JP2005013105A

JP2005013105A - Gene involved in acetic acid tolerance, acetic acid bacteria bred using the gene, and method for producing vinegar using the acetic acid bacteria

Info

Publication number: JP2005013105A
Application number: JP2003182932A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Nakano; 繁中野
Original assignee: Mizkan Group Corp
Current assignee: Mizkan Group Corp
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2005-01-20

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new acetic acid-tolerant gene, to breed acetic acid bacteria enhanced in acetic acid tolerance using the gene, to provide a method for improving the acetic acid tolerance of microorganisms belonging to acetic acid bacteria, and to provide a method for efficiently producing vinegar of high acetic acid concentration using the acetic acid bacteria with improved acetic acid tolerance. <P>SOLUTION: The new gene comprises a DNA encoding the following protein(A) or (B): (A) a protein having an amino acid sequence shown by the Sequence No.2 or (B) a protein having an amino acid sequence with one or several amino acids substituted, deleted, inserted, added or inverted in the above-amino acid sequence and having the function of enhancing acetic acid tolerance. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酢酸耐性微生物に関し、より具体的には、微生物に由来する酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子のコピー数を増幅した微生物、及びこれらの微生物を用いて食酢を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
【０００３】
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００４】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００５】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
このうち、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、また、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
【０００７】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍＩＦＯ３２８８）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ＡＬＤＨはアセトアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００９】
このような実情から、酢酸菌の酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を分離、及びこの酢酸耐性遺伝子を用いてより強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【００１０】
【特許文献１】
特開平３−２１９８７８号公報
【特許文献２】
特開平２−２３６４号公報
【非特許文献１】
Ｆｕｋａｙａ，Ｍ．ら、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１７２巻，ｐ．２０９６−２１０４，１９９０年
【非特許文献２】
Ｆｕｋａｙａ，Ｍ．ら、「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，７６巻，ｐ．２７０−２７５，１９９３年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、酢酸耐性が増強された酢酸菌を育種すること、酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が増強された酢酸菌を用いて、高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が存在するとの仮説を立て、この遺伝子の単離を試みたところ、かかる新規な遺伝子を単離することに成功した。またこの酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用することによって、微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する従来得ることのできなかった新規食酢を効率的に製造することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は以下の（１）〜（８）である。
（１）下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質
（２）下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質
（３）下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２０１〜６４６からなる塩基配列を含むＤＮＡ
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２０１〜６４６からなる塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２０１〜６４６からなる塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
（４）上記（２）又は（３）のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）上記（４）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（６）上記（２）又は（３）のＤＮＡからのコピー数が細胞内において増幅されていることを特徴とする酢酸耐性が増強された微生物。
上記微生物としては、例えばアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が挙げられる。
【００１５】
（７）上記（６）の微生物をアルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
（８）上記（７）の食酢製造方法により得られる、酢酸を高濃度に含む食酢。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離
本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を単離する方法を開発し、そのような機能を有する遺伝子の単離を試みた。この単離方法においては、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて酢酸菌を形質転換し、通常寒天培地上で１％の酢酸の存在下でしか生育できない酢酸菌を、２％の酢酸の存在下でも生育可能な酢酸菌株をスクリーニングすることによって、該酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を単離する。
【００１７】
この方法を、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌に適用したところ、実用レベルで酢酸耐性を向上させる機能を有する遺伝子をクローニングすることに初めて成功した。
【００１８】
得られた酢酸耐性遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索した結果、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａｃｏｌｉ）で見出されているｏｍｐＲ遺伝子やヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）のｏｍｐＲ遺伝子などによってコードされる一群のタンパク質とある程度の相同性を有しており、酢酸菌のｏｍｐＲ遺伝子であると推定された。
【００１９】
また、大腸菌のｏｍｐＲ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで２８％の、またヘリコバクター・ピロリのｏｍｐＲ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで２８％の相同性があり、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、他の原核生物のｏｍｐＲ遺伝子とはある程度は似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（以下、タンパク質ＯＭＰＲともいう）をコードする新規遺伝子（以下、ｏｍｐＲ遺伝子ともいう）であることが確認された。
【００２０】
本発明において、ｏｍｐＲ遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換して作製した、コピー数を増幅させた形質転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上した。従って、ｏｍｐＲ遺伝子が確かに酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードし、該タンパク質の機能を発揮するように発現していることが確認できた。以上から、本発明者は、このｏｍｐＲ遺伝子のコピー数を増幅させた微生物を用いることにより、高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できると考えた。
【００２１】
２．本発明のＤＮＡ及びタンパク質
本発明のＤＮＡは、酢酸菌に由来するｏｍｐＲ遺伝子及び該遺伝子の調節配列をコードするものであり、また酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードしている（配列番号２）。
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
【００２２】
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓＭＨ−２４）株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、昭和５９年２月２３日に、ＦＥＲＭＢＰ−４９１として寄託されている）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）により取得することができる。
【００２３】
次に、ｏｍｐＲ遺伝子を単離するために、上述のように得られた染色体ＤＮＡから染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
【００２４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）を温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００２５】
次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えベクターを得る。
染色体ＤＮＡから染色体ＤＮＡライブラリーを作製する方法は当技術分野で公知であり（例えばショットガン法）、上述した方法に限定されるものではない。
【００２６】
得られた組換えベクターを用いて、通常は寒天培地上で１％よりも高濃度の酢酸の存在下では増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉＮｏ．１０２３）株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、昭和５８年６月２７日に、ＦＥＲＭＢＰ−２２８７として寄託されている）を形質転換し、その後２％酢酸含有寒天培地に塗布し、培養する。生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで酢酸耐性遺伝子ｏｍｐＲを含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、その内、塩基番号２１０〜６４６からなる塩基配列はコード領域であり、配列番号２に示すタンパク質をコードするものである。
【００２８】
配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列（図２：配列番号１の塩基番号２１０〜６４６に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａｃｏｌｉ）のｏｍｐＲ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで２８％の、またヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）のｏｍｐＲ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで２８％の相同性を示し、タンパク質ＯＭＰＲをコードする遺伝子であることが推定されたが、いずれも３０％以下の低い相同性であり、これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
【００２９】
本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡがコードするｏｍｐＲ遺伝子の塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）によって、又は該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。そのようなプライマー又はプローブとしての機能を有する、ｏｍｐＲ遺伝子の一部の配列から作製されたＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。具体的には、限定されるものではないが、配列番号３及び４に示す配列からなるＤＮＡは、本発明においてプライマーとして使用することができる。ここで「プライマー又はプローブとしての機能を有する」とは、プライマー又はプローブとして使用することが可能な塩基配列の長さ、塩基配列の塩基組成などを有することを意味し、このようなプライマー又はプローブとして機能するＤＮＡの設計は当業者に周知である。
【００３０】
ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３１】
また、本発明のＯＭＰＲタンパク質は、上記ＤＮＡによりコードされるものであり、具体的には配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むものである。配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、酢酸耐性を増強する機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異が生じてもよい。
【００３２】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。
【００３３】
上記のような変異アミノ酸配列を含む酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、公知の突然変異処理によっても取得することができる。
【００３４】
