプレニル基をタンパク質に転移させてプレニル化タンパク質を生成する酵素を指し、限定するものではないが、ファルネシル化酵素及びゲラニルゲラニル化酵素が含まれる。 In this method, the cells or cells are cultured under conditions that reduce prenylated enzyme activity. In the present invention, “prenylating enzyme” refers to an enzyme that forms a prenylated protein by transferring a prenyl group from prenyl diphosphate to a protein, and includes, but is not limited to, farnesylating enzyme and geranylgeranylating enzyme. It is.
ここでプレニル化酵素活性を低下させる方法としては、
（１）プレニル化酵素阻害剤を培地に添加する
（２）プレニル化酵素欠損株を用いる
（３）プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する
（４）プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する
方法が挙げられる。
Here, as a method of reducing the prenylation enzyme activity,
(1) Add a prenylating enzyme inhibitor to the medium (2) Use a prenylating enzyme-deficient strain (3) Repress the transcription of the prenylating enzyme gene (4) A method of suppressing the translation of the prenylating enzyme gene It is done.
（１）プレニル化酵素阻害剤を培地に添加する方法
プレニル化酵素阻害剤は、プレニル化酵素のプレニル基転移作用を阻害することができるものであれば限定されるものではないが、具体的には、ファルネシル化酵素阻害剤、及びゲラニルゲラニル化酵素阻害剤が挙げられる。ファルネシル化酵素阻害剤としては、例えばα−ヒドロキシファルネシルフォスフォン酸（ＨＦＰ）；マヌマイシンＡ（Manumycin A）；ザーネストラＲ１１５７７７（（Ｒ）−６−アミノ［（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン）；４−（ナフタレン−１−イル）ピリジン（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，１３（９）１５２３−１５２６）；２−アミノエタンチオール；３−アリルファルネソール（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００２，３０３（１）７４−８１）；（＋）−４−［２−［４−（８−クロロ−３，１０−ジブロモ−６，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２ｂ］ピリジン−１１（Ｒ）−イル)−１−ピペリジニル］−２−オキソエチル］−１−ピペリジンカルボキサミド（Ｓｃｈ−６６３３６）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５（１８）３８５４−６４）；Ｌ−７７８１２３（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７（１２）３８９４−３９０３）；ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６，６１（１８）６２９６−６３０１）；ＴＡＮ−１８１３（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ ２０００，５３（８）７６５−７７８）；ＦＬ−４１５１０；３，１０−ジブロモ−８−クロロベンゾシクロヘプタピリジン（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２（１４）２６５１−２６６１）；ｃｌａｖａｒｉｃ ａｃｉｄ（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９８，６１（１２）１５６８−１５７０）；ペンタペプチド誘導体Ｃｂｚ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）−Ｔｒｐ−ＤＡｌａ−ＮＨ2（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４０（２）１９２−２００）；バリノクチンＡ（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９６，４９（１０）１０３１−１０３５）；ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，４（６）８８１−８８３）；ペプチシンナミンＥ（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９３，４６（２）２２９−２３４）を挙げることができる。
ゲラニルゲラニル化酵素阻害剤としては、Ｎ−アセチル−Ｓ−ゲラニル−Ｌ−システイン（ＧＣ）、Ａｊｏｅｎｅ（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３，１３８（５）８１１−８１８）、ＧＧＴＩ−２１４７、ＧＧＴＩ−２８６（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００，２８１（４）８２４−８３１）を挙げることができる。
(1) Method of adding a prenylating enzyme inhibitor to the medium The prenylating enzyme inhibitor is not limited as long as it can inhibit the prenyl group transfer action of the prenylating enzyme, but specifically, Include farnesylase inhibitors and geranylgeranylase inhibitors. Examples of the farnesylase inhibitor include α-hydroxyfarnesylphosphonic acid (HFP); Manumycin A; Zanestra R115777 ((R) -6-amino [(4-chlorophenyl) (1-methyl-1H- Imidazol-5-yl) methyl] -4- (3-chlorophenyl) -1-methyl-2 (1H) -quinolinone); 4- (naphthalen-1-yl) pyridine (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 5,13 (9) 1523-1526); 2-aminoethanethiol; 3-allylfarnesol (J. Pharmacol Exp. Ther. 2002, 303 (1) 74-81); (+)-4- [2- [ 4- (8-Chloro-3,10-dibromo-6,11-dihydro-5H-benzo [5,6] Lohepta [1,2b] pyridin-11 (R) -yl) -1-piperidinyl] -2-oxoethyl] -1-piperidinecarboxamide (Sch-66336) (J. Med. Chem. 2002, 45 (18) 3854- 64); L-778123 (Clin. Cancer Res. 2001 7 (12) 3894-3903); chamellic acid A (J. Org. Chem. 1996, 6, 61 (18) 6296-6301); TAN-1813 (J Antibiot 2000, 53 (8) 765-778); FL-41510; 3,10-dibromo-8-chlorobenzocycloheptapyridine (J. Med. Chem. 1999, 42 (14) 2651-2661); (J. Nat. Prod 1998,61 (12) 1568-1570); pentapeptide derivative Cbz-His-Tyr (OBn) -Trp-DAla-NH 2 (J.Med.Chem.1997,40 (2) 192-200); Barinokuchin A ( J. Antibiot. 1996, 49 (10) 1031-1035); chaetomeric acid A (Bioorg. Med. Chem. 1996, 4 (6) 881-883); peptinamine E (J. Antibiot. 1993, 46 (2) 229. -234).
Examples of geranylgeranylase inhibitors include N-acetyl-S-geranyl-L-cysteine (GC), Ajoene (Br. J. Pharmacol. 2003, 138 (5) 811-818), GGTI-2147, GGTI-286 ( Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000, 281 (4) 824-831).
これらプレニル化酵素阻害剤は、菌体又は細胞を培養する培地に単独で添加しても良いし、複数を組み合わせて添加しても良い。プレニル化酵素阻害剤としてＨＦＰを使用する場合、添加量は、特に限定されないが、約０．０００１〜０．１％、例えば０．００１〜０．０５％が好ましい。またＧＣを使用する場合、添加量は、特に限定されないが、約０．０００１〜０．１％、例えば０．００１〜０．０５％が好ましい。 These prenylating enzyme inhibitors may be added singly to the culture medium for culturing cells or cells, or may be added in combination. When HFP is used as the prenylating enzyme inhibitor, the amount added is not particularly limited, but is preferably about 0.0001 to 0.1%, for example 0.001 to 0.05%. When GC is used, the amount added is not particularly limited, but is preferably about 0.0001 to 0.1%, for example 0.001 to 0.05%.
また、本方法では、プレニル化酵素阻害剤を、菌体又は細胞を培養する培地に予め添加しても良いし、菌体又は細胞の培養途中に培地に添加してもよい。特に細胞の種類によっては、プレニル化酵素阻害剤によって生育阻害が生ずる場合もあり、この場合には、細胞が十分に生育（増殖）した後、プレニル化酵素阻害剤を培地に添加することが好ましい。 In this method, the prenylating enzyme inhibitor may be added in advance to a culture medium for culturing cells or cells, or may be added to the medium during the culture of the cells or cells. In particular, depending on the cell type, growth inhibition may occur due to the prenylated enzyme inhibitor. In this case, it is preferable to add the prenylated enzyme inhibitor to the medium after the cells have sufficiently grown (proliferated). .
（２）プレニル化酵素欠損株を用いる方法
本発明において、プレニル化酵素欠損株とは、生物によっては複数のプレニル化酵素遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも１のプレニル化酵素遺伝子を破壊した菌株を意味する。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、本来的に、ファルネシル化酵素ＲＡＭ１及び２をコードする遺伝子、またゲラニルゲラニル化酵素ＢＥＴ２、４、及びＣＤＣ４３をコードする遺伝子、といったプレニル化酵素遺伝子を有している。従って、例えば、プレニル化酵素欠損株としては、これら遺伝子のうち１つのみを破壊したサッカロミセス・セレビシエ、及び上記遺伝子のうち任意の組合せの遺伝子を破壊したサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。なお、上記遺伝子のうち、ＲＡＭ１をコードする遺伝子以外の遺伝子の破壊は細胞致死となる可能性が高いため、ＲＡＭ１をコードする遺伝子以外の遺伝子を破壊する場合には、ゲノム上の対立遺伝子のうち一方が破壊されているヘテロ二倍体を作製することが好ましい。
(2) Method using a prenylated enzyme-deficient strain In the present invention, a prenylated enzyme-deficient strain has a plurality of prenylated enzyme genes depending on the organism, but a strain in which at least one of the prenylated enzyme genes is destroyed. Means. For example, Saccharomyces cerevisiae inherently has prenylated enzyme genes such as the genes encoding farnesylase enzymes RAM1 and 2, and the genes encoding geranylgeranylation enzymes BET2, 4 and CDC43. Yes. Thus, for example, prenylated enzyme-deficient strains include Saccharomyces cerevisiae in which only one of these genes is disrupted, and Saccharomyces cerevisiae in which any combination of genes among the above genes is disrupted. Of the above genes, the destruction of genes other than the gene encoding RAM1 is highly likely to be lethal, so when destroying genes other than the gene encoding RAM1, It is preferred to produce heterodiploids in which one is destroyed.
