JP2004517175A

JP2004517175A - 化合物を固定する基質の調製方法、その基質およびその使用方法

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Publication number: JP2004517175A
Application number: JP2002554241A
Authority: JP
Inventors: ウィンターイェンセンビョルン; フレゲンリングクリステンセンソレン; グルダガーペーターセンステーン
Original assignee: エヌ・ケー・ティーリサーチアンドイノベーションアクティーゼルスカブ
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2004-06-10
Also published as: CA2436253A1; KR20030083690A; EP1345705A1; WO2002053299A1; US20040086660A1

Abstract

【課題】化合物、特に生体高分子を固定するための固体基質と、この方法によって得られる基質、および化合物をそのような固体基質の表面に固定するプロセスを提供する。
【解決手段】本発明の方法は、基台となる基質を用意し、その表面を、多相の交流および多相の直流からなる群より選択される電源によって発生させたプラズマ中において、モノマーのガスで処理する。この際プラズマの強度は、多くても５．０Ｗ／ｌ、例えば３．０Ｗ／ｌとし、またモノマーガスは、１または２種以上のプラズマ重合されたモノマーからなるものとする。こうして固体基質の表面に反応基を付与する。本発明の方法は、比較的簡単で、経済的にも実施可能である。そして、本発明に係る基質は、高品質で、多機能である。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化合物、特に生体高分子、ならびにその類似物質および誘導体を固定するための固体基質を調製する方法に関する。この基質は、アミン、リン・エステル、チオールおよびヒドロキシルなどの、生体高分子の特定の基と反応することができる反応基を担持する。本発明はまた、そのような基質およびこの基質の使用にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体高分子（例えば、タンパク質、脂質、核酸、すべての細胞または細胞の断片）を固定する技術は多数存在するけれども、特に反応基が、さらなる活性化を必要とすることなく生体高分子と反応することができる、この目的に適した基質を求める声は依然として強い。
【０００３】
生体高分子のような化合物を固定する基質の調製方法は、例えば特許文献１に記載されている。ここに記載されている方法は、光化学作用による固定である。同様の方法は、特許文献２および３にも記載されている。
【０００４】
酸ハロゲン化物、酸無水物、エポキシド、アルデヒドなどは、アミン（特に第一級アミン）と反応することができる。したがって、これらの反応基は、生体高分子を固定すると特別な関連を有すると考えられる。しかし、本出願人が知る限り、そのような官能基を付した基質は、特に工業的な規模で生産するのは、非常に困難であった。
【０００５】
特許文献４は、固体のポリマー材料の表面に放射線照射をして、照射した表面を、アミドと反応する不飽和のエチレン結合を有するモノマーで架橋し、そのアミドと反応する基を、アミンと反応する基に転換させる、アミンと反応するポリマーからなる表面を有する基質の調製方法を開示している。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ９６／３１５５７号明細書
【特許文献２】
米国特許第４，９７３，４９３号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，００２，５８２号明細書
【特許文献４】
米国特許第６，３０３，１７９号明細書
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、分子、例えば生体高分子を固定する基質を調製する、従来とは異なる方法を提供することである。特に、本発明は、上述の公知の方法に比して比較的簡単で経済的にも実施可能な、化合物を固定する官能基を含む基質の調製方法を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、基質の表面が、固定すべき化合物と結合する比較的高濃度の官能基を含むようにし、かつ比較的制御が簡単で、高品質で量産することができるようにした、化合物を固定する基質を調製する方法を提供することも、本発明の目的である。
【０００９】
この外、本発明は、所望の活性な官能基を表面に有するように設計された、化合物を固定する、高品質の基質を提供することも目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上述の目的は、特許請求の範囲により定義される本発明によって達成される。以下の説明から明らかになるように、本発明は、さらに利点を有する。
【００１１】
低エネルギーのプラズマを用いて化合物を固定する基質を調製することによって、非常の高品質の基質が得られることが分かった。さらに、本発明の方法は、簡単で、経済的にも実施可能であり、基質の設計について高い柔軟性を備える。また、本発明の方法は、広範囲の化合物を固定する基質を調製することにも用いることができる。
【００１２】
したがって、本発明は、プラズマ重合による層を基質の表面に形成するため、多相の交流または多相の直流によって生起されるプラズマ中でモノマーガスにより基質を処理する工程を含む、プラズマ重合により、固体基質の表面に形成される反応基を含む官能基を調製する新規な方法に関するものである。モノマーガスは、固体基質の表面に反応基を生成させる元になる１または２種以上のモノマーを含む。
【００１３】
さらに、本発明は、生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体を固体基質の表面に結合するプロセスをも提供する。本発明のプロセスは、基質の表面に反応基を導入するための特許請求の範囲に定義した方法を用いて、基質の表面に官能基を導入する工程と、基質の反応基と、タンパク質、脂質、細胞もしくは細胞の断片または核酸もしくはその類似物質との間で反応を生起させるために基質の表面に、生体高分子またはまたはその類似物質もしくは誘導体を含む溶液を接触させる工程とを含む。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に係る、化合物を固定する固体基質を調製する方法は、基台となる基質を用意する工程と、この基台となる基質の表面をプラズマ中でモノマーガスにより処理する工程を含む。
【００１５】
プラズマを用いて表面状態を変化させる技術は、この業界では一般的に知られている。例えば、米国特許第５，８７６，７５３号明細書には、ＲＦプラズマ重合プロセスを用いて、フルオロカーボンフィルムを基質に適用する方法が開示されている。
【００１６】
本発明によれば、多相の交流および多相の直流からなる群より選択される電源によって生起されるプラズマを適用すると、プラズマの強度が最大で５．０Ｗ／ｌ、例えば３．０Ｗ／ｌのときに基質が高品質になることが明らかになった。
【００１７】