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明のＤＮＡの変異型であって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするものを合成することもできる。なお、ＤＮＡ、すなわち遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（タカラバイオ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（タカラバイオ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはＣｈｅｎＫ，ａｎｄＡｒｎｏｌｄＦＨ．１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：５６１８−５６２２を、またＤＮＡシャッフリングについてはＳｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１及びＳｔｅｍｍｅｒＷ．Ｐ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１０７４７−１０７５１を参照されたい。
【００３５】
ここで、本発明において「酢酸耐性を増強する機能」とは、高濃度の酢酸の存在下における微生物の増殖の促進や死滅を抑制する機能を指す。上述のようにして変異を導入した遺伝子が酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするか否かは、実施例に示すように、酢酸を含有する培地での生育の有無を判別することにより確認することができる。
【００３６】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００３７】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基配列番号２０１〜６４６からなる塩基配列又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする核酸を単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一の、すなわち酢酸耐性を増強する機能を保持するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有する核酸同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００３８】
３．本発明の酢酸耐性微生物
本発明のＤＮＡは、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＯＭＰＲをコードするため、本発明のＤＮＡを利用して、高濃度酢酸存在下における増殖が促進された、すなわち酢酸耐性が増強された微生物を作製することができる。
【００３９】
微生物における酢酸耐性の増強は、例えば、組換えベクターにｏｍｐＲ遺伝子を連結し、該ベクターを用いて微生物を形質転換することによって、該遺伝子の細胞内でのコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子と微生物中で効率よく機能するプロモーター配列とを連結した組換えベクターを用いて該微生物を形質転換することによって、該遺伝子からのコピー数を増幅して発現を増強することにより行うことができる。
【００４０】
本発明の組換えベクターは、前項「２．本発明のＤＮＡ及びタンパク質」に記載したＯＭＰＲタンパク質をコードするＤＮＡを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを用いてｏｍｐＲ遺伝子が発現し得るように宿主を形質転換することにより得ることができる。
【００４１】
組換えベクターとしては、宿主で自律的に増殖し得るファージミド又はプラスミドを使用することができる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＥＴ１６ｂ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージミドＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０，λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
【００４２】
また、マルチコピーベクター又はトランスポゾンなどを用いて目的のＤＮＡを宿主に導入することもでき、本発明においてはそのようなマルチコピーベクター又はトランスポゾンも本発明の組換えベクターに含まれるものとする。マルチコピーベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，１９８９，１５３−１５８参照）、ｐＭＶ２４（例えば、Ｆｕｋａｙａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，５５：１７１−１７６参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，５２：３１２５−３１２９参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００４３】
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４４】
本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡがコードする遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４５】
また、染色体ＤＮＡ上のｏｍｐＲ遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えるには、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。このようにして微生物における内因性ｏｍｐＲ遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該ｏｍｐＲ遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
【００４６】
形質転換に使用する微生物としては、導入されるＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌、乳酸菌等）、酵母やアスペルギルス属などの真菌が挙げられる。本発明においては、その酢酸耐性を増強するという目的から、微生物としては酢酸菌を使用することが好ましい。酢酸菌の中でも、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する細菌が特に好ましい。
【００４７】
アセトバクター属に属する細菌として、例えば、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭＢＰ−２２８７）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍＩＦＯ３２８８）を用いることができる。
【００４８】
また、グルコンアセトバクター属に属する細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＭ６１６０（ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｕｒｏｐａｅｕｓＤＳＭ６１６０）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）を用いることができる。
【００４９】
酢酸菌を含む細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（例えば、Ｆｕｋａｙａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，４９：２０９１−２０９７参照）、エレクトロポレーション法（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：８１３０−８１３４）等が挙げられる。
【００５０】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００５１】
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す微生物を選択する。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、形質転換体は、少なくとも配列番号１に示す塩基配列を有する核酸を含む組換えベクターであって、例えば、酢酸菌―大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＵＦ１０６に当該核酸を挿入した組換えベクターｐＯＭＰＲ１を、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭＢＰ−２２８７）株に導入することにより得られる。
【００５３】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００５４】
４．食酢製造法
前項「３．本発明の酢酸耐性微生物」に記載のようにして作製される、酢酸耐性を増強する機能を有する遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強された微生物（酢酸菌）であってアルコール酸化能を有するものは、酢酸存在下においても増殖し、さらに酢酸を生産することが可能であるため、食酢の製造に利用することができる。従って、ｏｍｐＲ遺伝子の発現コピー数が増幅された微生物をアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。
【００５５】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえばよく、特に限定されるものではない。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
【００５６】
炭素源としては、グルコースやスクロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００５７】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常培養は１〜２１日間行う。
【００５８】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸耐性を増強する機能を付与することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。このようにして育種された微生物（酢酸菌）は、高濃度酢酸を含有する食酢の製造に有用である。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕グルコンアセトバクター・エンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイの１株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）を、６％酢酸及び４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に記載の染色体ＤＮＡ調製法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して、切断した。得られた断片を適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００６０】
（２）酢酸耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖できないことが知られるアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭＢＰ−２２８７）に形質転換し、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃にて４日間培養した。
【００６１】
生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図１に示した約１．４ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＳ１５と命名した。さらに２％酢酸を含有するＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を生育可能にする断片は、ｐＳ１５にクローン化された約１．４ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片中、約６００ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であることが確認できた。
【００６２】
このようにして通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖できないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、２％酢酸含有寒天培地でも増殖可能とする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００６３】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１に示す塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行ない、配列表にはＥｃｏＲＶ−ＢａｌＩ断片の配列を記載した（配列番号１）。このようにして得られた遺伝子をｏｍｐＲと命名した。
【００６４】
配列番号１に示す塩基配列中には、塩基番号２０１から６４６にかけて、配列番号２に示す１１５個のアミノ酸（図２）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
【００６５】
〔実施例２〕グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株における酢酸耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
実施例１に従ってクローン化されたアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭＢＰ−４９１）由来のｏｍｐＲ遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６（例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ，１９８９，１５３−１５８参照）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した部位に挿入したプラスミドｐＯＭＰＲ１を作製した。ｐＯＭＰＲ１に挿入された増幅断片の概略を図１に示す。
【００６６】
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（５’−ＴＧＴＧＡＣＧＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧ−３’：配列番号３）及びプライマー２（５’−ＣＡＴＣＧＴＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＣＡＧＧＧ−３’：配列番号４）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記のＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、及び６８℃ ３０秒を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００６７】
このｐＯＭＰＲ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、Ｗｏｎｇ，ＨＣ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：８１３０−８１３４参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００６８】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性を増強する機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００６９】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＯＭＰＲ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株を、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育について、シャトルベクターｐＵＦ１０６のみを導入した親株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００７０】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００７１】
その結果、図３に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも増殖が可能であったのに対して、親株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供される。この遺伝子を用いて、高酢酸濃度存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することが可能である。従って、本発明は、高酢酸濃度の食酢を高効率に製造するために有用である。
【００７３】
【配列表】