プレニル化酵素欠損株としては、既存の菌株を用いても良いし、野生型の菌株に対して新たに変異（例えば部位特異的変異）を導入して作出したものを用いてもよい。プレニル化酵素遺伝子に変異を導入する手法は当技術分野で周知であり、特に限定されるものではない。 As the prenylation enzyme-deficient strain, an existing strain may be used, or a strain produced by newly introducing a mutation (for example, site-specific mutation) into a wild-type strain may be used. Techniques for introducing mutations into the prenylating enzyme gene are well known in the art and are not particularly limited.
プレニル化酵素欠損株は、後述するように、プレニル化酵素阻害剤を添加しない又は添加した通常の培地を用いて培養することができる。 As will be described later, the prenylating enzyme-deficient strain can be cultured using a normal medium to which a prenylating enzyme inhibitor is not added or added.
（３）プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する方法
プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる菌株又は細胞におけるプレニル化酵素遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該変異型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、ＧＡＬ１遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
(3) Method of suppressing transcription of prenylated enzyme gene As a method of suppressing transcription of prenylated enzyme gene, the transcription promoter region of prenylated enzyme gene in the target strain or cell is replaced with a transcription repressing promoter. And a method of culturing the mutant cell under transcriptional repression conditions. Specifically, a transcriptional promoter for the GAL1 gene can be used as a transcriptional repression promoter. In this case, the transcriptional repression can be achieved by culturing in a glucose-containing medium.
また、プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、菌体又は細胞におけるプレニル化酵素遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該菌体又は細胞を培養しても良い。 In addition, as a method for suppressing transcription of the prenylating enzyme gene, a mutant strain or cell prepared by inserting a base sequence having transcription inhibiting activity into a region involved in transcription of the prenylating enzyme gene in a cell or cell is prepared. The cells or cells may be cultured.
さらに、本発明においては、プレニル化酵素遺伝子の転写の抑制には、プレニル化酵素遺伝子の転写時期を改変することも含む。例えば、遺伝子の転写時期を改変するには、時期特異的に発現するプロモーターを使用することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエの場合には、培養後期に転写活性を高めるためにＡＣＳ１、ＡＬＤ２などのプロモーターに置換することができる。一方、培養初期の転写活性を高めるためには、ＴＨ１２、ＡＤＥ１などのプロモーターに置換することができる。これにより、菌体又は細胞をある程度増殖させた培養中後期において、プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制することが可能となる。このようにプレニル化酵素の発現時期を改変することは、プレニル化タンパク質の存在が特に重要な菌体又は細胞において有用である。 Furthermore, in the present invention, suppression of transcription of the prenylated enzyme gene includes modification of the transcription time of the prenylated enzyme gene. For example, in order to modify the transcription time of a gene, a promoter that is expressed in a time-specific manner can be used. For example, in the case of Saccharomyces cerevisiae, it can be replaced with a promoter such as ACS1 or ALD2 in order to increase transcriptional activity in the later stage of culture. On the other hand, in order to increase the transcriptional activity at the initial stage of culture, it can be replaced with a promoter such as TH12, ADE1. This makes it possible to suppress the transcription of the prenylated enzyme gene in the later stage of culture in which the cells or cells are grown to some extent. Modifying the expression time of prenylated enzyme in this way is useful in cells or cells where the presence of prenylated protein is particularly important.
（４）プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法
また、プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスＲＮＡを用いる方法が挙げられる。すなわち、プレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを転写する遺伝子を、菌体又は細胞のゲノムに組み込み、当該アンチセンスＲＮＡを過剰発現させることで、プレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。アンチセンスＲＮＡに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳動物（マウス）、昆虫（線虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１９６６−１９７０；Ａｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６９，３００７−３０１２；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，５６９−５９７；Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１，１０９４−１０９９；Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ，３７，４２９−３６；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４３１３−４３１７；Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２４，１０７９−８６）。
(4) Method for suppressing translation of prenylated enzyme gene As a method for suppressing translation of prenylated enzyme gene, a method using so-called antisense RNA can be mentioned. That is, by integrating a gene that transcribes an antisense RNA against mRNA of a prenylated enzyme gene into the genome of a cell or cell and overexpressing the antisense RNA, translation of the mRNA of the prenylated enzyme gene is suppressed. . The technology relating to antisense RNA is known not only when Escherichia coli, which is a bacterium, but also higher organisms such as mammals (mouse), insects (Drosophila melanogaster) and angiosperms (tomatoes) are used as hosts ( Mizuno et al. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81, 1966-1970; Aiba et al. (1987) J. Bacteriol, 169, 3007-3012; Green et al. (1986) Annu. Rev. Biochem., 55, 569-597; Harland et al. (1985) J. Cell. Biol., 101, 1094-1099, Coleman et al. (1984) Cell, 37, 429-36; (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4313-4317; Hackett et al. (2000) Plant Physiol., 124, 1079-86).
また、プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を利用することも可能である。具体的には、標的とするプレニル化酵素遺伝子の塩基配列に相補的な二本鎖ＲＮＡを菌体又は細胞内に導入すると、内在性のプレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその菌体又は細胞でのプレニル化酵素遺伝子発現が特異的に抑制されることとなる。この手法は、最初に線虫で報告され、その後ショウジョウバエ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、植物、哺乳動物細胞などにおいても確認されている（Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１８，２４４−２５１（ｒｅｖｉｅｗ）；特表２００２−５１６０６２号公報；特表平８−５０６７３４号公報）。 In addition, RNA interference can be used to suppress translation of the prenylating enzyme gene. Specifically, when a double-stranded RNA complementary to the base sequence of the target prenylating enzyme gene is introduced into a cell or cell, the mRNA of the endogenous prenylating enzyme gene is degraded, and as a result, Prenylation enzyme gene expression in the cells or cells will be specifically suppressed. This technique was first reported in C. elegans and subsequently confirmed in C. elegans, plants, mammalian cells, etc. (Hannon, GJ., Nature (2002) 418, 244-251 (review)). ; Japanese translations of PCT publication No. 2002-516062; Japanese translations of PCT publication No. 8-506734).
上記（１）〜（４）の方法において、使用可能な菌体又は細胞は、プレニルアルコール及び／又はスクアレンを生合成する代謝経路を有する、すなわちプレニルアルコール及び／又はスクアレン生産能を有する菌体又は細胞であれば特に限定されない。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、デバリオマイセス・バンリイアエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、ウィリオプシス・サツルナス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄ ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。また、本方法においては微生物の他、動物細胞及び植物細胞を用いることも可能である。さらに、野生型の菌体又は細胞だけではなく、変異型のものを使用することも可能である。一例として、サッカロミセス・セレビシエＡＨ３ ＡＨＫＵ株（特許文献１及び２参照）を用いることができる。ＡＨ３ ＡＨＫＵ株は、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＢＴＳ１）とファルネシル二リン酸合成酵素（ＥＲＧ２０）との融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ１）をコードする遺伝子を、３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターの下流に連結して形質転換された二倍体酵母であり、プレニルアルコールの生産能が高められている。従って、ＡＨ３ ＡＨＫＵ株は本方法においてプレニルアルコールを製造するために好ましい。 In the above methods (1) to (4), usable cells or cells have a metabolic pathway for biosynthesizing prenyl alcohol and / or squalene, that is, cells having the ability to produce prenyl alcohol and / or squalene or If it is a cell, it will not specifically limit. For example, Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces vanriiae, Williopsis saturnus, and Candida grabrata. In this method, it is also possible to use animal cells and plant cells in addition to microorganisms. Furthermore, it is possible to use not only wild-type cells or cells but also mutant types. As an example, Saccharomyces cerevisiae AH3 AHKU strain (see Patent Documents 1 and 2) can be used. The AH3 AHKU strain contains a gene encoding a fusion protein of geranylgeranyl diphosphate synthase (BTS1) and farnesyl diphosphate synthase (ERG20) and a gene encoding HMG-CoA reductase (HMG1). A diploid yeast transformed by ligation downstream of the promoter of the acid dehydrogenase gene, and the ability to produce prenyl alcohol is enhanced. Therefore, the AH3 AHKU strain is preferred for producing prenyl alcohol in this method.
上記菌体又は細胞を培養するための培地は、特に限定されるものではなく、上述した菌体又は細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば細胞としてサッカロミセス・セレビシエを使用する場合には、グルコース及び大豆油を添加したＹＰＤ培地を使用することができる。 The medium for culturing the cells or cells is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of the cells or cells described above. For example, when Saccharomyces cerevisiae is used as a cell, a YPD medium supplemented with glucose and soybean oil can be used.
また、培地中には、エタノールを添加することが好ましい。エタノールを添加した培地によれば、プレニルアルコール及びスクアレンの生産効率が向上することとなる。 Moreover, it is preferable to add ethanol in a culture medium. According to the culture medium to which ethanol is added, the production efficiency of prenyl alcohol and squalene is improved.