基台となる固体基質は、層状の材料あるいは混合材料など、原則的には、どのような種類の材料またはその組み合わせてであってもよい。固体基質は、典型的には、ガラス、シリコーン樹脂、紙、炭素繊維、セラミックス、金属およびポリマー（例えば、ポリエチレン（ＰＥ）およびポリプロピレン（ＰＰ）のようなポリオレフィン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロカーボン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン−コポリマー（ＦＥＰ）、ポリビニル−ジフッ化物（ＰＶＤＦ）、ポリアミド（例えばナイロン−６，６およびナイロン−１１）およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）のような他の熱可塑性樹脂、シリコーンゴムのようなゴム等から選択される材料からなる。現在のところ、好ましい材料は、伝統的に生化学においてよく用いられており、最も標準的な分析によく対応するポリエチレン（ＰＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、シリコーン樹脂およびガラスである。
【００１８】
固体基質は、例えば、断片状、プレート状、スライドガラス状、エリザプレート状、計深棒状など、どのような形状をとることもできる。
【００１９】
本発明においては、基質の表面または「基質表面」は、１またはそれ以上の小領域であってもよいことに留意すべきである。しかし、もちろん基質の全表面でもよい。また、基質は、各小領域ごとに、様々な反応基を含んだり、あるいは反応基の濃度を変えることができることに留意すべきである。したがって、基質は、その全部あるいは一部が、プラズマ処理の全工程あるいは一部の工程を通して被覆される。さらに、基質は、小領域ごとに被覆の状態が異なるように、２回またはそれ以上のプラズマ処理にかけることもできる。一般的には、プラズマ処理にかけられ、反応基が生成する基質表面は、少なくとも１ｍｙ^２、好ましくは少なくとも１０ｍｙ^２、より好ましくは少なくとも１００ｍｙ^２の面積を有するのが好ましい。用途によっては、プラズマ処理にかけられ、反応基が生成する基質表面は、０．０１〜１００ｃｍ^２、またはこれより大きな面積を有する。
【００２０】
基質表面は、その特性、例えばプラズマ重合された層との付着特性、あるいはその疎水性を変化させるために予めコーティング（プリコート）する。このプリコートは、例えばプラズマ重合によって行うことができる。プリコートは、基質本来の表層上に、ほぼ均質なポリマー層を形成するのが好ましい。例えば、基質の表面は、ポリスチレンのプラズマ重合層でプリコートすることができる（実施例１参照）。
【００２１】
本発明において特に好ましい反応基は、生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体（以下、併せて「生体高分子」と呼称する）と反応することができる反応基である。反応は、反応基と化合物の間で、好ましくはイオン結合、より好ましくは共有結合を生起させる。生体高分子は、通常アミノ基、ヒドロキシ基、チオ基、リン酸エステル等の反応を起こす箇所を含むが、そうでなければ、特に第一級アミンなどのアミンのような基を含むように誘導体を生成させることもできる。特に、そのような生体高分子のアミンは、本発明によって固体基質に固定する際には、特に有用である。
【００２２】
固体基質の表面に生成される反応基は、生体高分子、好ましくはタンパク質または核酸と、熱、紫外線、電子ビーム、マイクロ波、超音波等の外部からのエネルギー供給を必要としない液相反応により反応して、これに結合することができる反応基であるのが好ましい。典型的には、このような結合反応は、ｐＨ緩衝剤、塩、カーボジイミド等、生体高分子の結合の分野で当業者に公知の他の添加剤を含むこともある水溶液中、またはアセトニトリル、テトラヒドロフラン、クルロホルム、ジクロメタン、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒中、もしくは生体高分子の結合の分野で当業者に公知の添加剤を含むことのある２種またはそれ以上の有機溶媒の混合液中で行われる。
【００２３】
特に関心を引く官能基の例としては、酸無水物（特にカルボン酸無水物）、酸ハロゲン化物、酸ヨウ化物、エポキシド、アルデヒド、カルボン酸、チオール、ニトニル、第一級および第二級アミン、リン酸エステル、特に酸無水物、酸ハロゲン化物、エポキシドおよびアルデヒドがある。特に、関心を引く反応基は、酸無水物と酸ハロゲン化物（例えば酸塩化物）およびエポキシドである。これら後者の反応基は、生体高分子（またはその類似物質もしくは誘導体）のアミノ基との反応に特に適している。
【００２４】
「生体高分子」の語は、最も広い意味に解すべきである。生体高分子の例としては、これらに制限する意図はないが、タンパク質、脂質、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡなど）、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの類似物質（例えばＰＮＡ、ＬＮＡ等）およびこれらの誘導体、ならびに細胞、微生物がある。特に関心を引く誘導体は、ここで述べたようにして調製した固体基質に結合するのに適したアミノ基を含む誘導体である。その外、特に関心を引く基は、チオ基およびホスフェート基である。
【００２５】
反応基に戻ると、前述の特に関心を引く反応基は、例えばカップリング試薬を用いるなど、その生体高分子の反応基を活性化する必要がなく、生体高分子と容易に反応することができるものであることが明らかになった。
【００２６】
本発明の方法は、固体基質の表面に反応基を導入するため、基質を、その表面にプラズマ重合される１種またはそれ以上のモノマーを含むモノマーガスとともに、プラズマ中で処理する工程を含む。
【００２７】
モノマーは、固体基質に反応基を導入する基に加えて、重合可能な基を含む場合が非常に多い。そのような重合可能な基は、典型的には、ビニル基、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、アセチレンなどのエチレン性不飽和基、およびモノ−、ジ−、またはトリ−置換芳香族化合物から選択される。このモノマーは、主として重合を目的とした１種を超える基（例えばアクリル酸無水物）、および基質に反応基を導入することを目的とした１種を超える基（例えば１，２−ジ−チオール−ベンゼン）を含む場合があることに留意すべきである。
【００２８】
有用なモノマーの例としては、メタクリル酸無水物、アクリル酸塩化物、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸無水物、４−ペンタン酸無水物、メタクリル酸塩化物、アクロレイン、メタクロレイン、１，２−エポキシ−５−ヘキサン、グリシジルメタクリレート、アリルアミンおよびアリルメルカプタンがある。本発明の場合、好ましいモノマーは、メタクリル酸無水物、アクリル酸、アクリル酸塩化物、アクロレインおよびグリシジルメタクリレートである。
【００２９】
モノマーガスは、１種を超える官能基性のモノマーを含む。
【００３０】
上に挙げた種類のモノマーは、官能基を有するように調製される固体基質の表面張力に大きな影響を与える。モノマーとして用いられる酸無水物は、通常、基質の表面をきわめて親水性のものにし、他方、酸ハロゲン化物は、基質の表面をきわめて疎水性のものにする。きわめて疎水性となった表面は、官能基を有する表面ながら、生体高分子の水溶液を接触させるのがより困難になる。他方、非常に親水性となった表面は、少量の水溶液を垂らして正確にスポットをつくるのが困難である。そこで、特性が変化したコポリマー、すなわち生体高分子を含む溶液とよりバランスのとれた表面になるようにするコポリマーを調製するため、モノマーガスの中に特性を変化させるモノマーを含ませるのが好ましい。特性を変化させるモノマーは、例えば、特別な反応開始の操作なしで生体高分子と反応する基を有しないものとすることができる。