【００７４】
【配列フリーテキスト】
配列番号３及び４：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓａｕ３ＡＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＳ１５）の制限酵素地図と酢酸耐性遺伝子の位置、及びｐＯＭＰＲ１への挿入断片の概略図である。
【図２】本酢酸耐性遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】酢酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an acetic acid resistant microorganism, and more specifically, a gene encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance derived from a microorganism, a microorganism having an amplified copy number of the gene, and using these microorganisms The present invention relates to a method for producing vinegar.
[0002]
[Prior art]
Acetic acid bacteria are microorganisms widely used for vinegar production, and particularly acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and Glucon acetobacter are used for industrial acetic acid fermentation.
[0003]
In acetic acid fermentation, ethanol in the medium is oxidized by acetic acid bacteria and converted to acetic acid. As a result, acetic acid accumulates in the medium, but acetic acid is also inhibitory to acetic acid bacteria. As the concentration of acetic acid increases and the concentration of acetic acid in the medium increases, the growth ability and fermentation ability of acetic acid bacteria gradually decrease.
[0004]
Therefore, in acetic acid fermentation, it is required that growth ability and fermentation ability do not decrease even at higher acetic acid concentrations, that is, to develop acetic acid bacteria with strong acetic acid resistance. As one means, genes involved in acetic acid resistance are required. Attempts have been made to clone (acetic acid resistant gene) and to breed and improve acetic acid bacteria using the acetic acid resistant gene.
[0005]
As for the knowledge about the acetic acid resistance gene of acetic acid bacteria so far, a cluster is formed as a complementary gene that can restore acetic acid sensitivity by mutating the acetic acid resistance of acetic acid bacteria of Acetobacter genus. Three genes (aarA, aarB, aarC) have been cloned (see, for example, Non-Patent Document 1).
[0006]
Of these, the aarA gene is a gene encoding citrate synthase, and the aarC gene was presumed to be an enzyme encoding an enzyme related to acetate utilization, but the function of the aarB gene is unknown. (For example, refer nonpatent literature 2).
[0007]
A transformant obtained by cloning a gene fragment containing these three acetate resistance genes into a multicopy plasmid and transforming it into an Acetobacter acetic subspecies zylinum IFO3288 (Acetobacteraceti subsp. Xylinum IFO3288) strain is In addition, the improvement level of acetic acid resistance was only slight, and it was unclear as to whether or not there was an improvement in performance in actual acetic acid fermentation (see, for example, Patent Document 1).
[0008]
On the other hand, an example has been disclosed in which the final acetic acid concentration has been improved in acetic acid fermentation by introducing a gene encoding membrane-bound aldehyde dehydrogenase (ALDH) cloned from acetic acid bacteria into acetic acid bacteria. (For example, refer to Patent Document 2). However, since ALDH is an enzyme having a function of oxidizing acetaldehyde and not directly related to acetic acid resistance, it cannot be determined that the gene encoding ALDH is truly an acetic acid resistance gene.
[0009]
From such a situation, a novel acetic acid resistant gene encoding a protein having a function capable of improving acetic acid resistance of acetic acid bacteria at a practical level was isolated, and acetic acid bacteria having stronger acetic acid resistance were isolated using this acetic acid resistant gene. Breeding was desired.
[0010]
[Patent Document 1]
JP-A-3-21878
[Patent Document 2]
JP-A-2-2364
[Non-Patent Document 1]
Fukaya, M .; Et al., “Journal of Bacteriology”, Volume 172, p. 2096-2104, 1990
[Non-Patent Document 2]
Fukaya, M .; Et al., “Journal of Fermentation and Bioengineering”, vol. 76, p. 270-275, 1993
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention obtains a novel acetic acid resistant gene encoding a protein having a function capable of improving acetic acid resistance at a practical level, and uses the obtained acetic acid resistant gene to breed acetic acid bacteria having enhanced acetic acid resistance. Another object of the present invention is to provide a method for improving acetic acid resistance of microorganisms belonging to acetic acid bacteria, and a method for efficiently producing vinegar with high acetic acid concentration using acetic acid bacteria with enhanced acetic acid resistance.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors believe that acetic acid bacteria that can grow and ferment in the presence of acetic acid have a gene encoding a protein having a function of enhancing specific acetic acid resistance that does not exist in other microorganisms. When we hypothesized and tried to isolate this gene, we succeeded in isolating such a novel gene. In addition, by using a gene encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance, it is possible to improve the acetic acid resistance of microorganisms, and further, a novel vinegar containing a high concentration of acetic acid that could not be obtained conventionally. As a result, the present invention has been completed.
[0013]
That is, this invention is the following (1)-(8).
(1) The following protein (A) or (B).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, added or inverted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a function of enhancing acetic acid resistance
(2) DNA encoding the following protein (A) or (B).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, added or inverted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a function of enhancing acetic acid resistance
(3) DNA of the following (A), (B) or (C).
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 201 to 646 among the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(B) A function of hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to the base sequence consisting of base numbers 201 to 646 among the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and enhancing acetate resistance DNA encoding a protein having
(C) Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, it hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence having a function as a primer or probe prepared from a part of the base sequence consisting of base numbers 201-646. DNA encoding a protein that functions as a soybean and enhances acetic acid resistance
[0014]
(4) A recombinant vector comprising the DNA of (2) or (3) above.
(5) A transformant transformed with the recombinant vector of (4) above.
(6) A microorganism with enhanced acetate resistance, wherein the copy number from the DNA of (2) or (3) is amplified in the cell.
Examples of the microorganism include acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter.
[0015]