さらに、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、プレニルアルコール及びスクアレンの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンＸ−３０５、スパン８５、アデカノールＬＧ−１０９（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９４（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９７（旭電化製）、アデカノールＢ−３００９Ａ（旭電化製）、アデカプロニックＬ−６１（旭電化製）
Furthermore, the production efficiency of prenyl alcohol and squalene can be further increased by adding terpenoids, fats and oils, surfactants and the like to the medium, and increasing the concentration of nitrogen source and carbon source in the medium. The following can be illustrated as these additives.
Terpenoids: squalene, tocopherol, IPP, DMAPP
Fats and oils: soybean oil, fish oil, almond oil, olive oil Surfactants: Taditol, Triton X-305, Span 85, Adecanol LG-109 (Asahi Denka), Adecanol LG-294 (Asahi Denka), Adecanol LG-295S ( Asahi Denka), Adecanol LG-297 (Asahi Denka), Adecanol B-3009A (Asahi Denka), Adekapronic L-61 (Asahi Denka)
テルペノイド濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、油脂濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、界面活性剤濃度は０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。 The terpenoid concentration is 0.01% (w / v) or more, preferably 1 to 3% (w / v), and the fat concentration is 0.01% (w / v) or more, preferably 1 to 3% (w / V), and the surfactant concentration is 0.005 to 1% (w / v), preferably 0.05 to 0.5% (w / v).
また、培地は、エタノール及び／又は脂質を含有するものであってもよい。エタノールは、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは０．５〜５％、最も好ましくは１〜３％の濃度で含有する。脂質としては、例えばパルミチン酸を挙げることができ、培地中に、例えば０．１〜５％の濃度で含有する。 Moreover, the culture medium may contain ethanol and / or lipid. Ethanol is preferably contained at a concentration of 0.1 to 10%, more preferably 0.5 to 5%, and most preferably 1 to 3%. Examples of lipids include palmitic acid, which is contained in the medium at a concentration of 0.1 to 5%, for example.
また特に本発明に係るプレニルアルコールの製造方法においては、菌体又は細胞を、スクアレン合成酵素活性を低下させた条件下で培養してもよい。スクアレン合成酵素活性を低下させると、ファルネシル二リン酸を基質としたスクアレンの合成が阻害され、結果としてプレニルアルコールの生産が促進される。スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、上述したプレニル化酵素活性を低下させる場合と同様な方法を使用することができる。すなわち、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下としては、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法、スクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法、またさらにはスクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法が挙げられる。 In particular, in the method for producing prenyl alcohol according to the present invention, the cells or cells may be cultured under conditions where squalene synthase activity is reduced. When squalene synthase activity is reduced, synthesis of squalene using farnesyl diphosphate as a substrate is inhibited, and as a result, production of prenyl alcohol is promoted. As conditions for reducing the squalene synthase activity, the same method as that for reducing the prenylated enzyme activity described above can be used. That is, the conditions for reducing the activity of squalene synthase include a method of suppressing transcription of squalene synthase gene, a method of suppressing translation of squalene synthase gene, and a method of further adding a squalene synthase inhibitor to the medium. Is mentioned.
また、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、ＷＯ０２／０５３７４７号パンフレットに開示されている方法を、菌体又は細胞に適用することができる。 Moreover, about the method which suppresses transcription | transfer of a squalene synthetase gene, and the method which suppresses translation of a squalene synthetase gene, the method currently disclosed by WO02 / 053747 pamphlet can be applied to a microbial cell or a cell.
スクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、ＳＱＡＤ（特表平８−５０８２４５号公報）、ＢＳＭ−１８７７４５（Ｔｏｘｉ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍ．１４５，９１−９８（１９８７））、ＥＲ−２７８５６（Ｊ．ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４４，１２８−１３５（２００２））等の合成品の他、カビ類が生産するｚａｒａｇｏｚｉｃ ａｃｉｄ（Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１１，２７９−３０２（１９９４））を挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを使用した場合、ＳＱＡＤの添加量は、菌体又は細胞を培養する培地中に５〜２００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。 Examples of squalene synthase inhibitors include SQAD (Japanese Patent Publication No. 8-508245), BSM-187745 (Toxi. Appl. Pharm. 145, 91-98 (1987)), ER-27856 (J. lipid. In addition to synthetic products such as Res.44, 128-135 (2002)), zaragozic acid (Nat. Prod. Rep. 11, 279-302 (1994)) produced by fungi can be mentioned. When SQAD is used as a squalene synthase inhibitor, the amount of SQAD added is preferably 5 to 200 mg / L in the culture medium for culturing cells or cells.
一方、スクアレン合成酵素活性を低下させることによって、ファルネシル二リン酸を基質としたスクアレンの合成が阻害されることとになる。スクアレン合成酵素活性を低下させた場合、細胞においてエルゴステロール生合成が抑制されるため、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。エルゴステロールを含む培地を用いるか、エルゴステロールを培地に追添加することによって、エルゴステロール生合成阻害による細胞の生育阻害等を防止することができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを用いた場合、エルゴステロールの添加量は、１〜１００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。 On the other hand, by reducing the squalene synthase activity, the synthesis of squalene using farnesyl diphosphate as a substrate is inhibited. When squalene synthase activity is reduced, ergosterol biosynthesis is suppressed in the cells. Therefore, it is preferable to use a medium containing ergosterol or to add a necessary amount of ergosterol to the medium. By using a medium containing ergosterol or additionally adding ergosterol to the medium, cell growth inhibition due to inhibition of ergosterol biosynthesis can be prevented. When SQAD is used as a squalene synthase inhibitor, the amount of ergosterol added is preferably 1 to 100 mg / L.
菌体又は細胞を培養する条件は、特に限定されるものではなく、使用する菌体又は細胞の種類、及び使用する培地などに応じて適宜設定することができる。例えば、細胞としてサッカロミセス・セレビシエ（又はその変異株）を使用し、培地としてグルコース及び大豆油を添加したＹＰＤ培地を使用する場合には、約２０〜４０℃、好ましくは３０℃にて、約１２時間〜１４日、好ましくは４日間培養する。 The conditions for culturing cells or cells are not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of cells or cells used, the medium used, and the like. For example, when Saccharomyces cerevisiae (or a mutant thereof) is used as the cell and a YPD medium supplemented with glucose and soybean oil is used as the medium, it is about 20 to 40 ° C., preferably at 30 ° C., about 12 Incubate for a period of time to 14 days, preferably 4 days.
以上のように、プレニル化酵素活性を低下させた条件下で菌体又は細胞を培養することによって、得られる培養物からプレニルアルコール及びスクアレンを優れた生産性で採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。 As described above, prenyl alcohol and squalene can be collected from the obtained culture with excellent productivity by culturing the cells or cells under conditions where the prenylation enzyme activity is reduced. “Culture” means not only the culture supernatant but also cultured cells or cultured cells per se or disrupted cells or cells.
本方法においては、プレニルアルコール及びスクアレンを高収率で生産することができる。なお、プレニルアルコール及びスクアレンを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、プレニルアルコール又はスクアレンが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりプレニルアルコール又はスクアレンを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、プレニルアルコール又はスクアレンが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコール又はスクアレンを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。 In this method, prenyl alcohol and squalene can be produced in high yield. In addition, a jar fermenter culture apparatus etc. can also be used in order to culture prenyl alcohol and squalene in large quantities. When prenyl alcohol or squalene is produced in the cells or cells after culturing, prenyl alcohol or squalene is collected by crushing the cells or cells by applying a homogenizer treatment or the like. Alternatively, the cells may be directly extracted with an organic solvent or the like without disrupting the cells. Alternatively, when prenyl alcohol or squalene is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, prenyl alcohol or squalene is collected from the culture by extraction with an organic solvent or the like, and can be further isolated and purified using various chromatographies and the like as necessary.
図１に示した代謝経路から判るように、プレニルアルコールは、プレニル二リン酸（ＦＰＰ，ＧＧＰＰ）から合成される。この代謝経路においては、プレニル化酵素もプレニル二リン酸を基質として利用し、プレニル化タンパク質を合成する。したがって、上述したようにプレニル化酵素活性を低下させた場合、プレニル化酵素によるプレニル二リン酸の消費が抑えられ、アルキルホスファターゼの作用によりプレニル二リン酸からプレニルアルコールが生成される反応がより強く進行することとなる。例えば、ファルネシル二リン酸からファルネソール（ＦＯＨ）が生成される反応、ＦＯＨからネロリドール（ＮＯＨ）が生成される反応、ゲラニルゲラニル二リン酸からゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）が生成される反応が強く進行することとなる。その結果、プレニルアルコールの生産効率が向上することとなる。 As can be seen from the metabolic pathway shown in FIG. 1, prenyl alcohol is synthesized from prenyl diphosphate (FPP, GGPP). In this metabolic pathway, prenylated enzymes also use prenyl diphosphate as a substrate to synthesize prenylated proteins. Therefore, when the prenylated enzyme activity is reduced as described above, the consumption of prenyl diphosphate by the prenylated enzyme is suppressed, and the reaction in which prenyl alcohol is generated from the prenyl diphosphate by the action of the alkyl phosphatase is stronger. Will progress. For example, the reaction in which farnesol (FOH) is produced from farnesyl diphosphate, the reaction in which nerolidol (NOH) is produced from FOH, and the reaction in which geranylgeraniol (GGOH) is produced from geranylgeranyl diphosphate proceed strongly. It becomes. As a result, the production efficiency of prenyl alcohol is improved.