【００３１】
このような、表面張力を調整するために用いられるモノマーの例としては、比較的疎水性のモノマー（例えばペルフルオロヘキセン、ペルフルオロメチルペンテン、ヘキセン、ペンテン、プロペン、エチレン、シクロヘキセン、アセチレン、スチレン、キシレン、ビニルボルネン、テトラ−メチルシラン、ヘキサメチル−ジ−シラン等）、および比較的親水性のモノマー（例えばビニルアセテート、ビニルピロリドン、エチレングリコールビニルエーテル、ジエチレングルコールビニルエーテル、メタクリレート、メチルメタクリレート、アリルアルコール等）がある。
【００３２】
例としては、酸無水物（親水性）は、ヘキセンまたはスチレンなどの疎水性モノマーと都合よく組み合わせることができる。他方、酸塩化物（疎水性）は、酢酸ビニル（親水性）と都合よく組み合わせることができる。
【００３３】
上述の種類のモノマーはまた、官能基を有する固体基質の機械的な強度にも大きな影響を与える。その反応基がモノマーの主要な部分を構成するモノマーは、通常基質表面の機械的強度をかなりの程度弱くする。したがって、コポリマーの機械的強度をより強くする他の種類のモノマー（非反応性のもの）を、モノマーガスに含めるのが好ましい。
【００３４】
例として、酸ハロゲン化物は、ヘキセン、スチレンまたはキシレン（疎水性）のような機械強度を与えるモノマー、またはビニルアセテート（親水性）もしくはメチルメタクリレートと、好ましく組み合わせることができる。
【００３５】
好ましい実施形態においては、モノマーガスはさらに、１種またはそれ以上のモノマーとのプラズマ重合の後にコポリマーを生成させる第２のモノマー（上述の親水性、疎水性または機械強度を付与するモノマー）を含む。
【００３６】
上述のような第２のモノマーを用いる場合、「反応性」モノマーと疎水性／親水性の機械強度を付与するモノマーとの間の相対的なモル比は、例えば１：１〜１：１００モル／モルの範囲である。
【００３７】
本発明の方法において有用なプラズマ反応チャンバは、特許請求の範囲に定義したような所望のプラズマを発生させることができるなら、基本的にはどのような型の物でもよい。使用可能な反応チャンバは、本出願人による先行特許出願ＷＯ第００／４４２０７号に記載したもの、または欧州特許第０７４１４０４Ｂ１号に記載された電極システムを用いたものである。
【００３８】
本発明の技術思想において有利に用いることができるプラズマのタイプは、多相の交流または直流によって生起されるものである。このタイプのプラズマは、高いエネルギー準位にあり、反応基のかなりの部分をそのまま保存することができる。例えば大きくても５Ｗ／ｌ、例えば３Ｗ／ｌという十分に低いエネルギーを用いることができる二相または三相の交流プラズマが特に有利である。プラズマのエネルギー強度は、好ましくは大きくても２．０Ｗ／ｌ、より好ましくは最大で１．７Ｗ／ｌ、さらに好ましくは最大で１．５Ｗ／ｌであり、特に好ましいのは最大で１．０Ｗ／ｌ、最も好ましいのは最大で０．７Ｗ／ｌである。プラズマの強度は、最も好ましくは０．５〜２．０Ｗ／ｌがよい。以下の実施例においては、このような驚くほど低エネルギーのプラズマでも、非常に有用な官能基を有する基質が得られることが示されている。
【００３９】
反応チャンバの圧力は、通常は１０〜１０００μｂａｒ（１〜１００Ｐａ）、例えば２５〜５００μｂａｒ（２．５〜５０Ｐａ）、あるいは２０〜３００μｂａｒ（２〜３０Ｐａ）である。反応チャンバ内の圧力は、ガス流減圧バルブを備えることのある真空ポンプと、モノマーガスとキャリアガス（不活性ガスもしくは反応性のガスまたはこれらの混合物）の供給によって制御される。不活性のキャリアガスは、ヘリウム、アルゴン、ネオン、クリプトンまたはこれらの混合物のような希ガスが好適である。反応性のキャリアガスは、水素、酸素、フッ素、塩素またはこれらの混合物からなる群より選択するのが好ましい。
【００４０】
したがって、プラズマ反応チャンバは、ここで述べた指示に従って、当業者には自明の修正を加えながら、改良することができる。
【００４１】
モノマーの濃度および、処理に要する時間の総計は、少なくとも約５オングストローム（５０ｎｍ）、例えば１０〜１０００オングストローム（１００〜１００００ｎｍ）またはそれ以上の厚さを有するプラズマ重合された層をもつ、基台となる基質表面をつくり出すのに十分なものであることが好ましい。
【００４２】
プラズマ重合プロセスは、通常１〜１０００秒間、例えば１０〜１００秒間行われる。
【００４３】
プラズマ重合された層は、典型的にはほぼ均一な厚さを有する。層の厚さは、１〜１０００ｎｍまたは１０〜１０００ｎｍのように、一般的には５〜５０００ｎｍ、典型的には５〜５０ｎｍのように１０〜２００ｎｍである。
【００４４】
本発明の方法は、プラズマに導入されるモノマーガスによって与えられる、少なくとも３モル％のように、好ましくは少なくとも１モル％、例えば少なくとも５モル％の反応基が、基質の表面、すなわち重合された層に存在するような表面（重合された層）をつくり出すのに用いることができる。本発明の一実施形態においては、重合された層における反応基の、例えば５もしくは２５％またはそれ以上の分画が、生体高分子との反応に与ることができ、他の基は、プラズマ重合された層に埋没する。
【００４５】
したがって、本発明は、上で説明した方法の外、上で定義した方法によって得られる基質も提供する。このような基質は、酸無水物、酸ハロゲン化物（酸塩化物など）、カルボン酸、エポキシド、アルデヒドおよびチオール、好ましくは酸無水物、エポキシドおよび酸ハロゲン化物、特に酸無水物、エポキシドおよび酸塩化物からなる群より選択される、プラズマ重合されたモノマーを含むのが好ましい。そのような基質は、少なくとも０．００１ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の化学反応にアクセス可能な反応基濃度を有するのが好ましい。
【００４６】
特に好ましい基質は次のものである：
−少なくとも０．００１ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の化学反応にアクセス可能な酸無水物基濃度を有する、酸無水物を含む基質；
−少なくとも０．００１ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の化学反応にアクセス可能な酸ハロゲン基濃度を有する、酸ハロゲン化物を含む基質；および
−少なくとも０．００１ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の化学反応にアクセス可能なエポキシ基濃度を有する、エポキシ性官能基を含む基質。
【００４７】
生体高分子とは別に、他の分子、例えば低分子量の分子も、ここで述べたように調製した基質と結合することができる。したがって、この基質は、ペプチド、アミノ基などの有機スペーサを固定するのに用いることができる。
【００４８】
本発明のさらなる様相は、次の工程を含む、化合物を固体基質の表面に固定するプロセスに関する：
（ｉ）上述の基質を用意し、適宜この基質表面にある反応基を活性化する工程；および
（ｉｉ）基質の反応基と化合物の間で反応を生起させるため、基質の表面にその化合物を含む溶液を接触させ、固定する工程。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、タンパク質、核酸またはその類似物質を含む溶液は、カップリング剤を含まない。すなわち、基質の反応基と生体高分子（またはその類似物質もしくは誘導体）の間の反応は、活性化なしで起こる。
【００５０】
一般的に、基質表面の反応基が活性化を必要としないこと、したがってプロセスがそのような活性化工程を必要としないことは好ましいことである。