(7) A method for producing vinegar, wherein the microorganism of (6) is cultured in a medium containing alcohol, and acetic acid is produced and accumulated in the medium.
(8) Vinegar containing acetic acid at a high concentration obtained by the vinegar production method of (7).
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Isolation of a gene encoding a protein having a function of enhancing acetate resistance
The present inventors developed a method for isolating an acetic acid resistant gene from acetic acid bacteria, and attempted to isolate a gene having such a function. In this isolation method, a chromosomal DNA library of acetic acid bacteria is constructed, acetic acid bacteria are transformed using this chromosomal DNA library, and acetic acid that can grow only in the presence of 1% acetic acid on an ordinary agar medium. By screening an acetic acid strain capable of growing in the presence of 2% acetic acid, an acetic acid resistance gene is isolated from the acetic acid bacterium.
[0017]
When this method was applied to acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconacetobacter which is actually used for vinegar production, it succeeded for the first time in cloning a gene having a function of improving acetic acid resistance at a practical level.
[0018]
As a result of homology search in DDBJ / EMBL / GenBank and SWISS-PROT / PIR, the obtained acetic acid resistance gene was found to be found in Escherichia coli ompR gene, Helicobacter pylori ompR gene, etc. It was presumed to be an ompR gene of acetic acid bacteria.
[0019]
Furthermore, the homology was 28% at the amino acid sequence level with the ompR gene of E. coli and 28% at the amino acid sequence level with the ompR gene of Helicobacter pylori, and the degree of homology was very low. Therefore, it is a novel gene (hereinafter also referred to as the ompR gene) that encodes a novel protein specific to acetic acid bacteria (hereinafter also referred to as protein OMPR), although it is somewhat similar to other prokaryotic ompR genes. Was confirmed.
[0020]
In the present invention, acetic acid resistance was remarkably improved in a transformed strain with an amplified copy number produced by ligating the ompR gene to a plasmid vector and transforming it into acetic acid bacteria. Therefore, it has been confirmed that the ompR gene encodes a protein having a function of enhancing acetate resistance and is expressed so as to exert the function of the protein. From the above, the present inventor considered that vinegar having a high acetic acid concentration can be efficiently produced by using a microorganism in which the copy number of the ompR gene is amplified.
[0021]
2. DNA and protein of the present invention
The DNA of the present invention encodes an ompR gene derived from acetic acid bacteria and a regulatory sequence of the gene, and also encodes a protein having a function of enhancing acetic acid resistance (SEQ ID NO: 2).
The DNA of the present invention can be obtained from the chromosomal DNA of Gluconacetobacter entaniii as follows.
[0022]
First, Glucon Acetobacter enterii, for example, Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Independent Administrative Institution National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki 6), and a chromosomal DNA library (deposited as FERM BP-491 on February 23, 1984) is prepared. Chromosomal DNA can be obtained by a conventional method (for example, see JP-A-60-9489).
[0023]
Next, in order to isolate the ompR gene, a chromosomal DNA library is prepared from the chromosomal DNA obtained as described above. First, chromosomal DNA is partially decomposed with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various fragments. A wide variety of restriction enzymes can be used by adjusting the cleavage reaction time to adjust the degree of cleavage. For example, Sau3AI is digested by acting on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C. or higher, preferably 37 ° C., at an enzyme concentration of 1 to 10 units / ml for various times (1 minute to 2 hours).
[0024]
Next, the cleaved chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA capable of autonomous replication in acetic acid bacteria to produce a recombinant vector. Specifically, a restriction enzyme (for example, BamHI) that generates a terminal base sequence complementary to the restriction enzyme Sau3AI used for the cleavage of the chromosomal DNA is obtained under the conditions of a temperature of 30 ° C. and an enzyme concentration of 1-100 units / ml. It is allowed to act on the vector DNA for more than an hour to completely digest it and cleave it.
[0025]
Next, the chromosomal DNA fragment mixture obtained as described above and the cleaved vector DNA were mixed, and this was mixed with T4 DNA ligase at a temperature of 4 to 16 ° C. and an enzyme concentration of 1 to 100 units / ml. The recombinant vector is obtained by allowing to act for more than an hour, preferably 6 to 24 hours.
Methods for preparing a chromosomal DNA library from chromosomal DNA are known in the art (for example, the shotgun method) and are not limited to the methods described above.
[0026]
Using the resulting recombinant vector, acetic acid bacteria that cannot normally grow on an agar medium in the presence of acetic acid at a concentration higher than 1%, such as Acetobacter aceti no. On June 27, 1983, the FERM BP- 2287), and then applied to 2% acetic acid-containing agar medium and cultured. The resulting colony is ingested in a liquid medium and cultured, and a plasmid is recovered from the resulting bacterial cells to obtain a DNA fragment containing the acetic acid resistance gene ompR.
[0027]
Specific examples of the DNA of the present invention include DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and of these, the base sequence consisting of base numbers 210 to 646 is a coding region, and the protein shown in SEQ ID NO: 2 It is what you code.
[0028]
When the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (corresponding to base numbers 210-646 of SEQ ID NO: 1) were homology searched in DDBJ / EMBL / GenBank and SWISS-PROT / PIR, It is 28% homologous to Escherichia coli ompR gene at the amino acid sequence level and 28% homologous to Helicobacter pylori ompR gene at the amino acid sequence level, and encodes the protein OMPR. It was presumed that there was a low homology of 30% or less, and it was clear that they were novel different from these genes.
[0029]
Since the base sequence of the ompR gene encoded by the DNA of the DNA of the present invention has been clarified, for example, an oligonucleotide synthesized based on the base sequence using the genomic DNA of Gluconacetobacter enteriacetic acid as a template Can be obtained by polymerase chain reaction (PCR reaction) using as a primer, or by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence as a probe. DNA prepared from a partial sequence of the ompR gene having the function as such a primer or probe is also included in the DNA of the present invention. Specifically, although not limited, DNA consisting of the sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 can be used as a primer in the present invention. Here, “having a function as a primer or probe” means having the length of a base sequence that can be used as a primer or probe, the base composition of the base sequence, and the like. The design of DNA that functions as is well known to those skilled in the art.