またプレニル二リン酸が蓄積すると、プレニル二リン酸を原料とするテルペノイド類の合成を増加させることができる。例えば、ステロール、カロチノイド、ビタミンＫ類などがこれに該当するが、特にステロールの前駆体であるスクアレンの合成増加を促進できる。 In addition, accumulation of prenyl diphosphate can increase the synthesis of terpenoids using prenyl diphosphate as a raw material. For example, sterols, carotenoids, vitamin Ks, and the like fall under this, and in particular, it is possible to promote an increase in the synthesis of squalene, which is a sterol precursor.
一般に、アミノ酸を始めとする生育上極めて重要な一次代謝産物では、当該産物の合成反応に直接関与する遺伝子を強化又は抑制することによって、当該産物の生産性を向上させる試みが行われ成果を出している。しかしながら、プレニルアルコール及びスクアレン等の二次代謝産物においては、その合成経路の強化又は抑制を行っても、原料物質が一次代謝産物等の合成に消費されることが多く、生産性を向上させることが困難である。例えば、単にアセチル−ＣｏＡの生産を亢進しても、プレニルアルコール及びスクアレンの生合成が強化される蓋然性は低いといえる。 In general, for primary metabolites that are extremely important for growth, including amino acids, attempts have been made to improve the productivity of the product by enhancing or suppressing genes directly involved in the synthesis reaction of the product. ing. However, in secondary metabolites such as prenyl alcohol and squalene, even if the synthesis pathway is strengthened or suppressed, the raw material is often consumed for the synthesis of the primary metabolites, etc., which improves productivity. Is difficult. For example, it can be said that even if the production of acetyl-CoA is merely increased, the probability that the biosynthesis of prenyl alcohol and squalene is enhanced is low.
本発明においては、プレニル二リン酸が関与する様々な代謝経路の中で、特にプレニル二リン酸をプレニル化タンパク質に変換するプレニル化酵素活性を低下させ、プレニルアルコール及びスクアレンへの変換反応を亢進することで、プレニルアルコール及びスクアレンの生産性を向上させることができる。 In the present invention, among various metabolic pathways involving prenyl diphosphate, in particular, the prenylated enzyme activity for converting prenyl diphosphate into a prenylated protein is decreased, and the conversion reaction to prenyl alcohol and squalene is enhanced. By doing so, the productivity of prenyl alcohol and squalene can be improved.
以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, although this method is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
〔参考例〕
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＢＴＳ１）とファルネシル二リン酸合成酵素（ＥＲＧ２０）との融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ１）をコードする遺伝子を、３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターの下流に連結し、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）において発現させた。具体的な手順を以下に示す。
（１）遺伝子取得
（１−Ａ）ファルネシルピロリン酸合成酵素遺伝子（ＦＰＳ）ＥＲＧ２０のクローニング
サッカロミセス・セレビシエＤＢＹ７４６由来のｃＤＮＡライブラリー“Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ”（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を鋳型として用い、以下の条件でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した：
プライマー１（SCFPS1）：5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3'（配列番号１）
プライマー２（SCFPS 2）：5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3'（配列番号２）
[Reference example]
A gene encoding a fusion protein of geranylgeranyl diphosphate synthase (BTS1) and farnesyl diphosphate synthase (ERG20) and a gene encoding HMG-CoA reductase (HMG1) are triphosphate dehydrogenase genes And was expressed in yeast (Saccharomyces cerevisiae). The specific procedure is shown below.
(1) Gene acquisition (1-A) Cloning of farnesyl pyrophosphate synthase gene (FPS) ERG20 PCR was performed under the following conditions using a cDNA library "Quick-Clone cDNA" (Clonetech) derived from Saccharomyces cerevisiae DBY746 as a template. (Polymerase chain reaction) was performed:
Primer 1 (SCFPS1): 5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3 '(SEQ ID NO: 1)
Primer 2 (SCFPS 2): 5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3 '(SEQ ID NO: 2)
１０×ＥｘＴａｑバッファー（タカラバイオ） ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ ４μｌ
５Ｕ／μｌ ＥｘＴａｑ（タカラバイオ） １μｌ
１０ｐｍｏｌ プライマー１
１０ｐｍｏｌ プライマー２
計５０μｌにする
10 × ExTaq buffer (Takara Bio) 5 μl
2.5 mM dNTPmix 4 μl
5 U / μl ExTaq (Takara Bio) 1 μl
10 pmol primer 1
10
Total 50 μl
上記反応液を用い、９４℃にて４５秒、５５℃にて１分及び７２℃にて２分を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。なお、後述するＰＣＲ反応は特別な記載がない限り上記と同様の条件で行った。増幅したＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）へＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。サッカロミセス・セレビシエゲノムデータベース（http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/）にあるＥＲＧ２０の塩基配列と比較したところエラーはなかった。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＥＲＧ２０とした。 Using the above reaction mixture, 30 cycles of PCR reaction were performed with 94 ° C. for 45 seconds, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes as one cycle. The PCR reaction described below was performed under the same conditions as described above unless otherwise specified. The amplified PCR fragment was purified by agarose gel electrophoresis and then cloned into pT7Blue-T (Novagen) by T / A ligation. There was no error when compared with the base sequence of ERG20 in the Saccharomyces cerevisiae genome database (http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/). The prepared plasmid DNA was designated as pT7ERG20.
（１−Ｂ）ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素遺伝子ＢＴＳ１のクローニング
以下のプライマーを用いて上記ＥＲＧ２０の場合と同様にＰＣＲ反応を行った：
プライマー３：5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3'（配列番号３）
プライマー４：5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3'（配列番号４）
(1-B) Cloning of geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene BTS1 A PCR reaction was performed in the same manner as in the case of ERG20 using the following primers:
Primer 3: 5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3 '(SEQ ID NO: 3)
Primer 4: 5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3 '(SEQ ID NO: 4)
ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。増幅した約１．０ｋｂの断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターにＴ／Ａクローニングし、ＢＴＳ１領域の塩基配列を決定した。その結果、ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html）のＢＴＳ１配列と完全に一致し、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子であることを確認した。次にＢＴＳ１遺伝子がクローニングされたｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターをＢａｍＨ１とＳａｌＩで消化し、ＢＴＳ１遺伝子を含むＢａｍＨ１−ＳａｌＩフラグメントをｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに導入した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６と命名した。 For PCR, Perfect Match (Stratagene) was used. The amplified fragment of about 1.0 kb was T / A cloned into the pT7Blue-T vector, and the base sequence of the BTS1 region was determined. As a result, the BTS1 sequence of GenBank (http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html) was completely matched and confirmed to be a gene derived from Saccharomyces cerevisiae. Next, the pT7Blue-T vector in which the BTS1 gene was cloned was digested with BamH1 and SalI, and the BamH1-SalI fragment containing the BTS1 gene was introduced into the BamHI and XhoI sites of the pYES2 vector (manufactured by Invitrogen). The prepared plasmid DNA was named pYES-GGPS6.
（１−Ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１のクローニング
以下のプライマーを用いて上記ＥＲＧ２０の場合と同様にＰＣＲ反応を行った：
プライマー５：5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3'（配列番号５）
プライマー６：5'-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3'（配列番号６）
(1-C) Cloning of HMG-CoA reductase gene HMG1 A PCR reaction was carried out in the same manner as in ERG20 above using the following primers:
Primer 5: 5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3 '(SEQ ID NO: 5)
Primer 6: 5'-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3 '(SEQ ID NO: 6)
ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。増幅した約３．２ｋｂの断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターにＴ／Ａクローニングし、ＨＭＧ１領域の塩基配列を決定した。その結果、ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html）に登録されているサッカロミセス・セレビシエ由来のＨＭＧ１遺伝子配列と比較したところ１２ヶ所で違いが見られた。この内の３ヶ所はアミノ酸配列に影響する変異であった（Ｓ６８Ｆ、Ｌ６０７Ｓ、Ｈ９０９Ｒ）。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＨＭＧ１とした。 For PCR, Perfect Match (manufactured by Stratagene) was used. The amplified fragment of about 3.2 kb was T / A cloned into the pT7Blue-T vector, and the base sequence of the HMG1 region was determined. As a result, when compared with the HMG1 gene sequence derived from Saccharomyces cerevisiae registered in GenBank (http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html), differences were found in 12 places. Three of these were mutations affecting the amino acid sequence (S68F, L607S, H909R). The prepared plasmid DNA was designated as pT7HMG1.