【００５１】
好ましくは、反応基は、上述の生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体からなる群から選択するべきである。好ましい化合物は、タンパク質、脂質、核酸またはその類似物質もしくはその混合物である。
【００５２】
このようなプロセスは、反応に与らなかった生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体を除去し、あるいは反応に与らなかった反応基を不活性化するため、基質の表面を洗浄するという後処理を含む。
【００５３】
疎水性が適当なものに調整されたときは、例えば１０ｃｍ^２未満の同一の基質上に、異なる生体高分子の多数（例えば１０〜１０００またはそれ以上）の分離したスポットを提供することが可能になる。
【００５４】
以下に、本発明を、添付の図面と実施例を用いてさらに詳しく説明する。
【００５５】
実施例１．スチレン（Ｓ）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、２０枚のスライドガラス（１インチ（２．５４ｃｍ）×３インチ（７．６６ｃｍ））を載置した。各スライドガラスは、次の条件の下に、３つの工程にかけた：１）アルゴン（Ａｒ）プラズマ、圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度２．１Ｗ／ｌ、Ａｒの流量４０標準ｃｍ^３／ｍｉｎ（ｓｃｃｍ）で、６０秒間、２）水素プラズマ、圧力０．０２５ｍＰａ、電力密度２Ｗ／ｌ、Ｈ_２の流量４０ｓｃｃｍで、６０秒間、３）重合０．０５０ｍｂａｒ、電力密度０．２Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１０ｓｃｃｍ、Ｓの流量２００ｓｃｃｍで、６０秒間。
【００５６】
得られたコーティングの特徴：
脱イオン水との前進方向の接触角が９０°であった。未処理のスライドガラスの比較値は、１０°であった。
【００５７】
フーリエ変換した赤外線スペクトル（ＦＴＩＲ）の結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリスチレンの存在が証明された：３１００〜３０００ｃｍ^−１（芳香族のＣ−Ｈ）、３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１６０１ｃｍ^−１（芳香族のＣ−Ｃ）、１４５１ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。
【００５８】
実施例１Ｂ．ヘキサメチルジシラン（ＨＭＤＳＬＡＮ）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、１７枚のスライドガラスを載置した。各スライドガラスは、次の条件の下に、３つの工程にかけた：１）アルゴン（Ａｒ）プラズマ、圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度５．９Ｗ／ｌ、Ａｒの流量５０標準ｃｍ^３／ｍｉｎ（ｓｃｃｍ）で、６０秒間、２）アルゴン／水素（Ａｒ／Ｈ_２）プラズマ、圧力０．０２５ｍＰａ、電力密度６Ｗ／ｌ、Ａｒの流量３５ｓｃｃｍ、Ｈ_２の流量１５ｓｃｃｍで、６０秒間、３）重合０．０２５ｍｂａｒ、電力密度６Ｗ／ｌ、Ａｒの流量３５ｓｃｃｍ、ＨＭＤＳＬＡＮの流量１００ｓｃｃｍで、６０秒間。
【００５９】
得られたコーティングの特徴：
脱イオン水との前進方向の接触角が９０°〜１２０°であった。未処理のスライドガラスの比較値は、１０°であった。
【００６０】
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリヘキサメチルジシランの存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、２１７０〜２１４０ｃｍ^−１（Ｓｉ−Ｈ）、１２７０〜１２５０ｃｍ^−１（Ｓｉ−ＣＨ_３）、１０３０〜１０１０ｃｍ^−１（Ｓｉ−ＣＨ_２−Ｓｉ）、８１０〜７９０ｃｍ^−１（Ｓｉ−Ｈ）。
【００６１】
実施例１Ｃ．ヘキセン（Ｈｅｘ）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システム（１３５リットル）を備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、２２枚のスライドガラス（１インチ（２．５４ｃｍ）×３インチ（７．６６ｃｍ））を載置した。各スライドガラスは、次の条件の下に、３つの工程にかけた：１）アルゴン（Ａｒ）プラズマ、圧力０．０１３ｍｂａｒ（１．３Ｐａ）、電力密度３．３Ｗ／ｌ、Ａｒの流量２５ｓｃｃｍで、６０秒間、２）Ａｒ／Ｈ_２プラズマ、圧力０．０１３ｍＰａ、電力密度２．０Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１７ｓｃｃｍ、Ｈ_２の流量７ｓｃｃｍで、６０秒間、３）重合０．０１３ｍｂａｒ、電力密度約３．９Ｗ／ｌ、Ａｒの流量２５ｓｃｃｍ、Ｈｅｘの流量１００ｓｃｃｍで、１５秒間。
【００６２】
実施例２．メタクリル酸（ＭＡ）の重合
ＥＰ０７４１４０４Ｂ１号に記載されたような三相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたスライドガラスを２４枚載置した。ＭＡのプラズマ重合は次のようにして行った。１０ｓｃｃｍのＡｒをＭＡを通して泡立て、チャンバに供給する。そして、圧力０．０１０ｍｂａｒ（１．０Ｐａ）、電力密度４．８Ｗ／ｌで、３００秒間、重合を行った。
【００６３】
得られたコーティングの特徴：
脱イオン水との前進方向の接触角は１０°未満であった。ポリスチレンでコーティングしたスライドガラスの比較値は、９０°であった。
【００６４】
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリ（メタクリル酸）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１７２０〜１７００ｃｍ^−１（カルボン酸）、１４５１ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。さらに、４０００〜３０００ｃｍ^−１の広い吸収ピークがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸の存在を示している。
【００６５】
実施例３．メタクリル酸無水物（ＭＡＡＨ）の重合
ＥＰ０７４１４０４Ｂ１号に記載されたような三相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたスライドガラスを１０枚載置した。ＭＡＡＨのプラズマ重合は次のようにして行った。５ｓｃｃｍのＡｒをＭＡを通して泡立て、チャンバに供給する。そして、圧力０．３０ｍｂａｒ（３０Ｐａ）、電力密度２．７Ｗ／ｌで、３００秒間、重合を行った。
【００６６】
得られたコーティングの特徴：
脱イオン水との前進方向の接触角は３０°であった。一方、ポリスチレンでコーティングしたスライドガラスの比較値は、９０°であった。
【００６７】
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリ（メタクリル酸無水物）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１８００〜１７４０ｃｍ^−１（カルボン酸無水物）、１４５１ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。さらに、４０００〜３０００ｃｍ^−１の広い吸収ピークがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸の存在を示している。