[0030]
For example, DNA (oligonucleotide) can be synthesized according to a conventional method using various commercially available DNA synthesizers. The PCR reaction is carried out using a thermal cycler Gene Amp PCR System 2400 manufactured by Applied Biosystems, TaqDNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and the like. Can be carried out according to the standard method.
[0031]
The OMPR protein of the present invention is encoded by the above DNA, and specifically includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. As long as the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has a function of enhancing acetic acid resistance, substitution, deletion, insertion, addition, and inversion of a plurality of amino acid sequences, preferably one or several amino acids, in the amino acid sequence Etc. may occur.
[0032]
For example, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be deleted, and 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably 1 to Five amino acids may be added, or a protein in which 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids is also included in the protein of the present invention. included.
[0033]
A DNA encoding a protein having a function of enhancing acetic acid resistance including a mutant amino acid sequence as described above is obtained by deleting, substituting, inserting or adding an amino acid at a specific site, for example, by site-directed mutagenesis, or vice versa. It can also be obtained by modifying the base sequence as a position. The modified DNA as described above can also be obtained by a known mutation treatment.
[0034]
In addition, a variant of the DNA of the present invention that encodes a protein having a function of enhancing acetate resistance can be synthesized by site-directed mutagenesis. In order to introduce a mutation into DNA, that is, a gene, a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method, or a method equivalent thereto can be employed. For example, mutation introduction is performed using a mutation introduction kit (for example, Mutan-K (manufactured by Takara Bio Inc.) or Mutan-G (manufactured by Takara Bio Inc.)) using site-directed mutagenesis. Moreover, gene mutation introduction and chimera genes can be constructed by techniques such as error introduction PCR and DNA shuffling. Error introduction PCR and DNA shuffling techniques are known in the art. For example, for error introduction PCR, Chen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 5618-5622, and for DNA shuffling, see Stemmer, W .; P. 1994, Nature, 370: 389-391 and Stemmer W. et al. P. , 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10951.
[0035]
Here, in the present invention, the “function of enhancing acetic acid resistance” refers to a function of suppressing the promotion of growth and death of microorganisms in the presence of a high concentration of acetic acid. Whether or not the gene into which the mutation is introduced as described above encodes a protein having a function of enhancing acetic acid resistance is determined by determining the presence or absence of growth in a medium containing acetic acid, as shown in the Examples. Can be confirmed.
[0036]
In addition, it is generally known that the amino acid sequence of a protein and the base sequence that encodes it are slightly different between species, strains, mutants, and variants, so that DNA encoding substantially the same protein Can be obtained from all species of acetic acid bacteria, especially species, strains, mutants and variants of the genus Acetobacter or Gluconacetobacter.
[0037]
Specifically, from the Acetobacter or Gluconacetobacter acetic acid bacteria, or the mutated Acetobacter or Glucon Acetobacter acetic acid bacteria, natural mutants or variants thereof, for example, the base shown in SEQ ID NO: 1 Among the sequences, a nucleic acid encoding a protein that has a function of enhancing acetic acid resistance by hybridizing with a probe prepared from a base sequence consisting of base sequence numbers 201 to 646 or a part thereof under stringent conditions By doing so, it is possible to obtain a DNA that encodes a protein that is substantially the same as the protein, that is, retains the function of enhancing acetate resistance. The stringent condition referred to here is a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, nucleic acids with high homology, for example, nucleic acids with homology of 70% or more hybridize and nucleic acids with lower homology Examples include conditions that do not hybridize with each other, or normal hybridization washing conditions, such as conditions in which washing is performed at 60 ° C. with a salt concentration corresponding to 0.1% SDS with 1 × SSC.
[0038]
3. Acetic acid resistant microorganism of the present invention
Since the DNA of the present invention encodes a protein OMPR having a function of enhancing acetic acid resistance, the use of the DNA of the present invention promotes growth in the presence of high-concentration acetic acid, that is, a microorganism with enhanced acetic acid resistance Can be produced.
[0039]
Enhancement of acetic acid resistance in a microorganism can be achieved, for example, by linking the ompR gene to a recombinant vector and transforming the microorganism with the vector to amplify the copy number of the gene in the cell, or By transforming the microorganism using a recombinant vector in which the structural gene of the gene and a promoter sequence that functions efficiently in the microorganism are linked, the copy number from the gene is amplified to enhance expression. be able to.
[0040]
The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating the DNA encoding the OMPR protein described in the preceding section “2. DNA and protein of the present invention” to an appropriate vector. It can be obtained by transforming a host so that the ompR gene can be expressed using a recombinant vector.
[0041]
As a recombinant vector, a phagemid or a plasmid capable of autonomously growing in a host can be used. Examples of plasmid DNA include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pET16b, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YCp50, etc.), etc. Examples of the phagemid DNA include λ phage (λgt10, λZAP, etc.). Furthermore, transformants can also be prepared using animal virus vectors such as retrovirus or vaccinia virus, insect virus vectors such as baculovirus, bacterial artificial chromosome (BAC), yeast artificial chromosome (YAC), and the like.
[0042]