次にＰＣＲエラーを修正するため、ｐＴ７ＨＭＧ１をＳｍａ１、ＡｐａＬ１、Ｓａｌ１で切断し、３．２ｋｂｐ断片をアガロース電気泳動で調製した。この断片をｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＳｍａ１−Ｓａｌ１部位に挿入し、ｐＡＬＨＭＧ１を作製した。ｐＡＬＨＭＧ１をアルカリ変性後、下記変異導入オリゴ、Ａｍｐ ｒｅｐａｉｒ ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｔｅｔ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をアニーリングさせた。大腸菌ＥＳ１３０１株（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入後、１２５μｇ／ｍｌアンピシリンで部位特異的変異が導入されたプラスミドを保持する形質転換体を集積培養し、プラスミドＤＮＡを調製した。 Next, in order to correct the PCR error, pT7HMG1 was cleaved with Sma1, ApaL1, and Sal1, and a 3.2 kbp fragment was prepared by agarose electrophoresis. This fragment was inserted into the Sma1-Sal1 site of the pALTER-1 (Promega) vector to prepare pALHMG1. After pALHMG1 was alkali-denatured, the following mutagenesis oligo, Amp repair oligo (Promega), and Tet knockout oligo (Promega) were annealed. After introduction into Escherichia coli ES1301 strain (Promega), a transformant carrying a plasmid having a site-specific mutation introduced with 125 μg / ml ampicillin was accumulated and cultured to prepare plasmid DNA.
プライマー７：5'-CCA AAT AAA GAC TCC AAC ACT CTA TTT-3'（配列番号７）
プライマー８：5'-GAA TTA GAA GCA TTA TTA AGT AGT GGA-3'（配列番号８）
プライマー９：5'-GGA TTT AAC GCA CAT GCA GCT AAT TTA-3'（配列番号９）
得られたプラスミドのＤＮＡ配列を解析したところ修正されていた。このプラスミドをｐＡＬＨＭＧ１０６とした。
Primer 7: 5'-CCA AAT AAA GAC TCC AAC ACT CTA TTT-3 '(SEQ ID NO: 7)
Primer 8: 5'-GAA TTA GAA GCA TTA TTA AGT AGT GGA-3 '(SEQ ID NO: 8)
Primer 9: 5'-GGA TTT AAC GCA CAT GCA GCT AAT TTA-3 '(SEQ ID NO: 9)
When the DNA sequence of the obtained plasmid was analyzed, it was corrected. This plasmid was designated as pALHMG106.
（２）ベクターの構築
（２−Ａ）ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃの作製（ｐＲＳベクターへＣＹＣ１ｔ断片の挿入）
ＣＹＣ１転写ターミネーターＣＹＣ１ｔ断片はＰＣＲで調製した。以下の組み合わせのプライマーを用いてＰＣＲ行った。
(2) Construction of vector (2-A) Preparation of pRS405Tcyc and pRS404Tcyc (insertion of CYC1t fragment into pRS vector)
The CYC1 transcription terminator CYC1t fragment was prepared by PCR. PCR was performed using the following combinations of primers.
（イ）ＣＹＣ１ｔ−ＸＫ
XhoI-Tcyc1FW：5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3'（配列番号１０）
KpnI-Tcyc1RV：5'CAT TAG GTA CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3'（配列番号１１）
（ロ）ＣＹＣ１ｔＸＡ
XhoI-Tcyc1FW：5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3'（配列番号１２）
ApaI-Tcyc1RV：5'CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3'（配列番号１３）
(I) CYC1t-XK
XhoI-Tcyc1FW: 5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3 '(SEQ ID NO: 10)
KpnI-Tcyc1RV: 5'CAT TAG GTA CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3 '(SEQ ID NO: 11)
(B) CYC1tXA
XhoI-Tcyc1FW: 5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3 '(SEQ ID NO: 12)
ApaI-Tcyc1RV: 5'CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3 '(SEQ ID NO: 13)
ＰＣＲ条件：
鋳型 ：ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）０．１μｇ
プライマー：５０ｐｍｏｌ プライマーＤＮＡ
反応液 ：１×ｐｆｕバッファー（ＭｇＳＯ4添加）（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１０ｎｍｏｌ ｄＮＴＰ
１．５μ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１μｌ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む５０μｌ溶液
反応 ：９５℃にて２分→（９５℃４５秒、６０℃３０秒、７２℃１分）×３０サイクル→７２℃５分→４℃ストック
PCR conditions:
Template: pYES2 (manufactured by Invitrogen) 0.1 μg
Primer: 50 pmol primer DNA
Reaction solution: 1 × pfu buffer (MgSO 4 added) (Promega)
10 nmol dNTP
1.5μ Pfu DNA polymerase (Promega)
1 μl perfect match polymerase enhancer
50 μl solution reaction containing (Stratagene): 2 minutes at 95 ° C. → (95 ° C. 45 seconds, 60 ° C. 30 seconds, 72 ° C. 1 minute) × 30 cycles → 72 ° C. 5 minutes → 4 ° C. stock
上記（イ）及び（ロ）の条件で増幅したＤＮＡをそれぞれ、ＸｈｏＩとＫｐｎＩ、又は、ＸｈｏＩとＡｐａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で２６０ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ＣＹＣ１ｔ−ＸＫ及びＣＹＣ１ｔＸＡとした。ｐＲＳ４０５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ部位にＣＹＣ１ｔ−ＸＫを、ｐＲＳ４０４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＸｈｏＩ−ＡｐａＩ部位にＣＹＣ１ｔＸＡを挿入し、それぞれｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃとした。 The DNA amplified under the conditions (a) and (b) above was cleaved with XhoI and KpnI, or XhoI and ApaI, and a 260 bp DNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis to obtain CYC1t-XK and CYC1tXA. . CYC1t-XK was inserted into the XhoI-KpnI site of pRS405 (manufactured by Stratagene), and CYC1tXA was inserted into the XhoI-ApaI site of pRS404 (manufactured from Stratagene) to obtain pRS405Tcyc and pRS404Tcyc, respectively.
（２−Ｂ）ＴＤＨ３ｐの作製（転写プロモーターの調製）
サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ゲノムＤＮＡを酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製し、同ゲノムを鋳型としたＰＣＲを行い、ＴＤＨ３ｐ（ＰＧＫ）プロモーターを含むＤＮＡ断片を調製した。
(2-B) Production of TDH3p (Preparation of transcription promoter)
Saccharomyces cerevisiae YPH499 (manufactured by Stratagene) genomic DNA was prepared with a yeast genomic DNA preparation kit "Gentoru-kun" (manufactured by Takara Bio), PCR was performed using the same genome as a template, and DNA containing the TDH3p (PGK) promoter Fragments were prepared.
ＤＮＡプライマー １００ｐｍｏｌ
SacI-Ptdh3FW：5'CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA 3'（配列番号１４）
SacII-Ptdh3RV：5'CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC 3'（配列番号１５）
鋳型：サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ゲノムＤＮＡ０．４６μｇ
反応溶液：１×ＥｘＴａｑバッファー（Ｔａｋａｒａ）
２０ｎｍｏｌｄＮＴＰ
０．５μＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）
１μｌ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー
を含む１００μｌ溶液
反応：９５℃２分→（９５℃４５秒、６０℃１分、７２℃２分）×３０サイクル→７２℃４分→４℃ストック
増幅したＤＮＡをＳａｃＩとＳａｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で６８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製しＴＤＨ３ｐとした。
DNA primer 100 pmol
SacI-Ptdh3FW: 5'CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA 3 '(SEQ ID NO: 14)
SacII-Ptdh3RV: 5'CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC 3 '(SEQ ID NO: 15)
Template: Saccharomyces cerevisiae YPH499 (manufactured by Stratagene) Genomic DNA 0.46 μg
Reaction solution: 1 × ExTaq buffer (Takara)
20 nmold NTP
0.5 μExTaq DNA polymerase (Takara)
1 μl perfect match polymerase enhancer
100 μl solution reaction containing: 95 ° C. 2 minutes → (95 ° C. 45 seconds, 60 ° C. 1 minute, 72 ° C. 2 minutes) × 30 cycles → 72 ° C. 4 minutes → 4 ° C. Stock Amplified DNA was cleaved with SacI and SacII, A 680 bp DNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis to obtain TDH3p.
（２−Ｃ）２μＯｒｉＳＮの作製（２μＤＮＡ複製開始領域の調製）
ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＳｓｐＩとＮｈｅＩで切断後２μＤＮＡ複製開始点（２μｏｒｉ）を含む１．５ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、このＤＮＡ断片を２μＯｒｉＳＮとした。
(2-C) Preparation of 2 μOriSN (Preparation of 2 μDNA replication initiation region)
After cutting pYES2 (manufactured by Invitrogen) with SspI and NheI, a 1.5 kbp fragment containing 2 μDNA replication origin (2 μori) was purified by agarose gel electrophoresis, blunt-ended with Klenow enzyme, and this DNA fragment was designated as 2 μOriSN.