【００６８】
実施例４．アクリル酸塩化物（ＡＡＣｌ）の重合
ＥＰ０７４１４０４Ｂ１号に記載されたような三相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたスライドガラスを６０枚載置した。ＡＡＣｌのプラズマ重合は次のような条件下で行った：圧力０．１ｍｂａｒ（１０Ｐａ）、電力密度２．１Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１０ｓｃｃｍ、ＡＡＣｌの流量２００ｓｃｃｍで、６０秒間、重合を行った。
【００６９】
得られたコーティングの特徴：
【００７０】
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリ（アクリル酸塩化物）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１７８０〜１７４０ｃｍ^−１（カルボン酸無水物）、１４４５ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。しかし、１７３０〜１７００ｃｍ^−１でかなりの吸収がみられたため、コーティングは、ＰＡＡＣｌの外に、カルボン酸、エステル、ケトンなど他のカルボニル基も含んでいる。さらに、４０００〜３０００ｃｍ^−１の広い吸収ピークがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸の存在を示している。
【００７１】
実施例５．アクリル酸塩化物（ＡＡＣｌ）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、スライドガラスを２０枚載置した。電極の配置は、それぞれ正面図と側面図である図４ａと図４ｂに示してある。この電極配置は、２つの同心状の電極１と２、すなわち外側電極１と、この外側電極１によって周囲を取り囲まれた内側電極２を含む。外側電極１は、厚さ０．５ｍｍのステンレススチールからなり、断面がほぼ楕円形のチューブ（幅５００ｍｍ、高さ２４０ｍｍおよび長さ１０００ｍｍ）を形成するようにプレートを湾曲させたものである。内側電極２は、厚さ１ｍｍのステンレススチールからなり、断面がほぼ楕円形のチューブ（幅３６０ｍｍ、高さ１００ｍｍおよび長さ１０００ｍｍ）を形成するようにプレートを湾曲させたものである。基質は、内側電極２内の対称な平面位置にあって、電極１，２から電気的に隔離されたステンレススチール製のグリッド３に載置される。
【００７２】
ＡＡＣｌのプラズマ重合は次のような条件下で行った：圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度０．１８Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１０ｓｃｃｍ、ＡＡＣｌの流量２００ｓｃｃｍで、１２０秒間、重合を行った。
【００７３】
得られたコーティングの特徴：
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリ（アクリル酸塩化物）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１７８０〜１７４０ｃｍ^−１（カルボン酸無水物）、１４４５ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。しかし、１７３０〜１７００ｃｍ^−１でかなりの吸収がみられたため、コーティングは、ＰＡＡＣｌの外に、カルボン酸、エステル、ケトンなど他のカルボニル基も含んでいる。さらに、４０００〜３０００ｃｍ^−１の広い吸収ピークがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸の存在を示している。
【００７４】
Ｘ線フォトンスペクトル（ＸＰＳ）：約５ｎｍの上方の初期組成（原子％）；酸素１３％、窒素１．５％、炭素７１．７％、塩素１３．２％。モノマーの組成は酸素２０％、炭素６０％および塩素２０％である。したがって、モノマーは化学量論比からみると、重合されていない。しかし、塩素のかなりの量が、得られたコーティングに見られた。そしてより重要なのは、塩素の酸素に対する比が、酸塩化物の場合のように、１：１に近いということである。
【００７５】
ＸＰＳのデータの解釈：酸素（％）と塩素（％）の初期組成からＣＯＣｌとＣＯＯＨの濃度を推定すると、次の通りである。
仮にフーリエ変換した赤外線スペクトル（ＦＴＩＲ）がＣＯＣｌ（１７８０〜１７４０ｃｍ^−１）とＣＯＯＨ（１７３０〜１７１０ｃｍ^−１以下）のみ示し、他のカルボニル基（−Ｃ＝Ｏ：１８００〜１７００ｃｍ^−１）の存在を示さない場合、ＣＯＣｌとＣＯＯＨの濃度は、酸素と塩素の初期組成から推定することができる。
【００７６】
スライドガラスの表面の推定値は、すべてコーティングの値によって求められる（すなわちＳｉ（％）＝０とする）。
１）Ｃｌ（％）＝Ｏ（％）の場合、ＣＯＣｌ（％）＝Ｃｌ（％）＝Ｏ（％）、そしてＣＯＯＨ（％）＝０。
２）Ｃｌ（％）＜Ｏ（％）の場合、ＣＯＣｌ（％）＝Ｃｌ（％）、そしてＣＯＯＨ（％）＝（Ｏ（％）−Ｃｌ（％））／２。
３）Ｃｌ（％）＞Ｏ（％）の場合、ＣＯＣｌ（％）＝Ｏ（％）、そしてＣｌは、ＣＯＣｌ以外の形（たとえば脂肪族（Ｃ−Ｃｌ））で存在しているはずである。
【００７７】
実施例５Ｂ．アクリル酸塩化物（ＡＡＣｌ）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたスライドガラスを１７枚載置した。ＡＡＣｌのプラズマ重合は次のような条件下で行った：圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度０．２８Ｗ／ｌ、Ａｒの流量２５ｓｃｃｍ、ＡＡＣｌの流量２００ｓｃｃｍで、６０秒間、重合を行った。
【００７８】
得られたコーティングの特徴：
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリアクリル酸塩化物（ＰＡＡＣｌ）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１７８０〜１７４０ｃｍ^−１（カルボン酸無水物）、１４４５ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。ＨＭＤＳＬＡＮによるベースコーティングの強い吸収ピークが、実施例１Ｂで説明したＨＭＤＳＬＡＮに特徴的な吸収帯に観察された。
【００７９】
結合とハイブリダイゼーション：アミンを端末とするオリゴ−ＤＮＡのプローブは、０．００２ｎｍｏｌ／ｃｍ^２を超える量が、表面と結合することに成功した。この結果、プローブは、相補的オリゴ−ＤＮＡとのハイブリダイゼーションに成功した。
【００８０】
実施例６．アクリル酸塩化物（ＡＡＣｌ）の重合
ＥＰ０７４１４０４Ｂ１号に記載されたような三相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたスライドガラスを２０枚載置した。ＡＡＣｌのプラズマ重合は次のような条件下で行った：圧力０．１５ｍｂａｒ（１５Ｐａ）、電力密度２．１Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１０ｓｃｃｍ、ＡＡＣｌの流量２００ｓｃｃｍで、６０秒間、重合を行った。
【００８１】
得られたコーティングの特徴：