In addition, a target DNA can be introduced into a host using a multicopy vector or a transposon. In the present invention, such a multicopy vector or transposon is also included in the recombinant vector of the present invention. Examples of multicopy vectors include pUF106 (see, for example, Fujiwara, M. et al., Cellulose, 1989, 153-158), pMV24 (see, for example, Fukaya, M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55). 171-176), pTA5001 (A), pTA5001 (B) (for example, see JP-A-60-9488) and the like, and pMVL1 (for example, Okumura, H. et al.) Which is a chromosome integration type vector. , Agric. Biol. Chem., 1988, 52: 3125-3129). Examples of transposons include Mu and IS1452.
[0043]
In order to insert the DNA of the present invention into a vector, first, the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector DNA, and linked to the vector. Adopted.
[0044]
The DNA of the present invention needs to be incorporated into a vector so that the function of the gene encoded by the DNA is exhibited. Therefore, in addition to the promoter and the DNA of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like are linked to the recombinant vector of the present invention. be able to. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, a kanamycin resistance gene, a tetracycline resistance gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.
[0045]
In addition, in order to replace the promoter sequence of the ompR gene on the chromosomal DNA with another promoter sequence that functions efficiently in an acetic acid bacterium of the genus Acetobacter or Glucon acetobacter, a vector for homologous recombination is constructed, A vector may be used to cause homologous recombination in the chromosome of the microorganism. Examples of such promoter sequences include ampicillin resistance gene of plasmid pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.) of Escherichia coli, kanamycin resistance gene of plasmid pHSG298 (manufactured by Takara Bio Inc.), and chlorampheny of plasmid pHSG396 (manufactured by Takara Bio Inc.). Examples include promoter sequences derived from microorganisms other than acetic acid bacteria, such as promoters of genes such as call resistance gene and β-galactosidase gene. The construction of a vector for homologous recombination is well known to those skilled in the art. Thus, by placing the endogenous ompR gene in a microorganism under the control of a strong promoter, the copy number from the ompR gene is amplified and expression is enhanced.
[0046]
The microorganism used for transformation is not particularly limited as long as the introduced DNA can be expressed. Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, etc.), fungi such as yeast and Aspergillus. In the present invention, it is preferable to use acetic acid bacteria as the microorganism for the purpose of enhancing the acetic acid resistance. Among the acetic acid bacteria, bacteria belonging to the genus Acetobacter and Glucon acetobacter are particularly preferable.
[0047]
Examples of the bacterium belonging to the genus Acetobacter include Acetobacter aceti, and specifically, for example, Acetobacter aceti No. 1023 strain (FERM BP-2287), Acetobacter aceti subspecies zylinum IFO3288 strain (Acetobacteraceti subsp. Xylinum IFO3288) can be used.
[0048]
Examples of the bacterium belonging to the genus Gluconacetobacter include Gluconacetobacter europaeus DM6160 (Gluconacetobacter europaeus DSM6160), Gluconacetobacter entaniii, and specific examples include Acetobacter Genes MH-24 strain (FERM BP-491) can be used.
[0049]
The method for introducing a recombinant vector into a bacterium containing acetic acid bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into the bacterium. For example, a method using calcium ions (for example, see Fukaya, M. et al., Agric. Biol. Chem., 1985, 49: 2091- 2097), an electroporation method (for example, Wong, H. et al., Proc). Natl.Acad.Sci.USA, 1990, 87: 8130-8134).
[0050]
When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe are used. The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
[0051]
A transformant is selected by utilizing the property of a marker gene constructed in a gene to be introduced. For example, when a neomycin resistance gene is used, a microorganism exhibiting resistance to the G418 drug is selected.
[0052]
In a preferred embodiment of the present invention, the transformant is a recombinant vector containing a nucleic acid having at least the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example, an acetic acid bacteria-Escherichia coli shuttle vector (multicopy vector) pUF106. The recombinant vector pOMPR1 into which A. was inserted was designated as Acetobacter acetti No. It is obtained by introducing into the strain 1023 (FERM BP-2287).
[0053]
In acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter having alcohol oxidizing ability, when the acetic acid resistance is enhanced as described above, the production amount and production efficiency of acetic acid can be increased.
[0054]
4). Vinegar production method
A microorganism (Acetate-tolerant microorganism of the present invention) produced as described in the preceding paragraph, wherein the acetic acid resistance is selectively enhanced by amplifying the copy number of a gene having a function of enhancing acetate resistance ( Acetic acid bacteria) having an ability to oxidize alcohol can proliferate even in the presence of acetic acid, and can further produce acetic acid, and thus can be used for the production of vinegar. Therefore, by culturing a microorganism in which the expression copy number of the ompR gene is amplified in an alcohol-containing medium and accumulating and acetic acid in the medium, vinegar containing high concentration of acetic acid can be efficiently produced.
[0055]
The acetic acid fermentation in the production method of the present invention may be carried out in the same manner as the conventional vinegar production method by the fermentation method of acetic acid bacteria, and is not particularly limited. The medium used for acetic acid fermentation contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, ethanol, and if necessary, if it contains an appropriate amount of nutrient source required for growth by the strain used, it can be a synthetic medium or a natural medium. But it ’s okay.
[0056]
Examples of the carbon source include various carbohydrates including glucose and sucrose, and various organic acids. As the nitrogen source, natural nitrogen sources such as peptone and fermented bacterial cell decomposition products can be used.
[0057]
Cultivation is performed under aerobic conditions such as stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture, and the culture temperature is usually 30 ° C. The pH of the medium is usually in the range of 2.5 to 7, preferably in the range of 2.7 to 6.5, and can be prepared with various acids, various bases, buffers and the like. Usually, culture is performed for 1 to 21 days.
[0058]