（２−Ｄ）ｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰの作製（ＹＥｐ型発現ベクターの作製）
ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃを、ＢＡＰ（細菌アルカリホスファターゼ，Ｔａｋａｒａ）処理したＮａｅＩ部位に２μＯｒｉＳＮを挿入し、大腸菌ＳＵＲＥ２に形質転換後、プラスミドＤＮＡを調製した。これを、ＤｒａＩＩＩとＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、又は、ＰｓｔＩとＰｖｕＩＩにより切断後、アガロースゲル電気泳動し、２μｏｒｉの挿入とその向きをチェックした。作製したｐＲＳ４０４ Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５ Ｔｃｙｃに、ｐＹＥＳ２と同じ向きに２μｏｒｉが挿入されたプラスミドをそれぞれｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μＯｒｉとした。
(2-D) Preparation of pRS434GAP and pRS435GAP (Preparation of YEp type expression vector)
After pRS404Tcyc and pRS405Tcyc were treated with BAP (bacterial alkaline phosphatase, Takara), 2 μOriSN was inserted into the NaeI site and transformed into E. coli SURE2, and plasmid DNA was prepared. This was cleaved with DraIII and EcoRI, HpaI, or PstI and PvuII, and then subjected to agarose gel electrophoresis to check the insertion of 2 μori and its orientation. The plasmids in which 2 μori was inserted in the same direction as pYES2 into the prepared pRS404 Tcyc and pRS405 Tcyc were designated as pRS434Tcyc2μOri and pRS435Tcyc2μOri, respectively.
ｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μＯｒｉのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位に転写プロモーターを含む断片ＴＤＨ３ｐを挿入し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰをそれぞれ得た。 A fragment TDH3p containing a transcription promoter was inserted into the SacI-SacII site of pRS434Tcyc2μOri and pRS435Tcyc2μOri to obtain pRS434GAP and pRS435GAP, respectively.
（３）融合遺伝子の作製
（３−Ａ）ｐＲＳ４３５ＧＧＦ（ＦＰＳ−ＧＧＰＳ融合タンパク遺伝子）の作製
ＧＧＰＳ遺伝子ＢＴＳ１を組み込んだｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６と、ＦＰＳ遺伝子ＥＲＧ２０を組み込んだｐＴ７−ＥＲＧ２０を鋳型に用い、以下の条件でＰＣＲを行った：
（イ）ＰＣＲ１
鋳型 ：ｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６
プライマー１：SacII-BTS1：5'TCC (CCG CGG) ATG GAG GCC AAG ATA GAT 3'（配列番号１６）
プライマー２：BTSI-109I：5'GCA [GGG ACC C]CA ATT CGG ATA AGT GGT C 3'（配列番号１７）
（ロ）ＰＣＲ２
鋳型 ：pT7-ERG20
プライマー１：109I-ERG20：5'GTA [GGG TCC T]CA GAA AAA GAA ATT AGG AG 3'（配列番号１８）
プライマー２：-21：5'TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3'（配列番号１９）
(3) Preparation of fusion gene (3-A) Preparation of pRS435GGF (FPS-GGPS fusion protein gene) Using pYES-GGPS6 incorporating GGPS gene BTS1 and pT7-ERG20 incorporating FPS gene ERG20 as templates, the following PCR was performed under conditions:
(A) PCR1
Mold: pYES-GGPS6
Primer 1: SacII-BTS1: 5'TCC (CCG CGG) ATG GAG GCC AAG ATA GAT 3 '(SEQ ID NO: 16)
Primer 2: BTSI-109I: 5′GCA [GGG ACC C] CA ATT CGG ATA AGT GGT C 3 ′ (SEQ ID NO: 17)
(B) PCR2
Template: pT7-ERG20
Primer 1: 109I-ERG20: 5′GTA [GGG TCC T] CA GAA AAA GAA ATT AGG AG 3 ′ (SEQ ID NO: 18)
Primer 2: -21: 5'TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3 '(SEQ ID NO: 19)
括弧内はベクター連結用のＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩ又はＸｂａＩ認識部位で、四角括弧内は融合遺伝子作製用のＥｃｏＯ１０９Ｉ認識部位を示す）
反応液：１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓバッファー（Ｔｏｙｏｂｏ）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．２５ｍＭ ＭｇＳＯ4
１５ｐｍｏｌプライマー１
１５ｐｍｏｌプライマー２
０．０１〜０．１μｇ鋳型ＤＮＡ
１ｕＫＯＤ−ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）
（５０μｌ反応カクテル中）ＫＯＤ−Ｐｌｕｓには１．６μｇ／μｌのＫＯＤ抗体が含まれている。
反応条件：９４℃−２分の後、９４℃−１５秒，５５℃−３０秒，６８℃−１分を３０サイクルし、６８℃−２分保温
(In parentheses are SacII, XhoI or XbaI recognition sites for ligation of vectors, and square brackets indicate EcoO109I recognition sites for fusion gene production)
Reaction solution: 1 × KOD-Plus buffer (Toyobo)
0.2 mM dNTPs
0.25 mM MgSO 4
15 pmol primer 1
15
0.01-0.1 μg template DNA
1uKOD-Plus DNA polymerase (Toyobo)
(In 50 μl reaction cocktail) KOD-Plus contains 1.6 μg / μl of KOD antibody.
Reaction conditions: 94 ° C. for 2 minutes, 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 1 minute for 30 cycles, and 68 ° C. for 2 minutes incubation
上記（イ）及び（ロ）で得られた反応産物をそれぞれ＃９及び＃１１とした。＃９及び＃１１を制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉで消化後ライゲーションし、この溶液をＰＣＲの鋳型とし、さらに上記ＳａｃＩＩ−ＢＴＳ１と−２１をプライマーとし、同様の条件で２ｎｄＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片＃９−＃１１を得た。 The reaction products obtained in (i) and (b) above were designated as # 9 and # 11, respectively. # 9 and # 11 were digested with the restriction enzyme EcoO109I and ligated, and this solution was used as a PCR template, and 2nd PCR was carried out under the same conditions using the above SacII-BTS1 and -21 as primers. DNA fragment # 9- # 11 Got.
２ｎｄＰＣＲ産物＃９−＃１１をＳａｃＩＩとＢａｍＨＩで切断後、ｐＲＳ４３５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＲＳ４３５ＧＧＦとした。 The 2nd PCR product # 9- # 11 was cleaved with SacII and BamHI, and then inserted into the SacII-BamHI site of pRS435GAP to obtain pRS435GGF.
（４）ＨＭＧ１遺伝子発現ベクターの作製
ｐＡＬＨＭＧ１０６をＳｍａＩとＳａｌＩで切断後、アガロース電気泳動で３．２ｋｂのＨＭＧ１遺伝子断片を精製した。これをｐＲＳ４３４ＧＡＰのＳｍａＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１を得た。
(4) Preparation of HMG1 gene expression vector After cutting pALHMG106 with SmaI and SalI, a 3.2-kb HMG1 gene fragment was purified by agarose electrophoresis. This was inserted into the SmaI-SalI site of pRS434GAP to obtain pRS434GAP-HMG1.
（５）遺伝子導入酵母の非栄養要求性二倍体化
（Ａ−１）野生型Ｈｉｓ３フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した。
プライマー１（His3-L）：5'-TTT TAA GAG CTT GGT GAG CGC-3'（配列番号２０）
プライマー２（His3-R）：5'-TCG AGT TCA AGA GAA AAA AAA-3'（配列番号２１）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、３０ｎｇ
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃１０分でＰＣＲ反応を行った。
(5) Non-auxotrophic diploidization of transgenic yeast (A-1) Amplification of wild-type His3 fragment Next, PCR was performed under the following conditions (100 μl).
Primer 1 (His3-L): 5'-TTT TAA GAG CTT GGT GAG CGC-3 '(SEQ ID NO: 20)
Primer 2 (His3-R): 5'-TCG AGT TCA AGA GAA AAA AAA-3 '(SEQ ID NO: 21)
1 x Pyrobest buffer (Takara Bio)
200 μM dNTPmix
0.4 μM DNA primer 2.5 U Pyrobest (manufactured by Takara Bio Inc.)
Template: pRS403 (manufactured by Stratagene), 30 ng
PCR reaction was performed at 94 ° C. for 1 minute, 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 2 minutes) × 30 cycles at 72 ° C. for 10 minutes using the above reaction solution.
（Ａ−２）野生型Ａｄｅ２フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（Ade 1）：5'-ATG GAT TCT AGA ACA GTT GGT-3'（配列番号２２）
プライマー２（Ade 2）：5'-TTA CTT GTT TTC TAG ATA AGC-3'（配列番号２３）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃７分でＰＣＲ反応を行った。
(A-2) Amplification of wild-type Ade2 fragment Next, PCR was carried out under the following conditions (100 μl):
Primer 1 (Ade 1): 5'-ATG GAT TCT AGA ACA GTT GGT-3 '(SEQ ID NO: 22)
Primer 2 (Ade 2): 5'-TTA CTT GTT TTC TAG ATA AGC-3 '(SEQ ID NO: 23)
1 x Pyrobest buffer (Takara Bio)
200 μM dNTPmix
0.4 μM DNA primer 2.5 U Pyrobest (manufactured by Takara Bio Inc.)
Template: Saccharomyces cerevisiae A451 (ATCC 200589), 0.05 μg, prepared with a yeast genomic DNA preparation kit “Gentori-kun” (manufactured by Takara Bio Inc.) Using the above reaction solution, 94 ° C. for 1 minute, (94 ° C. for 30 seconds, 55 The PCR reaction was performed at 30 ° C. for 7 minutes and 72 ° C. for 7 minutes.