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリアクリル酸塩化物（ＰＡＡＣｌ）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１７８０〜１７４０ｃｍ^−１（カルボン酸無水物）。しかし、１７３０〜１７００ｃｍ^−１の吸収帯でかなりの吸収がみられたため、コーティングは、ＰＡＡＣｌの外に、カルボン酸、エステル、ケトンなど他のカルボニル基も含んでいる。さらに、４０００〜３０００ｃｍ^−１の広い吸収ピークがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸の存在を示している。
【００８２】
実施例６Ｂ．アクリル酸塩化物（ＡＡＣｌ）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたスライドガラスＡを載置した。ＡＡＣｌのプラズマ重合は次のような条件下で行った：圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度１Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１０ｓｃｃｍ、ＡＡＣｌの流量２００ｓｃｃｍで、１２０秒間、重合を行った。同一のプラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたもう１枚のスライドガラスＢを載置した。ＡＡＣｌのプラズマ重合は次のような条件下で行った：圧力０．１００ｍｂａｒ（１０．０Ｐａ）、電力密度１Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１０ｓｃｃｍ、ＡＡＣｌの流量２００ｓｃｃｍで、１２０秒間、重合を行った。
【００８３】
得られたコーティングの特徴：
スライドＡとＢのフーリエ変換した赤外線スペクトルの結果：次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリアクリル酸塩化物（ＰＡＡＣｌ）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１７８０〜１７４０ｃｍ^−１（カルボン酸無水物）、１４４２ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。さらに、スライドＢのＦＴＩＲからは、１７１０ｃｍ^−１での吸収ピークが認められた。これは、コーティングが、ＰＡＡＣｌの外に、カルボン酸、エステル、ケトンなど他のカルボニル基も含むことを示している。このピークはスライドＡには見られない。スライドＡとＢのプラズマ重合のパラメータを比較すると、圧力を高くした方が、アクリル酸塩化物以外のカルボニル基が得られるようである。
【００８４】
Ｘ線フォトンスペクトル（ＸＰＳ）：スライドＡにおける約５ｎｍの上方の初期組成（原子％）；酸素１１．９％、炭素７３．７％、塩素１４．４％。比較のため、スライドＢの初期組成を示すと、酸素１２．８％、窒素１．３％、炭素７０．９％、塩素１５．０％である。初期組成については、スライドＡとＢの間に大きな差異は見当たらない。
【００８５】
実施例７．アミノ基が末端のモデル化合物の固定
実施例４の２枚のスライド（Ａ１，Ａ２）をＸＰＳで分析した。同じバッチにあった他の２枚のスライド（Ｂ１，Ｂ２）は、ホウ酸緩衝液（ｐＨ＝１０）に入れた。同じバッチのさらに３枚のスライド（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３）も同様に、ホウ酸緩衝液（ｐＨ＝１０）に入れたが、この緩衝液には２−ブロモ−エチルアミンヒドロブロミド（ＢＥＡ）を０．１モル／ｌの割合で添加した。特定の結合をしない比較例として、ポリスチレンをコーティングした２枚のスライド（Ｄ１，Ｄ２）を、ホウ酸緩衝液に０．７モル／ｌのＢＥＡを添加したものと、脱イオン水にそれぞれ入れた。２４時間後に、Ｂ１，Ｂ２，Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｄ１およびＤ２を２時間脱イオン水で洗浄し、乾燥させた後ＸＰＳで分析した。結果（原子％）を下記の表１に示す。
【００８６】
【表１】

【００８７】
表１からは、臭素は、ＢＥＡに晒し、かつＡＡＣｌで処理した試料にのみ見られることが分かる。ポリスチレンに対する特別の結合は認められなかった。
【００８８】
スライドＢ１，Ｂ２，Ｃ１，Ｃ２およびＣ３における塩素（Ｃｌ）と臭素（Ｂｒ）の原子濃度を比較すると、スライドＣ１，Ｃ２，Ｃ３とＢＥＡの間の結合反応は、スライドにおけるＣｌ濃度のわずかな減少とＢｒ濃度の０から０．３％への増加をもたらす。ＣＯＣｌ基のＢＥＡへの結合容量を計算する場合は、ＸＰＳの測定深度は典型的には５ｎｍであること、および結合反応は、表面の単層においてのみ生起することを考慮に入れる。５ｎｍが２５枚の単層に相当すると仮定すると、ＢＥＡとの結合に先立ってＸＰＳで測定したスライド上のＣｌ原子％が１０％の場合には結合反応が１００％の効率で行われたとすると、表面に結合したＢｒは０．４％となる。表１から分かるように、結合反応が生起する前には、Ｃｌの濃度は１１％であり（Ｂ１とＢ２の平均値）、反応後にはＢｒの濃度は０．３％になった（Ｃ１，Ｃ２およびＣ３の平均値）。これは、コーティングしたＣＯＣｌ基の結合容量は、約７０％であることを示しているが、これはかなり高い値である。
【００８９】
実施例８．アクリル酸塩化物（ＡＡＣｌ）とｐ−キシレン（ｐＸ）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、ポリスチレンをコーティングしたスライドガラスを２０枚載置した。ＡＡＣｌとｐＸのプラズマ重合は次のような条件下で行った：圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度０．３Ｗ／ｌ、Ａｒの流量１０ｓｃｃｍ、ＡＡＣｌの流量１００ｓｃｃｍ、ｐＸの流量１００ｓｃｃｍで、３００秒間、重合を行った。
【００９０】
得られたコーティングの特徴：
フーリエ変換した赤外線スペクトルの結果、次の吸光帯での吸収ピークにより、ポリ（ＡＡＣｌ−ｃｏ−ｐＸ）の存在が証明された：３０００〜２８００ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）、１７８０〜１７４０ｃｍ^−１（カルボン酸無水物）、１６１１ｃｍ^−１（芳香族のＣ−Ｈ）、１４４８ｃｍ^−１（脂肪族のＣ−Ｈ）。しかし、１７３０〜１７００ｃｍ^−１でかなりの吸収がみられたため、コーティングは、ポリ（ＡＡＣｌ−ｃｏ−ｐＸ）の外に、カルボン酸、エステル、ケトンなど他のカルボニル基も含んでいる。さらに、４０００〜３０００ｃｍ^−１の広い吸収ピークがヒドロキシルおよび／またはカルボン酸の存在を示している。
【００９１】
実施例９．ＡＡＣｌの重合
得られるコーティングの組成と厚さに対するプロセスのパラメータの影響を、一連の実験によって調べた。
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、スライドガラスを２枚載置した。ＡＡＣｌとｐＸのプラズマ重合は、下記表２にある条件の下で行った。表２には、ＸＰＳによって得られたコーティングの初期組成（原子％）と、１７００〜１８００ｃｍ^−１の吸収帯におけるＦＴＩＲの最大吸収ピークの高さΔＡ_ｍａｘ（コーティングの厚さを間接的に計測したもの）が含まれている。
【００９２】
【表２】

【００９３】
表２から、ケイ素と酸素の信号は減少し、ΔＡ_ｍａｘが増加（すなわちコーティングの厚さが増加）すると、炭素の信号も増加することが分かる。一般に、圧力が低くなり、そして処理時間が長くなると、コーティングの厚さは増加する。
【００９４】