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the function which enhances acetic acid tolerance can be provided with respect to microorganisms. And, in microorganisms having alcohol oxidizing ability, especially acetic acid bacteria, the growth function (acetic acid resistance) in the presence of high concentration acetic acid is improved, and the ability to efficiently accumulate high concentration acetic acid in the medium can be given. it can. The microorganisms (acetic acid bacteria) bred in this way are useful for the production of vinegar containing high concentrations of acetic acid.
[0059]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Cloning of acetic acid resistance gene from Gluconacetobacter enterii and determination of base sequence and amino acid sequence
(1) Preparation of chromosomal DNA library
Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491), a strain of Gluconacetobacter enteranie, is added to YPG medium (3% glucose, 0.5% yeast) supplemented with 6% acetic acid and 4% ethanol. (Extract, 0.2% polypeptone) was cultured at 30 ° C. with shaking. After culturing, the culture solution was centrifuged (7,500 × g, 10 minutes) to obtain bacterial cells. Chromosomal DNA was prepared from the obtained bacterial cells according to the chromosomal DNA preparation method described in JP-A-60-9489.
The chromosomal DNA obtained as described above was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI (manufactured by Takara Bio Inc.), and the E. coli-acetic acid shuttle vector pUF106 was completely digested with the restriction enzyme BamHI and cleaved. Appropriate amounts of the resulting fragments were mixed and ligated using a ligation kit (TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2, manufactured by Takara Bio Inc.) to construct a chromosomal Acetobacter / Centani chromosomal DNA library.
[0060]
(2) Cloning of acetic acid resistance gene
Glucon Acetobacter enterii chromosomal DNA library obtained as described above is usually Acetobacter aceti No., which is known to be able to grow up to about 1% acetic acid concentration on an agar medium. The strain 1023 (FERM BP-2287) was transformed and cultured on a YPG agar medium containing 2% acetic acid and 100 μg / ml ampicillin at 30 ° C. for 4 days.
[0061]
The resulting colony was inoculated into a YPG medium containing 100 μg / ml ampicillin and cultured, and the plasmid was recovered from the resulting bacterial cells. As a result, the approximately 1.4 kbp Sau3AI fragment shown in FIG. 1 was cloned. This plasmid was designated pS15. Furthermore, in APG medium containing 2% acetic acid, Acetobacter aceti no. It was confirmed that the fragment allowing the strain 1023 to grow was an approximately 600 bp EcoRV-HindIII fragment in the approximately 1.4 kbp Sau3AI fragment cloned into pS15.
[0062]
In this way, Acetobacter aceti No. 1 which can usually grow on an agar medium only to an acetic acid concentration of about 1%. Acetic acid-resistant gene fragments that enable the 1023 strain to grow on an agar medium containing 2% acetic acid were obtained.
[0063]
(3) Determination of the base sequence of the cloned DNA fragment
The cloned Sau3AI fragment was inserted into the BamHI site of pUC19, and the nucleotide sequence of the fragment was determined by the Sanger dideoxy chain termination method. As a result, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was determined. Sequencing was performed for the entire region of both DNA strands so that all the breakpoints overlapped, and the sequence of the EcoRV-BalI fragment was described in the sequence listing (SEQ ID NO: 1). The gene thus obtained was named ompR.
[0064]
In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the presence of an open reading frame encoding 115 amino acids (FIG. 2) shown in SEQ ID NO: 2 was confirmed from base numbers 201 to 646.
[0065]
[Example 2] Enhancement of acetic acid resistance in a transformant transformed with an acetic acid resistant gene derived from Gluconacetobacter enterii
(1) Transformation to Acetobacter aceti
The ompR gene derived from Acetobacter altoacetylenes MH-24 (FERM BP-491) cloned according to Example 1 was amplified by PCR using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and amplified. The digested DNA fragment was cleaved with an acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector pUF106 (see, for example, Fujiwara, M. et al., CELLULOSE, 1989, 153-158) with the restriction enzyme EcoRI, and inserted into a site blunt-ended with T4 DNA polymerase. Plasmid pOMPR1 was prepared. An outline of the amplified fragment inserted into pOMPR1 is shown in FIG.
[0066]
Specifically, the PCR method was performed as follows. Namely, genomic DNA of Acetobacter altoacetylenes MH-24 strain was used as a template, primer 1 (5′-TGTGACGTGGGGTGGTTTGACATGGCGGCAG-3 ′: SEQ ID NO: 3) and primer 2 (5′-CATCGTAAGGCTGCCCCACGCCGTAACAGGG-3 ′ sequence as primers Using No. 4), PCR was performed under the following PCR conditions using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
That is, the PCR method was carried out for 30 cycles, with 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 30 seconds as one cycle.
[0067]
This pOMPR1 was designated as Acetobacter aceti no. Strain 1023 was transformed by electroporation (see, for example, Wong, HC. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 8130-8134). Transformants were selected on YPG agar medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin and 2% acetic acid.
[0068]
About the ampicillin resistant transformant grown on the selection medium, the plasmid was extracted and analyzed by a conventional method, and it was confirmed that the plasmid carrying the gene having the function of enhancing acetate resistance was retained.
[0069]
(2) Acetic acid resistance of transformed strains
The ampicillin resistant transformant having the plasmid pOMPR1 obtained as described above was grown for growth on a YPG medium supplemented with acetic acid, the parent strain Acetobacter aceti No. 1 introduced with only the shuttle vector pUF106. Comparison with 1023 strain.
[0070]
Specifically, in 100 ml of YPG medium containing 3% acetic acid, 3% ethanol and 100 μg / ml ampicillin, shaking culture (150 rpm) was performed at 30 ° C. Growth was compared by measuring absorbance at 660 nm.
[0071]
As a result, as shown in FIG. 3, the transformed strain was able to grow even in a medium supplemented with 3% acetic acid and 3% ethanol, whereas the parent strain Acetobacter aceti No. It was confirmed that the strain 1023 could not grow, and the acetic acid resistance enhancing function of the acetic acid resistance gene was confirmed.
[0072]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel gene involved in acetic acid resistance is provided. Using this gene, it is possible to obtain a breeding strain that can improve the growth function (acetic acid resistance) in the presence of high acetic acid concentration and can produce vinegar with high acetic acid concentration with high efficiency. Therefore, the present invention is useful for producing vinegar having a high acetic acid concentration with high efficiency.
[0073]
[Sequence Listing]