（Ａ−３）野生型Ｕｒａ３フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（URA3-L）：5'-TTC AAT TCA TCA TTT TTT TTT-3'（配列番号２４）
プライマー２（URA3-R）：5'-GGG TAA TAA CTG ATA TAA TTA-3'（配列番号２５）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５０℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃、７分でＰＣＲ反応を行った。
(A-3) Amplification of wild-type Ura3 fragment Next, PCR was carried out under the following conditions (100 μl):
Primer 1 (URA3-L): 5'-TTC AAT TCA TCA TTT TTT TTT-3 '(SEQ ID NO: 24)
Primer 2 (URA3-R): 5'-GGG TAA TAA CTG ATA TAA TTA-3 '(SEQ ID NO: 25)
1 x Pyrobest buffer (Takara Bio)
200 μM dNTPmix
0.4 μM DNA primer 2.5 U Pyrobest (manufactured by Takara Bio Inc.)
Template: Saccharomyces cerevisiae A451 (ATCC 200589), 0.05 μg, prepared with a yeast genomic DNA preparation kit “Gentori-kun” (manufactured by Takara Bio) 94 ° C. for 1 minute (94 ° C. for 30 seconds, 50 PCR reaction was performed at 30 ° C. for 7 minutes and 72 ° C. for 7 minutes.
（Ａ−４）野生型Ｌｙｓ１フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（Lys 1）：5'-ATG ACT AAC GAA AAG GTC TGG-3'（配列番号２６）
プライマー２（Lys 2）：5'-TAA AGC TGC TGC GGA GCT TCC-3'（配列番号２７）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５８℃１分、７２℃４分）×３０サイクル、７２℃７分でＰＣＲ反応を行った。
(A-4) Amplification of wild-type Lys1 fragment Next, PCR was carried out under the following conditions (100 μl):
Primer 1 (Lys 1): 5'-ATG ACT AAC GAA AAG GTC TGG-3 '(SEQ ID NO: 26)
Primer 2 (Lys 2): 5'-TAA AGC TGC TGC GGA GCT TCC-3 '(SEQ ID NO: 27)
1 x Pyrobest buffer (Takara Bio)
200 μM dNTPmix
0.4 μM DNA primer 2.5 U Pyrobest (manufactured by Takara Bio Inc.)
Template: Saccharomyces cerevisiae A451 (ATCC 200589), 0.05 μg, prepared with a yeast genomic DNA preparation kit “Gentori-kun” (manufactured by Takara Bio Inc.) Using the above reaction solution, 94 ° C. for 1 minute, (94 ° C. for 30 seconds, 58 The PCR reaction was performed at 30 ° C. for 7 minutes and 72 ° C. for 7 minutes.
（Ｂ）ＹＨ１−ＡＨ株の作製
凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１をサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入し、酵母を形質転換した。ｐＲＳ４３５ＧＧＦが導入されればロイシン非要求性に、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１が導入されればトリプトファン非要求性になることから、アデニン、ヒスチジン、リジン及びウラシルを含む酵母最少栄養培地ＤＯＢ（ＢＩＯ１０１社製）プレートで生育する株を取得した。２つのベクターが導入された株をＹＨ１株と命名した。次に、アデニンとヒスチジン要求性をなくすため野生型のＨｉｓ３、Ａｄｅ２遺伝子を相同組換えで染色体ＤＮＡ上に組み込むことにした。前項（Ａ−１）及び（Ａ−２）においてＰＣＲ増幅したＨｉｓ３、Ａｄｅ２フラグメントを凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて順次導入、形質転換し、酵母最少栄養培地を用い、アデニン、ヒスチジン非要求性になった株を取得した。同株をＹＨ１−ＡＨ株と命名した。
(B) Preparation of YH1-AH strain pRS435GGF and pRS434GAP-HMG1 were introduced into Saccharomyces cerevisiae YPH499 (Stratagene) with a frozen EZ yeast transformation kit (Zymoresearch) to transform the yeast. When pRS435GGF is introduced, it becomes leucine non-required, and when pRS434GAP-HMG1 is introduced, tryptophan becomes non-required. Therefore, in yeast minimal nutrient medium DOB (BIO101) containing adenine, histidine, lysine and uracil. A growing strain was obtained. The strain into which the two vectors were introduced was designated as YH1 strain. Next, in order to eliminate the requirement for adenine and histidine, it was decided to integrate wild-type His3 and Ade2 genes into chromosomal DNA by homologous recombination. The His3 and Ade2 fragments PCR-amplified in the preceding paragraphs (A-1) and (A-2) were sequentially introduced and transformed using a frozen EZ yeast transformation kit (manufactured by Zymoresearch), and adenine was used using a yeast minimal nutrient medium. Acquired a histidine non-requiring strain. This strain was named YH1-AH strain.
（Ｃ）ＹＰＨ５００−ＫＵ株の作製
前項（Ｂ）と同様にしてサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００（ＡＴＣＣ２０４６８０）株をウラシル、リジン非要求性にした。前項（Ａ−３）及び（Ａ−４）においてＰＣＲ増幅したＵｒａ３、Ｌｙｓ１フラグメントを凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて順次導入、形質転換し、酵母最少栄養培地を用い、ウラシル、リジン非要求性になった株を取得した。同株をＹＰＨ５００−ＫＵ株と命名した。
(C) Preparation of YPH500-KU strain The Saccharomyces cerevisiae YPH500 (ATCC204680) strain was made uracil and lysine non-requiring in the same manner as in the previous section (B). The Ura3 and Lys1 fragments PCR-amplified in the preceding paragraphs (A-3) and (A-4) were sequentially introduced and transformed using a frozen EZ yeast transformation kit (manufactured by Zymoresearch), and uracil was used using a yeast minimal nutrient medium. Acquired a strain that became non-lysine lysine. This strain was designated as YPH500-KU strain.
（Ｄ）ＹＨ３−ＡＨＫＵ株作製
ＹＨ１−ＡＨ株とＹＰＨ５００−ＫＵ株を、イーストエクストラクト５ｇ／Ｌ、モルトエクストラクト５ｇ／Ｌ、バクトペプトン１０ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌを含む培地（ＹＰＤ７）で３０℃にて、それぞれ一晩振とう培養した。両株の培養液２００μｌずつを混合し（ほぼ同じＯＤ６００ｎｍになるよう液量を調整）、新しいＹＰＤ７培地を加え、さらに一晩振とう培養した。培養液を生理食塩水で希釈してＤＯＢプレート（ＢＩＯ１０１社製）にまき、コロニーを取得した。二倍体化された株は栄養要求性が相補され、最少培地のＤＯＢプレートで生育するようになる。
(D) YH3-AHKU strain production YH1-AH strain and YPH500-KU strain were prepared in a medium (YPD7) containing yeast extract 5 g / L, malt extract 5 g / L, bactopeptone 10 g / L, glucose 5 g / L. Each was cultured overnight at 30 ° C. with shaking. 200 μl of the culture solutions of both strains were mixed (the liquid volume was adjusted so as to be approximately the same OD 600 nm), a new YPD7 medium was added, and further cultured with shaking overnight. The culture solution was diluted with physiological saline and plated on a DOB plate (manufactured by BIO101) to obtain colonies. The diploid strain is complemented by auxotrophy and grows on DOB plates with minimal media.
二倍体化していることを確認するため得られたコロニーをＹＰＤ７培地で液体培養した後、前胞子形成培地に全量をプレーティングし３０℃で一晩培養した。
＜前胞子形成培地＞
０．８％イーストエクストラクト
０．３％ポリペプトン
１０％グルコース
２％アガロース
The colonies obtained to confirm that they were diploid were liquid cultured in YPD7 medium, and then the entire amount was plated on a prespore-forming medium and cultured at 30 ° C. overnight.
<Prespore formation medium>
0.8% yeast extract 0.3% polypeptone 10
次に、前胞子形成培地で生育した菌体を以下に示す胞子形成培地に塗布した。このとき約１ｃｍ四方に厚めに菌を塗った。室温で３日間置いた後、位相差顕微鏡で胞子形成を確認したところ、約２０％近くが四胞子を形成しており、二倍体化されていることが確認できた。このようにして得られた二倍体栄養非要求性株をＹＨ３−ＡＨＫＵ株と命名した。 Next, the cells grown in the pre-spore formation medium were applied to the spore formation medium shown below. At this time, the bacteria were applied thickly about 1 cm square. After leaving at room temperature for 3 days, spore formation was confirmed by phase contrast microscopy, and nearly 20% formed tetraspores, confirming diploidization. The diploid non-auxotrophic strain thus obtained was named YH3-AHKU strain.
＜胞子形成培地＞
０．１％イーストエクストラクト
１％酢酸カリウム
０．０５％グルコース
２％アガロース
<Spore formation medium>
0.1% yeast extract 1% potassium acetate 0.05
〔実施例１〕プレニルアルコール及びスクアレン産生
本実施例においては、参考例で作製したＡＨ３ ＡＨＫＵ株を用いて、プレニル化酵素阻害剤の存在下におけるそれらのプレニルアルコール及びスクアレン産生能について試験した。
[Example 1] Production of prenyl alcohol and squalene In this example, the AH3 AHKU strain prepared in Reference Example was used to test the ability to produce prenyl alcohol and squalene in the presence of a prenylated enzyme inhibitor.