実施例９Ｂ．アクロレイン（アルデヒド官能価）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、３枚のスライドガラス（１インチ（２．５４ｃｍ）×３インチ（７．６６ｃｍ））を載置した。アクロレインのプラズマ重合は、次の条件の下で行った：圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度０．０３Ｗ／ｌ、Ａｒの流量３５ｃｃｍ、Ｈ_２の流量３５ｓｃｃｍ、アクロレインの流量２００ｓｃｃｍで、６０秒間。
【００９５】
実施例９Ｃ．アクロレイン（アルデヒド官能価）の重合
ＰＣＴ／ＤＫ０１／００７１４に記載されたような二相電極システムを備えた、３００リットルの円筒形プラズマチャンバに、１７枚のスライドガラス（１インチ（２．５４ｃｍ）×３インチ（７．６６ｃｍ））を載置した。ポリヘキセンのベースコーティングを実施例１Ｃと同様にして施した。ついで、グリシジルメタクリレートのプラズマ重合を、次の条件の下で行った：圧力０．０２５ｍｂａｒ（２．５Ｐａ）、電力密度０．３Ｗ／ｌ、Ａｒを５ｃｃｍの流量で、６００秒間グリシジルメタクリレートに通して泡立てた。
【００９６】
実施例１０．オリゴヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）の固定
実施例４の２枚のスライドガラス（Ａ１，Ａ２）を用いた。実施例４でアクリル酸塩化物をプラズマで重合させたスライドガラスの表面に、以下の３種のオリゴヌクレオチドＳＧＰ１，ＳＧＰ３およびＳＧＰ６を結合させた：
ＳＧＰ１：５’ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＣＧＴＣＧＧＴＣＧ−ＮＨ_３
ＳＧＰ３：５’ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＣＧＴＣＧＧＴＣＧ−ＯＨ_３
ＳＧＰ６：５’ＴＴＴＡＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴＡＧＴＴＡＴＴ−ＯＮＨ_３。
【００９７】
最初に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニュージーランドのＢｉｏＬａｂ社から入手）とともに、３つのオリゴに放射線標識を付した。酵素は、γＰ−３２で標識を付したアデノシン三リン酸の末端ホスフェターゼ基が、オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシレート末端に転移する際に触媒作用を及ぼす。この反応は、３７℃で３０分間行われた。標識を付したオリゴヌクレオチドは、エタノール中で沈殿させて生成し、冷却した７０％エタノールで３回洗浄した後、０．８５ＭのＫＨ_２ＰＯ_４溶液にし、シリカゲルプレート（メルク社）上で薄層クロマトグラフィーにより分析した。
【００９８】
標識を付したオリゴと標識を付さないオリゴ（標識を付さないオリゴは、相補的なオリゴ列へのハイブリダイゼーションに用いる。後記を参照）の試料を、１μｌ当り１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを含む５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．２）中で調製した。各６個の試料（ＳＧＰ１，ＳＧＰ３およびＳＧＰ６についてそれぞれ標識を付したものと付さないもの）について、１μｌのスポットを２つスライドガラスの表面に垂らした（図１参照）。ついで、飽和塩化ナトリウム水溶液が底部にある封止した湿潤チャンバ内で、２２℃で１６時間培養した。図１に示すように、上段のスポットは、左から、放射線標識を付したオリゴヌクレオチドＳＧＰ１，ＳＧＰ３およびＳＧＰ６であり、下段のスポットは、左から、放射線標識を付さないオリゴヌクレオチドＳＧＰ１，ＳＧＰ３およびＳＧＰ６である。各オリゴは、並行してスポットをつくった。
【００９９】
その後、スライドガラスは、洗浄液（５０ｍＭのエタノールアミン；０．１％のＳＤＳ；０．１ＭのＴｒｉｓ）中で、５０℃で５分間洗浄した。ついで、この洗浄液を廃棄し、新しい洗浄液を用いて、５０℃で２５分間２度目の洗浄を行った。最後に、スライドをＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用い、２２℃で５分間洗浄し、乾燥した後、標識を付したオリゴのカップリングを、標識を付した各オリゴについての乾燥した参照試料とともに、５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．２）中で監視する。監視は、インスタント・イメージャ（パッカード社）を用いて行った。結果を図２に示す。ｎｍｏｌ／ｃｍ^２のオーダーでの結合容量が達成された。各オリゴ（図１参照）のスポットの強度は、参照試料（データは図示していない）と比較されるべきで、互いに比較されるべきものではないことに留意されたい。
【０１００】
カップリングしたオリゴＳＧＰ１，ＳＧＰ３およびＳＧＰ６の平均的な量は、それぞれ０．１２ｎｍｏｌ／ｃｍ^２、０．００４ｎｍｏｌ／ｃｍ^２、および０．００４ｎｍｏｌ／ｃｍ^２であった。
【０１０１】
カップリングの後、スライドガラスは、下記オリゴＳＧＰ４（ＳＧＰ１とＳＧＰ３とは相補的だが、ＳＧＰ６とは相補的でない）との間でハイブリダイゼーションを生起させた：
ＳＧＰ４：５’ＣＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡＡ−ＯＨ_３。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションに先立って、オリゴＳＧＰ４に放射標識を付し、他のオリゴについて説明したのと同様に生成した。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションは、５０℃・相対湿度１００％の下、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．１μｇ／μｌのサケの精子および０．０２ｐｍｏｌの標識したオリゴＳＧＰ４の中で１８時間行った。ハイブリダイゼーションの容量は１８０μｌであり、ハイブリダイゼーション混合物は、カバー片で覆った。ハイブリダイゼーションの後は、スライドガラスは次のようにして洗浄した：５０℃の下、２×ＳＳＣ；０．１％のＳＤＳの中で５分間、２２℃の下、０．２×ＳＳＣの中で１０分間、２２℃の下、０．１×ＳＳＣの中で１０分間、そして最後に２２℃の下、Ｍｉｌｌｉｅ−Ｑ水の中で２分間。ついで、スライドガラスを乾燥し、ハイブリダイゼーションをＣｙｃｌｏｎｅＳｔｏｒａｇｅＰｈｏｓｐｈｏｒシステム（パッカード社）を用いて監視した。ハイブリダイゼーションの結果を図３に示す。オリゴＳＧＰ１とＳＧＰ３については、かなりの量のＤＮＡハイブリダイゼーションが示されているが、ネガティブコントロールであるＳＧＰ６については、ハイブリダイゼーションは検知されない。
【０１０４】
結論として、生体高分子を基質表面に結合するためのモノマーが、プラズマ処理を介して基質の表面に付着されたことが示された。さらに、生体高分子が、一定の強度をもって、かつ他の生体高分子とのかなりの相互作用を可能にする立体配置で結合したことが示された。
【０１０５】
実施例１０Ａ．オリゴＤＮＡの、アルデヒドおよびエポキシ官能基を有するスライドガラスに対する固定
実施例９Ｂに従って調製したアクロレインをプラズマ処理したガラススライドの表面、および実施例１０と同じ結合手順で、実施例９Ｃに従って調製したグリシジルメタクリレートをプラズマ処理したガラススライドの表面に結合させるために、オリゴヌクレオチドを用いた。結合の結果を下記の表３に示す。
【表３】