[0074]
[Sequence free text]
SEQ ID NOs: 3 and 4: synthetic oligonucleotides
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a restriction enzyme map of a gene fragment (pS15) derived from Gluconacetobacter enterii cloned using Sau3AI, the position of an acetic acid resistance gene, and an insert fragment into pOMPR1.
FIG. 2 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of a protein encoded by the acetic acid resistance gene.
FIG. 3 is a diagram showing the culture course of a transformed strain having an amplified copy number of an acetic acid resistance gene.

Claims

The following protein (A) or (B).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (B) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, added or inverted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 And a protein having a function of enhancing acetate resistance

DNA encoding the following protein (A) or (B).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (B) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, added or inverted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 And a protein having a function of enhancing acetate resistance

DNA of the following (A), (B) or (C).
(A) DNA containing a base sequence consisting of base numbers 201 to 646 among the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(B) A function of hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to the base sequence consisting of base numbers 201 to 646 among the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and enhancing acetate resistance DNA encoding a protein having
(C) Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, it hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence having a function as a primer or probe prepared from a part of the base sequence consisting of base numbers 201-646. DNA encoding a protein that functions as a soybean and enhances acetic acid resistance

A recombinant vector comprising the DNA according to claim 2 or 3.

A transformant transformed with the recombinant vector according to claim 4.

A microorganism with enhanced acetate resistance, wherein the copy number from the DNA according to claim 2 or 3 is amplified in a cell.

The microorganism according to claim 6, wherein the microorganism is an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or Glucon acetobacter.

A method for producing vinegar, comprising culturing the microorganism according to claim 6 or 7 in a medium containing alcohol and generating and acetic acid in the medium.

A vinegar containing acetic acid at a high concentration obtained by the method according to claim 8.