上記ＡＨ３ ＡＨＫＵ株を、６％グルコース、１％大豆油を含む２ｍｌのＹＰＤ培地（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ）１３−１参照）において３０℃にて４日間培養した。また、培養開始時と培養２日目に、ゲラニルゲラニル化酵素阻害剤であるＮ−アセチル−Ｓ−ゲラニル−Ｌ−システイン（ＧＣ）又はファルネシル化酵素阻害剤であるα−ヒドロキシファルネシルフォスフォン酸（ＨＦＰ）を、０．００２２５％又は０．０２２５％で培地に添加した。 The AH3 AHKU strain was cultured at 30 ° C. for 4 days in 2 ml of YPD medium (see Short Protocols in molecular biology (WILEY) 13-1) containing 6% glucose and 1% soybean oil. Further, N-acetyl-S-geranyl-L-cysteine (GC), which is a geranylgeranylase inhibitor, or α-hydroxyfarnesylphosphonic acid (HFP), which is a farnesylase inhibitor, at the start of culture and on the second day of culture. ) Was added to the medium at 0.00225% or 0.0225%.
培養終了後、培養液２ｍｌを採取し、これにメタノール１．２ｍｌ及びペンタン２ｍｌを添加した。その後、培養液を十分に攪拌し、ペンタン相を成分分析に供した。成分分析は、以下の条件で行った。分析装置は、ヒューレットパッカード社製ＨＰ６８９０／５９７３ ＧＣ／ＭＳシステムを用いた。 After completion of the culture, 2 ml of the culture solution was collected, and 1.2 ml of methanol and 2 ml of pentane were added thereto. Thereafter, the culture solution was sufficiently stirred, and the pentane phase was subjected to component analysis. Component analysis was performed under the following conditions. As the analyzer, HP6890 / 5973 GC / MS system manufactured by Hewlett-Packard Company was used.
インレット温度：２５０℃
ディテクター温度：２６０℃
ＭＳゾーン温度
ＭＳ Ｑｕａｄ：１５０℃
ＭＳ Ｓｏｕｒｃｅ：２３０℃
スキャンパラメーター
Ｌｏｗ Ｍａｓｓ：３５
Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓ：２００
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：４０
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：２μｌ
洗浄回数：メタノールで３回、ヘキサンで２回
スプリット比：１：２０
カラム：ヒューレットパッカード社製ＨＰ−５ＭＳ（０．２５ｍｍ×３０Ｍ、フィルム厚０．２５μｍ）
キャリアーガス：１ヘリウム１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ソルベントディレイ：２ｍｉｎ
オ一ブン昇温条件：ｌ１５℃、１．５分保持→７０／分で２５０℃まで昇温、２分保持→７０／分で３００℃まで昇温、７分保持
ポストタイム：０
内部標準：１−ウンデカノール／エタノール溶液（１μｌ／ｍｌ）を各バイアルに１０μ１添加
注入口ライナー：スプリット／スプリットレス ライナー
解析：ＴＩＣを取り込んだ後、６９マスをセレクションし１ウンデカノール（ＲＴ＝３．３９ｍｉｎ）、ネロリドール（ＲＴ＝３．８６ｍｉｎ）、ファルネソール（ＲＴ＝４．２３ｍｉｎ）、ゲラニルゲラニオ一ル（ＲＴ＝５．７８ｍｉｎ）のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
Inlet temperature: 250 ° C
Detector temperature: 260 ° C
MS zone temperature MS Quad: 150 ° C
MS Source: 230 ° C
Scan parameter Low Mass: 35
High Mass: 200
Threshold: 40
Injection parameter Mode: Automatic injection Sample volume: 2μl
Number of washings: 3 times with methanol, 2 times with hexane Split ratio: 1:20
Column: HP-5MS (0.25 mm × 30 M, film thickness 0.25 μm) manufactured by Hewlett-Packard Company
Carrier gas: 1 helium 1.0ml / min
Solvent delay: 2 min
Oven temperature rise condition: 115 ° C., hold for 1.5 minutes → heat to 250 ° C. at 70 / min, hold for 2 minutes → heat to 300 ° C. at 70 / min, hold for 7 minutes Post time: 0
Internal standard: 10 μl of 1-undecanol / ethanol solution (1 μl / ml) added to each vial Inlet liner: Split / splitless liner Analysis: After taking in TIC, 69 masses were selected and 1 undecanol (RT = 3.39 min) ), Nerolidol (RT = 3.86 min), farnesol (RT = 4.23 min), and geranylgeraniol (RT = 5.78 min). Quantified from the peak area ratio of the internal standard undecanol.
また、培養終了後、菌数を測定した。培養液１００μｌを生理食塩水で１〜２０倍に希釈し、血球計（林理化学）で細胞数を計測した。０．０６ｍｍ四方（最少グリット９つ分）の菌数を４平均し、以下の式から培養液１Ｌ当りの菌数を算出した。
菌数（１０9／培地１ｌ）＝０．４４４×（０．０６ｍｍ四方の菌体数）×希釈倍率
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。
Moreover, the number of bacteria was measured after completion | finish of culture | cultivation. 100 μl of the culture solution was diluted 1 to 20 times with physiological saline, and the number of cells was counted with a hemocytometer (Hayashiri Chemical). The average number of bacteria in 0.06 mm square (for 9 minimum grids) was averaged, and the number of bacteria per liter of culture was calculated from the following formula.
For the number of bacteria (10 9 / medium 1l) = 0.444 × (0.06mm cell number of square) × dilution factor each strain, Table 1 shows the results of results and measuring the number of bacteria in component analysis of the culture.
表１から判るように、ＨＦＰ又はＧＣを培養開始時又は培養中に培地に添加して培養することにより、ネロリドール（ＮＯＨ）、ファルネソール（ＦＯＨ）及びゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）の各プレニルアルコール、及びスクアレン（ＳＱ）の生産が上昇した。具体的には、培養開始時にＨＦＰ又はＧＣを添加した場合、ＮＯＨは約１．０〜１．６倍、ＦＯＨは約１．０〜２．０倍、ＧＧＯＨは約０．８５〜１．４倍、ＳＱは約１．０〜１．７倍に上昇した。また培養２日目にＨＦＰ又はＧＣを添加した場合、ＮＯＨは約１．１〜１．３倍、ＦＯＨは約１．１〜１．５倍、ＧＧＯＨは約１．１〜１．２倍、ＳＱは約１．１〜１．３倍に上昇した。この結果より、ＧＧＯＨの生産効率を上げることを目的とする場合には、培養開始直後ではなく、培養開始から所定期間経過後にプレニル化酵素阻害剤を添加することが好ましいことがわかる。 As can be seen from Table 1, each of the prenyl alcohols of nerolidol (NOH), farnesol (FOH) and geranylgeraniol (GGOH) is obtained by adding HFP or GC to the medium at the start of culture or during culture, and Squalene (SQ) production increased. Specifically, when HFP or GC is added at the start of culture, NOH is about 1.0 to 1.6 times, FOH is about 1.0 to 2.0 times, and GGOH is about 0.85 to 1.4 times. Doubled, SQ rose to about 1.0-1.7 times. When HFP or GC is added on the second day of culture, NOH is about 1.1 to 1.3 times, FOH is about 1.1 to 1.5 times, GGOH is about 1.1 to 1.2 times, SQ rose about 1.1 to 1.3 times. From these results, it can be seen that, when the purpose is to increase the production efficiency of GGOH, it is preferable to add a prenylating enzyme inhibitor not only immediately after the start of culture but after a predetermined period of time has elapsed since the start of culture.
以上のように、プレニル化酵素阻害剤を添加した培地で酵母を培養することによりプレニルアルコール及びスクアレンの生産効率を向上させることができる。 As described above, the production efficiency of prenyl alcohol and squalene can be improved by culturing yeast in a medium to which a prenylating enzyme inhibitor is added.
以上、詳細に説明したように、本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、細胞におけるプレニルアルコール及びスクアレンの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコール及びスクアレンを優れた生産性で製造できる。 As described above in detail, in the method for producing prenyl alcohol according to the present invention, the productivity of prenyl alcohol and squalene in cells can be improved, and prenyl alcohol and squalene useful in various fields are excellently produced. Can be manufactured by sex.
配列番号１〜２７ 合成オリゴヌクレオチド SEQ ID NOs: 1-27 synthetic oligonucleotides
Claims (8)
培養物中からプレニルアルコールを回収する
プレニルアルコールの製造方法。 Culturing cells or cells under conditions that reduce prenylated enzyme activity,
A method for producing prenyl alcohol, wherein prenyl alcohol is recovered from a culture.
培養物中からスクアレンを回収する
スクアレンの製造方法。
Culturing cells or cells under conditions that reduce prenylated enzyme activity,
A method for producing squalene, comprising recovering squalene from a culture.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003306876A JP2005073550A (en) | 2003-08-29 | 2003-08-29 | Method for producing prenyl alcohol |
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| JP (1) | JP2005073550A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009532377A (en) * | 2006-03-31 | 2009-09-10 | アルコン リサーチ， リミテッド | Prenyltransferase inhibitors for the control of ocular hypertension and the treatment of glaucoma |
-
2003
- 2003-08-29 JP JP2003306876A patent/JP2005073550A/en active Pending
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