【０１０６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、生体高分子を固定する基質を調製する、比較的簡単で経済的にも実施可能な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
スライドガラス（実施例４と１０）上のスポット（上の列は結合用、下の列はハイブリダイゼーション用）の位置を示す平面図である。
【図２】
放射線標識を付したオリゴをスライド（実施例４と１０）に結合させた様子を示す平面図である（結合容量は、０．００４〜０．０１２ｎｍｏｌ・ｃｍ^−２である）。
【図３】
上述の結合したオリゴヌクレオチドに対するオリゴＳＧＰ４のハイブリダイゼーションを示す（実施例１０）平面図である。
【図４ａ】
本発明を実施する際に用いる電極システムの正面図である。
【図４ｂ】
本発明を実施する際に用いる電極システムの側面図である。
【符号の説明】
１外側電極
２内側電極
３グリッド

Claims

基台となる基質を用意する工程と、プラズマ中で前記基台となる基質の表面をモノマーガスで処理する工程とを含む、化合物、特に生体高分子を固定する固体基質を調製する方法であって、
前記プラズマは多相交流および多相直流からなる群より選択される電源によって生起され、プラズマの強度は多くても３．０Ｗ／ｌのように、多くても５．０Ｗ／ｌであり、前記モノマーガスは、前記固体基質の表面にプラズマ重合されて、その表面に反応基を付与する１種またはそれ以上のモノマーを含み、前記モノマーの濃度と処理時間は、好ましくは基台となる基質の表面に、１０〜１０００オングストロームのように、好ましくは少なくとも約５オングストロームの厚さのプラズマ重合層を形成するのに十分なものである方法。
前記反応基は、酸無水物、酸ハロゲン化物、エポキシド、アルデヒド、カルボン酸およびチオールからなる群より選択される請求項１記載の方法。
前記モノマーは、好ましくは反応基をさらに活性化することなく、生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体と反応することができる反応基を含む請求項１または２記載の方法。
前記反応基は前記生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体のアミノ基と反応することができ、好ましくは前記生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体のアミノ基と反応してイオン結合、より好ましくは共有結合を形成することができる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
前記モノマーガスとともに前記プラズマ中に導入される前記反応基の、少なくとも３モル％のような、少なくとも１モル％、例えば少なくとも５モル％は、前記基質の表面に重合される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
前記基質表面の反応基の密度は、少なくとも１ｃｍ^２当り０．００５ｎｍｏｌのように、少なくとも１ｃｍ^２当り０．００１ｎｍｏｌ、例えば少なくとも１ｃｍ^２当り０．０１ｎｍｏｌである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
前記モノマーは、カルボン酸（例えばアクリル酸、メタクリル酸）、酸無水物（例えばアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、４−ペンタン酸無水物）、酸ハロゲン化物（例えばアクリル酸塩化物、メタクリル酸塩化物）、アルデヒド（例えばアクロレイン、メタクロレイン）、エポキシド（例えば１，２−エポキシ−５−ヘキセン、グリシジルメタクリレート）およびチオール（例えば１−プロパンチオール、１，２−ジーチオール−ベンゼン）ならびにこれらの混合物からなる群より選択される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
前記プラズマの強度は、多くても１．５Ｗ／ｌのように、多くても２．０Ｗ／ｌ、例えば多くても１．０Ｗ／ｌであり、好ましくは多くても１．２Ｗ／ｌ、特に多くても１．７Ｗ／ｌであり、最も好ましくは多くても０．７Ｗ／ｌである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
前記プラズマは、二相または三相の交流など、多相の交流によって生起される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
前記基質は、ポリマー、ガラス、紙、炭素繊維、セラミックス、金属およびこれらの混合物からなる群より選択され、好ましくはガラスである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記基質は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）のようなポリオレフィン、およびテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラ−フルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン−コポリマー（ＦＥＰ）、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリアミド（例えばナイロン−６，６およびナイロン−１１）のような他の熱可塑性樹脂を含む熱可塑性樹脂、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ならびにゴム（例えばシリコーンゴム）からなる群より選択される１種またはそれ以上のポリマーを含むポリマー材料を含むかまたは実質的にこれらからなり、好ましくはポリエチレン（ＰＥ）または、ポリスチレン（ＰＳ）である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
前記モノマーガスは、コポリマーを形成して前記基質上にプラズマ重合される、互いに異なる第１および第２のモノマーを含む請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法によって得られる基質。
基質表面における反応基の密度が、１ｃｍ^２当り少なくとも０．００１ｎｍｏｌである請求項１３記載の基質。
基質表面における酸無水物の密度が、１ｃｍ^２当り少なくとも０．００１ｎｍｏｌである基質。
基質表面におけるエポキシ基の密度が、１ｃｍ^２当り少なくとも０．００１ｎｍｏｌである基質。
基質表面における酸ハロゲン化物の密度が、１ｃｍ^２当り少なくとも０．００１ｎｍｏｌである基質。
化合物を基質に固定する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれかに記載の方法に従って、基質を用意し、適宜基質表面の反応基を活性化する工程と、
（ｉｉ）前記基質の表面を、固定するべき化合物を含む溶液に接触させ、前記基質の反応基と化合物との間で反応を生起させる工程を含む方法。
前記化合物は、生体高分子またはその類似物質もしくは誘導体からなる群より選択され、好ましくは脂質、タンパク質、核酸およびその類似物質ならびにこれらの混合物からなる群より選択される請求項１８に記載の方法。
前記方法はさらに、反応に与らなかった化合物および／または反応に与らなかった不活性な反応基を除去するため、前記基質の表面を洗浄する工程を含む請求項１８または１９に記載の方法。
前記化合物を含む溶液は、実質的にカップリング剤を含まない請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。